JP3175822B2 - ハプテンの免疫学的測定法 - Google Patents
ハプテンの免疫学的測定法Info
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Description
的測定法に関する。さらに詳しくは、検体中のハプテン
の濃度を精度良く測定できるハプテンの免疫学的測定法
に関する。
は、検体中のハプテンと、ハプテンを認識する抗体との
免疫反応をハプテン乖離剤の存在下で行う方法であっ
て、検体中のハプテンと、ハプテンを認識する抗体の不
溶化抗体と、標識化ハプテンとを同時または逐次に免疫
反応させる方法(一抗体競合法)が知られていた。具体
的には、「ホルモンと臨床,31巻,p.89,198
3年(文献)」や「医学と薬学,21巻,2号,p.
315,1989年(文献)」に記載のハプテンの免
疫学的測定法が挙げられる。
一抗体競合法による免疫学的測定法では、検体中のハプ
テンが低濃度の場合、ハプテンの濃度を精度良く測定す
ることができなかった。例えば、文献記載のトリヨー
ドサイロニン(以下、T3とする)の免疫学的測定法に
おいて、測定検体のT3濃度が1.1ng/mLの場合
の同時再現性(CV)は7%である。又、文献記載の
サイロキシン(以下、T4とする)の免疫学的測定法に
おいて、測定検体のT4濃度が3.1μg/dlの場合
の同時再現性(CV)は7%である。文献、の何れ
の方法も測定精度の面で不十分なハプテンの免疫学的測
定法であった。
解決するため鋭意検討した結果、低濃度のハプテンでも
精度良く測定することができるハプテンの二抗体競合法
による免疫学的測定法を見出し、本発明に到達した。す
なわち本発明は、検体中のハプテンと、ハプテンを認識
する抗体(A)との免疫反応をハプテン乖離剤(B)の
存在下で行う方法であり、検体中のハプテンと、抗体
(A)と、抗体(A)を認識する不溶化抗体(C)と、
標識化ハプテン(D)とを同時または逐次に免疫反応さ
せることを特徴とするハプテンの免疫学的測定法であ
る。
の中で最も重要な、検体中のハプテンと、ハプテンを認
識する抗体との反応が、液相−固相のみの反応である。
それに対し、本発明の二抗体競合法は、検体中のハプテ
ンとハプテンを認識する抗体との反応が、液相−液相お
よび液相−固相の反応である。よって、本発明の方法で
は従来の方法と比べ、免疫反応の効率が格段に向上し、
低濃度のハプテンでも精度良く測定することが可能にな
ると推測される。
ハプテンを認識する抗体(A)と、不溶化抗体(C)
と、標識化ハプテン(D)とを同時または逐次に免疫反
応させるが、好ましくは、検体中のハプテンと、抗体
(A)と、不溶化抗体(C)とを同時または逐次に免疫
反応させ、次いで、未反応物を除去した後に標識化ハプ
テン(D)を免疫反応させる(二抗体競合法&二段階反
応)。
る抗体(A)としては、ポリクローナル抗体および/ま
たはモノクローナル抗体が使用できるが、抗体の特異性
の面からモノクローナル抗体が好ましく使用される。
する不溶化抗体(C)は、抗体(A)を認識する抗体が
不溶性担体に結合し、不溶化されたものである。抗体
(A)を認識する抗体としては、ポリクローナル抗体お
よび/またはモノクローナル抗体が使用できるが、HA
MAの影響を避けるために、抗体(A)にモノクローナ
ル抗体を使用した場合は、抗体(A)を認識する抗体に
は、ポリクローナル抗体を使用することが好ましい。
尚、HAMAとは、ヒト検体中に存在する抗体で、二つ
のモノクローナル抗体を架橋するように結合するので、
免疫学的測定法における干渉物として知られている「例
えば、臨床化学,18巻,4号,p.202,1989
年」。
や、抗体(A)を認識する抗体を得るために用いる免疫
動物としては、抗体を産生できる動物であれば特に限定
されない。好ましい動物は、ウサギ、ヤギ、ロバ、ヒツ
ジ、マウス及びモルモットである。
は、血中に一部は遊離状態で存在し大部分はキャリアー
蛋白に結合した状態で存在する。ハプテンとしては、例
えば、甲状腺ホルモン(ジヨードサイロニン(T2)、
T3、T4、リバースT3(rT3))、ステロイドホ
ルモン(コーチゾール、エストラジオール、テストステ
ロン、アルドステロン、プロゲステロンおよびそれらの
誘導体など)、薬剤(ジゴキシン、ジギトキシン、ジフ
ェニルヒダントイン、テオフィリン、モルフィン、ペニ
シリンなど)が挙げられる。これらのうち、測定対象と
して好ましいものは、甲状腺ホルモンであり、さらに好
ましいものは、T3、T4である。また、標識化ハプテ
ン(D)に用いられるハプテンとしても、検体中のハプ
テンと同様のものが使用でき、好ましいものも同様であ
る。
BG、TBPA、アルブミン、性ホルモン結合グロブリ
ン、コーチゾール結合蛋白などである。
(B)は、ハプテンとキャリアー蛋白の結合を切断する
ものであれば特に限定されない。また、ハプテン乖離剤
(B)は、単独でも複数の混合でも使用できる。ハプテ
ン乖離剤(B)として、好ましいものは、分子量500
以下のものであり、例えば、8−アニリノ−1−ナフタ
レンスルホン酸、サリチル酸、ジフェニルヒダントイ
ン、トルブタミド、フロセミドなどや、それらの塩類で
ある。ハプテン乖離剤(B)として、さらに好ましいも
のは、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホン酸、サリ
チル酸、それらの塩類であり、最も好ましいものは、サ
リチル酸、サリチル酸塩である。
質としては、ケイ酸質無機担体[ガラス(ポ−ラス、ツ
ヤ消しガラスなど)、シリカゲル、ベンナイトなど]、
磁性体、有機担体(プラスチック、デキストラン、ロ紙
など)などいずれも公知のものが使用される。また、こ
れらの不溶性担体は微粒子にされ懸濁の状態で使用され
る場合もある。
離が可能である形状であれば特に限定されない。不溶性
担体の好ましい形状は、B/F効率が高いことより、球
体(ビーズ、パーティクル)、試験管、チューブ、ウエ
ルであり、さらに好ましくは、B/F効率が最も高いこ
とより、ビーズである。
結合させ、不溶化抗体(C)とする方法としては、抗体
をガラスに化学的に結合させる方法(例えば、米国特許
第4280992号明細書及び同第3652761号明
細書)や、抗体をプラスチックに物理吸着させる方法
(例えば、イ−・エングバル等;バイオシム・バイオフ
ィズ・アクタ、251巻、427貢、1971年)など
がある。さらに、抗体にビオチンを結合させ担体にはス
トレプトアビジンを結合させることにより、抗体を不溶
化させる方法など、間接的に抗体を不溶化抗体にさせる
方法がある。
物に結合させたものである。この標識物としては、アイ
ソト−プ[I125など]、酵素[ペルオキシダーゼ、
アルカリフォスファターゼ、βガラクトシダーゼな
ど]、蛍光物質[ユーロピウム誘導体など]、発光物質
[アクリジウム誘導体など]等いずれも公知のものが使
用される。
テン(D)とする方法としては、ハプテンを標識物に結
合させる方法(例えば、生化学実験法15、東京化学同
人、p.308〜330、1993年)がある。さら
に、ハプテンにストレプトアビジンを結合させ標識物に
ビオチンを結合させることによりハプテンを標識物に結
合させる方法など、間接的にハプテンを標識物に結合さ
せる方法がある。
が、本発明はこれに限定されるものではない。
ン酸緩衝液(pH8.0)に、牛血清アルブミンを3g
/Lおよび塩化ナトリウムを8.5g/Lの濃度になる
ように添加し、免疫反応用緩衝液(a)を調製した。緩
衝液(a)中に8−アニリノ−1−ナフタレンスルホン
酸アンモニウムを0.1g/L含有させたものを
(b)、緩衝液(a)中に8−アニリノ−1−ナフタレ
ンスルホン酸アンモニウムを0.2g/L含有させたも
のを(c)、緩衝液(a)中にサリチル酸ナトリウムを
5g/L含有させたものを(d)、緩衝液(a)中にサ
リチル酸ナトリウムを10g/L含有させたものを
(e)とした。
パス光学工業株式会社製)を用い、第一反応として、
(b)または(d)の0.3mLと、標準T3液または
同時再現性用検体の0.02mLと、抗T3モノクロー
ナル抗体(ヒツジ)結合ポリスチレンビーズ(以下G1
とする)1個とを反応管中で37℃,15分間免疫反応
させ、T3+G1複合体を形成させた。反応後、装置専
用のB/F分離液にて洗浄させ、B/F分離を行った。
合体1個に、ペルオキシダーゼ標識T3(以下P1とす
る)を200μg/L含有する(a)を0.3mL分注
させ、反応管中で37℃,15分間免疫反応させ、T3
+G1+P1複合体を形成させた。反応後、装置専用の
B/F分離液にて洗浄させ、B/F分離を行った。
P1複合体1個に、過酸化水素を0.1g/Lおよびテ
トラメチルベンジジンを0.17g/L含有する酢酸緩
衝液を0.3mL分注させ、反応管中で37℃,15.
5分間発色反応させ、反応後、0.7mLの脱イオン水
を混合させ、380nmで測光させた。
2次式の逆数(1/(Ax2+Bx+C))で自動回帰
させ、その検量線から、同時再現性用検体の測光値に対
する濃度値を算出させた。
パス光学工業株式会社製)を用い、第一反応として、抗
T3モノクローナル抗体(ヒツジ)(以下M1とする)
を20μg/Lの濃度でそれぞれ含有する(b)または
(d)の0.3mLと、標準T3液または同時再現性用
検体の0.02mLと、抗ヒツジIgポリクローナル抗
体(ウサギ)結合ポリスチレンビーズ(以下G2とす
る)1個とを反応管中で37℃,15分間免疫反応さ
せ、T3+M1+G2複合体を形成させた。反応後、装
置専用のB/F分離液にて洗浄させB/F分離を行っ
た。
G2複合体1個に、P1を400μg/L含有する
(a)を0.3mL分注させ、反応管中で37℃,15
分間免疫反応させ、T3+M1+G2+P1複合体を形
成させた。反応後、装置専用のB/F分離液にて洗浄さ
せB/F分離を行った。
G2+P1複合体1個に、過酸化水素を0.1g/Lお
よびテトラメチルベンジジンを0.17g/L含有する
酢酸緩衝液を0.3mL分注させ、反応管中で37℃,
15.5分間発色反応させ、反応後、0.7mLの脱イ
オン水を混合させ、380nmで測光させた。
2次式の逆数(1/(Ax2+Bx+C))で自動回帰
させ、その検量線から、同時再現性用検体の測光値に対
する濃度値を算出させた。
パス光学工業株式会社製)を用い、第一反応として、P
1を200μg/Lの濃度でそれぞれ含有する(b)ま
たは(d)の0.3mLと、標準T3液または同時再現
性用検体の0.02mLと、G1の1個とを反応管中で
37℃,15分間免疫反応させ、T3+G1+P1複合
体を形成させた。反応後、装置専用のB/F分離液にて
洗浄させB/F分離を行った。
P1複合体1個に、過酸化水素を0.1g/Lおよびテ
トラメチルベンジジンを0.17g/L含有する酢酸緩
衝液を0.3mL分注させ、反応管中で37℃,15.
5分間発色反応させ、反応後、0.7mLの脱イオン水
を混合させ、380nmで測光させた。
2次式の逆数(1/(Ax2+Bx+C))で自動回帰
させ、その検量線から、同時再現性用検体の測光値に対
する濃度値を算出させた。
パス光学工業株式会社製)を用い、第一反応として、P
1を500μg/Lの濃度でそれぞれ含有する(b)ま
たは(d)の0.15mLと、M1を40μg/Lの濃
度でそれぞれ含有する(b)または(d)の0.15m
Lと、標準T3液または同時再現性用検体の0.02m
Lと、G2の1個とを反応管中で37℃,15分間免疫
反応させ、T3+M1+G2+P1複合体を形成させ
た。反応後、装置専用のB/F分離液にて洗浄させB/
F分離を行った。
G2+P1複合体1個に、過酸化水素を0.1g/Lお
よびテトラメチルベンジジンを0.17g/L含有する
酢酸緩衝液を0.3mL分注させ、反応管中で37℃,
15.5分間発色反応させ、反応後、0.7mLの脱イ
オン水を混合させ、380nmで測光させた。
2次式の逆数(1/(Ax2+Bx+C))で自動回帰
させ、その検量線から、同時再現性用検体の測光値に対
する濃度値を算出させた。
パス光学工業株式会社製)を用い、第一反応として、
(c)または(e)の0.3mLと、標準T4液または
同時再現性用検体の0.02mLと、抗T4モノクロー
ナル抗体(マウス)結合ポリスチレンビーズ(以下G3
とする)1個とを反応管中で37℃,15分間免疫反応
させ、T4+G3複合体を形成させた。反応後、装置専
用のB/F分離液にて洗浄させB/F分離を行った。
合体1個に、ペルオキシダーゼ標識T4(以下P2とす
る)を300μg/L含有する(a)を0.3mL分注
させ、反応管中で37℃,15分間免疫反応させ、T4
+G3+P2複合体を形成させた。反応後、装置専用の
B/F分離液にて洗浄させB/F分離を行った。
P2複合体1個に、過酸化水素を0.1g/Lおよびテ
トラメチルベンジジンを0.17g/L含有する酢酸緩
衝液を0.3mL分注させ、反応管中で37℃,15.
5分間発色反応させ、反応後、0.7mLの脱イオン水
を混合させ、380nmで測光させた。
2次式の逆数(1/(Ax2+Bx+C))で自動回帰
させ、その検量線から、同時再現性用検体の測光値に対
する濃度値を算出させた。
パス光学工業株式会社製)を用い、第一反応として、抗
T4モノクローナル抗体(以下M2とする)を300μ
g/Lの濃度でそれぞれ含有する(c)または(e)の
0.3mLと、標準T4液または同時再現性用検体の
0.02mLと、抗マウスIgポリクローナル抗体(ヤ
ギ)結合ポリスチレンビーズ(以下G4とする)1個と
を反応管中で37℃,15分間免疫反応させ、T4+M
2+G4複合体を形成させた。反応後、装置専用のB/
F分離液にて洗浄させB/F分離を行った。
G4複合体1個に、P2を600μg/L含有する
(a)を0.3mL分注させ、反応管中で37℃,15
分間免疫反応させ、T4+M2+G4+P2複合体を形
成させた。反応後、装置専用のB/F分離液にて洗浄さ
せB/F分離を行った。
G4+P2複合体1個に、過酸化水素を0.1g/Lお
よびテトラメチルベンジジンを0.17g/L含有する
酢酸緩衝液を0.3mL分注させ、反応管中で37℃,
15.5分間発色反応させ、反応後、0.7mLの脱イ
オン水を混合させ、380nmで測光させた。
2次式の逆数(1/(Ax2+Bx+C))で自動回帰
させ、その検量線から、同時再現性用検体の測光値に対
する濃度値を算出させた。
パス光学工業株式会社製)を用い、第一反応として、P
2を300μg/Lの濃度でそれぞれ含有する(c)ま
たは(e)の0.3mLと、標準T4液または同時再現
性用検体の0.02mLと、G3の1個とを反応管中で
37℃,15分間免疫反応させ、T4+G3+P2複合
体を形成させた。反応後、装置専用のB/F分離液にて
洗浄させB/F分離を行った。
P2複合体1個に、過酸化水素を0.1g/Lおよびテ
トラメチルベンジジンを0.17g/L含有する酢酸緩
衝液を0.3mL分注させ、反応管中で37℃,15.
5分間発色反応させ、反応後、0.7mLの脱イオン水
を混合させ、380nmで測光させた。
2次式の逆数(1/(Ax2+Bx+C))で自動回帰
させ、その検量線から、同時再現性用検体の測光値に対
する濃度値を算出させた。
パス光学工業株式会社製)を用い、第一反応として、P
2を800μg/Lの濃度でそれぞれ含有する(c)ま
たは(e)の0.15mLと、M2を600μg/Lの
濃度でそれぞれ含有する(c)または(e)の0.15
mLと、標準T4液または同時再現性用検体の0.02
mLと、G4の1個とを反応管中で37℃,15分間免
疫反応させ、T4+M2+G4+P2複合体を形成させ
た。反応後、装置専用のB/F分離液にて洗浄させB/
F分離を行った。
G4+P2複合体1個に、過酸化水素を0.1g/Lお
よびテトラメチルベンジジンを0.17g/L含有する
酢酸緩衝液を0.3mL分注させ、反応管中で37℃,
15.5分間発色反応させ、反応後、0.7mLの脱イ
オン水を混合させ、380nmで測光させた。
2次式の逆数(1/(Ax2+Bx+C))で自動回帰
させ、その検量線から、同時再現性用検体の測光値に対
する濃度値を算出させた。
免疫学的測定法の同時再現性:低濃度のハプテンでも精
度良く測定することができるハプテンの免疫学的測定法
であることを確かめるため、比較例1〜4および実施例
1〜4のT3免疫学的測定法で、低濃度(1ng/m
L)および高濃度(4ng/mL)の同時再現性用検体
をそれぞれn=40で測定し、同時再現性[測定値の標
準偏差値/平均値×100(%)]を求めた。1ng/
mLの検体の同時再現性の結果を表1に示し、4ng/
mLの検体の同時再現性の結果を表2に示す。
免疫学的測定法の同時再現性:さらに、比較例5〜8お
よび実施例5〜8のT4免疫学的測定法で、低濃度(3
μg/dL)および高濃度(12μg/dL)の同時再
現性用検体をそれぞれn=40で測定し同時再現性[測
定値の標準偏差値/平均値×100(%)]を求めた。
3μg/dLの検体の同時再現性の結果を表3に示し、
12μg/dLの検体の同時再現性の結果を表4に示
す。
定することができなかったが、本発明によって、低濃度
のハプテンおよび高濃度のハプテンが極めて精度良く測
定することができるようになる。さらに、本発明によっ
て液体中のハプテン濃度が正確に得られ、血中のハプテ
ン濃度が臨床診断に利用される場合には、従来よりも極
めて正確な診断が可能となり、さらには極めて正確な治
療も可能となる。
Claims (4)
- 【請求項1】検体中のハプテンと、ハプテンを認識する
抗体(A)との免疫反応をハプテン乖離剤(B)の存在
下で行う方法であり、検体中のハプテンと、抗体(A)
と、抗体(A)を認識する不溶化抗体(C)と、標識化
ハプテン(D)とを同時または逐次に免疫反応させるこ
とを特徴とするハプテンの免疫学的測定法。 - 【請求項2】ハプテン乖離剤(B)が、8−アニリノ−
1−ナフタレンスルホン酸、サリチル酸またはこれらの
塩類である請求項1記載の免疫学的測定法。 - 【請求項3】検体中のハプテンと、抗体(A)と、不溶
化抗体(C)とを同時または逐次に免疫反応させ、次い
で、未反応物を除去した後に標識化ハプテン(D)を免
疫反応させる請求項1または2記載の免疫学的測定法。 - 【請求項4】抗体(A)がモノクローナル抗体であり、
不溶化抗体(C)がポリクローナル抗体である請求項1
〜3の何れか記載の免疫学的測定法。
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JP07129198A JP3175822B2 (ja) | 1998-03-04 | 1998-03-04 | ハプテンの免疫学的測定法 |
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JP07129198A JP3175822B2 (ja) | 1998-03-04 | 1998-03-04 | ハプテンの免疫学的測定法 |
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Publication Number | Publication Date |
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JPH11248702A JPH11248702A (ja) | 1999-09-17 |
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1998
- 1998-03-04 JP JP07129198A patent/JP3175822B2/ja not_active Expired - Fee Related
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