JP3135262B2 - ヒトのガラニン、ヒトのガラニンをエンコードするｃＤ ＮＡクローンとヒトのガラニン製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、ヒトのプレプロガラニン（Preprogalani
n）cDNAのヌクレオチド配列から引出されるようなヒト
のガラニン（Galanin）のアミノ酸配列を有するペプチ
ドに関する。さらに本発明は、そのペプチドをエンコー
ドするcDNAクローンに関する。加えて、本発明はペプチ
ドの治療的な使用と、ガラニンの拮抗と作動の計画にお
けるペプチドの使用とを包含する。

発明の背景 ガラニンは、1983年（１）においてブタの小腸から最
初に分離された神経のペプチドと推定されるものであ
る。ブタのガラニンは、それのＮ−端末グリシントＣ−
端末アラニン残基によって命名された29のアミノ酸残基
のペプチドである。cDNAエンコードされたガラニンは、
ラット（２）、ブタ（３）及びウシ（４）の３つの種か
らクローンとされており、示されているガラニンはプレ
プロガラニン（２）として知られる大きなタンパク質前
駆体のタンパク分解生成物である。ガラニンは種の間で
90％の相同性を示すが他の既知のペプチドにも少し類似
的である（１）。ブタのガラニンに乗る抗体は、制御神
経系（CNS）とヒトを含む他のいくつかの種の末梢神経
系（PNS）の至る所の領域と分離し、ガラニン類似免疫
反応性（GAL−LI）のマッピングがされている。

CNSにおけるGAL−LIの免疫組織化学的なマッピング
は、高濃度のものが正中***と視床下部中に見出されて
いるラットにおいて最も集中して実行されている
（５）。これらの結果は、血圧制御に動く水バランスか
ら分類されるいくつかのファクターの調節を供給するこ
とにおけるガラニンの影響を試験的に示唆するラットの
脳のなかのプレプロガラニンの分散化の交雑の本来の位
置のより最近の研究では一致している（６）。

同じく、ウシの脳におけるガラニンのラジオイムノア
ッセイでは視床下部と正中***中に高いGAL−LIと、ま
た扁桃と同様な片縁系の構造と結び付くGAL−LIとを示
す（７）。ラットの発達する間のプレプロガラニンmRNA
の免疫組織化学と本来の位置の研究は、ガラニン濃度に
おける特定の性の差異の組織で示されており、そこで表
現されたエオストロゲン依存性（Eostrogen dependnt）
との表現は以前の脳下垂体（５）中で注目に値する
（９）。GAL−LIの全ての分類と、カテコールアミン、
セロトニン、GABA、アセチルコリン及び各種の他のペプ
チド（10）とともに別個の神経細胞中のコロカリゼーシ
ョン（Colocalisation）はガラニンの調整の役割を強く
指摘している。注目するべき実例は、ガラニンがアルツ
ハイマー病における役割を演じるであろうという推測に
達している、ラット（11）とウシ（７）において、前脳
の基底の海馬（Hippocampus）から突出した神経繊維中
のアセチルコリンとガラニンとが共存するということで
ある。これは、しかしながら、ヒトの脳のこの領域にお
けるガラニンの表現に関係している証拠と相争う。たと
えCNS中のガラニンの生理学的な役割がまだ確立されて
いないとしても、その神経内分泌の調整における薬理学
上の役割が指摘される。ラットの第三脳室中にガラニン
を注入すると成長ホルモンの増加を引き起こし（13）、
室旁核（PVP）内に注入すると食物摂取が増す（14）。

PNSにおいて、ガラニンについて指摘されたGAL−LIの
分類は普及されている。ガラニンの分類とその薬理学、
それは種々の、しばしば特定の種であるが、ガラニンの
ための生理学上の作用の範囲を指摘する。しかしなが
ら、いくつかの混同が、他の種を包含する実験中のブタ
のガラニンの使用を通してその薬理学的な役割として生
じているであろう。多数の哺乳動物の種においてGAL−L
Iの最も高い濃度が、腸（１）、膵臓（15）、副腎
（３）、及び呼吸（16）と尿生殖器路（17）において見
出される。膵臓に関するガラニンの作用と糖尿病中の役
割の可能性は論争とされ；それがイヌにおけるブタのガ
ラニンの注入（15）と、分離されたラット膵臓を通して
ラットとブタのガラニンの注入（18）とによって確立さ
れ、血漿インシュリンのレベルが減少する。しかしなが
ら、これらはブタ膵臓に関するブタのガラニンの作用に
関する結果と相争う（19）。イヌのガラニンにおいては
又、グルカゴンの増加の間ソマトスタチンが減少する
が、これは他の種において生じることはないであろう
（15）。静脈内へのブタのガラニンはヒトを含むいろい
ろの種で分泌される成長ホルモンを生じる。しかしなが
ら、成長ホルモンのレベル増加を引出すような十分に高
い濃度のブタのガラニンのヒトにおける静脈内への注入
は、インシュリンの予期される阻害が発生しない（2
0）。明確な相違はヒトに対するブタのガラニンのアミ
ノ酸配列の相違によるものであろうし、又はガラニンの
種に特有な影響を単に反映したものであろう。幾つかの
種（15）の神経支配された島状の神経細胞中のGAL−LI
の視覚化は、膵臓の内分泌作用に関しガラニンのための
神経調節的な役割をサポートするラットのＢ−細胞系
（21）におけるインシュリン分泌の阻害を導くガラニン
を説明する提議に加えられる。PNS中のガラニンの他の
薬理学的な効果は、幾つかの哺乳類の種の平滑筋活性に
関してガラニンの種に特有な刺激性又は阻害作用を含む
（22）。

ガラニン受容体はハムスターのインシュリン分泌Ｂ−
細胞腫瘍（23）、ラット（24）とサルの脳（25）、及び
平滑筋の膜（22）において同定されている。ガラニン結
合の分類はGAL−LIのそれと、その結果神経伝達におけ
るガラニンの支持する役割とに関連する。これらがガラ
ニン受容体のサブタイプであるか、或いはその受容体に
結合する原因であるペプチドの領域であるのかは明確で
はない。平滑筋の調整（22）に関しガラニンのトリプシ
ン断片の生物学的影響についての研究、加えてRin 5mf
パンクレアチンＢ−細胞系に関するラジオートグラフィ
ー的結合の研究（26）と、腸の膜調整（27）について、
相争う結果がある。

ガラニン遺伝子の分子生物学はヒトにおいてまだ調査
していない。ブタのプレプロガラニンはシグナル配列を
備えた123アミノ酸残基タンパク質であり、ガラニン（2
9アミノ酸）とガラニンmRNAとして知られる59アミノ酸
ペプチドはペプチド（GMAP）に連合される。ラット、ブ
タ及びウシのプレピロガラニンの長さと構造は類似して
いる。種を交差して相同なガラニンアミノ酸中の20％の
差異はペプチドのＣ−末端の終わりの上に明示される。
今日までに同定された全ての種の配列はアミド化（Amid
ation）による結果として拡張されたゲラニンがグリシ
ンの部位翻訳的な役割を示唆する。GMAPは又、種を交差
して良く保存され、それが生物学的活性の推測に達して
いる；それは種を交差して78％の相同性を示す35アミノ
酸の領域と、大きな相同性を示すこの領域内の17残基の
範囲を含む。

この発明は神経芽腫細胞系cDNAライブラリーからと、
下垂体cDNAライブラリー（DNA library）からのヒトの
プレプロガラニンの分離と特徴づけを開示する（28）。
ブタとラットのプレプロガラニンの２つの保存された領
域に補充のオリゴヌクレオチドは神経芽腫と下垂体cDNA
からの一致する配列を特別に拡大するポリメラーゼ連鎖
反応（PCR）において使用される。使用する２つの拡大
オリゴヌクレオチド（No.1及び２）はラットとブタの各
々のプレプロガラニンのアミノ酸29−37と105−97、及
びガラニンのエンコードする230塩基対領域の側面とGMA
PのＮ−末端（第１図）に相当する（29）。この領域内
に加えられるオリゴヌクレオチド（No.3）は適正なPCR
生産物のためのプローブが用いられる（30）。DNAの両
方の源からの拡大された領域はサブクローンされ、次い
で配列され（31）、同一の配列を示す。神経芽腫cDNAか
らの拡大された領域はこのライブラリーからの完全なプ
レプロガラニンcDNAをエンコードするクローンを分離す
るプローブとして使用される（32）。後の、下垂体cDNA
ライブラリーは、ヒトのプレプロガラニンと、神経芽腫
の培養された細胞系中のDNAの間違った転移のためでな
い他の種の間の何らかのアミノ酸の明白な差異を確認す
るために、同じプローブとスクリーニングされる。

両方のライブラリーから分離されたヒトのプレプロガ
ラニンcDNAクローンの最初の構造は同定されたが、ブ
タ、ウシ及びラットのそれとは異なっている。一般に、
アミノ酸の置換は他の種（第７図）の中での可変性の著
明な言値のみで起こり、それによりガラニンとして確認
され、より小さい範囲のGMAPは両方とも良く保存され
る。しかしながら、これらの変化の幾つか（例えばガラ
ニン中の17,23と26）はヒトのガラニンの正確な機能の
ために重要であるそのような変化を指摘する医学的及び
化学的特性の非常に異なるアミノ酸を含む。またヒトの
ガラニンは、タンパク質前駆体中のLys−Arg分割サイト
の直接進展するガラニンのＣ−端末でのグリシン残基と
セリンの置換を生じることにより特に表現される。これ
はヒトのガラニンがそのＣ−端末でアミド化されず、タ
ンパク分解後の残留物を処理したアミド ドナーとして
グリシン残基が保存される他の種とは対照をなすことを
意味する。その結果として、人のガラニンは、ブタ、ラ
ット及びウシのガラニンと異なる生物学的特性の変化を
有しているだろう。

発明の要約 従って、本発明の第１の態様は以下のアミノ酸配列を
有するポリペプチドよりなる： GWTLNSAGYLLGPHAVGNHRSFSDKNGLTS 又はそれについて機能的同等物又はそれのフラグメン
ト。

本発明のポリペプチドフラグメントの好適な実施態様
は次のアミノ酸配列を持つ： GWTLNSAGYLLGPHAVNHRSFSDKNGLTS ポリプペチド配列に関してここで使用される語句“機
能的同等物”とは、ポリペプチドの生物学的活性に影響
する有毒ではないアミノ酸配列中の小さい変化を含むも
のとして言う。それはペプチドの生物学的な活性に影響
を及ぼし有害でない本発明のペプチドと制定して良い多
くの変形を当業者であれば認識するであろう。これは挿
入、削除及び置換、ペプチドの生物学的な活性を十分に
減少させることのないそのような変化させるペプチド配
列における保存の又は非保存のような各種の変化により
達成されるであろう。置換を保存することにより企図さ
れる化合物は： G,A;V,I,L,M;D,E;N;Q;S,T;K,R,H;及びF,Y,Wである。

それは又、ペプチドの生物学的な活性を十分に減少さ
せることなく、インビボでの効能の増加又は半減期の延
長のような有利性を授与する本発明のペプチドに各種の
基を加えることが可能であろう。これらの機能の実行を
予定するペプチドはガラニン作動薬として表現される。
これら付加物と変換物はＤ−アミノ酸残基の導入とサイ
クリック類似物の組成物とを含む。

本発明中の第２の態様は本発明のペプチドをエンコー
ドするcDNA分子よりなり、そのcDNA分子は第１図に示す
97から186のヌクレオチド又は機能の相当する配列のよ
うな特定の配列を有する。

本発明の第３の態様は、ヒトのプレプロガラニンとGM
APをエンコードするDNA分子よりなり、そのDNA分子は第
１図に示すもの又は機能の相当する配列のように特定の
配列を有している。

ここで用いたようなDNA配列における語句“機能的同
等配列”は、異なるポリペプチドをエンコードする配列
となることがない、DNAコード中の変性のためにDNA配列
中の小さい変化を包含することを意図する。

さらに、この語句はペプチドのエンコードにおける変
化に通じるDNAコード中の変質を包含することを意図す
る。

ヒトのガラニンのインビボでの異なる半減期は特有な
受容体に親和的結合とその結果として種の異なる両者の
効能の差異に加え、予期することができる。

特に興味のあるのはインシュリン阻害剤についてヒト
のガラニンが有効であろうことである。分離されたラッ
トの膵臓を通してブタとラットのガラニンの両方の注入
は、ブタのガラニンがラットのガラニンよりも効能が損
失しているが、インシュリンとソマトスタチンの開放を
阻害するガラニンの両方のタイプを示す（18）。加え
て、ブタのガラニンに反して分泌されるグルカゴンを増
すラットのガラニンは無効である。ブタとラットのガラ
ニンの活性における違いは、それのＣ−端末でのそれら
の間に存在する４個のアミノ酸の相違に帰されている。
同様に、ヒトとブタのガラニンの間で異なっている、ア
ミド化のために異なった結合をした５つのアミノ酸は、
ブタのガラニンがヒト被験者中に注入された時に観察さ
れるインシュリン阻害の予測を欠く原因であろう（2
0）。逆に膵臓に関するガラニンの作用に関係し、及びG
I路に関するガラニンの効果のようなガラニンの種に特
有な効果の別な例は調査を受けた種に相同のガラニンを
用いることが好適であることを示す。

本発明の第４の態様は、DNA配列を表現させること及
びヒトのガラニンを回復する条件のもとで本発明の第２
又は第３の態様のcDNA分子と転換させる細胞を培養する
ことを備えたヒトのガラニンを製造する方法よりなる。

一方、原核生物の又は真核生物の中での組み替え技法
を含む生物学的手段によって本発明のポリペプチドを形
成することが可能であり、そのポリペプチドは又、化学
合成により形成してもよい。使用される合成の経路につ
いての決定は合成されるペプチドの長さに主として頼る
であろう。

予備試験の結果から本発明のポリペプチドは、成長ホ
ルモンの刺激剤として、及び心臓迷走神経性機能の希薄
剤として、膵臓の活性の調整における治療の適用を有す
る。

従って、本発明の更なる態様は膵臓の活性を調整する
方法よりなり、ヒトにおける成長ホルモンの生産を刺激
すること又は心臓迷走神経性機能を希薄化することはヒ
トに本発明のペプチドを投与することを含んでいる。

本発明は又、膵臓の活性の調整、成長ホルモンの生産
の刺激又は心臓迷走神経性機能の希薄のための薬剤の調
整において本発明のペプチドを使用することよりなる。

それは、ガラニン拮抗物質がキメラのガラニン類似ペ
プチドの化学合成により発展することができるというこ
とを示している。ガラニン受容体に結合するＮ−端末ガ
ラニンフラグメント（アミノ酸１−13）は、生物学的な
作用は有していないがＮ−端末部位を安定させるα−螺
旋構造のペプチドに結合することができる。その結果キ
メラはガラニンの拮抗物質として表され、それは結合す
るであろうがガラニン受容体を活性化することはなく、
かくて内因性のガラニンの作用を阻害する。ガラニン拮
抗剤としての機能に同様なキメラのペプチドの能力は、
RIN m5F細胞中で表現されるガラニン受容体に結合する
能力と、ガラニンに対応するインシュリンの阻害に反す
る能力とを測定することによって評価することができ
る。ガラニン拮抗剤は、投薬依存手法及びガラニンに対
応するグルコース導入の阻害を逆転することにおいてRI
N m5F細胞から125I−ガラニンの結合を置き換えるだろ
う。ガラニンの競合物としての拮抗剤の機能はしかしグ
ルコース導入によるインシュリン分泌に関してそれ自身
の効果は持っていない。

本発明のポリペプチドの使用は、ガラニン作動薬と拮
抗剤のためのペプチドの他の化合物のスクリーンが可能
となるであろう。これはRIN m5F細胞中で押された受容
体によって行われる。競合の結合を示した化合物はつい
で生物学的活性のための評価がなされる。

本発明の別の態様は、細胞受容体に結合すること及び
競合的な結合をする化合物の生物学的な評価のために本
発明のペプチドと競合する化合物の能力を評価すること
を含んだガラニン作動薬又は拮抗剤活性のための化合物
のスクリーニングの方法よりなる。

本発明は又このスクリーニング方法により得られたガ
ラニン拮抗剤に関する。

本発明は、関連する以下の実施例と添付した図面に記
載された好適な形状によって、より明確に理解されるで
あろう。

第１図はプレプロガラニンのヌクレオチド配列、ヒト
のガラニンとGMAPののアミノ酸配列を示す。

第２図はウシ、ブタ、及びラットと、ヒトのガラニン
のアミノ酸配列の比較を供給する。

第３図は血中グルコースのレベル（BG;（ａ）350μｇ
と（ｂ）250μｇ）に関するヒトのガラニンの投与の影
響と、意識のあるラットにおける血清インシュリンのレ
ベル（c 250μｇ）を示す。その矢印はガラニンが投与
された時点を示す。

第４図はヒトの中にヒトのガラニンを導入するための
実験の原案を示す。

第５図はヒトの治験者における脈拍数に関するヒトの
ガラニンの投与の影響を示す。

第６図はヒトの治験者におえる血漿グルコースとイン
シュリンのレベルに関するヒトのガラニンの投与の影響
を示す 第７図はヒト治験者における成長ホルモンのレベルの
ヒトガラニンの投与量影響を示す 実施例 材料と方法 cDNAライブラリー： ２つのcDNAライブラリーは、ライブラリーのスクリー
ニングのために、またポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の
ために鋳型DNAの原料として使用した。神経芽腫cDNAラ
イブラリー（catNo.HL1007,Clontech Laboratories In
c.,USA）は、そのEcoR Iクローニングサイトでλgt10ベ
クターの中に押入された1.05×10⁶の独立したクローン
を含む。下垂体cDNAライブラリーはDr P.Seeburg（cent
re for Molecular Biology,University of Heidelberg,
FRG）から得られ、又、λgt10とEcoR Iサイト中で搬ば
れる。

オリゴヌクレオチドの合成： λgt10（Promega,VIC.,Australia）のEcoR Iクローニ
ングサイトに向けられたオリゴヌクレオチドの除外と共
に、全てのオリゴヌクレオチドはDNA合成装置（Applied
Bio−systems,DNA synthesiser Model 380B,Burwood,A
ustralia）で調整した。

オリゴヌクレオチドの配列： 1.GAATTCAAGGA（A/G）AAGAGAGGCTGGAC（T/C）CTGAA（Ec
oR Iサイトに合体した） 2.CCATAAGCTTGC（G/C）CC（G/C）GC（G/A/T/C）TCTTT
（A/G）AG（A/G）TGCA（G/A）GAA（Hind IIIサイトに合
体した） 3.CCATAAGCTTAATGA（C/T）CTGTGG（C/T）TGTC（A/G）Ａ
（T/G）（C/G）GCATG（Hind IIIサイトに合体した） ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）： 鋳型cDNAの調製のため平板溶解法は伝染性ファージ
（T.Maniatis,E.F.Fritsch,J.Sambrook,Molecular Clon
ing:A Lab Manual,2Ed.,Cold Spring Harbour Press,US
A,2.65（1989））を用いた。そのライブラリーは、150m
m径の平板毎に20,000プラークで平板培養し、ml当り１
×10⁹個のファージの滴下により与える保存媒体（SM 0.
1M NaCl/0.008M MgSO₄7H₂O/0.05Mトリス塩酸/0.02％ゼ
ラチン）内に抽出した。そのファージ株（2ml）はフェ
ノール/CHCl₃で抽出し次いでエタノールで析出した。そ
のPCRは神経芽腫cDNAライブラリー（オリゴ１と２）か
らのプレプロガラニンの230塩基対の領域を拡大するの
に使用し、スクリーニングによって後で分離されるcDNA
ライブラリークローン（λgt10オリゴ）もまた拡大す
る。両方の反応においてハイブリッドインテリジェント
加熱ブロック（Model 1HB 2024,Hybaid,Middx.,UK）を
以下の温度パラメーターで使用した:95℃で保持
（５′）、次いで92℃（１′）,42℃（１′）及び72℃
（１′）の25サイクル。各反応はKCl（50mM）、ゼラチ
ン（100μg/ml）、MgCl₂（1.5mM）、トリス塩酸（pH8,1
0mM）DNA（10ng−100ng）、αNTF（200μＭ）,,Tthポリ
メラーゼ（0.25U,東洋紡，日本）及びオリゴヌクレオチ
ド（500μＭ）を含めた。

PCR生成物は３％Nuseiveゲル（FMC Bioproducts,ME,U
SA）（500塩基対より少ない生成物）又は１％アガロー
ス（700塩基対より大きな生成物）により分離した。PCR
生成物バンドの同定はサウザーンブロッティング（L.So
uthern,J.Mol.Biol,98,503（1975））により、ナイロン
膜（Zeta probe,Bio−Rad Laboratories Inc.,CA,USA）
の上のDNAを、オリゴ＃３との交雑に従い転移緩衝液と
して0.4MNaOHを使用して設定した。予備交雑は5xSSPE
（1xSSPEは0.18M NaCl.10mM NaH₂PO₄/1mM NaEDTA pH＝
７）0.5％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）と、5x Denha
rdt's溶液（1x Denhardt's溶液は0.02％フィコール−40
0/0.02％ウシ血清アルブミン/0.02％ポリビニリピロリ
ドン−40）と100μg/ml変成サケ***DNA中、42℃で実行
した。交雑は同じ溶液中にプローブを加え42℃、６−12
次官で実行した。そのオリゴは、T4ポリヌクレオキナー
ゼ（BRL,MD,USA）を用いγ³²P ATP（Amersham,Internat
ional Plc,UK）標識した。ブロットは増度スクリーンと
ともに−70℃にて12時間Ｘ線フィルム（コダック イー
ストマン,NY,US）に曝露する以前に、1xSSC（1xSSCは0.
151M NaCl/0.1675Mクエン酸三ナトリウム）/0.1％SDS
中、37℃で洗浄した。

サブクローニングと配列 PCR生成物は上述したようなゲル上で分離した。適当
なバンドは、制限消化の前に遺伝子クリーン（Bio 101,
CA,USA）により切除し純化した。PCR生成物はHind III
とEcoR Iで消化されたプレプロガラニンのオリゴ１と２
によって生じ、そのPCR生成物はM13mp19内に連紮する前
にEcoR Iで消化されるγt10オリゴとともに生成した。
そのM13mp19サブクローンはJM101コンピテント細胞（Ma
niatis,1.82−1.84）の転移に用いられ、続いて単鎖DNA
が配列（kit No.Q5800,Promega）のための標準法（Mani
atis,4.29−4.30）を用いて調製される。二次的構造の
ための配列の困難性は、配列用酵素として70℃の反応温
度でのTaq DNAポリメラーゼ（kit No.Q5540,Promega）
の使用により克服される。

cDNAライブラリーのスクリーニング 上述したcDNAライブラリーを、神経芽腫プレプロガラ
ニンの配列をエンコードする230塩基対のPCR生成物とス
クリーニングする。そのプローブは、ゲルから切除し、
ランダム取付反応（kit No.8187SA,BRL）中のα³²dCTP
の標識（25ng）以前に遺伝子クリーンを用いて純化す
る。概ね６×10⁵のプラークが2YTプレート（A3,Maniati
s）上に培養され、これをハイボンドＮナイロンフィル
ター（Amersham）に載せ、製造推奨名にしたがって固定
した。予備水素化処理と交雑形成は上述したように65℃
で実行した。フィルターは65℃にて0.1％SDS/0.1％SSC
で厳重に洗浄し、増度スクリーンとともにＸ線フィルム
に一夜曝露した。

血中グルコースとグルコ調整ホルモンの分泌 意識のあるラットへのヒトのガラニンの投与 ラットは確立した飼料で飼育し、麻酔下でカニューレ
挿入した。そのラットは次いで回復させてグルコースを
導入した。10分後にヒトのガラニンの食塊投薬を投与
し、次の３時間で血液試料を採取した。次のサンプリン
グ手続により実験動物を犠牲とした。

全血中グルコースレベルの上昇は、ヒトのガラニン35
0μｇ（110nmol;第2a図）と250μｇ（第2b図中80nmol）
の食塊投与に対応して評価した。ヒトのガラニン250μ
ｇ（第2c図中80nmol）の投与に対応した全血中グルコー
スレベルの上昇は循環インシュリンのレベルの低下と相
互に関係した。

成長ホルモンの分泌 ヒト中でのヒトガラニンの導入 概ね３−４×10^-9Mのガラニンの最大値の循環レベル
に達するようにヒト中にヒトガラニンの導入するための
実験的原案を第４図に示す。

ヒトにおける血中グルコースとグルコ調節ホルモンの分
泌に関するヒトガラニンの影響 １対象者の予備データは、ヒトのガラニンが１×10^-9
Mと４×10^-9Mの最大値の循環レベルに達するように、第
４図中の示す原案に従ってヒトのガラニンの投与として
示されインシュリン分泌の抑制が検出可能となる（第６
図;Y軸単位:mlU/L）。これは標準位置に関係する血漿グ
ルコースの上昇と結び付けられる（第６図;Y軸単位:m
M）。

成長ホルモン分泌に関するヒトのガラニンの効果 第４図に表された原案に従った志願者へのヒトガラニ
ンの投与は今日まで研究された２対象者においてヒトガ
ラニン１×10^-9Mと３−４×10^-9の両方の循環レベルで
の成長ホルモンレベルの上昇となった。使用した２つの
投薬率でのこれた２対象者の１つにおいてヒトのガラニ
ンの影響を第７図に示す。

心臓血管の効果 麻酔したネコにおえる血圧と迷走神経機能に関するヒト
のガラニンの影響 麻酔したネコ中にヒトのガラニンの静脈内導入は心拍
数の遅延する心臓迷走の希薄化となる。

ヒトにおけるヒトガラニン心臓血管の影響 第４図に詳細化したようにヒト中へのヒトガラニンの
導入は、ヒトにおける迷走神経機能の希薄化に関するヒ
トガラニンの効果と一致して、脈拍数が増加することに
なる（第５図参照）。

今日までに導かれた研究から、ヒトのガラニンは以下
のものを含む多くの医学的な使用をなされるであろう： 1.胃腸の活性の阻害、例えば下痢止め薬として。

2.インシュリン分泌の阻害、例えば膵臓疾患における膵
臓内分泌の活性調整。

3.放出されるホルモン成長ホルモンの独立的な動作であ
る成長ホルモンの有効な刺激物質として。

4.心臓迷走神経機能の希釈剤として。

5.今までのところよく特徴付けされていない神経系の効
果、例えばアルツハイマー症の除去、食欲に関する効
果、プロラクチン放出など。

ラットのモデルを用いた導かれた実験は最初の３つの
使用を支持し、一方ヒトのガラニンで着手した人におい
ての研究は、インシュリン分泌の調整、成長ホルモン分
泌及び心臓迷走神経機能に対してヒトのガラニンの能力
を実証する。

本発明の以前のガラニンの医学的な使用の可能性はガ
ラニンの種に特異的な薬理学的な作用のために大きく制
限され、即ちヒトに投与する時外因性のヒトのガラニン
は、商業上利用できるブタとラットのガラニンと、薬理
学的な効果が異なっていただろう。本発明より以前はこ
の種の特異性の理由が理解されていなかった。現在では
その種の特異性が当然であることが確信され、少なくと
も一部において、ヒトのガラニンと特に記載した他の種
のガラニンとの間で目立つ差異の幾つかのアミノ酸は、
そのＣ−端末でのグリシン、及びその場所がインビボに
おいて転写後分割の後のアミド化（Amidation）の可能
性を除外するセリン残基によって拡張されない。

当業者によって正しく判断されるであろうが、より広
く記載された本発明の精神又は範囲から逸脱することな
く、明細書の実施態様中に示すように本発明に対して多
数の変形及び／又は変更態様を持たせて良い。本実施態
様はそれゆえ例示にすぎず、それに限定されるものでは
ない。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 シャイン， ジョン オーストラリア国 2110 ニュー サウ ス ウェールズ ウールウィッチ メイ フィールド アヴェニュ ２ (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．83［17］（1986) ｐ．6287−6291 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．85［４］（1988) ｐ．1065−1069 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．234 ［２］（1988）ｐ．400−406 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/12 C07K 14/47 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｐ ＩＲ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／Ｇｅｎｅｓｅ ｑ ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次のアミノ酸配列を有するポリペプチド： GWTLNSAGYLLGPHAVGNHRSFSDKNGLTS 又はそれの機能的同等物。
2. 【請求項２】次のアミノ酸配列を有する請求項１記載の
   ポリペプチド GWTLNSAGYLLGPHAVGNHRSFSDKNGLTS。
3. 【請求項３】請求項１又は２記載のペプチドをエンコー
   ドするcDNA分子であり、第１図中に示すヌクレオチド97
   から186又はヌクレオチド97から145又は機能的同等の配
   列のような特定な配列を有するcDNA分子。
4. 【請求項４】ヒトのプレプロガラニンとペプチドに合体
   したガラニンmRNAをエンコードするDNA分子であって、
   第１図中の又は機能的同等の配列のような特定の配列を
   有するcDNA分子。
5. 【請求項５】DNA配列を抑制させ及びヒトのガラニンを
   回復する条件のもとで請求項３又は４記載のDNA分子で
   細胞を形質転換することを備えたヒトのガラニンの製造
   方法。
6. 【請求項６】前記細胞が細菌である請求項５記載の方
   法。
7. 【請求項７】請求項１又は２記載のポリペプチドを含む
   膵臓の機能を調整するための薬剤。
8. 【請求項８】請求項１又は２記載のポリペプチドを含む
   成長ホルモンの生産を刺激するための薬剤。
9. 【請求項９】請求項１又は２記載のポリペプチドを含む
   心臓迷走神経機能を希釈するための薬剤。
10. 【請求項１０】ガラニンの拮抗又は阻害活性のための化
    合物をスクリーニングする方法であって、細胞受容体に
    結合及び競合的結合する化合物の生物学的な評価のため
    請求項１又は２に記載されたペプチドに競合する化合物
    の能力を評価することを備えた前記の方法。