JP3075602B2 - Electrophoresis device - Google Patents

Electrophoresis device

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JP3075602B2
JP3075602B2 JP03233489A JP23348991A JP3075602B2 JP 3075602 B2 JP3075602 B2 JP 3075602B2 JP 03233489 A JP03233489 A JP 03233489A JP 23348991 A JP23348991 A JP 23348991A JP 3075602 B2 JP3075602 B2 JP 3075602B2
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Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は電気泳動装置、特に、試
料導入部が改良されたDNA等の分離検出に有効なゲル
電気泳動装置に関する。
BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to an electrophoresis apparatus and, more particularly, to a gel electrophoresis apparatus having an improved sample introduction portion and effective for separation and detection of DNA and the like.

【0002】[0002]

【従来の技術】従来、DNAシーケンシングをはじめ、
DNAの分離検出には平板型ゲル(スラブゲル)が用い
られてきた。この装置でのDNAの最小検出量は測定領
域内のDNA濃度と体積に依存する。従って、微量の試
料を有効に検出するためにはDNAバンドの体積を小さ
くする必要がある。これを実現する方法としてキャピラ
リー電気泳動法が提案されておりDNA解析にも使用さ
れている(Anal. Chem.62, 900-903,(1990))。
2. Description of the Related Art Conventionally, including DNA sequencing,
Plate-type gels (slab gels) have been used for separation detection of DNA. The minimum detection amount of DNA in this device depends on the DNA concentration and volume in the measurement area. Therefore, it is necessary to reduce the volume of the DNA band in order to effectively detect a small amount of sample. As a method for realizing this, a capillary electrophoresis method has been proposed and used for DNA analysis (Anal. Chem. 62, 900-903, (1990)).

【0003】キャピラリー電気泳動に現在用いられてい
る装置は図5にその概念図が示されるように、バッファ
液で満たされた第1と第2のバッファ槽101、1
02とを有し、二つのバッファ槽内には泳動電界電位
を与えるため高電圧電源Bからの電極103、104が
装着されている。また、二つの槽内のバッファ液はキ
ャピラリ105を介して連通し得るようにされてお
り、該キャラリの適宜箇所に検出部106が位置し
ている。この装置を用いてDNA等の分離検出を行うに
当たっては、バッファ液で満たされたバッファ槽か
らキャラリの先端を離脱させ、外部に位置する試料
溜Sにその先端を挿入して所定量の試料をキャラリ
の先端に導入した後、再びキャラリの先端をバッフ
槽内のバッファ液内に浸漬させる。しかる後、バ
ッファ槽間に泳動電極を与え試料を電気泳動させ分析
を行う。
[0003] The apparatus currently used for capillary electrophoresis is shown in FIG.
First and second buffer over bath filled with over liquid 101,1
And a 02, electrodes 103 and 104 from the high voltage power supply B to provide the electrophoretic field potential is attached to the two buffers over tank. The buffer over liquid in the two tanks is key <br/> through Yapirari over 105 are adapted to be communicated with, the detection unit 106 to the appropriate position of the calibration peak rally is located. In performing the separation and detection of DNA or the like using this device, to disengage the front end of the calibration peak rally from the buffer over tank filled with buffer over liquid, and insert the tip into the sample reservoir S located outside after introducing a predetermined amount of the sample to the tip of the calibration peak rally <br/>, it is immersed again tip of calibration peak rally the buffer <br/> buffer over liquid within § chromatography tank. Thereafter, an analysis was electrophoresed samples gave migration electrode between bar <br/> Ffa over bath.

【0004】この種のキャピラリー電気泳動において
は、通常試料はμlのオーダの試料溜から、電界注入に
よりnl程度がキャピラリー内に入り分析される。
In this type of capillary electrophoresis, usually about nl of a sample enters a capillary from a sample reservoir of the order of μl by electric field injection and is analyzed.

【0005】[0005]

【発明が解決しようとする課題】上記従来技術ではキャ
ピラリーに注入される試料量はわずかであるが、注入量
の100倍近い試料を試料溜に必要とする難点があっ
た。このため、分離検出に必要な実際の試料の必要最小
量は必ずしも小さくなく、極微量成分の分析には難点が
あった。
In the above prior art, the amount of the sample injected into the capillary is small, but there is a drawback that a sample that is nearly 100 times the injected amount is required in the sample reservoir. For this reason, the required minimum amount of the actual sample required for separation and detection is not necessarily small, and there has been a difficulty in analyzing trace components.

【0006】本発明の目的は、試料溜中にあるDNA等
の分析対象試料のほぼ全量をいったん濃縮し、その後に
分離泳動部に泳動させることにより、分析検出に実際に
必要な極微量の試料とほぼ同量の試料を試料溜に提供す
るだけで、十分な分離検出を行い得る電気泳動によるD
NA等の試料分離分析装置を提供することにある。
[0006] An object of the present invention is to concentrate almost all of a sample such as DNA in a sample reservoir once and then migrate it to a separation electrophoresis section, thereby obtaining a very small amount of sample actually required for analysis and detection. By providing an approximately same amount of sample to the sample reservoir, D by electrophoresis that can perform sufficient separation and detection
An object of the present invention is to provide a sample separation / analysis device such as NA.

【0007】[0007]

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明は、試料注入部、分離泳動部、検出部、及び
泳動用高圧電源供給部とからなる蛍光検出型電気泳動装
置において、該試料注入部は相互に細管部分で連結され
た二つのバッファ槽及び該細管部分に位置する検出対
象物は通過し得ないが検出対象物より小さいサイズの物
質は通過し得る第1の分子ふるい膜とを有していると共
に、該分離泳動部は該分子ふるい膜の近傍上流側に開口
しており、かつ泳動用高圧電源供給部は該二つのバッフ
槽間及び二つのバッファ槽間の一方と分離泳動部
間とに切り替え自在に接続していることを特徴とする電
気泳動装置を開示する。
In order to achieve the above object, the present invention provides a fluorescence detection type electrophoresis apparatus comprising a sample injection section, a separation and migration section, a detection section, and a high voltage power supply section for migration. sample injection portion to the first molecule capable of passing material detection object located concatenated two buffer over bath and capillary tubes part tubule portion is smaller than the detection target but not pass size to each other together and a sieve membrane, the separation lane area is open in the vicinity upstream of the molecule sieve membrane, and high-voltage power supply unit for electrophoresis is and between said two buffer <br/> § over bath discloses an electrophoresis apparatus characterized by connecting freely switch and between one and the separation electrophoresis unit between two buffer over bath.

【0008】該細管部分のより上流側に検出対象物は通
過し得るが検出対象物より大きいサイズの物質の通過は
阻止する第2の分子ふるい膜設け、該分離泳動部を第
2と第1の分子ふるい膜間の該細管部分に開口させるこ
とにより、より目的を達成することができる。分離泳動
部はバッファ液を満たした中空キャラリーであって
よく、またガラスキャラリー内部に形成されたゲルで
あってもよい。さらに、2枚のガラス平板の間に形成さ
れた平板型ゲルであってもよい。
[0008] A second molecular sieve membrane is provided on the upstream side of the capillary portion to allow the detection target to pass therethrough, but to block the passage of a substance having a size larger than the detection target. The object can be further achieved by opening the capillary portion between the one molecular sieve membranes. Separating lane area may be hollow calibration pin rally filled with buffer over liquid, or may be a gel formed within Garasukya pin rally. Further, a flat gel formed between two glass flat plates may be used.

【0009】また、分子ふるい膜面積を該分離泳動部の
断面積とほぼ等しいかあるいはより小さな面積に制限す
る手段を具備することにより、より目的は達成される。
Further, the object can be further achieved by providing a means for limiting the area of the molecular sieve membrane to an area substantially equal to or smaller than the cross-sectional area of the separation / phoresis section.

【0010】[0010]

【作用】本発明による電気泳動装置の好ましい態様にお
いては、試料注入部は、第1及び第2のバッファー槽
と、第2のバッファー槽内の底部に位置する試料注入ウ
ェルと、分子サイズを選択分離する分子ふるい膜と、二
つのバッファー槽相互間を連結する細管によって構成さ
れている。また、上記分子ふるい膜は好ましくは第1の
バッファー槽と第2のバッファー槽とを連結する細管の
途中に設けられる。試料の分析にあたり、まず試料を上
記第2のバッファー槽内の底部に設けた試料注入ウェル
に注入し、上記第1及び第2のバッファー槽をバッファ
ー液で満たす。それにより上記細管内はバッファー液で
満たされるとともに、該分子ふるい膜近傍にその入り口
を開口している分離泳動部もバッファー液で満たされ
る。
In a preferred embodiment of the electrophoresis apparatus according to the present invention, the sample injecting section is configured by selecting a first and a second buffer tank, a sample injecting well located at the bottom of the second buffer tank, and a molecular size. It consists of a molecular sieve membrane to be separated and a capillary tube connecting the two buffer tanks. Further, the molecular sieve membrane is preferably provided in the middle of a thin tube connecting the first buffer tank and the second buffer tank. In analyzing the sample, first, the sample is injected into a sample injection well provided at the bottom in the second buffer tank, and the first and second buffer tanks are filled with a buffer solution. As a result, the inside of the thin tube is filled with the buffer solution, and the separation electrophoresis part whose entrance is opened near the molecular sieve membrane is also filled with the buffer solution.

【0011】この状態で上記泳動用の電極間に電位を与
えて、第1及び第2のバッファー槽間での電気泳動を可
能とする。分子ふるい膜はバッファー液中の分子サイズ
の小さい塩は通すが、分子サイズの大きなDNA分子は
通さないものが選択され、従って、第1及び第2のバッ
ファー槽間での電気泳動によって、上記分子ふるい膜の
面あるいはその近傍に試料は濃縮される。
In this state, a potential is applied between the electrodes for electrophoresis to enable electrophoresis between the first and second buffer tanks. The molecular sieve membrane is selected so that the salt having a small molecular size in the buffer solution is allowed to pass through but the DNA molecule having a large molecular size is not allowed to pass through. Therefore, the electrophoresis between the first and second buffer tanks allows the above molecular sieve to be formed. The sample is concentrated on or near the surface of the sieving membrane.

【0012】このようにして濃縮されたDNA等の試料
は分離泳動部のキャピラリー等に直結した領域に保持さ
れた後、分離泳動部のキャピラリー等内を電気泳動する
ので、ほぼ全試料を無駄なく分離、検出の測定に使用す
ることができ、計測に必要な最小量を少なくできる。な
お、本発明において「細管部分」というときは、単に細
管そのもののみならず、以下の実施例、特に第2、3、
4の実施例に示すように二つのバッファー槽間を連通す
る管路部分のすべてをいうものとする。
The sample such as DNA concentrated in this manner is held in a region directly connected to the capillary or the like in the separation and migration section, and then electrophoresed in the capillary or the like in the separation and migration section. It can be used for measurement of separation and detection, and the minimum amount required for measurement can be reduced. In the present invention, the term "capillary portion" refers not only to the capillaries themselves, but also to the following examples, particularly to the second, third, and third embodiments.
As shown in the fourth embodiment, the term refers to all the pipe sections communicating between the two buffer tanks.

【0013】[0013]

【実施例】以下、本発明による電気泳動装置を添付の図
面を参照したいくつかの実施例に基づきより詳細に説明
する。図1は、第一の実施例を示しており、その装置を
DNA断片の解析を行う場合を例にとって説明する。図
において、aは試料注入部であり、第1のバッファ
1及び第2のバッファ槽2とが隔壁3を介して位置し
ており、一方のバッファ槽、図においてはバッファ
槽2の底部には試料注入ウェル4が設けられている。試
料注入ウェル4の底部と他方のバッファ槽、図におい
てはバッファ槽1の底部とは細管5により連通されて
いて、該細管5のバッファ槽1の底部近傍には分子ふ
るい膜6が介装されている。この分子ふるい膜6は分子
サイズの小さい塩は通すが、分子サイズの大きなDNA
分子は通さない物性を有するものであって、例えば、セ
ルロースアセテート膜やポリエーテルスルフォン膜など
が利用できる。
DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, an electrophoresis apparatus according to the present invention will be described in more detail with reference to the accompanying drawings. FIG. 1 shows a first embodiment, and the apparatus will be described by way of example in which a DNA fragment is analyzed. In FIG., A is a sample injection part, a first buffer over tank 1 and the second buffer over tank 2 is positioned through the septum 3, one buffer over tank buffer over in FIG. < A sample injection well 4 is provided at the bottom of the tank 2. Bottom and the other buffer over bath sample injection well 4, is the bottom of the buffer over tank 1 have been communicated by capillary 5 in the figure, near the bottom of the buffer over tank 1 of capillary tubes 5 molecular sieve film 6 It is interposed. This molecular sieve membrane 6 allows the passage of salts having a small molecular size but DNA having a large molecular size.
It has physical properties that do not allow molecules to pass through. For example, a cellulose acetate film or a polyethersulfone film can be used.

【0014】試料注入ウェル4の底部と分子ふるい膜6
との間の細管5の部分には、従来公知の分離泳動部bの
キャピラリ50の先端が接続しており、該キャピラリ
50の他方端は、第3のバッファ槽60内に解放し
ている。さらに、キャピラリ50の下方端近傍には蛍
光標識されたDNA断片等の被検出試料を検出する公知
の検出手段cが設けられている。
The bottom of the sample injection well 4 and the molecular sieve film 6
And in the portion of the thin tube 5 between, and the tip of <br/> capillary -50 conventional known separation lane area b is connected, the capillary
The other end of the over 50 is released in the third buffer over bath 60. Further, the lower end near the capillary over 50 known detection means c for detecting the detected sample of DNA fragments or the like which is a fluorescent label is provided.

【0015】第1、第2、第3のバッファ槽1、2、
60には、それぞれ電極71、72、73が設けられて
おり、各電極は電源切換スイッチ74を介して泳動用高
圧電源75に対し以下に記す2つの態様に選択的に切り
変わるように接続されている。すなわち、図1において
実線で示される第2のバッファー槽2に設けた泳動電極
72と第1のバッファー槽1に設けた泳動電極71との
間に電位を与える第1の切り換え態様と、点線で示され
る第1のバッファー槽1に設けた泳動電極71と第3の
バッファー槽60設けた泳動電極73との間に電位を与
える第2の切り換え態様である。
[0015] The first, second, third buffer over tank 1,
The electrode 60 is provided with electrodes 71, 72, and 73, respectively, and each electrode is connected to a high-voltage power supply for electrophoresis 75 via a power switch 74 so as to be selectively switched to the following two modes. ing. That is, a first switching mode in which a potential is applied between the migration electrode 72 provided in the second buffer tank 2 and the migration electrode 71 provided in the first buffer tank 1 shown by a solid line in FIG. This is a second switching mode in which a potential is applied between the migration electrode 71 provided in the first buffer tank 1 and the migration electrode 73 provided in the third buffer tank 60 as shown.

【0016】次ぎに、この電気泳動装置を用いてDNA
断片の解析を行う方法を説明する。まず、すべてのバッ
ファー槽をバッファ液で満たす。しかる後、測定しよ
うとする蛍光標識されたDNA断片を含む試料をマイク
ロシリンジ等で1〜2μl採取し、第2バッファー槽2
の底部にある試料注入ウェル4に注入する。試料注入ウ
ェル4は第1バッファー槽1とキャピラリーの内径と同
程度の径の細管5で連結され、この細管5の途中すなわ
ち好ましくは第1バッファー槽1の底部近傍には、細管
5をふさぐように分子ふるい膜6が設けられ、かつ、試
料注入ウェル4の底部と分子ふるい膜6との間の細管5
の部分には、分離泳動部bのキャピラリ50の先端が
接続している。従って、電源切換スウィッチ74を図1
の実線で示す側にして第2のバッファー槽2に設けた泳
動電極72と第1のバッファー槽2に設けた泳動電極7
1との間に電位を与えると、蛍光標識されたDNA断片
は第2のバッファー槽下方の試料注入ウェル4から分
子ふるい膜6の方向に向かって泳動する。
Next, a DNA is prepared using this electrophoresis apparatus.
A method for analyzing a fragment will be described. First, meet all buffers reactor with buffer over liquid. Thereafter, 1-2 μl of a sample containing the fluorescently labeled DNA fragment to be measured is collected with a microsyringe or the like, and the second buffer tank 2
Is injected into the sample injection well 4 at the bottom of the sample. The sample injection well 4 is connected to the first buffer tank 1 by a thin tube 5 having a diameter approximately the same as the inner diameter of the capillary, and the middle of the thin tube 5, that is, preferably near the bottom of the first buffer tank 1, is closed with the thin tube 5. Is provided with a molecular sieve film 6, and a capillary 5 between the bottom of the sample injection well 4 and the molecular sieve film 6.
The part, the tip end of the capillary over 50 separate lane area b is connected. Therefore, the power supply switching switch 74 is not shown in FIG.
The migration electrode 72 provided in the second buffer tank 2 and the migration electrode 7 provided in the first buffer tank 2 on the side indicated by the solid line.
When a potential is applied between the sample buffer and the sample buffer, the fluorescently labeled DNA fragment migrates from the sample injection well 4 below the second buffer tank 2 toward the molecular sieve membrane 6.

【0017】バッファー液中の塩など分子サイズの小さ
な分子は分子ふるい膜6を自由に通過するが、蛍光標識
されたDNA断片分子は分子サイズが大きいため分子ふ
るい膜6の下部面あるいはその近傍の細管領域5'に濃
縮して集積し保持される。2〜5分間泳動させることに
より、ほぼすべての蛍光標識されたDNA断片分子を第
2のバッファー槽2から試料保持領域である前記の細管
領域5'へ濃縮して移すことができる。なお、この実施
例においては、分子ふるい膜6の下部の細管領域5'の
断面積は、泳動路断面すなわちキャピラリ11の断面
積とほぼ同等となるようにしてあり、内径は0.1mm〜
0.05mmが好適である。
Although small molecules such as salts in the buffer solution pass freely through the molecular sieve membrane 6, the fluorescently labeled DNA fragment molecules have a large molecular size, so that the lower surface of the molecular sieve membrane 6 or the vicinity thereof can be used. It is concentrated and accumulated and held in the capillary region 5 '. By performing the electrophoresis for 2 to 5 minutes, almost all of the fluorescently labeled DNA fragment molecules can be concentrated and transferred from the second buffer tank 2 to the above-described capillary region 5 ′ which is a sample holding region. Incidentally, in this embodiment, the molecular cross-sectional area of the bottom of the capillary region 5 'of the old film 6 Yes set to be approximately equal to the cross-sectional area of the migration path sectional i.e. capillary chromatography 11 and an inner diameter 0.1mm~
0.05 mm is preferred.

【0018】次いで、電源切換スウィッチ74を図1に
点線で示す方へ倒し、第1のバッファー槽1に設けた泳
動電極71と第3のバッファー槽60に設けた泳動電極
73との間に電位を与える。それにより、細管領域5'
に濃縮された状態で保持されている蛍光標識DNA断片
は一斉に第3のバッファー60の方向へ泳動を開始す
る。それにより蛍光標識されたDNA断片はゲルキャピ
ラリー50内で分子サイズに応じて分離され、検出部c
で検出される。
[0018] Then, the power switching switch 74 in FIG. 1 Killed towards to indicate by dotted lines, between the first focusing electrode 73 that migration electrode 71 provided in the buffer tank 1 and provided with a third buffer tank 60 Apply potential. Thereby, the capillary region 5 ′
The fluorescently labeled DNA fragments held in a concentrated state start to migrate toward the third buffer tank 60 at the same time. Thereby, the fluorescently labeled DNA fragment is separated in the gel capillary 50 according to the molecular size,
Is detected by

【0019】上記の説明から明らかなように、この電気
泳動装置においては、試料注入ウェルに注入された試料
がいったん濃縮された後、泳動分離部のキャピラリ
に導入されるので、試料注入ウェル内の全試料を無駄な
く分離、検出の測定に使用することができ、計測に必要
な試料の量を極微量のものとすることができる。図2は
本発明による第2の実施例の試料注入部a2の断面を示
している。
[0019] As apparent from the above description, in this electrophoresis apparatus, after the sample injected into the sample injection wells is once concentrated, since it is introduced into the capillary over the electrophoretic separation unit, sample injection wells All the samples can be used for measurement of separation and detection without waste, and the amount of sample required for measurement can be made extremely small. FIG. 2 shows a cross section of a sample injection part a2 of a second embodiment according to the present invention.

【0020】この実施例の試料注入部a2は、第2のバ
ッファー槽22の底部に設けた試料注入ウェルの底部に
第2の分子ふるい膜26'を設けている点で第1の実施
例のものと基本的に異なっている。この実施例におい
て、第1及び第2のバッファ槽21、22の底部には
凹陥部が形成されており、該凹陥部の底部が細管25に
より相互に連通されている。
The sample injection section a 2 of this embodiment is different from the first embodiment in that a second molecular sieve film 26 ′ is provided at the bottom of a sample injection well provided at the bottom of the second buffer tank 22. Basically different from the ones. In this embodiment, the bottom portion of the first and second buffer over tank 21 is formed with a recess, the bottom of the recessed portion is communicated with each other by the capillary tube 25.

【0021】第1のバッファー槽21の底部に形成され
た凹陥部には細管25の開口部を覆う状態で第1の実施
例のものと同様の分子ふるい膜26が装着され、該分子
ふるい膜26は貫通孔27付き押さえ板28により固定
されている。また、第2のバッファー槽22の底部に形
成された凹陥部にも同様に細管25の開口部を覆う状態
で第2の分子ふるい膜26’が装着され、該分子ふるい
膜26’は試料注入ウェル24を兼ねた押さえ板24’
により固定されている。第2の分子ふるい膜26’は、
シーケンス解析に用いるDNA断片は透過し得るがそれ
より大きな分子サイズのものは透過しないメッシュをも
つ膜体が選択される。
A molecular sieve film 26 similar to that of the first embodiment is attached to the recess formed at the bottom of the first buffer tank 21 so as to cover the opening of the thin tube 25. 26 is fixed by a holding plate 28 with a through hole 27. Similarly, a second molecular sieve film 26 'is attached to a concave portion formed at the bottom of the second buffer tank 22 so as to cover the opening of the thin tube 25, and the molecular sieve film 26' is used for sample injection. Holding plate 24 ′ that also serves as well 24
It is fixed by. The second molecular sieve film 26 ′
A membrane having a mesh that can transmit DNA fragments used for sequence analysis but does not transmit DNA fragments of a larger molecular size is selected.

【0022】この実施例においても、特に図示しない
が、第3のバッファ槽、電源切換スウィッチ等電気泳
動による分析に必要な他の部材は第1の実施例のものと
同様に設けられる。この実施例を用いてのDNA断片の
解析も、第1の実施例の場合と同様に行われる。すなわ
ち、試料及びバッファ液をそれぞれ注入し、図1の実
線で示す側に切換スウィッチ74を倒し泳動を開始す
る。この実施例においては、試料注入ウェル24と細管
25との間に上記のようなメッシュを持つ第2の分子ふ
るい膜26'が設けられていることにより、DNA相補
鎖合成反応を用いたDNAシーケンス用断片生成に用い
るM13ファージやプラスミドベクターなどのより大き
なサイズの鋳型DNAは第2の分子ふるい膜26'を透
過せず、それよりも小さいサイズのもののみが透過す
る。従って、鋳型DNAと生成したDNA断片であるシ
ーケンス解析に用いる小さなDNA断片は第2の分子ふ
るい膜26'により分離される。
[0022] Also in this embodiment, although not particularly shown, a third buffer over bath, other members necessary for analysis by switching power switch and the like electrophoresis is provided in the same manner as in the first embodiment. Analysis of a DNA fragment using this embodiment is performed in the same manner as in the first embodiment. That is, sample and buffer over solution was poured respectively, to start electrophoresis defeat switching switch 74 to the side indicated by the solid line in FIG. 1. In this embodiment, since the second molecular sieve film 26 'having the mesh as described above is provided between the sample injection well 24 and the capillary 25, a DNA sequence using a DNA complementary strand synthesis reaction is provided. Larger size template DNA such as M13 phage or plasmid vector used for the production of the fragment does not permeate the second molecular sieve membrane 26 ', but only the smaller size DNA permeates. Therefore, the small DNA fragment used for sequence analysis, which is the template DNA and the generated DNA fragment, is separated by the second molecular sieve membrane 26 '.

【0023】すなわち、鋳型DNAと生成したDNA断
片を含む溶液を試料注入ウェル24に注入し、第2のバ
ッファー槽22に設けた泳動電極72と第1のバッファ
ー槽21に設けた泳動電極71との間に電位を与えるこ
とにより、分子サイズの小さい生成したDNA断片はバ
ッファー液中の塩などといっしょに第2の分子ふるい膜
26’を通過し、第1のふるい膜26の方向に泳動す
る。前記したように第2の分子ふるい膜26’は分子サ
イズの大きな鋳型DNAを通さないように選定され、第
1のふるい膜26は第1の実施例と同様にDNA断片を
通さないものが選定されているので、DNA断片は第1
のふるい膜26の下部面あるいはその近傍の試料保持領
域である細管領域25’に濃縮して集積する。これによ
り試料保持領域に濃縮して集積するDNAの総量中に占
めるシーケンス用DNA断片の比率を第1の実施例のも
のと比較し、さらに上げることができる。以下の動作方
法は第1の実施例と同じである。
That is, a solution containing the template DNA and the generated DNA fragment is injected into the sample injection well 24, and the electrophoresis electrode 72 provided in the second buffer tank 22 and the electrophoresis electrode 71 provided in the first buffer tank 21 By applying an electric potential between the two, the generated DNA fragment having a small molecular size passes through the second molecular sieve film 26 'together with the salt and the like in the buffer solution, and migrates in the direction of the first sieve film 26. . As described above, the second molecular sieve film 26 'is selected so as not to pass a template DNA having a large molecular size, and the first sieve film 26 is selected so as not to pass a DNA fragment as in the first embodiment. DNA fragment, the first
The sample is concentrated and accumulated in a capillary region 25 'which is a sample holding region at or near the lower surface of the sieve film 26. Thereby, the ratio of the sequencing DNA fragment in the total amount of DNA concentrated and accumulated in the sample holding region can be further increased as compared with that of the first embodiment. The following operation method is the same as in the first embodiment.

【0024】本発明はキャピラリー型電気泳動装置ばか
りでなく分離泳動部に平板型ゲル(スラブゲル)を用い
た電気泳動装置にも適用できる。図3は本発明による第
3の実施例を示すスラブゲル用の試料注入部a3を表す
斜視図をその断面と共に示している。分離泳動部を構成
するゲル保持板55、55間に挟まれたスラブゲル51
の上部にパッキング材52を介して試料注入部a3が取
り付けられている。この試料注入部a3は、上記の実施
例と同様に二つのバッファー槽31、32とそれぞれの
二つの分子ふるい膜36、36'を有しているが、それ
らはゲル保持板55のほぼ全長にわたって設けられてお
り、かつ第2のバファー槽32の底部にある試料注入
ウェル44は、試料注入ウェル板48内にゲル保持板5
5間に設けられる泳動路の数だけ存在し、かつ、二つの
バッファ槽の底部を連通する細管35も同様に泳動路
の数だけ存在している。従って、泳動路の数に応じて試
料保持領域である細管領域35'も存在することとな
る。また、この実施例においては泳動路の形状に応じ
て、該細管領域35'の泳動路と直交する面での断面形
状を短冊型とすることもできる。
The present invention can be applied not only to a capillary electrophoresis apparatus but also to an electrophoresis apparatus using a flat gel (slab gel) in a separation / phoresis section. Figure 3 shows a perspective view showing the sample injection unit a 3 for slab gel showing a third embodiment according to the present invention together with the cross-section. Slab gel 51 sandwiched between gel holding plates 55 constituting a separation / phoresis section
Sample injection unit a 3 through a packing material 52 of the upper are attached. This sample injection part a 3 has two buffer tanks 31 and 32 and two molecular sieve films 36 and 36 ′, respectively, as in the above embodiment. provided over, and sample injection well 44 at the bottom of the second bus Tsu fur tank 32, gel holding plate 5 to the sample injection wells plate 48
There is only the number of the migration path provided between 5 and are present as many as the number of capillaries 35 likewise migration path for communicating the bottom of the two <br/> buffer over bath. Therefore, a capillary region 35 'which is a sample holding region also exists according to the number of migration paths. Further, in this embodiment, the cross-sectional shape of the narrow tube region 35 'on a surface orthogonal to the migration path can be formed in a rectangular shape according to the shape of the migration path.

【0025】スラブゲル形式の泳動装置においては、泳
動路の断面積(あるいは幅)は試料の保持される部分の
幅と泳動中に拡散で広がる幅で決定される。従って、試
料の拡散による広がりを防止するために、泳動路の中に
高分子リボンあるいはワイヤーを設置し、隣接する泳動
路を独立させるようにしてもよい。試料の濃縮の方法、
その他の動作方法は第1、第2の実施例と同じであるの
で、説明は省略する。図3では泳動電極は記載していな
い。
In a slab gel type electrophoresis apparatus, the cross-sectional area (or width) of an electrophoresis path is determined by the width of a portion where a sample is held and the width spread by diffusion during electrophoresis. Therefore, in order to prevent the sample from spreading due to diffusion, a polymer ribbon or a wire may be provided in the migration path, and the adjacent migration path may be made independent. How to concentrate the sample,
Other operation methods are the same as those of the first and second embodiments, and the description is omitted. In FIG. 3, the electrophoresis electrode is not shown.

【0026】図4は本発明による第4の実施例を示す試
料注入部a4を表す断面図である。この実施例のもの
は、第1と第2の二つのバッファー槽を上下方向に一方
が他方の内部に入り込む形で設置した点で上記の他の実
施例のものと異なっている。すなわち、外側のバッファ
槽42内にもう一つのバッファ槽41が設けられて
おり、それぞれ第1から第3の実施例における第2のバ
ッファ槽及び第1のバッファ槽に対応した機能を果
たすように構成されている。バッファ槽41の底部に
は他の実施例と同様に分離泳動部bのキャピラリ41
の先端が接続しており、該キャピラリ41は外側のバ
ッファ槽42の底部を貫通して、図示しない第3のバ
ッファ槽に達している。バッファ槽41の底部には
同様に分子ふるい膜46が設けられ貫通孔付き押さえ板
48により固定されている。
FIG. 4 is a sectional view showing a sample injection part a4 according to a fourth embodiment of the present invention. This embodiment is different from the above-mentioned other embodiments in that the first and second buffer tanks are installed in such a manner that one of them enters the other in the vertical direction. That is, the outer buffer
Another is Buffer over bath 41 is provided, functions corresponding from the first, respectively third second bar <br/> Ffa chromatography tank and a first buffer over tank in the embodiment of the chromatography tank 42 It is configured to fulfill. Capillary chromatography of the bottom of the buffer over bath 41 another embodiment similarly to the separation electrophoresis unit b 41
Has distal end of the connection, said capillary chromatography 41 through the bottom of the outer bar <br/> Ffa over tank 42 has reached the third bar <br/> Ffa over tank (not shown). It is fixed by bottom Similarly molecular sieve membrane 46 provided at the portion through the perforated presser plate 48 of the buffer over bath 41.

【0027】この実施例においては、キャピラリ41
には外側のバッファ槽42内に位置している個所にお
いて細孔が設けるかあるいは切開した細隙45が形成さ
れる。その細孔あるいは細隙45を介して、バッファ
槽42内の空間とキャピラリの空間とが連通してい
る。また、特に図示しないが、各泳動電極が上記の他の
実施例と同様に各バッファ槽に装着されている。
[0027] In this embodiment, capillary chromatography 41
Or incised slit 45 pores at points located outside the buffer over bath 42 provided is formed in the. Through the pores or interstices 45, and the space of the spatial and capillary chromatography in the buffer over <br/> tank 42 are communicated. Further, although not particularly shown, each electrophoretic electrode is attached to each buffer over tanks as well as other embodiments described above.

【0028】使用に際し、外側の第2のバッファー槽4
2に試料を注入する。この試料が注入されるバッファー
槽42の底部が試料注入ウェルに相当する。各バッファ
槽にバッファ液を満たした後他の実施例と同様にし
て泳動を行う。この実施例にあってもキャピラリーに設
けられた細孔あるいはキャピラリーの切開した細隙部4
5から電気泳動によりDNA断片が進入し、分子ふるい
膜46の直下である試料保持領域45'に試料が濃縮さ
れて導かれることが容易に理解されよう。その後の動作
方法は第1の実施例と同じである。
In use, the outer second buffer tank 4
2. Inject the sample into 2. The bottom of the buffer tank 42 into which the sample is injected corresponds to a sample injection well. Each buffer
Performing electrophoresis in the same manner as other examples after filling a buffer over liquid chromatography tank. Also in this embodiment, the pores provided in the capillary or the slit portion 4 cut out of the capillary are provided.
From FIG. 5, it can be easily understood that the DNA fragment enters by electrophoresis and the sample is concentrated and led to the sample holding region 45 ′ immediately below the molecular sieve membrane 46. The subsequent operation method is the same as in the first embodiment.

【0029】この実施例において、キャピラリーに設け
られた細孔あるいはキャピラリーの切開した細隙45よ
り上方、即ち内方の第1のバッファー槽41に連結する
キャピラリー内には必ずしもゲルが形成されていなくと
もよい。また、切断部を設ける場合には第1のバッファ
ー槽41は外側の第2のバッファー槽42との間に一定
の位置関係を保ち保持される必要がある。
In this embodiment, the gel is not necessarily formed above the pores provided in the capillary or above the slit 45 formed in the capillary, that is, in the capillary connected to the first buffer tank 41 inside. May be. In the case where a cutting portion is provided, the first buffer tank 41 needs to be held in a fixed positional relationship with the outer second buffer tank 42.

【0030】特に図示しないが、この実施例のものを図
3に示した実施例のような平板型ゲルを用いた装置にも
適用できることは容易に理解されよう。なお、以上の第
1〜第4の実施例では分離部にゲルを持つ場合について
述べたが、ゲルなどの担体を持たない場合にも本発明は
適用できる。
Although not particularly shown, it will be easily understood that this embodiment can be applied to an apparatus using a flat gel like the embodiment shown in FIG. In the above-described first to fourth embodiments, the case where the separation portion has a gel has been described. However, the present invention can be applied to a case where a carrier such as a gel is not provided.

【0031】[0031]

【発明の効果】本発明によれば、広い試料注入ウェルに
注入した試料を電気泳動により、狭い領域に濃縮して保
持した後に、電気泳動分離するので作製した試料の大部
分を有効に分析に使用でき、濃度の低い試料でも感度良
く分離、検出することができる。
According to the present invention, a sample injected into a wide sample injection well is concentrated by electrophoresis in a narrow area and held, and then subjected to electrophoretic separation, so that most of the prepared sample can be effectively analyzed. It can be used and can be separated and detected with high sensitivity even for low concentration samples.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図1】本発明による第1の実施例の概念図。FIG. 1 is a conceptual diagram of a first embodiment according to the present invention.

【図2】本発明による第2の実施例の断面図。FIG. 2 is a sectional view of a second embodiment according to the present invention.

【図3】本発明による平板ゲルを用いた第3の実施例の
断面による見取図。
FIG. 3 is a cross-sectional view of a third embodiment using a flat gel according to the present invention.

【図4】本発明による第4の実施例の断面図。FIG. 4 is a sectional view of a fourth embodiment according to the present invention.

【図5】従来のキャピラリー電気泳動装置の概念図。FIG. 5 is a conceptual diagram of a conventional capillary electrophoresis apparatus.

【符号の説明】[Explanation of symbols]

1…第1バッファー槽、2…第2バッファー槽、60…
第3のバッファー槽、4…試料注入ウェル、5…細管、
5’…細管領域(試料保持部領域)、6…第1の分子ふ
るい膜、26’…第2の分子ふるい膜、71,72,7
3…泳動電極、74…泳動電源切換スウィッチ、75…
泳動電源、a…試料注入部、b…泳動分離部、c…検出
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... 1st buffer tank, 2 ... 2nd buffer tank, 60 ...
Third buffer tank, 4 ... sample injection well, 5 ... capillary,
5 ′: capillary region (sample holding region), 6: first molecular sieve film, 26 ′: second molecular sieve film, 71, 72, 7
3: electrophoresis electrode, 74: electrophoretic power supply switching switch, 75:
Electrophoresis power supply, a: sample injection section, b: electrophoresis separation section, c: detection section

フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−231247(JP,A) 特開 平2−269935(JP,A) 特開 昭61−13148(JP,A) 特開 平4−127049(JP,A) 特開 平2−165047(JP,A) 特開 平1−147355(JP,A) 特開 平3−68860(JP,A) 特開 昭63−262554(JP,A) 特開 平3−223667(JP,A) 特開 平3−87648(JP,A) 特開 昭50−16677(JP,A) 特開 昭63−191051(JP,A) 特開 平5−215716(JP,A) 特表 平4−502516(JP,A) (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) G01N 27/447 WPI(DIALOG)Continuation of the front page (56) References JP-A-63-231247 (JP, A) JP-A-2-269935 (JP, A) JP-A-61-13148 (JP, A) JP-A-4-127049 (JP, A) JP-A-2-165047 (JP, A) JP-A-1-147355 (JP, A) JP-A-3-68860 (JP, A) JP-A-63-262554 (JP, A) JP-A-3-223667 (JP, A) JP-A-3-87648 (JP, A) JP-A-50-16677 (JP, A) JP-A-63-191051 (JP, A) JP-A-5-215716 (JP, A A) Tokuhei 4-502516 (JP, A) (58) Fields surveyed (Int. Cl. 7 , DB name) G01N 27/447 WPI (DIALOG)

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項1】 試料注入部、分離泳動部、検出部、及び
泳動用高圧電源供給部とからなる蛍光検出型電気泳動装
置において、該試料注入部は相互に細管部分で連結され
た二つのバッファ槽及び該細管部分に位置する検出対
象物は通過し得ないが検出対象物より小さいサイズの物
質は通過し得る第1の分子ふるい膜とを有していると共
に、該分離泳動部は該分子ふるい膜の近傍上流側に開口
しており、かつ泳動用高圧電源供給部は該二つのバッフ
槽間及び二つのバッファ槽間の一方と分離泳動部
間とに切り替え自在に接続していることを特徴とする電
気泳動装置。
In a fluorescence detection type electrophoresis apparatus comprising a sample injection section, a separation and migration section, a detection section, and a high voltage power supply section for electrophoresis, the sample injection section is connected to two buffers connected to each other by a thin tube portion. A first molecular sieve membrane through which the detection object located in the vessel and the capillary portion cannot pass but a substance smaller in size than the detection object can pass; switching molecule is opened near the upstream side of the sieve film, and high-voltage power supply unit for electrophoresis and between one and the separation lane area between between the two buffer <br/> § chromatography tank and two buffers over bath An electrophoresis apparatus characterized by being freely connected.
【請求項2】 該細管部分のより上流側には検出対象物
は通過し得うるが検出対象物より大きいサイズの物質の
通過は阻止する第2の分子ふるい膜が設けられており、
該分離泳動部は、第2と第1の分子ふるい膜間の該細管
部分に開口していることを特徴とする、請求項1記載の
装置。
2. A second molecular sieve membrane is provided on the upstream side of the capillary portion so as to allow a detection target to pass therethrough, but to block passage of a substance having a size larger than the detection target,
2. The apparatus according to claim 1, wherein the separation electrophoresis section is open to the capillary portion between the second and first molecular sieve membranes.
【請求項3】 分離泳動部がバッファ液を満たした中
空キャラリーであることを特徴とする、請求項1また
は2記載の装置。
3., wherein the separation lane area is hollow calibration pin rally filled with buffer over liquid, according to claim 1 or 2 wherein.
【請求項4】 分離泳動部がガラスキャラリー内部に
形成されたゲルであることを特徴とする、請求項1ない
し3いずれか記載の装置。
4., wherein the separation lane area is a gel formed inside Garasukya pin rally, device according to any one of claims 1 to 3.
【請求項5】 分離泳動部が2枚のガラス平板の間に形
成された平板型ゲルであることを特徴とする、請求項1
または2記載の装置。
5. The method according to claim 1, wherein the separation electrophoresis section is a flat gel formed between two glass flat plates.
Or the apparatus according to 2.
【請求項6】 分子ふるい膜面積を該分離泳動部の断面
積とほぼ等しいかあるいはより小さな面積に制限する手
段を具備することを特徴とする、請求項1ないし5いず
れか記載の装置。
6. The apparatus according to claim 1, further comprising means for limiting an area of the molecular sieve membrane to an area substantially equal to or smaller than a cross-sectional area of the separation / phoresis section.
【請求項7】 第1、第2のバッファー槽と、前記第
1、第2のバッファー槽を連結する細管と、一方の端部
が前記細管の途中に開口し、検出対象物を電気泳動分離
する分離泳動部と、前記一方の端部と前記第1のバッフ
ァー槽との間の前記細管の途中に配置され、前記検出対
象物を通過させず前記検出対象物より小さいサイズの物
質を通過させる分子ふるい膜と、前記第1、第2のバッ
ファー槽内にそれぞれ配置される第1、第2の電極とを
具備し、前記第1の電極と前記第2の電極との間に電圧
が印加され、前記第2のバッファー槽に注入された前記
検出対象物を含む試料が濃縮されて、前記分子ふるい膜
と前記一方の端部との間の前記細管の部分に保持される
ことを特徴とする電気泳動装置。
7. A first and second buffer tank, a thin tube connecting the first and second buffer tanks, one end of which is opened in the middle of the thin tube, and an object to be detected is electrophoretically separated. Separation electrophoresis section, which is disposed in the middle of the thin tube between the one end and the first buffer tank, and allows a substance having a size smaller than the detection target to pass without passing the detection target. A molecular sieve membrane, and first and second electrodes respectively disposed in the first and second buffer tanks, wherein a voltage is applied between the first electrode and the second electrode. The sample containing the detection object injected into the second buffer tank is concentrated, and is held in a portion of the capillary tube between the molecular sieve membrane and the one end. Electrophoresis device.
【請求項8】 第1、第2のバッファー槽と、前記第
1、第2のバッファー槽を連結する細管と、一方の端部
が前記細管の途中に開口し、検出対象物を電気泳動分離
する分離泳動部と、前記細管の前記第1のバッファー槽
の末端側に配置され、前記検出対象物を通過させず前記
検出対象物より小さいサイズの物質を通過させる第1の
分子ふるい膜と、前記細管の前記第2のバッファー槽の
末端側に配置され、前記検出対象物を通過させ前記検出
対象物より大きいサイズの物質の通過を阻止する第2の
分子ふるい膜と、前記第1、第2のバッファー槽内にそ
れぞれ配置される第1、第2の電極とを具備し、前記第
1の電極と前記第2の電極との間に電圧が印加され、前
記第2のバッファー槽に注入された前記検出対象物を含
む試料が濃縮されて、前記第1の分子ふるい膜と前記一
方の端部との間の前記細管の部分に保持されることを特
徴とする電気泳動装置。
8. A first and second buffer tank, a thin tube connecting the first and second buffer tanks, one end of which is opened in the middle of the thin tube, and an object to be detected is electrophoretically separated. A separation and migration section, and a first molecular sieve membrane that is disposed on the terminal side of the first buffer tank of the thin tube and allows a substance smaller in size than the detection target to pass without passing the detection target; A second molecular sieve membrane that is disposed on the terminal side of the second buffer tank of the thin tube and that allows the detection target to pass therethrough and blocks the passage of a substance having a size larger than the detection target; And a first electrode and a second electrode disposed in the second buffer tank, respectively. A voltage is applied between the first electrode and the second electrode, and the voltage is applied to the second buffer tank. The sample containing the detection target is concentrated, An electrophoresis apparatus, wherein the electrophoresis apparatus is held in a portion of the capillary tube between the first molecular sieve membrane and the one end.
【請求項9】 第1、第2のバッファー槽と、前記第2
のバッファー槽の底部に配置される複数の試料注入ウェ
ルと、前記第1のバッファー槽と前記各試料注入ウェル
とを連結する複数の細管と、一方の端部が前記複数の細
管の各々の途中に開口し、検出対象物を電気泳動分離す
る複数の電気泳動路を有する分離泳動部と、前記複数の
細管の前記第1のバッファー槽の側の末端に配置され、
前記検出対象物を通過させず前記検出対象物より小さい
サイズの物質を通過させる第1の分子ふるい膜と、前記
複数の細管の前記第2のバッファー槽の側の末端と前記
各試料注入ウェルとの間に配置され、前記検出対象物を
通過させ前記検出対象物より大きいサイズの物質の通過
を阻止する第2の分子ふるい膜と、前記第1、第2のバ
ッファー槽内にそれぞれ配置される第1、第2の電極と
を具備し、前記第1の電極と前記第2の電極との間に電
圧が印加され、前記各試料注入ウェルに注入された前記
検出対象物を含む試料が濃縮されて、前記第1の分子ふ
るい膜と前記複数の電気泳動路の一方の端部との間に前
記複数の細管の部分に保持されることを特徴とする電気
泳動装置。
9. The first and second buffer tanks and the second buffer tank.
A plurality of sample injection wells arranged at the bottom of the buffer tank, a plurality of thin tubes connecting the first buffer tank and each of the sample injection wells, and one end portion is in the middle of each of the plurality of thin tubes. The separation electrophoresis section having a plurality of electrophoresis paths for electrophoretically separating the detection target, and disposed at the end of the plurality of thin tubes on the side of the first buffer tank,
A first molecular sieve membrane that allows passage of a substance smaller in size than the detection target without passing through the detection target, an end of the plurality of capillaries on the side of the second buffer tank, and each of the sample injection wells; And a second molecular sieve membrane that passes through the detection target and blocks a substance having a size larger than the detection target, and is disposed in the first and second buffer tanks, respectively. A first electrode, a second electrode, a voltage is applied between the first electrode and the second electrode, and the sample containing the detection target injected into each of the sample injection wells is concentrated. The electrophoresis apparatus is characterized in that the electrophoresis apparatus is held between the first molecular sieve membrane and one end of the plurality of electrophoresis paths by the plurality of capillary tubes.
【請求項10】 第2のバッファー槽と、前記第2のバ
ッファー槽の内部に配置される第1のバッファー槽と、
一方の端部が前記第1のバッファー槽の底部に接続し、
前記第2のバッファー槽に連通する細孔を有し、前記第
2のバッファー槽の底部を貫通する電気泳動部であり、
検出対象物を電気泳動分離する分離泳動部と、前記分離
泳動部の前記一方の端部に配置され、前記検出対象物を
通過させず前記検出対象物より小さいサイズの物質を通
過させる分子ふるい膜と、前記第1、第2のバッファー
槽内にそれぞれ配置される第1、第2の電極とを具備
し、前記第1の電極と前記第2の電極との間に電圧が印
加され、前記第2のバッファー槽に注入された前記検出
対象物を含む試料が濃縮されて、前記分子ふるい膜と前
記細孔が形成された部位との間の前記電気泳動路の部分
に保持されることを特徴とする電気泳動装置。
10. A second buffer tank, a first buffer tank disposed inside the second buffer tank,
One end is connected to the bottom of the first buffer tank,
An electrophoresis section having pores communicating with the second buffer tank and penetrating the bottom of the second buffer tank;
A separation electrophoresis section for electrophoretically separating an object to be detected, and a molecular sieve membrane disposed at the one end of the separation electrophoresis section and passing a substance smaller in size than the object to be detected without passing through the object to be detected And a first and a second electrode respectively disposed in the first and second buffer tanks, wherein a voltage is applied between the first and the second electrodes, The sample containing the object to be detected injected into the second buffer tank is concentrated and held in a portion of the electrophoresis path between the molecular sieve membrane and the site where the pores are formed. Characteristic electrophoresis device.
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