JP3072579B2 - Alkaline lipase, microorganism producing the same and detergent composition containing alkaline lipase - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は新規なアルカリリパーゼ
およびそれを生産する微生物及び用途に関する。さらに
詳しくいえば、シュードモナス（Pseudomonas ）属細菌
の生産するアルカリ側に至適ｐＨを有する新規リパーゼ
およびそれを生産する微生物およびアルカリ性領域で脂
質類を加水分解することが出来る酵素を含有し、洗濯時
溶液がアルカリ性ｐＨを有する洗剤組成物に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a novel alkaline lipase, a microorganism producing the same and a use thereof. More specifically, it contains a novel lipase having an optimum pH on the alkaline side produced by a bacterium of the genus Pseudomonas, a microorganism producing the lipase, and an enzyme capable of hydrolyzing lipids in an alkaline region. It relates to a detergent composition wherein the solution has an alkaline pH.

【０００２】[0002]

【従来の技術】リパーゼは、乳製品のフレーバー形成の
ための食品加工用酵素、消化剤としての医療用酵素、血
中脂質の測定のための診断用酵素、油脂の加水分解や改
質のための工業用酵素等として広範囲に使用されてい
る。近年は、さらに洗剤配合組成物としてのリパーゼの
用途が注目されている。洗剤組成物にプロテアーゼを配
合して被洗浄物に付着したタンパク質その他汚垢を分解
除去することは、従来から知られている。また、セルラ
ーゼを配合してセルロース繊維被洗浄物に付着した汚垢
を除去すること、あるいはアミラーゼ等の糖質分解酵素
を配合して被洗浄物に付着した糖質その他汚垢を分解除
去することも知られている。更に、近年においては、リ
パーゼを配合して被洗浄物に付着した脂質類を分解除去
し洗浄効率を向上出来ることが知られている。この用途
は、アンドレー（Ｈ．Ａｎｄｒｅｅ）らによる「洗浄剤
成分としてのリパーゼ」（Ｌｉｐａｓｅ ａｓ ｄｅｔ
ｅｒｇｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）と題する報文
（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，２，２１８−２２９（１９８０））等
に記載されている。2. Description of the Related Art Lipase is used as an enzyme for food processing for flavor formation of dairy products, a medical enzyme as a digestive agent, a diagnostic enzyme for measuring blood lipids, and for hydrolysis and modification of fats and oils. Widely used as industrial enzymes and the like. Recently it is further noted lipase applications as a detergent formulation composition. 2. Description of the Related Art It has been conventionally known that a protease is added to a detergent composition to decompose and remove proteins and other dirt attached to an object to be washed. In addition, cellulase is blended to remove dirt attached to cellulose fiber to-be-cleaned material, or carbohydrate-decomposing enzyme such as amylase is blended to decompose and remove sugar and other dirt attached to the material to be washed. Is also known. Furthermore, in recent years, it has been known that lipase can be incorporated to decompose and remove lipids attached to an object to be washed, thereby improving washing efficiency. This use is described in "Lipase as det" by H. Andree et al.
Journal components of Applied Bioch.
emistry, 2, are described in 218-229 (1980)) or the like.

【０００３】好ましい洗剤配合用リパーゼは、通常の洗
濯条件では洗浄液のｐＨがアルカリ性領域にあるため、
アルカリ性ｐＨで機能するアルカリリパーゼである。ま
た、一般に脂質汚れは高温高アルカリ条件下では比較的
除去されやすいが、低温（６０℃以下）の洗浄では十分
に脂質汚れを除去出来ないことが知られている。従来よ
り主として低温洗濯が行われている我国はもとより、欧
米においても洗濯温度は低温化する傾向にあり、従っ
て、好ましい洗剤配合用リパーゼは、低温で十分に機能
するものである。また、好ましい洗剤配合用リパーゼ
は、界面活性剤等の洗剤成分や、多くの洗剤に含有され
ているプロテアーゼの存在下でも洗濯時に安定に機能を
発揮し得るものである。また、界面活性剤等の洗剤成分
による活性阻害が少なく、さらに、洗剤に配合した状態
で保存する時にも安定であるものである。以上のような
好ましい特性を有するリパーゼを配合してなる脂質汚れ
に対し高い洗浄効果を有する洗剤組成物の開発が望まれ
ている。[0003] A preferred detergent-containing lipase has a pH of a washing solution in an alkaline range under normal washing conditions.
It is an alkaline lipase that functions at alkaline pH. In general, it is known that lipid soil is relatively easily removed under high-temperature and high-alkali conditions, but it cannot be sufficiently removed by washing at a low temperature (60 ° C. or lower). The washing temperature tends to be low in Europe and the United States, as well as in Japan, where low-temperature washing has been mainly carried out conventionally. Therefore, preferred lipases for detergent blending function sufficiently at low temperatures. Further, a preferred lipase for detergent blending is a lipase capable of stably exerting a function at the time of washing even in the presence of detergent components such as surfactants and proteases contained in many detergents. In addition, the activity is little inhibited by a detergent component such as a surfactant, and is stable when stored in a state in which the detergent is added to the detergent. There is a demand for the development of a detergent composition having a high cleaning effect on lipid stains containing lipase having the above-mentioned preferable properties.

【０００４】微生物の生産するリパーゼは、シュードモ
ナス（Pseudomonas ）属、アルカリゲネス（Alcaligene
s ）属、アクロモバクター（Achromobacter ）属、ムコ
ール（Mucor ）属、キャンディダ（Candida ）属、フミ
コーラ（Humicola）属等に由来することが知られてい
る。しかしながら、これらから得られる大部分のリパー
ゼはその至適ｐＨが中性から微アルカリ性にあり、アニ
オン性界面活性剤に対する安定性が低い。さらには、ア
クロモバクター（Achromobacter ）属、キャンディダ
（Candida ）属、ムコール（Mucor ）属、フミコーラ
（Humicola）属の各リパーゼは、アニオン性界面活性剤
の共存下においてその活性を強く阻害される。[0004] Lipases produced by microorganisms are of the genus Pseudomonas , Alcaligene.
s ), genus Achromobacter, genus Mucor, genus Candida, genus Humicola and the like. However, most of the lipases obtained from these have a neutral to slightly alkaline pH optimum and have low stability to anionic surfactants. Furthermore, Achromobacter (Achromobacter) genus Candida (Candida) spp, Mucor (Mucor) genus Humicola (Humicola) genus each lipase is strongly inhibited its activity in the presence of an anionic surfactant .

【０００５】また、シュードモナス（Pseudomonas ）属
に属する微生物がリパーゼを生産することは広く知られ
ており、シュードモナス（Pseudomonas ）属の菌株には
シュードモナス・フルオレッセンス（ Ps. fluorescen
s ）、シュードモナス・セパシア（ Ps. cepacia ）、
シュードモナス・フラギ（ Ps. fragi ）、シュードモ
ナス・アルカリゲネス（ Ps. alcaligenes ）、シュー
ドモナス・アエルギノサ（ Ps. aeruginosa）がある。
しかしこれらの菌株から得られる公知の酵素も前記の特
性を満足するものではない。It is widely known that microorganisms belonging to the genus Pseudomonas produce lipase, and some strains belonging to the genus Pseudomonas include Pseudomonas fluorescen .
s ), Ps. cepacia ,
Pseudomonas fragi (Ps. Fragi), Pseudomonas Alcaligenes (Ps. Alcaligenes), there is a Pseudomonas aeruginosa (Ps. Aeruginosa).
However, known enzymes obtained from these strains do not satisfy the above-mentioned properties.

【０００６】[0006]

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、至適
ｐＨが高アルカリ側にあり、洗剤成分により活性がほと
んど阻害されることがなく、且つ界面活性剤やプロテア
ーゼ等の洗剤成分に対する安定性の高いアルカリリパー
ゼを提供しようとするものである。また、かかるアルカ
リリパーゼを含有する酵素含有洗剤組成物を提供するも
のである。さらにまた、前記アルカリリパーゼの他にプ
ロテアーゼを含んでなる、２種以上の酵素を含有する酵
素含有洗剤組成物を提供するものである。Accordingly, the present invention has an optimum pH on the high alkali side, the activity is hardly inhibited by detergent components, and the stability to detergent components such as surfactants and proteases. It is intended to provide an alkaline lipase having a high lipase. The present invention also provides an enzyme-containing detergent composition containing such an alkaline lipase. Still another object of the present invention is to provide an enzyme-containing detergent composition containing two or more enzymes, which comprises a protease in addition to the alkaline lipase.

【０００７】[0007]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記の性
質を有するアルカリリパーゼを得るべく、多数の微生物
を分離、培養して検索した結果、東京都下の土壌より分
離した菌株であるシュードモナス・メンドシナ（ Pseud
omonas mendocina ）ＳＤ７０２株に代表されるシュー
ドモナス（Pseudomonas ）属に属する菌株が、洗浄剤組
成物配合用として有効な新規なアルカリリパーゼを生産
することを見出した。また、本発明者らは、シュードモ
ナス・メンドシナ（ Pseudomonas mendocina ）NCIMB1
0541株、またはNCIMB10542株、またはNCIMB10543株の培
養物より得られるリパーゼも前記のアルカリリパーゼと
同一の性質をもち、洗浄剤組成物配合用として有効なア
ルカリリパーゼであることを見出した。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present inventors isolated and cultured a large number of microorganisms to obtain alkaline lipase having the above-mentioned properties, and found that the microorganisms were isolated from the soil under Tokyo. Pseud Monas Mendocina
omonas mendocina) SD702 Pseudomonas typified strain (Pseudomonas) strains belonging to the genus were found to produce an effective novel alkaline lipases as detergent composition formulation. The present inventors have also proposed that Pseudomonas mendocina NCIMB1
The lipase obtained from the culture of the 0541 strain, the NCIMB10542 strain, or the NCIMB10543 strain was also found to have the same properties as the above-mentioned alkaline lipase and to be an effective alkaline lipase for blending a detergent composition.

【０００８】従来、種々の菌株により産生されたリパー
ゼおよびリパーゼ配合洗剤組成物が知られているが、シ
ュードモナス・メンドシナに由来するアルカリリパーゼ
およびシュードモナス・メンドシナに由来するアルカリ
リパーゼを配合した洗浄組成物は知られていない。本発
明者らは、シュードモナス・メンドシナが産生する新規
なアルカリリパーゼが洗剤配合用酵素として極めて有効
であることを見いだし、本発明を完成するに至った。Conventionally, lipases produced by various strains and detergent compositions containing lipase have been known. However, cleaning compositions containing alkaline lipase derived from Pseudomonas mendocina and alkaline lipase derived from Pseudomonas mendocina are known. unknown. The present inventors have found that a novel alkaline lipase produced by Pseudomonas mendocina is extremely effective as an enzyme for blending detergents, and have completed the present invention.

【０００９】[0009]

【生産菌】本発明のアルカリリパーゼを製造するために
使用する微生物は、後記の性質を有するアルカリリパー
ゼを生産することができるシュードモナス（Pseudomona
s）属細菌であれば特に限定されない。この様な細菌
は、保存菌株中から、または自然界から新たに分離した
微生物中から選択することができる。またこれらの細菌
の、自然または人為的変異株であっても、後記の如き特
性を有するアルカリリパーゼの産生能を有する限り、当
然包含されるものである。細菌菌株は土壌その他の分離
源から常法に従って分離することができる。目的とする
菌株の選択は、被検微生物を例えば通常の細菌用培地中
で培養し、そして培養物（培地または菌体）中の高ｐＨ
常温条件下でのリパーゼ活性を常法に従って測定するこ
とにより行なうことができる。[Production Bacteria] The microorganism used for producing the alkaline lipase of the present invention is Pseudomonas ( Pseudomona) capable of producing alkaline lipase having the following properties.
s ) It is not particularly limited as long as it is a genus bacterium. Such a bacterium can be selected from a stock strain or a microorganism newly isolated from nature. Naturally or artificially mutant strains of these bacteria are naturally included as long as they have the ability to produce alkaline lipase having the following properties. Bacterial strains can be isolated from soil or other sources according to standard methods. Selection of the target strain is performed by culturing the test microorganism in, for example, a normal bacterial medium, and then increasing the pH of the culture (medium or bacterial cells).
It can be carried out by measuring lipase activity under normal temperature conditions according to a conventional method.

【００１０】本発明の新規なリパーゼを生産するシュー
ドモナス（Pseudomonas ）属に属する菌株の一例とし
て、本発明者らが東京都下の土壌より分離したＳＤ７０
２株が挙げられる。[0010] As an example of a strain belonging to Pseudomonas (Pseudomonas) genus to produce a novel lipase of the present invention, the inventors have isolated from the soil under Tokyo SD70
There are two strains.

【００１１】このＳＤ７０２株は下記の性質を有する。 （ａ）形態 (1) 細胞の形および大きさ：0.5 〜0.7 ×2.2 〜3.3 ミ
クロンの直状桿菌。 (2) 細胞の多形性：なし。 (3) 運動性：あり、極単毛を持つ。 (4) 胞子：なし。 (5) グラム染色：陰性。 (6) 抗酸性：なし。This strain SD702 has the following properties. (A) Morphology (1) Shape and size of cells: straight bacilli of 0.5 to 0.7 × 2.2 to 3.3 microns. (2) Cell polymorphism: None. (3) Motility: Yes, with extremely single hair. (4) Spores: None. (5) Gram staining: negative. (6) Acid resistance: None.

【００１２】（ｂ）生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養：集落は拡散性でなめらか、色素
の産生はない。 (2) 肉汁寒天斜面培養：菌苔は拡散性で周辺はなめら
か、色素の産生はない。 (3) 肉汁液体培養：培地全体に生育し、沈殿が認められ
る。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養：培地上部にのみ生育し、液
化は認められない。 (5) リトマスミルク：微アルカリ性、凝固は認められな
い。(B) Growth state (1) Gravy agar plate culture: The colonies are diffuse and smooth, and do not produce pigment. (2) Gravy agar slant culture: Bacterial moss is diffusible, the periphery is smooth, and there is no pigment production. (3) Liquid broth culture: Growing throughout the medium, with precipitation. (4) Broth gelatin puncture culture: grows only in the upper part of the medium, no liquefaction is observed. (5) Litmus milk: slightly alkaline, no coagulation observed.

【００１３】（ｃ）生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元：陽性。 (2) 脱窒反応：陰性。 (3) ＭＲテスト：陰性。 (4) ＶＰテスト：陰性。 (5) インドールの生成：陰性。 (6) 硫化水素の生成：陰性。 (7) デンプンの加水分解：陰性。 (8) クエン酸の利用：陽性。 (9) 無機窒素源の利用：硝酸塩、アンモニウム塩を利用
する。 (10)色素の生成：非水溶性色素を生成し、水溶性色素お
よび蛍光色素を生成しない。 (11)ウレアーゼ：陰性。 (12)オキシダーゼ：陽性。 (13)カタラーゼ：陽性。 (14)生育のｐＨ範囲：５〜１２．５。 (15)生育の温度範囲：５〜４３℃。 (16)酸素に対する態度：好気性。 (17)ＯＦテスト：酸化。 (18)糖類からの酸およびガスの産生：Ｄ−グルコース、
Ｄ−フラクトースおよびグリセリンから酸を産生する
が、ガスは産生しない；Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロ
ース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、麦芽糖、シ
ョ糖、乳糖、トレハロース、Ｄ−ソルビット、イノシッ
トおよびデンプンからは酸、ガスいずれも生成しない。(C) Physiological properties (1) Reduction of nitrate: positive. (2) Denitrification reaction: negative. (3) MR test: negative. (4) VP test: negative. (5) Indole formation: negative. (6) Production of hydrogen sulfide: negative. (7) Starch hydrolysis: negative. (8) Use of citric acid: positive. (9) Use of inorganic nitrogen source: Use nitrate and ammonium salts. (10) Dye formation: Generates water-insoluble dyes and does not generate water-soluble dyes and fluorescent dyes. (11) Urease: negative. (12) Oxidase: positive. (13) Catalase: positive. (14) pH range for growth: 5-12.5. (15) Temperature range for growth: 5-43 ° C. (16) Attitude to oxygen: aerobic. (17) OF test: oxidation. (18) Production of acids and gases from sugars: D-glucose,
Produces acid from D-fructose and glycerin but not gas; from L-arabinose, D-xylose, D-mannose, D-galactose, maltose, sucrose, lactose, trehalose, D-sorbitol, inosit and starch Produces neither acid nor gas.

【００１４】（ｄ）その他の性質 (1) 塩化ナトリウムの耐性：７％までのＮａＣｌ存在下
で生育する。 (2) 脂肪の分解：Tween 80、トリブチリン、トリアセチ
ン、植物油などを分解する。 (3) 炭素化合物の資化性：グルコースおよびゲラニオー
ルを資化する。デンプンを分解しない。ゼラチンを液化
しない。 (4) ビタミン要求性：陰性。 (5) ＰＨＢの蓄積：陰性。 (6) アルギニンジヒドラターゼ：陽性。 (7) フェニルアラニン脱アミノ酸反応：陰性。(D) Other properties (1) Resistance to sodium chloride: grows in the presence of up to 7% NaCl. (2) Decomposition of fats: Decomposes Tween 80, tributyrin, triacetin, vegetable oil, etc. (3) Utilization of carbon compounds: Utilizes glucose and geraniol. Does not degrade starch. Do not liquefy gelatin. (4) Vitamin requirement: negative. (5) PHB accumulation: negative. (6) Arginine dihydratase: positive. (7) Phenylalanine deamino acid reaction: negative.

【００１５】上記の菌学的性質を有する本菌の分類学上
の性質をバージーズ・マニュアル・オブ・システマチッ
ク・バクテオロジー（Bergey's Mannual of Systematic
Bacteriology, 1984 ）を参考にして他の菌株と比較し
た結果、本菌株はシュードモナス・メンドシナ（ Pseud
omonas mendocina ）と同定された。本菌株は工業技術
院微生物工業研究所に微工研菌寄第12944 号として寄託
されている。The taxonomic properties of the bacterium having the above-mentioned mycological properties are described by Bergey's Manual of Systematic Bacteriology.
Bacteriology, 1984) and compared with other strains, this strain was found to be Pseudomonas mendocina ( Pseud
omonas mendocina ). This strain has been deposited with the Institute of Microbial Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as Microorganism Kenkyu No. 12944.

【００１６】[0016]

【培養方法】本発明のアルカリリパーゼを生産するにあ
たってはシュードモナス（Pseudomonas ）属に属する本
アルカリリパーゼ生産菌を培地に培養する。培地の栄養
源としては、通常培養に用いられているものが広く利用
できる。炭素源としては同化できる炭素化合物またはこ
れを含有するものであればよく、例えば、ブドウ糖、グ
リセリン、油脂、コーンスティープリカー、Tween 系界
面活性剤などが用いられる。窒素源としても同化可能な
窒素化合物、またはこれを含有するものであればよく、
例えばアンモニウム塩、硝酸塩、大豆粉、肉エキス、コ
ーンスティープリカー、ファーマメディアなどが用いら
れる。また、無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム
塩などの塩類が使用される。[Culture method] In producing the alkaline lipase of the present invention, the present alkaline lipase-producing bacterium belonging to the genus Pseudomonas is cultured in a medium. As the nutrient source of the medium, those commonly used for culture can be widely used. The carbon source may be any assimilable carbon compound or a compound containing the same. For example, glucose, glycerin, oil and fat, corn steep liquor, Tween-based surfactant and the like are used. Any nitrogen compound that can be assimilated as a nitrogen source, or any compound containing it,
For example, ammonium salts, nitrates, soybean flour, meat extracts, corn steep liquor, pharma media and the like are used. Salts such as phosphates and magnesium salts are used as the inorganic salts.

【００１７】培養条件は培地組成により多少異なるが、
生産の目的物であるアルカリリパーゼの生産に最も有利
な条件を選択する。培養温度は１０〜４０℃、好ましく
は２０〜３７℃の範囲であり、培養時間は８時間から１
００時間程度であり、アルカリリパーゼ生産が最高に達
したときに培養を終了すればよい。培地のｐＨは７〜9.
5 がアルカリリパーゼ生産に好適である。この様な培養
により、目的とするアルカリリパーゼは主として菌体外
（培養液中）に得られる。The culture conditions vary somewhat depending on the medium composition.
The most advantageous conditions for the production of alkaline lipase, which is the object of production, are selected. The culture temperature ranges from 10 to 40 ° C, preferably from 20 to 37 ° C, and the culture time ranges from 8 hours to 1 hour.
It is about 00 hours, and the culture may be terminated when the production of alkaline lipase reaches the maximum. The pH of the medium is 7-9.
5 is suitable for alkaline lipase production. By such a culture, the desired alkaline lipase is mainly obtained outside the cells (in the culture solution).

【００１８】[0018]

【分離精製法】この様にして得られた培養液からのアル
カリリパーゼの採取は、リパーゼを採取するための常法
にしたがって分離、精製することにより行なうことがで
きる。すなわち、培養液からろ過法や遠心分離法などの
公知の適当な方法により菌体や培地固形物を分離して得
られる上清液またはろ液を分離し、この分離液を濃縮し
または濃縮することなく、可溶性塩類を添加して酵素を
沈殿させる塩析法、親水性有機溶媒を添加し酵素あるい
は夾雑物を沈殿させる有機溶剤沈殿法、イオン交換樹脂
等を用いた吸着脱離法、ゲルろ過法、安定補助剤を加え
てまたは安定補助剤なしに噴霧乾燥する方法、凍結乾燥
法等の分離もしくは精製手段を単独または複数組み合わ
せて用いることにより、アルカリリパーゼを得ることが
できる。[Separation and Purification Method] Alkaline lipase can be collected from the culture solution thus obtained by separating and purifying according to a conventional method for collecting lipase. That is, the supernatant or the filtrate obtained by separating the cells and the solid medium is separated from the culture by a known appropriate method such as filtration or centrifugation, and the separated solution is concentrated or concentrated. Salting out method to precipitate enzymes by adding soluble salts without any problem, organic solvent precipitation method to add hydrophilic organic solvent to precipitate enzymes or impurities, adsorption / desorption method using ion exchange resin, gel filtration Alkaline lipase can be obtained by using a separation or purification means such as a spray drying method with or without a stabilizing aid or a freeze-drying method, alone or in combination.

【００１９】[0019]

【酵素力価の測定方法】リパーゼ活性の測定は、本発明
においてはトリオレイン−ポリビニルアルコール（ＰＶ
Ａ）エマルジョンを基質とするＴＬＣ−ＦＩＤ測定法、
またはオリーブ油−ＰＶＡあるいはオリーブ油−アラビ
アゴムを基質とするｐＨスタット滴定法を用いて実施し
た。ＴＬＣ−ＦＩＤ測定法は具体的には以下の方法で行
なった。酵素液 0.1ml、１００mMトリス緩衝液（ｐＨ9.
0 ）0.4ml 、およびトリオレインエマルジョン0.5ml か
らなる混合液を共栓付き試験管中で３７℃にて１０分間
加熱して反応させ、反応停止液として１Ｎ塩酸0.2ml を
用いて反応を停止させた。ここでトリオレインエマルジ
ョンとしては、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）２％水
溶液（ポバールＰＶＡ１１７（（株）クラレ商品名）：
ポバールＰＶＡ２０５（（株）クラレ商品名）９：１）
１５mlに1.5 ｇのトリオレインを加え、氷冷しながら18
000 rpm 、１０分間ホモジナイズしたものを用いた。反
応停止後、ｎ−ヘキサン２ml、イソプロピルアルコール
２ml、蒸留水１mlを加え、激しく撹拌し、静置後ヘキサ
ン層をサンプリングし、ＴＬＣ−ＦＩＤ法（ Minagawa
ら，Lipids, 18, 732, 1983 ）にてオレイン酸を定量し
た。活性の単位は１分間に１マイクロモルのオレイン酸
を生成する酵素量を１ユニット（Ｕ）とした。[Method for measuring enzyme titer] The lipase activity was measured in the present invention by triolein-polyvinyl alcohol (PV).
A) TLC-FID measurement method using emulsion as a substrate,
Alternatively, the measurement was performed using a pH stat titration method using olive oil-PVA or olive oil-gum arabic as a substrate. The TLC-FID measurement method was specifically performed by the following method. Enzyme solution 0.1 ml, 100 mM Tris buffer (pH 9.
0) A mixture of 0.4 ml and 0.5 ml of triolein emulsion was reacted by heating at 37 ° C. for 10 minutes in a test tube with a stopper and the reaction was stopped using 0.2 ml of 1N hydrochloric acid as a reaction stopping solution. Was. Here, as the triolein emulsion, a 2% aqueous solution of polyvinyl alcohol (PVA) (Poval PVA117 (trade name of Kuraray Co., Ltd.)):
Poval PVA205 (trade name of Kuraray Co., Ltd.) 9: 1)
Add 1.5 g of triolein to 15 ml, and add
The homogenized sample was used at 000 rpm for 10 minutes. After stopping the reaction, 2 ml of n-hexane, 2 ml of isopropyl alcohol and 1 ml of distilled water were added, and the mixture was vigorously stirred. After standing, the hexane layer was sampled, and the TLC-FID method (Minagawa)
Oleic acid was determined by Lipids, 18 , 732, 1983). The unit of activity was 1 unit (U) of the amount of the enzyme that produced 1 micromol of oleic acid per minute.

【００２０】ｐＨスタット滴定法は具体的には以下の方
法にて行なった。基質のオリーブ油−アラビアゴムエマ
ルジョンは、オリーブ油１０ｇにアラビアゴム１０ｇ、
水１００ｇを加え、氷冷しながら25000 rpm で１０分間
ホモジナイズして調製した。またオリーブ油−ＰＶＡエ
マルジョンはオリーブ油１０ｇに前記ＰＶＡ２％水溶液
１００mlを加え、氷冷しながら18000 rpm で１０分間ホ
モジナイズして調製した。基質エマルジョン５ml、１１
０mM−ＮａＣｌを含む１０mMトリス緩衝液（ｐＨ9.0 ）
５ml、水4.5ml 、酵素液0.5ml の混合物を３０℃、ｐＨ
９にて反応せしめたときの脂肪酸生成速度を0.05Ｎ Ｎ
ａＯＨ水溶液の滴定速度より求めた。活性の単位は１分
間に１マイクロモルの脂肪酸を生成する酵素量である。Specifically, the pH stat titration method was performed by the following method. The olive oil-gum arabic emulsion of the substrate is composed of 10 g of olive oil, 10 g of gum arabic,
It was prepared by adding 100 g of water and homogenizing at 25,000 rpm for 10 minutes while cooling with ice. The olive oil-PVA emulsion was prepared by adding 100 ml of the PVA 2% aqueous solution to 10 g of olive oil and homogenizing at 18,000 rpm for 10 minutes while cooling with ice. Substrate emulsion 5ml, 11
10 mM Tris buffer (pH 9.0) containing 0 mM NaCl
A mixture of 5 ml, 4.5 ml of water and 0.5 ml of the enzyme solution was added at 30 ° C, pH
The rate of fatty acid production at the time of reaction at
It was determined from the titration rate of the aOH aqueous solution. The unit of activity is the amount of enzyme that produces 1 micromole of fatty acids per minute.

【００２１】また、プロテアーゼ活性は、特公昭60-551
18号に記載の力価測定法により測定し、活性の単位は、
nkatal（ナノカタール；nkatal＝１０^-9katal ）で表示
した。Further, the protease activity was determined by
Measured by the titration method described in No. 18, the unit of activity is
nkatal (nano Qatar; nkatal = ^10-9 katal) was displayed.

【００２２】[0022]

【酵素の性質】本発明に属するアルカリリパーゼの一例
として、前記のシュードモナス・メンドシナ（ Pseudom
onas mendocina ）ＳＤ７０２株が生産するアルカリリ
パーゼについて、その性質を記載する。[Properties of the enzyme] As an example of the alkaline lipase belonging to the present invention, the above-mentioned Pseudomonas mendocina ( Pseudom
onas mendocina ) The properties of alkaline lipase produced by strain SD702 are described.

【００２３】（１）作用 グリセリドに作用し、そのエステル結合を加水分解す
る。(1) Action Acts on glyceride to hydrolyze the ester bond.

【００２４】（２）基質特異性 各種グリセリド、エステルなどを広範囲にわたり加水分
解する。(2) Substrate specificity Various glycerides, esters and the like are hydrolyzed over a wide range.

【００２５】グリセリド基質としては、各グリセリド−
アラビアゴムエマルジョンを用いた。用いたエマルジョ
ンは各グリセリド１０ｇにアラビアゴム１０ｇ、水１０
０ｇを加え、氷冷しながら25000 rpm で１０分間ホモジ
ナイズしたものである。前記エマルジョン５ml、１１０
mM ＮａＣｌおよび２６mM ＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏを含
む１０mMトリス緩衝液（ｐＨ9.0 ）５ml、水4.5ml 、酵
素液0.5ml の混合物を３０℃、ｐＨ９にて反応せしめた
ときの脂肪酸生成速度を0.05Ｎ ＮａＯＨ水溶液を用い
たｐＨスタット滴定法により求めた。この脂肪酸生成速
度を各基質の分解力とした。トリオレインの分解力を１
００とすると、トリブチリン１０１、オリーブ油１０
０、大豆油１１３、綿実油１０１の相対活性を示す。As the glyceride substrate, each glyceride-
Gum arabic emulsion was used. The emulsion used was 10 g of glyceride, 10 g of gum arabic and 10 g of water.
After adding 0 g, the mixture was homogenized at 25,000 rpm for 10 minutes while cooling on ice. 5 ml of the emulsion, 110
When a mixture of 5 ml of 10 mM Tris buffer (pH 9.0) containing mM NaCl and 26 mM CaCl ₂ .2H ₂ O, 4.5 ml of water and 0.5 ml of the enzyme solution was reacted at 30 ° C. and pH 9, the fatty acid production rate was 0.05. It was determined by a pH stat titration method using an N NaOH aqueous solution. This fatty acid production rate was defined as the decomposition power of each substrate. Decomposition power of triolein by 1
00, tributyrin 101, olive oil 10
0 shows the relative activities of soybean oil 113 and cottonseed oil 101.

【００２６】また、エステルに対する分解力は、ｐ−ニ
トロフェニル脂肪酸エステルを基質とし、ｐＨ9.0 、３
０℃での加水分解反応により生じるｐ−ニトロフェノー
ルの比色（ＯＤ₄₀₅ ）より求めた。ｐＮＰＰ（ｐ−ニト
ロフェニルパルミテート）の分解力を１００とした場
合、ｐＮＰＶ（ｐ−ニトロフェニルバレレート）３４、
ｐＮＰＢ（ｐ−ニトロフェニルブチレート）１７の相対
活性を示す。The ester-decomposing ability is determined by using p-nitrophenyl fatty acid ester as a substrate at pH 9.0, 3
It was determined from the colorimetric (OD ₄₀₅ ) of p-nitrophenol generated by the hydrolysis reaction at 0 ° C. Assuming that the decomposition power of pNPP (p-nitrophenyl palmitate) is 100, pNPV (p-nitrophenyl valerate) 34,
The relative activity of pNPB (p-nitrophenyl butyrate) 17 is shown.

【００２７】（３）作用ｐＨおよび至適ｐＨ トリオレインエマルジョンを基質として、前記のＴＬＣ
−ＦＩＤ法による力価測定法により、但し、ｐＨ4.0 〜
11.5の範囲（ただし緩衝液としては、100 mMε−アミノ
カプロン酸、100 mMビストリス（Bis(2-hydroxyethyl)i
minotris(hydroxymethyl)methane）、100 mMＴＡＰＳ
（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfon
ic acid ）混合緩衝液を塩酸またはＮａＯＨでｐＨ調
整）で異なるｐＨにおいて測定した、反応ｐＨと相対活
性の関係は図１に示すとおりであり、作用ｐＨは４〜1
1.5であり、至適ｐＨは7.0 〜9.5 である。(3) Working pH and Optimum pH The above-mentioned TLC was prepared using triolein emulsion as a substrate.
-By titration method by FID method, provided that pH 4.0 to
In the range of 11.5 (however, 100 mM ε-aminocaproic acid, 100 mM bistris (Bis (2-hydroxyethyl) i
minotris (hydroxymethyl) methane), 100 mM TAPS
(N-Tris (hydroxymethyl) methyl-3-aminopropanesulfon
ic acid) The pH of the mixed buffer was measured at different pHs with hydrochloric acid or NaOH (adjusted with hydrochloric acid or NaOH). The relationship between the reaction pH and the relative activity is as shown in FIG.
1.5 and the optimum pH is 7.0 to 9.5.

【００２８】（４）作用温度および至適温度の範囲 トリオレインエマルジョンを基質とし、３０〜８０℃の
温度範囲で反応させたこと以外は、前記のＴＬＣ−ＦＩ
Ｄ法による力価測定法と同様の方法により測定した反応
温度と相対活性の関係は図２に示すとおりであり、作用
温度は３０〜８０℃、至適温度は５５〜６５℃である。
４０℃および７０℃においては、至適温度における活性
の約５０％の相対活性を示す。[0028] (4) The scope triolein emulsion of operating temperature and optimum temperature as a substrate, of 30 to 80 ° C.
Except that the reaction was performed in a temperature range, the TLC-FI described above was used.
The relationship between the reaction temperature and the relative activity measured by the same method as the titration method by Method D is as shown in FIG. 2, and the working temperature is 30 to 80 ° C and the optimum temperature is 55 to 65 ° C.
At 40 ° C. and 70 ° C., it shows a relative activity of about 50% of the activity at the optimum temperature.

【００２９】（５）温度安定性 ２０℃から７０℃の温度範囲の異なる温度でｐＨ８にて
１時間保温処理した後の残存活性を、前記のＴＬＣ−Ｆ
ＩＤ法による力価測定法で測定して求めた相対活性は図
３に示すとおりであり、３０℃および４０℃にて１時間
の処理ではほとんど失活しないが、７０℃では１時間の
処理ではほぼ失活する。(5) Temperature stability The residual activity after 1 hour of incubation at pH 8 at different temperatures in the temperature range of 20 ° C. to 70 ° C. was measured using the TLC-F
The relative activity determined by titration by the ID method is as shown in FIG. 3 and hardly deactivated at 30 ° C. and 40 ° C. for 1 hour, but at 70 ° C. for 1 hour. Almost deactivated.

【００３０】（６）ｐＨ安定性 ｐＨ３から１２のｐＨ範囲の異なるｐＨで３７℃にて１
時間処理した後の残存活性を前記ＴＬＣ−ＦＩＤ法で測
定したときの残存活性は図４に示すとおりであり、ｐＨ
３〜９で８０％以上の残存活性を有する。ただし処理時
の緩衝液は以下のものを使用した（ｐＨ３：グリシン−
塩酸；ｐＨ４〜５：酢酸−酢酸ナトリウム；ｐＨ６〜
７：リン酸；ｐＨ８〜９：トリス−塩酸；ｐＨ１０〜１
２：グリシン−ＮａＯＨ）。(6) pH stability One pH at 37 ° C. at different pHs in the pH range from 3 to 12.
The residual activity measured after the time treatment by the TLC-FID method is as shown in FIG.
It has a residual activity of 80% or more at 3 to 9. However, the following buffer was used for the treatment (pH 3: glycine-
Hydrochloric acid; pH 4-5: acetic acid-sodium acetate; pH 6-
7: phosphoric acid; pH 8-9: Tris-hydrochloric acid; pH 10-1
2: glycine-NaOH).

【００３１】（７）分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（分子量標
準：チトクロームＣ（モノマー、ダイマー、トリマー、
テトラマー、ヘキサマー））により得られた分子量は28
000 ±2000である。(7) Molecular weight SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (molecular weight standard: cytochrome C (monomer, dimer, trimer,
The molecular weight obtained by tetramer, hexamer)) is 28
000 ± 2000.

【００３２】（８）等電点 等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により得られ
た等電点は4.5 ±1.5である。(8) Isoelectric Point The isoelectric point obtained by polyacrylamide gel electrophoresis is 4.5 ± 1.5.

【００３３】（９）洗剤成分による影響 各種市販洗剤（４種）の標準使用濃度（1.2 〜５ｇ／リ
ットル）溶液および各種市販洗剤（４種）の標準使用濃
度溶液に代表的な洗剤用アルカリプロテアーゼであるＡ
ＰＩ−２１（特公昭60-55118号）を0.3nkat/mlの濃度で
添加した溶液中、５mMまたは2.5mM のＣａＣｌ₂ ・２Ｈ
₂ Ｏを添加し、ｐＨ１０、３０℃の条件で本発明のアル
カリリパーゼを処理した後の残存活性をＴＬＣ−ＦＩＤ
法で測定した結果は表１に示すとおりであり、洗剤溶液
中での安定性が高い。(9) Influence of Detergent Components Alkaline proteases for detergents representative of standard use concentration (1.2 to 5 g / liter) solutions of various commercial detergents (4 types) and standard use concentration solutions of various commercial detergents (4 types) A
5 mM or 2.5 mM CaCl ₂ .2H in a solution to which PI-21 (JP-B-60-55118) is added at a concentration of 0.3 nkat / ml
The ₂ O was added, pH10,30 ℃ residual activity of TLC-FID after treatment alkaline lipase of the present invention under the conditions of
The results measured by the method are shown in Table 1, and the stability in the detergent solution is high.

【００３４】[0034]

【表１】 [Table 1]

【００３５】また、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナ
トリウム（ＬＡＳ）３００ppm 、５mMＣａＣｌ₂ ・２Ｈ
₂ Ｏの溶液中、ｐＨ１０、３０℃におけるＳＤ７０２株
の生産したアルカリリパーゼの活性を、オリーブ油−Ｐ
ＶＡエマルジョンを基質としたｐＨスタット滴定法で測
定した場合の活性阻害は５０％以下であり、ＬＡＳによ
る活性阻害は非常に少ないことがわかる。Also, sodium linear alkylbenzene sulfonate (LAS) 300 ppm, 5 mM CaCl ₂ .2H
Solution of ₂ O, the production activity of alkaline lipase SD702 strain in pH10,30 ℃, olive -P
The activity inhibition measured by the pH stat titration method using the VA emulsion as a substrate was 50% or less, indicating that LAS inhibited the activity very little.

【００３６】さらに、各種市販洗剤（５種）の標準使用
濃度（1.2 〜５ｇ／リットル）溶液にアルカリプロテア
ーゼＡＰＩ−２１を0.3nkat/mlの濃度で添加した溶液
中、５mMまたは2.5mM のＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏを添加
し、ｐＨ１０、３０℃の条件でＳＤ７０２株の生産した
アルカリリパーゼの活性阻害性をオリーブ油−アラビア
ゴムエマルジョンを基質としたｐＨスタット滴定法で測
定した。結果は表２に示すとおりであり、各種市販洗剤
溶液中において活性阻害が少ない。Further, 5 mM or 2.5 mM CaCl ₂ was added to a solution obtained by adding the alkaline protease API-21 at a concentration of 0.3 nkat / ml to a standard working concentration (1.2 to 5 g / liter) solution of various commercially available detergents (5 types). · 2H ₂ O was added, the activity inhibition of production alkaline lipase SD702 strain in conditions of PH10,30 ° C. olive oil - was measured with a pH stat titration method acacia emulsion as the substrate. The results are as shown in Table 2 and show little activity inhibition in various commercially available detergent solutions.

【００３７】[0037]

【表２】 [Table 2]

【００３８】[0038]

【発明の効果】本発明のリパーゼは至適ｐＨが7.0 〜9.
5 と高く、また、界面活性剤、プロテアーゼ等の洗剤成
分に対する安定性が高く、さらには洗剤成分による活性
阻害が少ないため、洗浄条件下で油脂汚れを分解除去で
き、洗剤に配合して洗浄力の増強を図ることができる。The lipase of the present invention has an optimum pH of 7.0 to 9.
5 and has high stability to detergent components such as surfactants and proteases, and furthermore, there is little activity inhibition by detergent components. Can be enhanced.

【００３９】[0039]

【実施例】次に本発明を実施例を挙げて説明するが、本
発明は下記の実施例に限定されるものではない。なお、
下記の説明中、特に記載がない限り％は重量を基準とす
るものである。EXAMPLES Next, the present invention will be described with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples. In addition,
In the following description,% is based on weight unless otherwise specified.

【００４０】実施例１：アルカリリパーゼ生産菌（ＳＤ
７０２株）の培養 大豆粉２％、グルコース２％、リン酸一水素二アンモニ
ウム０．１％、リン酸一水素二カリウム０．５％、硫酸
マグネシウム・７水和物０．１％、炭酸ナトリウム０．
３％の濃度の液体培地２ｍｌを１８ｍｍ径の試験管に取
り、１２１℃、２０分間高圧蒸気滅菌した後、シュード
モナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎ
ｄｏｃｉｎａ）ＳＤ７０２菌株を１白金耳接種し、３５
℃で２４時間、１３０ｒｐｍで培養した。培養後、遠心
分離により菌体を除去しアルカリリパーゼ液を得た。こ
の液のリパーゼ活性は５Ｕ／ｍｌであった。Example 1 Alkaline Lipase Producing Bacteria (SD
702 strain) soybean flour 2%, glucose 2%, diammonium hydrogen phosphate 0.1%, dipotassium hydrogen phosphate 0.5%, magnesium sulfate heptahydrate 0.1%, sodium carbonate 0.
2 ml of a 3% liquid medium was placed in a test tube having a diameter of 18 mm, and subjected to high-pressure steam sterilization at 121 ° C. for 20 minutes, followed by Pseudomonas men.
docina ) SD702 strain was inoculated with one platinum loop and 35
The cells were cultured at 130 rpm at 24 ° C for 24 hours. After the culture, the cells were removed by centrifugation to obtain an alkaline lipase solution. The lipase activity of this solution was 5 U / ml.

【００４１】実施例２：アルカリリパーゼ生産菌（ＳＤ
７０２株）の培養及びアルカリリパーゼの取得 大豆粉２％、グルコース２％、リン酸一水素二アンモニ
ウム 0.1％、リン酸一水素二カリウム 0.5％、硫酸マグ
ネシウム・７水和物 0.1％、炭酸ナトリウム 0.3％、Tw
een 85 1.0％の濃度の液体培地２リットルを５リットル
培養槽に取り、１２１℃、２０分間高圧蒸気滅菌し、こ
れにあらかじめ培養しておいたシュードモナス・メンド
シナ（ Pseudomonas mendocina ）ＳＤ７０２菌株を接
種し、３５℃で２０時間、1000 rpmで通気撹拌培養を行
なった。培養後、遠心分離機で菌体を除去しアルカリリ
パーゼ液を得た。この液のリパーゼ活性は２０Ｕ／mlで
あった。このようにして得られたアルカリリパーゼ液か
らアセトン沈殿法にて３０〜５０％画分の沈殿を得、蒸
留水に溶かした後、硫酸アンモニウム沈殿法にて２０〜
４０％画分の沈殿を得た。この沈澱を１０mMトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、これを脱塩後、凍結乾燥
によりアルカリリパーゼ原末を得た。Example 2 Alkaline Lipase Producing Bacteria (SD
702 strain) and acquisition of alkaline lipase Soybean flour 2%, glucose 2%, diammonium hydrogen phosphate 0.1%, dipotassium hydrogen phosphate 0.5%, magnesium sulfate heptahydrate 0.1%, sodium carbonate 0.3 %, Tw
een 85 2 liters of a liquid medium having a concentration of 1.0% was placed in a 5 liter culture tank, sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes, and inoculated with Pseudomonas mendocina SD702 strain which had been cultured in advance. Aeration and agitation culture was performed at 35 ° C. for 20 hours at 1000 rpm. After the culture, the cells were removed by a centrifuge to obtain an alkaline lipase solution. The lipase activity of this solution was 20 U / ml. From the alkaline lipase solution thus obtained, a precipitate of 30 to 50% fraction was obtained by acetone precipitation method, dissolved in distilled water, and then precipitated by ammonium sulfate precipitation method.
A precipitate of the 40% fraction was obtained. This precipitate was dissolved in a 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7), desalted, and lyophilized to obtain an alkaline lipase bulk powder.

【００４２】実施例３：アルカリリパーゼの精製 実施例２で得られたアルカリリパーゼ原末を１０mMトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解させ、１０％硫酸アン
モニウムを含む１０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７）に
て透析した後、Butyl-Toyopearl （東ソー（株）商品
名）での疎水性クロマトグラフィーを行ない、活性画分
をさらに同疎水性クロマトグラフィーにより分画し、活
性画分を得た。この活性画分を１mM塩化カルシウムを含
む１０mMトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ６）にて透析後、同
緩衝液で平衡化したDEAE-Cellulofine A-800（生化学工
業（株）商品名）でのイオン交換クロマト樹脂に吸着さ
せ、ＮａＣｌ溶液にて溶出し活性画分を得た。これを脱
塩後、凍結乾燥により精製酵素を得た。この凍結乾燥品
はポリアクリルアミドゲル電気泳動法により単一である
ことが確認された。Example 3 Purification of Alkaline Lipase The alkaline lipase bulk powder obtained in Example 2 was dissolved in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7) and 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7) containing 10% ammonium sulfate. After dialysis, hydrophobic chromatography was performed using Butyl-Toyopearl (trade name of Tosoh Corporation), and the active fraction was further fractionated by the same hydrophobic chromatography to obtain an active fraction. This active fraction was dialyzed against 10 mM Tris-HCl buffer (pH 6) containing 1 mM calcium chloride, and then ion-exchanged with DEAE-Cellulofine A-800 (trade name of Seikagaku Corporation) equilibrated with the buffer. The active fraction was obtained by adsorption on a chromatographic resin and elution with a NaCl solution. After desalting, a purified enzyme was obtained by freeze-drying. This freeze-dried product was confirmed to be single by polyacrylamide gel electrophoresis.

【００４３】実施例４〜６：NCIMB10541株、NCIMB10542
株、NCIMB10543株の培養およびアルカリリパーゼの取得 大豆粉２％、グルコース２％、リン酸一水素二アンモニ
ウム 0.1％、リン酸一水素二カリウム 0.5％、硫酸マグ
ネシウム・７水和物 0.1％、炭酸ナトリウム 0.3％、Tw
een 85 1.0％の濃度の液体培地２リットルを５リットル
培養槽に取り、１２１℃、２０分間高圧蒸気滅菌し、こ
れらにあらかじめ培養しておいたシュードモナス・メン
ドシナ（ Pseudomonas mendocina ）NCIMB10541株、NC
IMB10542株、もしくはNCIMB10543株を接種し、３５℃で
２０時間、1000 rpmで通気撹拌培養を行なった。培養
後、培養液を遠心分離により菌体を除去しアルカリリパ
ーゼ液を得た。このようにしてNCIMB10541株、NCIMB105
42株、NCIMB10543株各々の培養液から得られたアルカリ
リパーゼ液のリパーゼ活性は各々１６Ｕ／ml、１２Ｕ／
ml、１６Ｕ／mlであった。このようにして得られた各々
のアルカリリパーゼ液からアセトン沈殿法にて３０〜５
０％画分の沈殿を得、蒸留水に溶かした後、硫酸アンモ
ニウム沈殿法にて２０〜４０％画分の沈殿を得た。この
沈澱を１０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、
これを脱塩後、凍結乾燥によりアルカリリパーゼ原末を
得た。Examples 4 to 6: NCIMB10541 strain, NCIMB10542
Of strain and NCIMB10543 strain and acquisition of alkaline lipase Soybean flour 2%, glucose 2%, diammonium hydrogen phosphate 0.1%, dipotassium monohydrogen phosphate 0.5%, magnesium sulfate heptahydrate 0.1%, sodium carbonate 0.3%, Tw
een 85 Two liters of a liquid medium having a concentration of 1.0% was placed in a 5 liter culture tank, sterilized by high-pressure steam at 121 ° C. for 20 minutes, and cultivated in advance in these cells Pseudomonas mendocina NCIMB10541 strain, NC
The IMB10542 strain or the NCIMB10543 strain was inoculated, and cultured under aeration and agitation at 1,000 rpm for 20 hours at 35 ° C. After the culturing, the culture was centrifuged to remove the cells, thereby obtaining an alkaline lipase solution. Thus, NCIMB10541 strain, NCIMB105
The lipase activity of the alkaline lipase solution obtained from the culture solution of each of the 42 strain and the NCIMB 10543 strain was 16 U / ml and 12 U / ml, respectively.
ml and 16 U / ml. Each of the alkaline lipase solutions thus obtained is subjected to acetone precipitation by 30 to 5 times.
A precipitate of 0% fraction was obtained and dissolved in distilled water, and then a precipitate of 20 to 40% fraction was obtained by ammonium sulfate precipitation method. This precipitate was dissolved in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7),
After desalting it, freeze-drying was performed to obtain a bulk alkaline lipase powder.

【００４４】実施例７〜２４：洗濯評価−１ 実施例２で得られたアルカリリパーゼ原末を用いて洗浄
試験を行なった。汚垢布は、脱脂した綿布（１５ｃｍ×
１５ｃｍ）に、ベンゼンに溶解したトリオレイン７０ｍ
ｇを浸ませ、乾燥させたものを用い、洗浄装置は、Ｔｅ
ｒｇ−Ｏ−Ｔｏｍｅｔｅｒを用いた。塩化カルシウムを
加えて所定のカルシウム濃度にした蒸留水１リットルに
各種市販洗剤を標準使用濃度で溶解し、さらに、アルカ
リリパーゼを所定の濃度になるように添加した。場合に
より、さらに、プロテアーゼＡＰＩ−２１（特公昭６０
−５５１１８号）を所定の濃度になるように添加した。
洗濯液１リットル当たり４〜６枚の前記トリオレイン汚
垢布を入れ、２０℃〜３５℃の洗濯温度にて、１２０ｒ
ｐｍで３０分間洗浄した。洗浄後、前記のカルシウム含
有蒸留水１リットルで２回すすぎを行なった後、乾燥し
た。未洗浄と洗浄後の汚垢布のトリオレイン量は、ｎ−
ヘキサンで抽出後、前記ＴＬＣ−ＦＩＤ法にて定量し、
洗浄効率および酵素添加効果を以下の計算式により求め
た。 洗浄効率（％）＝［（未洗浄汚染布のトリオレイン量−
洗浄後汚染布のトリオレイン量）／未洗浄汚染布のトリ
オレイン量］×１００ 酵素添加効果（％）＝酵素添加時の洗浄効率（％）−酵
素未添加時（洗剤のみ）の洗浄効率（％）Examples 7 to 24: Evaluation of washing-1 A washing test was carried out using the bulk alkaline lipase powder obtained in Example 2. Dirty cloth is degreased cotton cloth (15cm ×
15cm), 70m of triolein dissolved in benzene
g, soaked and dried, and the cleaning device is Te
rg-O-Tometer was used. Various commercially available detergents were dissolved in 1 liter of distilled water adjusted to a predetermined calcium concentration by adding calcium chloride at a standard use concentration, and further, alkaline lipase was added to a predetermined concentration. In some cases, protease API-21 (Japanese Patent Publication No.
No.-55118) was added to a predetermined concentration.
Put 4 to 6 pieces of the triolein soiled cloth per liter of the washing liquid, and at a washing temperature of 20 ° C. to 35 ° C., 120 r.
Washed at pm for 30 minutes. After washing, it was rinsed twice with 1 liter of the above-mentioned calcium-containing distilled water, and then dried. The amount of triolein in the uncleaned and washed cloth is n-
After extraction with hexane, it was quantified by the TLC-FID method,
The washing efficiency and the effect of adding the enzyme were determined by the following formulas. Cleaning efficiency (%) = [(Amount of triolein in uncleaned contaminated cloth-
After washing contaminated triolein amount of cloth) / Not Application Benefits <br/> oleic amount of washing soiled cloth] × 100 enzyme addition effect (%) = cleaning efficiency during enzyme addition (%) - no enzyme added during (detergent only ) Cleaning efficiency (%)

【００４５】その結果を表３に示す。Table 3 shows the results.

【００４６】[0046]

【表３】 [Table 3]

【００４７】表３より、本アルカリリパーゼを配合した
洗浄組成物では、脂質汚れに対する洗浄効果が増強され
ていることが明かである。From Table 3, it is clear that the cleaning composition containing the present alkaline lipase has an enhanced cleaning effect on lipid stains.

【００４８】実施例２５〜２７：洗濯評価−２ 実施例４で得られたアルカリリパーゼ原末を用いて実施
例１１と同様の操作により洗浄試験を行なった。洗浄効
率および酵素添加効果を実施例７〜２４に示したのと同
じ計算式により求めた。その結果を表４に示す。Examples 25 to 27: Evaluation of washing-2 A washing test was carried out in the same manner as in Example 11 using the bulk alkaline lipase powder obtained in Example 4. The cleaning efficiency and the effect of adding the enzyme were determined by the same formulas as shown in Examples 7 to 24. Table 4 shows the results.

【００４９】[0049]

【表４】 [Table 4]

【００５０】表４より、数種のシュードモナス・メンド
シナの菌株より得られたリパーゼを配合した洗浄組成物
においても、脂質汚れに対する洗浄効果が増強されるこ
とが明らかである。From Table 4, it is evident that the cleaning composition containing lipase obtained from several species of Pseudomonas mendocina also enhances the cleaning effect on lipid stains.

【００５１】比較例１〜３：他のリパーゼの洗濯評価 本アルカリリパーゼに替えて、特開昭48-62990号に記載
のフミコラ・ラヌギノザ（Humicola lanuginosa）由来
のリパーゼ、特開昭61-280274 号に記載のシュードモナ
ス・フラギ（ Pseudomonas fragi ）２２−３９Ｂ株由
来のリパーゼ、または、アクロモバクター（ Achromoba
cter sp. ）由来のリパーゼ（生化学工業）を添加し、
市販洗剤ＢまたはＦを使用して各々、実施例１１または
実施例１７と同様の操作で洗浄を行い酵素添加効果を求
めた。その結果を表５に示す。Comparative Examples 1-3: Washing evaluation of other lipases The lipase derived from Humicola lanuginosa described in JP-A-48-62990 was used in place of the alkaline lipase described in JP-A-61-280274. A lipase derived from Pseudomonas fragi 22-39B strain or Achromoba
cter sp. )-derived lipase (Seikagaku Corporation )
Using commercially available detergent B or F, washing was carried out in the same manner as in Example 11 or Example 17, and the effect of enzyme addition was determined. Table 5 shows the results.

【００５２】[0052]

【表５】 [Table 5]

【００５３】表５より、本アルカリリパーゼを配合した
洗浄組成物との差は明白である。From Table 5, the difference from the cleaning composition containing the present alkaline lipase is clear.

【００５４】これらの結果より、本発明によるアルカリ
リパーゼ添加の場合は、無添加に比べ洗浄率で１０％以
上の向上が認められた。From these results, it was confirmed that the washing rate was improved by 10% or more when the alkaline lipase according to the present invention was added as compared with the case where no alkaline lipase was added.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 ＳＤ７０２株の生産するアルカリリパーゼの
反応ｐＨと相対活性との関係を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing the relationship between the reaction pH and the relative activity of alkaline lipase produced by strain SD702.

【図２】 ＳＤ７０２株の生産するアルカリリパーゼの
反応温度と相対活性との関係を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing the relationship between the reaction temperature and the relative activity of alkaline lipase produced by strain SD702.

【図３】 ＳＤ７０２株の生産するアルカリリパーゼを
種々の温度にてｐＨ８で１時間処理した場合の残存活性
を示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing residual activity when alkaline lipase produced by strain SD702 is treated at various temperatures at pH 8 for 1 hour.

【図４】 ＳＤ７０２株の生産するアルカリリパーゼを
種々のｐＨにて３７℃で１時間保持した後の残存活性を
示すグラフである。FIG. 4 is a graph showing the residual activity of alkaline lipase produced by the strain SD702 after being kept at 37 ° C. for 1 hour at various pHs.

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:38） (72)発明者 水越 達也 東京都大田区多摩川２−24−25 昭和電 工株式会社 生化学研究所内 (72)発明者 後藤 志江 東京都大田区多摩川２−24−25 昭和電 工株式会社 生化学研究所内 (72)発明者 田中 計実 東京都大田区多摩川２−24−25 昭和電 工株式会社 生化学研究所内 (72)発明者 高間 道裕 東京都港区芝大門１−13−９ 昭和電工 株式会社内 (72)発明者 守屋 則雄 神奈川県川崎市川崎区大川町５−１ 昭 和電工株式会社 工学研究センター内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 C11D 3/386 C12N 1/00 - 1/38 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI (C12N 9/20 C12R 1:38) (72) Inventor Tatsuya Mizukoshi 2-24-25 Tamagawa, Ota-ku, Tokyo Showa Denko KK Biochemical Research In-house (72) Inventor Shige Goto 2-24-25 Tamagawa, Ota-ku, Tokyo Showa Denko KK Biochemical Research Laboratories (72) Inventor Tanaka Tanaka 2-24-25 Tamagawa, Ota-ku, Tokyo Showa Denko KK Inside the Biochemical Research Laboratory (72) Michihiro Takama 1-13-9 Shibadaimon, Minato-ku, Tokyo Showa Denko KK (72) Norio Moriya 5-1 Okawacho, Kawasaki-ku, Kawasaki-shi, Kanagawa Showa Denko KK Within the Engineering Research Center (58) Fields investigated (Int. Cl. ⁷ , DB name) C12N 9/00-9/99 C11D 3/386 C12N 1/00-1/38 BIOSIS (DIALOG) WPI (DIALOG)

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 下記の性質を有するアルカリリパーゼ。 （１）作用ｐＨおよび至適ｐＨ トリオレインエマルジョンを基質とし、ｐＨ４〜１１．
５の範囲で反応させたとき、作用ｐＨが４〜１１．５、
至適ｐＨが７．０〜９．５である。 （２）作用温度および至適温度 トリオレインエマルジョンを基質とし、３０〜８０℃の
温度範囲で反応させたとき、作用温度が３０〜８０℃、
至適温度が５５〜６５℃である。 （３）分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により測定した
分子量が２８０００±２０００である。 （４）等電点 等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって測定
した等電点が４．５±１．５である。 （５）洗剤成分によるリパーゼ活性阻害 直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムによる活性
阻害が５０％以下である。An alkaline lipase having the following properties: (1) Working pH and Optimum pH Using triolein emulsion as a substrate, pH 4-11.
When reacted in the range of 5, the working pH is 4 to 11.5,
The optimum pH is 7.0-9.5. (2) Working temperature and optimum temperature Using triolein emulsion as a substrate ,
When reacted at a temperature range, working temperature of 30 to 80 ° C.,
The optimum temperature is 55-65 ° C. (3) Molecular weight The molecular weight measured by SDS-polyacrylamide electrophoresis is 28,000 ± 2000. (4) Isoelectric point The isoelectric point measured by polyacrylamide gel electrophoresis is 4.5 ± 1.5. (5) Inhibition of lipase activity by detergent components Inhibition of activity by sodium linear alkylbenzene sulfonate is 50% or less. 【請求項２】 シュードモナス（Pseudomonas ）属に属
する細菌の培養物より得られる請求項１記載のアルカリ
リパーゼ。2. The alkaline lipase according to claim 1, which is obtained from a culture of a bacterium belonging to the genus Pseudomonas . 【請求項３】 シュードモナス・メンドシナ（ Pseudom
onas mendocina ）に属する細菌の培養物より得られる
請求項１記載のアルカリリパーゼ。3. Pseudom ( Pseudom)
The alkaline lipase according to claim 1, which is obtained from a culture of a bacterium belonging to Onas mendocina ). 【請求項４】 シュードモナス・メンドシナ（ Pseudom
onas mendocina ）ＳＤ７０２株（微工研菌寄第12944
号）の培養物より得られる請求項１記載のアルカリリパ
ーゼ。4. Pseudom ( Pseudom)
onas mendocina ) SD702 strain
2. The alkaline lipase according to claim 1, which is obtained from the culture of item (1). 【請求項５】 請求項１に記載のアルカリリパーゼを生
産するシュードモナス・メンドシナ（ Pseudomonas me
ndocina ）ＳＤ７０２株（微工研菌寄第12944 号）。5. The Pseudomonas to produce alkaline lipase according to claim 1 mendocina (Pseudomonas me
ndocina ) SD702 strain (Microtechnological Laboratory No. 12944). 【請求項６】 シュードモナス・メンドシナ（ Pseudom
onas mendocina ）の生産する請求項１に記載のアルカ
リリパーゼを含んでなることを特徴とする酵素含有洗剤
組成物。6. Pseudom ( Pseudom)
An enzyme-containing detergent composition comprising the alkaline lipase according to claim 1 produced by C. onas mendocina ). 【請求項７】 シュードモナス・メンドシナ（ Pseudom
onas mendocina ）ＳＤ７０２株（微工研菌寄第12944
号）の生産する請求項１に記載のアルカリ性リパーゼを
含んでなることを特徴とする酵素含有洗剤組成物。7. Pseudom ( Pseudom)
onas mendocina ) SD702 strain
(2) An enzyme-containing detergent composition comprising the alkaline lipase according to (1). 【請求項８】 シュードモナス・メンドシナ（ Pseudom
onas mendocina ）細菌NCIMB10541株、またはNCIMB105
42株、またはNCIMB10543株の培養物より得られる請求項
１に記載のアルカリリパーゼを含んでなることを特徴と
する酵素含有洗剤組成物。8. Pseudom mendsina ( Pseudom)
onas mendocina ) Bacteria NCIMB10541 strain, or NCIMB105
An enzyme-containing detergent composition comprising the alkaline lipase according to claim 1, which is obtained from a culture of 42 strains or NCIMB10543 strain. 【請求項９】 酵素添加物が無粉塵性粒剤として提供さ
れている請求項６乃至８のいずれかの項に記載の酵素含
有洗剤組成物。9. The enzyme-containing detergent composition according to claim 6, wherein the enzyme additive is provided as a dust-free granule. 【請求項１０】 酵素添加物が液体またはスラリーとし
て提供されている請求項６乃至８のいずれかの項に記載
の酵素含有洗剤組成物。10. The enzyme-containing detergent composition according to claim 6, wherein the enzyme additive is provided as a liquid or a slurry. 【請求項１１】 アルカリリパーゼの他にプロテアーゼ
を含有する請求項６乃至８のいずれかの項に記載の酵素
含有洗剤組成物。11. The enzyme-containing detergent composition according to claim 6, further comprising a protease in addition to the alkaline lipase.