JP3102611B2 - 複合体の分離方法 - Google Patents
複合体の分離方法Info
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、例えば血清，血液，血
漿，尿等の生体体液、リンパ球、血球、各種細胞類等の
生体由来の試料中の微量成分とそれに対して特異的な結
合能を有する物質との複合体を、その他の物質から分離
する方法並びにこの分離方法を利用した微量成分の測定
方法に関する。
漿，尿等の生体体液、リンパ球、血球、各種細胞類等の
生体由来の試料中の微量成分とそれに対して特異的な結
合能を有する物質との複合体を、その他の物質から分離
する方法並びにこの分離方法を利用した微量成分の測定
方法に関する。
【０００２】
【従来技術及びその問題点】ある特定の物質同士、例え
ば抗原と抗体，プロテアーゼとその蛋白性プロテアーゼ
インヒビター，糖鎖とレクチン，酵素とそれに対する基
質や補酵素，ホルモン等の生理活性物質とそれに対する
リセプターや輸送蛋白，２本鎖ＤＮＡの１対のポリヌク
レオチド鎖等は、互いに強い相互作用を及ぼしあい、強
固な複合体を形成することが知られている。
ば抗原と抗体，プロテアーゼとその蛋白性プロテアーゼ
インヒビター，糖鎖とレクチン，酵素とそれに対する基
質や補酵素，ホルモン等の生理活性物質とそれに対する
リセプターや輸送蛋白，２本鎖ＤＮＡの１対のポリヌク
レオチド鎖等は、互いに強い相互作用を及ぼしあい、強
固な複合体を形成することが知られている。
【０００３】このような相互作用を利用した試料中の微
量成分の測定方法として、本発明者らが先に開発した特
開平2−28557号公報、特開平3−206964号公報及び特開
平3−221865号公報に記載の方法がある。特開平2−2855
7号公報に記載された方法を、例えば抗原と抗体の相互
作用を利用する場合について説明すると大略以下の如く
になる。 (1)生体由来の試料中の測定対象物質の測定に於て、測
定対象物質を抗原として作製した抗体に何らかの方法に
より検出可能な物質（以下、検出物質と略記する。）を
標識したもの（標識抗体）を、試料と混合して反応させ
た後、測定対象物質（抗原）と標識抗体との複合体と、
遊離型の標識抗体とを高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）により分離し、該複合体中の検出物質の量を測
定することにより試料中の測定対象物質の量を測定する
ことを特徴とする測定方法。 (2)生体由来の試料中の測定対象物質の測定に於て、検
出物質を結合させた測定対象物質及び測定対象物質を抗
原として作製した抗体を、試料と混合して反応させた
後、検出物質により標識された測定対象物質（抗原）と
抗体との複合体と、遊離型の検出物質を結合させた測定
対象物質（抗原）とをＨＰＬＣにより分離し、該複合体
中の検出物質の量又は遊離型の検出物質を結合させた測
定対象物質（抗原）中の検出物質の量を測定することに
より試料中の測定対象物質の量を測定することを特徴と
する測定方法。
量成分の測定方法として、本発明者らが先に開発した特
開平2−28557号公報、特開平3−206964号公報及び特開
平3−221865号公報に記載の方法がある。特開平2−2855
7号公報に記載された方法を、例えば抗原と抗体の相互
作用を利用する場合について説明すると大略以下の如く
になる。 (1)生体由来の試料中の測定対象物質の測定に於て、測
定対象物質を抗原として作製した抗体に何らかの方法に
より検出可能な物質（以下、検出物質と略記する。）を
標識したもの（標識抗体）を、試料と混合して反応させ
た後、測定対象物質（抗原）と標識抗体との複合体と、
遊離型の標識抗体とを高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）により分離し、該複合体中の検出物質の量を測
定することにより試料中の測定対象物質の量を測定する
ことを特徴とする測定方法。 (2)生体由来の試料中の測定対象物質の測定に於て、検
出物質を結合させた測定対象物質及び測定対象物質を抗
原として作製した抗体を、試料と混合して反応させた
後、検出物質により標識された測定対象物質（抗原）と
抗体との複合体と、遊離型の検出物質を結合させた測定
対象物質（抗原）とをＨＰＬＣにより分離し、該複合体
中の検出物質の量又は遊離型の検出物質を結合させた測
定対象物質（抗原）中の検出物質の量を測定することに
より試料中の測定対象物質の量を測定することを特徴と
する測定方法。
【０００４】また、特開平3−206964号公報に開示され
た発明は、アイソザイムや糖鎖構造の異なるホルモン等
の「同一の作用を有し、且つ同一の検出可能な化学特性
を有する２以上の測定対象物質」を測定対象物質とする
測定方法である。この方法を、唾液型α−アミラーゼと
膵臓型α−アミラーゼとを測定対象物質とする場合を例
にとって説明すれば、以下の如くなる。即ち、上記の２
種類のα−アミラーゼを含む試料中に、抗唾液型α−ア
ミラーゼ（マウス）モノクローナル抗体を混合して反応
させた後、唾液型α−アミラーゼと抗唾液型α−アミラ
ーゼ（マウス）モノクローナル抗体との複合体と遊離の
膵臓型α−アミラーゼをＨＰＬＣにより分離し、唾液型
α−アミラーゼと抗唾液型α−アミラーゼ（マウス）モ
ノクローナル抗体との複合体に含まれる唾液型α−アミ
ラーゼの量又は／及び遊離の膵臓型α−アミラーゼの量
を測定することにより試料中の唾液型α−アミラーゼ又
は／及び膵臓型α−アミラーゼの量を分別測定すること
を特徴とする測定方法である。
た発明は、アイソザイムや糖鎖構造の異なるホルモン等
の「同一の作用を有し、且つ同一の検出可能な化学特性
を有する２以上の測定対象物質」を測定対象物質とする
測定方法である。この方法を、唾液型α−アミラーゼと
膵臓型α−アミラーゼとを測定対象物質とする場合を例
にとって説明すれば、以下の如くなる。即ち、上記の２
種類のα−アミラーゼを含む試料中に、抗唾液型α−ア
ミラーゼ（マウス）モノクローナル抗体を混合して反応
させた後、唾液型α−アミラーゼと抗唾液型α−アミラ
ーゼ（マウス）モノクローナル抗体との複合体と遊離の
膵臓型α−アミラーゼをＨＰＬＣにより分離し、唾液型
α−アミラーゼと抗唾液型α−アミラーゼ（マウス）モ
ノクローナル抗体との複合体に含まれる唾液型α−アミ
ラーゼの量又は／及び遊離の膵臓型α−アミラーゼの量
を測定することにより試料中の唾液型α−アミラーゼ又
は／及び膵臓型α−アミラーゼの量を分別測定すること
を特徴とする測定方法である。
【０００５】また、特開平3−221865号公報に開示され
た発明は、アイソザイムや糖鎖構造の異なるホルモン等
の「同一の作用を有する２以上の測定対象物質」、また
は、ステロイドホルモン類やヒト絨毛性ゴナドトロピン
等の「類似した構造を有するが異なる作用を有する２以
上の測定対象物質」を測定対象物質とする測定方法であ
る。この方法を、胎盤絨毛由来ｈＣＧと絨毛癌由来ｈＣ
Ｇとを測定対象物質とする場合を例にとって説明すれ
ば、以下の如くなる。即ち、上記の２種類のｈＣＧを含
む試料中に、何れのｈＣＧにも結合能を持つ抗ｈＣＧ−
β鎖モノクローナル抗体に検出物質を標識したものと、
絨毛癌由来ｈＣＧにのみ結合能を有し胎盤絨毛由来ｈＣ
Ｇには結合しないレクチンとを混合して反応させた後、
胎盤絨毛由来ｈＣＧと検出物質により標識された抗ｈＣ
Ｇ−β鎖モノクローナル抗体との複合体と、絨毛癌由来
ｈＣＧと検出物質により標識された抗ｈＣＧ−β鎖モノ
クローナル抗体及びレクチンとの複合体と、遊離型の検
出物質により標識された抗ｈＣＧ−β鎖モノクローナル
抗体とをＨＰＬＣにより分離し、各複合体中の検出物
質の量を測定することにより試料中の２種類のｈＣＧの
量を測定することを特徴とする測定方法である。
た発明は、アイソザイムや糖鎖構造の異なるホルモン等
の「同一の作用を有する２以上の測定対象物質」、また
は、ステロイドホルモン類やヒト絨毛性ゴナドトロピン
等の「類似した構造を有するが異なる作用を有する２以
上の測定対象物質」を測定対象物質とする測定方法であ
る。この方法を、胎盤絨毛由来ｈＣＧと絨毛癌由来ｈＣ
Ｇとを測定対象物質とする場合を例にとって説明すれ
ば、以下の如くなる。即ち、上記の２種類のｈＣＧを含
む試料中に、何れのｈＣＧにも結合能を持つ抗ｈＣＧ−
β鎖モノクローナル抗体に検出物質を標識したものと、
絨毛癌由来ｈＣＧにのみ結合能を有し胎盤絨毛由来ｈＣ
Ｇには結合しないレクチンとを混合して反応させた後、
胎盤絨毛由来ｈＣＧと検出物質により標識された抗ｈＣ
Ｇ−β鎖モノクローナル抗体との複合体と、絨毛癌由来
ｈＣＧと検出物質により標識された抗ｈＣＧ−β鎖モノ
クローナル抗体及びレクチンとの複合体と、遊離型の検
出物質により標識された抗ｈＣＧ−β鎖モノクローナル
抗体とをＨＰＬＣにより分離し、各複合体中の検出物
質の量を測定することにより試料中の２種類のｈＣＧの
量を測定することを特徴とする測定方法である。
【０００６】以上述べたことから明らかな如く、上記公
報に記載の各測定方法は、測定対象物質（又は検出物質
により標識された測定対象物質）とそれに対する結合能
を有する物質（以下、結合能物質と略記する。）との相
互作用の結果生じる複合体（又は検出物質により標識さ
れた複合体）と遊離の結合能物質（又は遊離の、検出物
質により標識された測定対象物質）との分離をＨＰＬＣ
を用いて行なう点に特徴を有するもので、該方法によれ
ば、微量成分の定量を従来のＥＩＡ（酵素免疫測定
法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）或はＦＩＡ（蛍光免疫
測定法）等の測定法と比べて容易に且つ短時間で極めて
精度よく行なうことができるので、今後の展開が大いに
期待される測定法であると考えられている。
報に記載の各測定方法は、測定対象物質（又は検出物質
により標識された測定対象物質）とそれに対する結合能
を有する物質（以下、結合能物質と略記する。）との相
互作用の結果生じる複合体（又は検出物質により標識さ
れた複合体）と遊離の結合能物質（又は遊離の、検出物
質により標識された測定対象物質）との分離をＨＰＬＣ
を用いて行なう点に特徴を有するもので、該方法によれ
ば、微量成分の定量を従来のＥＩＡ（酵素免疫測定
法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）或はＦＩＡ（蛍光免疫
測定法）等の測定法と比べて容易に且つ短時間で極めて
精度よく行なうことができるので、今後の展開が大いに
期待される測定法であると考えられている。
【０００７】また、上記の公報中には、複合体を形成さ
せる際に、２種類以上の結合能物質（具体的には、測定
対象物質上の異なる部位に各々結合する性質を有する２
種類以上の結合能物質）を用いる方法、更には、検出物
質により標識された２種類以上の結合能物質を用いる方
法、並びにこのような２種類以上の結合能物質を用いた
場合には、結果的に複合体の分子量が大きくなったり、
複合体の等電点の変動巾が大きくなる等するため複合体
と結合能物質との分離がより容易となり、測定精度の向
上を計ることができることや、各々の結合能物質を検出
物質により標識しておくことにより、測定感度を上昇さ
せることができること等が開示されている。
せる際に、２種類以上の結合能物質（具体的には、測定
対象物質上の異なる部位に各々結合する性質を有する２
種類以上の結合能物質）を用いる方法、更には、検出物
質により標識された２種類以上の結合能物質を用いる方
法、並びにこのような２種類以上の結合能物質を用いた
場合には、結果的に複合体の分子量が大きくなったり、
複合体の等電点の変動巾が大きくなる等するため複合体
と結合能物質との分離がより容易となり、測定精度の向
上を計ることができることや、各々の結合能物質を検出
物質により標識しておくことにより、測定感度を上昇さ
せることができること等が開示されている。
【０００８】しかしながら、これら２種の結合能物質
（標識されているものも含む）を使用する方法は、測定
対象物質に１ヶ所しか結合能物質が結合できる部位が存
在しない場合には利用できない。また、該方法は、複合
体の性質（分子量、疎水性、イオン性等）が結果的に変
化してその溶出位置がずれるという現象を生じさせるこ
とは可能でも、複合体の上記した如き性質を自由自在に
調節することは不可能であった。
（標識されているものも含む）を使用する方法は、測定
対象物質に１ヶ所しか結合能物質が結合できる部位が存
在しない場合には利用できない。また、該方法は、複合
体の性質（分子量、疎水性、イオン性等）が結果的に変
化してその溶出位置がずれるという現象を生じさせるこ
とは可能でも、複合体の上記した如き性質を自由自在に
調節することは不可能であった。
【０００９】従って、上記した如き方法に於けるＨＰＬ
Ｃを用いた分離操作に於いて、単に２種の結合能物質を
用いるだけでは、複合体（又は検出物質により標識され
た複合体）と遊離の結合能物質（又は検出物質により標
識された測定対象物質）との分離が未だ不十分であった
り、測定対象物質によっては複合体（又は検出物質によ
り標識された複合体）の溶出位置が血清や尿中の生体成
分の溶出位置と重なるために測定精度が低下する等の問
題が生じる場合があり、更なる改良が望まれていた。
Ｃを用いた分離操作に於いて、単に２種の結合能物質を
用いるだけでは、複合体（又は検出物質により標識され
た複合体）と遊離の結合能物質（又は検出物質により標
識された測定対象物質）との分離が未だ不十分であった
り、測定対象物質によっては複合体（又は検出物質によ
り標識された複合体）の溶出位置が血清や尿中の生体成
分の溶出位置と重なるために測定精度が低下する等の問
題が生じる場合があり、更なる改良が望まれていた。
【００１０】
【発明の目的】本発明は、上記した如き状況に鑑みなさ
れたもので、測定対象物質と結合能物質との相互作用の
結果生じる複合体と、遊離の結合能物質等の該複合体の
検出に影響を与える恐れのある共存物質とをＨＰＬＣを
用いて分離する際に、該複合体と遊離の結合能物質等と
をより効果的に分離し得る方法並びにこの分離方法を利
用した微量成分の測定方法を提供することをその目的と
する。
れたもので、測定対象物質と結合能物質との相互作用の
結果生じる複合体と、遊離の結合能物質等の該複合体の
検出に影響を与える恐れのある共存物質とをＨＰＬＣを
用いて分離する際に、該複合体と遊離の結合能物質等と
をより効果的に分離し得る方法並びにこの分離方法を利
用した微量成分の測定方法を提供することをその目的と
する。
【００１１】
【発明の構成】 本発明は、測定対象物質が、互いに同
一の作用を有し、且つ同一の検出可能な化学特性を有す
る２以上の物質である場合の測定用キットであって、
（ａ）測定対象物質の少なくとも１つと特異的に結合す
るが、これらのうちの少なくとも１つとは結合しない性
質を有する（以下、結合能物質Ａ2と略記する。）と、
（ｂ）測定対象物質と結合能物質Ａ2とが結合して生じ
る複合体の性質を変化させ得る分離向上物質により修飾
され且つ測定対象物質と結合能物質Ａ2との複合体に対
して結合する性質を有する物質（以下、修飾結合能物質
Ｂ１と略記する。）を含んでなるキットの発明である。
一の作用を有し、且つ同一の検出可能な化学特性を有す
る２以上の物質である場合の測定用キットであって、
（ａ）測定対象物質の少なくとも１つと特異的に結合す
るが、これらのうちの少なくとも１つとは結合しない性
質を有する（以下、結合能物質Ａ2と略記する。）と、
（ｂ）測定対象物質と結合能物質Ａ2とが結合して生じ
る複合体の性質を変化させ得る分離向上物質により修飾
され且つ測定対象物質と結合能物質Ａ2との複合体に対
して結合する性質を有する物質（以下、修飾結合能物質
Ｂ１と略記する。）を含んでなるキットの発明である。
【００１２】 また、本発明は、測定対象物質が、同一
の作用を有する２以上の物質又は類似した構造を有する
が異なる作用を有する２以上の物質である場合の測定用
キットであって、（ａ’）測定対象物質の全てに対して
結合能を有し且つ検出物質により標識された物質（以
下、結合能物質Ａ3と略記する。）と、（ｂ’）特定の
測定対象物質に対する結合能を有し且つ該測定対象物質
と結合能物質Ａ3との複合体の性質を変化させ得る分離
向上物質により修飾された物質（以下、修飾結合能物質
Ｃと略記する。）と、を含んでなるキットの発明であ
る。
の作用を有する２以上の物質又は類似した構造を有する
が異なる作用を有する２以上の物質である場合の測定用
キットであって、（ａ’）測定対象物質の全てに対して
結合能を有し且つ検出物質により標識された物質（以
下、結合能物質Ａ3と略記する。）と、（ｂ’）特定の
測定対象物質に対する結合能を有し且つ該測定対象物質
と結合能物質Ａ3との複合体の性質を変化させ得る分離
向上物質により修飾された物質（以下、修飾結合能物質
Ｃと略記する。）と、を含んでなるキットの発明であ
る。
【００１３】 更に、本発明は、同一の作用を有し、且
つ同一の検出可能な化学特性を有する２以上の測定対象
物質を含む生体由来の試料と、結合能物質Ａ2及び修飾
結合能物質Ｂ１とを反応させ、特定の測定対象物質と結
合能物質Ａ2と修飾結合能物質Ｂ１との複合体を形成さ
せ、該複合体と遊離の測定対象物質とを分離した後、該
複合体に含まれる測定対象物質の量又は／及び遊離の測
定対象物質の量を測定することにより、試料中の測定対
象物質の何れかの量を求めることを特徴とする測定方法
の発明である。
つ同一の検出可能な化学特性を有する２以上の測定対象
物質を含む生体由来の試料と、結合能物質Ａ2及び修飾
結合能物質Ｂ１とを反応させ、特定の測定対象物質と結
合能物質Ａ2と修飾結合能物質Ｂ１との複合体を形成さ
せ、該複合体と遊離の測定対象物質とを分離した後、該
複合体に含まれる測定対象物質の量又は／及び遊離の測
定対象物質の量を測定することにより、試料中の測定対
象物質の何れかの量を求めることを特徴とする測定方法
の発明である。
【００１４】更にまた、本発明は、同一の作用を有する
２以上の測定対象物質又は類似した構造を有するが異な
る作用を有する２以上の測定対象物質を含む生体由来の
試料と、結合能物質Ａ3及び修飾結合能物質Ｃとを反応
させ、測定対象物質と結合能物質Ａ3との複合体（複合
体Ａ）及び特定の測定対象物質と結合能物質Ａ3と修飾
結合能物質Ｃとの複合体（複合体Ｂ）を形成させ、複合
体Ａと複合体Ｂとを分離した後、複合体Ａ中に含まれる
検出物質の量又は／及び複合体Ｂ中に含まれる検出物質
の量を測定することにより、試料中の測定対象物質の何
れかの量を求めることを特徴とする測定方法の発明であ
る。
２以上の測定対象物質又は類似した構造を有するが異な
る作用を有する２以上の測定対象物質を含む生体由来の
試料と、結合能物質Ａ3及び修飾結合能物質Ｃとを反応
させ、測定対象物質と結合能物質Ａ3との複合体（複合
体Ａ）及び特定の測定対象物質と結合能物質Ａ3と修飾
結合能物質Ｃとの複合体（複合体Ｂ）を形成させ、複合
体Ａと複合体Ｂとを分離した後、複合体Ａ中に含まれる
検出物質の量又は／及び複合体Ｂ中に含まれる検出物質
の量を測定することにより、試料中の測定対象物質の何
れかの量を求めることを特徴とする測定方法の発明であ
る。
【００１５】また、本発明は、測定対象物質と結合能物
質Ａ2と修飾結合能物質Ｂ１との複合体の発明である。
更に、本発明は、測定対象物質と、結合能物質Ａ3と修
飾結合能物質Ｃとの複合体の発明である。
質Ａ2と修飾結合能物質Ｂ１との複合体の発明である。
更に、本発明は、測定対象物質と、結合能物質Ａ3と修
飾結合能物質Ｃとの複合体の発明である。
【００１６】即ち、本発明者らは、２以上の測定対象物
質を、これらに対して結合能を有する結合能物質を用い
て簡便に且つ効率よく分別測定する方法について鋭意研
究を重ねた結果、測定対象物質と結合能物質との複合体
に更に適当な性質を有する分離向上物質を結合させ、且
つ該分離向上物質の性質に基づいて該複合体の分離操作
を行った場合には、分離向上物質を適宜選択して用いる
ことにより、該複合体のカラムクロマトグラフィーに於
ける溶出位置を自在に調節することが可能となること、
言い換えれば、該分離向上物質を該複合体に結合させる
ことにより、該複合体を、これの検出に影響を与える恐
れのある共存物質と明確に分離し得ることを見出し、本
発明を完成するに至った。
質を、これらに対して結合能を有する結合能物質を用い
て簡便に且つ効率よく分別測定する方法について鋭意研
究を重ねた結果、測定対象物質と結合能物質との複合体
に更に適当な性質を有する分離向上物質を結合させ、且
つ該分離向上物質の性質に基づいて該複合体の分離操作
を行った場合には、分離向上物質を適宜選択して用いる
ことにより、該複合体のカラムクロマトグラフィーに於
ける溶出位置を自在に調節することが可能となること、
言い換えれば、該分離向上物質を該複合体に結合させる
ことにより、該複合体を、これの検出に影響を与える恐
れのある共存物質と明確に分離し得ることを見出し、本
発明を完成するに至った。
【００１７】 本発明の方法に於て用いられる分離向上
物質としては、測定対象物質と結合能物質Ａ2又はＡ3と
の複合体の例えば分子量、疎水性、等電点等の性質を変
化させ得る物質であれば特に限定されることなく挙げら
れるが、具体的には例えばα−キモトリプシノーゲン，
β−ガラクトシダーゼ，リゾチーム，チトクロームＣ，
トリプシンインヒビター等のタンパク質、例えばフェニ
ルアラニン，プロリン，アルギニン，リジン，アスパラ
ギン酸，グルタミン酸等のアミノ酸を含むペプチド、例
えば臭素，塩素，沃素等のハロゲン原子、例えばポリエ
チレングリコール等の合成高分子、例えばポリグルタミ
ン酸，ポリアスパラギン酸，ポリリジン，ポリアルギニ
ン，ポリフェニルアラニン，ポリチロシン等のポリアミ
ノ酸、炭素数３〜10のアルキル鎖、例えばパルミチン
酸，オレイン酸，ステアリン酸等の脂肪酸、例えばN-
(ε-マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド［N-
(ε-maleimidocaproyloxy)succinimide、以下、ＥＭＣ
Ｓと略記する。］,N-スクシンイミヂル-6-マレイミドヘ
キサノエイト（N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat
e），ビスマレイミドヘキサン（Bismaleimidohexane、
以下、ＢＭＨと略記する。），オクチルアミン等の、測
定対象物質と結合能物質Ａ2又はＡ3との複合体に対する
結合能を有する物質に結合し得る反応基を有し且つ疎水
性若しくはイオン性を有する化学物質等が好ましく挙げ
られる。
物質としては、測定対象物質と結合能物質Ａ2又はＡ3と
の複合体の例えば分子量、疎水性、等電点等の性質を変
化させ得る物質であれば特に限定されることなく挙げら
れるが、具体的には例えばα−キモトリプシノーゲン，
β−ガラクトシダーゼ，リゾチーム，チトクロームＣ，
トリプシンインヒビター等のタンパク質、例えばフェニ
ルアラニン，プロリン，アルギニン，リジン，アスパラ
ギン酸，グルタミン酸等のアミノ酸を含むペプチド、例
えば臭素，塩素，沃素等のハロゲン原子、例えばポリエ
チレングリコール等の合成高分子、例えばポリグルタミ
ン酸，ポリアスパラギン酸，ポリリジン，ポリアルギニ
ン，ポリフェニルアラニン，ポリチロシン等のポリアミ
ノ酸、炭素数３〜10のアルキル鎖、例えばパルミチン
酸，オレイン酸，ステアリン酸等の脂肪酸、例えばN-
(ε-マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド［N-
(ε-maleimidocaproyloxy)succinimide、以下、ＥＭＣ
Ｓと略記する。］,N-スクシンイミヂル-6-マレイミドヘ
キサノエイト（N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat
e），ビスマレイミドヘキサン（Bismaleimidohexane、
以下、ＢＭＨと略記する。），オクチルアミン等の、測
定対象物質と結合能物質Ａ2又はＡ3との複合体に対する
結合能を有する物質に結合し得る反応基を有し且つ疎水
性若しくはイオン性を有する化学物質等が好ましく挙げ
られる。
【００１８】 本発明に係る修飾結合能物質Ｂ１を調製
するために用いられる、特定の測定対象物質と結合能物
質Ａ2との複合体に対して結合能を有する物質（以下、
結合能物質Ｂ’と略記する。）としては、特定の測定対
象物質と結合能物質Ａ2との複合体形成反応及び該複合
体中の測定対象物質又は遊離の測定対象物質を検出する
反応を阻害しないものであって、測定対象物質、結合能
物質Ａ2又は該複合体に対して結合能を有する物質であ
れば特に限定されることなく挙げられる。具体的には、
例えば測定対象物質に対して結合能を有する例えば抗
体、例えばコンカナバリンＡ，レンズマメレクチン，イ
ンゲンマメレクチン，ダツラレクチン，小麦胚芽レクチ
ン等のレクチン類（但し、結合能物質Ａ2とは結合部位
が異なるもの。）等、或は結合能物質Ａ2に対して結合
能を有する例えば抗体、例えばコンカナバリンＡ，レン
ズマメレクチン，インゲンマメレクチン，ダツラレクチ
ン，小麦胚芽レクチン等のレクチン類等が好ましく挙げ
られる。また、本発明に係る修飾結合能物質Ｃを調製す
るために用いられる、特定の測定対象物質と結合能物質
Ａ3との複合体に対して結合能を有する物質（以下、結
合能物質Ｃ’と略記する。）としては、測定対象物質と
遊離の結合能物質Ａ3との複合体形成反応及び複合体中
の検出物質（又は結合能物質Ａ3）を検出する反応を阻
害しないものであって、特定の測定対象物質、結合能物
質Ａ3又はこれらの複合体に対して結合能を有する物
質、或は結合能物質Ａ3に結合した検出物質に対して結
合能を有する物質であれば特に限定されることなく挙げ
られる。具体的には、例えば測定対象物質に対して結合
能を有する例えば抗体、例えばコンカナバリンＡ，レン
ズマメレクチン，インゲンマメレクチン，ダツラレクチ
ン，小麦胚芽レクチン等のレクチン類（但し、結合能物
質Ａ3とは結合部位が異なるもの。）等、或は結合能物
質Ａ3又は該検出物質に対して結合能を有する例えば抗
体、例えばコンカナバリンＡ，レンズマメレクチン，イ
ンゲンマメレクチン，ダツラレクチン，小麦胚芽レクチ
ン等のレクチン類等が好ましく挙げられる。
するために用いられる、特定の測定対象物質と結合能物
質Ａ2との複合体に対して結合能を有する物質（以下、
結合能物質Ｂ’と略記する。）としては、特定の測定対
象物質と結合能物質Ａ2との複合体形成反応及び該複合
体中の測定対象物質又は遊離の測定対象物質を検出する
反応を阻害しないものであって、測定対象物質、結合能
物質Ａ2又は該複合体に対して結合能を有する物質であ
れば特に限定されることなく挙げられる。具体的には、
例えば測定対象物質に対して結合能を有する例えば抗
体、例えばコンカナバリンＡ，レンズマメレクチン，イ
ンゲンマメレクチン，ダツラレクチン，小麦胚芽レクチ
ン等のレクチン類（但し、結合能物質Ａ2とは結合部位
が異なるもの。）等、或は結合能物質Ａ2に対して結合
能を有する例えば抗体、例えばコンカナバリンＡ，レン
ズマメレクチン，インゲンマメレクチン，ダツラレクチ
ン，小麦胚芽レクチン等のレクチン類等が好ましく挙げ
られる。また、本発明に係る修飾結合能物質Ｃを調製す
るために用いられる、特定の測定対象物質と結合能物質
Ａ3との複合体に対して結合能を有する物質（以下、結
合能物質Ｃ’と略記する。）としては、測定対象物質と
遊離の結合能物質Ａ3との複合体形成反応及び複合体中
の検出物質（又は結合能物質Ａ3）を検出する反応を阻
害しないものであって、特定の測定対象物質、結合能物
質Ａ3又はこれらの複合体に対して結合能を有する物
質、或は結合能物質Ａ3に結合した検出物質に対して結
合能を有する物質であれば特に限定されることなく挙げ
られる。具体的には、例えば測定対象物質に対して結合
能を有する例えば抗体、例えばコンカナバリンＡ，レン
ズマメレクチン，インゲンマメレクチン，ダツラレクチ
ン，小麦胚芽レクチン等のレクチン類（但し、結合能物
質Ａ3とは結合部位が異なるもの。）等、或は結合能物
質Ａ3又は該検出物質に対して結合能を有する例えば抗
体、例えばコンカナバリンＡ，レンズマメレクチン，イ
ンゲンマメレクチン，ダツラレクチン，小麦胚芽レクチ
ン等のレクチン類等が好ましく挙げられる。
【００１９】 本発明に係る結合能物質Ｂ’又はＣ’と
分離向上物質の結合方法は、結合能物質Ｂ’又はＣ’の
特定反応基と分離向上物質の特定反応基とを結合させる
方法、結合能物質Ｂ’又はＣ’の特定反応基を分離向上
物質で置換する方法、結合能物質Ｂ’又はＣ’に対して
結合能のある物質（例えば抗体、レクチン、抗原、イン
ヒビター、ＤＮＡ等）を介して結合能物質Ｂ’又はＣ’
と分離向上物質とを結合させる方法等が挙げられる。よ
り具体的には、例えば１）自体公知の酵素免疫測定法
（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）或いは蛍
光免疫測定法（ＦＩＡ）等において一般に行われている
自体公知の標識物質と抗体との結合方法（例えば、医学
実験口座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、
1971；図説 蛍光抗体、川生明著、第１版、(株)ソフト
サイエンス社、1983；酵素免疫測定法、石川栄治、河合
忠、宮井潔編、第２版、医学書院、1982、等）、２）自
体公知の物質の修飾および結合方法（例えば、蛋白質の
化学修飾〈上〉〈下〉、瓜谷郁三、志村憲助、中村道
徳、船津勝編集、第１版、(株)学会出版センター、198
1；ポリエチレングリコール修飾タンパク質、稲田祐二
他、生化学、第62巻、第11号、P1351ー1362、（社）日本
生化学会、1990；DNA PROBES, George H.K. and Mark
M.M. STOCKTON PRESS,1989 、等）等が何れも例外なく
挙げられ、これらの方法に準じて行えばよい。
分離向上物質の結合方法は、結合能物質Ｂ’又はＣ’の
特定反応基と分離向上物質の特定反応基とを結合させる
方法、結合能物質Ｂ’又はＣ’の特定反応基を分離向上
物質で置換する方法、結合能物質Ｂ’又はＣ’に対して
結合能のある物質（例えば抗体、レクチン、抗原、イン
ヒビター、ＤＮＡ等）を介して結合能物質Ｂ’又はＣ’
と分離向上物質とを結合させる方法等が挙げられる。よ
り具体的には、例えば１）自体公知の酵素免疫測定法
（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）或いは蛍
光免疫測定法（ＦＩＡ）等において一般に行われている
自体公知の標識物質と抗体との結合方法（例えば、医学
実験口座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、
1971；図説 蛍光抗体、川生明著、第１版、(株)ソフト
サイエンス社、1983；酵素免疫測定法、石川栄治、河合
忠、宮井潔編、第２版、医学書院、1982、等）、２）自
体公知の物質の修飾および結合方法（例えば、蛋白質の
化学修飾〈上〉〈下〉、瓜谷郁三、志村憲助、中村道
徳、船津勝編集、第１版、(株)学会出版センター、198
1；ポリエチレングリコール修飾タンパク質、稲田祐二
他、生化学、第62巻、第11号、P1351ー1362、（社）日本
生化学会、1990；DNA PROBES, George H.K. and Mark
M.M. STOCKTON PRESS,1989 、等）等が何れも例外なく
挙げられ、これらの方法に準じて行えばよい。
【００２０】 本発明の分離方法は、例えば以下の如く
して容易に実施し得る。 即ち、測定対象物質が、同一
の作用を有し、且つ同一の検出可能な化学特性を有する
２以上のものである場合は、先ず、該測定対象物質を含
有する試料と、結合能物質Ａ2と修飾結合能物質Ｂ１と
を、要すれば適当な緩衝液中に添加、混合して反応さ
せ、特定の測定対象物質と結合能物質Ａ2と修飾結合能
物質Ｂ１とが結合した複合体を形成させた後、該複合体
と遊離の結合能物質Ａ2等のその他の共存物質とを、分
離向上物質の性質に応じて選択された充填剤を充填した
カラムを装着したＨＰＬＣにより分離することにより、
容易に実施し得る。また、測定対象物質が、同一の作用
を有する２以上の測定対象物質又は類似した構造を有す
るが異なる作用を有する２以上のものである場合は、先
ず、該測定対象物質を含有する試料と、結合能物質Ａ3
と修飾結合能物質Ｃとを、要すれば適当な緩衝液中に添
加、混合して反応させ、測定対象物質と結合能物質Ａ3
とが結合した複合体（複合体Ａ）、及び特定の測定対象
物質と結合能物質Ａ3と修飾結合能物質Ｃとが結合した
複合体（複合体Ｂ）を形成させた後、該複合体Ａと該複
合体Ｂとを、分離向上物質の性質に応じて選択された充
填剤を充填したカラムを装着したＨＰＬＣにより分離す
ることにより、容易に実施し得る。
して容易に実施し得る。 即ち、測定対象物質が、同一
の作用を有し、且つ同一の検出可能な化学特性を有する
２以上のものである場合は、先ず、該測定対象物質を含
有する試料と、結合能物質Ａ2と修飾結合能物質Ｂ１と
を、要すれば適当な緩衝液中に添加、混合して反応さ
せ、特定の測定対象物質と結合能物質Ａ2と修飾結合能
物質Ｂ１とが結合した複合体を形成させた後、該複合体
と遊離の結合能物質Ａ2等のその他の共存物質とを、分
離向上物質の性質に応じて選択された充填剤を充填した
カラムを装着したＨＰＬＣにより分離することにより、
容易に実施し得る。また、測定対象物質が、同一の作用
を有する２以上の測定対象物質又は類似した構造を有す
るが異なる作用を有する２以上のものである場合は、先
ず、該測定対象物質を含有する試料と、結合能物質Ａ3
と修飾結合能物質Ｃとを、要すれば適当な緩衝液中に添
加、混合して反応させ、測定対象物質と結合能物質Ａ3
とが結合した複合体（複合体Ａ）、及び特定の測定対象
物質と結合能物質Ａ3と修飾結合能物質Ｃとが結合した
複合体（複合体Ｂ）を形成させた後、該複合体Ａと該複
合体Ｂとを、分離向上物質の性質に応じて選択された充
填剤を充填したカラムを装着したＨＰＬＣにより分離す
ることにより、容易に実施し得る。
【００２１】本発明の分離方法は、試料中の特定微量成
分を分離（或は精製）するのに有効に利用し得るが、該
微量成分を測定する際に本発明の分離方法を利用すると
特に効果的である。
分を分離（或は精製）するのに有効に利用し得るが、該
微量成分を測定する際に本発明の分離方法を利用すると
特に効果的である。
【００２２】
【００２３】
【００２４】本発明を微量成分の測定に利用した例を以
下に示す。 (1)測定対象物質が同一の作用を有し、且つ同一の検出
可能な化学特性を有する２以上の物質である測定方法
（測定方法(1)） 先ず、測定対象物質を含む生体由来の試料と、測定対象
物質の少なくとも１つと特異的に結合するがこれらのう
ちの少なくとも１つとは結合しない性質を有する物質
（即ち、結合能物質Ａ2）、及び分離向上物質で修飾さ
れ且つ測定対象物質と結合能物質Ａ2との複合体に対し
て結合する性質を有する物質（即ち、修飾結合能物質Ｂ
１）とを、要すれば適当な緩衝液中に添加、混合して反
応させ、特定の測定対象物質と結合能物質Ａ2と修飾結
合能物質Ｂ１との複合体を形成させた後、該複合体と遊
離の測定対象物質とを分離向上物質の性質に応じて選択
された充填剤を充填したカラムを装着したＨＰＬＣによ
り分離する。次いで、分離された複合体に含まれる測定
対象物質の量又は／及び遊離の測定対象物質の量を、測
定対象物質の性質に応じた測定方法により求めれば、試
料中の測定対象物質の何れかの量が求められる。上記の
反応に於て、複合体を形成させる際の結合能物質Ａ2の
使用濃度は、測定対象物質の検量限界や測定感度をどの
程度に設定するかによって適宜設定すればよく、特に限
定されないが、通常は反応液中に於いて、設定された検
量限界濃度に相当する測定対象物質全てと結合し得る濃
度以上、好ましくはその２倍濃度以上、より好ましくは
５倍濃度以上が反応液中に存在していることが望まし
い。また、複合体を形成させる際の修飾結合能物質Ｂ１
の使用濃度も、測定対象物質の検量限界をどの程度に設
定するかによって適宜設定すればよく、特に限定されな
い。但し、該使用濃度は、反応液中に存在する結合能物
質Ａ2全てが特定の測定対象物質と反応して生ずる複合
体全てと結合し得る濃度以上に設定しておかなければな
らないことは言うまでもない。
下に示す。 (1)測定対象物質が同一の作用を有し、且つ同一の検出
可能な化学特性を有する２以上の物質である測定方法
（測定方法(1)） 先ず、測定対象物質を含む生体由来の試料と、測定対象
物質の少なくとも１つと特異的に結合するがこれらのう
ちの少なくとも１つとは結合しない性質を有する物質
（即ち、結合能物質Ａ2）、及び分離向上物質で修飾さ
れ且つ測定対象物質と結合能物質Ａ2との複合体に対し
て結合する性質を有する物質（即ち、修飾結合能物質Ｂ
１）とを、要すれば適当な緩衝液中に添加、混合して反
応させ、特定の測定対象物質と結合能物質Ａ2と修飾結
合能物質Ｂ１との複合体を形成させた後、該複合体と遊
離の測定対象物質とを分離向上物質の性質に応じて選択
された充填剤を充填したカラムを装着したＨＰＬＣによ
り分離する。次いで、分離された複合体に含まれる測定
対象物質の量又は／及び遊離の測定対象物質の量を、測
定対象物質の性質に応じた測定方法により求めれば、試
料中の測定対象物質の何れかの量が求められる。上記の
反応に於て、複合体を形成させる際の結合能物質Ａ2の
使用濃度は、測定対象物質の検量限界や測定感度をどの
程度に設定するかによって適宜設定すればよく、特に限
定されないが、通常は反応液中に於いて、設定された検
量限界濃度に相当する測定対象物質全てと結合し得る濃
度以上、好ましくはその２倍濃度以上、より好ましくは
５倍濃度以上が反応液中に存在していることが望まし
い。また、複合体を形成させる際の修飾結合能物質Ｂ１
の使用濃度も、測定対象物質の検量限界をどの程度に設
定するかによって適宜設定すればよく、特に限定されな
い。但し、該使用濃度は、反応液中に存在する結合能物
質Ａ2全てが特定の測定対象物質と反応して生ずる複合
体全てと結合し得る濃度以上に設定しておかなければな
らないことは言うまでもない。
【００２５】 (2)測定対象物質が、同一の作用を有す
る２以上の物質又は類似した構造を有 するが異なる作
用を有する２以上の物質である測定方法（測定方法
(2)） 先ず、測定対象物質を含む生体由来の試料と、
測定対象物質の全てに対して結合能を有し且つ検出物質
により標識された物質（即ち、結合能物質Ａ3）及び特
定の測定対象物質に対する結合能を有し且つ測定対象物
質と結合能物質Ａ3との複合体の性質を変化させ得る物
質（分離向上物質）により修飾された物質（即ち、修飾
結合能物質Ｃ）を、要すれば適当な緩衝液中に添加、混
合して反応させ、測定対象物質と結合能物質Ａ3との複
合体（即ち、複合体Ａ）及び特定の測定対象物質と結合
能物質Ａ3と修飾結合能物質Ｃとの複合体（即ち、複合
体Ｂ）を形成させた後、複合体Ａ、複合体Ｂ及び遊離の
結合能物質Ａ3とを、分離向上物質の性質に応じて選択
された 充填剤を充填したカラムを装着したＨＰＬＣに
より分離する。次いで、分離された複合体Ａ中に含まれ
る検出物質の量又は／及び複合体Ｂ中に含まれる検出物
質の量を、検出物質が保有する性質に応じた測定方法に
より求めれば、試料中の測定対象物質の何れかの量が求
められる。
る２以上の物質又は類似した構造を有 するが異なる作
用を有する２以上の物質である測定方法（測定方法
(2)） 先ず、測定対象物質を含む生体由来の試料と、
測定対象物質の全てに対して結合能を有し且つ検出物質
により標識された物質（即ち、結合能物質Ａ3）及び特
定の測定対象物質に対する結合能を有し且つ測定対象物
質と結合能物質Ａ3との複合体の性質を変化させ得る物
質（分離向上物質）により修飾された物質（即ち、修飾
結合能物質Ｃ）を、要すれば適当な緩衝液中に添加、混
合して反応させ、測定対象物質と結合能物質Ａ3との複
合体（即ち、複合体Ａ）及び特定の測定対象物質と結合
能物質Ａ3と修飾結合能物質Ｃとの複合体（即ち、複合
体Ｂ）を形成させた後、複合体Ａ、複合体Ｂ及び遊離の
結合能物質Ａ3とを、分離向上物質の性質に応じて選択
された 充填剤を充填したカラムを装着したＨＰＬＣに
より分離する。次いで、分離された複合体Ａ中に含まれ
る検出物質の量又は／及び複合体Ｂ中に含まれる検出物
質の量を、検出物質が保有する性質に応じた測定方法に
より求めれば、試料中の測定対象物質の何れかの量が求
められる。
【００２６】 尚、結合能物質Ａ3自身が何らかの方法
により測定（検出）可能な物質である場合には、検出物
質により標識されていない結合能物質Ａ3を用いて上記
(2)の反応を行ない、得られた複合体中の結合能物質Ａ3
の量を結合能物質Ａ3の性質に応じた測定方法により求
めることによっても、同様に試料中の測定対象物質量を
求めることができる。
により測定（検出）可能な物質である場合には、検出物
質により標識されていない結合能物質Ａ3を用いて上記
(2)の反応を行ない、得られた複合体中の結合能物質Ａ3
の量を結合能物質Ａ3の性質に応じた測定方法により求
めることによっても、同様に試料中の測定対象物質量を
求めることができる。
【００２７】
【００２８】
【００２９】 本発明を利用した測定方法(1)により測
定可能な測定対象物質としては、それ自身が何らかの方
法により測定（検出）可能であって、且つ測定対象物質
の少なくとも１つとは互いに強い相互作用を及ぼしあ
い、強固な複合体を形成するが、それらの少なくとも１
つとは結合しない性質を有する物質が存在するものであ
れば、特に限定することなく挙げられるが、例えば血
清，血液，血漿，尿等の生体体液、リンパ球、血球、各
種細胞類等の生体由来の試料中に含まれる酵素等が代表
的なものとして挙げられる。更に具体的には、例えばア
ミラーゼ，アルカリホスファターゼ，酸性ホスファター
ゼ，γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴ
Ｐ），リパーゼ，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），乳酸脱
水素酵素（ＬＤＨ），グルタミン酸オキザロ酢酸トラン
スアミナーゼ（ＧＯＴ），グルタミン酸ピルビン酸トラ
ンスアミナーゼ（ＧＰＴ），レニン，プロテインキナー
ゼ（ＰＫ），チロシンキナーゼ等の酵素等が挙げられ
る。
定可能な測定対象物質としては、それ自身が何らかの方
法により測定（検出）可能であって、且つ測定対象物質
の少なくとも１つとは互いに強い相互作用を及ぼしあ
い、強固な複合体を形成するが、それらの少なくとも１
つとは結合しない性質を有する物質が存在するものであ
れば、特に限定することなく挙げられるが、例えば血
清，血液，血漿，尿等の生体体液、リンパ球、血球、各
種細胞類等の生体由来の試料中に含まれる酵素等が代表
的なものとして挙げられる。更に具体的には、例えばア
ミラーゼ，アルカリホスファターゼ，酸性ホスファター
ゼ，γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴ
Ｐ），リパーゼ，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），乳酸脱
水素酵素（ＬＤＨ），グルタミン酸オキザロ酢酸トラン
スアミナーゼ（ＧＯＴ），グルタミン酸ピルビン酸トラ
ンスアミナーゼ（ＧＰＴ），レニン，プロテインキナー
ゼ（ＰＫ），チロシンキナーゼ等の酵素等が挙げられ
る。
【００３０】 本発明を利用した測定方法(1)に係る測
定対象物質に対する結合能物質Ａ2としては、測定対象
物質の少なくとも１つとは互いに強い相互作用を及ぼし
あい、強固な複合体を形成するが、測定対象物質の少な
くとも１つとは結合しない物質であれば特に限定するこ
となく挙げられるが、例えば抗原性を有する物質（ハプ
テンを含む。）の特定の部分構造或は抗原決定部位に対
する抗体、特定構造の糖鎖に対して結合能を有する例え
ばコンカナバリンＡ，レンズマメレクチン，インゲンマ
メレクチン，ダツラレクチン，ヒイロチャワンタケレク
チン，ヒママメレクチン，ピーナッツレクチン，小麦胚
芽レクチン等のレクチン類、例えばアミラーゼ，クレア
チンキナーゼ（ＣＫ），グルタミン酸オキザロ酢酸トラ
ンスアミナーゼ（ＧＯＴ）等の酵素に対するインヒビタ
ー等が挙げられる。
定対象物質に対する結合能物質Ａ2としては、測定対象
物質の少なくとも１つとは互いに強い相互作用を及ぼし
あい、強固な複合体を形成するが、測定対象物質の少な
くとも１つとは結合しない物質であれば特に限定するこ
となく挙げられるが、例えば抗原性を有する物質（ハプ
テンを含む。）の特定の部分構造或は抗原決定部位に対
する抗体、特定構造の糖鎖に対して結合能を有する例え
ばコンカナバリンＡ，レンズマメレクチン，インゲンマ
メレクチン，ダツラレクチン，ヒイロチャワンタケレク
チン，ヒママメレクチン，ピーナッツレクチン，小麦胚
芽レクチン等のレクチン類、例えばアミラーゼ，クレア
チンキナーゼ（ＣＫ），グルタミン酸オキザロ酢酸トラ
ンスアミナーゼ（ＧＯＴ）等の酵素に対するインヒビタ
ー等が挙げられる。
【００３１】
【００３２】 本発明を利用した測定方法(2)により測
定可能な測定対象物質としては、測定対象物質の全てと
結合し、且つそれ自身が何らかの方法により検出可能な
性質を有しているか又は検出物質により標識が可能な物
質が存在し、更に測定対象物質の少なくとも１つとは互
いに強い相互作用（affinity；親和力或は親和性）を及
ぼしあい、強固な複合体を形成するが、それらの少なく
とも１つとは結合しない物質が存在するものであれば、
特に限定することなく挙げられるが、例えば血清，血
液，血漿，尿等の生体体液、リンパ球、血球、各種細胞
類等の生体由来の試料中に含まれる酵素、生理活性物
質、癌関連抗原、糖鎖を有する物質等が代表的なものと
して挙げられる。更に具体的には、例えばアミラーゼ，
アルカリホスファターゼ，酸性ホスファターゼ，γ-グ
ルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴＰ），リパー
ゼ，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），乳酸脱水素酵素（Ｌ
ＤＨ），グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ
（ＧＯＴ），グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナー
ゼ（ＧＰＴ），レニン，プロテインキナーゼ，チロシン
キナーゼ等の酵素類、例えばステロイドホルモン，ヒト
絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ），プロラクチン，甲状
腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），黄体形成ホルモン（ＬＨ）
等の生理活性物質、例えば前立腺特異抗原（ＰＳＡ），
α2-マクログロブリン，癌胎児性抗原（ＣＥＡ），α-
フェトプロテイン等の癌関連抗原等が好ましく挙げられ
る。
定可能な測定対象物質としては、測定対象物質の全てと
結合し、且つそれ自身が何らかの方法により検出可能な
性質を有しているか又は検出物質により標識が可能な物
質が存在し、更に測定対象物質の少なくとも１つとは互
いに強い相互作用（affinity；親和力或は親和性）を及
ぼしあい、強固な複合体を形成するが、それらの少なく
とも１つとは結合しない物質が存在するものであれば、
特に限定することなく挙げられるが、例えば血清，血
液，血漿，尿等の生体体液、リンパ球、血球、各種細胞
類等の生体由来の試料中に含まれる酵素、生理活性物
質、癌関連抗原、糖鎖を有する物質等が代表的なものと
して挙げられる。更に具体的には、例えばアミラーゼ，
アルカリホスファターゼ，酸性ホスファターゼ，γ-グ
ルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴＰ），リパー
ゼ，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），乳酸脱水素酵素（Ｌ
ＤＨ），グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ
（ＧＯＴ），グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナー
ゼ（ＧＰＴ），レニン，プロテインキナーゼ，チロシン
キナーゼ等の酵素類、例えばステロイドホルモン，ヒト
絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ），プロラクチン，甲状
腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），黄体形成ホルモン（ＬＨ）
等の生理活性物質、例えば前立腺特異抗原（ＰＳＡ），
α2-マクログロブリン，癌胎児性抗原（ＣＥＡ），α-
フェトプロテイン等の癌関連抗原等が好ましく挙げられ
る。
【００３３】 本発明を利用した測定方法(2)に係る測
定対象物質に対する結合能物質Ａ3としては、測定対象
物質の全てと結合し、且つそれ自身が何らかの方法によ
り検出可能な性質を有しているか又は検出物質により標
識されている物質であれば特に限定することなく挙げら
れる。結合能物質Ａ3に係る、測定対象物質全てに対し
て結合能を有する物質の具体例としては、例えば抗原性
を有する物質（ハプテンを含む。）の特定の部分構造或
は抗原決定部位に対する抗体や特定構造の糖鎖に対して
結合能を有する例えばコンカナバリンＡ，レンズマメレ
クチン，インゲンマメレクチン，ダツラレクチン，ヒイ
ロチャワンタケレクチン，ヒママメレクチン，ピーナッ
ツレクチン，小麦胚芽レクチン等のレクチン類、或はア
ミラーゼ，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），グルタミン酸
オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）等の酵素に
対するインヒビター等が挙げられ、これらに検出物質を
標識したものが結合能物質Ａ3の具体例として好ましく
挙げられる。
定対象物質に対する結合能物質Ａ3としては、測定対象
物質の全てと結合し、且つそれ自身が何らかの方法によ
り検出可能な性質を有しているか又は検出物質により標
識されている物質であれば特に限定することなく挙げら
れる。結合能物質Ａ3に係る、測定対象物質全てに対し
て結合能を有する物質の具体例としては、例えば抗原性
を有する物質（ハプテンを含む。）の特定の部分構造或
は抗原決定部位に対する抗体や特定構造の糖鎖に対して
結合能を有する例えばコンカナバリンＡ，レンズマメレ
クチン，インゲンマメレクチン，ダツラレクチン，ヒイ
ロチャワンタケレクチン，ヒママメレクチン，ピーナッ
ツレクチン，小麦胚芽レクチン等のレクチン類、或はア
ミラーゼ，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），グルタミン酸
オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）等の酵素に
対するインヒビター等が挙げられ、これらに検出物質を
標識したものが結合能物質Ａ3の具体例として好ましく
挙げられる。
【００３４】
【００３５】本発明の分離方法を利用した測定方法に於
いて用いられる検出物質としては、例えば酵素免疫測定
法（ＥＩＡ）に於いて用いられるアルカリホスファター
ゼ，β-ガラクトシダーゼ，パーオキシダーゼ，マイク
ロパーオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコ
ース-6-リン酸脱水素酵素，アセチルコリンエステラー
ゼ，リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類、
例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で用いられる
99mＴc，131Ｉ，125Ｉ，14Ｃ，3Ｈ等の放射性同位元
素、例えば蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）で用いられるフル
オレセイン，ダンシル，フルオレスカミン，クマリン，
ナフチルアミン或はこれらの誘導体等の蛍光性物質、例
えばルシフェリン，イソルミノール，ルミノール，ビス
(2,4,6-トリフロロフェニル)オキザレート等の発光性物
質、例えばフェノール，ナフトール，アントラセン或は
これらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば
4-アミノ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシ
ル，3-アミノ-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-1-オキ
シル，2,6-ジ-t-ブチル-α-(3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソ
-2,5-シクロヘキサジエン-1-イリデン)-p-トリルオキシ
ル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラ
ベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられるが、
これらに限定されるものではないことは言うまでもな
い。
いて用いられる検出物質としては、例えば酵素免疫測定
法（ＥＩＡ）に於いて用いられるアルカリホスファター
ゼ，β-ガラクトシダーゼ，パーオキシダーゼ，マイク
ロパーオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコ
ース-6-リン酸脱水素酵素，アセチルコリンエステラー
ゼ，リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類、
例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で用いられる
99mＴc，131Ｉ，125Ｉ，14Ｃ，3Ｈ等の放射性同位元
素、例えば蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）で用いられるフル
オレセイン，ダンシル，フルオレスカミン，クマリン，
ナフチルアミン或はこれらの誘導体等の蛍光性物質、例
えばルシフェリン，イソルミノール，ルミノール，ビス
(2,4,6-トリフロロフェニル)オキザレート等の発光性物
質、例えばフェノール，ナフトール，アントラセン或は
これらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば
4-アミノ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシ
ル，3-アミノ-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-1-オキ
シル，2,6-ジ-t-ブチル-α-(3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソ
-2,5-シクロヘキサジエン-1-イリデン)-p-トリルオキシ
ル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラ
ベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられるが、
これらに限定されるものではないことは言うまでもな
い。
【００３６】 結合能物質Ａ3に、上記した如き検出物
質を標識する方法としては、自体公知のＥＩＡ、ＲＩＡ
或はＦＩＡ等に於いて一般に行われている自体公知の標
識方法（例えば、医化学実験講座、第８巻、山村雄一監
修、第１版、中山書店、1971；図説 蛍光抗体、川生明
著、第１版、(株)ソフトサイエンス社、1983；酵素免疫
測定法、石川栄治、河合忠、宮井潔編、第２版、医学書
院、1982等）が何れも例外なく挙げられ、これらに準じ
て行えばよい。また、標識方法として、アビジン（又は
ストレプトアビジン）とビオチンの反応を利用した常法
を利用しても良いことは言うまでもない。
質を標識する方法としては、自体公知のＥＩＡ、ＲＩＡ
或はＦＩＡ等に於いて一般に行われている自体公知の標
識方法（例えば、医化学実験講座、第８巻、山村雄一監
修、第１版、中山書店、1971；図説 蛍光抗体、川生明
著、第１版、(株)ソフトサイエンス社、1983；酵素免疫
測定法、石川栄治、河合忠、宮井潔編、第２版、医学書
院、1982等）が何れも例外なく挙げられ、これらに準じ
て行えばよい。また、標識方法として、アビジン（又は
ストレプトアビジン）とビオチンの反応を利用した常法
を利用しても良いことは言うまでもない。
【００３７】 本発明に係る、それ自身何らかの方法に
より測定（検出）可能な結合能物質Ａ3の例としては、
例えば酵素、蛍光性物質、発光性物質或は紫外部に吸収
を有する物質等のように、それ自身上記した如き検出物
質としての性質を有しているものが挙げられる。
より測定（検出）可能な結合能物質Ａ3の例としては、
例えば酵素、蛍光性物質、発光性物質或は紫外部に吸収
を有する物質等のように、それ自身上記した如き検出物
質としての性質を有しているものが挙げられる。
【００３８】 本発明に係る分離向上物質は、測定対象
物質や結合能物質Ａ2又はＡ3（又は／及び結合能物質
Ｂ’又はＣ’）の性質（例えばｐＨ安定性，疎水度，水
溶液への溶解度，等電点等）を考慮した上で適宜選択し
て用いれば足りる。
物質や結合能物質Ａ2又はＡ3（又は／及び結合能物質
Ｂ’又はＣ’）の性質（例えばｐＨ安定性，疎水度，水
溶液への溶解度，等電点等）を考慮した上で適宜選択し
て用いれば足りる。
【００３９】また、ＨＰＬＣで使用されるカラムの充填
剤の種類も、分離向上物質の性質に応じて適宜選択すれ
ば足りる。
剤の種類も、分離向上物質の性質に応じて適宜選択すれ
ば足りる。
【００４０】以下に、該充填剤と分離向上物質の組み合
わせについて更に詳細に説明する。
わせについて更に詳細に説明する。
【００４１】 ゲル瀘過用充填剤を用いる場合 分子
量の差を利用して目的物とその他の共存物質とを分離す
る性質を有する充填剤であるので、分離向上物質として
はタンパク質、ポリエチレングリコール等の合成高分
子、ポリアミノ酸等の高分子物質が好ましく挙げられ
る。即ち、測定対象物質と、結合能物質Ａ2又はＡ3との
複合体に、修飾結合能物質Ｂ１又はＣを更に結合させる
ことにより、該複合体の分子量を目的のものに変更する
ことが可能となる。修飾結合能物質Ｂ１又はＣの分子量
としては、該複合体の分子量の1.2倍以上、好ましくは
1.5倍以上、さらに好ましくは２倍以上が、高分離能が
得られるので好ましい。上記の原理に基づく分離方法
は、測定対象物質を含む試料が、例えば血清の如く分析
に影響を与える物質を種々含んでおり、且つそれらの分
子量に幅がある場合に特に有効である。即ち、このよう
な試料において共存物質による影響を回避するには、分
析に影響を与える物質の分子量の最大値よりも、複合体
の分子量を大きくすれば良いのであるから、分離向上物
質としてこの条件を満足し得る分子量を有するものを選
択して用いれば足りる。尚、従来の方法の如く結合させ
る結合能物質Ａ2又はＡ3の数で複合体の分子量を調節す
るとすれば、（目的の分子量／結合能物質Ａ2又はＡ3の
分子量）個の結合能物質Ａ2又はＡ3を測定対象物質に結
合させることが必要となるので、この方法が、必要な数
の結合部位を有する物質を測定対象とする場合にしか利
用できないと言う問題を有していることは明らかであ
る。また、本発明に於いて、ゲル瀘過用充填剤の分画分
子量より大きい分子量の分離向上物質を結合させた場合
には、測定対象物質を含む複合体はカラムのボイド部分
に溶出するので、最も短時間で分析できることになる。
尚、この場合、分離向上物質は単一分子量の物質ではな
くてもよいこと、即ちゲル瀘過用充填剤の分画分子量よ
り大きい分子量を有する物質であればよいことは言うま
でもない。また、ゲル瀘過用充填剤としては、例えばYM
C-パック Diol-200（(株)ワイエムシー商品名）、YMC-
パック Diol-300（(株)ワイエムシー商品名）、TSKゲ
ル(東ソー(株)商品名)等が挙げられる。
量の差を利用して目的物とその他の共存物質とを分離す
る性質を有する充填剤であるので、分離向上物質として
はタンパク質、ポリエチレングリコール等の合成高分
子、ポリアミノ酸等の高分子物質が好ましく挙げられ
る。即ち、測定対象物質と、結合能物質Ａ2又はＡ3との
複合体に、修飾結合能物質Ｂ１又はＣを更に結合させる
ことにより、該複合体の分子量を目的のものに変更する
ことが可能となる。修飾結合能物質Ｂ１又はＣの分子量
としては、該複合体の分子量の1.2倍以上、好ましくは
1.5倍以上、さらに好ましくは２倍以上が、高分離能が
得られるので好ましい。上記の原理に基づく分離方法
は、測定対象物質を含む試料が、例えば血清の如く分析
に影響を与える物質を種々含んでおり、且つそれらの分
子量に幅がある場合に特に有効である。即ち、このよう
な試料において共存物質による影響を回避するには、分
析に影響を与える物質の分子量の最大値よりも、複合体
の分子量を大きくすれば良いのであるから、分離向上物
質としてこの条件を満足し得る分子量を有するものを選
択して用いれば足りる。尚、従来の方法の如く結合させ
る結合能物質Ａ2又はＡ3の数で複合体の分子量を調節す
るとすれば、（目的の分子量／結合能物質Ａ2又はＡ3の
分子量）個の結合能物質Ａ2又はＡ3を測定対象物質に結
合させることが必要となるので、この方法が、必要な数
の結合部位を有する物質を測定対象とする場合にしか利
用できないと言う問題を有していることは明らかであ
る。また、本発明に於いて、ゲル瀘過用充填剤の分画分
子量より大きい分子量の分離向上物質を結合させた場合
には、測定対象物質を含む複合体はカラムのボイド部分
に溶出するので、最も短時間で分析できることになる。
尚、この場合、分離向上物質は単一分子量の物質ではな
くてもよいこと、即ちゲル瀘過用充填剤の分画分子量よ
り大きい分子量を有する物質であればよいことは言うま
でもない。また、ゲル瀘過用充填剤としては、例えばYM
C-パック Diol-200（(株)ワイエムシー商品名）、YMC-
パック Diol-300（(株)ワイエムシー商品名）、TSKゲ
ル(東ソー(株)商品名)等が挙げられる。
【００４２】 疎水クロマトグラフィー用充填剤を用
いる場合 疎水性の差を利用して目的物とその他の共存
物質とを分離する性質を有する充填剤であるので、分離
向上物質としては例えばα−キモトリプシノーゲン，β
−ガラクトシダーゼ等の疎水度が高いタンパク質、例え
ばフェニルアラニン，プロリン等の疎水性が高いアミノ
酸を含むペプチド、例えばポリグルタミン酸，ポリアス
パラギン酸，ポリリジン，ポリアルギニン，ポリフェニ
ルアラニン，ポリチロシン等のポリアミノ酸、炭素数３
〜10のアルキル鎖、例えば臭素，塩素，沃素等のハロゲ
ン原子、例えばオクチルアミン，ＥＭＣＳ，ＢＭＨ等の
疎水性の高い化学物質、例えばパルミチン酸，オレイン
酸，ステアリン酸等の脂肪酸等の複合体の疎水度を適宜
設定することができる物質が好ましく挙げられる。尚、
分離向上物質としてペプチドを用いる場合は、疎水性の
高いアミノ酸を含むペプチドが好ましく、その鎖長の選
択により疎水性を調節すればよい。また、疎水性アミノ
酸のみで構成されたペプチド及びポリアミノ酸ではアミ
ノ酸の数が15個以上になると水への溶解度が低下するの
で２〜15個が好ましい。分離向上物質がハロゲン原子の
場合、修飾結合能物質Ｂ１又はＣは、結合能物質Ｂ’又
はＣ’を直接ハロゲン化すれば容易に得ることができ、
導入ハロゲン量を変えることにより適宜疎水性を調節で
きる。疎水性の高い化学物質としては、上記したもの以
外にもアルキル鎖が長い物質が挙げられ、アルキル鎖長
を適宜選択することにより疎水性を調節することができ
る。尚、疎水性があまりにも高い分離向上物質は水への
溶解度が低いので、結合能物質Ｂ’又はＣ’と、分離向
上物質の結合反応時に有機溶媒を用いる必要が生じ、得
られる修飾結合能物質の変性や活性の低下が起こった
り、或は、修飾結合能物質が水に不溶となる等の問題が
生じる場合があるので、分離向上物質として好ましいも
のとは言い難い。また、疎水クロマトグラフィー用充填
剤としては、例えばブチル-NPR(東ソー(株)商品名)、ブ
チル MCIゲル（三菱化成(株)商品名)、フェニル MCIゲ
ル(三菱化成(株)商品名)等が挙げられる。
いる場合 疎水性の差を利用して目的物とその他の共存
物質とを分離する性質を有する充填剤であるので、分離
向上物質としては例えばα−キモトリプシノーゲン，β
−ガラクトシダーゼ等の疎水度が高いタンパク質、例え
ばフェニルアラニン，プロリン等の疎水性が高いアミノ
酸を含むペプチド、例えばポリグルタミン酸，ポリアス
パラギン酸，ポリリジン，ポリアルギニン，ポリフェニ
ルアラニン，ポリチロシン等のポリアミノ酸、炭素数３
〜10のアルキル鎖、例えば臭素，塩素，沃素等のハロゲ
ン原子、例えばオクチルアミン，ＥＭＣＳ，ＢＭＨ等の
疎水性の高い化学物質、例えばパルミチン酸，オレイン
酸，ステアリン酸等の脂肪酸等の複合体の疎水度を適宜
設定することができる物質が好ましく挙げられる。尚、
分離向上物質としてペプチドを用いる場合は、疎水性の
高いアミノ酸を含むペプチドが好ましく、その鎖長の選
択により疎水性を調節すればよい。また、疎水性アミノ
酸のみで構成されたペプチド及びポリアミノ酸ではアミ
ノ酸の数が15個以上になると水への溶解度が低下するの
で２〜15個が好ましい。分離向上物質がハロゲン原子の
場合、修飾結合能物質Ｂ１又はＣは、結合能物質Ｂ’又
はＣ’を直接ハロゲン化すれば容易に得ることができ、
導入ハロゲン量を変えることにより適宜疎水性を調節で
きる。疎水性の高い化学物質としては、上記したもの以
外にもアルキル鎖が長い物質が挙げられ、アルキル鎖長
を適宜選択することにより疎水性を調節することができ
る。尚、疎水性があまりにも高い分離向上物質は水への
溶解度が低いので、結合能物質Ｂ’又はＣ’と、分離向
上物質の結合反応時に有機溶媒を用いる必要が生じ、得
られる修飾結合能物質の変性や活性の低下が起こった
り、或は、修飾結合能物質が水に不溶となる等の問題が
生じる場合があるので、分離向上物質として好ましいも
のとは言い難い。また、疎水クロマトグラフィー用充填
剤としては、例えばブチル-NPR(東ソー(株)商品名)、ブ
チル MCIゲル（三菱化成(株)商品名)、フェニル MCIゲ
ル(三菱化成(株)商品名)等が挙げられる。
【００４３】イオン交換クロマトグフィー用充填剤を
用いる場合 イオン性の差を利用して目的物とその他の共存物質とを
分離するので、分離向上物質としては例えばリゾチー
ム，チトクロームＣ等の塩基性タンパク質、例えばトリ
プシンインヒビター等の酸性タンパク質、例えばアルギ
ニン，リジン等の塩基性アミノ酸の残基又は、アスパラ
ギン酸，グルタミン酸等の酸性アミノ酸の残基を含むペ
プチド、上記した如きアミノ酸残基を50個以上含むポリ
アミノ酸、例えばパルミチン酸，オレイン酸，ステアリ
ン酸等の脂肪酸等が好ましく挙げられる。尚、イオン交
換クロマトグラフィーに於ては、一般に、測定対象物を
カラムに一度吸着してから溶出するほうが、高分離能と
高特異性が得られることから、カチオン性分離向上物質
を使用する場合にはカチオン交換クロマトグラフィー用
充填剤を、アニオン性分離向上物質を使用する場合には
アニオン交換クロマトグラフィー用充填剤を使用するこ
とが好ましい。分離向上物質が塩基性アミノ酸残基（又
は酸性アミノ酸残基）のみで構成されたペプチドやポリ
アミノ酸の場合、アミノ酸残基数を調節することにより
複合体の溶出時間を自由に調節できるが、アミノ酸残基
数として通常５個以上、好ましくは50個以上、更に好ま
しくは100個以上から成るペプチド又はポリアミノ酸を
用いると、複合体の溶出位置が血清や尿中の生体成分の
それと完全に分離できるので望ましい。また、上記ペプ
チドやポリアミノ酸が合成ペプチド又は合成ポリアミノ
酸の場合、ペプチド（又はポリアミノ酸）の長さとイオ
ン性は比例関係にあるので、合成する際にペプチド（又
はポリアミノ酸）の長さを適宜調節して分離向上物質と
して用いることにより、複合体の溶出位置を容易に調節
することができる。また、測定に影響を与える血清成分
が複数の場合でも、分離向上物質を用いて複合体のイオ
ン性をこれら血清成分が有するイオン性よりも大きくし
ておけば、ステップワイズグラジエントを利用すること
により分析に要する時間を短縮することができるという
効果が生ずる。イオン交換クロマトグラフィー用の充填
剤は、一般に交換能（イオン性物質の絶対吸着能）が高
いので血清等の生体由来試料の如くイオン性の共存物質
の絶対量が多い試料の分析を行う場合であっても、分離
向上物質の結合した複合体を全て吸着することができる
ので、該複合体を共存物質による影響を殆ど回避できる
位置に溶出させることが可能である。また、本方法に利
用できる分離向上物質は、水に対する溶解度が高いの
で、これが結合した複合体の水溶性は結合前のそれより
も高くなるので、本方法に於いては、分離向上物質が結
合した複合体の形成反応時に測定対象物の変性、失活が
起こる可能性は殆どない。イオン交換クロマトグラフィ
ー用充填剤としては、例えばDEAE-MCIゲル（三菱化成
(株)商品名)、QAE MCIゲル（三菱化成(株)商品名)、ワ
コービーズDEAEゲル（和光純薬工業(株)商品名)等のア
ニオン交換クロマトグフィ用充填剤、或は例えばSP MCI
ゲル（三菱化成(株)商品名)、CM MCIゲル（三菱化成
(株)商品名)、ワコービーズCMゲル（和光純薬工業(株)
商品名)等のカチオン交換クロマトグラフィー用充填剤
等が挙げられる。
用いる場合 イオン性の差を利用して目的物とその他の共存物質とを
分離するので、分離向上物質としては例えばリゾチー
ム，チトクロームＣ等の塩基性タンパク質、例えばトリ
プシンインヒビター等の酸性タンパク質、例えばアルギ
ニン，リジン等の塩基性アミノ酸の残基又は、アスパラ
ギン酸，グルタミン酸等の酸性アミノ酸の残基を含むペ
プチド、上記した如きアミノ酸残基を50個以上含むポリ
アミノ酸、例えばパルミチン酸，オレイン酸，ステアリ
ン酸等の脂肪酸等が好ましく挙げられる。尚、イオン交
換クロマトグラフィーに於ては、一般に、測定対象物を
カラムに一度吸着してから溶出するほうが、高分離能と
高特異性が得られることから、カチオン性分離向上物質
を使用する場合にはカチオン交換クロマトグラフィー用
充填剤を、アニオン性分離向上物質を使用する場合には
アニオン交換クロマトグラフィー用充填剤を使用するこ
とが好ましい。分離向上物質が塩基性アミノ酸残基（又
は酸性アミノ酸残基）のみで構成されたペプチドやポリ
アミノ酸の場合、アミノ酸残基数を調節することにより
複合体の溶出時間を自由に調節できるが、アミノ酸残基
数として通常５個以上、好ましくは50個以上、更に好ま
しくは100個以上から成るペプチド又はポリアミノ酸を
用いると、複合体の溶出位置が血清や尿中の生体成分の
それと完全に分離できるので望ましい。また、上記ペプ
チドやポリアミノ酸が合成ペプチド又は合成ポリアミノ
酸の場合、ペプチド（又はポリアミノ酸）の長さとイオ
ン性は比例関係にあるので、合成する際にペプチド（又
はポリアミノ酸）の長さを適宜調節して分離向上物質と
して用いることにより、複合体の溶出位置を容易に調節
することができる。また、測定に影響を与える血清成分
が複数の場合でも、分離向上物質を用いて複合体のイオ
ン性をこれら血清成分が有するイオン性よりも大きくし
ておけば、ステップワイズグラジエントを利用すること
により分析に要する時間を短縮することができるという
効果が生ずる。イオン交換クロマトグラフィー用の充填
剤は、一般に交換能（イオン性物質の絶対吸着能）が高
いので血清等の生体由来試料の如くイオン性の共存物質
の絶対量が多い試料の分析を行う場合であっても、分離
向上物質の結合した複合体を全て吸着することができる
ので、該複合体を共存物質による影響を殆ど回避できる
位置に溶出させることが可能である。また、本方法に利
用できる分離向上物質は、水に対する溶解度が高いの
で、これが結合した複合体の水溶性は結合前のそれより
も高くなるので、本方法に於いては、分離向上物質が結
合した複合体の形成反応時に測定対象物の変性、失活が
起こる可能性は殆どない。イオン交換クロマトグラフィ
ー用充填剤としては、例えばDEAE-MCIゲル（三菱化成
(株)商品名)、QAE MCIゲル（三菱化成(株)商品名)、ワ
コービーズDEAEゲル（和光純薬工業(株)商品名)等のア
ニオン交換クロマトグフィ用充填剤、或は例えばSP MCI
ゲル（三菱化成(株)商品名)、CM MCIゲル（三菱化成
(株)商品名)、ワコービーズCMゲル（和光純薬工業(株)
商品名)等のカチオン交換クロマトグラフィー用充填剤
等が挙げられる。
【００４４】 本発明は上記した何れのクロマトグラフ
ィーを利用したＨＰＬＣによっても実施可能であるが、
中でもイオン交換クロマトグラフィーの利用が本発明に
とって最も好ましい。その理由としては例えば以下のよ
うな点が挙げられる。 例えば、ゲル濾過クロマトグラ
フィーを利用して本発明の分離方法を実施するためには
適当な長さのカラムを用いることが必要であるので、ゲ
ル濾過クロマトグラフィーを利用した場合には、イオン
交換クロマトグラフィーを利用する場合に比較して分離
時間が長くなるという欠点がある。それ故、分離時間の
短縮が要求されるときにはイオン交換クロマトグラフィ
ーを利用する方が好ましい。さらに、ゲル濾過クロマト
グラフィーには、非常に高い分子量（分子の大きさが約
1000オングストローム以上）を持つ測定対象物質の分離
には適していない、という欠点もある。また、疎水クロ
マトグラフィーの場合、測定対象物質がタンパク質のよ
うな高次元構造を持つ生理活性物質であるときには、分
離操作の際に使用する有機溶媒により高次元構造が破壊
されて複合体中の測定対象物質の活性が失われるという
問題が生じる場合がある。このような理由から、分離向
上物質として高い疎水性を持つ物質を使用することは好
ましくない。さらに、分離向上物質として疎水性物質が
結合した結合能物質Ｂ’又はＣ’の疎水性が高くなるほ
ど、複合体の水溶性が低下して沈澱し易くなるため分離
が難しくなるという問題もある。一方、イオン交換クロ
マトグラフィーは、イオン性の微妙な違いに基づいて、
より効果的に測定対象物質を分離することができる。更
に、イオン交換クロマトグラフィーによれば、様々なイ
オン性を持つ分離向上物質を任意に選択することができ
るので、最適ｐＨ条件下で測定対象物質の分離を行うこ
とができる。更にまた、イオン交換クロマトグラフィー
に於いて用いられる分離向上物質は、それ自体高い水溶
性を持つので、分離向上物質を測定対象物質に結合させ
ても、測定対象物質の沈澱が起こる恐れは殆どなく、安
定な状態で分離操作を実行することが可能になる。
ィーを利用したＨＰＬＣによっても実施可能であるが、
中でもイオン交換クロマトグラフィーの利用が本発明に
とって最も好ましい。その理由としては例えば以下のよ
うな点が挙げられる。 例えば、ゲル濾過クロマトグラ
フィーを利用して本発明の分離方法を実施するためには
適当な長さのカラムを用いることが必要であるので、ゲ
ル濾過クロマトグラフィーを利用した場合には、イオン
交換クロマトグラフィーを利用する場合に比較して分離
時間が長くなるという欠点がある。それ故、分離時間の
短縮が要求されるときにはイオン交換クロマトグラフィ
ーを利用する方が好ましい。さらに、ゲル濾過クロマト
グラフィーには、非常に高い分子量（分子の大きさが約
1000オングストローム以上）を持つ測定対象物質の分離
には適していない、という欠点もある。また、疎水クロ
マトグラフィーの場合、測定対象物質がタンパク質のよ
うな高次元構造を持つ生理活性物質であるときには、分
離操作の際に使用する有機溶媒により高次元構造が破壊
されて複合体中の測定対象物質の活性が失われるという
問題が生じる場合がある。このような理由から、分離向
上物質として高い疎水性を持つ物質を使用することは好
ましくない。さらに、分離向上物質として疎水性物質が
結合した結合能物質Ｂ’又はＣ’の疎水性が高くなるほ
ど、複合体の水溶性が低下して沈澱し易くなるため分離
が難しくなるという問題もある。一方、イオン交換クロ
マトグラフィーは、イオン性の微妙な違いに基づいて、
より効果的に測定対象物質を分離することができる。更
に、イオン交換クロマトグラフィーによれば、様々なイ
オン性を持つ分離向上物質を任意に選択することができ
るので、最適ｐＨ条件下で測定対象物質の分離を行うこ
とができる。更にまた、イオン交換クロマトグラフィー
に於いて用いられる分離向上物質は、それ自体高い水溶
性を持つので、分離向上物質を測定対象物質に結合させ
ても、測定対象物質の沈澱が起こる恐れは殆どなく、安
定な状態で分離操作を実行することが可能になる。
【００４５】 本発明の測定方法を用いて測定対象物質
の測定を行った場合には、目的の測定対象物質のピーク
を血清や尿等の成分の影響を受けない位置に移動させる
ことができる。そればかりか、測定対象物質に応じて適
宜修飾結合能物質Ｂ１又はＣを選択して用いることによ
り、種々の測定対象物質を含む複合体の溶出位置を一致
させることができるので、特定分析条件下のＨＰＬＣを
用いて、多種の測定対象物質の測定を行うことができる
という効果も生ずる。
の測定を行った場合には、目的の測定対象物質のピーク
を血清や尿等の成分の影響を受けない位置に移動させる
ことができる。そればかりか、測定対象物質に応じて適
宜修飾結合能物質Ｂ１又はＣを選択して用いることによ
り、種々の測定対象物質を含む複合体の溶出位置を一致
させることができるので、特定分析条件下のＨＰＬＣを
用いて、多種の測定対象物質の測定を行うことができる
という効果も生ずる。
【００４６】 本発明の測定方法に於いて、ＨＰＬＣに
より分離された複合体（修飾結合能物質Ｂ１又はＣが結
合しているものと結合していないものの何れをも含
む。）中に含まれる検出物質（又は、結合能物質Ａ3又
は測定対象物質）の量の測定は、検出物質（又は、結合
能物質Ａ3又は測定対象物質）が有している、何らかの
方法により検出し得る性質に応じて夫々所定の方法に従
って実施される。例えば、その性質が酵素活性の場合に
はＥＩＡの常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質 核
酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・ 南原利夫・辻章夫・
石川榮治編集、51〜63頁、共立出版（株）、1987年９月
10日発行」等に記載された方法に準じて測定を行えばよ
く、検出物質が放射性物質の場合にはＲＩＡの常法に従
い、該放射性物質の出す放射線の種類及び強さに応じて
液浸型ＧＭカウンター，液体シンチレーションカウンタ
ー，井戸型シンチレーションカウンター，ＨＰＬＣ用カ
ウンター等の測定機器を適宜選択して使用し、測定を行
えばよい（例えば医化学実験講座、第８巻、山村雄一監
修、第１版、中山書店、1971等参照。）。また、その性
質が蛍光性の場合には蛍光光度計等の測定機器を用いる
ＦＩＡの常法、例えば「図説 蛍光抗体、川生明著、第
１版、( 株)ソフトサイエンス社、1983」等に記載され
た方法に準じて測定を行えばよく、その性質が発光性の
場合にはフォトンカウンター等の測定機器を用いる常
法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質 核酸 酵素 別冊
No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、2
52〜263頁、共立出版（株）、1987年９月10日発行」等
に記載された方法に準じて測定を行えばよい。更に、そ
の性質が紫外部に吸収を有する性質の場合には分光光度
計等の測定機器を用いる常法によって測定を行えばよ
く、検出物質がスピンの性質を有する物質の場合には電
子スピン共鳴装置を用いる常法、例えば「酵素免疫測定
法、蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川 常廣・南原利
夫・辻章夫・石川榮治編集、264〜271頁、共立出版
（株）、1987年９月10日発行」等に記載された方法に準
じて夫々測定を行えばよい。
より分離された複合体（修飾結合能物質Ｂ１又はＣが結
合しているものと結合していないものの何れをも含
む。）中に含まれる検出物質（又は、結合能物質Ａ3又
は測定対象物質）の量の測定は、検出物質（又は、結合
能物質Ａ3又は測定対象物質）が有している、何らかの
方法により検出し得る性質に応じて夫々所定の方法に従
って実施される。例えば、その性質が酵素活性の場合に
はＥＩＡの常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質 核
酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・ 南原利夫・辻章夫・
石川榮治編集、51〜63頁、共立出版（株）、1987年９月
10日発行」等に記載された方法に準じて測定を行えばよ
く、検出物質が放射性物質の場合にはＲＩＡの常法に従
い、該放射性物質の出す放射線の種類及び強さに応じて
液浸型ＧＭカウンター，液体シンチレーションカウンタ
ー，井戸型シンチレーションカウンター，ＨＰＬＣ用カ
ウンター等の測定機器を適宜選択して使用し、測定を行
えばよい（例えば医化学実験講座、第８巻、山村雄一監
修、第１版、中山書店、1971等参照。）。また、その性
質が蛍光性の場合には蛍光光度計等の測定機器を用いる
ＦＩＡの常法、例えば「図説 蛍光抗体、川生明著、第
１版、( 株)ソフトサイエンス社、1983」等に記載され
た方法に準じて測定を行えばよく、その性質が発光性の
場合にはフォトンカウンター等の測定機器を用いる常
法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質 核酸 酵素 別冊
No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、2
52〜263頁、共立出版（株）、1987年９月10日発行」等
に記載された方法に準じて測定を行えばよい。更に、そ
の性質が紫外部に吸収を有する性質の場合には分光光度
計等の測定機器を用いる常法によって測定を行えばよ
く、検出物質がスピンの性質を有する物質の場合には電
子スピン共鳴装置を用いる常法、例えば「酵素免疫測定
法、蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川 常廣・南原利
夫・辻章夫・石川榮治編集、264〜271頁、共立出版
（株）、1987年９月10日発行」等に記載された方法に準
じて夫々測定を行えばよい。
【００４７】 本発明に於て、測定対象物質と結合能物
質Ａ2又はＡ3とを反応させて、複合体を形成する際の反
応条件、或はこれら複合体と修飾結合能物質Ｂ１又はＣ
との結合反応の際の反応条件としては、複合体の形成反
応、或はこれら複合体と修飾結合能物質Ｂ１又はＣとの
結合反応を妨げる様な条件でなければ特に限定されない
が、常法、例えばＥＩＡ，ＲＩＡ，ＦＩＡ，アフィニテ
ィクロマトグラフィー等の自体公知の方法に於いて複合
体等を形成させる際の反応条件に準じて行えばよい。例
えば、反応時に緩衝液を用いる場合には、使用される緩
衝剤やその他の試薬はこれら自体公知の方法に於いて用
いられるものを適宜選択して用いればよい。また、反応
時のｐＨとしては、複合体の形成反応、或はこれら複合
体と修飾結合能物質Ｂ１又はＣとの結合反応を妨げない
範囲であれば特に限定されるものではないが、通常２〜
10、好ましくは５〜９の範囲が挙げられる。反応時の温
度も、複合体の形成反応、或はこれら複合体と修飾結合
能物質Ｂ１又はＣとの結合反応を妨げない範囲であれば
特に限定されるものではないが、通常０〜50℃、好まし
くは20〜40℃の範囲が好ましく挙げられる。反応時間
は、複合体（又は標識複合体）が形成され、且つこれら
複合体と修飾結合能物質Ｂ１又はＣとの結合するのに要
する時間が、測定対象物質と結合能物質Ａ2又はＡ3と修
飾結合能物質Ｂ１又はＣとの性質により異なるので、各
々の性質に応じて数秒間乃至数時間適宜反応させればよ
い。
質Ａ2又はＡ3とを反応させて、複合体を形成する際の反
応条件、或はこれら複合体と修飾結合能物質Ｂ１又はＣ
との結合反応の際の反応条件としては、複合体の形成反
応、或はこれら複合体と修飾結合能物質Ｂ１又はＣとの
結合反応を妨げる様な条件でなければ特に限定されない
が、常法、例えばＥＩＡ，ＲＩＡ，ＦＩＡ，アフィニテ
ィクロマトグラフィー等の自体公知の方法に於いて複合
体等を形成させる際の反応条件に準じて行えばよい。例
えば、反応時に緩衝液を用いる場合には、使用される緩
衝剤やその他の試薬はこれら自体公知の方法に於いて用
いられるものを適宜選択して用いればよい。また、反応
時のｐＨとしては、複合体の形成反応、或はこれら複合
体と修飾結合能物質Ｂ１又はＣとの結合反応を妨げない
範囲であれば特に限定されるものではないが、通常２〜
10、好ましくは５〜９の範囲が挙げられる。反応時の温
度も、複合体の形成反応、或はこれら複合体と修飾結合
能物質Ｂ１又はＣとの結合反応を妨げない範囲であれば
特に限定されるものではないが、通常０〜50℃、好まし
くは20〜40℃の範囲が好ましく挙げられる。反応時間
は、複合体（又は標識複合体）が形成され、且つこれら
複合体と修飾結合能物質Ｂ１又はＣとの結合するのに要
する時間が、測定対象物質と結合能物質Ａ2又はＡ3と修
飾結合能物質Ｂ１又はＣとの性質により異なるので、各
々の性質に応じて数秒間乃至数時間適宜反応させればよ
い。
【００４８】 本発明の分離方法に於いて、複合体（修
飾結合能物質Ｂ１又はＣと結合しているものと結合して
いないものの何れをも含む。以下同じ。）や遊離の結合
能物質Ａ2又はＡ3、或いは遊離の測定対象物質の分離を
行う際に用いられるＨＰＬＣとしては、装置自身は通常
分析の分野に於いて用いられているもので定流速が得ら
れるものであれば特に問題なく用いることができる。
飾結合能物質Ｂ１又はＣと結合しているものと結合して
いないものの何れをも含む。以下同じ。）や遊離の結合
能物質Ａ2又はＡ3、或いは遊離の測定対象物質の分離を
行う際に用いられるＨＰＬＣとしては、装置自身は通常
分析の分野に於いて用いられているもので定流速が得ら
れるものであれば特に問題なく用いることができる。
【００４９】 ＨＰＬＣにより複合体や遊離の結合能物
質Ａ2又はＡ3の分離を行う際に用いられる溶媒（溶離
液）としては、形成された 複合体等が再び測定対象物
質と結合能物質Ａ2又はＡ3（及び修飾結合能物質Ｂ１又
はＣ）とに分解されるようなことがなく、且つ複合体に
含まれる結合能物質Ａ3（又は測定対象物質）が有して
いる或は結合能物質Ａ3が保持している検出物質が有し
ている、何らかの方法により検出し得る性質を失わしめ
るようなものでなければ特に限定されることなく挙げら
れるが、通常は例えばＥＩＡ，ＲＩＡ，ＦＩＡ，アフィ
ニティクロマトグラフィー等の自体公知の方法に於いて
緩衝液として用いられているようなものが好ましく用い
られる。具体例としては、例えばリン酸塩，酢酸塩，ク
エン酸塩，グッド(Good)の緩衝剤，トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン等の緩衝剤、例えば塩化ナトリウ
ム，塩化カリウム，硫酸アンモニウム等の塩類、例えば
メタノール，エタノール，イソプロピルアルコール，ア
セトニトリル，テトラヒドロフラン等の極性有機溶媒類
及び界面活性剤等を、複合体（又は標識複合体）や遊離
の結合能物質Ａ2又はＡ3、或いは遊離の測定対象物質の
性質に応じて適宜選択し、添加、混合して調製された、
ｐＨ２〜10の緩衝液が好ましく用いられる。
質Ａ2又はＡ3の分離を行う際に用いられる溶媒（溶離
液）としては、形成された 複合体等が再び測定対象物
質と結合能物質Ａ2又はＡ3（及び修飾結合能物質Ｂ１又
はＣ）とに分解されるようなことがなく、且つ複合体に
含まれる結合能物質Ａ3（又は測定対象物質）が有して
いる或は結合能物質Ａ3が保持している検出物質が有し
ている、何らかの方法により検出し得る性質を失わしめ
るようなものでなければ特に限定されることなく挙げら
れるが、通常は例えばＥＩＡ，ＲＩＡ，ＦＩＡ，アフィ
ニティクロマトグラフィー等の自体公知の方法に於いて
緩衝液として用いられているようなものが好ましく用い
られる。具体例としては、例えばリン酸塩，酢酸塩，ク
エン酸塩，グッド(Good)の緩衝剤，トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン等の緩衝剤、例えば塩化ナトリウ
ム，塩化カリウム，硫酸アンモニウム等の塩類、例えば
メタノール，エタノール，イソプロピルアルコール，ア
セトニトリル，テトラヒドロフラン等の極性有機溶媒類
及び界面活性剤等を、複合体（又は標識複合体）や遊離
の結合能物質Ａ2又はＡ3、或いは遊離の測定対象物質の
性質に応じて適宜選択し、添加、混合して調製された、
ｐＨ２〜10の緩衝液が好ましく用いられる。
【００５０】また、本発明の分離方法を利用した測定方
法に於て、ＨＰＬＣによる分離後の測定方式としては、
例えば「最新液体クロマトグラフィ、原昭二・辻章夫
編、第１版、92〜104頁、南山堂、1978年２月１日発
行」等に記載されているような、ＨＰＬＣのカラムから
の流出液をそのまま検出部に導き、流出液中の複合体中
に含まれる検出物質（又は、結合能物質Ａ3又は測定対
象物質）の量を直接測定する方式が、測定が迅速に行え
るのでより好ましい。この場合に、結合能物質Ａ3（又
は測定対象物質）が或は結合能物質Ａ3に保持されてい
る検出物質が有している、何らかの方法により検出し得
る性質が、例えば酵素活性であれば、ＨＰＬＣのカラム
と検出部との間に、酵素活性測定用の試薬を添加し流出
液と反応させる、所謂ポストカラム法の反応部を設ける
必要があることは言うまでもない。検出物質（又は、結
合能物質Ａ3又は測定対象物質）の該性質が酵素活性で
ある場合に該反応部に於いて用いられる酵素活性測定用
の試薬は、常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質 核
酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石
川 榮治編集、51〜63頁、共立出版（株）、1987年９月1
0日発行」等に記載された方法に準じて調製したものを
用いてもよいし、市販されている臨床検査用キットの試
薬を適宜選択して利用してもよい。また、検出物質（又
は、結合能物質Ａ3又は測定対象物質）の該性質が酵素
活性以外の場合に於いても、検出 感度を増加させる目
的で所定の試薬を添加、反応させるために、ＨＰＬＣの
カラムと検出部との間に適当な反応部を設けることは任
意である。
法に於て、ＨＰＬＣによる分離後の測定方式としては、
例えば「最新液体クロマトグラフィ、原昭二・辻章夫
編、第１版、92〜104頁、南山堂、1978年２月１日発
行」等に記載されているような、ＨＰＬＣのカラムから
の流出液をそのまま検出部に導き、流出液中の複合体中
に含まれる検出物質（又は、結合能物質Ａ3又は測定対
象物質）の量を直接測定する方式が、測定が迅速に行え
るのでより好ましい。この場合に、結合能物質Ａ3（又
は測定対象物質）が或は結合能物質Ａ3に保持されてい
る検出物質が有している、何らかの方法により検出し得
る性質が、例えば酵素活性であれば、ＨＰＬＣのカラム
と検出部との間に、酵素活性測定用の試薬を添加し流出
液と反応させる、所謂ポストカラム法の反応部を設ける
必要があることは言うまでもない。検出物質（又は、結
合能物質Ａ3又は測定対象物質）の該性質が酵素活性で
ある場合に該反応部に於いて用いられる酵素活性測定用
の試薬は、常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質 核
酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石
川 榮治編集、51〜63頁、共立出版（株）、1987年９月1
0日発行」等に記載された方法に準じて調製したものを
用いてもよいし、市販されている臨床検査用キットの試
薬を適宜選択して利用してもよい。また、検出物質（又
は、結合能物質Ａ3又は測定対象物質）の該性質が酵素
活性以外の場合に於いても、検出 感度を増加させる目
的で所定の試薬を添加、反応させるために、ＨＰＬＣの
カラムと検出部との間に適当な反応部を設けることは任
意である。
【００５１】本発明の分離方法に於けるＨＰＬＣの溶離
液として成分のことなるものを複数用いる場合には、そ
の操作法としては濃度勾配法（リニアグラジエント法）
により行ってもステップワイズ法により行っても何れに
ても良いが、ステップワイズ法には、操作が簡便である
こと、実際の分析時間を短くすることができること、目
的のピークがシャープになること等の利点があるので、
より望ましい。以下に実施例を挙げて、本発明を更に具
体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定され
るものではない。
液として成分のことなるものを複数用いる場合には、そ
の操作法としては濃度勾配法（リニアグラジエント法）
により行ってもステップワイズ法により行っても何れに
ても良いが、ステップワイズ法には、操作が簡便である
こと、実際の分析時間を短くすることができること、目
的のピークがシャープになること等の利点があるので、
より望ましい。以下に実施例を挙げて、本発明を更に具
体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定され
るものではない。
【００５２】
実施例１．ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、及び
α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）の測定（β−ガラクト
シダーゼを分離向上物質とし、ゲル瀘過用の充填剤を使
用した場合） （溶離液）リン酸１ナトリウム 3.9g、リン酸２ナトリ
ウム（12水塩） 81g、塩化ナトリウム 44gをイオン交換
水に溶解し、ｐＨを7.5に調整した後、全量を５リット
ルとして溶離液とした。 （基質液）溶離液 80mlに3-(p-ヒドロキシフェニル）プ
ロピオン酸 1.66gを溶解し、ｐＨ7.5 となるように１Ｎ
ＮａＯＨを加えた後、全量を100mlとした。この溶液で
30％過酸化水素水を希釈し、Ｈ2Ｏ2の20mM溶液を調製し
て基質液とした。 （抗体液１）抗ｈＣＧ−α鎖モノクローナル抗体（和光
純薬工業（株）製）を常法により処理してFab'とし、こ
れに常法により西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）
を標識して得たＰＯＤ標識抗ｈＣＧ−α鎖−Fab'を50mM
リン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化ナトリウム含有）中
に３nMのタンパク濃度となるように添加して抗体液１と
した。 （抗体液２）抗ｈＣＧ−β鎖モノクローナル抗体（和光
純薬工業（株）製）を常法により処理してFab'とし、こ
れとβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ、オリエンタル
酵母工業(株)社製）とをスルホサクシニミジル 4-(N-マ
レイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレイト
［Sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexa
ne-1-carboxylate(Sulfo-SMCC)、ピアス社製］を用いた
常法により結合させて得たβ−Ｇａｌ結合抗ｈＣＧ−β
鎖−Fab'を、50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化ナ
トリウム含有）中に50nMのタンパク濃度となるように添
加して抗体液２とした。 （抗体液３）抗ＡＦＰモノクローナル抗体（和光純薬工
業（株）製）を、抗体液１の調製方法に準じて処理して
得たＰＯＤ標識抗ＡＦＰ−Fab'を、50mMリン酸緩衝液
（ｐＨ7.5、150mM塩化ナトリウム含有）中に３nMのタン
パク濃度となるように添加して抗体液３とした。 （抗体液４）抗体液３で使用したモノクローナル抗体と
認識部位が違うことを確認した抗ＡＦＰモノクローナル
抗体（和光純薬工業（株）製）を、抗体液２の調製方法
に準じて処理して得たβ−Ｇａｌ結合抗ＡＦＰ−Fab'
を、50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化ナトリウム
含有）中に50nMのタンパク濃度となるように添加して抗
体液４とした。 （ｈＣＧ試料液）市販のｈＣＧ（胎盤絨毛由来、シグマ
社製）を50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化ナトリ
ウム含有）中に250mIU/mlの濃度となるように添加して
ｈＣＧ試料液とした。 （ＡＦＰ試料液）ヒト胎盤より精製したＡＦＰ（和光純
薬工業（株）製）を50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM
塩化ナトリウム含有）中に１nMの濃度となるように添加
してＡＦＰ試料液とした。 （ＨＰＬＣの使用条件）システムの概略を図１に示す。 ・カラム：0.8φx30cm。 ・充填剤：YMCパック Diol−200（（株）ワイエムシー
商品名）。 ・流速：溶離液；1.0ml/min、基質液；0.1ml/min。 ・反応部：0.025φx1000cm （55℃保温） ・検出：励起波長 320nm、蛍光波長 404nmで蛍光を測
定した。 （測定操作）下記表１の組成の検体１〜５を調製し、
各検体を30℃で30分間放置した後、各検体の50μlをＨ
ＰＬＣにより分析した。
α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）の測定（β−ガラクト
シダーゼを分離向上物質とし、ゲル瀘過用の充填剤を使
用した場合） （溶離液）リン酸１ナトリウム 3.9g、リン酸２ナトリ
ウム（12水塩） 81g、塩化ナトリウム 44gをイオン交換
水に溶解し、ｐＨを7.5に調整した後、全量を５リット
ルとして溶離液とした。 （基質液）溶離液 80mlに3-(p-ヒドロキシフェニル）プ
ロピオン酸 1.66gを溶解し、ｐＨ7.5 となるように１Ｎ
ＮａＯＨを加えた後、全量を100mlとした。この溶液で
30％過酸化水素水を希釈し、Ｈ2Ｏ2の20mM溶液を調製し
て基質液とした。 （抗体液１）抗ｈＣＧ−α鎖モノクローナル抗体（和光
純薬工業（株）製）を常法により処理してFab'とし、こ
れに常法により西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）
を標識して得たＰＯＤ標識抗ｈＣＧ−α鎖−Fab'を50mM
リン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化ナトリウム含有）中
に３nMのタンパク濃度となるように添加して抗体液１と
した。 （抗体液２）抗ｈＣＧ−β鎖モノクローナル抗体（和光
純薬工業（株）製）を常法により処理してFab'とし、こ
れとβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ、オリエンタル
酵母工業(株)社製）とをスルホサクシニミジル 4-(N-マ
レイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレイト
［Sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexa
ne-1-carboxylate(Sulfo-SMCC)、ピアス社製］を用いた
常法により結合させて得たβ−Ｇａｌ結合抗ｈＣＧ−β
鎖−Fab'を、50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化ナ
トリウム含有）中に50nMのタンパク濃度となるように添
加して抗体液２とした。 （抗体液３）抗ＡＦＰモノクローナル抗体（和光純薬工
業（株）製）を、抗体液１の調製方法に準じて処理して
得たＰＯＤ標識抗ＡＦＰ−Fab'を、50mMリン酸緩衝液
（ｐＨ7.5、150mM塩化ナトリウム含有）中に３nMのタン
パク濃度となるように添加して抗体液３とした。 （抗体液４）抗体液３で使用したモノクローナル抗体と
認識部位が違うことを確認した抗ＡＦＰモノクローナル
抗体（和光純薬工業（株）製）を、抗体液２の調製方法
に準じて処理して得たβ−Ｇａｌ結合抗ＡＦＰ−Fab'
を、50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化ナトリウム
含有）中に50nMのタンパク濃度となるように添加して抗
体液４とした。 （ｈＣＧ試料液）市販のｈＣＧ（胎盤絨毛由来、シグマ
社製）を50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化ナトリ
ウム含有）中に250mIU/mlの濃度となるように添加して
ｈＣＧ試料液とした。 （ＡＦＰ試料液）ヒト胎盤より精製したＡＦＰ（和光純
薬工業（株）製）を50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM
塩化ナトリウム含有）中に１nMの濃度となるように添加
してＡＦＰ試料液とした。 （ＨＰＬＣの使用条件）システムの概略を図１に示す。 ・カラム：0.8φx30cm。 ・充填剤：YMCパック Diol−200（（株）ワイエムシー
商品名）。 ・流速：溶離液；1.0ml/min、基質液；0.1ml/min。 ・反応部：0.025φx1000cm （55℃保温） ・検出：励起波長 320nm、蛍光波長 404nmで蛍光を測
定した。 （測定操作）下記表１の組成の検体１〜５を調製し、
各検体を30℃で30分間放置した後、各検体の50μlをＨ
ＰＬＣにより分析した。
【表１】 （結果）検体１と検体２の分析結果より、ＰＯＤ標識抗
ｈＣＧ−α鎖−Fab'は10.5分後に、ＰＯＤ標識抗ｈＣＧ
−α鎖−Fab'とｈＣＧとの複合体（複合体−１）は9.5
分後に、ＰＯＤ標識抗ｈＣＧ−α鎖−Fab'とβ−Ｇａｌ
結合抗ｈＣＧ−β鎖−Fab'とｈＣＧとの複合体（複合体
−２）は6.8分後に夫々溶出してくることが判った。検
体３と検体４の分析結果より、ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ−Fa
b'は10.5分後に、ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ−Fab'とＡＦＰと
の複合体（複合体−３）は9.1分後に、ＰＯＤ標識抗Ａ
ＦＰ−Fab'とβ−Ｇａｌ結合抗ＡＦＰ−Fab'とＡＦＰの
複合体（複合体−４）は6.8分後に夫々溶出してくるこ
とが判った。尚、検体２、検体４の場合、複合体−１、
複合体−３は検出されなかった。以上の結果から、修飾
結合能物質を用いることにより、ＰＯＤ標識抗体と複合
体とをより明確に分離することが可能となること、並び
に、複合体−２と複合体−４との溶出時間が同一（何れ
も6.8分後に溶出）となること、言い換えれば修飾結合
能物質を使用することにより測定対象物が異なる場合で
も同一の条件のＨＰＬＣを使用して分析を行うのが可能
となることが判る。また、検体５の場合には、複合体−
２は6.8分後に、複合体−３は9.1分後に、ＰＯＤ標識抗
ｈＣＧ−α鎖−Fab'及びＰＯＤ標識抗ＡＦＰ−Fab'は1
0.5分後に溶出した。この結果より明らかな如く、修飾
結合能物質を適宜用いることにより、異なる測定対象物
（ｈＣＧとＡＦＰ）を同時に測定することが可能となる
ことが判る。
ｈＣＧ−α鎖−Fab'は10.5分後に、ＰＯＤ標識抗ｈＣＧ
−α鎖−Fab'とｈＣＧとの複合体（複合体−１）は9.5
分後に、ＰＯＤ標識抗ｈＣＧ−α鎖−Fab'とβ−Ｇａｌ
結合抗ｈＣＧ−β鎖−Fab'とｈＣＧとの複合体（複合体
−２）は6.8分後に夫々溶出してくることが判った。検
体３と検体４の分析結果より、ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ−Fa
b'は10.5分後に、ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ−Fab'とＡＦＰと
の複合体（複合体−３）は9.1分後に、ＰＯＤ標識抗Ａ
ＦＰ−Fab'とβ−Ｇａｌ結合抗ＡＦＰ−Fab'とＡＦＰの
複合体（複合体−４）は6.8分後に夫々溶出してくるこ
とが判った。尚、検体２、検体４の場合、複合体−１、
複合体−３は検出されなかった。以上の結果から、修飾
結合能物質を用いることにより、ＰＯＤ標識抗体と複合
体とをより明確に分離することが可能となること、並び
に、複合体−２と複合体−４との溶出時間が同一（何れ
も6.8分後に溶出）となること、言い換えれば修飾結合
能物質を使用することにより測定対象物が異なる場合で
も同一の条件のＨＰＬＣを使用して分析を行うのが可能
となることが判る。また、検体５の場合には、複合体−
２は6.8分後に、複合体−３は9.1分後に、ＰＯＤ標識抗
ｈＣＧ−α鎖−Fab'及びＰＯＤ標識抗ＡＦＰ−Fab'は1
0.5分後に溶出した。この結果より明らかな如く、修飾
結合能物質を適宜用いることにより、異なる測定対象物
（ｈＣＧとＡＦＰ）を同時に測定することが可能となる
ことが判る。
【００５３】実施例２．ＡＦＰの測定（β−Ｇａｌを分
離向上物質とし、疎水クロマトグラフィー用の充填剤を
使用した場合） （溶離液Ａ）硫酸アンモニウム 1.7Ｍを含有する50mMリ
ン酸緩衝液（ｐＨ7.5）を溶離液Ａとした。 （溶離液Ｂ）50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5）を溶離液Ｂ
とした。 （基質液）実施例１と同じ。 （抗体液１）実施例１の抗体液３と同じ。 （抗体液２）実施例１の抗体液４と同じ。 （試料）実施例１のＡＦＰ試料液と同じ。 （ＨＰＬＣの使用条件）システムの概略を図２に示す。 ・カラム：0.46φx2.5cm。 ・充填剤：ブチル−NPR （東ソー（株）社商品名）。 ・流速：溶離液Ａ＋Ｂ；1.0ml/min、基質液；0.1ml/mi
n。 ・反応部：0.025φx1000cm （55℃保温） ・検出：励起波長 320nm、蛍光波長 404nmで蛍光を測
定した。 ・グラジエント：溶離液Ａと溶離液Ｂのグラジエントを
図３に示す （測定操作）実施例１の検体３と同一組成のものを検体
１、実施例１の検体４と同一組成のものを検体２とし、
各検体を30℃で30分間放置した後、各検体の50μlをＨ
ＰＬＣにより分析した。 （結果）ＨＰＬＣによる分析結果から、ＰＯＤ標識抗Ａ
ＦＰ−Fab'は4.9分後に、ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ−Fab'と
ＡＦＰとの複合体は6.7分後に、ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ−F
ab'とβ−Ｇａｌ結合抗ＡＦＰ−Fab'とＡＦＰとの複合
体は9.7分後に、夫々溶出してくることが判った。以上
結果より、修飾結合能物質を用いることによりＰＯＤ標
識抗ＡＦＰ−Fab'と複合体とをより明確に分離すること
が可能になることが判る。
離向上物質とし、疎水クロマトグラフィー用の充填剤を
使用した場合） （溶離液Ａ）硫酸アンモニウム 1.7Ｍを含有する50mMリ
ン酸緩衝液（ｐＨ7.5）を溶離液Ａとした。 （溶離液Ｂ）50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5）を溶離液Ｂ
とした。 （基質液）実施例１と同じ。 （抗体液１）実施例１の抗体液３と同じ。 （抗体液２）実施例１の抗体液４と同じ。 （試料）実施例１のＡＦＰ試料液と同じ。 （ＨＰＬＣの使用条件）システムの概略を図２に示す。 ・カラム：0.46φx2.5cm。 ・充填剤：ブチル−NPR （東ソー（株）社商品名）。 ・流速：溶離液Ａ＋Ｂ；1.0ml/min、基質液；0.1ml/mi
n。 ・反応部：0.025φx1000cm （55℃保温） ・検出：励起波長 320nm、蛍光波長 404nmで蛍光を測
定した。 ・グラジエント：溶離液Ａと溶離液Ｂのグラジエントを
図３に示す （測定操作）実施例１の検体３と同一組成のものを検体
１、実施例１の検体４と同一組成のものを検体２とし、
各検体を30℃で30分間放置した後、各検体の50μlをＨ
ＰＬＣにより分析した。 （結果）ＨＰＬＣによる分析結果から、ＰＯＤ標識抗Ａ
ＦＰ−Fab'は4.9分後に、ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ−Fab'と
ＡＦＰとの複合体は6.7分後に、ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ−F
ab'とβ−Ｇａｌ結合抗ＡＦＰ−Fab'とＡＦＰとの複合
体は9.7分後に、夫々溶出してくることが判った。以上
結果より、修飾結合能物質を用いることによりＰＯＤ標
識抗ＡＦＰ−Fab'と複合体とをより明確に分離すること
が可能になることが判る。
【００５４】実施例３．ＡＦＰの測定（ヨードを分離向
上物質とし、疎水クロマトグラフィー用の充填剤を使用
した場合） （抗体液１）実施例１の抗体液３と同じ （抗体液２）実施例１の抗体液４を調製するのに使用し
た抗ＡＦＰモノクローナル抗体を、自体公知のクロラミ
ンＴ法（生化学実験講座16「ホルモン 上」、社団法人
日本生化学会編集、東京化学同人発行、117〜180頁及
び230〜231頁、1977。）によりヨード化した。ヨード化
反応の時間を５秒、30秒又は２分として得られた各ヨー
ド化抗ＡＦＰモノクローナル抗体を、夫々50mMリン酸緩
衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化ナトリウム含有）中に50nMの
タンパク濃度となるように添加して抗体液２−１、抗体
液２−２及び抗体液２−３とした。 （試料）実施例１のＡＦＰ試料液と同じ （ＨＰＬＣの使用条件）実施例２と同じ。 （測定操作）抗体液１ 30μlとＡＦＰ試料液 30μlと
に、50mMリン酸緩衝液（pH7.5、150mM塩化ナトリウム含
有）、抗体液２−１、抗体液２−２又は抗体液２−３の
30μlを混合し、30℃で30分間放置した後、得られた混
合液の50μlをＨＰＬＣにより分析した。 （結果）ＨＰＬＣによる分析結果から、ＰＯＤ標識抗Ａ
ＦＰ−Fab'は4.9分後に、ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ−Fab'と
ＡＦＰとの複合体Ａは6.7分後に夫々溶出してくること
が判った。また、ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ−Fab'とヨード化
抗ＡＦＰ−Fab'とＡＦＰの複合体については、抗体液２
−１を用いた場合には8.2分後に、抗体液２−２を用い
た場合には9.5分後に、抗体液２−３を用いた場合には
9.9分後に夫々溶出してくることが判った。以上の結果
から、ヨードの結合量が違う抗体（修飾結合能物質）を
用いることによりＰＯＤ標識抗ＡＦＰ−Fab'とＡＦＰと
の複合体の溶出位置を自由に調節できることが判る。
上物質とし、疎水クロマトグラフィー用の充填剤を使用
した場合） （抗体液１）実施例１の抗体液３と同じ （抗体液２）実施例１の抗体液４を調製するのに使用し
た抗ＡＦＰモノクローナル抗体を、自体公知のクロラミ
ンＴ法（生化学実験講座16「ホルモン 上」、社団法人
日本生化学会編集、東京化学同人発行、117〜180頁及
び230〜231頁、1977。）によりヨード化した。ヨード化
反応の時間を５秒、30秒又は２分として得られた各ヨー
ド化抗ＡＦＰモノクローナル抗体を、夫々50mMリン酸緩
衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化ナトリウム含有）中に50nMの
タンパク濃度となるように添加して抗体液２−１、抗体
液２−２及び抗体液２−３とした。 （試料）実施例１のＡＦＰ試料液と同じ （ＨＰＬＣの使用条件）実施例２と同じ。 （測定操作）抗体液１ 30μlとＡＦＰ試料液 30μlと
に、50mMリン酸緩衝液（pH7.5、150mM塩化ナトリウム含
有）、抗体液２−１、抗体液２−２又は抗体液２−３の
30μlを混合し、30℃で30分間放置した後、得られた混
合液の50μlをＨＰＬＣにより分析した。 （結果）ＨＰＬＣによる分析結果から、ＰＯＤ標識抗Ａ
ＦＰ−Fab'は4.9分後に、ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ−Fab'と
ＡＦＰとの複合体Ａは6.7分後に夫々溶出してくること
が判った。また、ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ−Fab'とヨード化
抗ＡＦＰ−Fab'とＡＦＰの複合体については、抗体液２
−１を用いた場合には8.2分後に、抗体液２−２を用い
た場合には9.5分後に、抗体液２−３を用いた場合には
9.9分後に夫々溶出してくることが判った。以上の結果
から、ヨードの結合量が違う抗体（修飾結合能物質）を
用いることによりＰＯＤ標識抗ＡＦＰ−Fab'とＡＦＰと
の複合体の溶出位置を自由に調節できることが判る。
【００５５】実施例４．ＡＦＰの測定［オクチルアミ
ン、フェニルアラニンのテトラマー（以下、Phe4と略記
する。）、ＢＭＨ又はＥＭＣＳを分離向上物質とし、疎
水クロマトグラフィー用の充填剤を使用した場合］ （抗体液１）実施例１の抗体液３と同じ （抗体液２）0.1Ｍリン酸緩衝液［ｐＨ7.0、50％ジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）含有。］に溶解したオクチル
アミンとSulfo-SMCC（ピアス社製）との等モルを常法に
より反応させた後、この反応液に、抗体液１で用いた抗
体と認識部位の異なる抗ＡＦＰモノクローナル抗体を常
法により処理して得られたFab'（抗ＡＦＰ-Fab'）［0.1
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）に溶解］をオクチルアミン
の1/100倍量モル加え、この懸濁液を30℃で30分間イン
キュベーションした。この反応液を常法により精製して
オクチルアミン結合抗ＡＦＰ−Fab'を得、これを50mMリ
ン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化ナトリウム含有）中に
50nMのタンパク濃度となるように添加して抗体液２とし
た。 （抗体液３）オクチルアミンの代りにPhe4ペプチドを用
いた以外は、抗体液２を調製するために用いたのと同じ
試薬を用い、同様な操作を行なって、Phe4結合抗ＡＦＰ
-Fab'を調製し、これを50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、15
0mM塩化ナトリウム含有）中にタンパク濃度で50nMとな
るように添加して抗体液３とした。 （抗体液４）抗体液２を調製する際に用いたのと同じ抗
ＡＦＰ-Fab'とＢＭＨとを常法により反応させ、この反
応液にN-アセチル-L-システイン（ＡＣ）をＢＭＨの100
倍モル量加え、更に30℃で30分間インキュベーションし
た。この反応液を常法により精製してＡＣ−ＢＭＨ結合
抗ＡＦＰ-Fab'を得、これを50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.
5、150mM塩化ナトリウム含有）中に50nMのタンパク濃度
となるように添加して抗体液４とした。 （抗体液５）抗体液２を調製する際に用いたのと同じ抗
ＡＦＰ-Fab'とＥＭＣＳとを常法により反応させ、この
反応液にグリシンをＥＭＣＳの1000倍モル量加え、更に
30℃で30分間インキュベーションした。この反応液を常
法により精製してグリシン−ＥＭＣＳ結合抗ＡＦＰ-Fa
b'を得、これを50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化
ナトリウム含有）中に50nMのタンパク濃度となるように
添加して抗体液５とした。 （試料）実施例１のＡＦＰ試料液と同じ。 （ＨＰＬＣの使用条件）実施例２と同じ。 （測定方法）抗体液１ 30μlとＡＦＰ試料液 30μlと
に、50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化ナトリウム
含有）、抗体液２、抗体液３、抗体液４又は抗体液５の
30μlを混合し、30℃で30分放置した後、混合液の50μl
をＨＰＬＣにより分析した。 （結果）ＨＰＬＣによる分析の結果、ＰＯＤ標識抗ＡＦ
Ｐ−Fab'は4.9分後に、ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ−Fab'とＡ
ＦＰとの複合体は6.7分後に夫々溶出することが判っ
た。また、ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ−Fab'とＡＦＰと各修飾
抗ＡＦＰ−Fab'（修飾結合能物質）との複合体について
は、オクチルアミン結合抗ＡＦＰ−Fab'を用いた場合に
は7.5分後に、Phe4結合抗ＡＦＰ−Fab'を用いた場合に
は8.5分後に、ＡＣ−ＢＭＨ結合抗ＡＦＰ−Fab'を用い
た場合には7.2分後に、グリシン−ＥＭＣＳ結合抗ＡＦ
Ｐ−Fab'を用いた場合には7.1分後に夫々溶出すること
が判った。以上の結果より、分離向上物質の種類を変化
させることにより、目的の複合体の溶出位置を自由に調
節することができることが判る。
ン、フェニルアラニンのテトラマー（以下、Phe4と略記
する。）、ＢＭＨ又はＥＭＣＳを分離向上物質とし、疎
水クロマトグラフィー用の充填剤を使用した場合］ （抗体液１）実施例１の抗体液３と同じ （抗体液２）0.1Ｍリン酸緩衝液［ｐＨ7.0、50％ジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）含有。］に溶解したオクチル
アミンとSulfo-SMCC（ピアス社製）との等モルを常法に
より反応させた後、この反応液に、抗体液１で用いた抗
体と認識部位の異なる抗ＡＦＰモノクローナル抗体を常
法により処理して得られたFab'（抗ＡＦＰ-Fab'）［0.1
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）に溶解］をオクチルアミン
の1/100倍量モル加え、この懸濁液を30℃で30分間イン
キュベーションした。この反応液を常法により精製して
オクチルアミン結合抗ＡＦＰ−Fab'を得、これを50mMリ
ン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化ナトリウム含有）中に
50nMのタンパク濃度となるように添加して抗体液２とし
た。 （抗体液３）オクチルアミンの代りにPhe4ペプチドを用
いた以外は、抗体液２を調製するために用いたのと同じ
試薬を用い、同様な操作を行なって、Phe4結合抗ＡＦＰ
-Fab'を調製し、これを50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、15
0mM塩化ナトリウム含有）中にタンパク濃度で50nMとな
るように添加して抗体液３とした。 （抗体液４）抗体液２を調製する際に用いたのと同じ抗
ＡＦＰ-Fab'とＢＭＨとを常法により反応させ、この反
応液にN-アセチル-L-システイン（ＡＣ）をＢＭＨの100
倍モル量加え、更に30℃で30分間インキュベーションし
た。この反応液を常法により精製してＡＣ−ＢＭＨ結合
抗ＡＦＰ-Fab'を得、これを50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.
5、150mM塩化ナトリウム含有）中に50nMのタンパク濃度
となるように添加して抗体液４とした。 （抗体液５）抗体液２を調製する際に用いたのと同じ抗
ＡＦＰ-Fab'とＥＭＣＳとを常法により反応させ、この
反応液にグリシンをＥＭＣＳの1000倍モル量加え、更に
30℃で30分間インキュベーションした。この反応液を常
法により精製してグリシン−ＥＭＣＳ結合抗ＡＦＰ-Fa
b'を得、これを50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化
ナトリウム含有）中に50nMのタンパク濃度となるように
添加して抗体液５とした。 （試料）実施例１のＡＦＰ試料液と同じ。 （ＨＰＬＣの使用条件）実施例２と同じ。 （測定方法）抗体液１ 30μlとＡＦＰ試料液 30μlと
に、50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化ナトリウム
含有）、抗体液２、抗体液３、抗体液４又は抗体液５の
30μlを混合し、30℃で30分放置した後、混合液の50μl
をＨＰＬＣにより分析した。 （結果）ＨＰＬＣによる分析の結果、ＰＯＤ標識抗ＡＦ
Ｐ−Fab'は4.9分後に、ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ−Fab'とＡ
ＦＰとの複合体は6.7分後に夫々溶出することが判っ
た。また、ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ−Fab'とＡＦＰと各修飾
抗ＡＦＰ−Fab'（修飾結合能物質）との複合体について
は、オクチルアミン結合抗ＡＦＰ−Fab'を用いた場合に
は7.5分後に、Phe4結合抗ＡＦＰ−Fab'を用いた場合に
は8.5分後に、ＡＣ−ＢＭＨ結合抗ＡＦＰ−Fab'を用い
た場合には7.2分後に、グリシン−ＥＭＣＳ結合抗ＡＦ
Ｐ−Fab'を用いた場合には7.1分後に夫々溶出すること
が判った。以上の結果より、分離向上物質の種類を変化
させることにより、目的の複合体の溶出位置を自由に調
節することができることが判る。
【００５６】実施例５．ＡＦＰの測定（ポリアスパラギ
ン酸を分離向上物質とし、アニオン交換クロマトグラフ
ィー用の充填剤を使用した場合） （溶離液Ａ）10mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5）を溶離液Ａ
とした。 （溶離液Ｂ）１Ｍ塩化ナトリウムを含む50mMリン酸緩衝
液（ｐＨ7.5）を溶離液Ｂとした。 （基質液）20％ＤＭＦ及び150mM塩化ナトリウムを含む5
0mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5）に、4-メチルウンベリフェ
リルガラクトピラノシド 2.5mMを溶解し基質液とした。 （抗体液１）抗ＡＦＰモノクローナル抗体（和光純薬工
業（株）製）を常法により処理しFab'とし、これに常法
によりβ−Ｇａｌを標識して得たβ−Ｇａｌ標識抗ＡＦ
Ｐ−Fab'を、50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化ナ
トリウム含有）中に４nMのタンパク濃度となるように添
加して抗体液１とした。 （抗体液２）抗体液１で使用したモノクローナル抗体と
認識部位が異なることが確認されている抗ＡＦＰモノク
ローナル抗体（和光純薬工業（株）製）を常法により処
理しFab'とした後、これとポリアスパラギン酸（平均分
子量：6165、13000又は28800、シグマ社製）とをSulfo-
SMCC（ピアス社製）を用いた常法により結合させ、次い
で常法により精製を行って、各種ポリアスパラギン酸結
合抗ＡＦＰ−Fab'を得た。これらを50mMリン酸緩衝液
（ｐＨ7.5、150mM塩化ナトリウム含有）中に50nMのタン
パク濃度となるように夫々添加して抗体液２とした。 （試料）実施例１のＡＦＰ試料液と同じ （ＨＰＬＣの使用条件）システムの概略を図２に示す。 ・カラム：0.46φx3.0cm。 ・充填剤：DEAE−MCIゲル （三菱化成（株）社商品
名）。 ・流速：溶離液Ａ＋Ｂ；1.0ml/min、基質液；0.1ml/mi
n。 ・反応部：0.025φx1000cm （45℃保温） ・検出：励起波長 360nm、蛍光波長 450nmで蛍光を測
定した。 ・グラジエント：溶離液Ａと溶離液Ｂのグラジエントを
図４に示す （測定方法）抗体液１ 30μl、ＡＦＰ試料液 30μlと
に、50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化ナトリウム
含有）又は所定のポリアスパラギン酸が結合した抗ＡＦ
Ｐ−Fab'を含む抗体液２の30μlを混合し、30℃で30分
放置した後、混合液の50μlをＨＰＬＣにより分析し
た。 （結果）ＨＰＬＣによる分析の結果、β−Ｇａｌ標識抗
ＡＦＰ−Fab'は3.33分後に、β−Ｇａｌ標識抗ＡＦＰ−
Fab'とＡＦＰとの複合体は4.2分後に溶出することが判
った。また、β−Ｇａｌ標識抗ＡＦＰ−Fab'とＡＦＰと
ポリアスパラギン酸結合抗ＡＦＰ−Fab'（修飾結合能物
質）との複合体については、結合させたポリアスパラギ
ン酸の平均分子量が6165の場合には4.99分後に、13000
の場合には7.90分後に、28800の場合には8.85分後に夫
々溶出することが判った。以上の結果より、分離向上能
物質の性質、即ちポリアスパラギン酸の分子量を変化さ
せることにより、複合体の溶出位置を自由に調節するこ
とができることが判る。
ン酸を分離向上物質とし、アニオン交換クロマトグラフ
ィー用の充填剤を使用した場合） （溶離液Ａ）10mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5）を溶離液Ａ
とした。 （溶離液Ｂ）１Ｍ塩化ナトリウムを含む50mMリン酸緩衝
液（ｐＨ7.5）を溶離液Ｂとした。 （基質液）20％ＤＭＦ及び150mM塩化ナトリウムを含む5
0mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5）に、4-メチルウンベリフェ
リルガラクトピラノシド 2.5mMを溶解し基質液とした。 （抗体液１）抗ＡＦＰモノクローナル抗体（和光純薬工
業（株）製）を常法により処理しFab'とし、これに常法
によりβ−Ｇａｌを標識して得たβ−Ｇａｌ標識抗ＡＦ
Ｐ−Fab'を、50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化ナ
トリウム含有）中に４nMのタンパク濃度となるように添
加して抗体液１とした。 （抗体液２）抗体液１で使用したモノクローナル抗体と
認識部位が異なることが確認されている抗ＡＦＰモノク
ローナル抗体（和光純薬工業（株）製）を常法により処
理しFab'とした後、これとポリアスパラギン酸（平均分
子量：6165、13000又は28800、シグマ社製）とをSulfo-
SMCC（ピアス社製）を用いた常法により結合させ、次い
で常法により精製を行って、各種ポリアスパラギン酸結
合抗ＡＦＰ−Fab'を得た。これらを50mMリン酸緩衝液
（ｐＨ7.5、150mM塩化ナトリウム含有）中に50nMのタン
パク濃度となるように夫々添加して抗体液２とした。 （試料）実施例１のＡＦＰ試料液と同じ （ＨＰＬＣの使用条件）システムの概略を図２に示す。 ・カラム：0.46φx3.0cm。 ・充填剤：DEAE−MCIゲル （三菱化成（株）社商品
名）。 ・流速：溶離液Ａ＋Ｂ；1.0ml/min、基質液；0.1ml/mi
n。 ・反応部：0.025φx1000cm （45℃保温） ・検出：励起波長 360nm、蛍光波長 450nmで蛍光を測
定した。 ・グラジエント：溶離液Ａと溶離液Ｂのグラジエントを
図４に示す （測定方法）抗体液１ 30μl、ＡＦＰ試料液 30μlと
に、50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化ナトリウム
含有）又は所定のポリアスパラギン酸が結合した抗ＡＦ
Ｐ−Fab'を含む抗体液２の30μlを混合し、30℃で30分
放置した後、混合液の50μlをＨＰＬＣにより分析し
た。 （結果）ＨＰＬＣによる分析の結果、β−Ｇａｌ標識抗
ＡＦＰ−Fab'は3.33分後に、β−Ｇａｌ標識抗ＡＦＰ−
Fab'とＡＦＰとの複合体は4.2分後に溶出することが判
った。また、β−Ｇａｌ標識抗ＡＦＰ−Fab'とＡＦＰと
ポリアスパラギン酸結合抗ＡＦＰ−Fab'（修飾結合能物
質）との複合体については、結合させたポリアスパラギ
ン酸の平均分子量が6165の場合には4.99分後に、13000
の場合には7.90分後に、28800の場合には8.85分後に夫
々溶出することが判った。以上の結果より、分離向上能
物質の性質、即ちポリアスパラギン酸の分子量を変化さ
せることにより、複合体の溶出位置を自由に調節するこ
とができることが判る。
【００５７】実施例６．ＡＦＰ測定に於ける溶血の影響
の回避の検討（ポリアスパラギン酸を分離向上物質と
し、アニオン交換クロマトグラフィー用の充填剤を使用
した場合）（溶離液Ａ）実施例５の溶離液Ａと同じ。 （溶離液Ｂ）実施例５の溶離液Ｂと同じ。 （基質液）実施例１の基質液と同じ。 （抗体液１）実施例１の抗体液３と同じ。 （抗体液２）抗体液１で使用したモノクローナル抗体と
認識部位が異なることが確認されている抗ＡＦＰモノク
ローナル抗体（和光純薬工業（株）製）を常法により処
理しFab'とした後、これとポリアスパラギン酸（平均分
子量：13000、シグマ社製）とをSulfo-SMCC（ピアス社
製）を用いた常法により結合させ、次いで常法により精
製を行って、ポリアスパラギン酸が結合した抗ＡＦＰ−
Fab'を得た。これを50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM
塩化ナトリウム含有）中に50nMのタンパク濃度となるよ
うに添加して抗体液２とした。 （溶血液）ヒト赤血球より得たヘモグロビンを1000mg/d
lとなるように50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化
ナトリウム含有）で希釈したものを溶血液とした。 （試料）実施例１のＡＦＰ試料液と同じ。 （ＨＰＬＣの使用条件）システムの概略を図２に示す。 ・カラム：0.46φx3.0cm。 ・充填剤：ワコービーズ DEAEゲル （和光純薬工業
（株）社商品名）。 ・流速：溶離液Ａ＋Ｂ；1.0ml/min、基質液；0.1ml/mi
n。 ・反応部：0.025φx1000cm （55℃保温） ・検出：励起波長 320nm、蛍光波長 404nmで蛍光を測
定した。 ・グラジエント：溶離液Ａと溶離液Ｂのグラジエントを
図４に示す （測定方法）抗体液１ 30μlとＡＦＰ試料液 30μlと溶
血液 10μlとに、50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩
化ナトリウム含有）又は抗体液２の30μlを混合し、30
℃で30分放置した後、各混合液の50μlをＨＰＬＣによ
り分析した。 （結果）得られた溶出パターンを図５に示す。図５中、
Ａは溶血液を50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化ナ
トリウム含有）で10倍に希釈したものについて分析した
結果得られた溶出パターンを、Ｂは抗体液１、ＡＦＰ試
料液、溶血液及びリン酸緩衝液との混合液について分析
した結果得られた溶出パターンを、Ｃは抗体液１、ＡＦ
Ｐ試料液、溶血液及び抗体液２との混合液について分析
した結果得られた溶出パターンを夫々示す。図５のＡか
ら明らかなように、溶血成分は0.5〜5.5分の間に複数の
ピークとして溶出することが判る。これに対して、ＰＯ
Ｄ標識抗ＡＦＰ−Fab'は1.10分後に、ＰＯＤ標識抗ＡＦ
Ｐ−Fab'とＡＦＰとの複合体は3.25分後に、ＰＯＤ標識
抗ＡＦＰ−Fab'とポリアスパラギン酸結合抗ＡＦＰ−Fa
b'とＡＦＰとの複合体は7.20分後に夫々溶出することが
判る。以上の結果より、本発明の分離方法を利用するこ
とにより溶血の影響を全く受けない溶出位置に複合体を
溶出させることができること、言い換えれば本発明の分
離方法を利用することにより、測定時に於ける試料中の
溶血成分による影響を受けることなく測定対象物質を測
定することが可能となるので、従来よりも測定の精度を
向上させることができることが判る。
の回避の検討（ポリアスパラギン酸を分離向上物質と
し、アニオン交換クロマトグラフィー用の充填剤を使用
した場合）（溶離液Ａ）実施例５の溶離液Ａと同じ。 （溶離液Ｂ）実施例５の溶離液Ｂと同じ。 （基質液）実施例１の基質液と同じ。 （抗体液１）実施例１の抗体液３と同じ。 （抗体液２）抗体液１で使用したモノクローナル抗体と
認識部位が異なることが確認されている抗ＡＦＰモノク
ローナル抗体（和光純薬工業（株）製）を常法により処
理しFab'とした後、これとポリアスパラギン酸（平均分
子量：13000、シグマ社製）とをSulfo-SMCC（ピアス社
製）を用いた常法により結合させ、次いで常法により精
製を行って、ポリアスパラギン酸が結合した抗ＡＦＰ−
Fab'を得た。これを50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM
塩化ナトリウム含有）中に50nMのタンパク濃度となるよ
うに添加して抗体液２とした。 （溶血液）ヒト赤血球より得たヘモグロビンを1000mg/d
lとなるように50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化
ナトリウム含有）で希釈したものを溶血液とした。 （試料）実施例１のＡＦＰ試料液と同じ。 （ＨＰＬＣの使用条件）システムの概略を図２に示す。 ・カラム：0.46φx3.0cm。 ・充填剤：ワコービーズ DEAEゲル （和光純薬工業
（株）社商品名）。 ・流速：溶離液Ａ＋Ｂ；1.0ml/min、基質液；0.1ml/mi
n。 ・反応部：0.025φx1000cm （55℃保温） ・検出：励起波長 320nm、蛍光波長 404nmで蛍光を測
定した。 ・グラジエント：溶離液Ａと溶離液Ｂのグラジエントを
図４に示す （測定方法）抗体液１ 30μlとＡＦＰ試料液 30μlと溶
血液 10μlとに、50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩
化ナトリウム含有）又は抗体液２の30μlを混合し、30
℃で30分放置した後、各混合液の50μlをＨＰＬＣによ
り分析した。 （結果）得られた溶出パターンを図５に示す。図５中、
Ａは溶血液を50mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化ナ
トリウム含有）で10倍に希釈したものについて分析した
結果得られた溶出パターンを、Ｂは抗体液１、ＡＦＰ試
料液、溶血液及びリン酸緩衝液との混合液について分析
した結果得られた溶出パターンを、Ｃは抗体液１、ＡＦ
Ｐ試料液、溶血液及び抗体液２との混合液について分析
した結果得られた溶出パターンを夫々示す。図５のＡか
ら明らかなように、溶血成分は0.5〜5.5分の間に複数の
ピークとして溶出することが判る。これに対して、ＰＯ
Ｄ標識抗ＡＦＰ−Fab'は1.10分後に、ＰＯＤ標識抗ＡＦ
Ｐ−Fab'とＡＦＰとの複合体は3.25分後に、ＰＯＤ標識
抗ＡＦＰ−Fab'とポリアスパラギン酸結合抗ＡＦＰ−Fa
b'とＡＦＰとの複合体は7.20分後に夫々溶出することが
判る。以上の結果より、本発明の分離方法を利用するこ
とにより溶血の影響を全く受けない溶出位置に複合体を
溶出させることができること、言い換えれば本発明の分
離方法を利用することにより、測定時に於ける試料中の
溶血成分による影響を受けることなく測定対象物質を測
定することが可能となるので、従来よりも測定の精度を
向上させることができることが判る。
【００５８】実施例７．糖鎖構造の異なるｈＣＧの分別
測定（ポリアスパラギン酸を分離向上物質とし、アニオ
ン交換クロマトグラフィー用の充填剤を使用した場合） （抗体液）実施例１の抗体液１と同じ。 （レクチン溶液１）ダツラレクチン（和光純薬工業
（株）社製）を50mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン（以下、トリス）−塩酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM
塩化ナトリウム及び１mM塩化カルシウム含有）中に１mg
/mlのタンパク濃度となるように添加してレクチン溶液
１とした。 （レクチン溶液２）レクチン溶液１を調製するために用
いたのと同じダツラレクチンとポリアスパラギン酸（平
均分子量28800）とを、ジサクシンイミジルスベレイト
（Disuccinimidyl suberate、ピアス社製）を用いる常
法によりポリアスパラギン酸結合ダツラレクチンとし、
これを50mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.5 150mM塩化ナ
トリウム、１mM塩化カルシウム含有）中に１mg/mlのタ
ンパク濃度となるように添加したものをレクチン溶液２
とした。 （ｈＣＧ試料液）ヒト絨毛癌由来ｈＣＧ（和光純薬工業
（株）社製）を50mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.5 150m
M塩化ナトリウム及び１mM塩化カルシウム含有）中に250
mIU/mlの濃度となるように添加したものをｈＣＧ試料液
とした。 （ＨＰＬＣの使用条件）実施例６と同じ。 （測定操作）ｈＣＧ試料液 10μlと抗体液 20μlと、レ
クチン溶液１又はレクチン溶液２の70μlとを混合し、3
0℃で30分間放置した後、得られた混合液の50μlをＨＰ
ＬＣにより分析した。 （結果）ＨＰＬＣによる分析の結果、ＰＯＤ標識抗ｈＣ
Ｇ−α鎖−Fab'は1.10分後に、ＰＯＤ標識抗ｈＣＧ−α
鎖−Fab'とｈＣＧの複合体は3.50分後に、ＰＯＤ標識抗
ｈＣＧ−α鎖−Fab'とｈＣＧとダツラレクチンとの複合
体は3.82分後に、ＰＯＤ標識抗ｈＣＧ−α鎖−Fab'とｈ
ＣＧとポリアスパラギン酸結合ダツラレクチンとの複合
体は7.9分後に夫々溶出することが判った。以上の結果
より、ポリアスパラギン酸結合ダツラレクチンを用いる
ことにより、レクチン結合複合体とレクチン非結合複合
体とをより明確に分離できること、言い換えれば全ｈＣ
Ｇ中の特定糖鎖を有するｈＣＧ量をより精度良く測定す
ることができるようになることが判る。
測定（ポリアスパラギン酸を分離向上物質とし、アニオ
ン交換クロマトグラフィー用の充填剤を使用した場合） （抗体液）実施例１の抗体液１と同じ。 （レクチン溶液１）ダツラレクチン（和光純薬工業
（株）社製）を50mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン（以下、トリス）−塩酸緩衝液（ｐＨ7.5、150mM
塩化ナトリウム及び１mM塩化カルシウム含有）中に１mg
/mlのタンパク濃度となるように添加してレクチン溶液
１とした。 （レクチン溶液２）レクチン溶液１を調製するために用
いたのと同じダツラレクチンとポリアスパラギン酸（平
均分子量28800）とを、ジサクシンイミジルスベレイト
（Disuccinimidyl suberate、ピアス社製）を用いる常
法によりポリアスパラギン酸結合ダツラレクチンとし、
これを50mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.5 150mM塩化ナ
トリウム、１mM塩化カルシウム含有）中に１mg/mlのタ
ンパク濃度となるように添加したものをレクチン溶液２
とした。 （ｈＣＧ試料液）ヒト絨毛癌由来ｈＣＧ（和光純薬工業
（株）社製）を50mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.5 150m
M塩化ナトリウム及び１mM塩化カルシウム含有）中に250
mIU/mlの濃度となるように添加したものをｈＣＧ試料液
とした。 （ＨＰＬＣの使用条件）実施例６と同じ。 （測定操作）ｈＣＧ試料液 10μlと抗体液 20μlと、レ
クチン溶液１又はレクチン溶液２の70μlとを混合し、3
0℃で30分間放置した後、得られた混合液の50μlをＨＰ
ＬＣにより分析した。 （結果）ＨＰＬＣによる分析の結果、ＰＯＤ標識抗ｈＣ
Ｇ−α鎖−Fab'は1.10分後に、ＰＯＤ標識抗ｈＣＧ−α
鎖−Fab'とｈＣＧの複合体は3.50分後に、ＰＯＤ標識抗
ｈＣＧ−α鎖−Fab'とｈＣＧとダツラレクチンとの複合
体は3.82分後に、ＰＯＤ標識抗ｈＣＧ−α鎖−Fab'とｈ
ＣＧとポリアスパラギン酸結合ダツラレクチンとの複合
体は7.9分後に夫々溶出することが判った。以上の結果
より、ポリアスパラギン酸結合ダツラレクチンを用いる
ことにより、レクチン結合複合体とレクチン非結合複合
体とをより明確に分離できること、言い換えれば全ｈＣ
Ｇ中の特定糖鎖を有するｈＣＧ量をより精度良く測定す
ることができるようになることが判る。
【００５９】実施例８．チロキシン（Ｔ4）の測定（ポ
リグルタミン酸を分離向上物質とし、アニオン交換クロ
マトグラフィー用の充填剤を使用した場合） （溶離液Ａ）20mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）を溶
離液Ａとした。 （溶離液Ｂ）１Ｍ塩化ナトリウムを含む20mMトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ8.0）を溶離液Ｂとした。 （基質液）溶離液Ａ 80mlに3-(p-ヒドロキシフェニル)
プロピオン酸 1.66gを溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウムで
ｐＨを8.0とした後、溶離液Ａで全量を100mlとした。30
％過酸化水素水をこの溶液で希釈して、20mMのＨ2Ｏ2を
含む溶液を調製して基質液とした。 （抗体液１）抗Ｔ4モノクロ−ナル抗体（和光純薬工業
（株）製）を常法により処理してFab'としたものを、常
法により西洋ワサビペルオキシダ−ゼ（ＰＯＤ）標識し
て得たＰＯＤ標識抗Ｔ4−Fab'を20mMトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ8.0）中に３nMのタンパク濃度となるように添
加して抗体液１とした。 （抗体液２）抗ＰＯＤモノクロ−ナル抗体（和光純薬工
業（株）製）を常法により処理してＦab'とし、これと
ポリグルタミン酸（平均分子量：95100、シグマ社製）
とをSulfo-SMCCを用いる常法により結合させて得たポリ
グルタミン酸結合抗ＰＯＤ−Fab'を、20mMトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ8.0）中に50nMのタンパク濃度となるよう
に 添加して抗体液２とした。尚、今回使用した抗ＰＯ
Ｄモノクローナル抗体は、ＰＯＤと結合するがその酵素
活性は阻害しないという性質を有するものである。 （Ｔ4試料液）市販のＬ−チロキシン（シグマ社製）を2
0mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）中に10nMの濃度とな
るように添加してＴ4試料液とした。 （ＨＰＬＣの使用条件）システムの概略を図２に示す。 ・カラム：0.46φx3.0cm。 ・充填剤：ワコービーズ DEAEゲル （和光純薬工業
（株）社商品名）。 ・流速：溶離液Ａ＋Ｂ；1.0ml/min、基質液；0.1ml/mi
n。 ・反応部：0.025φx1000cm （55℃保温） ・検出：励起波長 320nm、蛍光波長 404nmで蛍光を測
定した。 ・グラジエント：溶離液Ａと溶離液Ｂのグラジエントを
図４に示す （測定操作）Ｔ4試料液 30μlと抗体液１ 30μlと20mM
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）30μlとを混合したもの
を検体１とし、Ｔ4試料液 30μlと抗体液１ 30μlと抗
体液２30μlとを混合したものを検体２とした。各検体
を30℃で30分間放置した後、各検体の50μlをＨＰＬＣ
により分析した。 （結果）ＨＰＬＣによる分析結果から、ＰＯＤ標識抗Ｔ
4−Fab'は3.3分後に、ＰＯＤ標識抗Ｔ4−Fab'とＴ4との
複合体は2.3分後に、ＰＯＤ標識抗Ｔ4−Fab'とポリグル
タミン酸結合抗ＰＯＤ−Fab'との複合体は8.9分後に、
ＰＯＤ標識抗Ｔ4−Fab'とポリグルタミン酸結合抗ＰＯ
Ｄ−Fab'とＴ4との複合体は7.4分後に夫々溶出してくる
ことが判った。以上の結果より、ポリグルタミン酸結合
抗ＰＯＤ−Fab'を用いることにより、ＰＯＤ標識抗Ｔ4
−Fab'及びＰＯＤ標識抗Ｔ4−Fab'とＴ4との複合体の溶
出位置を変化させることができること、言い換えればＰ
ＯＤ標識抗Ｔ4−Fab'と、ＰＯＤ標識抗Ｔ4−Fab'とＴ4
との複合体とをより明確に分離できるようになることが
判る。
リグルタミン酸を分離向上物質とし、アニオン交換クロ
マトグラフィー用の充填剤を使用した場合） （溶離液Ａ）20mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）を溶
離液Ａとした。 （溶離液Ｂ）１Ｍ塩化ナトリウムを含む20mMトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ8.0）を溶離液Ｂとした。 （基質液）溶離液Ａ 80mlに3-(p-ヒドロキシフェニル)
プロピオン酸 1.66gを溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウムで
ｐＨを8.0とした後、溶離液Ａで全量を100mlとした。30
％過酸化水素水をこの溶液で希釈して、20mMのＨ2Ｏ2を
含む溶液を調製して基質液とした。 （抗体液１）抗Ｔ4モノクロ−ナル抗体（和光純薬工業
（株）製）を常法により処理してFab'としたものを、常
法により西洋ワサビペルオキシダ−ゼ（ＰＯＤ）標識し
て得たＰＯＤ標識抗Ｔ4−Fab'を20mMトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ8.0）中に３nMのタンパク濃度となるように添
加して抗体液１とした。 （抗体液２）抗ＰＯＤモノクロ−ナル抗体（和光純薬工
業（株）製）を常法により処理してＦab'とし、これと
ポリグルタミン酸（平均分子量：95100、シグマ社製）
とをSulfo-SMCCを用いる常法により結合させて得たポリ
グルタミン酸結合抗ＰＯＤ−Fab'を、20mMトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ8.0）中に50nMのタンパク濃度となるよう
に 添加して抗体液２とした。尚、今回使用した抗ＰＯ
Ｄモノクローナル抗体は、ＰＯＤと結合するがその酵素
活性は阻害しないという性質を有するものである。 （Ｔ4試料液）市販のＬ−チロキシン（シグマ社製）を2
0mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）中に10nMの濃度とな
るように添加してＴ4試料液とした。 （ＨＰＬＣの使用条件）システムの概略を図２に示す。 ・カラム：0.46φx3.0cm。 ・充填剤：ワコービーズ DEAEゲル （和光純薬工業
（株）社商品名）。 ・流速：溶離液Ａ＋Ｂ；1.0ml/min、基質液；0.1ml/mi
n。 ・反応部：0.025φx1000cm （55℃保温） ・検出：励起波長 320nm、蛍光波長 404nmで蛍光を測
定した。 ・グラジエント：溶離液Ａと溶離液Ｂのグラジエントを
図４に示す （測定操作）Ｔ4試料液 30μlと抗体液１ 30μlと20mM
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）30μlとを混合したもの
を検体１とし、Ｔ4試料液 30μlと抗体液１ 30μlと抗
体液２30μlとを混合したものを検体２とした。各検体
を30℃で30分間放置した後、各検体の50μlをＨＰＬＣ
により分析した。 （結果）ＨＰＬＣによる分析結果から、ＰＯＤ標識抗Ｔ
4−Fab'は3.3分後に、ＰＯＤ標識抗Ｔ4−Fab'とＴ4との
複合体は2.3分後に、ＰＯＤ標識抗Ｔ4−Fab'とポリグル
タミン酸結合抗ＰＯＤ−Fab'との複合体は8.9分後に、
ＰＯＤ標識抗Ｔ4−Fab'とポリグルタミン酸結合抗ＰＯ
Ｄ−Fab'とＴ4との複合体は7.4分後に夫々溶出してくる
ことが判った。以上の結果より、ポリグルタミン酸結合
抗ＰＯＤ−Fab'を用いることにより、ＰＯＤ標識抗Ｔ4
−Fab'及びＰＯＤ標識抗Ｔ4−Fab'とＴ4との複合体の溶
出位置を変化させることができること、言い換えればＰ
ＯＤ標識抗Ｔ4−Fab'と、ＰＯＤ標識抗Ｔ4−Fab'とＴ4
との複合体とをより明確に分離できるようになることが
判る。
【００６０】実施例９．チロキシン（Ｔ4）の測定（ポ
リグルタミン酸を分離向上物質とし、アニオン交換クロ
マトグラフィー用の充填剤を使用した場合） （標識抗原）常法（NAKANE法：Nakane,P.K. and Kawao
i,A.,J.Histochem.Cytochem.,vol.22,1084〜1091,197
4）により調製したＰＯＤ標識Ｔ4を、20mMトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ8.0）に10nMの濃度となるように溶解した
ものを標識抗原液とした。 （抗体液１）抗Ｔ4モノクロ−ナル抗体（和光純薬工業
（株）製）を常法により処理して得たFab'と、これに対
して20倍モル量のN-エチルマレイミドを加えて37℃で60
分間放置して反応させた。次いで、これを常法により精
製して得たN-エチルスクシンイミド化Fab'を20mMトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）中に２nMのタンパク濃度とな
るように添加して抗体液１とした。 （抗体液２）実施例８の抗体液２と同じ。 （Ｔ4試料液）実施例８のＴ4試料液と同じ。 （溶血液）実施例６の溶血液と同じ。 （ＨＰＬＣの使用条件）実施例８と同じ。 （測定操作）下記表２の組成の検体１〜３を調製し、
各検体を30℃で30分間放置した後、各検体の50μlをＨ
ＰＬＣにより分析した。
リグルタミン酸を分離向上物質とし、アニオン交換クロ
マトグラフィー用の充填剤を使用した場合） （標識抗原）常法（NAKANE法：Nakane,P.K. and Kawao
i,A.,J.Histochem.Cytochem.,vol.22,1084〜1091,197
4）により調製したＰＯＤ標識Ｔ4を、20mMトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ8.0）に10nMの濃度となるように溶解した
ものを標識抗原液とした。 （抗体液１）抗Ｔ4モノクロ−ナル抗体（和光純薬工業
（株）製）を常法により処理して得たFab'と、これに対
して20倍モル量のN-エチルマレイミドを加えて37℃で60
分間放置して反応させた。次いで、これを常法により精
製して得たN-エチルスクシンイミド化Fab'を20mMトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）中に２nMのタンパク濃度とな
るように添加して抗体液１とした。 （抗体液２）実施例８の抗体液２と同じ。 （Ｔ4試料液）実施例８のＴ4試料液と同じ。 （溶血液）実施例６の溶血液と同じ。 （ＨＰＬＣの使用条件）実施例８と同じ。 （測定操作）下記表２の組成の検体１〜３を調製し、
各検体を30℃で30分間放置した後、各検体の50μlをＨ
ＰＬＣにより分析した。
【表２】 （結果）ＨＰＬＣによる分析結果から、ＰＯＤ標識Ｔ4
は2.6分後に、ＰＯＤ標識Ｔ4とN-エチルスクシンイミド
化Fab'の複合体は3.5分後に、ＰＯＤ標識Ｔ4とポリグル
タミン酸結合抗ＰＯＤ−Fab'の複合体は8.3分後に、Ｐ
ＯＤ標識Ｔ4とN-エチルスクシンイミド化Fab'とポリグ
ルタミン酸結合抗ＰＯＤ−Fab'との複合体は9.1分後に
夫々溶出してくることが判った。一方、溶血成分は実施
例６の場合と同様に0.5〜5.5分の間に複数のピークとし
て溶出することが判った。以上の結果より、本発明の分
離方法を利用することにより溶血の影響を全く受けない
溶出位置に複合体を溶出させることができること、言い
換えれば本発明の分離方法を利用することにより、測定
時に於ける試料中の溶血成分による影響を受けることな
く測定対象物質を測定することが可能となるので、従来
よりも測定の精度を向上させることができることが判
る。
は2.6分後に、ＰＯＤ標識Ｔ4とN-エチルスクシンイミド
化Fab'の複合体は3.5分後に、ＰＯＤ標識Ｔ4とポリグル
タミン酸結合抗ＰＯＤ−Fab'の複合体は8.3分後に、Ｐ
ＯＤ標識Ｔ4とN-エチルスクシンイミド化Fab'とポリグ
ルタミン酸結合抗ＰＯＤ−Fab'との複合体は9.1分後に
夫々溶出してくることが判った。一方、溶血成分は実施
例６の場合と同様に0.5〜5.5分の間に複数のピークとし
て溶出することが判った。以上の結果より、本発明の分
離方法を利用することにより溶血の影響を全く受けない
溶出位置に複合体を溶出させることができること、言い
換えれば本発明の分離方法を利用することにより、測定
時に於ける試料中の溶血成分による影響を受けることな
く測定対象物質を測定することが可能となるので、従来
よりも測定の精度を向上させることができることが判
る。
【００６１】
【発明の効果】以上述べた如く、本発明は、測定対象物
質とこれに対する結合能物質との相互作用の結果生じる
複合体と遊離の結合能物質（又は遊離の測定対象物質）
等のその他の物質との分離を高速液体クロマトグラフィ
を用いて行なう測定方法に於いて、該複合体に更に分離
向上物質を結合させて該複合体の性質を自由に変化させ
ることにより、高速液体クロマトグラフィに於ける該複
合体の溶出位置を自由に調節し得るという効果を奏する
方法を提供するものであり、本発明の分離方法を利用し
て血清等の生体試料中の微量成分の測定を行った場合に
は、従来のＥＩＡやＲＩＡ等の測定法に比較して容易に
且つ極めて短時間で高精度の測定が行な得るという顕著
な効果をも奏するものであり、斯業に貢献するところ大
なる発明である。
質とこれに対する結合能物質との相互作用の結果生じる
複合体と遊離の結合能物質（又は遊離の測定対象物質）
等のその他の物質との分離を高速液体クロマトグラフィ
を用いて行なう測定方法に於いて、該複合体に更に分離
向上物質を結合させて該複合体の性質を自由に変化させ
ることにより、高速液体クロマトグラフィに於ける該複
合体の溶出位置を自由に調節し得るという効果を奏する
方法を提供するものであり、本発明の分離方法を利用し
て血清等の生体試料中の微量成分の測定を行った場合に
は、従来のＥＩＡやＲＩＡ等の測定法に比較して容易に
且つ極めて短時間で高精度の測定が行な得るという顕著
な効果をも奏するものであり、斯業に貢献するところ大
なる発明である。
【図１】図１は、実施例１で使用した高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）のシステムの概略図を示したも
のである。
グラフィー（ＨＰＬＣ）のシステムの概略図を示したも
のである。
【図２】図２は、実施例２、３、４、５、６、７、８及
び９で使用したＨＰＬＣのシステムの概略図を示したも
のである。
び９で使用したＨＰＬＣのシステムの概略図を示したも
のである。
【図３】図３は、実施例２、３及び４に於けるＨＰＬＣ
のグラジエントパターンを示したもので、縦軸は硫酸ア
ンモニウム濃度(Ｍ)を、横軸は時間(分)を夫々表わす。
のグラジエントパターンを示したもので、縦軸は硫酸ア
ンモニウム濃度(Ｍ)を、横軸は時間(分)を夫々表わす。
【図４】図４は、実施例５、６、７、８及び９に於ける
ＨＰＬＣのグラジエントパターンを示したもので、縦軸
は溶離液Ｂの濃度(％)を、横軸は時間(分)を夫々表わ
す。
ＨＰＬＣのグラジエントパターンを示したもので、縦軸
は溶離液Ｂの濃度(％)を、横軸は時間(分)を夫々表わ
す。
【図５】図５は、実施例６に於て得られたＨＰＬＣによ
る試料の溶出パターンを示し、Ａは溶血液を50mMリン酸
緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化ナトリウム含有）で10倍に
希釈したものについて分析した結果得られた溶出パター
ンを、Ｂは抗体液１、ＡＦＰ試料液、溶血液及びリン酸
緩衝液との混合液について分析した結果得られた溶出パ
ターンを、Ｃは抗体液１、ＡＦＰ試料液、溶血液及び抗
体液２との混合液について分析した結果得られた溶出パ
ターンを夫々示す。
る試料の溶出パターンを示し、Ａは溶血液を50mMリン酸
緩衝液（ｐＨ7.5、150mM塩化ナトリウム含有）で10倍に
希釈したものについて分析した結果得られた溶出パター
ンを、Ｂは抗体液１、ＡＦＰ試料液、溶血液及びリン酸
緩衝液との混合液について分析した結果得られた溶出パ
ターンを、Ｃは抗体液１、ＡＦＰ試料液、溶血液及び抗
体液２との混合液について分析した結果得られた溶出パ
ターンを夫々示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 合議体 審判長 後藤 千恵子 審判官 矢沢 清純 審判官 伊坪 公一 (56)参考文献 特開 平３−221865（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−110059（ＪＰ，Ａ)
Claims (11)
- 【請求項１】測定対象物質が、互いに同一の作用を有
し、且つ同一の検出可能な化学特性を有する２以上の物
質である場合の測定用キットであって、（ａ）測定対象
物質の少なくとも１つと特異的に結合するが、これらの
うちの少なくとも１つとは結合しない性質を有する物質
（以下、結合能物質Ａ2と略記する。）と、（ｂ）測定
対象物質と結合能物質Ａ 2 とが結合して生じる複合体の
性質を変化させ得る分離向上物質により修飾され且つ測
定対象物質と結合能物質Ａ2との複合体に対して結合す
る性質を有する物質（以下、修飾結合能物質Ｂ１と略記
する。）を含んでなるキット。 - 【請求項２】測定対象物質が、同一の作用を有する２以
上の物質又は類似した構造を有するが異なる作用を有す
る２以上の物質である場合の測定用キットであって、
（ａ’）測定対象物質の全てに対して結合能を有し且つ
検出物質により標識された物質（以下、結合能物質Ａ3
と略記する。）と、（ｂ’）特定の測定対象物質に対す
る結合能を有し且つ該測定対象物質と結合能物質Ａ3と
の複合体の性質を変化させ得る分離向上物質により修飾
された物質（以下、修飾結合能物質Ｃと略記する。）
と、を含んでなるキット。 - 【請求項３】分離向上物質が、タンパク質、ペプチド、
合成高分子化合物、ポリアミノ酸、ハロゲン原子、アル
キル鎖、脂肪酸、又は測定対象物質と結合能物質Ａ2と
の複合体若しくは特定の測定対象物質に対する結合能を
有する物質に結合し得る反応基を有し且つ疎水性若しく
はイオン性を有する化学物質である請求項１又は２に記
載のキット。 - 【請求項４】同一の作用を有し、且つ同一の検出可能な
化学特性を有する２以上の測定対象物質を含む生体由来
の試料と、結合能物質Ａ2及び修飾結合能物質Ｂ１とを
反応させ、特定の測定対象物質と結合能物質Ａ2と修飾
結合能物質Ｂ１との複合体を形成させ、該複合体と遊離
の測定対象物質とを分離した後、該複合体に含まれる測
定対象物質の量又は／及び遊離の測定対象物質の量を測
定することにより、試料中の測定対象物質の何れかの量
を求めることを特徴とする測定方法。 - 【請求項５】同一の作用を有する２以上の測定対象物質
又は類似した構造を有するが異なる作用を有する２以上
の測定対象物質を含む生体由来の試料と、結合能物質Ａ
3及び修飾結合能物質Ｃとを反応させ、測定対象物質と
結合能物質Ａ3との複合体（複合体Ａ）及び特定の測定
対象物質と結合能物質Ａ3と修飾結合能物質Ｃとの複合
体（複合体Ｂ）を形成させ、複合体Ａと複合体Ｂとを分
離した後、複合体Ａ中に含まれる検出物質の量又は／及
び複合体Ｂ中に含まれる検出物質の量を測定することに
より、試料中の測定対象物質の何れかの量を求めること
を特徴とする測定方法。 - 【請求項６】分離が、液体クロマトグラフィーによるも
のである、請求項４乃至５に記載の方法。 - 【請求項７】液体クロマトグラフィーで使用されるカラ
ムの充填剤がイオン交換クロマトグラフィー用充填剤で
ある、請求項４乃至６に記載の方法。 - 【請求項８】分離向上物質が、タンパク質、ペプチド、
合成高分子化合物、ポリアミノ酸、ハロゲン原子、アル
キル鎖、脂肪酸、又は測定対象物質と結合能物質Ａ2と
の複合体若しくは特定の測定対象物質に対する結合能を
有する物質に結合し得る反応基を有し且つ疎水性若しく
はイオン性を有する化学物質である請求項４又は５に記
載の方法。 - 【請求項９】分離向上物質がタンパク質、合成高分子化
合物又はポリアミノ酸であり、液体クロマトグラフィー
で使用されるカラムの充填剤がゲル瀘過用充填剤であ
る、請求項６に記載の方法。 - 【請求項１０】分離向上物質がタンパク質、ペプチド、
ポリアミノ酸、アルキル鎖、ハロゲン原子、脂肪酸、又
は測定対象物質と結合能物質Ａ2との複合体若しくは特
定の測定対象物質に対する結合能を有する物質に結合し
得る反応基を有し且つ疎水性を有する化学物質であり、
液体クロマトグラフィーで使用されるカラムの充填剤が
疎水クロマトグラフィー用充填剤である、請求項６に記
載の方法。 - 【請求項１１】分離向上物質が合成高分子化合物、タン
パク質、ポリアミノ酸、又は測定対象物質と結合能物質
Ａ2との複合体若しくは特定の測定対象物質に対する結
合能を有する物質に結合し得る反応基を有し且つイオン
性を有する化学物質、脂肪酸又はペプチドであり、液体
クロマトグラフィーで使用されるカラムの充填剤がイオ
ン交換クロマトグラフィー用充填剤である、請求項６に
記載の方法。
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|---|---|---|---|
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| JP18301892 | 1992-06-17 | ||
| JP05171130A JP3102611B2 (ja) | 1992-06-17 | 1993-06-17 | 複合体の分離方法 |
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- 1993-06-17 JP JP05171130A patent/JP3102611B2/ja not_active Expired - Lifetime
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