JP3096487B2 - バルビツレート検定法、トレーサー、免疫抗原、抗体およびキット - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はバルビツレート検定法、
トレーサー、免疫抗原、抗体およびキット、詳しくは、
流体、特に血清、血漿または尿などの生物学的流体中の
バルビツレートの量を測定する蛍光偏光免疫学的検定操
作のための方法および試薬、並びに該試薬の製造法に関
する。更に詳しくは、本発明は、(１)試料中のバルビツ
レートの量を測定する試薬(トレーサーおよび抗体、お
よびトレーサーと抗体を含有するキット)、(２)抗体を
発生させるのに用いる免疫抗原化合物、(３)トレーサー
および免疫抗原化合物を製造する合成法、および(４)当
該検定を行う分析法に関する。

【０００２】

【従来の技術と発明が解決しようとする課題】バルビツ
レートは中枢神経系抑制薬である。治療上、バルビツレ
ートは鎮静薬、催眠薬および抗けいれん薬として用いら
れている。バルビツレートの法的利用可能性は衰退しつ
つあるが、バルビツレートは頻繁に乱用される鎮静薬あ
るいは催眠薬であって、一般に自殺をするために用いら
れている。

【０００３】バルビツレートの生理学的吸収、作用およ
び毒性は、広範囲に変化し、かつ５−置換基およびイミ
ノ−水素の性質に左右される。血液中の約３５％のバル
ビツレートは血漿プロテインと結合する。バルビツレー
トは各種の組織や器官に分布する。バルビツレートは主
に肝臓で代謝し、そして数種のものを除き、一般に主に
非活性代謝産物として尿の中に***される。

【０００４】最も普通に乱用されるバルビツレートは、
短時間作用乃至中間時間作用型の、セコバルビタール、
ペントバルビタール等である。これらのバルビツレート
は、刺激薬の使用に基づく興奮状態を和らげるのに広く
用いられている。これら薬物に対する耐性は、慢性使用
によって進行し、そして該薬物の過剰投与量あるいは突
然の退薬のいずれかによって死を招くことがある。

【０００５】従来、尿中のバルビツレート量は一般的
に、高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、ガスク
ロマトグラフィー(ＧＣ)、酵素免疫学的検定法(ＥＩ
Ａ)、基質−結合蛍光免疫学的検定法(ＳＬＦＩＡ)およ
び放射免疫学的検定法(ＲＩＡ)によって測定されてい
た。これらの方法は、薬物量の検出に対してかなり特異
的であるが、欠点を否定できない。すなわち、ＨＰＬＣ
およびＧＣ法には試料の抽出操作が必要で、かつ検定時
間が長い。ＥＩＡおよびＳＬＦＩＡでは共に酵素反応が
必然的に伴い、かつ以下の欠点を有する。 １)試薬が比較的に不安定である。 ２)ＥＩＡまたはＳＬＦＩＡの酵素反応に影響を及ぼし
うる、生物学的試料中のいずれかの成分(たとえば酵素
インヒビターまたは類する反応を触媒促進する酵素)が
検定結果に影響を及ぼす。 ３)ＥＩＡおよびＳＬＦＩＡは吸収度または蛍光のいず
れかを測定し、そして吸収度または蛍光に影響を及ぼし
うる、生物学的試料中のいずれかの成分(たとえば脂
質、ヘモグロビン、ビリルビンまたは他の発色団もしく
は発光団)が該検定から得られる結果の正確さに影響を
及ぼす。一方、ＲＩＡの試薬は以下の欠点を有する。 i) 半減期が短い。 ii) 放射能が生命を危険にさらす。 iii)放射性物質の貯蔵および廃棄に問題が付随する。

【０００６】一般に、試験試料中のリガンドを測定する
のに、競合結合免疫学的検定法が使用されている。ここ
で、“リガンド"は、競合結合免疫学的検定法で定量的
に測定される、生物学的に興味のある物質である。リガ
ンドは標識試薬、または“リガンド類縁体"もしくは
“トレーサー"と競合するが、これはリガンドおよびリ
ガンド類縁体に対し特有の抗体における限られた数の結
合部位においてである。試料中のリガンド濃度は、抗体
に結合するリガンド類縁体の量を決定する。結合するリ
ガンド類縁体の量は、試料中のリガンド濃度に反比例す
るが、これはリガンドおよびリガンド類縁体がそれぞ
れ、その濃度に比例して抗体に結合するからである。

【０００７】蛍光偏光は、競合結合免疫学的検定法にお
いて生じるトレーサー−抗体接合の量を測定するのに定
量手段を付与する。蛍光偏光法は、蛍光標識化合物が、
平面偏光によって励起されるとき、分子回転の速度に対
して逆比的に関係する偏光率を持つ蛍光を発するという
原理に基づく、従って、トレーサー−抗体接合を有する
蛍光標識が平面偏光と共に励起されると、発光団(fluor
ophore)は光が吸収されおよび発射される時間の間で回
転するのを抗体によって抑制されるため、発射した光は
高偏光の状態のままで残存する。これに対し、未結合ト
レーサーが平面偏光によって励起されると、その回転は
対応するトレーサー−抗体接合の回転よりはるかに速く
なる。その結果、未結合トレーサー分子から発した光は
偏光しなくなる。

【０００８】これまで、尿におけるバルビツレートや他
の“乱用薬物"の蛍光偏光法による正確な測定が妨げら
れてきた問題は、リボフラビン干渉にある。リボフラビ
ン、あるいはビタミンＢ₂は多くの食品や商業上入手し
うるビタミン補給品の一般的成分である。リボフラビン
は主に尿中に***され、かつフルオレセインに極めて類
する蛍光スペクトルを有する。その結果、尿試料中にた
とえ大したことのない量でもリボフラビンが存在する
と、間違った結果をもたらしうる干渉が起る。リボフラ
ビンの正常な消費では、痕跡量を越えるリボフラビンを
尿中に生成させるとは思われないが、バルビツレート使
用の発覚の阻止を望む人による過剰量のビタミン補給品
の消費によって、試験結果が容易にゆがめられる。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明の特徴は、一般に
用いられるバルビツレートに対するより均一なクロス反
応性(cross−reactivity)にある。さらに本発明は、特
にリボフラビン干渉を伴わないバルビツレートの測定に
対し、トレーサー、該トレーサーの製造法、および該ト
レーサーを用いる検定法を提供することによって、当該
技術の進歩を図るものである。

【００１０】すなわち、本発明はバルビツレートの蛍光
偏光検定法、該検定法に用いるトレーサー、免疫抗原お
よび抗体、試薬キット、並びに上記トレーサー、免疫抗
原および抗体の製造法に関連する。

【００１１】本発明の第１の観点は、新規構造を有する
ユニークなトレーサーおよび免疫抗原の発見に関係す
る。この第１観点によれば、当該トレーサーおよび免疫
抗原はそれぞれ、式:

【化１１】 および

【化１２】 で示され、式中、トレーサー[２７]の場合、Ｗは酸素ま
たは硫黄;Ｒ¹は直鎖または分枝鎖状に配列され、かつ１
個以下の脂肪族または芳香族環構造を持ち、トータル１
〜１２個の炭素原子および０〜１個のハロゲン原子を有
する、アルキル、アルケニル、アリール、またはアルキ
ニル基;Ｒ³はＲ⁴−Ｆl;Ｆlはフルオレセインまたはフル
オレセイン誘導体;およびＲ⁴は(a)直鎖または分枝鎖状
に配列され、かつ１個以下の脂肪族または芳香族環構造
を持ち、炭素原子およびＯ、Ｎ、Ｓ、ＰまたはＦのヘテ
ロ原子をトータルで０〜１５個有する結合基、または
(b)トータル０〜５個のヘテロ原子を有する結合基であ
る。また免疫抗原[２]の場合、Ｗは酸素または硫黄;Ｒ¹
は１個以下の脂肪族または芳香族環構造を持ち、トータ
ル１〜１２個の炭素原子および０〜１個のハロゲン原子
を有する、アルキル、アルケニル、アリール、またはア
ルキニル基;Ｒ²はＲ−Ｑ;Ｑはポリ(アミノ酸)、ポリ(ア
ミノ酸)誘導体、または他の免疫抗原的に活性な担体;お
よび Ｏ ‖ Ｒは(a)末端にＱに結合する−ＣＨ２−、−ＣＨ＝、−Ｃ−または−ＮＨ−を 有する結合基、(b)直鎖または分枝鎖状に配列され、か
つ１個以下の脂肪族または芳香族環構造を持ち、炭素原
子およびＯ、Ｎ、Ｓ、ＰまたはＦのヘテロ原子をトータ
ルで０〜２０個有する結合基、または(Ｃ)トータル０〜
７個のヘテロ原子を有する結合基である。

【００１２】本発明の第２の観点は、新規な免疫抗原に
対して製造される単クローン性または多クローン性抗体
に関係する。この第２観点によれば、該抗体は免疫抗原
[２]に応じて製造される。本発明の最も好ましい抗体
は、式:

【化１３】 で示される新規な免疫抗原[２９]に応じて製造される。

【００１３】本発明の第３の観点によれば、免疫抗原
は、式[２]において、Ｗが酸素または硫黄;Ｒ¹が直鎖ま
たは分枝鎖状に配列され、かつ１個以下の脂肪族または
芳香族環構造を持ち、トータル１〜１２個の炭素原子を
有する、アルキル、アルケニル、アリールまたはアルキ
ニル基;Ｒ²がＣＨ₂−Ｒ−Ｘ; ＸがＮＨ₂、Ｃl、Ｂr、Ｉ、ＯＨ、ＣＯ₂Ｈ、Ｏ−Ｃ−Ｃl、−Ｃ−ＣＨ₂Ｉ、 ‖ Ｏ −ＣＨＯ、−Ｃ−ＣＨ₃、または ‖ Ｏ

【化１４】 ;およびＲが直鎖または分枝鎖状に配列され、かつ１個
以下の脂肪族または芳香族環構造を持ち、７個以下のヘ
テロ原子、または炭素原子およびヘテロ原子をトータル
で０〜２０個有する結合基である化合物[２]を、ポリ
(アミノ酸)、ポリ(アミノ酸)誘導体または他の免疫抗原
的に活性な担体とカップリング反応させる工程から成る
方法によって合成することができる。

【００１４】本発明の第４の観点によれば、式[２７]に
おいて、Ｗが酸素または硫黄;Ｒ¹が直鎖または分枝鎖状
に配列され、かつ１個以下の脂肪族または芳香族環構造
を持ち、トータル１〜１２個の炭素原子を有するアルキ
ル、アルケニルまたはアルキニル基;Ｒ³がＣＨ₂−Ｒ−
Ｙ;ＹがＮＨ₂、ＣＯＯＨ、ＣＯＣl、ＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂Ｃ
l、ＳＨ、ＣＨＯ、ＣＮ、ＯＨまたはＩ;およびＲが直鎖
または分枝鎖状に配列され、かつ１個以下の脂肪族また
は芳香族環構造を持ち、１０個以下のヘテロ原子、また
は炭素原子およびヘテロ原子をトータルで０〜２０個有
する結合基である化合物[２７]を、フルオレセインまた
はフルオレセイン誘導体とカップリング反応させること
による、トレーサーの製造法が提供される。

【００１５】好ましくは、トレーサーは、式[２７]にお
いて、ＷおよびＲ³が前記と同意義;Ｒ¹が分枝鎖状に配
列され、かつ環構造を持たない、４または５個の炭素原
子を有するアルキル基;ＹがＮＨ₂またはＣＯＯＨ;およ
びＲが直鎖または分枝鎖状に配列され、かつ環構造を持
たない、３個以下のヘテロ原子、または炭素原子および
ヘテロ原子をトータルで３〜５個有する結合基である前
駆体[２７]をカップリング反応させることによって製造
される。

【００１６】好ましいフルオレセイン誘導体としては、
アミノ、アミド、アミジノ、尿素、チオ尿素、カルバミ
ド、チオカルバミドまたはトリアジニルアミノ誘導体が
挙げられる。現時点で最も好ましい誘導体はアミノ誘導
体、特にアミノメチルフルオレセインである。

【００１７】本発明の第５の観点は、リボフラビンによ
る潜在的蛍光干渉の排除に関係する。当該検定法で用い
る各試料または１種以上の試薬のいずれかに、直接リボ
フラビン結合プロテイン(ＲＢＰ)を加えると、ＲＢＰは
存在する全リボフラビンと結合してＲＢＰ−リボフラビ
ン錯体となり、このようにして蛍光干渉が排除される。
この目的に、他の蛍光消光物質も利用することができ
る。

【００１８】本発明の第６の観点によれば、バルビツレ
ート濃度の検出または測定法が提供される。試料を、バ
ルビツレート抗血清と、およびバルビツレート抗血清の
存在に対して検知しうる蛍光偏光応答をもたらすことが
できるフルオレセイン含有バルビツレート誘導体と接触
せしめる。得られる溶液に平面偏光を通して、蛍光偏光
応答を得、次いでこの蛍光偏光応答を、試料中のバルビ
ツレートの量の測度として検出する。

【００１９】本発明の第７の観点は、単一検定法で一般
使用のバルビツレートを検出するのに有用な安定化した
試薬キットに関係する。この試薬キットは、本発明の新
規方法で試薬として用いる新規トレーサー、またはその
塩を含有する。本発明に係る試薬キットの他の成分とし
ては、リボフラビンによる蛍光干渉を減少させるのに有
効量のリボフラビン結合プロテインおよび一般使用のバ
ルビツレートを明確に認知しかつ該バルビツレートに結
合しうる免疫抗原に対して産生する抗体試薬および本発
明の新規トレーサー試薬を含有する溶液が挙げられる。

【００２０】本発明の他の目的および付随利点について
は、以下の詳細な説明および実施例の記載から容易に理
解されるだろう。

【００２１】下記に示す式中、記号「Ｆl」はフルオレセ
イン成分を表わし、他の各種記号については後記で説明
する。式：

【化１５】 は、本発明に従って準定量的に測定される各種バルビツ
レートの一般構造式を示す。式：

【化１６】 は、本発明の免疫抗原並びに該免疫抗原の製造に用いる
各種反応体の一般構造式を示す。式：

【化１７】 は、本発明のトレーサーに含まれるフルオレセイン成分
の交互構造式を示す。式：

【化１８】 は、式［２]がトレーサーの前駆体を表わすとき、フル
オレセイン成分を式[２]の前駆体にカップリングさせる
各種結合基を示す。式：

【化１９】

【化２０】

【化２１】

【化２２】

【化２３】

【化２４】

【化２５】

【化２６】

【化２７】

【化２８】

【化２９】

【化３０】

【化３１】

【化３２】

【化３３】 は、本発明に係るトレーサーの各種具体例の構造式を示
す。式：

【化３４】

【化３５】

【化３６】

【化３７】

【化３８】

【化３９】

【化４０】 は、本発明で用いる免疫抗原の形成に使用するハプテン
反応体の各種具体例の構造式を示す。式:

【化４１】 は、本発明のトレーサー並びに該トレーサーの製造に用
いる各種反応体の一般構造式を示す。式:

【化４２】 は、本発明の好ましい免疫抗原を示す。式：

【化４３】 は、本発明の最も好ましい免疫抗原を示す。式：

【化４４】 は、本発明の最も好ましいトレーサーを示す。式：

【化４５】 は、本発明の好ましいトレーサーを示す。

【００２２】本発明は、フルオレセインおよびフルオレ
セイン誘導体の使用を要する。特に、本発明のトレーサ
ー化合物の有用性に対してフルオレセインおよびその誘
導体の必要な性質は、フルオレセインの蛍光である。フ
ルオレセインは式［３]で示されるように、環境の酸濃
度(pＨ)に基いて２つの互変異性体で存在する。開環
(酸)型において、多数の共役二重結合が存在し、開環型
のフルオレセイン(およびフルオレセイン成分を含有す
る化合物)は、約４×１０^-9秒の励起状態寿命後に、ブ
ルー光を吸収し、かつグリーン蛍光を発することが可能
となる。開環型と閉環(ラクトン)型が共存すると、開環
および閉環型の分子の相対濃度は、pＨレベルの調整に
よって容易に変えられる。一般に、本発明のトレーサー
化合物は、生理学的に許容しうる塩(たとえばナトリウ
ム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等)の溶液で存在す
ることにより、本発明の分析法で使用する場合、開環蛍
光型で存在することが可能となる。存在する特定の塩
は、pＨレベルの調整に用いる緩衝剤に左右される。た
とえば、リン酸ナトリウム緩衝剤が存在すると、本発明
のトレーサー化合物は一般に、ナトリウム塩の開環型で
存在する。

【００２３】なお、本明細書において個々の化合物また
はより大なる化合物の一成分として用いる語句“フルオ
レセイン"は、蛍光の点を除き、個々の分子に存在する
場合、開環および閉環型の両方を含むことを意味する。
開環型は蛍光を起す上で必要である。

【００２４】フルオレセイン分子の炭素原子の番号付け
は、該分子の開環型または閉環型のいずれを考慮するか
によって変化する。すなわち、フルオレセインおよびそ
の化合物に関する文献において、炭素原子の番号付けは
一定していない。閉環型において、フェニル環上のラク
トンのカルボニルに対しパラ位の炭素の番号は６であ
る。開環型において、フェニル環上のカルボン酸基に対
するパラ位の炭素の番号は５である(式[３]参照)。この
開示において、閉環型での番号付けを採用するが、それ
は合成に用いられる原料が最も一般的に、かかるシステ
ムで番号付けされているからである。従って、フルオレ
セインおよびその化合物のカルボキシル基と反対側の炭
素原子の番号を“６"とする。

【００２５】抗体と複合しない溶液状態のトレーサー
は、蛍光の吸収および再発射に必要な時間より少ない時
間で自由に回転しうる。その結果、再発射した光は比較
的ランダムに配向するので、抗体と複合しないトレーサ
ーの蛍光偏光は低く、ゼロに近づく。特定抗体と共に複
合すると、形成されるトレーサー−抗体錯体は、比較的
小さなトレーサー分子より遅い、抗体分子の回転を装う
ことにより、偏光の増大が観察される。従って、リガン
ドが抗体部位に対しトレーサーと競合するとき、得られ
る自由トレーサーとトレーサー−抗体錯体の混合物の蛍
光の観察される偏光は、トレーサーの値とトレーサー−
抗体錯体の値の中間値を呈示する。試料が高濃度のリガ
ンドを含有する場合、観察される偏光値は自由トレーサ
ーの値に接近、すなわち低くなる。試験試料が低濃度の
リガンドを含有する場合は、偏光値は結合トレーサーの
値に接近、すなわち高くなる。免疫学的検定の反応混合
物を、垂直そして水平に偏光する光で連続的に励起し、
次いで発射光の垂直成分のみを分析することにより、反
応混合物中の蛍光の偏光を正確に測定することができ
る。測定されるリガンドの偏光と濃度の明確な関係は、
キャリブレータの偏光値を公知濃度のリガンドで測定す
ることによって確立される。試料中のリガンド濃度は、
この方法で作成した標準曲線から外挿することができ
る。

【００２６】本発明によって形成される特定の抗体およ
びトレーサーは、極めて良好な検定法をもたらすことが
わかった。

【００２７】本発明の記載に先立って、広範なバルビツ
レート特異性を持つ免疫学に基づく診断試験を開発する
問題(すなわち、式[１−１〜６]で示されるような一般
使用のバルビツレートに対し、免疫学的検定法で用いら
れ、かつリガンドおよびトレーサーに対し特異的な抗体
の特異性の欠如またはより均一なクロス反応性)は、１
つのバルビツレートに対してそれぞれ特異的な数種の抗
血清を患者の試料と混合することにより解決された。し
かし、この異なるバルビツレート特異性を持つ抗体の混
合によって、感度が低く、クロス反応性が乏しく、かつ
ロットからロットの抗血清ブレンドの変異性が大きいと
いう重大な欠点を持つ検定法をもたらす。

【００２８】本発明は上記問題を解決した。驚くべきこ
とに、広範なバルビツール特異性を持つ免疫学に基づく
診断試験の開発は、免疫競合環境において、たった１つ
のバルビツール構造に対し産生するモノクローン性また
は多クローン性抗体を、適当なトレーサー(蛍光−標識
バルビツレート誘導体)との組合せで使用した場合に可
能であることがわかった。最適な組合せは、免疫抗原と
５員環構造を含有するトレーサーであることがわかっ
た。本発明の検定法において、この広範なバルビツレー
ト特異性は、抗血清中に含有される抗体を産生するのに
用いるトレーサーおよび免疫抗原を以下の条件を満足す
るよう設計することによって達成される。すなわち、
(１)トレーサーおよび免疫抗原は共に、一般使用のバル
ビツレートに類する化学構造を有すること、および(２)
抗血清中に含有される抗体は、トレーサーに対し特異的
であるよりはむしろクロス反応性を示し、このためトレ
ーサーとの結合親和力が小さく、抗体とトレーサーの結
合の置換を可能ならしめること。試料中の各種バルビツ
レートは、同様に抗体からトレーサーを置換する能力を
有するため、一般使用の各種バルビツレートのためのよ
り等価な検出システムがもたらされる。広範なバルビツ
ール特異性を持つ免疫学に基づく診断試験をもたらす、
抗体とトレーサーのいずれの組合せも、全く予測しえる
ものではない。すなわち、他の組合せではなく上記組合
せを必然的に伴う一定の実験から得られる有利な結果
は、全く予想外のものである。

【００２９】従って、本発明の方法は以下の点で、当該
分野で記載の関連技術とは著しく相違する。すなわち、
免疫学検定法の免疫学試薬の多特異性は一般に該検定法
の２つの重要な免疫学試薬(トレーサーおよび抗体)を産
生するのに、２種のバルビツレート誘導体を使用するこ
とによって達成される点である。本発明は、広範なバル
ビツレートに対し同等に応答する並外れた能力を有す
る、より等価なバルビツレート検出システムを提供す
る。加えて、本発明は、数種の免疫学試薬の混合から生
じる上記免疫学反応性に関して、当該分野で記載の検定
法の不確実性を解消する。さらに、本発明の免疫学的検
定法の広い特異性は、現在市場に出ており、かつ生物学
的試料のバルビツレートを検定するキットに含まれる、
検定法の特異性より優れている。すなわち、本発明の免
疫学的検定法は、当該分野で記載の方法あるいは社会一
般に公開される他の方法と比べて、より急速でかつ正確
なバルビツレート検定法を付与するが、その理由は以下
の通りである。 (１)分析前に検体処理の必要がないこと、 (２)広スペクトルのバルビツレート特異性を有するこ
と、 (３)抗体特異性がバルビツレートに類する化合物以外の
実質的全ての化合物の検出を排除するため、試料中の１
種以上のバルビツレートの存在を正確に測定すること、 (４)一般使用のバルビツレート間のクロス反応性が乏し
いため、高濃度過大評価に基づき確認できないバルビツ
レート濃度を持つ試料の別途分析を阻止すること、およ
び (５)不均質な免疫学的検定操作と異なる均質な検定法で
あって、最終偏光表示数値を読む前に、結合トレーサー
を未結合トレーサーから分離する必要がないこと。

【００３０】このように、本発明の免疫学的検定法は特
に、以下の点で有利である。すなわち、当該分野で記載
の問題(低感度、乏しいクロス反応性、および抗血清ブ
レンドのロットからロットの広い変異性)を有すること
なく、身体流体中の広範なバルビツレート薬物を検出す
るのに使用しうる点である。かかる免疫学的検定法は、
スクリーニング検定の使用が望ましい。何故なら、バル
ビツレートスクリーニング検定において、使用する抗体
をバルビツレートに類するどの化合物にも同等に反応さ
せることが望しく、かつ当該検定法が法医学、臨床医学
および産業界において広い適用性を有するからである。

【００３１】試薬および試薬キット 本発明の免疫抗原およびトレーサーは共に、前記の一
般構造式で示すことができる。試料中のバルビツレート
の存在またはその量を測定する本発明の新規方法の目的
は、抗体の認知部位に対しバルビツレートとトレーサー
を競合させることである。この目的達成において、ヘプ
テンおよびトレーサーの構造における大きな変動が可能
となる。本発明の目的において、“ハプテン"は免疫抗
原の前駆体であって、一般に、免疫学的活性な担体に結
合するのに適当な基を持つ置換バルビツレート誘導体か
らなる。

【００３２】生物学的流体中のバルビツレートの存在ま
たはその量を測定する本発明の新規な試薬キットは、前
記式[２７](式中、Ｗ,Ｒ¹,Ｒ³、ＦlおよびＲ⁴は前記と
同意義)の第１トレーサーの塩、および前記式[２](式
中、Ｗ,Ｒ¹,Ｒ²,ＱおよびＲは前記と同意義)の構造を有
する免疫抗原に対して産生する単クローン性または多ク
ローン性抗体を包含する。一般に、抗体は一般使用のバ
ルビツレートに類する構造を持つ免疫抗原に対して産生
し、トレーサーは一般使用のバルビツレートに類する構
造を有するが、免疫抗原の構造に類しない構造を有す
る。好ましくは、試薬キットはリボフラビンによる蛍光
干渉を減少させるのに有効量のリボフラビン結合プロテ
インをも含有する。試薬キットでの使用に最も好ましい
トレーサーは、前記式[３０]のトレーサーであるが、試
薬キットでの使用に最も好ましい抗体は、前記式[２９]
の免疫抗原に産生する抗体である。試薬キットでの使用
に最も好ましいトレーサーと抗血清の組合せは、前記式
[３０]のトレーサーと前記式[２９]の免疫抗原に対して
産生する単クローン性または多クローン性抗体の組合せ
である。

【００３３】免疫抗原の構成 使用できる抗体は、多種のバルビツレート誘導体から
産生することができる。環上の５位に官能基を持つ化合
物から作られる免疫抗原は、動物の抗体を産生すること
ができ、かかる抗体は適当なトレーサーと組合せること
により、本発明に係るバルビツレート検定法で用いられ
る。

【００３４】本発明の免疫抗原は、前記式[２]の一般構
造式で示され、本発明の好ましい型において、免疫抗原
は前記式[２]の一般構造式からも誘導される。本発明の
最も好ましい免疫抗原は、前記式[２９]で示される。免
疫抗原は、下記合成法および実施例の記載から説明され
るように、前記式[２]の化合物をポリ(アミノ酸)もしく
はポリ(アミノ酸)誘導体または他の免疫抗原的に活性な
担体とカップリング反応させることによって製造するこ
とができる。

【００３５】本発明の免疫抗原の最も好ましい型におい
て、使用するポリ(アミノ酸)はチログロブリンである
が、アルブミン類、血清プロテイン、たとえばグロブリ
ン類、眼レンズ(ocular lens)プロテイン、リポプロテ
インなどを含む各種のプロテイン担体を使用しうること
を理解すべきである。プロテイン担体の具体例として
は、チログロブリン以外に、チロキシン結合グロブリ
ン、牛血清アルブミン、キーホールリンペット(keyhole
limpet)ヘモシアニン、卵オボアルブミン、牛ガンマグ
ロブリン等が挙げられる。別法として、アスパラテート
などの、十分な数の有効カルボキシレート基を有する合
成ポリ(アミノ酸)を使用することができ、同様に反応性
官能基を持つ他の合成または天然ポリマー物質も使用で
きる。

【００３６】本発明の免疫抗原のほとんどは、免疫抗原
的に活性な担体にハプテンを結合させる、−ＣＨ₂−、
−ＣＨ＝または しやすいＲを前記式[２]の化学式の変化しやすいＱへ直
接結合させる。当該分野で公開されていないこれらの免
疫抗原の１つの利点は、本発明の免疫抗原の免疫抗原的
活性担体成分へ、免疫抗原のハプテン成分を直接結合さ
せる非ペプチド結合が極めて安定であることである。す
なわち、本発明の免疫抗原は、たとえばヤマオカらの
「Ｊ．Ｉmmunological Ｍethods」(２８、５１、１９７
９年)に記載の免疫抗原より安定である。ヤマオカらが
記載するペプチド結合とは異なり、本発明の多くの新規
免疫抗原で採用する結合基は、生物学的環境における加
水分解に対する感受性が著しく少ない。たとえば、前記
式[２１]、[２２]および[２３]に官能基を持った新規ハ
プテンが示されており、かかるハプテンはヨードアセタ
ミドの基を含有し、かつ塩基性pＨにて、免疫抗原的活
性担体にカップリング反応することができ、これによっ
て非ペプチド結合が形成される。また前記式[２４]、
[２５]および[２６]のそれぞれに示されるハプテンは、
還元アミノ化法によって、免疫抗原的活性担体にカップ
リング反応することができ、この結果、非ペプチド結合
が形成される。

【００３７】本発明の好ましい免疫抗原は、前記式[２
８]の構造を有する。本発明の最も好ましい免疫抗原
は、前記式[２９]で示される。

【００３８】トレーサーの構成 本発明のトレーサーの構造の可能な変動は、ハプテンの
構造の可能な変動と比べてはるかに大きい。本発明のト
レーサーは、前記式[２７](式中、Ｗ,Ｒ¹,Ｒ³,Ｆlおよ
びＲ⁴は前記と同意義)の一般構造式で示される。本発明
の好ましい型において、トレーサーは前記式[５]〜[３
１]のいずれかの構造式で示される。本発明の最も好ま
しいトレーサーは、前記式[３０]で示される。

【００３９】トレーサーは、たとえば前記式[４−１〜
１２]で示されるアミノ、アミジノ、トリアジニルアミ
ノ、カルバミド、チオカルバミド、カルバモイル、チオ
カルバモイルまたはスルホニルカルバモイル基によっ
て、フルオレセイン誘導体に結合するバルビツレート誘
導体である。トレーサーは、下記合成法および実施例の
記載から説明されるように、アミノ基、カルボン酸基、
スルホン酸基、メルカプト基、ヒドロキシル基、イミデ
ート基、ヒドラジド基、イソシアネート基、チオイソシ
アネート基、クロロホルメート基、クロロチオホルメー
ト基、カルボン酸クロリド基、クロロスルホニルカルバ
モイル基などを含有するバルビツレート誘導体に、適当
なフルオレセイン誘導体を結合させることによって製造
される。

【００４０】具体例として、以下に示すフルオレセイン
誘導体のいずれかを使用することができる。 Ｆl−ＣＨ₂−ＮＨ₂,アミノメチルフルオレセイン Ｆl−ＮＨ₂,フルオレセインアミン Ｆl−ＣＯ₂Ｈ,カルボキシフルオレセイン Ｆl−ＮＨＣＯＣＨ₂Ｉ,α−ヨードアセタミドフルオレ
セイン Ｆl−ＮＨＣＯＣＨ₂Ｂr,α−ブロモアセタミドフルオレ
セイン 式:

【化４６】 の２,４−ジクロロ−１,３,５−トリアジン−２−イル
アミノフルオレセイン(ＤＴＡＦ)式：

【化４７】 の４−クロロ−６−メトキシ−１，３,５−トリアジン
−２−イルアミノフルオレセイン Ｆl−ＮＣＳ、フルオレセインチオイソシアネート

【００４１】本発明の新規トレーサーにおける、フルオ
レセイン成分とバルビツレート環部間の炭素−炭素二重
結合の存在は、抗体との最適相互作用となるようトレー
サーを有利に配向することが、予想外にもわかった。す
なわち、本発明のトレーサーは、トレーサーのフルオレ
セインとリガンド成分間にエチレン(−ＣＨ＝ＣＨ−)結
合基を有することにより、以下に示す２つの予期しえな
い有利な特性を具備する。 (１)安定性が大きいこと、および (２)トレーサーのフルオレセイン(またはフルオレセイ
ン誘導体)とリガンド成分間の相互作用が減少する結
果、抗体への結合力が増大すること。

【００４２】本発明のトレーサーが結合基の二重結合に
基づき、驚くべき安定性に高いという最初の特性は、下
記表１に示すデータによって証明される。表１

【表１】 表１(つづき）

【表２】

【００４３】上記表１のデータによれば、トレーサーの
フルオレセインとリガンド成分間にエチレン（−ＣＨ＝
ＣＨ−)結合基を有するトレーサー(表１つづき)は、か
かるエチレン結合基を欠くトレーサー(表１)と比べ、各
種の温度での安定性がかなり大きいことが認められる。
エチレン結合基を含有するトレーサーの安定性は、２〜
８℃および４５℃の両温度において、１日目と７日目と
でほぼ同等であるが、かかるエチレン結合基を欠くトレ
ーサーでは、２〜８℃の温度において７日目には安定性
が３０％減少し、しかも温度４５℃における７日目で
は、実質的に全ての結合能力を失う(偏光値の８０％以
上)。

【００４４】二重結合を欠く化合物は約１２時間の寿命
を有するため、合成後１２時間で不安定となるが、二重
結合を含有する化合物では、かなり長い期間にわたって
安定のままで存在する。下記表２(a)および２(b)に示す
データによれば、トレーサーのフルオレセインとリガン
ド成分間にエチレン(−ＣＨ＝ＣＨ−)結合基を有するト
レーサーは、各種の温度において、少なくとも１年およ
び１年半にわたって安定のままで存在しうることが認め
られる。なお、表２(a)に示すデータを作成するのに、
前記式[５]の化学構造を持つトレーサーを使用し、一
方、表２(b)に示すデータを作成するのに、前記式[３
０]の化学構造を持つトレーサーを使用した。これらの
データから、当該トレーサーは長期間にわたって安定で
あることが認められる。

【００４５】 表２(a) 期間 温度(℃) 偏光値 平均純強度 ０日 ２−８ ２０９．１７ ３４００−５０００ １日 ２−８ ２０６．６１ ３２９０−４７３３ ２日 ２−８ ２０７．０７ ３２００−４６７０ ３日 −２０ ２０７．３８ ３３９５−４９６５ ２−８ ２０８．０５ ３３６７−４８９５ ３７ ２０７．６０ ３４００−４９１０ ４５ ２０５．５１ ３４００−４９５０ １週間 −２０ ２０８．４６ ３３００−４８００ ２−８ ２０８．２５ ３４００−４９００ ３７ ２０２．７８ ３５００−５０００ ４５ ２００．１１ ３５５０−５２００ ２週間 −２０ ２０８．８５ ３１８０−４６３５ ２−８ ２１０．４１ ３１００−４５９０ ４週間 ２−８ ２１０．３５ ３３９５−４９８８ ２ケ月 ２−８ ２０７．２１ ３２８２−４７７７ ４ケ月 ２−８ ２０５．５９ ３２１０−４７７５ ８ケ月 ２−８ ２０６．８５ ３１５０−４６７７ １年 ２−８ ２０４．８５ ３１６１−４６１５ １８ケ月 ２−８ １９９．２９ ３３０４−４７９８ 表２(b) 期間 温度(℃) 偏光値 平均純強度 ０日 ２−８ １７７．２９ ２６８６ １日 ２−８ １７７．２３ ２７３２ ２日 ２−８ １７８．３２ ２６９８ ３日 −２０ １７８．４８ ２７０６ ２−８ １７６．４５ ２６６４ ４日 ３７ １７６．５３ ２６４９ ４５ １７６．５６ ２６９０ １週間 ２−８ １７８．６９ ２７０５ ３７ １８０．０２ ２７１０ ４５ １７５．９６ ２６８１ ２週間 ２−８ １７８．０１ ２６４２ ３７ １７９．８１ ２６５２ ４５ １７２．６９ ２７６０ ４週間 ２−８ １８４．１６ ２６６９ ２．５ケ月 ２−８ １７６．４７ ２６９２ ４ケ月 ２−８ １７５．５３ ２６６５ ６．５ケ月 ２−８ １７６．９０ ２７４１ ９ケ月 ２−８ １７４．３４ ２８１６

【００４６】二重結合を含有する化合物に関し、かかる
二重結合を欠く化合物と比較しての第２の重要な利点が
ある。二重結合を含有しない化合物の場合、該化合物の
フルオレセイン(またはフルオレセイン誘導体)とリガン
ド成分間にかなりの相互作用が起り、免疫学的検定法に
おいて抗体に対し結合するリガンド成分の能力が損うと
いう不都合な結果となる。これに対し、二重結合を含有
する化合物は結果的に厳正な立体化学を具備する。すな
わち、フルオレセイン(またはフルオレセイン誘導体)と
リガンド成分間に相互作用はほとんどなく、免疫学的検
定法においてリガンド成分は抗体に対し自由に結合する
状態となる。

【００４７】抗体 本発明の抗体は、上記免疫抗原に対する羊の応答を喚起
することによって製造される。当業者にとって周知の方
法で、動物またはインビトロ培養の免疫反応能細胞に免
疫抗原を一連の接種で投与する。理解すべき点は、本明
細書で詳述する実験において、バルビツレート免疫抗原
に対し羊が好ましい免疫性宿主であるが、上述の化学構
造に抗体を産生しうるインビボまたはインビトロ宿主も
使用できることである。本発明の最も好ましい抗体は、
前記式[２９]の免疫抗原に対し産生する抗体である。

【００４８】免疫抗原の合成 本発明の免疫抗原は、前記式[２](Ｘがクロロホルメー
ト、アルデヒド、カルボキシル、アミノ、塩素、臭素、
ヨウ素またはヒドロキシのとき)の一般構造式で示され
るようなハプテンを、ポリ(アミノ酸)または他の免疫抗
原的活性担体にカップリング反応させることによって作
られる。ポリ(アミノ酸)または他の担体成分はハプテン
に対し、カルバメート、アミド、チオエーテル、エーテ
ル、ジアゾまたはアミノ結合基によって結合させること
ができる。最も好ましい具体例において、ポリ(アミノ
酸)はチログロブリンで、免疫抗原は前記式[２９]の構
造を有する。

【００４９】免疫抗原は、アルデヒド、カルボキシル、
アミノ、塩素、臭素、ヨウ素、ヒドロキシドまたはヨー
ドアセトニル基を含有するハプテンを、ポリ(アミノ酸)
または他の免疫学的活性担体にカップリング反応させる
ことによって製造される。アルデヒドは、ポリ(アミノ
酸)または他の免疫学的活性担体のアミノ基と共にシッ
フ(Ｓchiff)塩基を形成することにより、カップリング
反応を行うことができる。シッフ塩基を直ぐにシアノホ
ウ水素化ナトリウムで還元して、安定なアミノメチル結
合基を形成する。ポリ(アミノ酸)のカルボキシル基の活
性化は、ハプテンおよびポリ(アミノ酸)を、１−エチル
−３−(３−ジメチルアミノ−プロピル)カルボ−ジイミ
ド(ＥＤＣ)、Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド
(ＤＤＣ)、１−シクロヘキシル−３−(２−モルホリノ
エチル)カルボジイミド、メチル−p−トルエンスルホネ
ートなどと混合することにより行うことができる。ヒド
ラジドの場合は、非芳香族アミノの場合と同様な方法で
カップリング反応を行う。アルキル、クロロ、ブロモお
よびヨード誘導体とスルホネートエステルは、強アルカ
リ性条件下でチロシン残基のフェノール性ヒドロキシル
基をアルキル化して、アルキルアリールエーテルを形成
し、またシステインの遊離スルフヒドリル基の硫黄をア
ルキル化してチオエーテルを形成する。これらの反応に
おいて、好ましい誘導体はヨードアセトニル類およびヨ
ージド類である。

【００５０】上記ハプテン(免疫抗原前駆体)の合成は、
２つの一般法の一方で行う。前記式[２]に、本発明方法
の好ましい具体例に係る免疫抗原前駆体が示されてい
る。この製法は、適当な置換マロネートまたはシアノア
セテートエステルを、保護されたアルコール官能基を有
するブロモアルキルアルコール、好ましくはテトラヒド
ロピラニルアルコールでアルキル化することにより進行
する。かかる中間体を尿素で環化するには、上記反応体
の溶液混合物を、マグネシウムメトキシド、マグネシウ
ムエトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエト
キシド、またはカリウムt−ブトキシドなどの塩基で処
理することによって行うことができる。保護された官能
基を暴露し、化合物をポリ(アミノ酸)または他の担体に
カップリング反応させる。

【００５１】免疫抗原の５−ヨードアセトニルバルビツ
レート前駆体は、末端二重結合を持つ５−アルケン基を
有する、適当な５,５−ジ置換バルビツレート(前記式
[２])を、ヨージド／水と反応させることによって製造
される。この方法で、３−ヒドロキシ−ヨードバルビツ
レートを製造する。対応するα−ヨードアセトニルバル
ビツレートは、これらの化合物をクロム系酸化剤(たと
えばジョーンズ試薬など)で酸化することによって得ら
れる。

【００５２】末端二重結合を有する適当な５−アルケニ
ルバルビツレート(前記式[２])をメタノール中、−７８
℃にてオゾン分解することにより、アルデヒドを製造す
ることができる。アルデヒド(前記式[２])を得る他の好
ましい方法は、適当な置換マロネートエステルまたはシ
アノアセテートエステルを、好ましくはアセタルとして
の、保護されたアルデヒド官能基を有するブロモアルキ
ルアルデヒド反応させることによる。かかる中間体を尿
素で環化するには、上記反応体の溶液混合物を、ナトリ
ウムエトキシド、ナトリウムメトキシド、カリウムメト
キシド、またはカリウムt−ブトキシドなどの塩基で処
理することによって行うことができる。保護された官能
基を暴露し、化合物をポリ(アミノ酸)または他の担体に
カップリング反応させる。

【００５３】適当なアルデヒドをクロム系酸化剤(たと
えばジョーンズ試薬など)で酸化することにより、カル
ボン酸を得る。カルボキシアルキルバルビツレートまた
はカルボキシアルケンバルビツレートの好ましい合成法
は、適当な５−置換バルビツレート(前記式[２])をトリ
エチルアミン、水素化ナトリウム、カリウムt−ブトキ
シドなどの塩基の存在下、ハロゲンアルキルエステルま
たはハロゲンアルケニルエステルと反応させた後、適当
なバルビツレートエステルを濃塩酸、４０％硫酸などの
鉱酸で加水分解することによる。

【００５４】アルキルハライドは、アルコールを塩化水
素、臭化水素またはヨウ化水素で処理するか、あるいは
塩化チオニルなどのハロゲン化試薬で処理することによ
り製造することができる。これらのハライドは、比較的
中性条件下で直接、遊離スルフヒドリル基または担体
に、または強塩基性条件下でポリ(アミノ酸)のチロシル
残基などにおけるようなフェノール類にカップリングす
る。

【００５５】トレーサーの合成 本発明の２つの好ましいトレーサーの構造は、前記式
[５]および[３１]に示される。本発明の最も好ましいト
レーサーの構造は、前記式[３０]に示される。

【００５６】本発明のトレーサーは、フルオレセイン成
分またはフルオレセイン誘導体を、前記式[２７](式
中、Ｗ,Ｒ¹,Ｒ³,ＦlおよびＲ⁴は前記と同意義)の一般構
造にカップリング反応させることによって作られる。

【００５７】フルオレセイン成分は、前記式[４−１〜
１２]で示されるアミド、アミン、尿素、チオ尿素、カ
ルバメート、チオカルバメート、トリアジニルアミノま
たはスルホニルカルバメート結合基によって、アミノ、
カルボキシル、アルデヒド、酸クロリド、イミデートま
たはアルコキシ官能基に結合させることができる。好ま
しい具体例において、フルオレセイン誘導体はアミノメ
チルフルオレセインであって、これを前記式[２７](式
中、Ｒ¹は(メチル)ブチルまたは１−メチルプロピルお
よびＲ³は−ＣＨ₂、−ＣＯＯＨまたは−ＣＨ₂−ＣＨ＝
ＣＨ−ＣＯ₂Ｈである)で示される前駆体にカップリング
反応させる。最初に、バルビツレートのカルボン酸を用
いて混合無水物を形成することにより、適当なカルボキ
シアルケニルバルビツレートをアミノエチルフルオレセ
インにカップリング反応させる。混合無水物はイソブチ
ルクロロホルメートを用いて製造される。好ましい方法
では、ジメトキシエタンを用いる。

【００５８】他の活性化基、たとえば酸クロリド、１−
ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミド、p−ニトロフェノール、および２−エチル−
５−フェニルイソキサゾリウム−３'−スルホネートを
使用でき、また他の溶剤、たとえばテトラヒドロフラ
ン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキ
シド、およびヘキサメチレンホスホルアミドを使用でき
る。反応体はアミド結合を形成する条件下でカップリン
グ反応させることが好ましく、また混合無水物法を用い
ることが最も好ましい。使用できるトレーサーは、各種
のバルビツレートから製造することができる。

【００５９】アミノ、ヒドラジニル、ヒドラジドなどの
末端アミノ基を有する全てのバルビツレートを、活性エ
ステル法または混合無水物法によりカルボキシフルオレ
セインにカップリング反応させ、また単に両物質を溶液
状態で混合することによって、フルオレセインイソチオ
シアネート、ＤＴＡＦ、またはアルコキシＤＴＡＦにカ
ップリング反応させる。アミノ基は、ホスゲンまたはチ
オホスゲンと反応させることにより、それぞれイソシア
ネート基またはチオイソシアネート基に変換することが
できる。次いでこれらをアミノメチルフルオレセインと
縮合して、トレーサーを製造する。

【００６０】末端アルデヒド基を有する全てのバルビツ
レートを、ホウ水素化ナトリウムによる還元アミノ化で
アミノメチルフルオレセインにカップリング反応させ
る。

【００６１】末端ヒドロキシル基を有する全てのバルビ
ツレートを、ホスゲンと反応させた後、溶液状態のアミ
ノメチルフルオレセイン、ＤＴＡＦ、α−ヨードアセタ
ミドフルオレセイン、α−ブロモアセタミドフルオレセ
イン、またはフルオレセインイソチオシアネートと反応
させることにより、フルオレセインにカップリング反応
させることができる。５−ヨードアセトニル基を有する
全てのバルビツレートをアミノメチルフルオレセインに
カップリング反応させて、トレーサーを製造する。

【００６２】注目すべき点は、本発明の観点の中に、フ
ルオレセイン成分とバルビツレート環間の炭素−炭素二
重結合の存在が、抗体との最適相互作用が得られるよう
にトレーサーを配向させるといった知見が含まれること
である。

【００６３】検定法 本発明の個々のトレーサーおよび抗体は、バルビツレー
トの蛍光偏光検定法において驚くべき良好な結果をもた
らすことがわかった。

【００６４】前記式[１−１〜６]に、本発明に従って定
量的または定性的に測定されるバルビツレートの幾つか
の一般構造が示されている。

【００６５】本発明の検定法は、分析前にいかなる検体
処理も必要とせず、かつ該検定法によって広範なスペク
トルバルビツレート特異性が示されることから、従来法
のほとんどと比べて、より急速かつ正確なバルビツレー
ト検定法を付与する。かかる検定システムは試料中のバ
ルビツレートの存在を正確に測定するが、それは抗体特
異性がバルビツレート類似化合物以外のほとんどの化合
物の検出を阻止するからである。

【００６６】本発明の生物学的流体中のバルビツレート
の存在またはその量を測定する新規な方法は、 (Ａ)試料を、前記式[２](式中、Ｗ,Ｒ¹,Ｒ²,ＱおよびＲ
は前記と同意義)の構造を有する免疫抗原に対して産生
する単クローン性または多クローン性抗体を含有するバ
ルビツレート抗血清と、および前記式[２７](式中、Ｗ,
Ｒ¹,Ｒ³,ＦlおよびＲ⁴は前記と同意義)の構造を有し、
バルビツレート抗血清の存在に対し検出しうる蛍光偏光
応答をもたらすことができるトレーサー化合物と接触せ
しめる工程、 (Ｂ)工程(Ａ)から得られる溶液に平面偏光を通して、蛍
光偏光応答を得る工程、次いで (Ｃ)工程(Ｂ)の溶液の蛍光偏光応答を、試料中のバルビ
ツレートの存在またはその量の測度として検出する工程
からなる。

【００６７】この方法の最も好ましい型では、前記式
[２９]の構造を有する免疫抗原に対して製せられる単ク
ローン性または多クローン性抗体を、前記式[３０]の構
造を有するトレーサーと共に使用する。しかしながら、
これらの抗体と共に使用する他の好ましいトレーサー
は、前記式[３１]の構造を有するトレーサーである。

【００６８】本発明の分析法、すなわち、本発明のトレ
ーサー化合物および免疫抗原を用いる蛍光免疫学的検定
法によってバルビツレートを測定する方法によれば、バ
ルビツレートを含有するまたはバルビツレートを含有し
ているのではないかと思われる試料を、トレーサーの生
理学的に許容しうる塩およびバルビツレートに対し特異
的な抗体と混合する。抗体は上述の免疫抗原を用いて製
造される。バルビツレートとトレーサーは限られた抗体
結合部位で競合する結果、錯体が形成する。トレーサー
および抗体の濃度を一定に維持することにより、バルビ
ツレート−抗体錯体と形成されるトレーサー−抗体錯体
の比率は、試料中のバルビツレートの量に正比例する。
従って、混合物を平面偏光で励起し、次いでトレーサー
およびトレーサー−抗体錯体によって発せられる蛍光の
偏光値を測定すると、試料中のバルビツレートの存在を
測定することができる。

【００６９】結果は、純ミリ偏光単位およびスパン(ミ
リ偏光単位において)の観点から定量化することができ
る。純ミリ偏光単位の測定は、バルビツレートの非存在
下、最大量のトレーサーが抗体に結合したとき、最大偏
光を表示する。純ミリ偏光単位が高くなればなるほど、
抗体に対するトレーサーの結合がよくなる。スパンは、
トレーサーがバルビツレートの非存在下で抗体に対し最
大に結合したときの純ミリ偏光と、トレーサーが明示濃
度のバルビツレートの存在下で抗体に対し結合したとき
の純ミリ偏光との較差である。最大スパンは、当該検定
法が検出しうるリガンド濃度の範囲を規定する。大きな
スパンは、データの良好な数的分析をもたらす。好まし
い抗体−トレーサー組合せは、少なくとも８０ミリ偏光
単位のスパンを有する。小さなスパンは、各環境に応じ
て許容することができる。

【００７０】本発明方法を実施するときのpＨは、トレ
ーサーのフルオレセイン成分を開環型で存在せしめうる
のに十分なpＨでなければならない。pＨは通常約３〜１
２、より一般的には約５〜１０、最も好ましくは約６〜
９の範囲であってよい。種々の緩衝剤を用いることによ
り、検定操作中のpＨを維持することができる。代表的
な緩衝剤としては、ボレート、ホスフェート、カーボネ
ート、トリス(tris)、バルビタールなどが挙げられる。
本発明にとって、特定緩衝剤の使用に限定されるもので
ないが、トリスおよびホスフェート緩衝剤が好ましい。
緩衝剤のカチオン部は一般に、溶液状態のトリス塩のカ
チオン部を決定する。

【００７１】試料中に存在するリボフラビンに結合し
て、リボフラビン結合プロテイン(ＲＢＰ)−リボフラビ
ン錯体とするため、試料または１種以上の検定試薬へＲ
ＢＰを加えて、リボフラビンによる潜在的な蛍光干渉を
削除してもよい。ＲＢＰはＭ．Ｗ．(分子量)約３２００
０のプロテインで、通常卵白から単離される。卵白から
単離すると、ＲＢＰの各分子は１分子のリボフラビンを
含有する。このホロプロテイン型のＲＢＰは、酸性条件
下の透析でアポプロテイン型に変換して、結合リボフラ
ビンを除去しなければならない。本発明で用いるＲＢＰ
アポプロテインは、ミズーリ州セントルイス市のシグマ
・ケミカル・カンパニーから商業上入手可能である。使
用量に制限はないが、試料中の実質的に全ての遊離リボ
フラビンを結合させるのに十分な量を条件とする。

【００７２】以下、本発明の好ましい改良した検定法に
ついて、詳しく説明する。この検定法は“均質検定法"
であって、結合トレーサーと未結合トレーサーを分離し
ていない溶液から最終偏光値を読み取ることを意味す
る。このことは、数値の読み取り可能前に未結合トレー
サーから結合トレーサーを分離しなければならないよう
な、不均質免疫学的検定法にない優れた別異の利点であ
る。

【００７３】本発明の蛍光偏光検定法に用いる試薬は、
バルビツレート用抗体とバルビツレートトレーサーから
成る。付加的に、予備処理溶液、希釈緩衝剤、バルビツ
レートキャリブレータおよびバルビツレート対照を含む
極めて通常の溶液の調製が望まれる。これらの試薬の代
表的溶液の幾つかは以下に記載され、かつイリノイ州ア
ボット・パークのアボット・ラボラトリーズから検定用
“キット(kits)"で商業上入手することができる。

【００７４】本発明の最も好ましい検定法の場合、本明
細書で示す全ての百分率は、他に特別明示しない限り重
量／容量である。現時点で好ましいトレーサー配合は、
pＨ６．２の０．１モルホスフェート緩衝剤、５％５−
スルホサリチル酸ナトリウム、０．１％ナトリウムアジ
ド、および０．０１％牛ガンマグロブリンの１５０ナノ
モルトレーサーである。抗血清配合は、pＨ７．５の
０．１モルトリス緩衝剤、０．１％ナトリウムアジド、
０．１％牛ガンマグロブリンおよび２％エチレングリコ
ール(v／v)で希釈した羊血清から成る。希釈緩衝剤は、
pＨ７．５の０．１モルリン酸ナトリウム、０．１％ナ
トリウムアジドおよび０．０１％牛ガンマグロブリンか
ら成る。予備処理溶液は、０．０１％牛ガンマグロブリ
ン、pＨ７．５の０．１モルトリス緩衝剤、０．１％ナ
トリウムアジドおよび１０mg／mlリボフラビン結合プロ
テインから成る。バルビツレートカリブレータは、濃度
０．０、２００、４００、７００、１２００、および２
０００ナノグラム／mlの正常なヒトの尿中のセコバルビ
タールから成り、保存剤として０．１％ナトリウムアジ
ドが有用である。正常なヒトの尿中のセコバルビタール
から成るバルビツレート対照は、濃度３００、８００お
よび１５００ナノグラム／mlで供給され、保存剤として
０．１％ナトリウムアジドもまた有用である。

【００７５】好ましい操作は特に、イリノイ州アボット
・パークのアボット・ラボラトリーズから共に入手しう
る、アボット・ＴＤx(登録商標)クリニカル・アナライ
ザー(Ｃlinical Ａnalyzer、臨床分析器)やアボットＡ
Ｄx(登録商標)ドラッグス・オブ・アブュース・システ
ム(Ｄrugs of Ａbuse Ｓystem、乱用系の薬物)と共
に使用するようになっている。最小５０μlの尿が必要
である。ＴＤxまたはＡＤx試料カートリッジの試料容器
の中へ直接、キャリブレータ、対照または未知試料をピ
ペットで計量して入れる。この操作の利点の１つは、試
料に特別な調製を要しないことである。この点から、本
発明の検定操作は十分な自動制御方式である。

【００７６】手動で検定が行われている場合、試料を希
釈緩衝剤中予備処理溶液と混合し、バックグラウンド値
を読む。次いでトレーサーおよび抗体で試験溶液に混入
する。培養後、蛍光偏光値を読む。

【００７７】各カリブレータ、対照または試料の純蛍光
偏光値を測定し、アボットＴＤxアナライザーなどの計
器の出力テープにプリントする。非直線回帰分析を用
い、各キャリブレータ対その濃度の偏光値をプロットす
ることにより、標準曲線を予め計器に生成しておく。記
憶したキャリブレーション曲線から各対照または試料の
濃度を読み、出力テープにプリントする。

【００７８】上記好ましい操作に関し、注目すべき点
は、トレーサー、抗体、予備処理溶液、キャリブレータ
および対照を約２〜８℃に貯蔵し、一方、希釈緩衝剤を
周囲温度で貯蔵すべきである。標準曲線および対照は２
週間毎に処理し、各キャリブレータおよび対照は二回重
複で処理すべきである。全ての試料を二回重複で処理す
ることができる。

【００７９】なお、理解すべき点は、上記本発明の詳細
な説明および以下に挙げる実施例はあくまで例示であっ
て、本発明の技術的範囲を限定するものではない。各種
の改変は当業者にとって自明であり、従って、本発明の
技術的範囲は特許請求の範囲およびその法的均等範囲の
みによって制限されるものである。

【００８０】

【実施例】実施例１〜３は、本発明に従って行った実験
を示す。実施例１〜３および２５は抗体の産生に用いる
免疫抗原の製造に関し、実施例４〜８は免疫抗原および
トレーサーの前駆体の合成に関し、および実施例９〜２
４および２６はトレーサーの製造に関する。なお、実施
例２４には本発明の最も好ましいトレーサーの製造が、
また実施例２５には本発明の最も好ましい免疫抗原の製
造が記載されている。

【００８１】実施例１ ５−(１−メチルブチル)−５−(β−ヒドロキシ−v−ヨ
ードプロピル)バルビツール酸:５g(０．０２２モル)の
５−(１−メチルブチル)−５−(アリル)バルビツール酸
を１８０mlの水中にて、還流コンデンサー下で７５〜８
５℃に加熱し、反応混合物に６gのヨージドを２時間に
わたって少量づつ加える。反応混合物を７時間攪拌加熱
する。反応混合物を冷却して沈澱せしめる。結晶をブフ
ナー漏斗で濾別し、水洗する。生成物をエタノール(５
０ml)より晶出させて、５.５７gの所望物質を得る。

【００８２】５−(１−メチルブチル)−５−ヨードアセ
トニルバルビツール酸:１gの５−(１−メチルブチル)−
５−(β−ヒドロキシ−v−ヨードプロピル)バルビツー
ル酸を７５mlのアセトンに溶解する。１０％硫酸中の重
クロム酸カリウムの０．３３モル溶液３０mlを加える。
反応混合物を室温で２時間攪拌し、次いで２００mlの酢
酸エチルで抽出し、塩水、水で洗い、有機層を硫酸マグ
ネシウム上で乾燥する。酢酸エチルを減圧除去し、粗固
体物質を７０％エタノールより晶出させる。無色結晶の
所望生成物の収量５１９mg。

【００８３】５−(１−メチル)ヨードアセトニルバルビ
ツール酸と牛血清アルブミン(ＢＳＡ)のカップリング反
応:２２６mgのＢＳＡを４７mlのホスフェート(０．１Ｍ
緩衝剤、pＨ８)および５２０μlのＮ,Ｎ'−ジメチルホ
ルムアミド(ＤＭＦ)に溶解する。この溶液に、５３０ml
のＤＭＦ中の１５２mgの５−(１−メチルブチル)−５−
ヨードアセトニルバルビツール酸を加える。反応混合物
を室温で３６時間攪拌する。得られる溶液を水に対して
徹底的に透析し、凍結乾燥して２０８mgの所望複合物(c
onjugate)を得る。

【００８４】実施例２ １−ブロモメチルテトラヒドロピラニルエーテル:氷浴
で冷却した２−ブロモエタノール(１２５g、１．０当
量)に、p−トルエンスルホン酸(触媒量)を加える。アル
ゴン雰囲気下攪拌しながら、ジヒドロピラン(９３g、
１．１当量)を滴下する。滴下終了時、反応液を室温で
１時間攪拌する。残渣を短路蒸留で精製して、約１２５
gの生成物を得る。

【００８５】フェニル−テトラヒドロピラニルオキシエ
チルジエチルマロネート:ＤＭＦ中のジエチルフェニル
マロネート(７６ml、１．０当量)に、ＮaＨ(１３．１
g、１．０当量、６４．１４％鉱油分散体)を加える。反
応液を５０℃で０．５時間攪拌し、次いで１−ブロモ−
２−テトラヒドロピラニルエタノール(８０ml、１．５
当量)を加え、反応液を６０℃で１８時間攪拌する。反
応混合物を中和し、溶媒を減圧除去する。残渣を短路蒸
留で精製し、約４６gの生成物を得る。

【００８６】ＴＨＰ−ヒドロキシエチルフェノバルビタ
ール:マグネシウム削りくず(３．７g、１．２当量)をア
ルゴン雰囲気下、乾燥メタノールに溶解する。ＴＨＰ−
マロネート(４６g、１．０当量)および尿素(９．９g、
１．３当量)をいっしょに乾燥メタノールに溶解し、次
いでこれを上述のマグネシウム溶液に加える。４８時還
流後、さらに尿素(９．９g、１．３当量)とマグネシウ
ムメトキシド(Ｍg３．７g、１．２当量)を加える。さら
に２４時間還流後、溶媒を除去し、残渣を５％ＨＣl水
溶液に溶かし、次いでエーテルで抽出する。エーテル層
から生成物を取出し、エーテル／ヘキサンより晶出させ
て、約１３gの物質を得る。

【００８７】５−フェニル−５−ヒドロキシエチルバル
ビツール酸:ＴＨＰ−ヒドロキシエチルフェノバルビタ
ール(１９g)を酢酸／水(５０:５０)に加熱下で溶解す
る。溶液を還流し、脱保護をＴＬＣ(シリカゲル、メタ
ノール／塩化メチレン＝１０:９０)で監視する。反応の
終了時、溶媒を減圧除去し、残渣をエタノール／水より
晶出させる。白色粉末の生成物の収量８．７g。

【００８８】５−フェニル−５−ヒドロキシエチルバル
ビツール酸とＢＳＡの複合(接合)ヒドロキシエチルフェ
ニルバルビタール(５００mg)を乾燥した新蒸留ＴＨＦ
(１０ml)に懸濁する。溶液に攪拌下ホスゲンを１５分間
吹込んだ後、溶液にアルゴンを吹込み、過剰のホスゲン
を除去する。１５分後、ＴＨＦを減圧除去し、残渣をエ
チルエーテルと共にトリチュレートする。乾燥後、白色
粉末の生成物の収量約５２０mg。

【００８９】０．１Ｎ(pＨ８)のホスフェート緩衝剤(７
ml)中のＢＳＡ(５００mg、１．０当量)の溶液に先ずＤ
ＭＦ(３ml)を加え、次いで得られる溶液に、予めＴＨＦ
(１ml)に溶解したヒドロキシエチルフェノバルビタール
のクロロホルメート(５０mg)を加える。クロロホルメー
トは激しく攪拌しながら加え、反応液をさらに３時間攪
拌する。

【００９０】溶液を、蒸留水で溶離するＰＩＤカラムに
て精製する。２つのピークを集め、最初のは１００mgの
生成物、２つ目は４００mgの生成物を含有する。紫外線
で調べると、両試料ともプロテインとフェノバルビター
ルを含有することがわかった。

【００９１】実施例３ ジエチル−２−(１−メチルブチル)マロネート:ナト
リウム金属(５．２４g、０．２３g原子)を２５mlの無水
エタノールと反応させる。この溶液に攪拌下、ジエチル
マロネート(３６．０ml、０．２４モル)を滴下する。溶
液を加熱還流し、２−ブロモペンタン(２９．０ml、
０．２３モル)を滴下する。一夜還流後、反応液を冷却
し、エタノールを回転エバポレータにて除去する。生成
物を水洗し、ＭgＳＯ₄で乾燥し、分留して３５．７gの
所望生成物を得る。

【００９２】ジエチル−２−（１−メチルブチル)−２
−(５−ペンテニル)−マロネートカリウム金属(１．７
１g、０．０４g原子)を３０mlの無水t−ブチルアルコー
ルと反応させる。次いで反応液を７５℃に加熱し、ジエ
チル−２−(１−メチルブチル)−マロネート(１０．０
３g、０．０４モル)を滴下する。４時間還流後、攪拌し
ながら１−ブロモ−５−ペンテン(６．４g、０．０４モ
ル)を滴下する。反応液を一夜還流し、次いで水に注
ぎ、エーテルで抽出する。エーテル抽出物をＭgＳＯ₄で
乾燥し、エーテルを回転エバポレータにて蒸発させて、
所望物質を得る。

【００９３】５−(１−メチルブチル)−５−(ペンテニ
ル)−バルビツール酸:ナトリウム金属(０．９８g、０．
０４g原子)をメタノール(１５ml)と反応させた後、尿素
(５．１４g、０．０９モル)を加える。次いでジエチル
２−(１−メチルブチル)−２−(５−ペンテニル)−マロ
ネート(６．０８g。０．０２モル)を加える。２日間還
流後、メタノールを留去する。残渣を１Ｎ水酸化ナトリ
ウム溶液に溶解し、エーテルで抽出し、次いで塩酸で酸
性化して、白色沈澱のバルビツール酸化合物を得る。

【００９４】５−(４−ブタナール)−５−(１−メチル
ブチル)−バルビツール酸:上記バルビツレートのメタノ
ール溶液に−７８℃でオゾンを通す。溶液がブルーとな
った後、窒素を吹込んで過剰のオゾンを除去する。次い
でジメチルスルフィドを加え、溶液を室温で一夜攪拌す
る。溶媒を減圧除去して、０．６２gの所望アルデヒド
を得る。

【００９５】上記アルデヒドとＢＳＡの複合:２５mlの
水、５mlのジメチルホルムアミドおよび５mlのエタノー
ルの溶液に、１８８mgのＢＳＡを加える。溶液のpＨを
６．２に調整し、上記アルデヒド(１８．６mg、０．０
７ミリモル)を加える。１時間攪拌後、シアノホウ水素
化ナトリウム(４７２mg、７．５ミリモル)を加え、反応
液を一夜攪拌する。次いで物質を、pＨ９の水に対して
透析し、そしてpＨ７の水に対して透析する。物質を凍
結乾燥して、１１３mgのバルビツール酸−ＢＳＡ複合物
を得る。

【００９６】実施例４ ５−(１−メチルブチル)−５−ホルミルメチルバルビ
ツール酸:ナトリウム・セコバルビタール(５．３０g、
２２．２ミリモル)のメタノール溶液に、溶液がブルー
色に変わるまで、オゾン流を通す。反応液に窒素を通し
て過剰のオゾンを除去した後、ジメチルスルフィド(１
４ml)を加える。反応液を室温で一夜攪拌した後、溶媒
を回転エバポレータにて除去する。次いでアルデヒドを
シリカプレッププレート(prep prate)にて、酢酸エチ
ル／ヘキサン(１:１)を用いて精製する。

【００９７】実施例５ ジメチル−２−(３−メチルシクロヘキシル)−マロネー
ト:ナトリウム金属(７．０２g、０．３０g原子)を無水
メタノール(２５０ml)と反応させる。次いでこれにジメ
チルマロネート(７０ml)を滴下し、その間反応温度を５
０℃に維持する。次いでこの溶液に、３−メチルシクロ
ヘキシルブロミド(５４．０g、０．３０モル)を滴下
し、反応液を一夜還流する。メタノールを回転エバポレ
ータにて除去し、残った物質をエーテルと水間に分配す
る。エーテル層を分離し、ＭgＳＯ₄で乾燥し、蒸発して
黄色油状物を得る。この物質を９５〜１０６℃および
１．２mmＨg圧の蒸留に付し、透明油状物を得る。

【００９８】ジメチル２−(５−ヘキセニル)−２−(３
−メチルシクロヘキシル)−マロネート:無水Ｎ,Ｎ−ジ
メチルホルムアミド(５０ml)中の水素化ナトリウム
(２．５３g、０．０６モル)のスラリーに、ジメチル２
−(３−メチルシクロヘキシル)−マロネート(１４．４
６g、０．０６モル)を滴下する。滴下終了後、もはや水
素が発生しなくなるまで、反応液を攪拌する。次いで反
応液に、１−ブロモ−６−ヘキセン(１０．３３g、、
０．０６モル)を滴下した後、攪拌する。反応の進行に
伴って、シリカプレートにて酢酸エチル／ヘキサン(４
０:６０)を用いる分析クロマトグラフィーに付す。反応
の終了後、水(２０ml)を加え、溶媒のほとんどを高減圧
下で除去する。残った物質を水とエーテル間に分配し、
エーテル層を２回水洗する。エーテル溶媒をＭgＳＯ₄で
乾燥し、蒸発して粘稠黄色油状物を得る。次いで生成物
を１２７〜１３４℃および０．４４mmＨg圧にて蒸留
し、透明油状物を得る。

【００９９】５−(３−メチルシクロヘキシル)−５−
(５−ヘキセニル)バルビツール酸:ナトリウム金属(１．
２４g、０．０５g原子)を無水エタノール(７５ml)と反
応させる。反応の終了後、尿素(５．１６g、０．０８モ
ル)を加え、次いで上記マロネート(６．６７g、０．０
２モル)を加える。６０時間還流後、エタノールを蒸発
し、物質を水(pＨ４)と酢酸エチル間に分配する。酢酸
エチル層をＭgＳＯ₄で乾燥し、蒸発して白色ゴム状物質
を得る。次いでこの物質をシリカプレッププレートに
て、酢酸エチル／ヘキサン(４０／６０)で精製して、純
粋なバルビツール酸化合物を得る。

【０１００】５−(３−メチルシクロヘキシル)−５−ホ
ルミルブチルバルビツール酸:メタノール(２０ml)に溶
解した上記バルビツール酸化合物(４０mg、０．１３ミ
リモル)の溶液に、溶液がブルーになるまでオゾンを通
す。溶液に窒素を通して過剰オゾンを除去し、ジメチル
スルフィド(２ml)を加える。一夜攪拌後、溶媒を除去し
て、所望アルデヒドを白色ゴム状物質で得る。

【０１０１】実施例６ sec−ブチルジメチルマロネート:ナトリウム金属
(６．９g)を１２０mlの無水メタノールと反応させる。
この溶液に３９．６g(０．３モル)のジメチルマロネー
トを加える。反応混合物を還流し、２−ブロモブタン
(４１．１g。０．３モル)を加える。１６時間還流後、
反応混合物を冷却し、メタノールを減圧除去する。生成
物をエチルエーテルで抽出し、次いで水および半飽和塩
水で洗う。有機物を硫酸マグネシウム上で乾燥する。減
圧蒸発でエチルエーテルを除去後、粗油状物を分留し
て、２４gの所望生成物を得る(b．p．９５−１０５℃／
１５mmＨg)。

【０１０２】５−sec−ブチルバルビツール酸:１１０ml
の無水エタノールを７．７２gのナトリウム金属と反応
させる。次いで１７．６g(０．１モル)のジメチルsec−
ブチルマロネートを加えた後(約５分後)、尿素(６．７
２g)を加える。反応混合物を１５時間還流し、６０mlの
エタノールを留去する。残渣に２００mlの水を加えた
後、２０mlの濃硫酸を加える。沈殿した結晶を濾別す
る。次いで生成物を水より再結晶して、８gの無色結晶
を得る。

【０１０３】５−sec−ブチル−５−(カルベトキシ−１
−プロピレン)バルビツール酸:二ッ首１００mlフラスコ
に、２６５mg(６．６２５ミリモル)の水素化ナトリウム
(６０％油状分散体)を入れる。水素化ナトリウムをヘキ
サンで洗い、次いで５mlのＴＨＦ中の１２１９mgの５−
sec−ブチルバルビツール酸を加えた後、５０mlのジメ
チルホルムアミドを加える。反応混合物を室温で１．５
時間攪拌し、９１２μlのエチルブロモクロトネートを
加えた後、９００mgの無水ヨウ化ナトリウムを加える。
反応混合物を４８時間還流し、次いで回転蒸発で乾燥す
る。残渣を酢酸エチルで抽出し、水、５％重亜硫酸ナト
リウム、塩水で洗い、硫酸マグネシウム上で乾燥する。
溶媒を除去し、粗物質をシリカゲルにて、溶離剤として
酢酸エチルを用いるカラムクロマトグラフィーで精製す
る。所望生成物の収率７８％。

【０１０４】５−sec−ブチル−５−(カルボキシ−１−
プロピレン)バルビツール酸:１５２mgの５−sec−ブチ
ル−５−カルベトキシ−１−プロピレンバルビツール酸
を１５mlの濃塩酸中で、４５分間還流する。反応混合物
を蒸発乾固して、所望生成物を無色結晶で得る(収率９
５％、m．p．１６８〜１７１℃)。

【０１０５】実施例７ ２５０mgの５−(１−メチルブチル)−５−カルベトキシ
メチルバルビツール酸を２５mlの濃塩酸中で、４５分間
還流する。反応混合物を冷却し、沈殿した結晶を濾別す
る。水より再結晶して、１９０mgの無色結晶を得る(m．
p．２３８〜２４０℃)。

【０１０６】実施例８ ２００mgの５−(１−メチルブチル)−５−カルベトキシ
プロピルバルビツール酸を２５mlの濃塩酸と共に、１時
間還流する。反応混合物を減圧蒸発し、固体残渣を水よ
り晶出させる。無色結晶(m．p．１８９〜１９２℃)の収
量１２０mg。

【０１０７】実施例９ ５−sec−ブチル−５−カルボキシ−１−プロピレンバ
ルビツール酸とアミノメチルフルオレセインのカップリ
ング反応:２６．８mg(０．１ミリモル)の５−sec−ブチ
ル−５−カルボキシ−１−プロピレンバルビツール酸を
０．３mlの無水ＤＭＦに溶解し、この溶液に、０．３ml
のＤＭＦに溶解した２０mgのジシクロヘキシルカルボジ
イミドを加えた後、０．３mlのＤＭＦ中の１１．５mgの
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを加える。反応混合物を
室温で攪拌する。３０分後、４２mgのアミノメチルフル
オレセインを加える。２０時間後、反応混合物を回転蒸
発で乾燥し、シリカゲルにて溶離剤として酢酸エチル／
酢酸(１００:０．２)を用いるカラムクロマトグラフィ
ーで精製する。

【０１０８】実施例１０ ５−(１−メチルブチル)−５−カルボキシ−１−プロピ
レンバルビツール酸とアミノメチルフルオレセインのカ
ップリング反応:本例では、出発物質として２８．２mg
(０．１ミリモル)の５−(１−メチルブチル)−５−カル
ボキシクロトニルバルビツール酸、１１．５mgのＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミド、２０mgのジシクロヘキシルカ
ルボジイミドおよび４２mgのアミノメチルフルオレセイ
ンを用い、実施例９の操作に従って製造を行う。生成物
をシリカゲルにて、溶離剤として酢酸エチル／酢酸(１
００:０．２)を用いる分取薄層クロマトグラフィーで精
製する。

【０１０９】実施例１１ ５−イソプロピル−５−(カルボキシ−１−プロピレン)
バルビツール酸とアミノメチルフルオレセインのカップ
リング反応:本例では、出発物質として２１．４mgの５
−エチル−５−カルボキシメチルバルビツール酸、１
１．５mgのＮ−ヒドロキシスクシンイミド、２０mgのジ
シクロヘキシルカルボジイミドおよび４２mgのアミノメ
チルフルオレセインを用い、実施例９の操作に従って製
造を行う。生成物をシリカゲルにて、溶離剤として酢酸
エチル／酢酸(１００:０．２)を用いる分取薄層クロマ
トグラフィーで精製する。

【０１１０】実施例１２ ５−エチル−５−カルボキシメチルバルビツール酸とア
ミノメチルフルオレセインのカップリング反応:本例で
は、出発物質として２１．４mgの５−エチル−５−カル
ボキシメチルバルビツール酸、１１．５mgのＮ−ヒドロ
キシスクシンイミド、２０mgのジシクロヘキシルカルボ
ジイミドおよび４２mgのアミノメチルフルオレセインを
用い、実施例９の操作に従って製造を行う。生成物をシ
リカゲルにて、溶離剤として酢酸エチル／酢酸(１００:
０．２)を用いるクロマトグラフィーで精製する。

【０１１１】実施例１３ ５−sec−ブチル−５−カルボキシメチルバルビツー
ル酸とアミノメチルフルオレセインのカップリング反
応:本例では、出発物質として２４mgの５−sec−ブチル
−５−カルボキシメチルバルビツール酸、１１．５mgの
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、２０mgのジシクロヘキ
シルカルボジイミドおよび４２mgのアミノメチルフルオ
レセインを用い、実施例９の操作に従って製造を行う。
生成物をシリカゲルにて、溶離剤として酢酸エチル／酢
酸(１００:０．２)を用いる分取薄層クロマトグラフィ
ー(ＰＴＬＣ)で精製する。

【０１１２】実施例１４ sec−ブチル−５−カルボキシエチルバルビツール酸と
アミノメチルフルオレセインのカップリング反応:本例
では、出発物質として２６mgの５−sec−ブチル−５−
カルボキシエチルバルビツール酸、１１．５mgのＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミド、２０mgのジシクロヘキシルカ
ルボジイミドおよび４２mgのアミノメチルフルオレセイ
ンを用い、実施例９の操作に従って製造を行う。生成物
をシリカゲルにて、溶離剤として酢酸エチル／酢酸(１
００:０．２)を用いるＰＴＬＣで精製する。

【０１１３】実施例１５ ５−sec−ブチル−５−カルボキシプロピルバルビツー
ル酸とアミノメチルフルオレセインのカップリング反
応:本例では、出発物質として２８mgの５−sec−ブチル
−５−カルボキシプロピルバルビツール酸、１１．５mg
のＮ−ヒドロキシスクシンイミド、２０mgのジシクロヘ
キシルカルボジイミドおよび４２mgのアミノメチルフル
オレセインを用い、実施例９の操作に従って製造を行
う。生成物を溶離剤として酢酸エチル／酢酸(１００:
０．２)を用いるＰＴＬＣで精製する。

【０１１４】実施例１６ ５−sec−ブチル−５−カルボキシブチルバルビツール
酸とアミノメチルフルオレセインのカップリング反応:
本例では、出発物質として２９mgの５−sec−ブチル−
５−カルボキシブチルバルビツール酸、１１．５mgのＮ
−ヒドロキシスクシンイミド、２０mgのジシクロヘキシ
ルカルボジイミドおよび４２mgのアミノメチルフルオレ
セインを用い、実施例９の操作に従って製造を行う。生
成物を溶離剤として酢酸エチル／酢酸(１００:０．２)
を用いるＰＴＬＣで精製する。

【０１１５】実施例１７ ５−(１−メチルブチル)−５−カルボキシジメチルバル
ビツール酸とアミノメチルフルオレセインのカップリン
グ反応:本例では、出発物質として２４mgの５−(１−メ
チルブチル)−５−カルボキシメチルバルビツール酸、
１１．５mgのＮ−ヒドロキシスクシンイミド、２０mgの
ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび４２mgのアミノ
メチルフルオレセインを用い、実施例９の操作に従って
製造を行う。生成物をシリカゲルにて溶離剤として酢酸
エチル／酢酸(１００:０．２)を用いるＰＴＬＣで精製
する。

【０１１６】実施例１８ ５−(１−メチルブチル)−５−カルボキシエチルバルビ
ツール酸とアミノメチルフルオレセインのカップリング
反応:本例では、出発物質として２５mgの５−(１−メチ
ルブチル)−５−カルボキシエチルバルビツール酸、１
１．５mgのＮ−ヒドロキシスクシンイミド、２０mgのジ
シクロヘキシルカルボジイミドおよび４２mgのアミノメ
チルフルオレセインを用い、実施例９の操作に従って製
造を行う。生成物をシリカゲルにて、溶離剤として酢酸
エチル／酢酸(１００:０．２)を用いるＰＴＬＣで精製
する。

【０１１７】実施例１９ ５−(１−メチルブチル)−５−カルボキシプロピルバル
ビツール酸とアミノメチルフルオレセインのカップリン
グ反応:本例では、出発物質として２６．５mgの５−(１
−メチルブチル)−５−カルボキシプロピルバルビツー
ル酸、１１．５mgのＮ−ヒドロキシスクシンイミド、２
０mgのジシクロヘキシルカルボジイミドおよび４２mgの
アミノメチルフルオレセインを用い、実施例９の操作に
従って製造を行う。生成物をシリカゲルにて溶離剤とし
て酢酸エチル／酢酸(１００:０．２)を用いるＰＴＬＣ
で精製する。

【０１１８】実施例２０ ５−(１−メチルブチル)−５−カルボキシブチルバルビ
ツール酸とアミノメチルフルオレセインのカップリング
反応:本例では、出発物質として２８mgの５−(１−メチ
ルブチル)−５−カルボキシブチルバルビツール酸、１
１．５mgのＮ−ヒドロキシスクシンイミド、２０mgのジ
シクロヘキシルカルボジイミドおよび４２mgのアミノメ
チルフルオレセインを用い、実施例９の操作に従って製
造を行う。生成物をシリカゲルにて溶離剤として酢酸エ
チル／酢酸(１００:０．２)を用いるＰＴＬＣで精製す
る。

【０１１９】実施例２１ ５−(１−メチルブチル)−５−カルボキシメチルバルビ
ツール酸とフルオレセインアミド(異性体)の複合:５−
(１−メチルブチル)−５−カルボキシメチルバルビツー
ル酸(５８．３mg)に、塩化チオニル(２ml)を加え、溶液
を１．５時間還流する。過剰の塩化チオニルを減圧除去
し、油状物を冷却する。これに、乾燥ピリジン(１ml)中
のフルオレセインアミド(異性体１)の溶液を加える。物
質をシリカプレッププレートにて、酢酸エチル／酢酸
(１００:０．２)を用いるクロマトグラフィーに付し、
所望トレーサーを得る。

【０１２０】実施例２２ ５−(３−メチルシクロヘキシル)−５−カルボキシブチ
ルバルビツール酸の複合:本例では、出発物質として２
１mgの５−(３−メチルシクロヘキシル)−５−カルボキ
シブチルバルビツール酸、６．９mgのＮ−ヒドロキシス
クシンイミド、１９．９mgのジシクロヘキシルカルボジ
イミドおよび２４mgのアミノメチルフルオレセインを用
い、実施例９の操作に従って製造を行う。

【０１２１】実施例２３ ５−(１−メチルブチル)−５−ホルミルメチルバルビツ
ール酸とアミノメチルフルオレセインの複合:2mlの水お
よびpＨ６の２mlのメタノールの溶液に、５−(１−メチ
ルブチル)−５−ホルミルメチルバルビツール酸(１４１
mg、０．５８ミリモル)およびアミノメチルフルオレセ
イン(２１０mg、０．５８ミリモル)を加える。Ｎ,Ｎ−
ジメチルホルムアミドを滴下して溶解を完了する。１時
間攪拌後、直ちにシアノホウ水素化ナトリウム(３８．
８mg)を加える。一夜攪拌後、溶媒を蒸発し、物質を逆
相分取プレート(シリカゲル)にて、溶離剤としてメタノ
ール／水／トリフルオロ酢酸を用い精製する。

【０１２２】実施例２４ ジエチルシクロペンチルマロネート(最も好ましいトレ
ーサー、前記式[３０]の製造):８０mlの無水エタノール
中の４．６g(０．２モル)のナトリウム金属の溶液に、
３０．４ml(０．２モル)のジエチルマロネートを加え
る。得られる混合物を少し攪拌して、粘稠白色沈殿物を
生成する。この懸濁液に、２１．４ml(０．２モル)のシ
クロペンチルブロミドを加える。混合物を１２時間加熱
し、次いで周囲温度に冷却する。回転蒸発でエタノール
のほとんどを除去し、得られる残渣を２５０mlの水で希
釈し、ジエチルエーテル(１００ml×３)で抽出する。コ
ンバインした抽出物をＭgＳＯ₄上で乾燥し、濾過し、濃
縮する。６インチのビグレウクス(Ｖigreaux)カラムに
て、６mmＨgで蒸留を行い、３２．２３２gの無色液体
(b．p．１２２〜１２５℃)を得る。

【０１２３】５−シクロペンチルバルビツール酸:５０m
lの無水エタノール中の３．４８g(１５１ミリモル)のナ
トリウム溶液に、３．０２g(５０ミリモル)の尿素およ
び上記製造したジエチルシクロペンチルマロネート１０
g(４４ミリモル)を加える。形成する粘稠白色スラリー
を、１２時間還流する。回転蒸発でエタノールのほとん
どを除去し、残渣を１００mlの水で希釈し、１００mlの
９８％Ｈ₂ＳＯ₄で酸性化する。形成する白色固体を濾取
し、真空ポンプで乾燥する。固体を水より再結晶し、さ
らに５％水／エタノールより２回目の再結晶を行って、
７．００６gの無色板状結晶(m．p．２２２〜２２３℃)
を得る。

【０１２４】５−シクロペンチル−５−[(エトキシカル
ボニル)−２−プロペニル]バルビツール酸:１．０mlの
テトラヒドロフランおよび１．０mlのジメチルホルムア
ミドの混合物中の、上記製造した２００mg(１．０２ミ
リモル)のバルビツール酸化合物の溶液を、１．０mlの
ジメチルホルムアミド中の３２mg(８０％鉱油分散体、
１．０７ミリモル)の水素化ナトリウム(予め５mlのペン
タンで３回洗っておく)の懸濁液に加える。周囲温度で
１時間攪拌後、１６８μl(１．２２ミリモル)のエチル
４−ブロモクロトネートを加え、反応液を７０℃に加温
し、１２時間攪拌する。溶液を冷却し、回転エバポレー
タにて濃縮し、酢酸エチルで希釈し、水(１ml×２)で洗
う。溶液をＭgＳＯ₄上で乾燥し、濃縮する。ヘキサンを
詰めた１×１８cmカラムにて、それぞれ５０mlの１０
％,２０％,３０％,５０％および７０％酢酸エチル／ヘ
キサンで溶離するクロマトグラフィーを行って、２９７
mgの透明淡黄色油状物を得る。

【０１２５】５−シクロペンチル−５−[３−カルボキ
シ−２−プロペニル]バルビツール酸:１．０mlのジメト
キシエタン中の前記実験で製造した２９２mg(０．９４
ミリモル)のエステルの溶液に、５．０mlの１５％Ｈ₂Ｓ
Ｏ₄水溶液を加える。混合物を４５分間還流し、冷却す
る。溶液を濃縮して粘稠油状物とし、酢酸エチルで希釈
し、水(１ml×２)で洗う。ＭgＳＯ₄上で乾燥し、溶媒除
去を行って２４６mgのオフホワイト固体を得る。固体を
６mlの水中で煮沸し、冷却して１３２mgの白色固体(m．
p．２２６〜２２７℃)を得、晶出させ、次いで濾過で単
離する。

【０１２６】５−[３−[(２a−フルオレセイニル)メチ
ルアミノカルボニルオキシ]−２−プロペニル]−５−シ
クロペンチル−バルビツール酸:３００μlのジメトキシ
エタン中の前記実験で製造した７．８mg(２７μモル)の
酸化合物の冷却(０℃)溶液に、３．６μl(２７μモル)
のイソブチルクロロホルメートを加える。溶液を周囲温
度に加温し、１．３時間攪拌する。該溶液を０℃に再冷
却し、これに２００μlのジメチルホルムアミド中の１
０．９mg(２７μモル)のアミノメチルフルオレセイン塩
酸塩および７．６μl(５４μモル)のトリエチルアミン
の第２溶液を加え、次いで溶液を周囲温度に加温し、１
２時間攪拌する。溶媒をポンプ減圧で除去し、残渣を溶
離剤として８０％メタノール／クロロホルムを用いる分
取薄層クロマトグラフィーで精製する。主要な蛍光バン
ドを１０％メタノール／クロロホルムで溶離し、濃縮し
てから１０．２mgのオレンジ色固体を得る。

【０１２７】実施例２５ ジエチルシクロペンテニルマロネート(最も好ましい免
疫抗原、前記式[２９]の製造):−７８℃に冷却維持した
１７４g(２．６３モル)の新しい解重合したシクロペン
タジエンに、８７．５g(２．５０モル)のＨＣlガスを加
える。その間に、４００mlの無水エタノール中の２１．
４g(０．９３モル)のナトリウムの溶液に、１５２ml
(１．０モル)のジエチルマロネートを加える。ＨＣlの
添加終了後、該マロネート溶液に−７８℃に維持した粗
黄色クロリドを１ml部づつ加える。かなりの熱が発生
し、黄色が消え、そして各部を加える毎に、多量の白色
沈澱が形成する。次いで懸濁液を１７時間攪拌し、回転
蒸発でエタノールのほとんどを除去し、２００mlの水を
加えて反応を抑え、ジエチルエーテル(１００ml×５)で
抽出する。コンバインした抽出物をＭgＳＯ₄上で乾燥
し、濾過し、濃縮して透明黄色油状物とする。この物質
の一部を０．５mmＨgで蒸留して、１９．０９１gの透明
グリーン油状物(b．p．９１〜９４℃)を得る。

【０１２８】５−(２−シクロペンテニル)バルビツール
酸:このバルビツール酸化合物は、上記５−シクロペン
チルバルビツール酸の場合に記載した操作に従って合成
した。

【０１２９】５−(２−シクロペンテニル)−５−[３−
(エトキシカルボニル)プロピル]バルビツール酸:４mlの
テトラヒドロフランおよび１７mlのジメチルホルムアミ
ドの混合物中の、４３４mg(３．７９ミリモル)の水素化
カリウム(予めヘキサン５mlで３回洗っておく)の懸濁液
に、上記製造した７００mg(３．６０ミリモル)の５−
(２−シクロペンテニル)バルビツール酸を加える。混合
物を１時間攪拌した後、０．５１ml(３．９６ミリモル)
のエチル２−ブロモプロピオネートおよび１７８mg
(１．１８ミリモル)の無水ヨウ化ナトリウムを加える。
溶液を１２時間還流し、周囲温度に冷却せしめ、７２時
間攪拌する。回転蒸発で溶媒のほとんどを除去し、水を
加えて反応を抑え、１０mlの酢酸エチルで４回抽出す
る。コンバインした抽出物をＭgＳＯ₄上で乾燥し、濾過
し、濃縮する。シリカゲルにて、５％メタノール／クロ
ロホルムで溶離するクロマトグラフィーに付して、９１
７mgの淡黄色油状物を得る。

【０１３０】５−(２−シクロペンテニル)−５−(３−
カルボキシプロピル)バルビツール酸:２mlのテトラヒド
ロフラン中の前記実験で製造した７３７mg(２．５１ミ
リモル)のエステルの溶液に、６mlの５％硫酸／水の溶
液を加える。混合物を周囲温度で数日間攪拌する。反応
液を回転エバポレータで濃縮し、残渣をシリカゲルに
て、２％,５％および１０％メタノール／クロロホルム
で溶離するクロマトグラフィーに付し、２１５mgの白色
結晶物質を得る。

【０１３１】５−(２−シクロペンテニル)−５−カルボ
キシプロピルバルビツール酸とサイログロブリンのカッ
プリング反応:１２．６５mg(４．７×１０^-5モル)の５
−(２−シクロペンテニル)−５−カルボキシプロピルバ
ルビツール酸を１．０mlのp−ジオキサンに溶解して、
５−(２−シクロペンテニル)−５−カルボキシプロピル
バルビツール酸を、混合無水物のサイログロブリンにカ
ップリング反応させる。この混合物に、８×１０^-5モル
のトリエチルアミンおよび８×１０^-5モルのイソブチル
クロロホルメートを加える。反応液を室温で２時間攪拌
し、その間、微細な白色沈殿物が形成する。この懸濁液
を、１１．０mlの０．００５Ｍホウ酸ナトリウム(pＨ
９．５)に溶解した牛サイログロブリン(２００mg)の急
攪拌溶液に加える。室温で２時間攪拌後、混合物を４交
替(それぞれ２l)の０．０５Ｍリン酸ナトリウム(pＨ
７．５)に対して透析する。なお、透析は２〜８℃で実
施し、各透析緩衝剤を交替する間隔を少なくとも８時間
とした。透析後、最終プロテイン濃度をロウリィ法(Ｌo
wry Ｍethod)[Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．,Ｖol．１９３、２
６５−２７５頁(１９５１年)参照]で測定し、かつ置換
度をＴＮＢＳ(トリニトロベンゼンスルホネート)滴定で
測定した。

【０１３２】実施例２６ ジエチル[３−メチル−２−ブテニル]マロネート(好ま
しいトレーサー、前記式[３１]の製造):１０mlのテトラ
ヒドロフランおよび５mlのジメチルホルムアミドの混合
物中の、４２２mgの水素化ナトリウム(８０％鉱油分散
体、１４．１ミリモル、予めペンタン３mgで３回洗って
おく)の冷却(０℃)懸濁液に、２．０４ml(１３．４ミリ
モル)のジエチルマロネートを加える。混合物を周囲温
度に加温し、０．６時間撹拌する。次いでプレニルブロ
ミド(２．００g、１３．４ミリモル)を注入し、溶液を
周囲温度で３０分間、次いで還流温度で１時間撹拌す
る。次に溶液を周囲温度まで冷却せしめ、１２時間撹拌
する。水を加えて反応を抑え、１０％水性硫酸でpＨ３
に酸性化し、エーテル(１０ml×２)で抽出する。コンバ
インした洗液を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濃縮
する。シリカゲルにて、４％, ７％および１０％エーテ
ル／ヘキサンで溶離するクロマトグラフィーを行い、濃
縮して２．７３４gの透明無色油状物を得る。

【０１３３】５−[３−メチル−２−ブテニル]バルビツ
ール酸:１．０mlの無水エタノール中の７０mg(３．０３
ミリモル)のナトリウムの溶液に、６１mgの尿素(１．０
１ミリモル)を加えた後、前記実験で製造した２００mg
のジエチルフェニルマロネート(０．８８ミリモル)を加
える。溶液を１２時間静かに還流する。回転蒸発でエタ
ノールのほとんどを除去し、残渣を水に希釈する。溶液
をpＨ３に酸性化し、酢酸エチル(１０ml×２)で抽出す
る。コンバインした有機相を無水硫酸マグネシウム上で
乾燥し、濃縮して２１４mgのオフホワイト固体とする。

【０１３４】５−[３−メチル−２−ブテニル]−５−ア
リルバルビツール酸:前記反応で製造した固体を、０．
５mlのテトラヒドロフランおよび１．０mlのジメチルホ
ルムアミドの混合物に溶解し、３３mgの水素化ナトリウ
ム(８０％鉱油分散体、１．０９ミリモル)を加え、混合
物を１時間撹拌する。次いでアリルブロミド(０．１１m
l、１．１３ミリモル)を加え、溶液を周囲温度で７２時
間撹拌する。希塩酸をpＨ３まで加えて反応を抑え、酢
酸エチル(１０ml×３)で抽出する。コンバインした抽出
物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濃縮する。シリ
カゲルにて、２０％, ３０％および４０％酢酸エチル／
ヘキサンで溶離するクロマトグラフィーを行い、１００
mgの無色油状物を得る。

【０１３５】５−[４−ヒドロキシ−３−メチル−２−
ブテニル]−５−アリルバルビツール酸:１．０mlのジク
ロロメタン中の前記実験で製造したバルビツール酸誘導
体(１００mg、０．４２ミリモル)の溶液に、６mg(４２
μモル)のサリチル酸および９mg(８４μモル)の二酸化
セレンを加える。懸濁液を水浴に置き、t−ブチルハイ
ドロパーオキシドの３．８Ｍベンゼン無水溶液０．２９
ml(１．０９ミリモル)を加える。次いで懸濁液を周囲温
度で１２時間激しく撹拌する。反応混合物を濃縮し、シ
リカゲルカラムにて直接、４０％, ５０％, ６０％およ
び７０％酢酸エチル／ヘキサンで溶離するクロマトグラ
フィーに付す。幾つかの出発物質および他の生成物に加
えて、２１mgの無色油状物を単離する。

【０１３６】５−[４−[(２a−フルオレセイニル)メチ
ルアミノカルボニルオキシ]−３−メチル−２−ブテニ
ル]−５−アリルバルビツール酸:２００μlのテトラヒ
ドロフラン中の前記実験で製造した５mg(２０μモル)の
油状物の冷却(０℃)溶液に、２００μlのホスゲンの１
２％ベンゼン溶液を加える。溶液を周囲温度に加温し、
０．６時間撹拌する。回転蒸発で溶媒を除去し、残渣を
１００μlのジメチルホルムアミドに再溶解し、２００
μlのジメチルホルムアミドおよび５．６μl(４０μモ
ル)のトリエチルアミンの混合物中の、８mg(２０μモ
ル)のアミノメチルフルオレセイン塩酸塩の溶液を加え
る。溶液を周囲温度で１２時間撹拌する。溶媒を減圧ポ
ンプで除去し、残渣を１０％メタノール／クロロホルム
で溶離する薄層クロマトグラフィーで精製する。主要バ
ンドを８０％メタノール／クロロホルムで溶離し、濃縮
して６．６mgのオレンジ色固体を得る。

【０１３７】前記式[２８]の構造を持つ免疫抗原に対し
産生するバルビツレート用抗体および前記式[５]のバル
ビツレートトレーサーは、バルビツレートの蛍光偏光免
疫学的検定法において、驚くべき良好な結果をもたらす
ことがわかった。しかしながら、トレーサーを抗体の最
も好ましい組合せは、前記式[３０]の構造を持つトレー
サーと、前記式[２９]の構造を持つ免疫抗原に対し産生
する単クローン性または多クローン性抗体との組合せで
ある。

【０１３８】本発明方法の別の利点は、ゼロと区別でき
る分析物の最低測定可能濃度を９５％の信頼で規定す
る。当該検定法の感度がセコバルビタールに対する測定
で約６０ng／mlであることである。

【０１３９】さらに本発明方法の重要な利点は、一般使
用の多数のバルビツレートに対するクロス反応性であ
る。本発明方法によって、一般使用のバルビツレートの
クロス反応性が試験される。それぞれの場合において、
正常なヒトの無薬物尿に既知量(２００ng／ml)のバルビ
ツレート試験化合物を加えた後、アボット・ラボラトリ
ーズのＴＤxクリニカル・アナライザーまたはＡＤxドラ
ッグス・オブ・アブュース・システムで、化合物を検定
する。

【０１４０】トレーサーが前記式[５]の構造を有し、抗
体が前記式[２８]の構造を持つ免疫抗原に対して産生す
る、本発明検定法による、一般使用のバルビツレートの
代表的なクロス反応性データを下記表３(a)に示す。な
お、表中の５つの欄は、以下の情報を示す。 (１)欄１は、検定する個々のバルビツレートを示す。 (２)欄２は、無薬物尿に加えるバルビツレート試験化合
物の量を示す。 (３)欄３は、得られるヒト尿中に検出されるバルビツレ
ート試験化合物の量を示す。 (４)欄４は、検定する個々のバルビツレートを過大評価
(１．０より大、たとえば１．３３)または過小評価
(１．０より小、たとえば０．８３)するファクターを示
す。 (５)欄５は、クロス反応率を示す。

【０１４１】 表３(a) １ ２ ３ ４ ５ セコバルビタール 200 ng／mL 200 ng／mL 1.00 100％ アモバルビタール 200 ng／mL 310 ng／mL 1.55 155％ ブタルビタール 200 ng／mL 201 ng／mL 1.00 100％ ペントバルビタール 200 ng／mL 210 ng／mL 1.05 105％ フェノバルビタール 200 ng／mL 210 ng／mL 1.05 105％ タルブタール 200 ng／mL 180 ng／mL 0.90 90％

【０１４２】表に挙げたバルビツレートのそれぞれを、
標準として使用され、かつクロス反応率１００％(評価
ファクター１．０)を有すると判定されたセコバルビタ
ールと比較する。ファクター１．０とは、当該検定法が
正常なヒトの無薬物尿に最初に添加した試験化合物の実
際濃度を過大評価または過小評価のいずれもしないこと
を示す。換言すれば、正常なヒトの無薬物尿に２００ng
のセコバルビタールを加えたときに、得られる尿試料中
に約２００ngのセコバルビタールが検出されることを示
す。すなわち、ファクターが１．０に近づくにつれて、
分析される個々の試験化合物に対する検定法がより正確
となる。このファクターおよびクロス反応性は共に、ア
ボット・ラボラトリーズのＴＤxクリニカル・アナライ
ザーまたはＡＤxドラッグス・オブ・アブュース・シス
テムの数値を読むことによって測定することができ、ま
たこれらの測定器は、検定中に実際に検出されるバルビ
ツレートの量を下記の数式から測定するのに使用しうる
ものである。

【０１４３】

【０１４４】欄５に示されるクロス反応率は、下記の数
式から算出される。 得られるヒト尿中に検出される試験化合物の濃度 クロス反応率(％)＝ 正常なヒトの無薬物尿に添加される試験化合物の濃度 ×１００

【０１４５】しかしながら、本発明の検定法の最も好ま
しい具体例において、トレーサーが前記式[３０]の構造
を有し、抗体が前記式[２９]の構造を持つ免疫抗原に対
して産生する、一般使用のバルビツレートの代表的クロ
ス反応性データを下記表３(b)に示す。

【０１４６】 表３(b) １ ２ ３ ４ ５ セコバルビタール 200 ng／mL 200 ng／mL 1.00 100％ アモバルビタール 200 ng／mL 85 ng／mL 0.43 43％ アプロバルビタール 200 ng／mL 123 ng／mL 0.62 62％ ブタルビタール 200 ng／mL 227 ng／mL 1.13 113％ ブタバルビタール 200 ng／mL 489 ng／mL 2.24 224％ ブラロバルビタール 200 ng／mL 188 ng／mL 0.94 94％ ペントバルビタール 200 ng／mL 129 ng／mL 0.65 65％ フェノバルビタール 200 ng／mL 140 ng／mL 0.70 70％ タルブタール 200 ng／mL 531 ng／mL 2.65 265％

【０１４７】本発明の他の利点は、非バルビツレート化
合物との低クロス反応性である。クロス反応性はまた、
一般使用のバルビツレートに類する化学構造を有する化
合物を用いて試験する。一般使用のバルビツレートに類
する化学構造を有する化合物に対する低クロス反応性を
示す代表的クロス反応性データを、下記表４(a)(前記式
[５]の構造を持つトレーサーの場合)および表４(b)(前
記式[３０]の構造を持つトレーサーの場合)に示す。な
お、表４(a)および４(b)中の５つの欄は、前記表３(a)
の場合に記載したのと同じ情報を示す。

【０１４８】 表４(a) １ ２ ３ ４ ５ グルテチミド 10 μg／mL 180 ng／mL 0.018 1.80％ 1 μg／mL ND p−ヒドロキシ フェニトイン 100 μg／mL 1200 ng／mL 0.012 1.20％ 10 μg／mL 340 ng／mL 0.034 3.40％ 1 μg／mL NDフェニトイン 100 μg／mL 1020 ng／mL 0.0102 1.02％ 10 μg／mL 320 ng／mL 0.032 3.20％ 1 μg／mL ND プリミドン 100 μg／mL 320 ng／mL 0.0032 0.32％ 10 μg／mL 90 ng／mL 0.009 0.90％ 1 μg／mL ND イブプロフェン 100 μg／mL 70 ng／mL 0.0007 0.07％ 10 μg／mL ND 1 μg／mL ND OH-イブブロフェン 1000 μg／mL 60 ng／mL 0.00006 0.006％ 100 μg／mL ND 10 μg／mL ND 1 μg／mL ND フェノプロフェン 430 μg／mL 290 ng／mL 0.00067 0.067％ 215 μg／mL 180 ng／mL 0.00084 0.084％ ナプロキセン 100 μg／mL 70 ng／mL 0.0007 0.07％ 10 μg／mL ND ＮＤ＝非検出: 該検定法の感度(６０ng／ml)より小さい濃度

【０１４９】 表４(b) １ ２ ３ ４ ５ グルテチミド 10 μg／mL 480 ng／mL 0.048 4.80％ 1 μg／mL 89 ng／mL 0.089 8.90％ p−ヒドロキシ フェニトイン 500 μg／mL 218 ng／mL 0.00004 0.04％ 100 μg／mL 101 ng／mL 0.00010 0.10％ 10 μg／mL ND プリミドン 100 μg／mL 195 ng／mL 0.00019 0.19％ 10 μg／mL NDアミノク゛ルテチミト゛ 100 μg／mL 412 ng／mL 0.00041 0.41％ 10 μg／mL 117 ng／mL 0.00117 1.17％ 1μg／mL ND

【０１５０】数種の一般使用のバルビツレート、並びに
他のバルビツレートおよびバルビツレート類似構造に類
する化学構造を有する化合物に対する低クロス反応性を
示す代表的クロス反応性データを、下記表５に示す。こ
の場合、免疫抗原は前記式[２９]の構造を持ち、トレー
サーは前記式[３０]および[３１]の構造を持つ。

【０１５１】 表５ 前記式[３１] 前記式[３０] 化合物 添加濃度 検出濃度 クロス反応率 検出濃度 クロス反応率 (ng／mL) (ng／mL) (％) (ng／mL) (％) アルフェナール 1200 HI >167 1130 94 アモバルビタール 1200 870 73 490 41 アプロバルビタール 1200 1670 139 920 77 ブラロバルビタール 1200 1910 159 1400 117 ブタバルビタール 1200 HI >167 HI >167 ブタルビタール 1200 HI >167 2000 167 ブトバルビタール 1200 NA NA 580 48 シクロペント バルビタール 1200 HI >167 HI >167 ペントバルビタール 1200 770 64 740 62 フェノバルビタール 1200 1280 107 740 62 タルブタール 1200 HI >167 HI >167ＮＡ＝入手不可

【０１５２】 表５(つづき) クロス反応性の望ましくない化合物 前記式[３１] 前記式[３０] 化合物 添加濃度 検出濃度 クロス反応率 検出濃度 クロス反応率 (ng／mL) (ng／mL) (％) (ng／mL) (％) フェニトイン 100 90 0.09 40 0.04 HPPH(フェニトイン 代謝産物) 500 290 0.058 200 0.001 イブプロフェン 1000 50 0.005 20 0.002 ナプロキセン 100 20 0.02 20 0.02 フェノプロフェン 200 40 0.02 30 0.015 グルテチミド 10 470 4.70 470 4.70プリミドン 100 240 0.24 180 0.18

【０１５３】さらに、下記表６(a)に記載の化合物は、
１．０、１０．０および１００．０μg／mlで試験した
とき、前記式[５]の構造を持つトレーサーに対し、０．
０６μg／ml以下のクロス反応性結果を示す。

【０１５４】 表６(a) アセトアミノフェン アセチルサリチル酸 アルプラゾラム アミノピリン アミトリプチリン アモキシシリン d,l−アンフェタミン アンピシリン アンタブュース アポモルフィン アテノロール アトロピン ベンゾカイン ベンゾイルエクゴニン カフェイン 次亜塩素酸カルシウム カルバマゼピン セファレキシン クロルジアゼポキシド クロロキノン クロルフェニラミン クロルプロマジン クロルプロパミド シメチジン クロニジン コカイン コデイン シクリジン デキストロメトルファン ジアゼパム ジフルニザール ジゴキシン エクゴニン エフェドリン エピネフリン エリスロマイシン エストリオール エストロン−３−スルフェ ート フルラゼパム フロセミド ゲンチジン酸 グアイヤコールグリセリル ヒドロクロロチアジド ４−ＯＨ−ＰＩＰ−フェン エーテル シクリジン イミプラミン インドメタシン レボチロキシン ロキサピン メペリジン メフェニトイン メプロバメート メタドン d,l−メタンフェタミン メタクワロン メチルドパ メチプリロン メトプロロール モルフィン ナフィシリン ナロキソン ナロルフィン ナルトレキソン ニコチン ニコチン酸 ニフェジピン ノルエチンドロン オキサゼパム ペニシリン フェンシクリジン フェンメトラジン フェノチアジン フェンテルミン フェニルブタゾン フェニルプロパノラミン ピロキシカム 塩化カリウム プロメタジン プロマジン プロポキシフェン プロプラノロール キニーネ 二硫酸キニーネ キニジン テルブタリン テトラサイクリン デルタ−８−テトラヒドロ カンナビノールカルボン酸 デルタ−９−テトラヒ テトラヒドロゾリン テオフィリン ドロカンナビノールカ ルボン酸 チオプロパゼート トリアムテレン トリフルオペラジン トリメトプリム 尿酸 ゾメピラック

【０１５５】下記表６(b)に記載の化合物は、１００．
０μg／mlで試験したとき、前記式[３０]の構造を持つ
トレーサーに対し、６０ng／ml以下のクロス反応性結果
を示す。

【０１５６】 表６(b) アセトアミノフェン アセトプロマジン Ｎ−アセチル−１−システィン アセチルサリチル酸 アルファプロジン アルプラゾラム アルプレノロール アマンタジン アミノピリン アミトリプチリン シス−10−ＯＨ−アミトリプチリン トランス−10−ＯＨ−アミトリプチリン アモキシシリン d,l−アンフェタミン p−ＯＨ−アンフェタミン アンピシリン アニレリジン アンタビュース アポモルヒネ アプロバルビタール アスパルテーム アテノロール アトロピン アザタジン ベクロメタゾン ベナクチジン ベンゾカイン 安息香酸 ベンゾイルエクゴイニン ベンズトロピン ベンジルペニシリン ブロモクリプチンメシレート ブロムフェニラミン ブピバカイン ブスピロン ブトルファノール カフェイン 次亜塩素酸カルシウム カルバマゼピン カルバマゼピン−10,11−エポキシド カリソプロドール カルフェナジン セファレキシン セファロリジン クロラール水和物 クロラムフェニコール クロルジアゼポキシド エフェドリン クロロキン クロロチアジド クロルフェニラミン クロルプロマジン クロルプロパミド クロルゾキサゾン コレステロール シメチジン シプロフロキサシン クレマスチン クリンダマイシン クロミプラミン クロニジン コカイン コデイン コルチゾン β−コルトール シクラゾシン シクリジン シクロベンザプリン シクロゾシン シプロヘプタジン デオキシコルチコステロン デシプラミン デキストロメトルファン ジアセチルモルヒネ ジアゼパム ジベンゼピン ジブカイン ジエチルプロピオン ジフルニザール ジギトキシン ジゴキシン ジヒドロコデイン ジヒドロモルヒネ 10,11−ジヒドロキシカルバマゼピン ジルチアゼム ジフェンヒドラミン ジフェノキシレート ジフェニルヒダントイン ジピリダモール ドーパミン ドチェピン ドキセピン ドキシラミン エクゴニン エフェドリン エピネフリン エリスロマイシン エストラジオール エストリオール エストロン−３−スルフェート エタンブトール エチナメート ４−エチル−２,５−ジメトキシ エチルモルヒネ アンフェタミン(ＤＯＥＴ) フェンカムファミン フェンフルラミン フェノプロフェン(＊) フェンタニル フルフェナム酸 フルオキセチン フルフェナジン フルラゼパム フル−ビプロテン フロセミド ゲンチジン酸 グリコピロレート グアイヤコールグリセリルエーテル ハロペリドール 馬尿酸 ヒスタミン ヒドララジン ヒドロクロロチアジド ヒドロコドン ヒドロコルチゾン ヒドロモルホン ５−ヒドロキシインドール−３−酢酸 ５−ヒドロキシインドール−２− ヒドロキシジン カルボン酸 イブプロフェン(＊＊) ＣＯＯＨ−イブプロフェン(＊＊) ＯＨ−イブプロフェン(＊＊) イミノスチルベン イミプラミン インドール−３−酢酸 インドール−３−酪酸 インドメタシン イプロニアジド イソプロテレノール イソクスプリン ケタミン ケトプロフェン ラベタロール レバロルファン レボルファノール レボチロキシン リドカイン ロペラミド ロラタジン ロラゼパム ロクサピン ＬＳＤ マプロチリン メフェナム酸 メラニン メペリジン メフェニトイン メピバカイン メプロバメート メスカリン メタドン メタドン一次代謝産物 d−メタンフェタミン d,l−メタンフェタミン メタピリレン メタクワロン メトカルバモール メトトリメプラジン メトキシフェナミン メトキシプロマジン メトスクシミド ４−メチル−２,５−ジメトキシ ３,４−メチレンジオキシアンフェタミ アンフェタミン(ＤＯＭ) ン(ＭＤＡ) ３,４−メチレンジオキシ−Ｎ− ３,４−メチレンジオキシ−メタンフェ エチルアンフェタミン(ＭＤＥ) タミン(ＭＤＭＡ) メチルフェニデート メチプリロン メトクロプラミド メトプロロール メトロニダゾール ６−モノアセチルモルヒネ モノエチルグリシンキシリジド モルヒネ (ＭＥＧＸ) モルヒネ−３β−Ｄ−グルクロニド ナフシリン ナルブフィン ナロルフィン ナロキソン ナルトレキソン ナファゾリン ナプロキセン(＊) ニコチンアミド ニコチン ニコチン酸 ニフェジピン p−ニトロフェノール ノミフェンシン ノルクロリアゼポキシド Ｎ−ノルコデイン ノルドキセピン ノルエチンドロン Ｎ−ノルモルヒネ Ｎ−ノルオキシモルホン Ｎ−ノルプロポキシフェン ノルトロポキシフェン ノルトリプチリン シス−10−ＯＨ−ノルトリプチリン トランス−10−ＯＨ−ノルトリプチ ニリドリン リン オクトパミン オピプラモール オロチン酸 オルフェナドリン オキサゼパム オキシコドン オキシメタゾリン オキシモルホン オキシフェンブタゾン パーネート ペモリン ペニシリンＧ ペンタゾシン フェナセチン フェンシクリジン ４−ＯＨピップフェンシクリジン １−フェンシクロヘキシルアミン フェンジメトラジン フェネルジン フェネチルアミン フェンホルミン フェニラミン フェンメトラジン フェノチアジン フェンテルミン フェニルブタゾン フェニルプロパノールアミン フェニルトロキサミン フェニトイン ピセナドール ピペラセタジン １−ピペラジノシクロヘキシフェン ピロキシカム 塩化カリウム プラゾシン プレドニゾロン プレドニゾン プレグネノロン プリロカイン プロベネシド プロカインアミド プロカイン プロクロルペラジン プロゲステロン プロリンタン プロマジン プロメタジン プロポキシフェン プロプラノロール プロピルヘキセドリン プロトリプチリン プソイドエフェドリン ピリラミン キニジン キニン ラニチジン サリチル酸 スコポラミン セロトニン ストリキニン スドキシカム スルファメタジン スルファメトキサゾール スルファチアゾール スリンダク テルブタリン テストステロン テトラカイン テトラサイクリン １１−ノル−デルタ−９−テトラヒドロ カンナビノール−９−カルボン酸(＊＊＊) テトラヒドロコルチゾン テトラヒドロゾリン テバイン テニルジアミン テオフィリン チオプロパゼート チオリダジン チオチキセン トルブタミド トラゾドン トリアムテレン トリフルオペラジン トリフルプロマジン トリヘキスフェニジル トリメトプリム トリミプラミン トリペレナミン トリプロリジン トロパ酸 トロピン トリプタミン チラミン 尿酸 ワルファリン ゾメピラック ＊) ５００μg／mlで試験 ＊＊) １０００μg／mlで試験 ＊＊＊) １０μg／mlで試験

【０１５７】本発明方法の他の利点は、尿中に普通に検
出される化合物による干渉が無いことである。本発明の
検定法(トレーサーは前記式[５]の構造を有し、抗体は
前記式[２８]の構造を持つ免疫抗原に対して産生する)
では、正常なヒトのバルビツレート含有尿へ薬物を添加
したとき、該添加薬物(下記表７に記載の濃度の化合物
で、尿に普通に検出され、かつ本発明の検定法の如き全
ての免疫学的検定法を干渉する能力を有し、このため、
潜在的に検定法の結果を不正確にする化合物)の検出誤
差が１０％以下である。本発明の検定法の最も好ましい
具体例(トレーサーは前記式[３０]の構造を有し、抗体
は前記式[２９]の構造を持つ免疫抗原に対して産生す
る)は、尿に普通に検出される化合物による干渉が同様
に無くなることを明らかにした。

【０１５８】 表７ 化合物 試験濃度 アセトン １.０ g／dＬ アスコルビン酸 １.５ g／dＬ ビリルビン ０.２５０mg／dＬ クリアチニン ５００.０mg／dＬ エタノール １.０ g／dＬ グルコース ２.０ g／dＬ ＮaＣl ６.０ g／dＬ シュウ酸 １００.０mg／dＬ プロティン ０.０５ g／dＬ リボフラビン ７.５mg／dＬ 溶解赤血球 １１５.０mg／dＬ (Ｈgb 濃度) 尿素 ６.０ g／dＬ

【０１５９】本発明方法の他の利点は、各試料間(１つ
の試料から他の試料へ)の薬物から生じるキャリオーバ
ーが少ないことである。前記式[５]の構造を有するトレ
ーサーおよび前記式[２８]の構造を持つ免疫抗原に対し
て産生する抗体を用い、アボット・ラボラトリーズのＡ
Ｄxドラッグス・オブ・アブュース・システムで１１９
５μg／mlの正常なヒトの尿中のセコバルビタール溶液
を検定し、次いでクリニカル・アナライザーの同じキャ
ロウセル(carousel)で正常なヒトの無薬物尿の試料を検
定した後、下記数式からキャリオーバーを算出した。 無薬物尿中に検出されるセコバルビタールの測定濃度 キャリオーバー率(％)＝ セコバルビタール溶液の濃度 ×１００

【０１６０】キャリオーバーを測定したところ、０．０
２％以下であった。前記式[３０]の構造を有するトレー
サーおよび前記式[２９]の構造を持つ免疫抗原に対して
産生する抗体を用い、５００μg／mlの正常なヒトの尿
中のセコバルビタール溶液を検定した後、同様にキャリ
オーバーを測定したところ、０．０３％以下であった。

【０１６１】さらに、本発明方法の他の利点は、薬物測
定の正確さである。本発明の、前記式[５]の構造を有す
るトレーサーおよび前記式[２８]の構造を持つ免疫抗原
に対して産生する抗体を用いる検定法の正確さも、極め
て好都合のものであった。検定法の再現性は、２週間に
及ぶ１３回の検定操作において、４つの複製をそれぞれ
正常なヒトの尿中の０．４、０．６および１．０μg／m
lのセコバルビタールで検定することにより判断した。
各複製の濃度は、実験の１日目のシングルでの標準曲線
操作から判定した。これらの実験の結果として、たとえ
ば変動率は６％以下であった。代表的データを下記表８
(a)に示す。

【０１６２】 表８(a) 濃度(μg／mＬ) 標的値(n＝５２) ０.４ ０.６ １.００ 平均 ０.４１ ０.６０ １.００ 操作内の標準偏差 ０.０２ ０.０２ ０.０３ 操作内の変動率(％) ５.１０ ２.９５ ３.０５ 操作間の標準偏差 ０.０２ ０.０２ ０.０４ 操作間の変動率(％) ５.２８ ３.４８ ３.８３

【０１６３】前記式[３０]の構造を有するトレーサーお
よび前記式[２９]の構造を持つ免疫抗原に対して産生す
る抗体を用いる検定法の再現性は、２週間に及ぶ１０回
の検定操作において、５つの複製をそれぞれ正常なヒト
の尿中３００、８００および１５００ng／mlのセコバル
ビタールで検定することにより判断した。これらの実験
結果として、たとえば変動率は７％以下であった。代表
的データを下記表８(b)に示す。

【０１６４】 表８(b) 濃度(μg／mＬ) 標的値(n＝５０) 300 800 1500 平均 286.31 804.77 1448.04 操作内の標準偏差 8.41 37.88 37.99 操作内の変動率(％) 2.94 4.71 2.62 操作間の標準偏差 17.73 40.83 45.12 操作間の変動率(％) 6.19 5.07 3.12

【０１６５】加えて、両組合せおよびパネルモードの３
つの複製において、乱用薬物検定用のアボット・ラボラ
トリーズのＡＤxシステムズ・マルチコンスチチューエ
ント・ロウ・コントロールを操作することにより、正確
さを測定した。代表的データを下記表９(a)(トレーサー
は前記式[５]の構造を有し、抗体は前記式[２８]の構造
を持つ免疫抗原に対して産生する)および表９(b)(トレ
ーサーは前記式[３０]の構造を有し、抗体は前記式[２
９]の構造を持つ免疫抗原に対して産生する)に示す。

【０１６６】 表９(a) 濃度(μg／mＬ) 標的値(n＝５４) ０.６ 平均 ０.５９ 操作内の標準偏差 ０.０３ 操作内の変動率(％) ４.５１ 操作間の標準偏差 ０.０３ 操作間の変動率(％) ４.７３

【０１６７】 表９(b) 濃度(μg／mＬ) 標的値(n＝５４) ３００ 平均 ２７３ 操作内の標準偏差 １６.８８ 操作内の変動率(％) ６.１８ 操作間の標準偏差 １６.９０ 操作間の変動率(％) ６.１９

【０１６８】さらに、本発明方法の利点は検定法の正確
さである。本発明の検定法の回復の正確さは、正常なヒ
トの尿および希釈緩衝剤に、既知量のセコバルビタール
を表１０(a)では０．２、０．４、０．７、１．２およ
び２．０μg／mlのレベルまで、また表１０(b)では２０
０、４００、７００、１２００および２０００ng／mlの
レベルまで加えて、２組のキャリブレータを調製するこ
とによって判定した。尿キャリブレータを用いてキャリ
ブレーションを行い、このキャリブレーションに対し、
アボット・ラボラトリーズのＴＤxクリニカル・アナラ
イザーで２組のキャリブレータを検定した。回復率は、
下記数式に従って算出した。 代表的データを下記表１０(a)(トレーサーは前記式
[５]の構造を有し、抗体は前記式[２８]の構造を持つ免
疫抗原に対して産生する)および表１０(b)(トレーサー
は前記式[３０]の構造を有し、抗体は前記式[２９]の構
造を持つ免疫抗原に対して産生する)に示す。

【０１６９】 表１０(a) 標的濃度 緩衝剤中の濃度 尿中の濃度 回復率 (μg／mＬ) (μg／mＬ) (μg／mＬ) ０.２ ０.１８ ０.２０ １１１.１ ０.４ ０.３８ ０.４１ １０７.９ ０.７ ０.６９ ０.７２ １０４.４ １.２ １.１６ １.２２ １０５.２ ２.０ １.９６ ２.０２ １０３.１ 平均回復率＝１０６.３±３.２％

【０１７０】 表１０(a) 標的濃度 緩衝剤中の濃度 尿中の濃度 回復率 (μg／mＬ) (μg／mＬ) (μg／mＬ) ２００ １８５ ２００ ９２.５ ４００ ３９８ ４１２ ９６.６ ７００ ６９９ ６９２ １０１.０ １２００ １２３１ １２５６ ９８.０ ２０００ ２０４７ ２０６８ ９９.０ 平均回復率＝９７.１±２.５％

【０１７１】また本発明の検定法を以下の方法により、
他のバルビツレートの検出法、たとえばガスクロマトグ
ラフィー(ＧＣ)／マススペクトロ(ＭＳ)、同位元素標識
免疫定量法(ＲＩＡ)およびＥＭＩＴ(登録商標)と比較し
た。すなわち、この比較で無薬物尿検体とバルビツレー
ト含有尿検体とバルビツール代謝産物を検定した。代表
的データを下記表１１(a)(トレーサーは前記式[５]の構
造を有し、抗体は前記式[２８]の構造を持つ免疫抗原に
対して産生する)、表１１(b)(トレーサーは前記式[３
０]の構造を有し、抗体は前記式[２９]の構造を持つ免
疫抗原に対して産生する。ＥＭＩＴと比較)、および表
１１(c)(トレーサーは前記式[３０]の構造を有し、抗体
を前記式[２９]の構造を持つ免疫抗原に対して産生す
る。ＲＩＡと比較)に示す。

【０１７２】 表１１（ａ） 試料タイプ 試料の数 本発明 試験法（ＧＣ／ＭＳ） ＥＭＩＴ／
d.a.u. (Pos/Neg) (Pos/Neg) (Pos/Neg) ＞ 0.50μg／mL 149 149/0 149/0 149/0

【０１７３】 表１１(b) 試料タイプ 試料の数 ＴＤx ＡＤx ＥＭＩＴ ＧＣ／ＭＳ (Ｎ) (Pos/Neg) (Pos/Neg) (Pos/Neg) (Pos/Neg) ＜200ng／mL 128 0/128 0/128 0/128 2¹, ²/0＞ 200ng／mL 101 101/0 101/0 100/1 99/2³, ⁴ 試料No． TDx ADx EMIT GC/MS 同定化合物 ng／mL ng／mL Pos/Neg ng／mL 1 110.62 73 POS 226 フェノバルビタール 2 156.69 150 NEG 230 フェノバルビタール 3 1911.93 高 POS 0 グルテチミド 4 245.13 283 NEG 193 フェノバルビタール

【０１７４】 表１１(c) 試料タイプ 試料の数 ＴＤx ＡＤx ＲＩＡ ＧＣ／ＭＳ (Ｎ) (Pos/Neg) (Pos/Neg) (Pos/Neg) (Pos/Neg) ＜200ng／mL 108 0/108 1¹/107 0/108 2¹, ²/9＞ 200ng／mL 91 91/0 91/0 78/13 97 NT, 91/0 試料No． TDx ADx RIA GC/MS 同定化合物 ng／mL ng／mL Pos/Neg ng／mL 1 184.13 203 NEG 202 フェノバルビタール 2 125.00 127 NEG 207 フェノバルビタール

【０１７５】本発明について上述の如く個々の場合につ
いて説明したが、当業者であれば本発明の精神に即して
多くの改変や変更を適宜に成しうるであろう。これらの
改変や変更は、特許請求の範囲および発明の詳細な説明
に基づく技術的範囲に属するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｄ 405/12 Ｃ０７Ｄ 405/12 Ｇ０１Ｎ 33/536 Ｇ０１Ｎ 33/536 Ｄ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ (72)発明者 ルイス・エイ・カンタレロ アメリカ合衆国60060イリノイ州マンデ レイン、ダンレア・ドライブ1319番 (72)発明者 ロバート・エドワード・ダブラー アメリカ合衆国60031イリノイ州ガーニ ー、アデレ・ドライブ5041番 (72)発明者 ジョナサン・グロウト アメリカ合衆国60030イリノイ州グレイ スレイク、ダーハム・レイン753番 (72)発明者 パトリック・エフ・ジョナス アメリカ合衆国60085イリノイ州ワウク ガン、アレキサンダー・コート1608番 (72)発明者 ジェイン・アン・ネルソン アメリカ合衆国60074イリノイ州パラテ ィン、コンスティテューション・ドライ ブ３、623番 (56)参考文献 特開 昭58−113189（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−150680（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−14064（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/533 G01N 33/536 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式： 【化１】 (式中、Ｗは酸素または硫黄; Ｒ¹は直鎖または分枝鎖状に配列され、かつ１個以下の
   脂肪族または芳香族環構造を持ち、トータル１〜１２個
   の炭素原子および０〜１個のハロゲン原子を有する、ア
   ルキル、アルケニル、アリール、またはアルキニル基; Ｒ³はＲ⁴−Ｆl; Ｆlはフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体;およ
   びＲ⁴は(a)直鎖または分枝鎖状に配列され、かつ１個以
   下の脂肪族または芳香族環構造を持ち、炭素原子および
   Ｏ、Ｎ、Ｓ、ＰまたはＦのヘテロ原子をトータルで０〜
   １５個有する結合基、または(b)トータル０〜５個のヘ
   テロ原子を有する結合基である)で示されるトレーサ
   ー。
2. 【請求項２】 Ｒ¹がトータル２〜７個の炭素原子を有
   するアルキル基、およびＲ⁴が炭素原子およびヘテロ原
   子をトータルで０〜１０個有する結合基である請求項１
   に記載のトレーサー。
3. 【請求項３】 式、 【化２】 で示される請求項１に記載のトレーサー。
4. 【請求項４】 式、 【化３】 で示される請求項１に記載のトレーサー。
5. 【請求項５】 生物学的流体中のバルビツレートの存在
   もしくはその量を測定する方法であって、 (Ａ)試料を、式: 【化４】 (式中、Ｗは酸素または硫黄; Ｒ¹は１個以下の脂肪族または芳香族環構造を持ち、ト
   ータル１〜１２個の炭素原子および０〜１個のハロゲン
   原子を有する、アルキル、アルケニル、アリール、また
   はアルキニル基; Ｒ²はＲ−Ｑ; Ｑはポリ(アミノ酸)、ポリ(アミノ酸)誘導体、または他
   の免疫抗原的に活性な担体;および Ｏ ‖ Ｒは(a)末端にＱに結合する−ＣＨ₂−、−ＣＨ＝、−Ｃ−または−ＮＨ−を有 する結合基、(b)直鎖または分枝鎖状に配列され、かつ
   １個以下の脂肪族または芳香族環構造を持ち、炭素原子
   およびＯ、Ｎ、Ｓ、ＰまたはＦのヘテロ原子をトータル
   で０〜２０個有する結合基、または(ｃ)トータル０〜７
   個のヘテロ原子を有する結合基である)の免疫抗原に対
   して産生する単クローン性または多クローン性抗体を含
   有するバルビツレート抗血清と、およびバルビツレート
   抗血清の存在に対して検知しうる蛍光偏光応答をもたら
   すことができる、請求項１に記載のトレーサー化合物と
   接触せしめ、 (Ｂ)工程(Ａ)から得られる溶液に平面偏光を通して、蛍
   光偏光応答を得、次いで (Ｃ)工程(Ｂ)の溶液の蛍光偏光応答を、試料中のバルビ
   ツレートの存在もしくはその量の測度として検出するこ
   とを特徴とするバルビツレートの測定法。
6. 【請求項６】 抗体が式: 【化５】 の免疫抗原に対して産生する請求項５に記載の測定法。
7. 【請求項７】 トレーサー化合物が式: 【化６】 の化合物である請求項５に記載の測定法。
8. 【請求項８】 トレーサー化合物が式： 【化７】 の化合物である請求項６に記載の測定法。
9. 【請求項９】 生物学的流体中のバルビツレートの存在
   もしくはその量を測定する試薬キットであって、 (Ａ)請求項１に記載のトレーサー、および (Ｂ)式: 【化８】 (式中、Ｗは酸素または硫黄; Ｒ¹は１個以下の脂肪族または芳香族環構造を持ち、ト
   ータル１〜１２個の炭素原子および０〜１個のハロゲン
   原子を有する、アルキル、アルケニル、アリール、また
   はアルキニル基; Ｒ²はＲ−Ｑ; Ｑはポリ(アミノ酸)、ポリ(アミノ酸)誘導体、または他
   の免疫抗原的に活性な担体;および Ｏ ‖ Ｒは(a)末端にＱに結合する−ＣＨ₂−、−ＣＨ＝、−Ｃ−または−ＮＨ−を有 する結合基、(b)直鎖または分枝鎖状に配列され、かつ
   １個以下の脂肪族または芳香族環構造を持ち、炭素原子
   およびＯ、Ｎ、Ｓ、ＰまたはＦのヘテロ原子をトータル
   で０〜２０個有する結合基、または(ｃ)トータル０〜７
   個のヘテロ原子を有する結合基である)の免疫抗原に対
   して産生する単クローン性または多クローン性抗体を包
   含することを特徴とする試薬キット。
10. 【請求項１０】 リボフラビンによる蛍光干渉を減少さ
    せるのに有効量のリボフラビン結合プロテインをさらに
    包含する請求項９に記載の試薬キット。
11. 【請求項１１】 抗体が式: 【化９】 の免疫抗原に対して産生する請求項９または１０に記載
    の試薬キット。
12. 【請求項１２】 トレーサーが式: 【化１０】 のトレーサーである請求項９または１０に記載の試薬キ
    ット。