JP2509540B2 - Novel microorganism that produces new protease - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、広範囲なpH領域で作用
する新規なプロテアーゼを産生する微生物に関し、更に
詳細には、日本の洗濯状況に適した洗浄用酵素として広
く用いることのできるプロテアーゼを産生し、バチルス
属に属するプロテアーゼ生産菌に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a novel protease-producing microorganism that acts in a wide pH range, and more specifically, a protease that can be widely used as a washing enzyme suitable for Japanese laundry conditions. The present invention relates to a protease-producing bacterium that is produced and belongs to the genus Bacillus.

【０００２】[0002]

【従来の技術】洗浄剤へのプロテアーゼの配合は、以前
より行われてきているが、現状の洗浄剤のpHは全て高ア
ルカリ側にあるのでこのようなプロテアーゼの特性とし
てアルカリ側に最適反応pHを有し、界面活性剤中に於い
て安定に作用するものが望まれ開発されてきた。その代
表的なものとして、アルカラーゼ、サビナーゼ、エスペ
ラーゼ（ノヴォ・インダストリー社製）、マキサターゼ
（ギスト プロカーデイス社製）等が市販され多くの洗
浄剤に使用されている。2. Description of the Prior Art Protease has been blended with detergents for a long time, but the pH of detergents at present is all on the high alkaline side. It has been desired and developed to have a stable action in a surfactant. As typical examples thereof, Alcalase, Savinase, Esperase (manufactured by Novo Industry Co., Ltd.), Maxatase (manufactured by Gist Procardis Co., Ltd.) and the like are commercially available and used in many detergents.

【０００３】しかし、これらのプロテアーゼの活性領域
が高温側にあり、日本の洗濯が室温付近で行われている
状況から、低温域に於いても従来のプロテアーゼよりも
活性発現力の強いプロテアーゼの提供が求められ、この
要求に応じてＡＰＩ−２１（昭和電工社製）が近年開発
されるに至った。However, since the active regions of these proteases are on the high temperature side, and washing in Japan is carried out at around room temperature, it is possible to provide proteases having a stronger activity expressing ability than conventional proteases even in the low temperature region. In response to this demand, API-21 (manufactured by Showa Denko KK) has been developed in recent years.

【０００４】その他、更にプロテアーゼに望まれる特性
として、ケラチン等の不溶性蛋白を良く分解する能力の
あることが挙げられ、そのような能力のあるプロテアー
ゼが洗浄に寄与することも知られている（皆川基：繊消
誌第２６巻、第３２２頁（１９８５））。[0004] In addition, other properties desired for proteases include the ability to decompose insoluble proteins such as keratin well, and it is also known that proteases having such ability contribute to washing (Minagawa). Motoi: Senshi magazine Vol. 26, p. 322 (1985)).

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】従来の洗浄剤用プロテ
アーゼに要求されている特性として、（１）アルカリ側
に最適反応pHを有する、（２）低温域でも活性を有す
る、（３）ケラチン等の不溶性蛋白の分解力に優れてい
ることは、いずれも基本的な性能であるが、その他に更
にプロテアーゼが広範囲のpH領域に於いて最適な活性を
有するものであれば重、軽質洗剤に兼用が可能であるの
で、そのような酵素の開発が望まれていた。The properties required for conventional proteases for detergents are (1) having an optimum reaction pH on the alkaline side, (2) having activity even at low temperatures, (3) keratin, etc. The ability to decompose insoluble proteins in is a basic performance, but in addition, if the protease has optimal activity in a wide pH range, it can be used in both heavy and light detergents. Therefore, the development of such an enzyme has been desired.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、前
記（１）〜（３）の基本的性能の他に、広範囲のpH領域
に於いて最適な活性を有する新規なプロテアーゼを産生
する微生物を得べく鋭意検索を行った結果、栃木県芳賀
郡の土壌中より得られたバチルス・エスピーＫＳＭ−２
００４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−２００４）
が上記条件を満足するプロテアーゼを産生するものであ
ることを見出し、本発明を完成するに至った。Therefore, the present inventors produce a novel protease having optimum activity in a wide pH range in addition to the basic performances (1) to (3) described above. Bacillus sp. KSM-2 obtained from soil in Haga-gun, Tochigi prefecture, as a result of an intensive search for microorganisms
004 ( Bacillus sp. KSM-2004)
Has been found to produce a protease satisfying the above conditions, and has completed the present invention.

【０００７】本発明のバチルス・エスピー ＫＳＭ−２
００４は、以下に示すような菌学的性質を示す。Bacillus sp. KSM-2 of the present invention
004 shows the mycological properties as shown below.

【０００８】（Ａ）形態的性質 （ａ）細胞の形及び大きさ 桿菌；０．５〜０．８×２．０〜５．０μm 。 （ｂ）多形性 認められず。 （ｃ）運動性 鞭毛を持たず運動性なし。 （ｄ）胞子 ０．４〜０．８×０．４〜０．８μm 卵円形又は円形中
央準端。 （ｅ）グラム染色 陽性。 （ｆ）抗酸性 陰性。(A) Morphological properties (a) Shape and size of cells Bacillus; 0.5-0.8 x 2.0-5.0 µm. (B) Polymorphism Not observed. (C) Motility No flagella and no motility. (D) Spore 0.4-0.8x0.4-0.8micrometer Oval or circular center quasi-end. (E) Gram stain Positive. (F) Anti-acidity negative.

【０００９】（Ｂ）各種培地での生育状態 （ａ）肉汁寒天平板での発育状態 pH７．０にて生育し、円形中凸状、円滑波状のコロニー
を形成する。その大きさは、φ１．０〜５．０mm、表面
は円滑で露滴状淡黄色を呈する。また不透明であり、脂
状のコロニーである。 （ｂ）肉汁寒天斜面上での生育 pH７．０に於いて普通に生育を示し、乳白色の半透明で
拡帯状に生育する。 （ｃ）肉汁液体培養 pH７．０にて僅かに生育するが、菌膜は形成しない。 （ｄ）肉汁ゼラチン穿刺培養 pH７．０にていずれもゼラチンを液化する。 （ｅ）リトマスミルク ミルクの液化及び深部でのリトマスの脱色が認められ
る。(B) Growth state in various media (a) Growth state on broth agar plate Grows at pH 7.0 to form circular convex, smooth wave-like colonies. The size is φ1.0 to 5.0 mm, the surface is smooth and has a dewdrop-like pale yellow color. It is an opaque and oily colony. (B) Growth on broth agar slope It shows normal growth at pH 7.0 and is milky white, translucent and spreads in a wide band. (C) Meat juice liquid culture It grows slightly at pH 7.0, but does not form a pellicle. (D) Meat broth gelatin stab culture In any case, gelatin is liquefied at pH 7.0. (E) Litmus milk Liquefaction of milk and decolorization of litmus in the deep part are observed.

【００１０】（Ｃ）生理的性質 （ａ）以下の生理試験の結果は、いずれも陰性であっ
た。硝酸塩の還元、脱窒反応、ＭＲテスト、ＶＰテス
ト、インドールの生成、硫化水素の生成、無機窒素の利
用（硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム）、色素の生
成、オキシダーゼ及びＯＦテスト。 （ｂ）以下の生理試験の結果はいずれも陽性であった。
デンプン加水分解、カゼイン分解、チロシン加水分解、
カタラーゼ及びウレアーゼ（弱い陽性）。 （ｃ）クエン酸の利用 コーサーの培地では陰性、クリステンセン及びシモンズ
の培地では陽性。 （ｄ）生育pH範囲 pH６〜１０で生育良好。 （ｅ）生育温度範囲 ２０〜３０℃で生育良好、但し１０〜４０℃で生育可
能。 （ｆ）酸素に対する態度 好気性。嫌気条件下で生育不能。(C) Physiological properties (a) The results of the following physiological tests were all negative. Reduction of nitrate, denitrification reaction, MR test, VP test, formation of indole, formation of hydrogen sulfide, utilization of inorganic nitrogen (sodium nitrate, ammonium sulfate), formation of pigment, oxidase and OF test. (B) The results of the following physiological tests were all positive.
Starch hydrolysis, casein degradation, tyrosine hydrolysis,
Catalase and urease (weakly positive). (C) Utilization of citric acid Negative in Coerser's medium and positive in Christensen and Simmons' medium. (D) Growth pH range Good growth at pH 6-10. (E) Growth temperature range Good growth at 20 to 30 ° C, but possible to grow at 10 to 40 ° C. (F) Attitude toward oxygen Aerobic. Cannot grow under anaerobic conditions.

【００１１】（ｇ）糖類からの酸及びガスの生成(G) Production of acid and gas from sugar

【００１２】[0012]

【表１】 [Table 1]

【００１３】（ｈ）糖の資化性(H) Utilization of sugar

【００１４】[0014]

【表２】 [Table 2]

【００１５】（ｉ）塩化ナトリウムに対する耐性 ５％塩化ナトリウム存在下で生育可能。７％塩化ナトリ
ウム存在下で僅かに生育。(I) Tolerance to sodium chloride It can grow in the presence of 5% sodium chloride. Grow slightly in the presence of 7% sodium chloride.

【００１６】以上のバチルス・エスピー ＫＳＭ−２０
０４の菌学的性状を、「バージェーズ マニュアル オ
ブ デイターミネイティブ バクテリオロジー第８版
（１９７５）」及び「ザ ジーナス バチルス，アグリ
カルチャーハンドブックＮｏ．４２７（１９７３）」の
記載に準じ、他の菌株と比較すると次の通りである。The above Bacillus SP KSM-20
The mycological properties of No. 04 were compared with those of other strains according to the description in "Burger's Manual of Day Terminative Bacteriology 8th Edition (1975)" and "The Genus Bacillus, Agriculture Handbook No. 427 (1973)". Then it is as follows.

【００１７】ＫＳＭ−２００４は、グラム陽性の好気性
桿菌であり、胞子形成能を有することから、バチルス属
に属することは明白である。そして、ＫＳＭ−２００４
は、運動性を有しないこと、即ち、鞭毛を有していない
こと、サブロー寒天培地で生育できること、デンプン加
水分解能を有すること及びグルコース、アラビノース、
キシロースから酸産生を行うこと等の性質から、バチル
ス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌ
ａｎｓ）に類縁の菌であると判断された。しかし、ＫＳ
Ｍ−２００４はチロシンを加水分解するが、バチルス・
サーキュランスはこれを加水分解できない点が異なって
いる。また一般的にバチルス・サーキュランスはカゼイ
ン、ゼラチン及びリトマスミルクに対し、非常に弱い反
応を行うか又は全く反応を行わないとされているが、本
菌株は、これらの基質に対し、良好に反応しうる点に於
いても相異する。Since KSM-2004 is a gram-positive aerobic bacillus and has sporulation ability, it clearly belongs to the genus Bacillus. And KSM-2004
Has no motility, that is, has no flagella, can grow on Sabouraud agar, has starch hydrolyzing ability, and glucose, arabinose,
Because of the property of producing acid from xylose, Bacillus circul (Bacillus circul)
ans) was determined to be a fungus. But KS
M-2004 hydrolyzes tyrosine, but Bacillus
Circulance differs in that it cannot be hydrolyzed. Although Bacillus circulans is generally said to react very weakly to casein, gelatin and litmus milk or not at all, this strain reacts well with these substrates. There are differences in possible points.

【００１８】以上の記載から明らかなように、本菌株
は、バチルス・サーキュランスと類似しているもののい
くつかの点に於いてこれと相異し、また、他の公知の菌
株とも相異する。従って、本発明者らは本菌株をバチル
ス属の新菌種と判断し、工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌寄第９４５２号（ＦＥＲＭ Ｐ−９４５
２）として寄託した。As is clear from the above description, the present strain is similar to Bacillus circulans but differs from this in some respects, and also from other known strains. . Therefore, the present inventors determined that this strain is a new strain of the genus Bacillus and contacted the Institute of Microbial Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology for microincubation No. 9452 (FERM P-945).
Deposited as 2).

【００１９】上記のバチルス・エスピー ＫＳＭ−２０
０４を用いて新規なプロテアーゼを得るには、該菌株を
適当な培地に接種し、常法に従って培養すれば良い。培
地中には資化し得る炭素源及び窒素源を適当量含有せし
めておくことが好ましい。The above Bacillus sp. KSM-20
To obtain a novel protease using 04, the strain may be inoculated into an appropriate medium and cultured according to a conventional method. It is preferred that the medium contains appropriate amounts of assimilable carbon source and nitrogen source.

【００２０】この炭素源及び窒素源については特に制限
はないが、その例としては、窒素源としてコーングルテ
ンミール、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ
酸、酵母エキス、ファーマメディア、イワシミール、肉
エキス、ペプトン、ハイプロ、アジパワー、コーンミー
ル、ソイビーンミール、コーヒー粕、綿実油粕、カルチ
ベータ、アミフレックス及びアジプロン、ゼスト、アジ
ックスなどが挙げられる。また、炭素源としては、資化
し得る炭素源、例えば、アラビノース、キシロース、グ
ルコース、マンノース、蔗糖、麦芽糖、可溶性デンプ
ン、乳糖、廃糖蜜や資化し得る有機酸、例えば酢酸等が
挙げられる。また、その他、リン酸、Ｍｇ²⁺、Ｃａ²⁺、
Ｍｎ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｃｏ²⁺、Ｎａ⁺、Ｋ⁺などの無機塩や、
必要であれば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添
加することもできる。The carbon source and nitrogen source are not particularly limited, but examples thereof include corn gluten meal, soybean flour, corn steep liquor, casamino acid, yeast extract, pharmamedia, sardines and meat extract as nitrogen sources. , Peptone, hypro, adipower, cornmeal, soybean meal, coffee meal, cottonseed oil meal, cultivator, amiflex and adipron, zest, azix and the like. Examples of the carbon source include carbon sources that can be assimilated, such as arabinose, xylose, glucose, mannose, sucrose, maltose, soluble starch, lactose, molasses, and assimilable organic acids, such as acetic acid. In addition, phosphoric acid, Mg ²⁺ , Ca ²⁺ ,
Inorganic salts such as Mn ²⁺ , Zn ²⁺ , Co ²⁺ , Na ⁺ , K ⁺ ,
If necessary, inorganic or organic micronutrient sources can be appropriately added to the medium.

【００２１】斯くして得られた培養物中からの目的物質
であるプロテアーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採
取及び精製の手段に準じて行うことが出来る。Collection and purification of the target substance, protease, from the thus obtained culture can be carried out in accordance with general means for collecting and purifying enzymes.

【００２２】すなわち、培養物を遠心分離、又は濾過等
することによって菌体を分離し、その菌体及び培養濾液
から通常の分離手段、例えば、塩析法、等電点沈殿法、
溶媒沈殿法（メタノール、エタノール、イソプロパノー
ル、アセトン等）によって蛋白を沈殿させたり、また、
限外濾過（例えばダイアフローメンブレン、アミコン社
製）により濃縮させてプロテアーゼを得る。塩析法では
例えば、硫安（３０〜７０％飽和画分）、溶媒沈殿では
例えば、７５％エタノール中で酵素を沈殿させた後、濾
過或いは遠心分離、脱塩することによってこれを凍結乾
燥粉末とすることも可能である。脱塩の方法としては透
析又はセファデックス Ｇ−２５等を用いるゲル濾過法
等の一般的方法が用いられる。That is, cells are separated by centrifuging or filtering the culture, and the cells and the culture filtrate are separated by a conventional means such as salting out method, isoelectric focusing method,
Protein precipitation by solvent precipitation method (methanol, ethanol, isopropanol, acetone, etc.),
The protease is obtained by concentration by ultrafiltration (for example, Diaflow membrane, manufactured by Amicon). In the salting-out method, for example, ammonium sulfate (30 to 70% saturated fraction), and in the solvent precipitation, for example, the enzyme is precipitated in 75% ethanol, and then filtered or centrifuged, and desalted to obtain a freeze-dried powder. It is also possible to do so. As a desalting method, a general method such as dialysis or gel filtration using Sephadex G-25 is used.

【００２３】このようにして得られるプロテアーゼ液
は、そのまま使用することもできるが、更に公知の方法
によりプロテアーゼを精製結晶化して用いることもでき
る。プロテアーゼを精製するには、例えばヒドロキシア
パタイトクロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィ
ー、ＤＥＡＥ−セファデックス又はＤＥＡＥ−セルロー
ス等のイオン交換クロマトグラフィー及びセファデック
スやバイオゲルのような分子篩ゲルクロマトグラフィー
を適宜組み合わせて分別精製すれば良い。斯くして得ら
れたプロテアーゼは以下に示すような理化学的性質を有
する。The protease solution thus obtained may be used as it is, or may be purified and crystallized by a known method before use. To purify the protease, for example, adsorption chromatography such as hydroxyapatite chromatography, ion exchange chromatography such as DEAE-Sephadex or DEAE-cellulose, and molecular sieve gel chromatography such as Sephadex or biogel are appropriately combined and fractionated and purified. Just do it. The protease thus obtained has the following physicochemical properties.

【００２４】（ａ）最適反応pH 種々のpH緩衝液（１００mM）中に、最終濃度２．２％と
なるように尿素変性ヘモグロビン（基質）を加え、２５
℃で１０分間反応を行った。最適pHに於ける基質に対す
る反応初速度を１００％とし、各pHに於ける反応初速度
を相対的に表わした。この結果を図１に示す。図１から
明らかなように、本菌の生産するプロテアーゼの最適反
応pHはpH６．５〜１０．５と広範囲に亘っている。な
お、使用した緩衝液及びそのpH範囲は次の通りである。(A) Optimal reaction pH Urea-modified hemoglobin (substrate) was added to various pH buffers (100 mM) to a final concentration of 2.2%, and 25
The reaction was performed at 10 ° C for 10 minutes. The initial reaction rate for the substrate at the optimum pH was defined as 100%, and the initial reaction rate at each pH was relatively expressed. The result is shown in FIG. As is clear from FIG. 1, the optimum reaction pH of the protease produced by this bacterium is in a wide range of pH 6.5 to 10.5. The buffer solutions used and their pH ranges are as follows.

【００２５】[0025]

【表３】 酢酸緩衝液 pH４〜６ リン酸緩衝液 pH６〜８ ホウ酸緩衝液 pH８〜１０ 炭酸緩衝液 pH９〜１１ リン酸ナトリウム緩衝液 pH１０．５〜１２Table 3 Acetate buffer pH 4-6 Phosphate buffer pH 6-8 Borate buffer pH 8-10 Carbonate buffer pH 9-11 Sodium phosphate buffer pH 10.5-12

【００２６】（ｂ）pH安定性 （ａ）で用いたものと同じ緩衝液（１００mM）中に約２
×１０^-4AUのプロテアーゼを加え、５℃で２４時間放置
した。この処理液を０．５Ｍホウ酸緩衝液で５倍に希釈
後、尿素変性ヘモグロビンを基質としpH１０．５で反応
を行い残存活性を測定した。処理前の酵素活性を１００
％とし各pH領域にて処理したサンプルの活性を相対的に
表わした。この結果を図２に示す。図２から明らかなよ
うに、本発明のプロテアーゼは、pH５〜１２の広範囲で
極めて安定である。(B) pH stability About 2 in the same buffer (100 mM) as used in (a).
× 10 ^-4 AU of protease was added and the mixture was allowed to stand at 5 ° C for 24 hours. After diluting this treated solution 5-fold with 0.5 M borate buffer, the reaction was carried out at pH 10.5 using urea-modified hemoglobin as a substrate to measure the residual activity. Enzyme activity before treatment is 100
%, And the activity of the sample treated in each pH range was relatively expressed. The result is shown in FIG. As is clear from FIG. 2, the protease of the present invention is extremely stable in a wide range of pH 5-12.

【００２７】（ｃ）最適反応温度 各温度下、約５×１０^-5AUのプロテアーゼを用い、尿素
変性ヘモグロビンを基質としてpH１０．５で反応を行っ
たところ本発明によるプロテアーゼの最適温度は４０℃
であり、２０℃付近でも最高活性の５５％以上の活性を
有していた。この結果を図３に示す。(C) Optimum reaction temperature At a temperature of about 5 × 10 ^-5 AU of protease, the reaction was carried out at pH 10.5 using urea-modified hemoglobin as a substrate. The optimum temperature of the protease of the present invention was 40 ° C.
The maximum activity was 55% or more even at around 20 ° C. The result is shown in FIG.

【００２８】（ｄ）基質特異性 本発明微生物産生のプロテアーゼの各種基質に対する特
異性を他の市販アルカリプロテアーゼと比較した。用い
た基質は、尿素変性ヘモグロビン、ケラチン、カゼイ
ン、ミオグロビン、牛血清アルブミンであり反応液中の
濃度は、ヘモグロビンを２．２％とし、他は１．０％と
した。これらの基質をpH１０．５の０．１Ｍホウ酸緩衝
液に加え、各酵素約１×１０^-4AUを添加し、２５℃で１
０分間（ケラチンは６０分間）反応を行った。表４にそ
の結果を示した。なお、数値は、各酵素量を１×１０^-4
AU（尿素変性ヘモグロビンに対する活性について統一）
とし、これを各基質に対し反応させ、それぞれの基質に
対する活性の標準をＡＰＩ−２１の活性とし、対応する
基質に於ける各酵素活性をその相対値として表わした。(D) Substrate specificity The specificity of the protease produced by the microorganism of the present invention for various substrates was compared with other commercially available alkaline proteases. The substrates used were urea-modified hemoglobin, keratin, casein, myoglobin, and bovine serum albumin, and the concentrations in the reaction solution were hemoglobin at 2.2% and the other concentrations at 1.0%. These substrates were added to 0.1 M borate buffer of pH 10.5, and about 1 x 10 ^-4 AU of each enzyme was added, and the mixture was added at 25 ° C for 1 hour.
The reaction was performed for 0 minutes (60 minutes for keratin). The results are shown in Table 4. The numerical value is 1 × 10 ^-4 for each enzyme amount.
AU (Unified activity for urea-modified hemoglobin)
This was reacted with each substrate, the activity standard against each substrate was defined as the activity of API-21, and each enzyme activity on the corresponding substrate was represented as its relative value.

【００２９】[0029]

【表４】 [Table 4]

【００３０】以上の結果より、本発明微生物産生のプロ
テアーゼは、ケラチン分解能に優れ、かつ基質特異性が
高いことが明らかとなった。From the above results, it was clarified that the protease produced by the microorganism of the present invention has excellent keratin degrading ability and high substrate specificity.

【００３１】（ｅ）分子量 セファデックス Ｇ−１００ゲル濾過クロマトグラフィ
ーを用いて本プロテアーゼの分子量を求めたところ２
５，０００であった。溶出液としては、０．１Ｍ塩化カ
リウム及び５mM塩化カルシウムを含む１０mMトリス−塩
酸緩衝液（pH７．０）を用いた。なお、標準蛋白として
は、牛血清アルブミン（分子量：６８，０００）、卵白
アルブミン（分子量：４５，０００）、キモトリプシノ
ーゲンＡ（分子量：２５，０００）及びリボヌクレアー
ゼＡ（分子量：１３，７００）を用いた。(E) Molecular Weight The molecular weight of this protease was determined by using Sephadex G-100 gel filtration chromatography.
It was 5,000. As the eluent, 10 mM Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 7.0) containing 0.1 M potassium chloride and 5 mM calcium chloride was used. As standard proteins, bovine serum albumin (molecular weight: 68,000), ovalbumin (molecular weight: 45,000), chymotrypsinogen A (molecular weight: 25,000) and ribonuclease A (molecular weight: 13,700) are used. I was there.

【００３２】（ｆ）界面活性剤及びビルダーのプロテア
ーゼ安定性に及ぼす影響 約２×１０^-4AUの本発明微生物産生のプロテアーゼを、
所定濃度の各種界面活性剤又はビルダーを溶解した５０
mMホウ酸緩衝液（pH８．０）に加え、２５℃で１時間放
置した。その後同緩衝液で５倍に希釈し、尿素変性ヘモ
グロビンを基質とし、残存活性を測定した。その結果を
表５に示した。(F) Effect of Surfactants and Builders on Protease Stability About 2 × 10 ^-4 AU of the microorganism-produced protease of the present invention is added,
50 in which various surfactants or builders of prescribed concentration are dissolved
The mixture was added to mM borate buffer (pH 8.0) and left at 25 ° C for 1 hour. After that, it was diluted 5-fold with the same buffer, and the residual activity was measured using urea-modified hemoglobin as a substrate. The results are shown in Table 5.

【００３３】[0033]

【表５】 [Table 5]

【００３４】これらの結果から、本発明微生物産生のプ
ロテアーゼは、界面活性剤又はビルダー中でかなり安定
であると考えられる。From these results, it is considered that the protease produced by the microorganism of the present invention is considerably stable in the surfactant or builder.

【００３５】（ｇ）酵素阻害剤の影響 ４×１０^-3AUのプロテアーゼを、所定濃度の一般的なプ
ロテアーゼ阻害剤を加えた０．１Ｍホウ酸緩衝液（pH
８．０）中に添加し、２５℃で１時間処理を行った（ジ
イソプロピルフルオリデート（ＤＦＰ）を用いる場合
は、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液、pH７．０にて処理を行
った）。処理後、０．１Ｍホウ酸緩衝液（pH８．０）に
て１０倍に希釈し、アンソン・ヘモグロビン法により酵
素活性を測定した。対照として阻害剤未添加で同様に処
理を行った系を用意し、その活性を１００とした時の相
対値で阻害剤の影響を表わした。この結果を表６に示
す。(G) Effect of enzyme inhibitor 0.1M borate buffer solution (pH: 4 × 10 ⁻³ AU of protease added to a predetermined concentration of a general protease inhibitor)
8.0) and treated at 25 ° C. for 1 hour (when diisopropylfluoridate (DFP) was used, it was treated with 0.1 M Tris-HCl buffer, pH 7.0). After the treatment, it was diluted 10 times with 0.1 M borate buffer (pH 8.0), and the enzyme activity was measured by the Anson hemoglobin method. As a control, a system which was similarly treated without the addition of an inhibitor was prepared, and the effect of the inhibitor was expressed by the relative value when the activity was set to 100. The results are shown in Table 6.

【００３６】[0036]

【表６】 [Table 6]

【００３７】本プロテアーゼは、ＤＦＰにより微かに阻
害されることから、活性中心にセリンを有しているもの
と考えられるが、一般のセリン酵素に比べ、ＤＦＰに対
して強い耐性を有する。Since this protease is slightly inhibited by DFP, it is considered that it has serine at the active center, but it has stronger resistance to DFP than general serine enzymes.

【００３８】（ｈ）金属イオンの影響 各金属塩を５mMとなるように加えた０．１Ｍホウ酸緩衝
液（pH８．０）にアルカリプロテアーゼ４×１０^-3AUを
添加後、２５℃１０分間処理を行った。その後、同緩衝
液にて１０倍に希釈して、アンソン・ヘモグロビン法に
て酵素活性を測定した。金属塩未添加の系を対照として
用いその活性を１００とした時の相対値各金属イオンの
影響を表わした。この結果を表７に示す。(H) Effect of metal ion After adding alkaline protease 4 × 10 ^-3 AU to 0.1 M borate buffer (pH 8.0) containing 5 mM of each metal salt, 25 ° C. for 10 minutes Processed. Then, the enzyme activity was measured by the Anson hemoglobin method after diluting 10 times with the same buffer solution. The relative value when the activity was set to 100 using the system without addition of metal salt as a control, the effect of each metal ion was shown. The results are shown in Table 7.

【００３９】[0039]

【表７】 [Table 7]

【００４０】この結果から、本発明微生物産生のプロテ
アーゼは各種金属イオンに対して非常に安定であり、こ
れらの存在によっても何ら影響を受けないことが認めら
れた。From these results, it was confirmed that the protease produced by the microorganism of the present invention is extremely stable against various metal ions and is not affected by the presence of these.

【００４１】[0041]

【発明の効果】本発明のバチルス・エスピー ＫＳＭ−
２００４の産生するプロテアーゼは、叙上の如く広範囲
なpH領域に於いて最適な活性を示し、低温域でも活性を
有する。しかも、ケラチン等に対して優れた分解力を有
し、かつ、洗剤組成物中に配合されたり、洗濯中に混入
する各種成分、例えば界面活性剤、ビルダー成分、金属
イオン等の存在下に於いてもほとんどその作用の低下は
認められない。従って、このプロテアーゼは、重質及び
軽質洗剤に配合するプロテアーゼとして極めて優れたも
のである。The Bacillus sp. KSM- of the present invention
The protease produced by 2004 shows optimum activity in a wide pH range as described above, and has activity even in a low temperature range. Moreover, it has an excellent decomposing power for keratin and the like, and is present in the presence of various components such as a surfactant, a builder component, and a metal ion which are mixed in the detergent composition or mixed during washing. However, almost no decrease in the action is observed. Therefore, this protease is extremely excellent as a protease to be added to heavy and light detergents.

【００４２】[0042]

【実施例】次に実施例を挙げて、本発明を更に詳しく説
明する。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to examples.

【００４３】実施例１ プロテアーゼ産生菌株の分離、採取： （ｉ）栃木県芳賀郡で採取した土壌サンプルの約１ｇを
滅菌生理食塩水１０mlに懸濁し、８０℃にて２０分間放
置し熱処理した。熱処理上清液０．１mlをケラチンハロ
ー寒天培地へ接種し、３０℃で４８時間静置培養した。
用いたケラチンハロー寒天培地の組成は以下に示す通り
である。Example 1 Isolation and collection of protease-producing strain: (i) About 1 g of a soil sample collected in Haga-gun, Tochigi Prefecture was suspended in 10 ml of sterilized physiological saline and allowed to stand at 80 ° C. for 20 minutes for heat treatment. The heat-treated supernatant (0.1 ml) was inoculated into a keratin halo agar medium and statically cultured at 30 ° C. for 48 hours.
The composition of the keratin halo agar medium used is as shown below.

【００４４】[0044]

【表８】 グルコース １％ 酵母エキス ０．２％ リン酸第一カリウム ０．１％ 羊毛ケラチン １％ カルボキシメチルセルロース １％ 硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２％ 寒天 １．５％[Table 8] Glucose 1% Yeast extract 0.2% Potassium potassium phosphate 0.1% Wool keratin 1% Carboxymethyl cellulose 1% Magnesium sulfate heptahydrate 0.02% Agar 1.5%

【００４５】（ii）上記培地組成物に、別滅菌を施した
１０％炭酸ナトリウムを０．０１％、０．１％、１％添
加し、最終pHを７．０、９．０、１０．５に調整後、平
板培地を作製した。(Ii) Separately sterilized 10% sodium carbonate (0.01%, 0.1%, 1%) was added to the above medium composition, and the final pH was 7.0, 9.0, 10. After adjusting to 5, a plate medium was prepared.

【００４６】培養後、生育したコロニーの周囲にハロー
を生じたものを選抜し、同培地で２〜３回純化し、均一
のプロテアーゼ生産菌を得た。土壌サンプル３００点よ
り、各pHの平板培養より得られた菌株は、１２０菌株で
あった。After culturing, halos that had grown around the grown colonies were selected and purified 2-3 times in the same medium to obtain uniform protease-producing bacteria. From 300 soil samples, 120 strains were obtained by plate culture at each pH.

【００４７】（iii）上記（ii）で得たこれらの菌株を
以下に示すケラチン液体培地へ接種し、３０℃で好気的
に４８時間振盪培養を行った。(Iii) These strains obtained in (ii) above were inoculated into the keratin liquid medium shown below, and aerobically cultured at 30 ° C. for 48 hours with shaking.

【００４８】[0048]

【表９】 グルコース ０．２％ 羊毛ケラチン ０．５％ 酵母エキス ０．０５％ リン酸第一カリウム ０．１％ 炭酸ナトリウム（別滅菌） ０．４％ pH ９．０Table 9 Glucose 0.2% Wool keratin 0.5% Yeast extract 0.05% Potassium potassium phosphate 0.1% Sodium carbonate (other sterilization) 0.4% pH 9.0

【００４９】培養中又は終了後、ケラチンの分解力が顕
著な菌株を選択した。この方法でケラチンハロー平板培
地より得られた１２０菌株から本発明のプロテアーゼ生
産菌、バチルス・エスピー ＫＳＭ−２００４を得た。During or after the culture, a strain having a remarkable keratin degrading power was selected. Bacillus sp. KSM-2004, a protease-producing bacterium of the present invention, was obtained from 120 strains obtained from the keratin halo plate medium by this method.

【００５０】参考例１ 実施例１により得たバチルス・エスピー ＫＳＭ−２０
０４（ＦＥＲＭ Ｐ−９４５２）を以下の液体培地に接
種し、３０℃で好気的に４８時間振盪培養を行った。Reference Example 1 Bacillus sp. KSM-20 obtained in Example 1
04 (FERM P-9452) was inoculated into the following liquid medium, and shake culture was carried out aerobically at 30 ° C. for 48 hours.

【００５１】[0051]

【表１０】 グルコース ２％ 魚肉エキス １％ 大豆粉 １％ 硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２％ リン酸第一カリウム ０．１％ 炭酸ナトリウム（別滅菌） ０．４％ pH ９．０[Table 10] Glucose 2% Fish meat extract 1% Soybean powder 1% Magnesium sulfate heptahydrate 0.02% Potassium dihydrogen phosphate 0.1% Sodium carbonate (other sterilization) 0.4% pH 9.0

【００５２】培養終了後、得られた培養物を遠心分離
（３，０００回転；１０分間）に付して菌を除去し、得
られた培養上清を酵素液とし、そのプロテアーゼ活性を
測定した。プロテアーゼの活性は次の２通りの方法によ
って測定した。After completion of the culture, the obtained culture was subjected to centrifugation (3,000 rotations; 10 minutes) to remove the bacteria, and the obtained culture supernatant was used as an enzyme solution, and its protease activity was measured. . The activity of protease was measured by the following two methods.

【００５３】（ａ）尿素変性ヘモグロビンを基質とした
アンソン−ヘモグロビン法：アンソンの方法（Ａｎｓｏ
ｎ，Ｍ．Ｌ．：Ｊ．Ｇｅｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２２，
７９（１９３８））に従い尿素を用いて牛血清ヘモグロ
ビンを変性させ、苛性ソーダにてpH１０．５とした。こ
の基質溶液（ヘモグロビンとして２．２％）の０．５ml
に酵素液０．１ml（０．１×１０^-4〜１．０×１０^-4A
U）を添加し、２５℃にて１０分間反応を行い、４．９
％トリクロル酢酸１．０mlを加え反応を停止した。反応
終了後、遠心分離（３，０００rpm ；１０分間）を行
い、その上清液中に含まれる蛋白分解物をフォーリン・
ローリー法（Ｏ．Ｈ．Ｌｏｗｒｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．１９３，２６５（１９５１））によって定量し
た。なお、１AUは、上記反応条件下に於いて１分間に１
mmoleのチロシンを遊離する酵素量とした。(A) Anson-hemoglobin method using urea-modified hemoglobin as a substrate: Anson's method (Anso
n, M. L. : J. Ger. Physiol. , 22 ,
79 (1938)), the bovine serum hemoglobin was denatured with urea and adjusted to pH 10.5 with caustic soda. 0.5 ml of this substrate solution (2.2% as hemoglobin)
0.1 ml of enzyme solution (0.1 × 10 ^{-4 to} 1.0 × 10 ^-4 A)
U) was added and the reaction was carried out at 25 ° C. for 10 minutes, 4.9
The reaction was stopped by adding 1.0 ml of% trichloroacetic acid. After completion of the reaction, centrifugation (3,000 rpm; 10 minutes) was performed to remove the protein degradation product contained in the supernatant from the
Lowry method (OH Lowry et al., J. Biol. C)
hem. 193 , 265 (1951)). 1 AU is 1 per minute under the above reaction conditions.
The amount of enzyme that releases mmole of tyrosine was used.

【００５４】（ｂ）ケラチンを基質とした方法 ０．５％羊毛ケラチンを２０mM炭酸緩衝液中に懸濁させ
た溶液０．５mlに、酵素液０．１mlを添加し、２５℃で
２時間反応を行い、４．９％トリクロル酢酸水溶液１．
０mlを加え反応を停止した。以下の操作は（ａ）と同一
とし、蛋白分解物量を測定した。なお、１KUは、上記反
応条件下に於いて、１分間に１mmoleのチロシンを遊離
する酵素量とした。(B) Method using keratin as a substrate 0.5 ml of a 0.5% wool keratin suspension in 20 mM carbonate buffer was added with 0.1 ml of enzyme solution and reacted at 25 ° C. for 2 hours. Is carried out and 4.9% trichloroacetic acid aqueous solution 1.
The reaction was stopped by adding 0 ml. The following operations were the same as those in (a), and the amount of proteolytic products was measured. 1 KU is the amount of enzyme that liberates 1 mmole of tyrosine per minute under the above reaction conditions.

【００５５】本参考例で得られた酵素液のプロテアーゼ
活性は、表１１の通りである。The protease activity of the enzyme solution obtained in this reference example is shown in Table 11.

【００５６】[0056]

【表１１】 [Table 11]

【００５７】参考例２ 参考例１に於いて得られた酵素液に、７５％飽和になる
ように硫安を添加した。生じた沈殿を遠心分離（８，０
００rpm;１５分間）し、イオン交換水に対し透析後その
酵素学的性質（理化学的性質）を調べたところ、前記の
通りであった。Reference Example 2 Ammonium sulfate was added to the enzyme solution obtained in Reference Example 1 so as to be 75% saturated. The resulting precipitate was centrifuged (8.0
It was as described above when the enzymatic properties (physical and chemical properties) were examined after dialysis against ion-exchanged water.

【００５８】参考例３ 洗浄試験：ＪＩＳ Ｋ３３７１に準じ、洗浄試験を行っ
た。洗浄系は、市販の無リン重質洗剤（酵素未添加のも
の）を０．１３３％になるように４°ＤＨの水にて調製
後、本発明微生物産生のプロテアーゼ溶液を０．０１AU
／ｌとなるようにそれぞれ添加した。試験布は、ヒト皮
膚上の汚れが付着しやすいワイシャツ衿部分（３日間着
用）とし、一対比較ができるように１１×１３cm程に裁
断後、酵素添加、あるいは酵素未添加の洗浄系にて３０
℃１時間浸漬を行った。浸漬終了後、ターゴットメータ
ー（上島製作所社製）を使用し、２０℃ １２０rpm １
０分間の洗浄を行った。濯ぎ、乾燥後、一対の衿布（１
５組）を見比べ汚れ落ちの程度を３名の熟練した判定者
により、それぞれ肉眼で判定を行った。判定方法は、汚
れがほぼ完全に落ちている場合を５点、汚れがほとんど
落ちていない場合を１点として、１５枚の衿布の合計評
価点を求め、酵素未添加の洗浄系による評価点を１００
とした場合の比率を洗浄力指数として表わした。この結
果を表１２に示す。Reference Example 3 Cleaning Test: A cleaning test was conducted according to JIS K3371. For the washing system, a commercially available phosphorus-free heavy-duty detergent (without addition of enzyme) was prepared in 0.133% water at 4 ° DH, and then 0.01 AU of the protease solution produced by the microorganism of the present invention was prepared.
/ L, respectively. The test cloth is a shirt collar part (worn for 3 days) where stains on human skin are likely to adhere, and after being cut into pieces of about 11 × 13 cm so that pairwise comparison can be made, it is cleaned with an enzyme-containing or enzyme-free cleaning system.
Immersion was performed at ℃ for 1 hour. After the immersion, use a targot meter (manufactured by Kamijima Seisakusho Co., Ltd.) at 20 ° C. 120 rpm 1
Washing was performed for 0 minutes. After rinsing and drying, a pair of collar cloths (1
5 sets) were compared, and the degree of stain removal was visually evaluated by three skilled judges. The evaluation method was as follows: when the stains were almost completely removed, 5 points, and when the stains were hardly removed, 1 point was calculated, and the total evaluation points of 15 pieces of the collar cloth were obtained. To 100
Was expressed as a detergency index. The results are shown in Table 12.

【００５９】[0059]

【表１２】 [Table 12]

【００６０】以上の結果により、本発明の微生物より得
られたプロテアーゼは、その作用を充分に発揮しうる優
れた洗浄剤用の酵素であることが明らかである。From the above results, it is clear that the protease obtained from the microorganism of the present invention is an excellent enzyme for detergent which can sufficiently exert its action.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】本発明微生物産生のプロテアーゼの活性に及ぼ
すpHの影響を示す図面である。FIG. 1 is a drawing showing the effect of pH on the activity of a protease produced by the microorganism of the present invention.

【図２】本発明微生物産生のプロテアーゼの安定性に及
ぼすpHの影響を示す図面である。FIG. 2 is a drawing showing the effect of pH on the stability of a protease produced by the microorganism of the present invention.

【図３】本発明微生物産生のプロテアーゼの活性に及ぼ
す温度の影響を示す図面である。FIG. 3 is a drawing showing the effect of temperature on the activity of a protease produced by the microorganism of the present invention.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 伊藤 進 栃木県宇都宮市東峰町3441−64 (72)発明者 岡本 暉公彦 埼玉県越谷市七左町１−229−８─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI Technical display location C12R 1:07) C12R 1:07) (72) Inventor Susumu Ito 3441 Higashiminecho, Utsunomiya City, Tochigi Prefecture 64 (72) Inventor Akihiko Okamoto 1-229-8 Nanachiza, Koshigaya City, Saitama Prefecture

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 プロテアーゼを生産する能力を有し、微
工研菌寄第９４５２号（ＦＥＲＭ Ｐ−９４５２）とし
て寄託されたバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ．）ＫＳＭ−２００４。1. Bacillus sp. (Bacillus) having the ability to produce a protease and deposited as Microindustrial Research Institute No. 9452 (FERM P-9452).
sp. ) KSM-2004.