JP3065628B2

JP3065628B2 - ヒト免疫グロブリン遺伝子関連ｄｎａ断片及び該ｄｎａ断片を用いる診断方法

Info

Publication number: JP3065628B2
Application number: JP1329005A
Authority: JP
Inventors: 良和黒沢; 慶和市原; 昭粟屋; 雄作石塚
Original assignee: Mitsui Chemicals Inc; Fujita Health University
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc; Fujita Health University
Priority date: 1988-12-19
Filing date: 1989-12-19
Publication date: 2000-07-17
Anticipated expiration: 2015-07-17
Also published as: JPH0387185A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、免疫学、遺伝学、発生学、血液学、癌研究
等の分野で、下等動物より哺乳動物などの高等動物まで
の免疫グロブリンあるいはＴ細胞レセプターを生産する
動物類における、なかでもヒトにおける免疫グロブリン
あるいはＴ細胞レセプターの産生に関与する新たなDNA
断片に関する。

本発明のこれらDNA断片の、各種細胞からのクローニ
ング及び構造決定による免疫グロブリンあるいはＴ細胞
レセプターの多様な反応性の遺伝子レベルでの解析・実
証を行なうことにより、これらDNA断片に含まれる遺伝
子の発現過程を利用して、多様な抗原特異性を持つ免疫
ブロブリンを各種生産する技術の確立に必要な情報が提
供され得る。

更に、本発明は、前記のこれら特定のDNA断片を含む
固定のDNA断片を腫瘍マーカーとして用いるＢ細胞系あ
るいはＴ細胞系腫瘍細胞の検出法、すなわちリンパ系腫
瘍、白血病等の診断方法も提供する。

［従来の技術及び発明が解決しようとする課題］免疫化学、細胞免疫学、免疫遺伝学の進展により、動
物の生産する抗体分子（免疫グロブリン）については、
以下のような事実が明らかとされている（参考文献1:後
述の参考文献リストにその詳細を示す）。

免疫グロブリン（Ig）は、２本の同一な重鎖（Ｈ鎖）
および軽鎖（Ｌ鎖）からできている。Ｈ鎖、Ｌ鎖は構造
および機能上、２つの領域に分かれており、定常（不
変）領域（Ｃ領域）と呼ばれる一定した一次構造を持つ
Ｃ末端側に位置する領域と、可変領域（Ｖ領域）と呼ば
れるＮ末端より約110アミノ酸残基の領域とがあり、Ｖ
領域が抗原結合領域に相当する。

抗体の抗原結合能力の多様性は、Ｖ領域のアミノ酸一
次配列の相違で説明され、即ち対応する遺伝子のDNA塩
基配列の相違に起因する。

Ｈ鎖及びＬ鎖のＶ領域のアミノ酸の多様性について、
Ｎ末端からの距離とアミノ酸の変異度との相関からみる
と、Ｖ領域全体として高い変異度があるが、その中でも
とりわけ多様性に富んでいる場所が、それぞれ３個所に
集中している。それは、IgのＶ領域の立体構造において
βシート構造を形作るポリペプチドIIとIIIの間、IIIと
IVの間及びVIとVIIの間の３個所であり、Ｈ、Ｌ両鎖で
計６個所となる。これらの個所が抗原結合部位をポケッ
ト状に形成するので、相補性決定部位（complementarit
y determing region;CDR）と呼ばれている。

そして、これら３個所はそれぞれCDR I、CDR II、CDR
IIIと呼ばれる。

この中でＨ鎖のCDR IIIはとりわけ多様性に富んでお
り、このＶ領域部分が、多種類の抗原結合能を有するこ
とと密接に関連している。

20種類のアミノ酸のうち、比較的βシート構造をつく
りやすいアミノ酸は、システィン、フェニルアラニン、
イソロイシン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、ス
レオニン、バリン、トリプトファン、チロシンの10種類
である。

他方IgH鎖遺伝子の全構成はＨ鎖Ｖ（variable）領域
（V_H）遺伝子、Ｈ鎖Ｄ（diversity、分岐）領域（D_H）
遺伝子、Ｈ鎖Ｊ（joining、結合）領域（J_H）遺伝子及
びＣ領域遺伝子の順で成り立っている。

Ig遺伝子は、Ｂリンパ球系細胞に特異的に発現する遺
伝子で、その発現はＢ細胞の分化・成熟の過程にともな
って調節・制御される。

すなわち、これら遺伝子は２種類のDNA再配列を行な
い、１つはV_H−D_H−J_H結合で、これにより完全な活性型
Ｖ遺伝子が形成される。いま１つは、Ｈ鎖のクラススイ
ッチのためのDNA再編成である。

胎児型遺伝子配列の中で分散していたＨ鎖遺伝子は、
幹細胞からＢ細胞へ分化する過程で、まず１つのD_H遺伝
子断片と１つのJ_H遺伝子断片が、その間のシグナルヘプ
タマー、シグナルノナマー、スペーサーを含むイントロ
ン部分の欠失をともなって結合し、次にこのDJ結合断片
が１つのV_H断片と結合し、VDJという遺伝子配列をもつ
活性型のＶ遺伝子が形成される。

このIgH鎖遺伝子Ｄ領域に存在するD_H遺伝子が、Ｈ鎖C
DR IIIをコードする遺伝子であり、同一のファミリーに
属する胎児型D_H遺伝子は、規則的な間隔で、マウスでは
５キロ塩基対（kb）（参考文献２）、ヒトでは9kb（参
考文献３）ごとに繰り返しコードされている。

しかしながら、ヒトＤ領域におけるD_H遺伝子の分布、
存在様式については、十分で詳細にわたる検討は未だ行
なわれていなかったのが現状であり、わずかSiebenlist
らが上記の報告（参考文献３）で２つのD_H遺伝子ファミ
リー（D_HQ52、D_LR）を同定していたにすぎない。

そこで、本発明者らの一人は、既にマウスの胎児型D_H
遺伝子を12個同定し、３つのファミリーに分類した（参
考文献２）が、引き続き本発明者らはヒトD_H領域ゲノム
についても詳細に検討し、9kb単位の中に、５つの異な
るD_H遺伝子（D_M1遺伝子、D_LR1遺伝子、D_XP1遺伝子、Ｄ
_XP′１遺伝子及びD_N1遺伝子）を同定した（参考文献
４）。

D_H遺伝子領域は、抗体分子の各種抗原に対する多様な
反応性を、V_H遺伝子領域、J_H遺伝子領域とともに規定し
ており、これら３つの遺伝子の結合の組み合せから、１
個の生体は10⁶〜10⁸種類の抗体分子をつくり得るとされ
てる。

他方、Ｔ細胞レセプター、特にβ鎖、δ鎖の遺伝子の
VDJ結合の多様な組合せ、そして抗原に対する多様な反
応性も免疫グンロブリンと同様に解明されてきている。

このように多様な抗原に対して、Ｂ細胞系細胞あるい
はＴ細胞系細胞が分化し、その分化過程で抗体あるいは
Ｔ細胞レセプターの各遺伝子間で再編成が起き、多様な
抗体あるいはＴ細胞レセプターを産生するメカニズムの
大筋は明らかにされたが、その実体については未解決の
問題も多く、そのメカニズムを利用した多様な抗体等の
人為的な生産の研究は未だ行なわれていなかった。

本発明者らは、CRD IIIの抗原結合能の多様性の決定
に特別深く関与しているD_H遺伝子領域の全貌を明らかに
し、多種多様な抗体を作製する手段を開発する道を切り
開くことにつなげたいと考えた。

すなわち、更により多くのD_H遺伝子をクローニング
し、そのヌクレオチド配列を明らかにし、特定の部位の
アミノ酸を種々変えたIgを人工的に調製するために、そ
れらD_H遺伝子を使用することを企画した。

従来における抗体生産の研究は、特定の抗原に対する
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を必要にせま
られ調製している場合がほとんどすべてであったが、本
発明者らの方法は、従来における研究とは逆に、あらか
じめ様々な抗体を人工的に作製しておき、しかる後に、
これまで未検討の抗原あるいは新たに出現してきた抗原
に対応する抗体を、それらの中から探索・スクリーニン
グしていくという方法である。

本発明の目的は、Igの産生調節機構の解明及び新たに
人工的なIgの生産に有用な細胞生物学上、また医学的
に、更に医療産業上の応用に極めて有用な技術を提供す
ることにある。

例えば、各種D_H遺伝子の詳細なヌクレオチド配列と各
種D_H遺伝子のスクリーニングや同定に有用なプローブを
提供することにある。

更に、本発明は、前記の各種D_H遺伝子DNA断片を含む
固有のDNA断片を腫瘍マーカーとして用いるＢ細胞系あ
るいはＴ細胞系腫瘍細胞の検出法、すなわちリンパ系腫
瘍、白血病等の診断方法も提供する。

［課題を解決するための手段］本発明のDNA断片は、D_H遺伝子ファミリーD_A、D_K及び
ＤIRに属するD_H遺伝子の１以上を少なくとも含むことを
特徴とする。

このDNA断片は、各種D_H遺伝子のスクリーニングや同
定などのプローブとして、あるいは特定の部位のアミノ
酸を種々変えたIgを人工的に調製するための各過遺伝子
工学的操作に用いる遺伝子配列として有用である。

以下、本発明のDNA断片について、D_HP4遺伝子、D_A4遺
伝子、D_K4遺伝子、D_N4遺伝子、ＤIR_１遺伝子、D_M1遺伝
子、D_LR1遺伝子、D_XP1遺伝子、Ｄ_XP′１遺伝子、D_A1遺
伝子、D_K1遺伝子、D_N1遺伝子,DIR_２遺伝子及びD_M2遺伝
子を含む15kbからなるDNA断片を代表例として詳細に説
明する。

なお、15kb DNA断片中に見い出される遺伝子ファミリ
ーD_A、D_K及びD_IRに属するD_H遺伝子、すなわち、D_Aに属
するD_A4遺伝子、D_A1遺伝子;D_Kに属するD_K4遺伝子、D_K1
遺伝子;DIRに属するＤIR_１、ＤIR_２は、その存在及び具
体的なDNA配列が本発明者らによって初めて特定された
ものである。

先に述べたようにD_H遺伝子領域（多数のD_H遺伝子が配
列された領域）には、同一ファミリーに属するD_H遺伝子
が9kb間隔で繰り返されていることが知られており、本
発明者らにより同定された上記のD_H遺伝子と同一ファミ
リーに属するD_H遺伝子が該15kb DNA断片領域以外のD_H遺
伝子領域にも存在する（このことは後述の実施例の結果
によっても支持されている）。

従って、上記15kb DNA断片以外のD_H遺伝子領域中にあ
る遺伝子ファミリーD_A、D_K、ＤIRに属するD_H遺伝子もま
た本発明に含まれるものである。

該15kb DNA断片領域のヒト胎児型DNAでの存在位置を
第１図に模式的に示す。

該15kb DNA断片領域は、前述のSiebenlistらの報告
（参考文献３）にあるD₁に対応するD_LR1の上流及び下流
部分に相当し、9kbからなるD_LR1を含むその上流部分を
とし、下流部分をとし、同一ファミリーのD_H遺伝子
が対応するよう分割して示した。即ち、のDNA鎖の
３′末端に、のDNA鎖の５′末端が連結している。

のDNA鎖とのDNA鎖の間に引いた線は、両鎖を比較
して挿入あるいは欠失がある部分を示す。

なお、RE¹及びRE²で示された領域は16bpの繰り返しを
示す。また、ＥはEcoR I切断部位、ＢはBamH I切断部
位、ＨはHind III切断部位をそれぞれ示す。Ｅ^＊は、ク
ローニングのために人工的にマニアチスらにより導入さ
れたEcoR I切断部位である。

従って、該15kb DNA断片から所望の部位を含む小断片
を得るには、これらの制限酵素切断部位が好適に利用で
きる。

上述の本発明の15kb DNA断片および各D_H遺伝子は、遺
伝子工学を利用した人工的な各種抗体の調製等、これら
DNA断片の機能を種々の用途に使用する際の原料とし
て、また後に説明する本発明者らによる新たな知見を確
認するための、あるいは免疫グロブリン生産調節機構の
更なる解明のために利用する試薬として有用である。

これら本発明の15kb DNA断片および各D_H遺伝子は、例
えばヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子を適当な制限酵素で
処理して断片化し、これを適当なベクターに結合して、
DNAライブラリーを作製し、その中から所望の遺伝子を
含むクローンを選択する方法により作製できる。また、
D_H遺伝子は、15kb DNA断片からの再クローニングや化学
的合成法で調製できる。

このDNAライブラリーの作製には、クローニングに広
く用いられている各種のプラスミドやフファージからな
るベクターを用いることができる。

以下、ベクターとしてλ−ファージ由来のベクターを
用いる場合について述べる。

まず、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子を有する適当な
造血細胞のDNAを常法により調製し、これを適当な制限
酵素で処理し、得られたDNA断片をCharon 4 Aベクター
等のλ−ファージ由来のベクターに結合させて、DNAフ
ァージライブラリーを作製する。

次に、このDNAファージライブラリーから適当なD_H遺
伝子スクリーニング用のプローブとハイブリダイズする
組換え体を、プラークハイビリダイゼーション等の方法
により選別する。

選別された、クローンが所望の遺伝子を含んでいるか
どうかは、その制限酵素地図を作製したり、ヌクレオチ
ド配列を分析することにより確認できる。

なお、上述のDNAファージライブラリーとしては、例
えばマニアチス（T.Maniatis）のヒトDNAファージライ
ブラリー（参考文献５）が利用できる。

なお、このスクリーニングには、例えば、Benton−Da
vis法（参考文献６）などが利用できる。

なお、λ−ファージ由来のベクターに所望の遺伝子を
組み込んで作製したクローンは、適当な細菌を宿主とし
て増殖させて、種々の用途に用いることができる。

マニアチスのヒトDNAファージライブラリーのよう
に、Charon 4 Aベクターを用いた場合は、宿主として、
大腸菌（Escherichia coli）DP 50、E.coli 803［例え
ば、K.Murray（University of Edinburgh）等から入手
できる］、E.coli K−12 X 1776（ATTC 31244）、E.col
i K 802（ATTC 33526）、E.coli LE 392（ATTC 3357
2）、E.coli MM 29d（ATTC 33625）、E.coli MM21（ATT
C 33678）などが利用できる。これらの中では、E.coli
803が好ましい。

上記15kb DNA断片を含むクローンは、例えば、上記マ
ニアチスのヒトDNAファージライブラリーから、Ravetch
らが取り出したD_H−J_Hプローブ（参考文献10）を用い
て、前述のBenton−Davis法（参考文献６）によって単
離することができる。

なお、後述の実施例１でマニアチスのヒトDNAファー
ジライブラリーから分離された第１図の15kb DNA断片を
含むクローン（Bacteriophage,Clone HUD−３）は、NCI
MB（National Collection of Industrial and Marine B
acteria;P0 Box 31,135 Abbeyoad,AberdeenAB9 8DG,Sco
tland,UK）にブタペスト条約に基づいて寄託されてお
り、その寄託日及び寄託番号は以下のとおりである。

寄託日：昭和63年（1989）２月27日寄託番号:NGIB 40122 また、該15kb断片中の各D_H遺伝子を個々に、適当なベ
クター中に組み込んだクローンは、常法に従って各D_H遺
伝子の上流及び下流にある適当な制限酵素切断部位を利
用して、これらを切り出してクローン化することによっ
て得ることもできる。

該クローン化に、Charon 4 Aベクターを用いた場合
は、宿主として上記の大腸菌が利用できる。

また、プラスミドベクターを用いたクローンとして
は、例えば、後述の実施例２で得られたプラスミドpPDX
P（D_XP1遺伝子を含む）、プラスミドpDA（D_A4遺伝子を
含む）、プラスミドpDK（D_K1遺伝子を含む）、プラスミ
ドpDN（D_N4遺伝子を含む）、プラスミドpDM（D_M2遺伝子
を含む）、プラスミドpDLR（D_LR1遺伝子を含む）等を挙
げることができる。

なお、これらプラスミドpPDXPを有する大腸菌MV1184
は昭和63年12月15日付で、ブタペスト条約に基づいて工
業技術陰微生物工業技術研究所［茨城県つくば市東１丁
目１番３号（郵便番号305）］に寄託され、各寄託番号
は次のとおりである。

大腸菌pPDXP（プラスミドpPDXPを有する）： FERM BP−2193 大腸菌pDA（プラスミドpDAを有する）： FERM BP−2188 大腸菌pDK（プラスミドpDKを有する）： FERM BP−2189 大腸菌pDM（プラスミドpDMを有する）： FERM BP−2191 大腸菌pDN（プラスミドpDNを有する）： FERM BP−2192 大腸菌pDLR（プラスミドpDLRを有する）： FERM BP−2190 この15kb DNA断片の塩基配列は第２図に示すとおりで
ある。

第２図において、シグナルヘプタマー、シグナルノナ
マー部分に下線が引かれ、オープンリーディングフレー
ム（D_Hコード領域）には太い下線が引かれている。

また、典型的なD_Hコード領域の隣接領域のなか以外の
領域にも15個のCAC（A/T）GTG領域が存在し、そこにも
下線が引いてある。

それらのうちの１つで、D_M遺伝子の上流に位置するヘ
プタマーはシグナルノナマーにより取り囲まれている。

第１図の始めの9kb領域には、６個の異なるD_H遺伝
子が同定された。すなわち、５′−D_XP4−（1061bp）−
D_A4−（889bp）−D_k4−（1773bp）−D_N4−（430bp）−D
_M1−（2610bp）−D_LR1−３′である。

D_XPとD_LRの間には特徴的な16bpの繰り返し配列が存在
し、これらは21回繰り返され、該繰り返し部分の共通配
列は、CCTGG（G/A）Ｃ（C/T）Ｔ（C/A）AC（C/T）TG（A
/G）である（なお、「／」は「または」を意味する）。
また、D_XP4の上流には同じ16bp配列が17回繰り返されて
いる。

第１図の領域の次の9kb領域の前半部分には、D_XP
遺伝子を含むDNA断片が重複化しており、D_XP1とＤ
_XP′１が存在する。

この領域でのD_H遺伝子の配列順序は、５′−D_XP1−
（97bp）−Ｄ_XP′１−（804bp）−D_A1−（884bp）−D_k1
−（1426bp）−D_N1−（430bp）−D_M2−３′である。

なお、D_LR2は、まだ本発明者らの配列決定はそこまで
到達していないが、前に挙げたSiebenlistらの報告（参
考文献３）のとおりに存在しているはずである。

また、第１図部分と部分での繰り返し配列を対比
すると、４つの大きな欠失及び挿入部分が存在し、それ
らはＩ（256bp）、II（859bp）、III（499bp）、IV（16
bp）で表示された部分（四角で囲んだり、塗りつぶした
３角の印がついている）である（第１図にも対応する部
分を示してある）。

更に、部分と部分では、点変異や１〜３ヌクレオ
チドの欠失、挿入のような僅かの相違の存在も認められ
た（後述の表１）。

D_LR1の上流領域のD_XP4遺伝子は、D_LR1の下流領域にお
いて局所的に重複化されD_XP1遺伝子及びＤ_XP′１遺伝子
となっている。

先に挙げた参考文献４の報告で、相同的配列のCCACAG
（G/＊）CCTCCC（C/T）における不平等交差（乗り換えc
rossing−over）が生じるであろうという仮説は、上記
の事実によって確証された。

以上第１図および第２図で説明したように、本発明者
らがクローン化した15kb断片中に新たに３つのD_H遺伝子
ファミリーが見い出されたことから、D_H遺伝子領域中に
存在するD_H遺伝子の総数は約30と見積ることができる。

すなわち、Siebenlistら（参考文献３）は、４個D_LR
遺伝子ファミリーに属するD_H遺伝子がヒトのゲノム上で
9kbの間隔で直列にコードされていると報告している。
最近、Matsudaら（参考文献７）は、V_H遺伝子領域の中
に更に１つのD_LR遺伝子（D_LR5）を同定した。Buluwelら
（参考文献８）もまた、D_H遺伝子の大及び小クラスター
の構成の特性を記述した。

なお、本発明の15kb DNA断片は、これら公表論文のD
_LR4の３′側よりD_LR2の５′側までの部分に相当するも
のである。

本発明者らは、実施例３においてD_H遺伝子の総数を見
積るために、第１図に示すような異なるファミリーに属
するD_H遺伝子を個々にそれぞれ含む６つのプローブ（第
１図中ので示された部分のDNA断片をそれぞれ含むク
ローン）を調製し、これらのプローブを使用した、BamH
I、EcoR I及びHind IIIでそれぞれ消化処理したヒト胎
盤DNAのサザーンハイブリダイゼーションを行なった。

D_LRプローブは、BamH I消化物では18、7.2、6.5、2.2
及び1.9kbに相当する位置に５つのバンドを同定した
が、これは上述の参考文献３での報告とほぼ同じであっ
た。D_xpプローブは、BamH I消化物では20、7.2、6.5、
4.4及び3.7kbに相当する位置に５つのバンドを同定し
た。同様に、D_A、D_K及びD_Mプローブは上記３種の異なる
制限酵素の１種で５つのバンドを同定した。

このことは、これら５つのD_H遺伝子ファミリー
［D_LR、D_xp、D_A、D_K及びD_M）はすべて５つのメンバーよ
り構成されていることを示す。

なお、D_Nプローブでは、上記３種全ての制限酵素にお
ける消化物で３つのバンドしか同定されていないが、こ
れは9kbの繰り返しのヌクレオチド配列が繰り返し領域
間で良く似ているので、１つのバンドが２つ以上のD_H遺
伝子を含んでいたために生じた可能性がある。また、こ
れに加えて、大きなDNA断片もまた、２つ以上のD_H遺伝
子を含んでいる可能性もあるかもしれない。

これらプローブのそれぞれの大きさは、ほぼ500ヌク
レオチド長であるが、プローブでカバーされる領域中に
制限酵素切断部位があるため、あるプローブが１個のD_H
遺伝子に対し２個のバンドを同定する可能性もある。

すなわち、これらの要因によりサザーンハイブリダイ
ゼーションによるD_H遺伝子の数の見積りは妨害を受る可
能性がある。

しかしながら、それぞれのプローブはD_Nプローブを除
き３種の制限酵素に３〜５のバンドを同定したので、５
つの9kb間隔を置いた繰り返しがそれぞれ６種のD_H遺伝
子ファミリーを含んでおり、D_H遺伝子の総数がほぼ30で
あるということはほぼ間違いない。

一方、第４図に示すように、上記15kb DNA断片中の各
D_H遺伝子は７つのD_H遺伝子のファミリーに分類された。

各D_H遺伝子は図示するように12ヌクレオチドスペーサ
ーで分離されたシグナルヘプタマーとノナマー（下線
が引かれている）にその両側が取り囲まれている。

D_LR1〜D_LR4は前述のSiebenlistらの報告（参考文献
３）で公表されたものである。

ところが、本発明者らの分析では、D_LR1のほぼ中央部
は、AAではなくGGであった。これは本発明者らによる新
たな知見である。

また、D_LR5は参考文献９に、D_HQ52は参考文献10）に
報告されたものである。

第４図の比較結果からわかるように、同一D_H遺伝子フ
ァミリーに属するD_H遺伝子間でシグナルヘプタマーは良
く保存されている。ただし、D_M2の５′側でCACAGTGの代
りにCACAGCGが見つかり、D_A1の５′側でTGCTGTGが見つ
かった。

これに対し、シグナルノナマーは比較的に共通ノナマ
ー（GGTTTTTGTまたはACAAAAACC）から分岐していた。

この現象は、IgおよびＴ細胞レセプター（TRC）遺伝
子（参考文献11）の別のシグナル領域の中に一般的に見
られる。

なお、マウスの12個のD_H遺伝子は３つのファミリー
（D_SP2、D_FL16及びD_Q52）に分類された（参考文献
２）。

最大のファミリーのD_SP2はTACTATGGT配列を中心領域
に含んでいる。また、一番頻繁に使用されるD_H遺伝子の
Ｄ_FL16.1はTACTACGGT配列を含んでいる。D_SP2ファミリ
ーはTyr−Tyr−Gly、Thr−Met、Leu−Trpをコードし得
るものであり、またＤ_FL16.1はTyr−Tyr−Gly、Thr−Th
r、Leu−Argをコードし得るものである。

ところで、マウス体細胞D_H配列の大多数はTyr−Tyr−
Glyを含んでいる（参考文献12）。

このことは、マウスでは３通りのオープンリーディン
グフレームの中の１つが主に使用されていることを示唆
している。

これに反して、ヒトでは第５図に示すように、３通り
のオープンリーディングフレームがすべて等しく使われ
ている。

なお、第５図の15個の体細胞型D_H遺伝子の配列は参考
文献４に公表されたものである。また、第５図に要約さ
れているヌクレオチド配列の他にも、多数のヒト体細胞
型D_H領域のアミノ酸配列が報告されている（参考文献1
2）。

これらは第６図に示すように２つの組み合せ、すなわ
ち同一アミノ酸からなるPOMとLAY、及び同一アミノ酸配
列［RPPWRFT（Arg−Pro−Pro−Trp−Arg−Phe−Thr］を
含むMCEとNZUを除いては完全に分岐している。

その他のアミノ酸配列は、３アミノ酸以上の長さの配
列相同性を有していない。

次に、体細胞型D_Hのアミノ酸配列と、第４図のヌクレ
オチド配列から決めた胎児型D_Hのアミノ酸配列とが以下
のように比較された。

３通りのオープンリーディングフレームはすべて読み
出されことができると仮定して、４つのアミノ酸の内で
３つのアミノ酸が一致する例、あるいは４つのより多い
アミノ酸が一致する例が探された。

これらの判断基準を体細胞型D_Hの胎児型D_Hへの帰属に
採用した理由は、偶然の一致のために３つのアミノ酸が
一致することはほぼ起こり得ないといえるからである。
見かけ上のアミノ酸配列はこれらの間で非常に異なって
いるが、第６図に示すように19個の体細胞型D_H配列は胎
児型D_H遺伝子のどれか１つに帰属された。

なお第６図において、体細胞型D_H遺伝子配列は参考文
献12に報告されているものであり、胎児型D_H遺伝子配列
は第２図のヌクレオチド配列から決定されたものであ
る。なお、共通のアミノ酸部分には下線が引かれてい
る。第６図において各アルファベットは以下に示すアミ
ノ酸を表す。

MCEとNZUで見られた異なる体細胞型D_H配列中の同一配
列の存在は、これらがTdTによる無秩序なヌクレオチド
挿入の産物ではなくて、胎児型配列の中にコードされて
いることを示している。

RPPWRをコードしていると予測されるヌクレオチド配
列はGCに富んでいる。これらはDIR領域にコードされて
いるようである。

15個の公表された体細胞型D_H配列は、すべてDNA配列
レベルでは胎児型D_H遺伝子またはDIR遺伝子のどれかに
帰属されているので（第５図）、本発明の15kb DNA断片
に含まれる７種のD_H遺伝子ファミリーとは異なる多くの
他のD_H遺伝子が残っている可能性は少ないと考えられ
る。

第６図中でこれまでに決めた胎児型D_H遺伝子に帰属で
きない体細胞型D_H遺伝子は、６種のD_H遺伝子ファミリー
に属する別のD_H遺伝子に由来するのかもしれないし、ま
た配列の分岐は体細胞突然変異により更に拡大している
のかもしれない。

従って、ヒトIgH鎖のCDR III領域中の大きな多様性
は、限られた数の胎児型D_H遺伝子および体細胞突然変異
により作られたということはもっとなことである。

これらの結果は、IgH鎖の体細胞D_H配列が、マウスと
ヒトでは本質的に同じ機構で作られており、V_H−D_H−J_H
構造中の体細胞D_H領域の中心部が各々唯一のD_H遺伝子か
ら由来していることを示している。

一方、D_H遺伝子の進化については以下のような仮説が
立てられている。

SakanoらによりＶ及びＣドメインをコードするDNA断
片は、おそらく原始的遺伝子の多重化により生じたもの
であろうとの推論がなされ（参考文献14）、更に、Saka
no（参考文献13）らは先祖のＶコードDNA断片は連続し
ていたが、挿入断片（IS）様DNA要素がこの先祖Ｖ遺伝
子の中に挿入されＶとＪ遺伝子という２つの部分に分け
られたと提唱した。

そこで推定上のIS様DNA要素の両端には、12及び23ヌ
クレオチドスペーサーシグナルの存在を仮定し、また同
様のIS様断片がさらにもう一度Ｊ遺伝子の５′端の近く
に挿入され、ＤとＪ遺伝子に分けられたのではないかと
考えられる。

IgやTCR遺伝子部位におけるスペーサーの長さの規則
性はこの仮説により説明される。更にこのIS様DNA断片
はどちら向きにも挿入されたであろう。

実際、ツノザメのIgH鎖遺伝子部位で見られるD_H遺伝
子は５′側に12ヌクレオチドスペーサーシグナルを、ま
た３′側に23ヌクレオチドスペーサーシグナルを含んで
いる（参考文献15）。

このIS仮説が正しいならば、J_H遺伝子領域の近くに位
置するD_HQ52が最初に進化したD_H遺伝子であるはずであ
る。

そこで、他のD_H遺伝子はD_HQ52遺伝子から由来してい
るのだろうかという疑問が出てくる。しかしながら、シ
グナル領域における突然変異頻度の程度が介在領域にお
けるよりもわずかに低いにも拘らず、これら６つの異な
るD_H遺伝子が同一の原始D_H遺伝子より由来しているとい
うのはありそうもないことである。D_H遺伝子の本質的機
能は分岐性を創造することなので、通常の蛋白質をコー
ドする遺伝子のようにD_H遺伝子のヌクレオチド配列を保
持するような進化上の選択圧力が存在するのは理屈にあ
わない。機能を持たないD_H遺伝子の創造は生存能力には
なんの影響も及さないのかもしれない。

Akiraら（参考文献11）は、スペーサーの長さと同じ
ヘプタマーやノナマー配列が組み換えに本質的であり、
スペーサー領域におけるヌクレオチド配列は重要ではな
いということを示した。

しかしながら、Ichiharaらが指摘しているように（参
考文献４）、シグナルノナマーやヘプタマー配列ばかり
ではなくスペーサー領域もまた一般的に回分式（パリン
ドローム的）である。

この特徴は突然変異の結果ではありえず、D_H遺伝子の
起源の反映であると考え得る。

以上の推論や仮説に対して、本発明において得られた
新たな知見は、次のような新たな実証への手ががりを提
供する。

第７図は、本発明の15kb DNA断片中にある新規なＤIR
遺伝子ファミリーに属する不規則スペーサーシグナルを
含むD_H遺伝子の概要である。

第７図（ａ）に示されるように、D_M遺伝子の上流にCA
CAGTG配列が在している。このヘプタマーはシグナルノ
ナマー様配列により両側を取り囲まれている。ＴとＡ
は、それぞれGGTTTTTGT−及びACAAAAACC−様配列を示し
ている。上側の配列（ＤIR_１−D_M1）は第１図の最初の9
kb領域の中に、また下側の配列（ＤIR_２−D_M2）は第
１図のに続く9kb領域の前半領域中に存在する。

これらのＤIR遺伝子間で相違しているヌクレオチドに
は点が付されている。胎児型D_H配列のどれにも帰属でき
なかった２つの体細胞型D_H配列（HIG1と333）は、これ
ら領域と配列相同性を有している。このHIG1の体細胞型
D_H配列は相補性配列を有しており、また333の体細胞型D
_H配列はＤIR遺伝子領域と同じ方向で相同性を示してい
る。コロン（：）は体細胞型D_H遺伝子と胎児型ＤIR遺伝
子の間で一致している、あるいは相補性のあるヌクレオ
チドを示している。

この体細胞D_H配列データは、HIG1については参考文献
16から、333については参考文献17より引用した。

更に第７図（ｂ）に示すようにＤIR領域は、両側を12
及び32ヌクレオチドスペーサーで隔てられたシグナルヘ
プタマー及びノナマーにより挟まれている。白抜き四角
はGGTTTTTGT−およびACAAAAACC−様配列を示す。黒塗り
四角はシグナルヘプタマー配列を示す。推定上のD_H遺伝
子はシグナルヘプタマー（黒塗り三角）及びノナマー
（白抜き三角）ではさまれた白抜き枠で示した。ヘプタ
マーとノナマーの間の数字はスペーサーの長さを示す。

このＤIR遺伝子ファミリーが新たに同定されたこと
で、以下のような事項が示唆され得る。

参考文献４には、ＧとＣ残基に富むHIG1および333細
胞の体細胞D_H配列に対応するもう一つの胎児型D_H遺伝子
が予言されている。

しかし、すでに同定されていた17個の胎児型D_H遺伝子
は、これと配列相同性を示さず、更にマウスにおいてさ
え、ＧとＣ残基に富む体細胞型D_H配列のいくつかは12個
の胎児型D_H断片のどれとも相同性を示さない（参考文献
２）。

AltとBaltimore（参考文献18）は、Ｎ領域の分岐に末
端転移酵素の関与を提案した際に、Ｎ領域にはGCに富む
配列が高頻度で現れることと末端転移酵素がdG残基を選
択しやすいことを強調した。

このような胎児型D_H遺伝子のどれにも帰属されなかっ
たGCに富む体細胞型D_H配列において、胎児型D_H遺伝子に
よりコードされている領域はおそらくエクソヌクレアー
ゼ活性により除かれているのであろうと考えられる。

これに対し、本発明者らは第７図（ａ）に示すよう
に、D_M遺伝子の上流に、配列がHIG1D_H配列に相補的（18
/21ヌクレオチド）で、かつ333細胞のD_H配列と相同的な
（16/23ヌクレオチド）DNA領域を発見した。このDNA領
域を取り囲む領域は上述のようにいくつかのシグナルヘ
プタマーとノナマーを含んでいる。第７図（ｂ）にはそ
の位置とスペーサー長が図解的に示されている。

このＤIR遺伝子ファミリーにおける５′端のヘプタマ
ーとD_M遺伝子のヘプタマーとの間の距離はかなり長い
（127または151）にも拘らず、これら領域は両端を12及
び23ヌクレオチドスペサーシグナルの両者により取り囲
まれているこことがわかる。

このＤIR領域は欠失または逆位によりＤIR−D_H結合に
関与している可能性がある。

興味あることに、相同な配列をならべてみると、HIG1
のD_HとＤIRの極性は逆で333とＤIRの極性は同じであ
る。推定上のＤIR−D_H結合は５′側に12及び23ヌクレオ
チドスペーサーシグナルを、また３′側に12ヌクレオチ
ドスペーサーシグナルを持つはずなので、V_H−ＤIR−D_H
−J_H、V_H−D_H−ＤIR−J_H及びV_H−D_H−ＤIR−D_H−J_Hの構
造のどれかを形成するための基質であるかもしれない。

次に本発明者らによって得られた知見を基にD_H遺伝子
および介在領域での突然変異の頻度を計算するために、
第１図のとの部分が比較検討された。

D_H遺伝子が機能を有する断片であるためには、両側の
21ヌクレオチドスペーサーシグナルの存在が本質的であ
ると思われる。

表１に第１図のとの部分における突然変異の頻度
を要約した。

なお、この比較から４つの長い挿入または欠失領域
（第１図及び第２図に示したＩ〜IVで示された部分）は
のぞかれている。

表１のグループＩは16bp繰り返し領域とD_XP遺伝子の
間の領域に、グループIIはD_XP遺伝子とD_A遺伝子の間の
領域にそれぞれ対応する。

また、1574から1829までの挿入領域、12686から13184
まで、13232から13247まで、及び3536から4394までの部
分は表１の比較から除かれている。

更に、グループIIIはD_A遺伝子とD_K遺伝子の間の領域
に、グループIVはD_K遺伝子とD_N遺伝子の間の領域にそれ
ぞれ対応している。

一方、グループＶはD_N遺伝子とD_M遺伝子の間の領域
に、グループVIはD_M遺伝子の下流にそれぞれ対応してい
る。

不一致の（１）と（２）は（塩基）転移（Ｇ⇔Ａおよ
びＴ⇔Ｃ）と（塩基）転移（プリン⇔ピリミジン）をそ
れぞれ示す。なお、数字は塩基対数を示している。

表１に示すように、転移：塩基転換の頻度比率は、約
3:2であった。

また、短いヌクレオチドの欠失（または挿入）の総数
は1bpのものが45回、2bpのものが８回、3bpのものが３
回であった。

介在領域での２つの重複単位間の配列の違いの全体
は、約12％である。

シグナル領域においては、２つの同一遺伝子間でのヌ
クレオチドの違いがノナマーでは7bp（８％）、ヘプタ
マーでは4bp（６％）、スペーサー領域では10bp（８
％）見られた。

シグナル領域及び介在領域における突然変異の大多数
はDNA複製の間違いに起因するものと考えられる。

要約すると、１個のヌクレオチドの不一致は236回、
連続する２個のヌクレオチドの不一致は52回、連続する
３個のヌクレオチドの不一致は７回、連続する４個のヌ
クレオチドの不一致は１回、連続する８個のヌクレオチ
ドの不一致は１回であった。

１〜３個のヌクレオチドの欠失または挿入の大多数は
GCCCからGCCまたはGCCCCへのようなDNAポリメラーゼの
すべり（slippage）反応（参考文献21）により起こって
いる。

D_Hコード領域に見られる突然変異のいくつかは上記と
同様である。

D_A4コード領域とD_A1コード領域の間には差異はなく、
D_M1コード領域とD_M2コード領域では２個所に１個のヌク
レオチドの不一致が見られた。

D_N1コード領域とD_N4コード領域の間での連続する３個
のヌクレオチドの欠失（または挿入）はDNAポリメラー
ゼのすべり反応に起因するかもしれない。というのは、
AGC配列の３回繰り返しの中の１個のAGCが欠失していた
からである。

例えば、D_XP1とＤ_XP′１との間、D_K4とD_K1との間、D
_LRファミリー等の、その他のD_Hコード領域で見られる差
異は、異なる特徴を持っている。

突然変異したヌクレオチドは限られた領域に密集して
おり、分岐したヌクレオチドは他のD_Hコード領域と相同
性を示している。

参考文献４では、D_H遺伝子のコード配列が短いオリゴ
ヌクレオチドから組み立てられているように見え、D_XP1
中のGATATTやＤ_XP′１の中のGGGGAのような分岐した配
列がそれぞれD_LR1やD_HQ52の中にも見い出されることが
指摘された。

そこで、遺伝子変換（参考文献19）は、D_Hコード領域
における分岐性を高めている主経路の１つであるかもし
れないといえる。

更に、上述の本発明における新たな知見を用いてマウ
スとヒトのD_H配列が比較された。

その結果、第８図（ａ）に示すように。１つのヒトD_H
遺伝子のD_Hコードおよびシグナル配列はマウスのD_SP2の
ものと81％（59/73）の相同性を有しており、その上にD
_K4の場合にはD_H遺伝子領域だけでなく５′側及び３′側
隣接配列もD_SP2のものと57％（135/236）の相同性を有
していることが判明した［第８図（ｂ）］。

このことは、一度D_Hが進化した後は、D_H遺伝子部位に
は広範囲な突然変異が起こらなかったことを示唆する。

６つの異なるD_H遺伝子間では、この隣接配列は大いに
分岐しているようにみえるが、ある組み合せでは５′隣
接配列の100ヌクレオチド以上にわたり56〜61％の類似
性が見つかった。

同程度（52〜61％）の相補性が５′と３′隣接配列の
間に見い出された［第９図（ａ）］。

興味深いことには、相補性を示す隣接領域の配列の組
み合せは第９図（ｂ）に示すように異なる遺伝子ファミ
リーに属している。

以上の事項を要約すると、 a.重複化してできてきた２つの単位間での介在配列の相
違は約12％であるが、シグナル領域では６〜８％の相違
があり、 b.5′隣接領域配列の間におけるある組み合せでは約60
％の類似性が見い出されており、 c.5′と３′隣接領域配列の間にもまた約60％の相補性
が見い出されており、 d.更に、D_Hコード領域の大多数には、CAC（A/T）GTG−
様の配列が見い出された（第４図）。

これらの結果に基き、本発明者らはD_H遺伝子の起源に
つき以下の仮説を提唱することができる。

第10図に示す構造の原始的半Ｄ遺伝子（prih−Ｄ）の
クラスターが存在していた。

prih−Ｄ遺伝子とそれを取り除く領域のヌクレオチド
配列は初めから既に分岐していた。

Ｖ−（Ｄ）−Ｊ結合のリコンビナーゼは２つのprih−
Ｄ遺伝子を認識した。

これらDNA断片の極性は同じなので、欠失の代りに逆
位が起こった。

Ｎ断片は２つのシグナルヘプタマーの間に入れられた
のであろう。

この結果得られた断片は、D_Hコード領域が二組の12ヌ
クレオチドスペーサーシグナルにより取り囲まれている
ので、D_H遺伝子としての機能を有している。

この仮定がこの限定された領域で数回生じた。

このprih−Ｄ遺伝子の起源として推定される遺伝子
は、シグナルを含み、多遺伝子ファミリーからなってお
り、既に分岐しており、クラスターを形成しているはず
である。

このprih−Ｄ遺伝子はＶ遺伝子の３′端であるだろ
う。というのは、D_H遺伝子の隣接領域列とD_H遺伝子の
３′隣接領域配列の間に配列類似性が本発明者らによっ
て見い出されたからである（第11図）。

相同性または相補性の程度（57〜63％）は、D_H遺伝子
の隣接領域同士の間で見られるのと非常に似ている。

V_H遺伝子がprih−Ｄ遺伝子になるためには、23ヌクレ
オチドスペーサー領域中にCAC（A/T）GTG配列が創造さ
れたはずである。

このことは起こり得たと考えられる。すなわち、現在
のD_H遺伝子の３′側にスペーサーの中にもCAC（A/T）GT
G様の配列が見つかるからである（参考文献20）。

このモデルの有利な点は、逆位で得られたものが機能
を持った分岐D_H遺伝子であること、及び多種多様なD_H遺
伝子を得るためにはこの他に更に突然変異が起こったこ
とを仮定する必要がないことである。

上記した種々の知見から、ヒト免疫グロブリン重鎖お
よびTCRβ鎖、δ鎖遺伝子におけるVDJ結合の近傍領域の
塩基配列、すなわちＶ（−Ｎ−Ｄ−Ｎ）Ｊは、事実上、
無限大の多様性を示すことが明らかとなった。

なお、Ｎは胎児型のＶ、ＤあるいはＪ遺伝子にコード
されていないヌクレオチド断片の略号で、Ｖ−Ｄ−Ｊの
再配列の過程で、DNA配列内にターミナルトランスフェ
ラーゼの作用により入るヌクレオチド断片である。

例えば、後記の患者骨髄由来のI_gD−分泌ミエローマ
細胞のDNAをBamH Iで水解し、J_Hプローブで検出、分離
した20kbのDNAをフアージにパッケージしたDNAクローン
λIGD−１（参考文献26に記載）のV_DD_HJ_H再配列結合部
位を第12図に示す。

D_H部分にはD_k1およびＤ_xp′１のみ含まれることが明
らかとなった（第13図）。

すなわち、他の例を含めて各体細胞型D_Hには、本発明
でクローン化された15kbのDNA断片等の中の多数の胎児
型D_H遺伝子のうちごく一部のものが、V_DD_HJ_H再配列の際
に無作為に使用されており、体細胞型D_Hの塩基配列は無
限大の多様性を示し得る。

この無限大の多様性のあるDNA断片に対応する抗体の
ペプチド部位がCDR III領域である。

他方、リンパ球系腫瘍細胞は各個人、それぞれモノク
ローナルであることが知られており、腫瘍ごとにD_H及び
D_H近傍領域（N_H）で固有のDNA断片を有すると考えられ
る。

このことから、リンパ系腫瘍に羅患した各患者のD_H及
びD_H近傍領域（N_H）の、その患者に固有のDNA断片の塩
基配列を腫瘍マーカーとして決定しておけば、その配列
を有するDNAプローブなどを用いて、患者の全リンパ球
（DNA量）における腫瘍細胞（DNA量）の割合を算出する
ことができる。

すなわち、Ｂリンパ球系腫瘍あるいはＴリンパ球系腫
瘍、白血病、骨髄腫等において、種々の抗がん剤やステ
ロイド剤による骨髄形成の抑制のための化学療法が行な
われている。しかしながら、腫瘍細胞を完全に消滅させ
ることは、副作用などを警戒して、化学療法剤を充分
に、徹底的に投与することができないため、不可能に近
い現状である。

従って、白血病の活動を一時的に抑え込むことができ
た、いわゆるリンパ種、白血病の緩解期においても、再
生した正常骨髄細胞中に混入している腫瘍細胞の動態を
定期的に検査・診断し、白血病等の再発を、早期に診
断、予防、治療することが望まれ、行なわれているが、
診断法は、細胞診、骨髄穿刺による骨髄検査などの形態
学的分析にたよらざるをえない状況にある。

骨髄検査においては、白血病性幼若細胞が５〜15％を
超えた時はじめて、再発の診断が可能であり、早期の的
確な診断は困難であり、またリンパ球に特異的なモノク
ロナール抗体を用いた細胞蛍光分析法による診断も近年
行なわれているが、検出限界はそう改善されてはいな
い。

そこで本発明者らは、前記の知見に基き、リンパ球系
細胞が生産する免疫グロブリン、TCRに対応する再配列
遺伝子中のV_H（N_H ¹−D_H−N_H ²）J_HのDNA断片、特にD_H領
域及びD_H領域近傍領域（N_H ¹、N_H ²）のCDR IIIに対応す
る塩基配列が無限の多様性を示すことを利用して、腫瘍
細胞に固有のDNA断片の配列を同定した上で、正常リン
パ球系細胞のDNA量に対する割合を算出するというDNA診
断法を完成するに至った。

このDNA診断法は以下の過程を含む。

まず、個々の患者のリンパ球系細胞固有のDNA配列を
決定し、リンパ系腫瘍細胞の量を定量するに当って、ほ
とんど全ての細胞のV_HおよびJ_H遺伝子に保存され、共通
にみられるDNA断片、すなわちV_H中のオリゴヌクレオチ
ドを第１のプライマーとし、またJ_H中のオリゴヌクレオ
チドと相補的なオリゴヌクレオチドを第２のプライマー
として合成し、これらを患者リンパ系腫瘍細胞から分取
したDNAと混合し、PCR法［Saiki等のpolymerase chain
reaction法；参考文献24］等によってDNAポリメラーゼ
の存在下で多量のDNAを増幅生産させ、個々の患者のリ
ンパ球系細胞固有のD_H領域近傍の遺伝子（N_H ¹、N_H ²）の
塩基配列を決定し、上記V_H中から選択したDNA断片V_H ^(a)
と、決定したN_H ¹中から選択したDNA断片N_H ^1(a)からなる
V_H ^(a)−N_H ^1(a)DNA断片を、また場合によってはD_Hにまで
入り込んだDNA断片を、患者固有の第３のプライマーと
して合成する。また、上記J_H中から選択したDNA断片と
相補的なDNA断片J_H ^(a)と、決定したN_H ²から選択したDNA
断片と相補的なDNA断片N_H ^2(a)とからなるN_H ^2(a)−J_H ^(a)
DNA断片を、また場合によってはJ_H領域の他の部位のDNA
断片と相補的なDNA断片を、患者固有の第４のプライマ
ーとして合成する。

次に、更に患者の治療過程において経時的に患者リン
パ球DNAと第３のプライマーと第２のプライマー（また
は第４のプライマー）の組と、あるいは第１のプライマ
ーと第４のプライマーの組と混合してPCR法等によってD
NAポリメラーゼの存在下で多量のDNAを増幅生産させ、
その生産されたDNA量からリンパ系腫瘍細胞の割合を測
定する。

この方法を用いることにより、白血病等の患者の制癌
剤等による治療効果、奏功度の診断、および再発の診断
を早期に、迅速に行なうことができる。

この診断法は、Ｂリンパ種、Ｔリンパ種、急性白血
病、骨髄腫等の診断に特に好適に利用できる。

IgD−分泌ミエローマ患者における本発明の診断法の
一例を以下に説明する。

まず、患者固有のＶ（N¹−Ｄ−N²）Ｊの再配列結合部
位のDNA断片の塩基配列を決定する。

IgD−分泌ミエローマ患者の骨髄細胞あるいは末梢血
リンパ細胞より常法（参考文献22）に従いDNAを分取
し、そしてV_H中に高い頻度で保存されたDNA断片オリゴ
ヌクレオチドを第１のプライマーとし、またJ_H中に高い
頻度で保存されたDNA断片オリゴヌクレオチドに相補的
な配列を有するDNA断片オリゴヌクレオチドを第２のプ
ライマーとして選択し、選択した配列を、例えば固相ト
リエステル法（参考文献23）によって、Applied Biosys
tems Model 380A DNA合成器を用いて合成する。

次に、合成されたオリゴヌクレオチドをHPLCで精製し
た。

第１及び第２のプライマーとしては、以下のものが用
い得る。

第１のプライマー第２のプライマー次に、検査診断対象としてのIgD−分泌ミエローマ患
者より常法（参考文献22）により分取したリンパ球系細
胞DNAと、第１および第２のプライマーを用い、PCR法を
利用して、これらプライマー間に形成されるDNA配列
［Ｖ（N¹−Ｄ−N²）Ｊをコードする配列:V_H（N_H ¹−D_H−
N_H ²）J_H］を多量に増幅生産させる。

増幅されたDNA配列は、そのヌクレオチド配列をサン
ガーらのジデオキシ法（参考文献25）によって決定して
から、その患者固有の腫瘍マーカーとして登録してお
く。

次に、この患者のリンパ球系細胞固有のD_H領域近傍の
遺伝子（N¹ _H、N² _H）の塩基配列を選択し、上記V_H中の任
意のDNA断片V_H ^(a)と、決定したN_H ¹の中の任意のDNA断片
N_H ^1(a)からなるV_H ^(a)−N_H ^1(a)DNA断片を、また場合によ
ってはD_Hにまで入り込んだDNA断片を、患者固有の第３
のプライマーとして合成する。

また、上記J_H中の任意のDNA断片と相補的なDNA断片J_H
^(a)と、決定したN_H ²の中の任意のDNA断片と相補的なDNA
断片N_H ^2(a)とからなるN_H ^2(a)−J_H ^(a)DNA断片を、また場
合によってはJ_H領域の他の部位のDNA断片と相補的なDNA
断片を、患者固有の第４のプライマーとして合成する。

この第３及び第４のプライマーとしては例えば以下の
ものが利用できる。

第３のプライマー第４のプライマー次に、第３及び第４のプライマーと、検査診断対象と
してのIgD−分泌ミエローマ患者より、たとえば治療経
過を追って経時的に常法（参考文献22）により分取した
リンパ球系細胞DNAとをPCR法によって処理し、これらプ
ライマーの作用によって増幅したDNA配列があるかどう
か、また増幅したDNAの量から腫瘍細胞の割合を測定す
る。

なお、この増幅操作には、第１のプライマーと第４の
プライマーとを組合せて、第３のプライマーと第２のプ
ライマーとを組合せて用いることもできる。

また、増幅したDNA配列の検出は、電気泳動法によっ
て反応混合物を展開し、発色反応等によって可視化した
バンドと、先に患者固有の腫瘍マーカーとして登録した
DNA配列の同様の操作上の結果とを比較して、同一の位
置にバンドが表れるかどうかによって行なうことができ
る。

また、プライマーとして用いたDNA断片をプローブ類
として用いサザーンハイブリダイゼーションを行ない、
バンドを分析することもできる。

なお、第３及び第４のプライマーは、DNA配列を患者
固有の腫瘍マーカーとして登録したDNA配列から任意に
選択し、選択された配列ごとに上述と同様の操作を繰り
返して、その有効性を確認することで決定でき、上記の
配列に限定されない。

［実施例］実施例１ Ichihara,Y.,Kurosawa,Y.et al;Eur.J.Immunol.,18,6
49−652（1988）に記載の方法に従って、T.Maniatis
（ハーバード大学）から供給されたヒトDNAファージラ
イブラリー（参考文献５）からヒト胎児型DNAのクロー
ンHUD−３を単離した。

すなわち、上記マニアチスのヒトDNAファージライブ
ラリーから、Ravetchらが取り出したD_H−J_Hプローブ
（参考文献10）を用いて、Benton−Davis法（参考文献
６）によって、該D_H−J_Hプローブにハイブリダイズする
15kb DNA断片を含むクローンHUD−３を単離した。

次に得られたクローンHUD−３中の15kb断片の常法に
従って制限酵素地図を作製し、またそのヌクレオチド配
列を、Messingら［Messing,J.et al;Nucleic Acids Re
s.,９,309−321（1981）］の方法に従ったM13mp10また
はM13mp11をクローニングベクターとして用いたジデオ
キシ法［Sanger,F.et al;Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,
74,5463−5467（1977）］により決定し、第１図に示す
制限酵素地図及び第２図に示すヌクレオチド配列が得ら
れた。

第１図及び第２図に示した結果から、該クローンHUD
−３の15kb断片は、参考文献３中におけるD₁に対応する
D_LR1を断片が含むことが確認され、該15kb断片は胎児型
D_H遺伝子領域を含むものであることが判明した。

実施例２実施例１で得たクローンHUD−３中の15kb断片から以
下に示す制限酵素切断部位を利用して各DNA断片を調製
し、それらをそれぞれ個々に、BLUESCRIPT KS plus ベ
クター（Stratagene,San Diego,CA,USA）中に常法に従
って、クローン化し、第１図ので示される部位を有す
る組み換えDNA、すなわち、プラスミドpPDXP（D_XP1遺伝
子を含む）、プラスミドpDA（D_A4遺伝子を含む）、プラ
スミドpDK（D_K1遺伝子を含む）、プラスミドpDN（D_N4遺
伝子を含む）、プラスミドpDM（D_M2遺伝子を含む）、プ
ラスミドpDLR（D_LR1遺伝子を含む）を得た。

D_XP1遺伝子を含む断片（Ｄ_XP′１遺伝子を含む）； BamH I−Bal I^＊（10232）−Pst I（10749） D_A4遺伝子を含む断片； BamH I−EcoR V^＊（1561）−Acc I（2287）−Xho I D_K1遺伝子を含む断片； Sac I（12241）−Sma I（12875） D_N4遺伝子を含む断片； BamH I（4260）−Nco I^＊（4901）−Sal I D_M2遺伝子を含む断片（ＤIR_２を含む）； Xba I−Stu I^＊（14339）−Eco I（14923） D_LR1遺伝子を含む断片； Xba I−Nco I（7577）−Hind III（8174）なお、上記の「^＊」は構築過程で破壊された部位を示
し、また括弧内の数字は第２図における塩基番号に相当
する。

なお、各D_H遺伝子を含むプラスミドの単離には、ベク
ターの有するポリリンカー部位が利用された。

得られた各組み換えDNAはそれぞれ個々に大腸菌MV118
4に常法によって導入された。

実施例３実施例２で得た15kbから得られた各断片をそれぞれ個
々にプローブとして用いて、ヒト胎盤DNAのサザンハイ
ブリダィゼーションを行なった。

Gross−Bellardらの方法［Gross−Bellard,M.et al.;
Eur.J.Biochem.,36,32−38（1973）］に従ってヒト胎盤
DNAを抽出した。

抽出したヒト胎盤DNAは、制限酵素BamH I、EcoR I及
びHind IIIでそれぞれ個々に消化処理された。

得られた３種のDNA混合物（各々５μ）は、それぞれ
0.8％アガロースゲルを用いた電気泳動処理された。

各ゲルは、まず0.25M HClで15分間、次に0.5M NaO
H、1.5M NaClで30分間、更に1.0M Tris−HCl（pH7.5）
緩衝液（1.5M NaClを含む）で30分間処理された。

この処理によって得られたDNAは、Olszewskaら［Olsz
ewska,S.et al,;Trends in Genetics,４,92−94（198
8）］によるサザーンの方法［Southern,E.M.;J.Mol.Bio
l.,98,503−517（1975）］の変法に従って、LKB 2016 V
acuGene vaccum blotting system（ファルマシア社製）
を用いて、20×SSCを利用してナイロン膜（Hybond N,ア
マーシャム）に移された。

膜に移されたDNAは５分間の紫外線照射処理及び80
℃、２時間の処理で固定された。

上記の操作で調製された各膜は、煮沸洗浄溶液（0.1
×SSC、0.1％ SDS）中に15分間浸漬された後、プレハイ
ブリダイゼーション｛５×SSPE（20×SSPE:0.2M NaH₂PO
₄緩衝液（pH7.4、3.6M NaCl、20mM EDTAを含む）、0.1m
g/ml熱変性サケ***DNA、50％ホルムアミド［メルク社
（ダルムシュタット、***）製］、５％Irishcream liq
uer［Baileys社（ダブリン、アイルランド）製］および
0.1％SDSに42℃で一晩処理｝を行なった。

この、プレハイブリダイゼーション処理が終了した
後、実施例２で得た各DNA断片をランダムオリゴヌクレ
オチドラベリング法［Feinberg,A.P.et al.:Anal.Bioch
em.,132,6−13（1983）］によって³²Pで標識する過程を
含む方法により、熱変性³²P標識化DNAとし、それらを個
々にプローブとして加えることを除いては、上記プレハ
イブリダイゼーションと同様の処理条件のハイブリダイ
ゼーションを行なった。

４×SSCで42℃、30分の洗浄および２回の0.5×SSCの
洗浄処理を行ない、−80℃の条件でのオートラジオグラ
フを行なった。

結果を第３図に示す。

実施例４［第１及び第２のプライマー用の配列の選択］実施例１及び２で得られた各DNA断片及びこれらDNA断
片のクローニングに用いた各種プローブを用い、IgD−
分泌ミエローマ患者から常法（参考文献22）に従い骨髄
細胞あるいは末梢血リンパ細胞より分取したDNAを、実
施例３と同様の手法を用いたサザーンハイブリダイゼー
ションにかけ、その結果からV_H（N_H ¹−D_H−N_H ²）J_Hの再
配列結合を有するDNA断片を特定してそれを実施例１で
用いたBenton−Davis法によりクローニングし、それら
のヌクレオチド配列をSangerらのジデオキシ法（参考文
献25）によって分析した。

次に、上述のようにして得られたＶ（N¹−Ｄ−N²）Ｊ
の再配列結合部の配列をコードする領域［V_H（N_H ¹−D_H
−N_H ²）J_H］におけるV_H遺伝子領域及びJ_H遺伝子領域の
それぞれにおいて高い頻度で保存されたDNA配列を特定
した。

その結果、V_H遺伝子領域中に高い頻度で保存されたDN
A配列として以下の配列（なお括弧内はどれを選択して
も良く、括弧内部分の異なるものを混合して用いても良
い）を見い出し、第１のプライマー用配列とした。

また、J_H遺伝子領域に高い頻度で保存されたDNA配列
と相補的な配列として、以下の配列を見い出し、第２の
プライマー用配列とした。

なお、参考に、第２のプライマー用配列の選択に利用
した上記の分析の結果得られたJ_H遺伝子領域における配
列の一部を第14図に示す。

実施例５実施例４で選択した第１のプライマー用配列のうちの
１つを選択し、その配列を有するオリゴヌクレオチドを
固相トリエステル法（参考文献23）によって、Applied
Biosystems Model 380 A DNA合成器によって合成し、HP
LC（高速液体クロマトグラフィー）によって精製した。

これとは別に、実施例４で選択した第２のプライマー
用配列を有するオリゴヌクレオチドを固相トリエステル
法（参考文献23）によって、Applied Bio−systems Mod
el 380 A DNA合成器によって合成し、HPLC（高速液体ク
ロマトグラフィー）によって精製した。

次に、実施例４と同様の方法で、診断対象としてのIg
D−分泌ミエローマ患者（女性、45才）の骨髄細胞ある
いは末梢血リンパ細胞から分取した腫瘍細胞DNAと上記
の２種の精製オリゴヌクレオチドとを、SaikiらのPCR法
（参考文献24）によって反応させた。

反応液の組成は以下のとおりであり、反応条件はSaik
iらに従い、アニーリング温度は55℃とした。また、DNA
増幅のための反応は25回繰り返えされた。

反応液組成；細胞DNA（100μg/ml） 10μｌ第１のプライマー（20μg/ml）３μｌ第２のプライマー（20μg/ml）１μｌ dNTP（150μＭ） 16μｌ Taqポリメラーゼ（10u/μｌ）１μｌ 10×PCR用緩衝液 10μｌ蒸留水 59μｌ合計100μｌ〔PCR用緩衝液：トリス塩酸（pH8.0）、NaCl 50mM、MgC
l₂ 10mM、メルカプトエタノール10mM〕増幅反応終了後、反応混合液をアガロースゲルを用い
た電気泳動法によって展開した後、エチジウムブロマイ
ドでDNA断片を染色した。

その結果、282bpに相当する位置にバンドが検出され
た。

なお、実施例４で選択した第１のプライマー用配列の
うちあるいはを用いた場合に、282bpの位置に単一
のバンドが検出され、配列あるいはが、このIgD−
分泌患者の場合には、あるいはより優れていた。

次に、この282bpのDNA断片を必要に応じて適当な制限
酵素で処理し、実施例１で用いたデジオキシ法によっ
て、そのヌクレオチド配列を求めた。

得られたヌクレオチド配列を解析したところ、第12図
と同様の配列が含まれていることが確認された。

このヌクレオチド配列を前記診断対象患者に固有のDN
A断片マーカーとして登録した。

実施例６［第３及び第４のプライマーの調製］第12図に示された配列のV_H（N_H ¹−D_H領域から、以下
の配列を選択し、該配列を有するオリグヌクレオチドを
第３のプライマー用配列として実施例４と同様の方法に
より合成し、精製した。

更に、第12図に示された配列のD_H−N_H ²）J_H領域より
下流の、第２のプライマー用配列と相補的な配列より更
に下流の配列を選択し、該配列と相補的な以下の配列を
有するオリグヌクレオチドを第４のプライマーとして実
施例４と同様の方法により合成し、精製した。

実施例７［本発明の診断法の感度の検定］実施例５で診断対象患者から分取した腫瘍細胞DNAの
細胞１個当りの量を測定した。

次に、正常胎盤細胞及び正常リンパ球細胞から実施例
４で用いた方法によって分取したDNAから、10²個、10⁴
個、10⁶個の細胞分に相当するDNA量をそれぞれ調製し
た。

次に、腫瘍細胞DNAと、正常胎盤細胞DNAまたは正常リ
ンパ球細胞DNAとを混合し、細胞の個数［腫瘍細胞DNA
（Ｘ）：正常胎盤細胞DNAまたは正常リンパ球細胞DNA
（Ｙ）］で以下の比率となる試料Ａ〜Ｉをそれぞれ調製
した。なお各試料の（合計）DNA量は、PCRを実施する前
で一定とした。

試料Ａ腫瘍細胞DNAのみ試料Ｂ正常胎盤細胞DNAのみ試料Ｃ正常胎盤細胞DNA使用、 X:Y＝10^-2:1（Ｘ＝2ng）試料Ｄ正常胎盤細胞DNA使用、 X:Y＝10^-4:1（Ｘ＝20pg）試料Ｅ正常胎盤細胞DNA使用、 X:Y＝10^-6:1（Ｘ＝0.2pg）試料Ｆ正常リンパ球細胞DNAのみ試料Ｇ正常リンパ球細胞DNA使用、 X:Y＝10^-2:1（Ｘ＝2ng）試料Ｈ正常胎盤細胞DNA使用、 X:Y＝10^-4:1（Ｘ＝20pg）試料Ｉ正常胎盤細胞DNA使用、 X:Y＝10^-6:1（Ｘ＝0.2pg）次に、各試料を個々に用い、実施例５で調製した第３
及び第４のプライマーとのPCR法によるDNAの増幅生産を
行なった。

PCR用の反応液組成は以下のとおりである。なお、試
料の容量は、試料Ａ〜Ｅで11.5μｌ、Ｆ〜Ｉで16.2μｌ
とした。また、各成分の濃度は実施例５と同様とした。

PCR用の反応液組成試料 11.5μｌまたは16.2μｌ第１のプライマー 3 μｌ第２のプライマー 3.5μｌ dNTP 16 μｌ Taqポリメラーゼ 0.5μｌ 10×PCR用緩衝液 10 μｌ蒸留水 55.5μｌまたは50.8μｌ合計100μｌ反応条件はSaikiらに従い、アニーリング温度は65℃
とした。また、DNA増幅のための反応は50回繰り返えさ
れた。

増幅反応終了後、反応混合液をアガロースゲルを用い
た電気泳動法によって展開した後、エチジウムブロマイ
ドでDNA断片を染色した。

試料A,C〜Ｅ、Ｇ〜Ｈにおいていずれも131bpに相当す
る位置に単一バンドが検出された。

また、試料Ｂ、Ｆではバンドは検出されなかった。

次に、131bpのDNA断片を常法により単離し、必要に応
じて制限酵素によって処理して、実施例１で用いたジデ
オキシ法によって、そのヌクレオチド配列を求めた。

得られたヌクレオチド配列を解析したところ、この13
1bpのDNA断片は第12図に示す配列中に含まれるものであ
ることが確認された。

以上の結果から、1/10⁶の腫瘍細胞濃度まで検出でき
ることが確認できた。

実施例８実施例５と同一の診断対象患者の治療過程において、
経時的にリンパ系細胞を分取し、得られた細胞からDNA
を分離して、実施例７の方法でリンパ系細胞中に含まれ
る腫瘍細胞の割合を検定した。

その結果、治療後、時間経過すると、増加する腫瘍細
胞も、抗癌剤の投与により、再び減少過程に入ることが
確認された。

［発明の効果］従来の抗体生産の研究、実用においては、ある特定の
抗原に対応した抗体を、動物においてポリクローナル抗
体、マウス、ヒト等の抗体産生ハイブリドーマにおいて
モノクローナル抗体として生産することが行なわれてき
た。

本発明により得られたD_H遺伝子等30種を利用し、また
３通りのオープンリーディングフレームを使用して、D_H
領域だけでも少なくとも90種類の抗体を生産できる可能
性がある。V_H領域、J_H領域と組み合せれば、膨大な種類
の抗体が生産できるのであるが、本発明により得られた
知見をもとにして、細胞工学的、遺伝子工学的手法によ
り予め様々な抗体を人工的に作製しておき、しかる後
に、これまで未検討の抗原あるいは新たに出現してきた
抗原に対応する所望の抗体をそれらの中から探索、スク
リーニングするという方法が考案される。この方法が一
般化すれば、緊急を要し、量的に必要とされる特定の抗
体を、所望通り、医療用、あるいは研究用に提供するこ
とが可能となる。

また、本発明において、種々のD_H遺伝子を含むV_HD_HJ_H
再配列結合部分のDNA配列がほぼ無限大の多様性を持つ
という知見が明らかとされ、現実の患者の腫瘍細胞のD_H
領域に、本発明により同定とされた、D_H遺伝子も含まれ
ていることも示された。更に、これらの知見に基づい
て、一人の腫瘍患者の腫瘍細胞はモノクローナルである
ことに基づいて、Ｖ（Ｎ−Ｄ−Ｎ）Ｊ領域は個々の患者
の腫瘍細胞に固有のDNA配列からなりたっており、それ
をメルクマールとして患者固有のDNA断片マーカーを、P
CR法による増幅を行なうためにプライマーとして合成
し、患者の腫瘍細胞に固有のDNA配列を増幅生産し、腫
瘍細胞の他のリンパ系細胞に対する割合を算出できるこ
とが実証され、本発明の診断法が確立された。

この診断法は、従来の形態学的、細胞遺伝学的診断法
に比べ、はるかに感度が良く、精度良い検査法であり、
リンパ系腫瘍、白血病等の早期診断および化学的療法の
奏功度のチェックに有用である。

更に、本発明により得られた各種のD_Hプローブは様々
な患者に対応する患者リンパ球の細胞タイピングに使用
される診断薬として有用である。

また、免疫グロブリン遺伝子及び関連遺伝子の調製よ
りも本発明のD_Hプローブを用いることによりより簡便に
行なえる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の15kb DNA断片におえる12個のD_H遺伝子
の配列位置を模式的に示した図、第２図（ａ）〜（ｃ）
は第１図に示した12個のD_H遺伝子を含む15kb DNA断片の
ヌクレオチド配列、第３図は実施例３で行なったサザー
ンハイブリダイゼーションの結果を示す図、第４図は第
１図の15kb DNA断片中に見い出されたD_H遺伝子を含む17
個のヒト胎児型遺伝子のヌクレオチド配列、第５図は胎
児型D_H遺伝子と体細胞型D_H遺伝子のヌクレオチド配列の
比較図、第６図はアミノ酸レベルでの体細胞型D_H配列と
胎児型D_H配列の比較図、第７図（ａ）及び（ｂ）はＤIR
遺伝子ファミリーの構成を示す図、第８図（ａ）及び
（ｂ）はマウスとヒトD_H配列の比較図、第９図（ａ）及
び（ｂ）はD_H遺伝子の隣接する配列間でのヌクレオチド
配列の比較図、第10図はD_H遺伝子誕生のモデルを模式的
に示す図（四角枠内の数字はヌクレオチド数を示す）、
第11図はD_H遺伝子の両隣接領域の配列と胎児型V_H遺伝子
の３′側隣接領域との比較図、第12図はIgD−分泌ミエ
ローマ患者のV_HD_HJ_H領域のDNA配列を示す図（〜は
プライマーの選択に用いた配列を示し、ヌクレオチド配
列直上のアルファベットはその直下のコドンに対応する
アミノ酸を示し、第６図におけるのと同様に定義され
る）、第13図は第12図のD_H領域のDNA配列のみを示す図
（はD_K1に相当する部分、はＤ_XP′１に相当する配
列）、第14図は同定された各種J_H領域の結果の一部を示
す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者粟屋昭神奈川県横浜市戸塚区矢部町1541番地 (72)発明者石塚雄作神奈川県横浜市中区本牧大里町21番地 (56)参考文献Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 85［22］（1988，Ｎｏｖ．）ｐ．8548−8552 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．18［４］（1988，Ａｐｒ．）ｐ．649−652 Ｓｃｉｅｎｃｅ 238（1987）ｐ. 1134−1138 Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．155［１］（1982）ｐ．201−218 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅｓｅｑＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトDNAファージライブラリーから分離さ
れた約15kbのDNA断片であって、以下のD_H遺伝子：を含むことを特徴とするDNA断片。
【請求項２】請求項１に記載のDNA断片を含むλファー
ジクローン。