JP3088438B2 - Rice waxy sequence and method for improving endosperm component of rice seed using the same - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、イネのデンプン合成酵素の遺伝子およびこ
れを用いたイネ穀粒中のデンプンの質的向上を得る方法
に関するものである。Description: FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a rice starch synthase gene and a method for improving the quality of starch in rice grain using the same.

本発明のイネ・ワキシイ（waxy）配列を用いてアンチ
センス遺伝子はイネで有効に発現し、穀粒中のデンプン
合成を抑制することができるため、穀粒に含まれるデン
プンのアミロース含量を任意に変化させることが可能と
なり、米の食味性の著しい向上、あるいはモチ性の品種
の作出を可能にするものである。さらに、遺伝子の相同
性置換を利用してワキシイ（waxy）遺伝子の直接的改変
をも可能にするものである。The antisense gene can be effectively expressed in rice using the rice / waxy sequence of the present invention and can suppress the synthesis of starch in grains, so that the amylose content of starch contained in grains can be arbitrarily adjusted. This makes it possible to remarkably improve the palatability of rice or to produce a rice cultivar. In addition, it allows direct modification of the waxy gene using homologous substitution of the gene.

また、本発明は、このようにして形質転換されたイネ
自体にも関するものである。The present invention also relates to the rice transformed in this way.

（従来技術及び問題点） デンプンは光合成の最終産物である。それゆえ、デン
プンの生合成に関する研究は、植物生理、生化学におけ
る重要な研究課題の１つであるが、この生合成に関する
研究はあまり進んでいない。(Prior art and problems) Starch is the end product of photosynthesis. Therefore, research on starch biosynthesis is one of the important research subjects in plant physiology and biochemistry, but research on this biosynthesis has not progressed much.

デンプンはグルコースがα（１→４）結合した直鎖形
のアミロースと、α（１→６）結合による枝分れ構造を
もつアミロペクチンから構成されている。植物における
デンプン顆粒中のアミロース、アミロペクチンの含量比
は、植物種や品種によってそれぞれ固有の値をもってお
り、その高次構造もまた特有の形態をとっていることが
知られている。デンプン生合成の主酵素であるデンプン
合成酵素は、ADPグルコースあるいはUDPグルコースを基
質とし、アミロース分子の合成を行なう。これに対し、
アミロペクチン分子は、α（１→４）結合をつくるデン
プン合成酵素と、α（１→６）結合をつくるブランチン
グ（枝分れ）酵素が協調的に作用することによってつく
られる。アミロペクチンの枝分れ構造の形成機構に関す
る研究は、グリコーゲンでの枝分かれの機構の研究を参
考にして進められ、植物においてもグリコーゲンのブラ
ンチング酵素とよく似た性質の酵素が見つけられてい
る。Starch is composed of linear amylose having α (1 → 4) linkage of glucose and amylopectin having a branched structure by α (1 → 6) linkage. It is known that the content ratio of amylose and amylopectin in starch granules in plants has a specific value depending on the plant species and cultivar, and the higher-order structure also has a specific form. Starch synthase, which is the main enzyme of starch biosynthesis, synthesizes amylose molecules using ADP glucose or UDP glucose as a substrate. In contrast,
The amylopectin molecule is formed by the cooperative action of a starch synthase that forms an α (1 → 4) bond and a branching enzyme that forms an α (1 → 6) bond. Studies on the mechanism of the formation of the branched structure of amylopectin have been conducted with reference to studies on the mechanism of branching with glycogen. In plants, enzymes having properties similar to those of glycogen branching enzymes have been found.

植物における貯蔵デンプンの生合成機構はデンプン合
成酵素の発見以来、植物生理・生化学の分野でかなり解
明が進められている。しかし、その遺伝的調節機構につ
いてはまだ不明な部分が多い。The mechanism of biosynthesis of stored starch in plants has been considerably elucidated in the field of plant physiology and biochemistry since the discovery of starch synthase. However, the genetic regulatory mechanism remains largely unknown.

コメのアミロース含量は第６染色体に座位するモチ性
遺伝子座の遺伝子ワキシイ（waxy）に関係していると考
えられている。この遺伝子産物として、ウルチ性品種の
胚乳では分子量約60,000ダルトンのWx蛋白が生産される
（Sano;Theor.Appl.Genet.,68,467（1984））。胚乳中
のアミロース含量はこの蛋白の量に比例する。すなわち
このWx蛋白が多く存在するほどアミロース含量が高い
（Sano et al.;Euphytica,35,1（1986））。なお、モチ
性品種の胚乳ではWx蛋白質が認められず、アミロースも
生産されない。モチ性を決める遺伝子はこの他に多くの
ものの存在が示唆されているが、分子生物学的にはほと
んどわかっていない。トウモロコシでの遺伝子解析の結
果では、Wx蛋白はUDPグルコースグリコシル転移酵素で
あり、ワキシイはこの構造遺伝子であろうと考えられて
いる（Kloesgen et al.;Mol.Gen.Genet.,203,237（198
6））。The amylose content of rice is thought to be related to the waxy locus gene waxy located on chromosome 6. As this gene product, Wx protein having a molecular weight of about 60,000 daltons is produced in the endosperm of the wurtching variety (Sano; Theor. Appl. Genet., 68 , 467 (1984)). Amylose content in endosperm is proportional to the amount of this protein. That is, the more the Wx protein is present, the higher the amylose content (Sano et al .; Euphytica, 35 , 1 (1986)). In the endosperm of waxy varieties, Wx protein is not found and amylose is not produced. Although there are many other genes that determine motiness, little is known about the molecular biology. The results of genetic analysis in corn, Wx protein is UDP-glucose glycosyl transferase, Wakishii is believed that it would be the structural gene (Kloesgen et al;.. Mol.Gen.Genet , 203, 237 (198
6)).

穀類は我々にとって主要なカロリー供給源であり、か
つ脂質やタンパク質の重要な摂取源である。したがっ
て、穀類胚乳貯蔵成分の質的・量的改良は主要な育種目
種となっている。この目的達成のために穀類胚乳中の貯
蔵成分に関する遺伝資源の探索・収集とその遺伝・育種
学的評価が必要である。トウモロコシでは胚乳成分に関
する多様な遺伝的変異（突然変異）が見出されており、
それらはトウモロコシの品質改良に重要な役割を果たし
ている。さらに、これらの突然変異は生体内での遺伝的
制御機構の解明を行なう際の貴重な情報となる。Cereals are a major source of calories for us and an important source of lipids and proteins. Therefore, qualitative and quantitative improvement of cereal endosperm storage components is a major breeding species. To achieve this goal, it is necessary to search and collect genetic resources for storage components in cereal endosperm and to evaluate their genetic and breeding properties. In maize, various genetic mutations (mutations) related to the endosperm component have been found,
They play an important role in improving corn quality. Furthermore, these mutations provide valuable information for elucidating the genetic control mechanisms in vivo.

イネは粒食が主体であり、胚乳デンプン中の多糖類の
含有比率やデンプンの構造的変化が、コメの食味や調理
特性を大きく変える。とくにデンプン中のアミロース含
量は食味と密接な関係が指摘されており、低アミロース
品種の食味評価が高い。それゆえ、コメの食味改善には
胚乳デンプンの低アミロース化が有効である。Rice is predominantly granulated, and the content ratio of polysaccharide in endosperm starch and the structural change of starch greatly change the taste and cooking characteristics of rice. In particular, it has been pointed out that the amylose content in starch is closely related to taste, and the evaluation of taste of low amylose varieties is high. Therefore, it is effective to reduce endosperm starch amylose to improve the taste of rice.

しかしながら、このような低アミロース品種を自然界
から発見することは極めて困難であるし、これを突然変
異処理によって得ることも非常に困難である。まして
や、アミロース含量をコントロールすること等にいたっ
ては、このような従来から行われている育種技術では不
可能といっても過言ではない位である。However, it is extremely difficult to find such low amylose varieties from nature, and it is also very difficult to obtain them by mutation. Moreover, it is not an exaggeration to say that it is impossible to control the amylose content with such conventional breeding techniques.

（問題点を解決するための手段） 本発明は、このような技術の現状に鑑み、低アミロー
ス品種ないしアミロース含量を所望に応じてコントロー
ルできる品種の創製を目的としてなされたものである
が、従来法には全くとらわれることなく発想の大転換を
行い、その結果、イネのアミロース含量を決定づける遺
伝子を単離同定し、これを用いた遺伝子工学的手法によ
る品種改良によって、所期の目的を達成することとし
た。(Means for Solving the Problems) In view of the current state of the art, the present invention has been made for the purpose of creating a low amylose variety or a variety whose amylose content can be controlled as desired. A major change in thinking without being bound by the law at all, as a result, the gene that determines the amylose content of rice is isolated and identified, and the intended purpose is achieved by breeding using genetic engineering techniques using this. I decided that.

トウモロコシとオオムギのワキシイ遺伝子がすでにク
ローニングされ、塩基配列が明らかにされており（Kloe
sgen et al.;Mol.Gen.Genet.,203,237（1986）、Rohde
et al.;Nucl.Acids Res.,16,7185（1988））、この塩
基配列はEMBLデータベースより入手可能である。しかし
ながら、イネのワキシイ遺伝子の構造はこれらの塩基配
列よりある程度の推定はなされていたが、いまだその正
確な構造が明らかでなかった。本発明者らは、最近開発
され、その有用性が大きく取り上げられているPCR（pol
ymerase chain reaction）（Saiki et al.;Science 23
9,487（1988））に着目し、この技術を用いて、イネ・
ワキシイ遺伝子のクローニングの検討を行った。The maize and barley waxy genes have been cloned and sequenced (Kloe
sgen et al .; Mol. Gen. Genet., 203 , 237 (1986), Rohde
et al .; Nucl. Acids Res., 16 , 7185 (1988)), and this nucleotide sequence is available from the EMBL database. However, although the structure of the rice waxy gene has been deduced to some extent from these nucleotide sequences, the exact structure has not yet been clarified. The present inventors have recently developed a PCR (pol
ymerase chain reaction) (Saiki et al .; Science 23
9 , 487 (1988)), and using this technology,
The cloning of the waxy gene was examined.

PCRは２つの相向かい合うプライマーDNAを用い、この
あいだの配列をDNAポリメラーゼによって何度も合成を
繰り返すことにより、特定の領域の配列のみを高度に増
幅する技術である。PCRはDNA鎖の熱変性、プライマーと
のアニーリング、ポリメラーゼによる伸長反応を繰り返
し行うことによって、特定の断片を増幅することができ
る。温度変化を繰り返すためにDNAポリメラーゼは好熱
性のものを用いる。通常の反応系では、熱変性は94℃で
行ない、アニーリングは37℃から60℃で、ポリメラーゼ
反応は72℃で行なう。PCR is a technique in which two opposing primer DNAs are used and the sequence between them is repeatedly synthesized by a DNA polymerase many times to amplify only the sequence of a specific region to a high degree. In PCR, a specific fragment can be amplified by repeatedly performing heat denaturation of a DNA strand, annealing with a primer, and extension reaction with a polymerase. In order to repeat the temperature change, a thermophilic DNA polymerase is used. In a typical reaction system, heat denaturation is performed at 94 ° C., annealing is performed at 37 ° C. to 60 ° C., and polymerase reaction is performed at 72 ° C.

トウモロコシとオオムギのワキシイ遺伝子の塩基配列
を比較したところ両者の配列はエキソン領域において良
い相同性を示した。PCRを用いて、ある領域の配列を増
幅するためにはプライマー配列が標的のDNA配列とうま
くパイブリダイズすることが必要である。プライマーと
の相同性が低いDNAを標的とした場合でもプライマー配
列がうまくハイブリダイズすることができれば、PCRは
うまく進み、目的とする領域の増幅に成功する。このよ
うなプライマーが標的DNAと何とかバイブリダイズする
ためには原理的にはアニーリングの温度を加減すればよ
い。しかし、プライマーとして正常に機能させ、DNAポ
リメラーゼ反応を進めるためにはプライマーの３′端領
域の配列が標的DNAと完全に密着する構造でなければな
らない。Comparison of the nucleotide sequences of the maize and barley waxy genes showed that both sequences showed good homology in the exon region. In order to amplify the sequence in a certain region using PCR, it is necessary that the primer sequence be successfully hybridized with the target DNA sequence. Even when a DNA having low homology with the primer is targeted, if the primer sequence can be successfully hybridized, the PCR proceeds successfully and the target region is successfully amplified. In order for such a primer to somehow hybridize with the target DNA, the annealing temperature may be adjusted in principle. However, in order for the primer to function normally and to proceed with the DNA polymerase reaction, the sequence of the 3'-end region of the primer must have a structure that is completely adhered to the target DNA.

そこで、本発明ではトウモロコシやオオムギなどの異
種の植物のワキシイの塩基配列をもとにしてイネ・ワキ
シイ配列を推定し、これをもとにPCRのプライマーのDNA
を合成し、これ用いてPCRを行なうことにより、きわめ
て効率的に目的とするイネのワキシイ遺伝子を得た。Therefore, in the present invention, a rice waxy sequence is estimated based on the waxy base sequence of heterologous plants such as corn and barley, and the DNA
Was synthesized and PCR was performed using the same to obtain the desired rice waxy gene very efficiently.

本発明によって最初に得られたワキシイ遺伝子の断片
はイネのワキシイ遺伝子の全長を含んではいない。また
単離された３種の断片はそれぞれが塩基配列に一部相違
があった。これはPCRを行なった際のポリメラーゼ反応
の途中で点変異が起きやすいことによる。しかし、これ
らの配列を比較することによって本来のイネゲノムに存
在しているワキシイ遺伝子の配列は容易に推定された。
そこでこの相違点は部位特異的置換（Zoller and Smit
h;Methods in Enzymol.,100.468（1983））によって修
正がなされた。The waxy gene fragment initially obtained according to the present invention does not include the full length of the rice waxy gene. In addition, each of the three isolated fragments had a partial difference in base sequence. This is due to the fact that point mutation is likely to occur during the polymerase reaction during PCR. However, by comparing these sequences, the sequence of the waxy gene existing in the original rice genome was easily deduced.
Therefore, this difference is due to site-specific substitution (Zoller and Smit
h;. Methods in Enzymol, fixes were made by 100.468 (1983)).

特定の遺伝子をクローン化することができた場合、こ
れの逆鎖DNA塩基配列を用いて適用なプロモーター配列
と結合し、アンチセンス遺伝子とすることができる。こ
れを植物体に導入することによってアンチセンスRNAを
発現させ、これによって、特定の遺伝子の発現制御を行
なうことが可能となり、これによる実験例もいくつか報
告されている（Smith et al.;Nature,334,724（1988）,
Krol et al.;Gene,72,45（1988）。When a specific gene can be cloned, it can be used as an antisense gene by binding to an applicable promoter sequence using the reverse DNA base sequence. By introducing this into a plant, it is possible to express an antisense RNA, and thereby it becomes possible to control the expression of a specific gene, and there have been several experimental examples based on this (Smith et al .; Nature). , 334, 724 (1988),
Krol et al .; Gene, 72 , 45 (1988).

本発明によれば、本発明によってクローン化するのに
成功したイネ・ワキシイ遺伝子を用い、上記したアンチ
センス法を利用して、これをプロモーター配列と本来と
は逆方向に結合し、アンチセンス遺伝子とすることがで
きる。このアンチセンス遺伝子をイネ植物体に導入する
ことによってアンチセンスRNAを発現させ、これにより
イネ・ワキシイ遺伝子の発現をコントロールすることが
できる。According to the present invention, the rice waxy gene successfully cloned according to the present invention is used, and by using the antisense method described above, it is ligated to the promoter sequence in the reverse direction to the original, and the antisense gene It can be. By introducing this antisense gene into a rice plant, antisense RNA is expressed, whereby the expression of the rice waxy gene can be controlled.

したがって本発明によってはじめて、イネ穀粒中のデ
ンプンのアミロース含量を低減ないしゼロとしたイネの
育種が可能となったのである。したがって本発明によれ
ば、用いるプロモーター配列を換えることにより、アミ
ロース含量を任意の値に変化させることができ、例え
ば、ウルチ性多収品種をモチ性多収品種に交換したり、
ウルチ性品種のアミロース含量を抑え、低アミロース含
量の高品質のコメを生産することが可能となる。Therefore, for the first time according to the present invention, rice breeding with reduced or no amylose content of starch in rice grain has been made possible. Therefore, according to the present invention, the amylose content can be changed to an arbitrary value by changing the promoter sequence to be used.
It is possible to suppress the amylose content of the ultivar variety and produce high-quality rice with a low amylose content.

もちろん、各種のアンチセンス遺伝子の作成も可能で
あるので、上記したプロモーター配列の選択とも相まっ
て、この方法によってもアミロース含量が異なる各種の
イネを育種することができる。Of course, since various antisense genes can be prepared, various rice plants having different amylose contents can be bred by this method in combination with the selection of the promoter sequence described above.

本発明によって調製したアンチセンス遺伝子は、プラ
スミドと結合した後、エレクトロポーレーション法等常
法にしたがってイネのプロトプラストに導入し、得られ
た細胞をイネ植物体に再生すればよい。このようにし
て、アミロースを生成しないイネを栽培したり、アミロ
ースの生成量を自由にコントロールしたりすることがで
きる。After binding the antisense gene prepared according to the present invention to a plasmid, the antisense gene may be introduced into rice protoplasts by a conventional method such as electroporation, and the resulting cells may be regenerated into rice plants. In this way, it is possible to cultivate rice that does not produce amylose, and to freely control the amount of amylose produced.

これとは逆に、所望するのであれば、本発明に係るイ
ネのワキシイ遺伝子を用いてイネを形質転換することに
よってアミロース含量の高いコメを得ることができるこ
とは当然のことである。Conversely, if desired, it is natural that rice having a high amylose content can be obtained by transforming rice using the rice waxy gene of the present invention.

なお、本発明で得られた塩基配列は相互の間で、いく
つかの点で塩基置換による配列の相違が生じている。こ
れはPCRを行なった際に、偶然に生じたものであるが、
イネ・ワキシイ遺伝子に対するアンチセンス遺伝子を生
成した場合には、このような変化はこの効力になんら問
題を与えなかった。従って、この配列の一部を改変した
ものについても同等の効果を持つものと容易に推定され
る。さらに、この断片はイネ・ワキシイ遺伝子全体をク
ローン化する際に用いるプローブDNAとして非常に有効
である。また、このワキシイ遺伝子の一部を改変した
後、これをイネ植物体に再び導入することによって、イ
ネ・ワキシイ遺伝子の改造をも可能にするものである。The base sequences obtained in the present invention differ from each other in sequence at some points due to base substitution. This occurred accidentally when PCR was performed,
When an antisense gene to the rice waxy gene was generated, such a change did not pose any problem to this potency. Therefore, it is easily presumed that a partially modified sequence has the same effect. Furthermore, this fragment is very effective as a probe DNA used for cloning the whole rice waxy gene. In addition, by modifying a part of the waxy gene, it is re-introduced into a rice plant to enable the rice waxy gene to be remodeled.

以下、本発明を実施例によって更に詳述する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples.

実施例１ （１）PCRプライマーの合成 本発明において得ようとするイネのワキシイ遺伝子の
配列はまだ報告されていない。従ってイネのワキシイそ
のものの配列をもとにしてプライマーを合成することが
できない。しかし、トウモロコシとオオムギのワキシイ
遺伝子の塩基配列はすでに報告されており、EMBLデータ
ベース（Release20.0）より入手することができた。両
者を比較したところ、トウモロコシとオオムギの間では
蛋白の配列をコードしているエキソン部分以外の配列で
は全く相同性がみられず、さらにエキソン部分でもシグ
ナルペプチド領域や、非翻訳領域ではほとんど相同性が
みられなかった。言い換えれば、両者にホモロジーがあ
る部分は、全体の遺伝子の中の成熟蛋白をコードしてい
る部分のみに限られることがわかった。Example 1 (1) Synthesis of PCR primers The sequence of the rice waxy gene to be obtained in the present invention has not been reported yet. Therefore, a primer cannot be synthesized based on the sequence of rice waxy itself. However, the nucleotide sequences of the maize and barley waxy genes have already been reported and were available from the EMBL database (Release 20.0). Comparison of the two shows that there is no homology between maize and barley except for the exon portion encoding the protein sequence, and the exon portion has almost no homology in the signal peptide region or untranslated region. Was not seen. In other words, it was found that the portion having homology between both was limited to only the portion encoding the mature protein in the entire gene.

そこで、両者の間で相同性の高い部分のオオムギの配
列をもとにプライマー配列を決定した。配列は次に示
す。Therefore, a primer sequence was determined based on the barley sequence of a highly homologous portion between the two. The sequence is shown below.

これららプライマーDNAはApplied Biosystems社のDNA
合成機を用いて調製した。 These primer DNAs are DNAs from Applied Biosystems
It was prepared using a synthesizer.

なお、PCRのプライマーとして正常に機能するために
ある程度の相同性が必要である。しかし、トウモロコシ
とオオムギの配列の相同性を検討した結果、合成したプ
ライマーのイネに対するマッチングの度合が高くないこ
とが予想されたので、確率論的にマッチングの可能性を
増加させるために、プライマーをそれぞれ２種類ずつ合
成し、それぞれの組合せでPCR反応に供することとし
た。Note that a certain degree of homology is required for normal function as a PCR primer. However, as a result of examining the homology between the corn and barley sequences, it was expected that the degree of matching of the synthesized primers to rice was not high, so in order to stochastically increase the possibility of matching, primers were used. Two types of each were synthesized, and each combination was subjected to a PCR reaction.

（２）イネのワキシイ遺伝子のクローニング 材料としたイネ核DNAはRogersとBedichの方法（Plant
Mol.Biol.,５,69（1985））に従って調製した。本実施
例で用いたプラスミドpUC13はファルマシアから購入し
た。PCR（polymerase chain reaction）機は、Perkin
Elmer Cetus社のものを用い、反応系はInnisとGelfand
の方法に従った（PCR Protocols.Innis et al.（Ed
s.）,Academic Press,CA（1990）,pp3−12）。(2) Cloning of rice waxy gene The rice nuclear DNA used as material was prepared by the method of Rogers and Bedich (Plant
Mol. Biol., 5 , 69 (1985)). The plasmid pUC13 used in this example was purchased from Pharmacia. PCR (polymerase chain reaction) machine
The reaction system was from Elmer Cetus, and the reaction system was Innis and Gelfand
(PCR Protocols. Innis et al. (Ed.
s.), Academic Press, CA (1990), pp3-12).

前項で合成したイネ・ワキシイ釣りだし用PCRプライ
マーを用いPCRを行なった。その結果、プライマー間の
領域の合成反応が進み、特定の断片の増幅を認めること
ができた。PCR was performed using the PCR primers for rice and waxy fishing that were synthesized in the previous section. As a result, the synthesis reaction in the region between the primers proceeded, and amplification of a specific fragment could be recognized.

得られた断片はpUC13のSma I部位に挿入することを試
みた。得られた断片を２度エタノール沈澱を繰り返すこ
とによって過剰のdNTPと塩を除去し、T4 DNAポリメラー
ゼを用いて末端の平滑化を行ない、これをpUC13のSma I
切断断片とT4 DNAリガーゼを用いてライゼーションを行
った。この反応液を大腸菌JM109に導入し、アンピシリ
ン耐性となった形質転換体の出現を待った。大腸菌の形
質転換は常法にしたがった（Sambrook et al.（Eds.）,
Molecular cloning,Section1.53,Cold Spring Harbor
Laboratory Press）。その結果、多数の形質転換体が得
られた。これらのうちプライマーHVW−２とHVW−６の間
で増幅を行なった断片をクローン化した形質転換株から
選択した３株にはPCRによって増幅されたワキシイ断片
の長さに対応する挿入が見られた。これらのクローンに
含まれるプラスミドをpWX12,pWX15,pWX27と名付けた。An attempt was made to insert the obtained fragment into the SmaI site of pUC13. The resulting fragment was subjected to ethanol precipitation twice to remove excess dNTPs and salts, and the ends were blunt-ended using T4 DNA polymerase.
Ligation was performed using the cut fragment and T4 DNA ligase. This reaction solution was introduced into Escherichia coli JM109, and the appearance of transformants that became ampicillin resistant was waited. Transformation of E. coli was carried out according to a standard method (Sambrook et al. (Eds.),
Molecular cloning, Section1.53, Cold Spring Harbor
Laboratory Press). As a result, a large number of transformants were obtained. Of these, three strains selected from among the transformants in which the fragment amplified between primers HVW-2 and HVW-6 were cloned showed an insertion corresponding to the length of the waxy fragment amplified by PCR. Was. The plasmids contained in these clones were named pWX12, pWX15, and pWX27.

これらのプラスミドにはベクターに由来するマルチク
ローニングサイトが挿入断片であるイネのワキシイ遺伝
子の両側に存在する。これらのクローンは大量培養を行
い、プラスミドDNAの調製を行った。In these plasmids, a multicloning site derived from the vector is present on both sides of the rice waxy gene, which is an insert fragment. These clones were subjected to mass culture and plasmid DNA was prepared.

（３）塩基配列の解析 pWX12,pWX15,pWX27はプラスミドDNAをアルカリ変性に
より調製した変性DNAを基質とし、塩基配列の決定を行
った。塩基配列の決定はダイデオキシ法によった（Mess
ing,Methods in Enzymol.,101,20−78（1983））。これ
により得られた挿入断片の全塩基配列を第１図から第３
図に示す。pWX12とpWX27は同じ向きであり、pWX15は逆
向きであった。これらの塩基配列相互にはそれぞれ数ヵ
所の塩基において相違がみられた。これはPCRの際に生
じた置換変異によるものであろうと思われる。また、こ
れらの塩基配列を総合することによって、イネゲノムに
存在している（塩基置換のない）ワキシイ遺伝子の配列
を推定した（第４図）。(3) Analysis of nucleotide sequence The nucleotide sequence of pWX12, pWX15, and pWX27 was determined using denatured DNA prepared by alkali denaturation of plasmid DNA as a substrate. The nucleotide sequence was determined by the dideoxy method (Mess
ing, Methods in Enzymol., 101 , 20-78 (1983)). From FIG. 1 to FIG.
Shown in the figure. pWX12 and pWX27 were in the same orientation and pWX15 was in the opposite orientation. These nucleotide sequences differed from each other in several bases. This may be due to a substitution mutation generated during PCR. By combining these base sequences, the sequence of the waxy gene present in the rice genome (without base substitution) was estimated (FIG. 4).

さらに、この配列をトウモロコシとオオムギのワキシ
イ遺伝子の塩基配列と比較したところ、これらの間に良
好な相同性がみられ、得られた断片がイネのワキシイ遺
伝子の一部の配列であることが確認された。詳細な塩基
配列の比較の結果、イネとオオムギやトウモロコシの遺
伝子の間でもエキソンの部分に高い相同性がみられた
が、イントロンでの相同性は低かった。これはオオムギ
とトウモロコシの間での関係と一致した。Furthermore, when this sequence was compared with the base sequences of the maize and barley waxy genes, good homology was found between them, and it was confirmed that the obtained fragment was a partial sequence of the rice waxy gene. Was done. As a result of detailed nucleotide sequence comparison, high homology was observed in exons between rice and barley and maize genes, but homology in introns was low. This was consistent with the relationship between barley and corn.

（４）部位特異的置換によるワキシイ配列の改変 前項で推定したイネのワキシイ遺伝子の塩基配列を得
るため、置換変異の生じた部分の修正を試みた。pWX12
の場合、２ヵ所においてＴからＣへの置換変異が起こっ
ている。そこでまで、この変異がある塩基を中心にし
て、これをＴとし、この５′側および３′側にそれぞれ
８塩基づつ有機合成した。また、pWX12の配列をEcoR I
とHind IIIによって切り出して、M13ベクターに移しか
えた。これを先述の合成プライマーと、部位特異的変異
キット（宝酒造製Mutan−Ｇ）を使用してＣからＴへの
塩基置換を行なった。得られた配列はダイデオキシ法に
よって目的の配列であることを確認した。これにより取
得したイネのワキシイ遺伝子は、再びプラスミドpUC13
にクローン化した。これをpWX00と名付けた（第４
図）。(4) Modification of waxy sequence by site-specific substitution In order to obtain the nucleotide sequence of the rice waxy gene estimated in the preceding section, an attempt was made to correct the portion where the substitution mutation occurred. pWX12
In the case of, a substitution mutation from T to C has occurred in two places. Up to that point, this mutation was designated as the center, and this was designated as T, and 8 bases were synthesized on the 5 'and 3' sides, respectively. In addition, the sequence of pWX12 was
And transferred to the M13 vector. This was subjected to base substitution from C to T using the above-mentioned synthetic primer and a site-specific mutation kit (Mutan-G, manufactured by Takara Shuzo). The obtained sequence was confirmed to be the target sequence by the dideoxy method. The rice waxy gene thus obtained was again transformed into plasmid pUC13
Cloned. This was named pWX00 (fourth
Figure).

（５）アンチセンス遺伝子の構築 pWX12をEcoR Iで切断し、切断末端をT4 DNAポリメラ
ーゼ（宝酒造製、DNA bluntin kit）を用いて平滑化し
た。次にこれをXba Iにより切断を行ない、イネのワキ
シイ領域の切り出しを行なった。これをpBl221（CaMVの
35Sプロモーターを有する;Jefferson et al.;EMBO j.,
６,3901（1987））のXba IとSma Iによる切断断片との
結合を行なった。pBI221はClontech社より入手した。結
合の結果、35Sプロモーターの下流にワキシイ遺伝子が
逆向きにつながったアンチセンス・ワキシイ遺伝子が作
成された。これをpWXA23と名付けた（第５図）。(5) Construction of antisense gene pWX12 was cut with EcoRI, and the cut end was blunt-ended using T4 DNA polymerase (DNA bluntin kit, manufactured by Takara Shuzo). Next, this was cut with XbaI to cut out the waxy region of rice. This is called pBl221 (CaMV
With 35S promoter; Jefferson et al .; EMBO j.,
6 , 3901 (1987)) and the fragment cut with XbaI and SmaI. pBI221 was obtained from Clontech. As a result of the ligation, an antisense waxy gene was created in which the waxy gene was reversely connected downstream of the 35S promoter. This was named pWXA23 (FIG. 5).

（６）イネの形質転換 pWXA23プラスミドDNAを多田らの方法（Tada et al.;T
heor Appl.Genet.,in press（1990））に従い、イネ
（日本晴れ）のプロトプラスト細胞にエレクトロポレー
ショ法によって導入した。実験は２度行い、得られた細
胞は、藤村らの方法（Fujimura et al.;Plant Tissue C
ulture Lett.,２,74（1985））に従い、植物体に再生し
た。これらの細胞より、DNAを抽出し、サザンハイブリ
ダイゼーションを行なったところ、５株にpWXA23に由来
すると思われるDNA断片が存在していた。これらの形質
転換植物から種子をとり、その胚乳デンプンのアミロー
ス含量をヨウ素呈色比色法によって定量した。その結果
を下表に示す。形質転換植物から得られた胚乳デンプン中のアミロース含量 株 アミロース含量（％） 形質転換株No.1 10.5 同 No.2 8.8 同 No.3 12.5 同 No.4 10.9 同 No.5 9.6 Nihonbare（ウルチ） 22.5 Koganemochi（モチ） 0.0 これらの結果から、pWXA23を導入した形質転換植物は
胚乳デンプンのアミロース含量が低く抑えられているこ
とが明かとなり、アンチセンス遺伝子として有効に働い
ていることが証明された。(6) Transformation of rice pWXA23 plasmid DNA was prepared by the method of Tada et al. (Tada et al .; T
According to heor Appl. Genet., in press (1990)), the cells were introduced into rice (Nipponbare) protoplast cells by electroporation. The experiment was performed twice, and the obtained cells were subjected to the method of Fujimura et al. (Fujimura et al .; Plant Tissue C
ulture Lett., 2 , 74 (1985)). DNA was extracted from these cells and subjected to Southern hybridization. As a result, a DNA fragment presumably derived from pWXA23 was present in 5 strains. Seeds were taken from these transformed plants, and the amylose content of the endosperm starch was determined by an iodine colorimetric method. The results are shown in the table below. Amylose content strain in endosperm starch obtained from transgenic plant Amylose content (%) Transformant strain No.1 10.5 Same No.2 8.8 Same No.3 12.5 Same No.4 10.9 Same No.5 9.6 Nihonbare (Ulchi) 22.5 Koganemochi 0.0 From these results, it was revealed that the transgenic plant into which pWXA23 was introduced had a low amylose content of endosperm starch, and proved to work effectively as an antisense gene.

（発明の効果） 本発明によってはじめて、イネのワキシイ（waxy）遺
伝子の構造が解明され、クローニングにも成功した。ま
た、そのアンチセンス遺伝子の構築及びそれを用いるイ
ネの形質転換にも成功したものである。(Effect of the Invention) For the first time, the present invention has elucidated the structure of the rice waxy gene and succeeded in cloning. In addition, the construction of the antisense gene and the transformation of rice using the same have also been successful.

したがって、アンチセンス遺伝子の選択及び必要あれ
ばプロモーター配列の選択により、アミロース含量を低
減ないし、ゼロとすることが可能となり、アミロース含
量のコントロールを自由に行うことができる。すなわ
ち、本発明によって、例えばウルチ性多収品種をモチ性
多収品種に変換したり、ウルチ性品種のアミロース含量
を抑えて高品質のコメを生産することができ、我が国に
おける農業問題、特にコメに関する問題を有利に解決す
ることが可能となったのである。Therefore, the amylose content can be reduced or eliminated by selecting the antisense gene and, if necessary, the promoter sequence, and the amylose content can be controlled freely. That is, according to the present invention, for example, it is possible to convert a ulti-rich high-yield variety to a stretchy high-yield variety, or to suppress the amylose content of a ulti-yield variety to produce high-quality rice. Thus, it has become possible to advantageously solve the problem described above.

もちろん上記とは逆に、イネのワキシイ（waxy）遺伝
子をアンチセンス遺伝子とすることなく、プロモーター
配列と結合してイネに導入して、アミロース生産量の高
いイネを育種することも可能である。Of course, conversely to the above, it is also possible to breed rice with a high amylose production amount by introducing the rice waxy gene into rice by binding to a promoter sequence without using it as an antisense gene.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

第１〜４図は、プラスミドpWX12,pWX15,pWX27,及びpWX0
0にそれぞれ挿入されているイネのワキシイ（waxy）配
列である。 第５図は、アンチセンス・ワキシイ遺伝子pWXA23の構築
図である。1 to 4 show plasmids pWX12, pWX15, pWX27, and pWX0.
It is a rice waxy sequence inserted into 0 respectively. FIG. 5 is a construction diagram of the antisense waxy gene pWXA23.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 A01H 5/00 C12N 5/00 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ────────────────────────────────────────────────── ─── Continued on the front page (58) Field surveyed (Int. Cl. ⁷ , DB name) C12N 15/00 A01H 5/00 C12N 5/00 GenBank / EMBL / DDBJ

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】下記に示される塩基配列によって規定され
るDNAからなるイネ由来のワキシイ遺伝子のDNA断片を含
むDNA断片。 1. A DNA fragment comprising a rice-derived waxy gene DNA fragment comprising a DNA defined by the nucleotide sequence shown below. 【請求項２】下記に示される塩基配列によって規定され
るDNAからなるイネ由来のワキシイ遺伝子のDNA断片を含
むDNA断片であって、該DNA断片の逆鎖をアンチセンス法
を利用してイネ植物体に導入した場合、イネ・ワキシイ
遺伝子の発現をコントロールし得るDNA断片。 2. A DNA fragment comprising a rice-derived waxy gene DNA fragment comprising a DNA defined by the nucleotide sequence shown below, wherein the reverse strand of the DNA fragment is subjected to antisense method to rice plant. A DNA fragment that can control the expression of a rice waxy gene when introduced into the body. 【請求項３】請求項２に記載のDNA断片の逆鎖DNAである
DNA断片。3. A reverse-strand DNA of the DNA fragment according to claim 2.
DNA fragments. 【請求項４】請求項２又は３に記載の塩基配列を有する
２本鎖DNA。4. A double-stranded DNA having the nucleotide sequence according to claim 2 or 3. 【請求項５】請求項４に記載のDNAを、植物細胞内及び
／又は微生物内で安定に存在できるベクターに組み込ん
で得られるハイブリッドDNA。5. A hybrid DNA obtained by incorporating the DNA according to claim 4 into a vector capable of stably existing in plant cells and / or microorganisms. 【請求項６】請求項４に記載のDNAを、植物細胞内で発
現可能な遺伝子のプロモーター配列と結合し得られたハ
イブリッドDNA。6. A hybrid DNA obtained by binding the DNA according to claim 4 to a promoter sequence of a gene that can be expressed in a plant cell. 【請求項７】請求項６に記載のハイブリッドDNAを宿主
イネ細胞に導入することにより得られる形質転換イネ細
胞。7. A transformed rice cell obtained by introducing the hybrid DNA according to claim 6 into a host rice cell. 【請求項８】請求項７に記載の形質転換イネ細胞より再
生してなる形質転換イネ。A transformed rice regenerated from the transformed rice cell according to claim 7. 【請求項９】請求項７に記載の形質転換イネ細胞を用
い、請求項４に記載のDNAに由来するRNAをイネ細胞内で
生産する方法。[9] A method for producing RNA derived from the DNA according to [4] in a rice cell using the transformed rice cell according to [7]. 【請求項１０】請求項９に記載の方法を用いてイネ・ワ
キシイ遺伝子の発現量を制御する方法。10. A method for controlling the expression level of a rice waxy gene using the method according to claim 9. 【請求項１１】請求項９に記載の方法を用いてイネ穀粒
の胚乳澱粉中のアミロース含量を変化させる方法。11. A method for changing the amylose content in endosperm starch of rice grain using the method according to claim 9.