JP3150061B2 - 遺伝子発現分析方法 - Google Patents

遺伝子発現分析方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般的遺伝子発現
分析方法並びに遺伝子ファミリーのメンバーの発現の示
差的分析方法に関する。
【0002】
【従来の技術】膨大な数の生物学的プロセスについての
分子的基礎は、細胞、器官又は生物内の特定の遺伝子又
は遺伝子グループの協調された活性化又は不活性化であ
る。このプロセスでは、細胞、器官又は生物は、特有の
発現状況により特徴付けられる特定の生理的状態、分化
の度合い及び一定の外的影響の状態にある。この発現状
況、即ち全ての遺伝子又は特定の遺伝子グループの活性
化の度合いの知見は、多くの生物学的疑問に答えるのに
鍵となる重要なものである。従って、発現状況について
の情報を得るために意図される方法の狙いとするところ
は、一方では全ての遺伝子の活性並びに遺伝子の特定の
サブセットの活性を測定することである。特に、遺伝子
ファミリーがサブセットとして考慮される。遺伝子ファ
ミリーは、細胞内で遺伝子産物が請け負う特定のタイプ
の働きによりしばしば機能的に特徴付けられ、そして1
又は幾つかの共通の保存領域 (ドメイン) を構造的に有
するところの遺伝子のグループである。遺伝子ファミリ
ーの例は、MADS−ボックス及びホメオボックス遺伝
子ファミリー並びに更なる転写因子ファミリーである。
サイクリン、サイトカイン及びグロビン遺伝子ファミリ
ーは、医学的に興味あるものの例である。
【0003】遺伝子の発現状況の分析は先行技術から既
知である。示差的表示RT−PCR(differential disp
lay RT-PCR) (DDRT) が示差的遺伝子発現の分析方
法の例であって、その方法では、組織からのmRNAが
3’延長部分 (好ましくは2塩基) を有するcDNAプ
ライマーを用いることにより、cDNAの (好ましくは
12の) 下位集団への逆転写 (RT) によって転写され
る。ランダム配列を有する短いプライマー、好ましくは
10ヌクレオチドの長さのプライマーを用いることによ
り、シーケンシングゲル (sequencing gel) 上で分離す
ることができる転写産物特異長を有するPCR産物がこ
のcDNAから生成する。用いられるプライマーの組み
合わせの数が十分に大きいなら、その組織内に存在する
殆ど全ての転写産物を検出することが統計的に可能であ
る。2又は3以上の組織から得られるPCR産物を1つ
のゲル上に互いに隣り合うように適用するなら、このよ
うにして発現差を直接に表示することが可能である。示
差バンドをゲルから切り取って、再増幅して更なる分析
用にクローン化することができる。
【0004】更に、全てのmRNA分子の特定の下位グ
ループ、例えば、特定の遺伝子ファミリーのメンバーの
増幅産物を豊富化するには、遺伝子ファミリーに特異的
な配列を有するプライマーをランダムプライマーと組み
合わせることが可能である。DDRTのこの手法は、例
えば、Liang と Pardee (1992) Science 257, 967-971
;Liang ら (1993) Nucleic Acids Res. 21, 3269-327
5;Bauer ら (1993) Nucleic Acids Res. 21, 4272-428
0;Stone と Wharton (1994), Nucleic Acids Res. 22,
2612-2618 ; Wang と Feuerstein (1995) Biotechniq
ues 18, 448-452;WO 93/18176 及び DE 4317414 に記
載されている。
【0005】しかしながら、DDRTのこの実験デザイ
ンには幾つかの欠点がある。例えば、バンドパターンが
しばしば再現性に乏しい。例えば20塩基の長いランダ
ムプライマーを用いても、この再現性の問題を満足ゆく
まで解決することができない(Ito ら (1994), FEBS Let
t. 351, 231-236) 。加えて、必要なプライマーの組み
合わせの数が大きいため及び反復による再現性を増さな
ければならないという必要性のために、極端に多くの作
業量が必要である。加えて、しばしば高い割合の誤陽性
結果が得られる。更には、多くのDDRT実験では希薄
な転写産物を検出できないことも分かっている (Bertio
liら (1995) Nucleic Acids Res. 23, 4520-4523) 。
【0006】先行技術に記載された選択されたバンドの
配列分析も、DDRT産物の両末端に同じプライマーが
しばしば傍にある結果、直接に配列分析することが可能
ではなく追加のクローニング段階が必要になるので問題
がある。短いプライマーを用いることに起因して、たと
え2つの異なるプライマーがその産物の傍にあっても、
DDRTプライマーに比較して5’側に延びたプライマ
ー分子での更なる再増幅段階が必要である。最後に、ラ
ンダムプライマーを用いることに起因して、細胞の全て
の転写産物が用いたプライマーの組み合わせにより確実
に認識されるようにすることは決して可能ではない。こ
のことは、たとえ多数のプライマーを用いた場合でも、
全ての転写産物をそっくりそのまま検出しようとする実
験並びに遺伝子ファミリーの如き転写産物の下位集団の
分析に向けられた実験に当てはまる。
【0007】Songと Osborn は、Plant Molecular Biol
ogy 26 (1994) 1065-1071 に、RT−PCRとRFLP
(制限断片長多形現象) 分析の技術をお互いに組み合わ
せた植物多倍数体中で同種遺伝子の発現を検査する方法
を記載している。この方法では、cDNAをRNAから
逆転写により生成させ、2つの遺伝子特異的プライマー
を用いることにより増幅する。それら増幅産物をエンド
ヌクレアーゼ開裂により転写産物特異的に(transcript-
specifically) 短くし、それらをそれらの長さに応じて
分離し、そして続いてクローニング及び配列分析により
分析する。この方法も、発現産物を同定するには追加の
クローニング段階が必要なことから、低感度であるとい
う欠点を有している。この方法の更なる欠点は、適する
プライマーをデザインするには、分析される遺伝子内の
少なくとも2つの領域上で遺伝子特異的配列情報が利用
可能でなければならない点である。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、先行技術の欠点を少なくとも部分的に回避すること
ができる遺伝子発現分析方法、特に再現性ある結果が得
られる遺伝子発現分析方法であって、希薄な転写産物を
検出するのに十分な感度を有しかつ追加のクローニング
段階なしに増幅産物の同定が可能になる方法を提供する
ことである。
【0009】
【課題を解決するための手段】この目的は、下記段階を
特徴とする遺伝子ファミリーのメンバーの遺伝子発現の
示差的分析方法を提供することによる本発明の第1態様
により達成される。 (a) 分析すべき1又は幾つかの組織サンプルからのm
RNA分子の単離、(b) 該mRNA分子からのcDN
A第1鎖分子の合成、(c) 興味の対象である遺伝子フ
ァミリーのメンバーの該cDNA第1鎖分子の選択的増
幅であって、興味の対象である該遺伝子ファミリー内の
保存ドメインとハイブリダイズすることができる配列を
有するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの混
合物である該遺伝子ファミリーに特異的な少なくとも1
のプライマーが用いられる選択的増幅、及び該増幅産物
の標識、(d) 1又は幾つかの制限エンドヌクレアーゼ
での開裂による該増幅産物の転写産物特異的短縮化 (tr
anscript-specific shortening) 、(g) 該増幅産物の
それらの長さに応じた分離、及び(h) 該分離増幅産物
の分析。
【0010】本発明の第2態様では、下記段階を特徴と
する遺伝子ファミリーのメンバーの発現を分析する更な
る方法が提供される。 (a) 分析すべき1又は幾つかの組織サンプルからのm
RNA分子の単離、(b) 該mRNA分子からのcDN
A第1鎖分子の合成、(c) 興味の対象である遺伝子フ
ァミリーのメンバーの該cDNA第1鎖分子の選択的増
幅であって、興味の対象である該遺伝子ファミリー内の
保存ドメインとハイブリダイズすることができる配列を
有するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの混
合物である該遺伝子ファミリーに特異的な少なくとも1
のプライマーが用いられる選択的増幅、(d) 1又は幾
つかの制限エンドヌクレアーゼでの開裂による該増幅産
物の転写産物特異的短縮化、(e) 該制限断片の末端へ
のリンカー分子の付加、(f) 該リンカー分子に対して
向けられたプライマー及び遺伝子ファミリー特異的プラ
イマーを用いる、該制限断片の再増幅及び標識、(g)
該再増幅産物のそれらの長さに応じた分離、及び(h)
該分離再増幅産物の分析。
【0011】本発明による方法の第1及び第2態様に手
を加えた態様は、遺伝子ファミリーのメンバーについて
の試験だけでなく、あらゆる任意の転写産物についての
試験を可能にするために、遺伝子ファミリーに特異的な
プライマーを一組のランダムプライマーと置き換える態
様である (DD法に相当する) 。この態様では、例えば
約15〜25ヌクレオチドの長さを有する縮退ランダム
プライマーが好ましく用いられる。これら縮退ランダム
プライマーは、8〜12ヌクレオチドの長い非縮退プラ
イマーと統計的に同じほど頻繁にDNA鋳型に結合する
には、特に好ましくは、十分に高い度合いの縮退を有す
る。このランダムプライマーの縮退の度合いは、オリゴ
ヌクレオチド混合物を用いることにより及び/又はイノ
シンの如きヌクレオチドとハイブリダイズする縮退を取
り込むことにより達成することができる。
【0012】本発明の方法の第1および第2の態様にさ
らに手を加えた態様は、遺伝子ファミリーのメンバーの
みならず可能性のある転写産物を検出するために、増幅
の第1ラウンドの間に、遺伝子ファミリーに特異的なプ
ライマーを、前記mRNAの5’末端又は前記cDNA
の3’末端にそれぞれ付加された特定の配列に対して向
けられたプライマーで置き換えることである。この態様
においては、mRNAからキャップ構造を除去するのに
続いて、一本鎖連結でmRNAの5’末端にRNAオリ
ゴヌクレオチドを連結することが好ましい。該RNAオ
リゴヌクレオチドは、例えば、20〜30塩基の長さを
有してもよく、好ましくは、二本鎖cDNAを開裂する
ために使用される制限酵素のための制限部位を持ってい
る。制限段階が完了し、二本鎖リンカー分子の連結が完
了した後、リンカープライマー及び、遺伝子ファミリー
特異的ドメインに対して向けられたプライマーの代わり
に、cDNAプライマーの配列から、あるいは、前記R
NAオリゴヌクレオチドの配列から誘導されるプライマ
ーを再増幅に用いる。
【0013】遺伝子発現のそのような一般的分析方法
は、下記段階を含む。 (a) 分析すべき1又は幾つかのサンプルからのmRN
A分子の単離、 (aa) 該mRNA分子の5’末端へのアンカー配列の付
加、 (b) 該mRNA分子からのcDNA第1鎖分子の合
成、 (c) 該cDNA第1鎖分子の増幅及び該増幅産物の標
識、 (d) 1又は幾つかの制限エンドヌクレアーゼでの開裂
による該増幅産物の転写産物特異的短縮化、 (g) 該増幅産物のそれらの長さに応じた分離、 (h) 該分離増幅産物の分析。
【0014】また、遺伝子発現の更に好ましい一般的分
析方法であって、下記段階を特徴とする方法が提供され
る。 (a) 1又は幾つかのサンプルからのmRNA分子の単
離、 (aa) 該mRNA分子の5’末端へのアンカー配列の付
加、 (b) 該mRNA分子からのcDNA第1鎖分子の合
成、 (c) 該cDNA第1鎖分子の増幅、 (d) 1又は幾つかの制限エンドヌクレアーゼでの開裂
による該増幅産物の転写産物特異的短縮化、 (e) 該制限断片の末端へのリンカー分子の付加、 (f) 段階 (e) において付加された該リンカー分子に
対して向けられたプライマー及び (i) 段階 (aa) にお
いて付加された該アンカー配列に対して向けられたプラ
イマー又は (ii) 段階 (b) において用いられたcDN
Aプライマー配列に対して向けられたプライマーを用い
る、該制限断片の再増幅及び標識、 (ff) 場合によっては、“繰り込まれた (nested) ”プ
ライマーを用いる第2回目の再増幅及び標識、(fff) 場
合によっては、互いに比較されるべき2つの増幅産物の
プールのサブトラクティブハイブリダイゼーション (su
btractive hybridization)、 (g) 該再増幅産物のそれらの長さに応じた分離、 (h) 該分離再増幅産物の分析。
【0015】本発明による段階 (a) は、分析すべきサ
ンプル、例えば、動物、植物又は微生物から誘導するこ
とができる組織サンプルからのmRNA分子の単離を含
む。好ましくは、幾つかの、即ち少なくとも2の組織サ
ンプルで出発して、それら異なる組織サンプルからの遺
伝子発現の示差的分析を行う。mRNAの単離は、既知
の方法に従って行うことができる (例えば、Sambrook
ら, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 第2編
(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, の特
に第7章を参照のこと) 。
【0016】段階 (aa) は、そのmRNA分子の5’末
端への選択されたアンカー配列の付加を含む。このアン
カー配列は、好ましくはRNAオリゴヌクレオチドを含
み、mRNAを脱キャップした後にT4RNAリガーゼ
によって一本鎖連結することにより、そのmRNA分子
に付加させることができる。この方法では、そのキャッ
プ構造に特異的にハイブリダイズしかつ逆転写段階にお
いてそれ自身の配列に相補的な配列を取り込ませる適当
に修飾されたオリゴヌクレオチドを用いることも可能で
ある。好ましくは、このアンカー配列は、たとえ内部開
裂部位が存在しない場合でも各転写産物の検出を確実に
できるように、後で用いることになる制限酵素のための
開裂部位を含有する。
【0017】本発明による方法の段階 (b) は、mRN
Aからの一本鎖cDNA分子の合成を含む。このために
は、好ましくは、オリゴdTプライマーをそのmRNA
のポリ (A) テールにハイブリダイズさせ、そして逆転
写酵素又はTthポリメラーゼの如き適当な酵素によっ
て延長させる。このオリゴdTプライマーは、5’末端
及び/又は3’末端において延長部分を有することがで
きる。5’末端における延長部分は、例えば、好ましく
は20〜30ヌクレオチド、例えば24ヌクレオチドを
有する任意の配列であってもよい。3’末端における延
長部分は、1又は幾つかのヌクレオチド、好ましくは1
〜3ヌクレオチド、例えば1又は2ヌクレオチドの配列
であってもよい。オリゴdTプライマーの代わりに、c
DNA合成用のランダムプライマーであって、好ましく
は非常に短く、例えば、長さが6〜10ヌクレオチドで
あるランダムプライマー、又はそのmRNA又は既知の
配列、例えば遺伝子ファミリー特異的ドメインに向けら
れたオリゴヌクレオチドに統計的に十分頻繁に結合する
ために高い度合いの縮重を有するランダムプライマーを
用いることも可能である。
【0018】本発明による方法の段階 (c) はcDNA
第2鎖の合成を含む。遺伝子ファミリーのメンバーの発
現を分析するためのこの変法においては、選択された遺
伝子ファミリーのメンバーのcDNA分子の選択的増幅
を行う。この増幅は、好ましくは、それぞれの遺伝子フ
ァミリー内に保存された“ファミリー特異的”ドメイン
とハイブリダイズすることができる遺伝子ファミリー特
異的プライマーを用いるPCR又は他の等温若しくは非
等温増幅方法によって行われる。この遺伝子ファミリー
特異的プライマーは、縮重塩基であってもよく、イノシ
ンの如き非特異的にハイブリダイズする塩基を含有して
もよく、少なくとも5ヌクレオチド、好ましくは少なく
とも15ヌクレオチドの長さを有する。cDNAプライ
マーの配列から誘導されるオリゴヌクレオチドを第2プ
ライマー又はリバースプライマーとして用いることがで
きる。このリバースプライマーは、好ましくは、オリゴ
dTプライマーの5’延長部分の配列から誘導される
(Frohman ら, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 85 (1988),
8998-9002 を参照のこと) 。一方、既知のRNA配列、
例えば、更なる遺伝子ファミリー特異的プライマーに結
合するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして
用いることもできる。
【0019】段階 (c) と組み合わせて、増幅産物の標
識を行うことも可能である。このためには、用いられる
プライマーの一方又は両方を標識することも、標識した
オリゴヌクレオチドを用いることによって標識を行うこ
ともできる。32P、33P又は 35Sの如き放射性マーカー
基、並びに蛍光色素、ビオチン又は抗原、例えばジゴキ
シゲニンが標識に適している。この標識は、増幅又は再
増幅産物を鋳型として用いる別のプライマー延長段階
(リニアPCR (linear PCR)) においても行うことが
できる。一般的遺伝子発現分析のためのこの変法には、
選択的増幅はないが存在する全てのcDNA第1鎖分子
の増幅はある。このためには、段階 (aa) において付加
されたアンカー配列に対して向けられたプライマーが好
ましく用いられる。段階(b) において用いられたcD
NAプライマーの配列から誘導されるプライマー、例え
ばそのcDNAプライマーの5’延長部分に対して向け
られたプライマーが、リバースプライマーとして好まし
く用いられる。最初の増幅ラウンドがこのプライマーの
組み合わせを用いて行われ、数増幅サイクル、例えば1
0増幅サイクルが好ましくは "ロングレンジPCR (lo
ng range PCR) " 条件下で行われる。
【0020】本発明による方法の段階 (d) は、1又は
幾つかの制限酵素での開裂による増幅産物の転写産物特
異的短縮化を含む。統計的に高い確率で増幅産物を開裂
する制限酵素又は制限酵素の組み合わせが好ましく用い
られ、MseI、HinfI又はSau3AIの如き4
塩基認識配列を有する制限酵素が好ましく用いられる。
PCR産物を回収することが意図される場合には、段階
(e) として、段階 (d) において生成した制限断片の
末端に二本鎖リンカー又はアダプター分子を連結する。
リンカーの一方の末端は制限酵素により生成した制限断
片の末端とマッチするのに対し、他方の末端は例えば適
当な一本鎖張り出し末端により連結 (自己連結だけでな
く異種連結も) することができないようにデザインされ
た、異なる末端を有するリンカー分子が好ましく用いら
れる。更に、その後の修飾により、例えばその張り出し
末端を充填することにより、これら制限断片末端をそれ
ぞれに用いるリンカー分子の末端に合わせることができ
る。
【0021】本発明による方法の段階 (f) は、制限断
片を再増幅すること、及びそれが未だ起こらないことを
条件としてその制限断片を標識することを含む。このた
めには、 (i) リンカーに対して向けられたプライマ
ー、及び (ii) 段階 (aa) においてmRNAの5’末端
に付加されたアンカーオリゴヌクレオチドの配列に対し
て向けられたプライマー又は段階 (b) において用いら
れたcDNAプライマーの配列に対して向けられたプラ
イマーを含むプライマーの組み合わせが好ましく用いら
れる。遺伝子ファミリー特異的発現分析の場合には、
(i) 遺伝子ファミリー特異的プライマー、及び (ii)
リンカー分子に対して、アンカーオリゴヌクレオチドに
対して、又はcDNAプライマーの配列に対して向けら
れたプライマー、を含むプライマーの組み合わせが好ま
しく用いられる。用いられる全てのプライマーは、段階
(c) において先に用いられたプライマーと同一であっ
てもよく、それらの3’末端で1又は幾つかの追加の塩
基の延長部分を有してもよい。更に、遺伝子ファミリー
特異的プライマーは、そのファミリー特異的ドメイン内
のそれぞれの増幅産物内に位置する部位に対して向けら
れてもよい。再増幅産物の標識は、段階 (c) に記載し
た通りに行われる。
【0022】蛍光標識プライマーを用いる場合には、蛍
光色を用いてそれぞれのプライマーをコードすることが
できる。例えば、その3’末端において1塩基だけ延長
したプライマーの最端の塩基を幾つかの色、例えば4色
のうちの1色により標識することができる。段階 (c)
においてビオチン標識プライマーを用いる場合には、増
幅産物を再増幅の前にストレプトアビジンでコートした
磁気粒子又はストレプトアビジンでコートした反応容器
に結合させることにより精製することができる。この段
階で得られる約15000の異なるPCR産物を細分割
できるようにするには、 (ファミリー非特異的プライマ
ーを用いるときは) それらPCRプライマーは、好まし
くは、それらの3’末端において延長部分を保持する。
リンカープライマー上の2塩基延長部分は、例えば、リ
バースプライマー上で16の異なる組み合わせと1塩基
延長 (A、C又はGの3種の異なる組み合わせが可能で
ある) を可能にするのに適しているので、異なるプライ
マーの組み合わせで3×16=48の増幅反応を検査す
るべき各サンプルについて行わなければならない。加え
て、この“3’調製物”の代わりとして、リンカープラ
イマーとアンカー配列に対して向けられたプライマーと
を組み合わせることにより、5’において増幅を行うこ
とができる。この変法は、オリゴdT配列を含有するプ
ライマーが必要でないという利点を有する。
【0023】本発明による方法の任意的段階 (ff) は、
“繰り込まれた”プライマー、即ち段階 (f) において
用いたプライマーに比較して1又は2以上の塩基だけそ
れらの3’末端が延長されたプライマーを用いる、段階
(f) において得られた増幅産物の再増幅を含む。この
新たな再増幅は、低濃度で存在する希薄な増幅産物が検
出可能な濃度に増幅され、及びその後に検出されるのを
可能にする (McClellandと Welsh (1994), PCR Methods
Appl. 4, 66-81 ;Ralph ら (1993), Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 90, 10710-10714)。
【0024】本発明による方法の任意的段階(fff) は、
比較されるべき2つの増幅産物プールのサブトラクティ
ブハイブリダイゼーションを含み、それは周波数がそれ
ら2つのプール間で相違するゲル電気泳動により後で検
査するためだけに行われる。これら産物は初期サンプル
中で示差的(differentially)に発現した遺伝子に相当す
るので特に興味深いものであるが、多くの場合、非示差
的に発現した遺伝子についての情報を有する必要はな
い。サブトラクティブハイブリダイゼーションの方法
は、例えば Bautzと Reilly (1966), Science 151, 328
-330及び Zimmermann ら (1980), Cell 21, 709-715 に
記載されている。そのようなサブトラクティブハイブリ
ダイゼーションを行うには、比較されるべき増幅産物の
プールの一方(ドライバー) を標識し、例えばビオチニ
ル化されたプライマーを用いて例えばビオチニル化を行
ってから、他方のプール (テスター) の欠失とハイブリ
ダイズさせることができる。続いて、その標識されたハ
イブリダイゼーション産物を、例えばビオチン標識の場
合にはストレプトアビジンでコートした磁気粒子に結合
させることによって、分離することができる (例えば、
Wangと Brown (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
8, 11505-11509 を参照のこと) 。必要なら、この減数
段階 (subtraction step) を連続して数回行ってもよ
い。次いで、後の検出に利用できる十分な量のDNAを
有するように、溶液中に残っている増幅産物を再度増幅
に付することができる。そのような増幅が減数の後に行
われる場合には、好ましくは検出に適するマーカー基を
この段階までは導入しない。このようにして、例えば、
減数後のハイブリッドを分離するためのビオチン標識
と、断片を可視化するための標識とを区別することが可
能である。
【0025】本発明による方法のこの変法は“あり”又
は“なし”の発現状態の検出に (より多い過剰の標識D
NA,より少ないハイブリダイゼーションサイクル) 並
びに遺伝子のアップレギュレーション又はダウンレギュ
レーションの検出に (より少ない過剰の標識DNA,よ
り多いハイブリダイゼーションサイクル) 適用すること
ができる (Fargnoliら (1990), Analyt. Biochem. 187,
364-373) 。場合によっては、この減数を行った後に基
準化 (normalization)、即ち種々の濃度の個々の増幅産
物の標識を行うこともできる。この基準化は、後の段階
(h) において、分離した増幅産物の分析、つまり低濃
度で存在する希薄転写産物に該当する増幅産物の検出も
確実にできるようにする。そのような基準化は、減数の
後の増幅の前後又は増幅中に行うことができる。適する
基準化方法は、例えば、Ko (1990) Nucleic Acids Res.
19, 5705-5711に記載されている。
【0026】本発明による方法の段階 (g) は、適当な
システム、例えば電気泳動又はHPLCによる増幅産物
及び再増幅産物のそれらの長さに応じた分離を含む。変
性又は未変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動が特
に好ましい。この分離は、単一の反応混合液で行って
も、互いに比較されるべき幾つかの反応混合液で同時に
行ってもよい。分離した産物の可視化は、導入されるマ
ーカー基に応じて、例えばオートラジオグラフィー、化
学発光、又は染色若しくはUV光での照射による標識分
子の特異的検出により行われる。それら産物は、そのゲ
ル (未処理ゲル又は固定ゲル又は乾燥ゲル) 内で又は適
当な支持体、好ましくはハイブリダイゼーション膜に転
写した後で検出することができる。そのような転写には
直接ブロット電気泳動法が特に適している。検出は、銀
化合物又は適当な染料 (例えば、SYBR Green I) を用い
る非特異的DNA染色によっても、又はそれら産物を保
有するハイブリダイゼーション膜を、適するプローブと
ハイブリダイズさせることにより行ってもよい。標識に
蛍光標識を用いるなら、分離と検出を自動配列分析装置
によって行うことも、検出を蛍光ゲルスキャナー又は蛍
光イメージャーによって行うこともできる。
【0027】段階 (h) は、分離した増幅産物及び再増
幅産物の分析を含む。この操作では、興味の対象である
バンドを単離することも再度増幅することもできる。新
たに増幅する場合には、段階 (f) による再増幅と同じ
プライマーを用いることができる。バンドは、例えば、
ポリアクリルアミドゲルから、又は分離した産物を転写
した支持体からそれらを切り取るためのメスを用いるこ
とにより分離することができる。続いて、切り取ったバ
ンドをPCR混合液中でインキュベートして再増幅する
ことができる。この操作で得られた産物は、クローニン
グ段階なしで直接配列決定に用いることができる。サイ
クル配列決定法がこれに特に適している。これまでに用
いたPCRプライマーを配列決定プライマーとして用い
ることができる。また、他の増幅産物により生じるバン
ドの不純物の可能性を排除するために、3’末端を延長
したプライマーを再増幅及び/又は配列決定に用いるこ
とができる。この目的のために用いられるプライマーの
この必要な3’延長は、それらバンドが蛍光標識プライ
マーによって検出される場合、及びその最端の塩基がそ
れらそれぞれの標識によりコードされる異なる蛍光標識
プライマーの混合物が段階 (f) 又は (ff) において用
いられた場合に達成することができる。
【0028】配列決定に用いる前に、それら再増幅産物
の純度を、好ましくは他の変性ポリアクリルアミドゲル
での電気泳動により点検することができる。所望の増幅
産物とは異なる大きさの増幅産物が存在する場合には、
所望のバンドを再度切り取った後で再増幅することによ
り更なる精製を行うことが可能である。これら再増幅産
物を更にサザン、ノーザン又は in situハイブリダイゼ
ーション実験に用いることもできる。更に、それらが依
然として未知の核酸配列を有することを前提として、そ
れらを用いて適切なライブラリーからマッチングゲノミ
ック又はcDNAクローンを単離することができる。
【0029】増幅反応で得られる異なる産物の数がずっ
と少ない場合は、例えば前に用いたプライマーに比較し
て少なくとも1塩基の延長部分をそれらの3’末端にお
いて有する適当な選択プライマーを用いることにより、
個々の産物を全反応液から直接再増幅することができ
る。そのような状況は、特に、段階 (fff)に従って減数
を幾つかの並列混合液中で行った場合に発生するであろ
う。各減数反応液は、僅かな異なる増幅産物、例えば5
〜10の異なる増幅産物しか含有しないであろう。これ
らそれぞれを減数反応液からの増幅により選択的に個別
に単離するには、前に用いた増幅プライマーに隣接する
幾つかの塩基についての知見が助けとなる。この情報
は、例えば、それぞれが減数の後に行われる増幅用の4
つのプライマーの混合物を用いることにより得ることが
できる。これらプライマーはそれらの3’末端において
4つの可能な塩基のうちの1つにより延長され、そして
その色がプライマーのそれぞれの最端の塩基を明確にコ
ードする蛍光標識を保有している。増幅産物を分離して
UV光で検査すると、バンドの蛍光色で、対応する産物
中に取り込まれたプライマーであって続いて選択的増幅
に用いることができるプライマーについて演繹を行うの
が可能になる。十分な数のコード可能性 (例えば、
1 、42 =16、43 =64等) を得るためには、適
当な蛍光でコードされたプライマーをそれぞれの場合に
おいて未標識リバースプライマーと幾つかの並行した混
合物に混合して増幅に用いることができる。
【0030】更に、本発明による方法に対して多くの変
法が考えられる。例えば、段階 (b) において、第1鎖
cDNAの3’末端に特定の核酸配列を供することがで
き、そして遺伝子ファミリー特異的プライマーに加え
て、この特定核酸配列に対して向けられるオリゴヌクレ
オチドをその後の段階 (c) における増幅にリバースプ
ライマーとして用いることができる。この特定核酸配列
は、例えば、好ましくは20〜30ヌクレオチドの長さ
を有するホモポリマー又は任意の配列を含む。本発明に
よる方法の更なる変法は、例えば、第1鎖cDNAを自
己連結により、例えばRNAリガーゼでの連結反応で、
オリゴマー分子及び/又は環状分子に変換すること、及
び場合によりその3’末端において好ましくは1〜3ヌ
クレオチドの延長部分を有しかつ該cDNAプライマー
に少なくとも部分的に相補的である下流方向オリゴヌク
レオチドを、段階 (c) における後の増幅用に、遺伝子
ファミリー特異的プライマーに加えてリバースプライマ
ーとして用いること、を含む。
【0031】本発明による方法のなお更なる変法は、前
もって増幅することなく、二本鎖cDNA上で段階
(d) における制限開裂を行ってしまう方法である。こ
の操作で、完全な第1鎖cDNAの増幅の間に失われる
かも知れない数kbの長さの非常に長い転写産物を失う
のを回避できる。更に、本発明による方法及び以下で更
に説明するこの方法の変法においては、得られるバンド
パターンの再現性を高めるために、用いられるオリゴヌ
クレオチドプライマーが好ましくは少なくとも15ヌク
レオチド、特に好ましくは少なくとも18ヌクレオチド
の長さを有することである。更に、このオリゴヌクレオ
チドプライマーは、合成核酸類似体又は誘導体により、
例えばペプチド性核酸 (PNA) により置換することも
できる。但し、それらがそれらの3’末端においてポリ
メラーゼにより受け入れられる3’−OH基を有するこ
とを条件とする。
【0032】更には、本発明による方法及びその変法に
おいて用いられるオリゴヌクレオチド、即ちアンカーオ
リゴヌクレオチド、cDNAプライマー、増幅プライマ
ー等は、制限酵素のための1又は幾つかの認識部位又は
開裂部位を含有することができる。このようにして、末
端の充填をリンカー連結の前に行わなくても、制限酵素
によって開裂されない増幅産物の損失を回避することが
できる。本発明による方法は、既知の示差的表示法に比
較して驚くほどの利点を有する。というのは、この場合
には、増幅反応にとって最適な長さを有する完璧なマッ
チングプライマーが用いられるからである。これにより
この方法の高い再現性がもたらされる。対照的に、しば
しば非常に短いプライマーが用いられかつ結合プライマ
ーのミス対合が認容される先行技術のDD実験では、そ
の方法が一定の方法パラメーター、例えばPCRの間の
アニーリング温度に極端に依存しているので、不十分な
再現性しか達成されない (Bertioliら, 前記文献) 。D
DRT実験で見られるこの乏しい再現性の結果、人工物
それ自体を検出するのに、1回の反応当たり少なくとも
1回又は2回の反復実験が行われなければならない。一
定の確率を有する全ての転写産物の少なくとも大半を検
出するのに多数の異なるプライマーの組み合わせが必要
であること (Bauer ら, 前記文献) と相まって、先行技
術のDDRTの操作は極端に面倒である。それにもかか
わらず、この方法には、任意のプライマーの統計的結合
特性に起因して、全ての転写産物の検出を請け合うこと
ができる決まった数のプライマーの組み合わせはない。
対照的に、本発明による方法では、反復実験は不必要で
あり、そして完全な検査に要求されるプライマーの組み
合わせの数を検査組織中の転写産物の期待数 (例えば、
15000) 及び1増幅反応で見込まれる産物の数 (例
えば、100) から簡単に計算することができる。この
方法では、各転写産物の検出は、cDNAプライマーと
して又はアンカーとして用いられるオリゴヌクレオチド
が段階 (d) において用いられる制限酵素のための開裂
部位を含有するという事実により保証され得る。更に
は、反復反応の省略で、30又はそれ以上の異なるRN
Aサンプルを単一ゲル上で検査することが可能となる。
【0033】本発明による方法のDD法に比べた更なる
利点は、全ての検査バンドの示差的発現がノーザン実験
により確認できるという点である。対照的に、先行技術
のDD実験の場合には、得られた全部で15バンドのう
ちの5バンドしか示差的に発現されることが確認でき
ず、4は誤陽性シグナルを示し、他の6バンドはノーザ
ンブロットで全くシグナルを示さなかった (Liang ら,
前記文献) 。更に、本発明による方法は、1転写産物の
多検出を排除する。これは、非リン酸化オリゴヌクレオ
チドをリンカー調製に用いると、増幅は転写産物の決ま
った領域 (その3’末端、5’末端又はファミリー特異
的ドメイン) とリンカーの間で起こることができるに過
ぎず、2つの連結されたリンカー間では決して起こらな
いという事実の結果である。対照的に、先行技術のDD
RT実験では、所与の転写産物は異なるプライマーの組
み合わせにより認識され得るので多検出される。かくし
て、例えば1種かつ同一の転写産物が異なる5’プライ
マーと異なる3’プライマーとの組み合わせによって生
じる15の異なるDDRTバンドにより表されることに
なる (Linskensら (1995), Nucleic Acids Res. 23, 32
44-3251)。
【0034】更には、本発明による方法で得られる産物
は、クローニング段階を必要とすることなく、再増幅後
に直接に簡単なやり方で配列決定され得る。この配列決
定は、好ましくは、サイクルシークエンス法 (cycle se
quencing technique) により行われる。この方法は、約
10ヌクレオチドの長さを有するDD実験で用いられる
プライマーには適していない。更には、先行技術のDD
RT産物にはしばしば2分子の同じプライマーが傍らに
あり、配列決定用プライマーとしてそれぞれの増幅プラ
イマーを用いることを排除する (Guimaraes ら (1995),
Nucleic AcidsRes. 23, 1832-1833)。
【0035】本発明による方法の更なる利点は、サブト
ラクティブハイブリダイゼーションが段階(fff) におい
て行われることを前提する場合、行わなければならない
個々の反応の数並びに検査しなければならない増幅産物
を大きく減少する点である。先行技術のDD実験を行う
には数百のPCR調製物が必要で、それらは後で数百の
ポリアクリルアミドゲルのレーンに分離される (Liang
と Pardee,前記文献;Bauer ら, 前記文献) のに対し
て、本発明による方法では、プライマーの共通の結合部
位の配列と比較して、各場合においてプライマーの3’
末端が1又は2塩基だけ延長されたものを段階 (f) で
用いることにより、段階 (b) において生成したcDN
Aプールを幾つかの(例えば8又は12の)サブプール
に細分割することが可能である。次いで、互いに一致す
るサブプールを並列的に減数し、そして各減数産物をそ
れ自体のゲルのレーン内で分析するのである。
【0036】“cDNA−RDA”(Representational
Difference Analysis of cDNA ;Hubankと Schatz (199
4), Nucleic Acids Res. 22, 5640-5648) の既知方法に
比べると、本発明による方法は幾つかの利点を有する。
第1に、各転写産物は厳密に1の増幅産物により表され
るので、幾つかの転写産物の望ましくない損失並びに1
種かつ同じ転写産物の多検出が回避される。第2に、c
DNA−RDAと比較するだけでなく完全cDNA分子
のサブトラクティブハイブリダイゼーションと比較して
もハイブリダイゼーション反応の複雑さが少ないこと
が、より完全かつより迅速な反応経過をもたらす (Sarg
ent (1987), Methods in Enzymol. 152, 423-432) 。第
3に、本発明による方法の範囲内で与えられる段階が、
希薄な転写産物の検出を可能にする。
【0037】更に、DD産物の配列決定は、同じ大きさ
の汚染性cDNA分子の共存によりしばしば妨害され
る。この理由故に、更なる分析のためにDD産物の複雑
な精製操作が必要となる (Liang と Pardee,前記文献;
Bauer ら, 前記文献;Liら (1994), Nucleic Acids Re
s. 22, 1764-1765)。先行技術のDD法とは対照的に、
本発明による方法は、更に、所与の転写産物のシグナル
強度に関する結果の少なくとも半定量的な分析を可能に
する。このことは、本発明による方法を対照として行わ
れるノーザンハイブリダイゼーションと比較することに
より証明される。
【0038】遺伝子ファミリーの発現分析に本発明によ
る方法を用いる更なる利点は、生成する産物が概してフ
ァミリー特異的ドメイン並びに得られるcDNA分子の
分類と同定を可能にするフランキング配列を含有する点
である。対照的に、DD法の場合には、非常に限られた
値の配列情報しかもたらさない3’非翻訳領域が通常好
ましく得られる。その感度から、本発明による方法は、
興味の対象である転写産物を2,3の又は同数の個々の
細胞から分析するのにも用いることができる。かくし
て、この方法を例えば発生生物学に用いて、新規な遺伝
子を単離すること、興味の対象である遺伝子ファミリー
の新規なメンバーを同定すること、生物の異なるライフ
ステージを厳密に規定すること、及び細胞のライフサイ
クルを検査することができるので、例えば、癌の研究に
おいて正常なライフサイクルからの逸脱を検査すること
ができる。
【0039】更に、本発明は上記の方法の変法に関す
る。これら変法のうちの1つは、一般的発現分析のため
の態様において、cDNA第2鎖合成を他の簡便なやり
方で行うものである。例えば、第2鎖合成用のプライマ
ー結合部位を得るために、一本鎖cDNAが末端ヘアピ
ンループを形成する傾向を利用することも、特定核酸配
列、例えばホモポリマー又は一本鎖オリゴヌクレオチド
を第1鎖cDNAに付加することもできる (例えば、Sa
mbrookら, 前記文献, 特に第8章;Trouttら (1992), P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9823-9825 を参照のこ
と) 。本発明の方法のなお更なる変法は、上記の通り第
1鎖cDNAに特定核酸配列が供され、そして段階
(c) の増幅においてその付加された特定核酸配列に対
して向けられたオリゴヌクレオチドが遺伝子ファミリー
プライマーの代わりに第1プライマーとして用いられ、
そしてそのcDNAプライマーの配列から誘導されたオ
リゴヌクレオチドがリバースプライマーとして用いられ
るものである。このリバースプライマーは、場合により
3’延長部分を有することができる。特定核酸配列は、
ホモポリマー又は任意の配列を含むことができる。この
特定核酸配列は、好ましくは第1鎖cDNAに、好まし
くは連結により、例えばRNAリガーゼにより連結され
る。1を越えるオリゴヌクレオチド分子がそのcDNA
に連結するのを阻止するために、それをその3’末端に
おいて (例えば、アミノ基の導入により) 修飾すること
ができる。
【0040】本発明による方法のなお更なる変法におい
ては、第1鎖cDNAを自己連結により、例えばRNA
リガーゼで、オリゴマー分子及び/又は環状分子に変換
し、そして段階 (c) における後の増幅において、この
cDNAプライマーに対して向けられた2本のオリゴヌ
クレオチドを、その一方は上流に、他方は下流に向けて
いるプライマーとして用いる。制限及び連結段階後の再
増幅は、リンカーに対して向けられたプライマーに加え
て、この上流及び/又は下流プライマーで行うことがで
きる。これら2本のプライマーのそれぞれは、その3’
末端において延長部分を有する。即ち、1又は幾つかの
塩基により延長されている。これら上流及び下流プライ
マーは、増幅の間に両プライマーがハイブリダイゼーシ
ョンするのを回避するために、好ましくは、それらが重
複しないか又は僅かに重複するに過ぎないように選択さ
れる。
【0041】サブトラクティブハイブリダイゼーション
に基づく遺伝子の示差的発現分析の公知方法に比較する
と、本発明による方法は向上した再現性により際立って
いるので日常的に用いることができる。この向上した再
現性は、先行技術ではしばしば数千bpまでの長さを有
するcDNA分子が用いられ、更には完全なmRNA又
はcDNAが用いられてきたという事実に基づくもので
ある。これら問題は、本発明に従う方法により得られた
増幅産物を分析するためにサブトラクティブハイブリダ
イゼーションを用いる場合には起こらない。これら増幅
産物は先行技術のcDNA分子に比較して実質的に短く
されており、またプライマーのデザイン(例えば、他の
点では同一のプライマーについて異なる3’延長部分を
選択すること) のために、増幅産物の1プールを数サブ
プール、例えば8、12又は16のサブプールに簡単に
細分割することができる。次いで、互いに一致するサブ
プールを並列的に数することができる。
【0042】本発明のなお更なる主題は、遺伝子の発現
を分析するための、特に本発明による方法に用いるため
の試薬キットである。この試薬キットは、好ましくは空
間的に離れた配置で、下記のものを含む。 (a) cDNA第1鎖合成のための酵素、 (b) cDNA第2鎖の合成のための及びDNA断片の
増幅のための少なくとも1の酵素、 (c) 場合により、少なくとも1の制限酵素、 (d) 場合により、少なくとも1の二本鎖DNAリンカ
ー分子及び該リンカー分子をDNA断片に付加するため
の物質、 (e) 場合により、少なくとも1の一本鎖RNAオリゴ
ヌクレオチド及び該RNAオリゴヌクレオチドをmRN
A分子の5’末端に付加するための物質、 (f) (i) 少なくとも1の遺伝子ファミリー特異的プ
ライマー、 (ii) 少なくとも1のオリゴdTヌクレオチ
ド、(iii) 該DNAリンカー分子の配列から誘導される
少なくとも1のプライマー、 (iv) 該RNAオリゴヌク
レオチドの配列から誘導されるプライマー、 (v) 一組
のランダムプライマー、 (vi) 3’延長部分及び/又は
5’延長部分を有する (i) 〜 (v) のプライマー、(v
ii) マーカー基を保有する (i) 〜 (vi) のプライマ
ー、及び (viii) 標識のタイプ、例えば、蛍光標識の色
によりコードされる3’延長部分を含有する (vii)のプ
ライマー、を含む群から選ばれる一本鎖核酸プライマー
分子、 (g) 核酸を標識及び検出するための物質、 (h) 場合により、RNアーゼ阻害物質、ヌクレオチ
ド、緩衝液、ストレプトアビジンでコートした反応容器
又は磁気粒子の如き更なる試薬。 このキットの個々の試薬は、必要に応じて別々に得るこ
とができる。これら試薬に加えて、このキットは、それ
ぞれの場合に用いられる酵素に適する緩衝液も含有する
ことができる。
【0043】更に、以下の図面、配列の説明及び実施例
により本発明を説明する。図1は、遺伝子の一般的発現
分析のための本発明による方法の1つの態様を図示した
ものであり;図2は、遺伝子の一般的発現分析のための
本発明による方法の更なる態様であって、減数段階及び
蛍光でコードされる再増幅用のプライマーの使用を含む
態様を図示したものであり;図3は、遺伝子ファミリー
の発現分析のための本発明による方法の更なる態様を図
示したものであり;図4は、10の独立した実験により
証明された本発明の方法の再現性を示し;図5は、本発
明による方法を用いて示差的に発現されたMADSボッ
クス遺伝子の単離結果を示し;図6は、本発明による方
法により同定された遺伝子をMADSボックス遺伝子フ
ァミリーに割り当てた図である。
【0044】配列番号1は、RNAオリゴヌクレオチド
の配列を示し、配列番号2は、プライマーCT29Vの
配列を示し、配列番号3は、プライマーAP23の配列
を示し、配列番号4は、プライマーLT20の配列を示
し、配列番号5は、プライマーLT24の配列を示し、
配列番号6は、プライマーPO38の配列を示し、配列
番号7は、プライマーPO41の配列を示し、配列番号
8は、プライマーPO42の配列を示し、配列番号9
は、プライマーPO43の配列を示し、配列番号10
は、プライマーLR32の配列を示し、配列番号11
は、プライマーBLT18の配列を示し、配列番号12
は、プライマーPO46の配列を示し、配列番号13
は、プライマーPO09の配列を示し、そして配列番号
14は、MADSドメインコンセンサス配列を示す。
【0045】
【実施例】実施例1: RNAの単離 インドトウモロコシ (トウモロコシ亜種 mays)、近交系
T232及びブタモトコシ (トウモロコシ亜種 parvigl
umis) Central Balsas品種を温室内で7〜8週間栽培し
た。この時点で、これら植物は Chengら (Am. J. Bot.
70 (1983), 450-462) により定義された発育段階I及び
Jを示した。雄花及び雌花を採取し、液体窒素中で凍結
し、そして Sambrook ら (Molecular Cloning: A Labor
atory Manual, 第2編 (1989), Cold Spring Harbor La
boratory Press) の塩化グアニジニウム単離法に従って
全RNAを単離するのに用いた。
【0046】このRNA調製物の品質をトウモロコシグ
リセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ
(GAPDH) プローブを用いるノーザンハイブリダイ
ゼーション (Sambrookら, 前記文献) によって試験し
た。ゲノミックDNAを除去するために、50μgの全
RNAを1μl のRNアーゼ阻害物質RNアシン (RNas
in) (Promega, 40U/μl ) 及び5μl のRQ1RN
アーゼ不含DNアーゼ (Promega,1U/μl ) と共に1
00μl の逆転写酵素 (RT) 緩衝液 (Frohmanら, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 85 (1988), 8998-9002) 中
で37℃で15分間インキュベートした。それらサンプ
ルをトリス/EDTA (TE) で飽和したフェノールで
及びクロロホルム/イソアミルアルコール (24:1)
で抽出してエタノールで析出させた。20000×gで
0℃で30分間遠心分離した後、その全RNAを1 mM
EDTA (pH7.5) 中に溶かした。ポリ (A) +
RNAをオリゴ (dT) ダイナビーズ(Dynal, Oslo) を
用いて単離した。
【0047】実施例2:性依存的遺伝子発現の分析 まずトウモロコシ雄花及び雌花から単離した全RNAを
脱リン酸化した。このために、50μgの析出RNA
を、ピロ炭酸ジエチルで処理した40μl の水 (DEP
C水) 、5μl の10×AP緩衝液 (Boehringer Mannh
eim)、1μl の50 mM ジチオスレイトール及び1.5
μl のRNアシン(Promega) の混合物中に溶かした。4
μl のアルカリ性ホスファターゼ (AP;1U/μL; B
oehringerMannheim) を加えた後、37℃で1時間イン
キュベートした。アルカリ性ホスファターゼを不活性化
するため、1μgのプロテイナーゼK(Boehringer Mann
heim) を加えて37℃で1時間インキュベートした。こ
れらサンプルをTE飽和フェノールで及びクロロホルム
/イソアミルアルコールで上記の通り抽出してエタノー
ルで析出させた。それら析出物を各々40μl のDEP
C水中に溶かした。
【0048】5μl の10×TAP緩衝液、1.25μ
l のRNアシン、1μl の100 mM ATP及びタバコ
由来の3μl の酸性ピロホスファターゼ (TAP;5U
/μL; Epicentre) を加えた後、脱キャップさせるため
に37℃で1時間インキュベートした。この反応混合液
をまずフェノールで抽出してから、クロロホルム/イソ
アミルアルコールで抽出してエタノールで析出させた。
続いて、そのRNAを100μl の溶離緩衝液(Dynal)
中に溶かして、ポリ (A) + mRNAをオリゴ(dT)
ダイナビーズ(Dynal) を用いて単離した。
【0049】4.2μl の水で溶離させた後、それを
1.8μl の連結ミックス (3μl の10×RNAリガ
ーゼ緩衝液 [Boehringer Mannheim]、0.75μl のR
Nアシン、1.5μl の2 mM ATP、1.5μl のT
4−RNAリガーゼ [10U/μL; Boehringer Mannhe
im] 及び1μl の水中の1μg のアンカーRNAオリゴ
ヌクレオチド 5'-CAC GAU CUG AGG CCG AUC GAU UCA-3'
から調製したもの) と混合して16℃で20時間連結し
た。その連結調製物をエタノールで析出させて、その析
出物を2.8μl のDEPC水中に吸収させた。4.3
μl の5×RT緩衝液 (Boehringer Mannheim);dAT
P、dTTP、dGTP及びdCTPの1μl の20 m
M 溶液;1μl のcDNAプライマーCT29V (30
pmol/μl ;5'-ACC TAC GTG CAG AT15V-3', V=G、A 又
は C) ;及び1μl のM−MuL V逆転写酵素 (20
U/μL; Boehringer Mannheim)の1.5μl の混合液
を逆転写用に加えて37℃で1時間続いて42℃で30
分間インキュベートした。それら反応液をTE緩衝液で
20μl にした。
【0050】このようにして得られた各2μl のアンカ
ーcDNAプールを氷上で28.5μl の水;5μl の
10×PCR緩衝液 (670 mM トリス/HCl,pH
8.8;170 mM (NH4)2SO4 ;1%ツィーン20) ;
dATP、dTTP、dGTP及びdCTPの1 mM 溶
液を5μl ;8μl の10 mM MgCl2 ;1μl の水中の
各々0.1pmolのプライマーCT29V及びAP23
(5'-CAC GAT CTG AGG CCG ATC GAT TC-3') ;及び0.
5μl のTaqDNAポリメラーゼ (5U/μL;Boehri
nger Mannheim) とcDNA第2鎖合成及び増幅用に混
合した。これら反応液をパラフィンオイルの層で覆って
95℃に予熱した Trioblockサーモサイクラー (Biomet
ra) に入れた。始めに95℃で5分間変性した後、95
℃で30秒間の変性、72℃で2分間のアニーリング及
び延長からなる増幅プログラムを20サイクル行った。
反応液を QiaQuick カラム(Quiagen) で精製し、20μ
l のTEで溶離を行った。2.3μl の10×緩衝液A
(Boehringer Mannheim) 及び1μl のSau3AI (4
U/μl ; Boehringer Mannheim) を加えた後、37℃
で1.5時間開裂させ、それら反応物をエタノールで析
出させた。
【0051】オリゴクレオチドLT20 (5'-TCA CAT G
CT AAG TCT CGC GA-3') 及びLT24(5'-GAT CTC GCG
AGA CTT AGC ATG TGA C-3') 各々を1.5nmolずつ50
μl容量の水中に一緒に混合して90℃に3分間加熱し
た。二本鎖リンカーを生成させるために、この反応混合
液を50 mM トリス/HCl (pH7.5) 及び10mM
MgCl2 に調節して4℃にゆっくり冷却した。析出した
制限断片を Cobianchiと Wilson (Methods Enzymol. 15
2 (1987), 94-110) に従う総容量が4μl の連結混合液
中に吸収させて記載された通りに作った0.5μl のリ
ンカーを加え、そして16℃で16時間連結した。未連
結リンカーを QiaQuick カラムで除去した。
【0052】この精製連結反応液の5分の1を10μl
の10×PCR緩衝液;16μl の10 mM MgCl2 ;5
μl の1 mM dATP、dTTP、dGTP及びdCT
P;各々20pmolずつのCT29V及びLT24と混合
して続く増幅用に100μlの総容量にした。サーモサ
イクラー中で95℃に5分間加熱した後、5UのTaq
DNAポリメラーゼを加えて、95℃で30秒間の変
性、72℃で90秒間のアニーリング及び延長の条件下
で20サイクルの増幅を行った。
【0053】各場合において1μl の増幅産物を第2ラ
ウンド増幅に用いた。これを30μl の総容量で30サ
イクル行い、かつ各場合においてジゴキシゲニン標識プ
ライマーDIG−CT29A (配列はCT29Vと同一
であるが縮退最端塩基“V”の代わりに絶対最端塩基
“A”が付いている) 、DIG−CT29C又はDIG
−CT29Gのうちの1つとLT24に比較して2塩基
だけ延長された16の可能なプライマーLT24NNの
うちの1つとの組み合わせを用いた以外は、上記の条件
に従った。各場合において、3μl の反応液を Promega
からの1.5μlのサイクル続発停止溶液 (cycle seque
ncing stop solution) と混合した。
【0054】次いで、比較されるべき互いの組織に対応
する調製物を変性3.5%ポリアクリルアミドゲルの2
つのレーン上に互いに隣り合わせて載せた。DIG標識
DNA分子量マーカー VIII (Boehringer Mannheim) を
長さスタンダードとして空いているレーン上に載せた。
この電気泳動分離及びナイロン膜への転写は、GATC
1500配列分析装置(MWG Biotech) によってメーカー
の使用説明書に従って行った。ナイロン膜をメーカーの
使用説明書に従って核酸の化学発光検出用に非固定状態
で処理した。X線フィルム (Kodak X-Omat) を露光した
後、これら膜とフィルムを合わせ、そして示差バンドを
メスで膜から切り取った。それぞれの膜片を50μl の
再増幅反応液中で上記の条件下でインキュベートし、3
0〜40サイクルを用いた。この増幅がうまくいったこ
と及びその増幅産物の純度をアガロースゲル電気泳動に
よって点検した。
【0055】実施例3:性依存的MADSボックス遺伝
子発現の分析 実施例1で雄花及び雌花から単離したmRNAをRAC
E手順 (Frohman ら,前記文献) に従って一本鎖cDN
Aに変換してcDNAプールを得た。Frohmanらの前記
文献に記載されたRACEアダプタープライマー及び遺
伝子ファミリー特異的MADSボックスプライマーの混
合物を用いて、このcDNAプールでPCRを行った。
全てのMADSボックスプライマーは、高度に保存され
たアミノ酸モチーフの誘導体をコードしかつ植物から知
られている全ての変異を含む遺伝子ファミリー特異的配
列に対して向けられたものであった。最高の特異性を達
成するために、縮退の度合いをできるだけ低く抑えた。
この明細書で用いたプライマーは次の通りである。PO
38 (アミノ酸配列 "IKRIEN" に対して向けられたも
の) ,5'-GAT CAA G(A/C)G (G/C)AT CGA GAA-3' ;PO
41 ("MKRIEN"に対するもの) ,5'-GAT GAAG(A/C)G (G
/C)AT CGA GAA-3' ;PO42 ("IKHIEN"に対するもの)
,5'-GAT CAA GCA (C/T)AT CGA GAA-3' ;PO43 ("
IKKIEN"に対するもの) ,5'-GAT CAAGAA GAT CGA GAA-
3' 。
【0056】プライマーPO38を用いて次の通りに増
幅を行った。まず最初に67 mM トリス/HCl,pH
8.8;17 mM (NH4)2SO4 ;0.1%ツィーン20;
0.8 mM MgCl2 ;各々20μl ずつのdNTP;1.
5pmolのプライマーPO38;及び1μl のそれぞれの
cDNAプールを含有する50μl の反応混合液を一緒
に氷の上にピペッティングした。パラフィンオイルの層
で覆った後、これら反応混合液を Trioblockサーモサイ
クラー(Biometra, Gottingen) 中で95℃に5分間加熱
した。65℃に冷やした後、2.5UのTaqDNAポ
リメラーゼ(Boehringer Mannheim) を加えた。95℃で
30秒間の変性、54℃で100秒間のアニーリング、
72℃で2分間の延長からなるパラメーターを用いて3
0サイクルのリニア増幅 (linear amplification) を行
った。続いてこれら反応混合液を65℃に冷やした。
【0057】指数関数的増幅のために、100μM の諸
dNTP、15pmolのRACEアダプタープライマー及
びプライマーPO38と2.5UのTaqDNAポリメ
ラーゼを含有する65℃に予熱した50μl の反応混合
液をこのリニア増幅反応液に加えた。次いで、上記のパ
ラメーターを用いてPCRを24サイクル行った後、続
いて72℃で10分間延長を行った。それらPCR産物
を QiaQuick カラム(Quiagen, Hilden) で精製した。1
/5 (10μl ) の溶離液を15Uの制限酵素MseI
(New England Biolads)、HinfI又はSau3AI
(Boehringer Mannheim) と共にそれぞれの制限緩衝液中
で37℃で3時間インキュベートした。続いて65℃で
10分間インキュベートした後、核酸をエタノールで析
出させ、遠心分離 (30分間、4℃で20000×g)
により単離した。その残渣を5μl のTE中に再懸濁さ
せた。
【0058】所望により、以下に記載する通りに放射性
プライマー延長反応をこの段階で行ってもよい。一方、
以下に記載する通りに再増幅用にリンカー連結を行って
もよい。このためには、1/2μl の再懸濁制限断片を
10μl の充填用混合液 (50 mM トリス/HCl,p
H8.0;6 mM MgCl2 ;10 mM ジチオスレイトー
ル;各々100μMずつのdNTP;1mL当たり40
μgのウシ胎児血清アルブミン;0.5U T4−DN
Aポリメラーゼ (Boehringer Mannheim)) 中で37℃で
1時間インキュベートした。次いで、それら断片をエタ
ノールで析出させて上記の通りに単離した。そのペレッ
トを2μl のTE緩衝液中に再懸濁させた。各々1.2
5nmolずつのオリゴヌクレオチドLR32 (5'-ACT CGA
TTC TCA ACC CGA AAG TAT AGA TCC CA-3') 及びBTL
18(5'-TGG GAT CTA TAC TTT CAA-3') から実施例2の
通りに二本鎖リンカーを調製した。実施例2に記載した
通りにこれらリンカーを末端を充填したこれら制限断片
に連結した。この操作では、各場合において、0.5μ
l のリンカーと2μl の再懸濁末端充填反応液を4μl
の連結緩衝液中でインキュベートした。未連結リンカー
は QiaQuick カラムで除去した。
【0059】次いで、5μl の精製連結混合液を鋳型と
して用いて上記のPCR条件下で再増幅を全部で15サ
イクル行った。それぞれのMADSボックスプライマー
(例えば、PO38) を "fmolDNA配列分析システ
ム" (Promega) に同封されている使用説明書に従って32
Pで標識した。次いで、1/2μl のその再増幅産物を
用いて、50μMの諸dNTP、1UのTaqDNAポ
リメラーゼ及び0.4μl の標識MADSボックスプラ
イマーを含有する10μl のプライマー延長混合液を調
製した。これら反応混合液を予熱 (95℃) サーモサイ
クラーのウェルに入れて始めに95℃で3分間変性した
後、95℃で30秒間、54℃で30秒間及び72℃で
1分間からなるプログラムを30サイクル行った。最終
延長後、Promega からの5μl のサイクル続発停止溶液
を加えた。"Sequamark" 10bpラダー (10 bp ladde
r) (Research Genetics, Huntsville, AL) を長さスタ
ンダードとして調製した。ゲル電気泳動分析用に、この
延長混合液を70℃に2分間加熱して2μl を変性5%
アクリルアミドゲルに適用した。これらゲルを45Wで
3時間流し、5%酢酸/10%エタノール中に固定し、
そして風乾した。次いで、これらゲルを Kodak X-Omat
X線フィルム上で4〜12時間X線に曝した。実施例3
で行った反応手順を図3に図示した。
【0060】実施例4:ブタモトコシとトウモロコシ間
のMADSボックス遺伝子発現の比較 実施例1でトウモロコシとブタモトコシの雌花から単離
したDNAを実施例3に記載した通りに第1鎖cDNA
に変換して転写産物特異長の増幅産物の合成に用いた。
この操作では、この場合にはそれらの5’末端にビオチ
ン基を保有するオリゴヌクレオチドPO38、PO4
1、PO42及びPO43の混合物を、MADSボック
ス遺伝子ファミリーのメンバーに相当するcDNA分子
の選択的増幅に用いた。制限酵素としてのMseIと共
にインキュベートした後、これらビオチン標識延長産物
をストレプトアビジン被覆磁気粒子(Dynal) によって分
離して、実施例2及び3に記載した通りにリンカーの連
結に用いた。オリゴヌクレオチドPO46 5'-(A/C)G(G
/C)CAG GT(G/C) AC(C/G) T(A/T)C-3' ("RQVT(F/Y)"に対
して向けられたもの) を再増幅に用いた。こうして得ら
れた増幅産物を記載された通りに放射性標識して6%配
列分析ゲル上で分離した。
【0061】実施例5:増幅産物の分析と同定 興味の対象であるバンドを実施例3及び4で得られたゲ
ルから切り取った。そこに含有される核酸を25μl の
TE緩衝液中に溶離した。各場合において、5μl の溶
離液を上記のPCR条件を用いて50μl の容量で30
サイクル再増幅した。それぞれのMADSボックスプラ
イマー及びLR32の塩基1〜21と同一であるオリゴ
ヌクレオチドLR21をプライマーとして用いた。0.
5μl の再増幅バンドを Promegaからの pmol サイクル
配列分析キットの使用説明書に従って配列分析した。こ
の際、LR32、各場合に用いたそれぞれのMADSボ
ックスPCRプライマー又は内部MADSボックスプラ
イマーPO09(5'-GAA GGC GTA CGA GCT CTC GGT GCT-
3') のいずれかをプライマーとして用いた。アニーリン
グ温度はLR32及びPO09については70℃で、他
のMADSボックスプライマーについては50℃であっ
た。次いで、切り取ったバンドからの配列情報を用いて
cDNAライブラリー又はゲノムライブラリー中の対応
するクローンを同定した。
【0062】性依存的に発現したMADSボックス遺伝
子の単離の結果を図5に示す。奇数レーンは雄花からの
転写産物に対応し、偶数レーンは雌花からの転写産物に
対応する。遺伝子ZMM1をプライマーPO38及び制
限酵素Sau3AIを用いて得た。その配列ラダー(seq
uence ladder) は、LR32を配列分析プライマーとし
て用いる、切り取って増幅したバンドの直接配列分析に
より得られたZMM1配列の一部を示す。ZMM2を同
定するのにプライマーPO42及び酵素HinfIを用
いた。ZMM3及びZAG1は、プライマーPO41及
びMseIを用いて得られた。ZMM7及びZAG2
は、プライマーPO43及びMseIで得られた。Mで
表されるレーンは、核酸長さマーカーに該当する。
【0063】本発明による方法により同定された遺伝子
の類別を図6に示す。酵母、動物及び植物からのMAD
Sドメインの101の既知配列との比較で、レーン1に
示すMADSドメインコンセンサス配列が得られた。更
には、全縁遺伝子配列、発現パターン及びそれらの機能
に関して相違する別異なサブファミリーが見出された。
本発明による方法により同定されたトウモロコシからの
MADS配列は、これら2のサブファミリー、つまりA
G様及びAGL2様サブファミリーのメンバーである。
比較配列AGAMOUS (Yanofskyら, Nature 346 (19
90), 35-39) 及びAGL2 (Maら, Genes Dev. 5 (199
1), 484-495) は、シロイスナズナ (At) から生じた
ものである。比較配列FBP6 (Angenentら, Plant J.
4 (1993),101-112) 及びFBP2 (Angenentら, Plant
Cell 4 (1992), 983-993) は、ペチュニアハイブリッ
ド (Ph) から生じたものである。更に、Lycopersicon
esculentum (Le) からのTAG1 (Pnueliら, Plan
t Cell 6 (1994), 163-167)及びTM5 (Pnueliら, Pla
nt J. 1 (1991), 255-266) を比較配列として示す。本
実験で、遺伝子ZAG1、ZAG2、ZMM1及びZM
M2 (Schmidt ら, Plant Cell 5 (1993), 729-737;Th
eissenら, Gene 156 (1995), 155-166) だけでなく更に
新規な配列ZMM3及びZMM7をトウモロコシ (Z
m) から同定した。MADSドメインの個々の配列につ
いては、コンセンサス配列と相違するものだけを図6に
示している。ハイフンはコンセンサス配列と同一である
ことを示す。コンセンサス配列中の下線を引いたアミノ
酸は、遺伝子ファミリー特異的プライマーについての結
合部位を示す。
【0064】トウモロコシから同定された6種全てのM
ADSボックス遺伝子では、本発明による方法により検
出された示差的発現を独立ノーザンブロット又は in si
tuハイブリダイゼーション実験により確認することが可
能である。増幅産物のバンドの強度をノーザンブロット
からのそれぞれのデータと比較すると、本発明による方
法で、異なるサンプル中の遺伝子ファミリーの個々のメ
ンバーの発現の少なくとも半定量的測定が可能になるこ
とが分かる。更に、本発明による方法は、cDNAで出
発する10の独立反復実験が厳密に同一のバンドパター
ンをもたらすので、高い再現性を有する。総じて、その
うちの4種が既に知られている6種の異なるMADSボ
ックス遺伝子を本発明による方法により同定することが
可能である。既に知られている遺伝子のうち、ZAG2
及びZMM1は、雌性植物について特異的であると同定
された。ZAG1は雄性植物よりも雌性植物において強
く発現される。対照的に、ZMM2は雌花よりも雄花に
おいて強く発現される。本発明による方法により単離さ
れた新規な2種のMADSボックス遺伝子は、AGL様
遺伝子のサブファミリーのメンバーである。これら遺伝
子のうちZMM3と名付けられた1つの遺伝子は、雌花
よりも雄花において強く発現される。対照的に、新規な
遺伝子ZMM7の発現は、雌性植物において特異的に起
こるようである。
【配列表】
【0065】配列番号:1 配列の長さ:24 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列
【化1】
【0066】配列番号:2 配列の長さ:29 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列
【化2】
【0067】配列番号:3 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列
【化3】
【0068】配列番号:4 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列
【化4】
【0069】配列番号:5 配列の長さ:25 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列
【化5】
【0070】配列番号:6 配列の長さ:18 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列
【化6】
【0071】配列番号:7 配列の長さ:18 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列
【化7】
【0072】配列番号:8 配列の長さ:18 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列
【化8】
【0073】配列番号:9 配列の長さ:18 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列
【化9】
【0074】配列番号:10 配列の長さ:32 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列
【化10】
【0075】配列番号:11 配列の長さ:18 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列
【化11】
【0076】配列番号:12 配列の長さ:15 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列
【化12】
【0077】配列番号:13 配列の長さ:24 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列
【化13】
【0078】配列番号:14 配列の長さ:60 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列
【化14】
【図面の簡単な説明】
【図1】遺伝子の一般的発現分析のための本発明による
方法の1つの態様を図示したものである。
【図2】遺伝子の一般的発現分析のための本発明による
方法の更なる態様であって、減数段階及び蛍光でコード
される再増幅用のプライマーの使用を含む態様を図示し
たものである。
【図3】遺伝子ファミリーの発現分析のための本発明に
よる方法の更なる態様を図示したものである。
【図4】10の独立実験により証明された本発明による
方法の再現性を示す。
【図5】本発明による方法を用いて示差的に発現された
MADSボックス遺伝子の単離結果を示す。
【図6】本発明による方法により同定された遺伝子をM
ADSボックス遺伝子ファミリーに割り当てた図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アヒム フィッシャー ドイツ連邦共和国 D−53115 ボン ラインバッヒャー シュトラーセ 4番 地 (56)参考文献 Cancer Research,53 (1993)pp.5−8 Kidney Internatio nal,46(1997)pp.653−665 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12Q 1/68

Claims (25)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 下記段階を特徴とする遺伝子ファミリー
    のメンバーの発現の示差的分析方法。 (a) 分析すべき1又は幾つかの組織サンプルからのm
    RNA分子の単離、 (b) 該mRNA分子からのcDNA第1鎖分子の合
    成、 (c) 興味の対象である遺伝子ファミリーのメンバーの
    該cDNA第1鎖分子の選択的増幅であって、興味の対
    象である該遺伝子ファミリー内の保存ドメインとハイブ
    リダイズすることができる配列を有するオリゴヌクレオ
    チド又はオリゴヌクレオチドの混合物である該遺伝子フ
    ァミリーに特異的な少なくとも1のプライマーが用いら
    れる選択的増幅、 (d) 1又は幾つかの制限エンドヌクレアーゼでの開裂
    による該増幅産物の転写産物特異的短縮化、 (e) 該制限断片の末端へのリンカー分子の付加、 (f) 該リンカー分子に対して向けられたプライマー及
    び遺伝子ファミリー特異的プライマーを用いる、該制限
    断片の再増幅及び標識、 (g) 該増幅産物のそれらの長さに応じた分離、及び (h) 該分離増幅産物の分析。
  2. 【請求項2】 段階 (b) におけるcDNA第1鎖分子
    の合成がオリゴdTヌクレオチドをcDNAプライマー
    として用いる逆転写により行われる、請求項1記載の方
    法。
  3. 【請求項3】 遺伝子ファミリー特異的プライマーと、
    cDNAプライマーの配列から誘導されるオリゴヌクレ
    オチドであってリバースプライマーとして機能するオリ
    ゴヌクレオチドが段階 (c) における増幅に用いられ
    る、請求項1又は2記載の方法。
  4. 【請求項4】 標識の取り込みが増幅又は再増幅産物を
    鋳型として用いるプライマー延長の形で行われる、請求
    項1〜のいずれか1項に記載の方法。
  5. 【請求項5】 興味の対象である増幅又は再増幅産物が
    それぞれ段階 (h) においてクローニング段階なしに直
    接配列分析に用いられる、請求項1〜のいずれか1項
    に記載の方法。
  6. 【請求項6】 第1鎖cDNAに特定の核酸配列が特に
    その3’末端に供されており、そして段階 (c) におけ
    る増幅用のリバースプライマーとして該特定核酸配列に
    対して向けられたオリゴヌクレオチドが用いられる、請
    求項1〜のいずれか1項に記載の方法。
  7. 【請求項7】 特定核酸配列がホモポリマー又はランダ
    ム配列を含む、請求項記載の方法。
  8. 【請求項8】 第1鎖cDNAが自己連結によりオリゴ
    マー分子及び/又は環状分子に変換され、そして該cD
    NAプライマーに少なくとも部分的に相補的であり場合
    によりその3’末端において延長部分を有する下流方向
    オリゴヌクレオチドが段階 (c) における増幅用のリバ
    ースプライマーとして用いられる、請求項1〜のいず
    れか1項に記載の方法。
  9. 【請求項9】 転写産物特異的短縮化が、前もって増幅
    することなく二本鎖cDNA上で行われる、請求項1〜
    のいずれか1項に記載の方法の変法。
  10. 【請求項10】 二本鎖cDNAが第1鎖cDNAの連
    結及び後の第2鎖合成により作られる、請求項記載の
    方法。
  11. 【請求項11】 被検RNAの5’領域を得るためにア
    ンカーオリゴヌクレオチドを該mRNAの5’末端に付
    加しそして後の増幅においてそのcDNAプライマーか
    ら誘導されるプライマーを該アンカーオリゴヌクレオチ
    ドの配列から誘導されるプライマーと置き換える、請求
    項1〜10のいずれか1項に記載の方法の変法。
  12. 【請求項12】 遺伝子ファミリー特異的プライマーが
    任意の転写産物の検出ができるように一組のランダムプ
    ライマーにより置き換えられる、請求項1〜10のいず
    れか1項に記載の方法の変法。
  13. 【請求項13】 可能性のある転写産物の検出を可能に
    するために、アンカーオリゴヌクレオチドを該mRNA
    の5’末端に付加し、そして、段階(c) の増幅において
    その遺伝子ファミリー特異的プライマーを該アンカーオ
    リゴヌクレオチドの配列から誘導されるプライマーと置
    き換える、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法
    の変法。
  14. 【請求項14】 用いられるリンカー分子に対して向け
    られたプライマー及びアンカーオリゴヌクレオチドの配
    列から誘導されるプライマーを段階 (f) における増幅
    で用いる、請求項11〜13のいずれか1項に記載の方
    法。
  15. 【請求項15】 第1鎖cDNAに特定の核酸配列が供
    されており、そして段階 (c) の増幅において該特定核
    酸配列に対して向けられたオリゴヌクレオチドが遺伝子
    ファミリー特異的プライマーの代わりに用いられ、そし
    てcDNAプライマーの配列から誘導されるオリゴヌク
    レオチドがリバースプライマーとして用いられる方法で
    あって、両プライマーが場合により3’延長部分を有す
    る、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法の変
    法。
  16. 【請求項16】 互いに比較されるべき2の組織サンプ
    ルからの増幅又は再増幅産物のサブトラクティブハイブ
    リダイゼーションが該増幅又は再増幅産物の分離及び分
    析の前に行われる、請求項1〜15のいずれか1項に記
    載の方法の変法。
  17. 【請求項17】 アンカー分子、リンカー分子、cDN
    Aプライマー及び/又は増幅プライマーとして用いられ
    るオリゴヌクレオチドが、制限エンドヌクレアーゼのた
    めの1又は幾つかの認識部位又は開裂部位を有する、請
    求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
  18. 【請求項18】 下記段階を特徴とする請求項13〜1
    のいずれか1項に記載の方法。 (a) 分析すべき1又は幾つかのサンプルからのmRN
    A分子の単離、 (aa) 該mRNA分子の5’末端へのアンカー配列の付
    加、 (b) 該mRNA分子からのcDNA第1鎖分子の合
    成、 (c) 該cDNA第1鎖分子の増幅及び該増幅産物の標
    識、 (d) 1又は幾つかの制限エンドヌクレアーゼでの開裂
    による該増幅産物の転写産物特異的短縮化、 (g) 該増幅産物のそれらの長さに応じた分離、及び (h) 該分離増幅産物の分析。
  19. 【請求項19】 下記段階を特徴とする請求項13〜1
    のいずれか1項に記載の方法。 (a) 1又は幾つかのサンプルからのmRNA分子の単
    離、 (aa) 該mRNA分子の5’末端へのアンカー配列の付
    加、 (b) 該mRNA分子からのcDNA第1鎖分子の合
    成、 (c) 該cDNA第1鎖分子の増幅、 (d) 1又は幾つかの制限エンドヌクレアーゼでの開裂
    による該増幅産物の転写産物特異的短縮化、 (e) 該制限断片の末端へのリンカー分子の付加、 (f) 段階 (e) において付加された該リンカー分子に
    対して向けられたプライマー及び (i) 段階 (aa) にお
    いて付加された該アンカー配列に対して向けられたプラ
    イマー又は (ii) 段階 (b) において用いられたcDN
    Aプライマー配列に対して向けられたプライマーを用い
    る、該制限断片の再増幅及び標識、 (ff) 場合によっては、“繰り込まれた”プライマーを
    用いる新たな再増幅及び標識、 (fff) 場合によっては、互いに比較されるべき2の増幅
    産物のプールのサブトラクティブハイブリダイゼーショ
    ン、 (g) 該増幅産物のそれらの長さに応じた分離、 (h) 該分離増幅産物の分析。
  20. 【請求項20】 新規な遺伝子を単離するための請求項
    1〜19のいずれか1項に記載の方法の使用。
  21. 【請求項21】 遺伝子ファミリーの新規なメンバーを
    同定するための請求項1〜19のいずれか1項に記載の
    方法の使用。
  22. 【請求項22】 細胞又は生物のライフステージを決定
    するための請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法
    の使用。
  23. 【請求項23】 細胞又は生物のライフサイクルを検査
    するための請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法
    の使用。
  24. 【請求項24】 癌及び老人医学研究のための請求項
    0〜23のいずれか1項に記載の使用。
  25. 【請求項25】 遺伝子の発現を分析するための、特に
    請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法に用いるた
    めの試薬キットであって、下記のものを含む試薬キッ
    ト。 (a) cDNA第1鎖合成用の酵素、 (b) cDNA第2鎖の合成用の及びDNA断片の増幅
    用の少なくとも1の酵素、 (c) 場合により、少なくとも1の制限酵素、 (d) 場合により、少なくとも1の二本鎖DNAリンカ
    ー分子及び該リンカー分子をDNA断片の末端に付加す
    るための物質、 (e) 場合により、少なくとも1の一本鎖RNAオリゴ
    ヌクレオチド及び該RNAオリゴヌクレオチドをmRN
    A分子の5’末端に付加するための物質、 (f) (i) 少なくとも1の遺伝子ファミリー特異的プ
    ライマー、 (ii) 少なくとも1のオリゴdTヌクレオチ
    ド、(iii) 該DNAリンカー分子の配列から誘導される
    少なくとも1のプライマー、 (iv) 該RNAオリゴヌク
    レオチドの配列から誘導されるプライマー、 (v) 一組
    のランダムプライマー、 (vi) 3’延長部分及び/又は
    5’延長部分を有する (i) 〜 (v) のプライマー、(v
    ii) マーカー基を保有する (i) 〜 (vi) のプライマ
    ー、及び (viii) 標識のタイプ、例えば、蛍光標識の色
    によりコードされる3’延長部分を含有する (vii)のプ
    ライマー、を含む群から選ばれる一本鎖核酸プライマー
    分子、 (g) 核酸を標識及び検出するための物質、 (h) 場合により、RNアーゼ阻害物質、緩衝液、スト
    レプトアビジンコーテッド反応容器又は磁気粒子の如き
    更なる試薬。」
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