JP3054745B2 - raf遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド調節 - Google Patents
raf遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド調節Info
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Description
31日出願)の一部継続出願である。 技術分野 本発明は、異常細胞増殖および腫瘍形成への関与が示
唆されてきた天然に存在する細胞性遺伝子であるraf遺
伝子の発現を調節するための組成物および方法に関す
る。本発明はまた、細胞の過増殖を阻害するための方法
にも関している;これらの方法は診断的にまたは治療的
に使用しうる。さらに、本発明はraf遺伝子の発現に付
随する病状の処置にも関する。 発明の背景 直接的にまたは間接的に細胞の増殖および分化を制御
する細胞性遺伝子の変化は、癌の主原因と考えられてい
る。raf遺伝子ファミリーはA−、B−およびC-raf(ra
f-1とも呼ばれる)と称される三つの高度に保存された
遺伝子を含む。raf遺伝子は細胞増殖を制御する信号伝
達過程において重要な制御的役割を果たしていると考え
られているプロテインキナーゼをコードする。すべての
肺癌細胞株の60%はc-raf mRNAおよび蛋白質を通常では
ない高レベルで発現していることが報告されているた
め、c-raf蛋白質の発現は異常な細胞増殖に何らかの役
割を果たしていると考えられている。Rapp etal.,The O
ncogene Handbook,E.P.Reddy,A.M Skalka and T.Curra
n,eds.,Elsevier Science Publishers,New York,1988,p
p.213-253。 オリゴヌクレオチドは動物およびヒトの疾患状態の処
置において治療用成分として用いられてきた。例えば、
この分野の研究者は現在、ウイルス性、真菌性および代
謝疾患に示唆される遺伝子の発現を調節しうるアンチセ
ンス、トリプレックスおよび他のオリゴヌクレオチド組
成物を同定している。 例えば、1992年8月4日に発行された米国特許第5,13
5,917号はヒトインターロイキン−1レセプター発現を
阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供してい
る。Gawirtzらの名前で1992年3月24日に発行された米
国特許第5,098,890号はc−myb癌遺伝子と相補的なアン
チセンスオリゴヌクレオチドおよびある種の癌状態のア
ンチセンスオリゴヌクレオチド治療に関している。1992
年2月11日に発行された米国特許第5,087,617号はアン
チセンスオリゴヌクレオチドによる癌患者の処置法を提
供している。1992年11月24日に発行された米国特許第5,
166,195号はHIVのオリゴヌクレオチド阻害剤を提供して
いる。1991年4月2日に発行された米国特許第5,004,81
0号は単純ヘルペスウイルスVmw65 mRNAにハイブリダイ
ズして複製を阻害しうるオリゴマーを提供している。19
93年3月16日に発行された米国特許第5,194,428号はイ
ンフルエンザウイルスに対して抗ウイルス活性を有する
アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供している。1989
年2月21日に発行された米国特許第4,806,463号はアン
チセンスオリゴヌクレオチドおよびHTLV-III複製の阻害
にそれらを用いる方法を提供している。1994年2月15日
に発行された米国特許第5,286,717号(Cohen et al.)
は癌遺伝子に相補的な混合結合オリゴヌクレオチドホス
ホロチオエートに関している。米国特許第5,276,019号
および第5,264,423号(Cohen et al.)は細胞における
外来性核酸の複製阻害に使用されるホスホロチオエート
オリゴヌクレオチド類似体に関している。アンチセンス
オリゴヌクレオチドは安全にヒトヘ投与され、ウイルス
および細胞性遺伝子産物の両方を標的とするいくつかの
アンチセンスオリゴヌクレオチド薬剤の臨床応用が現在
進行中である。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチ
ド、ISIS2922はAIDS患者のサイトメガロウイルス網膜炎
に対して有効であることが示されている。BioWorld Tod
ay、1994年4月29日、p3。従って、オリゴヌクレオチド
は有用な治療手段であり、細胞および動物(特にヒト)
の処置のための治療計画において有用であろうことは確
立されている。 遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害は
raf遺伝子の役割の理解における有用な道具であること
が証明されている。ヒトc-rafの最初の6つのコドンに
相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを用い
て、インターロイキン−2(IL-2)に対するT細胞のマ
イトジェン応答にc-rafを必要とすることが示された。
オリゴヌクレオチドで処理した細胞はほとんど全部のc-
raf蛋白質の消失およびIL-2に対する増殖応答の実質的
な減少を示した。Riedel et al.,Eur.J.Immunol.1993,
23,3146-3150。Rappらはプロモーターの下流にアンチセ
ンス配向したraf遺伝子を含む発現ベクター、および細
胞でアンチセンスraf遺伝子または突然変異したraf遺伝
子を発現させることによるraf発現阻害の方法を開示し
ている。WO出願93/04170。マウスc-rafのコドン1−6
に相補的なアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドを用いてラット肝癌細胞株H4IIEにおけるDNA合成のイ
ンシュリン刺激を回避した。Tornkvist et al.,J.Biol.
Chem,1994,269,13919-13921。WO出願93/06248号は、c-r
af遺伝子領域を増幅し、および突然変異の証拠について
それを分析することを特徴とする、癌を発生する危険性
が大きい個体の同定法および癌にかかった患者の予後お
よび適当な処置を決定するための方法を開示している。 Dennerらはraf遺伝子にハイブリダイズするアンチセ
ンスポリヌクレオチド、およびそれらを使用する方法を
開示している。WO94/15645。ヒトおよびラットraf配列
にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが開示されて
いる。 Inversenらはras−活性化癌細胞を殺すことができるr
afに相補的なヘテロ型アンチセンスオリゴヌクレオチド
およびraf−活性化癌細胞を殺す方法を開示している。
多数のオリゴヌクレオチド配列が開示されているが、そ
のどれもが実際にはアンチセンスオリゴヌクレオチド配
列ではない。 raf遺伝子発現を阻害するための改良された組成物お
よび方法が長く待ち望まれている。 発明の概要 本発明はヒトrafをコードする核酸を標的とし、かつr
af発現を阻害しうるオリゴヌクレオチドを提供する。該
オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのヌクレオチド
上の2′位においてメトキシエトキシ(2′−O-CH2CH2
OCH3)修飾を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、診
断および治療の両方に有用であると考えられ、本発明の
方法において特に有用であると考えられる。 本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチドを用い
て、ヒトrafの発現、特にrafの異常発現を阻害する方法
を含む。これらの方法は、raf発現および過増殖が関連
しているため、治療および診断の両方に有用であると考
えられる。これらの方法はまた、例えば種々の細胞機能
および生理学的過程および状態におけるraf発現の役割
を検出および決定するための、およびraf発現に付随す
る状態を診断するための道具としても有用である。 本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチドを用いる
細胞の過増殖を阻害する方法も提供する。これらの方法
は、例えば、rafに付随する細胞過増殖の診断に有用で
あると考えられる。異常な増殖的状態の処置法もまた提
供される。これらの方法は本発明のオリゴヌクレオチド
を使用する。これらの方法は、治療的におよび臨床的研
究および診断の道具としても有用であると考えられる。 図面の簡単な説明 図1は、ヌードマウスにおけるA549肺腫瘍異種移植片
の増殖に対するISIS5132(図1A)およびスクランブル化
対照オリゴヌクレオチドISIS10353(図1B)の効果を示
す折れ線グラフである。ISIS5132はすべての用量で(0.
006mg/kg;0.06mg/kg;0.6mg/kg;および6.0mg/kg)用量応
答的に腫瘍サイズを減少させた。スクランブル化rafオ
リゴヌクレオチド、ISIS10353はいずれの用量でも効果
を示さなかった(図1B)。 図2は、ヌードマウスにお
けるA549肺腫瘍異種移植片の増殖に対するISIS5132およ
び同一の配列の2′メトキシエトキシ体(2′−O-CH2C
H2OCH3)、CGP69845の効果を示す折れ線グラフである。
ISIS5132はすべての用量で(0.006mg/kg;0.06mg/kg;0.6
mg/kg;および6.0mg/kg)用量応答的に腫瘍サイズを減少
させた。メトキシエトキシ(2′−O-CH2CH2OCH3)オリ
ゴヌクレオチド、CGP69845(ISIS10754としても知られ
ている)は、最も高い用量においてISIS5132よりさらに
高い阻害効果を有していた。 発明の詳細な説明 悪性腫瘍は、癌細胞の特性である増殖制御の消失を引
き起こす一連の段階的進行性変化を経て発育する。即
ち、連続的非制御増殖、周りの組織を侵襲する能力およ
び異なる器官部位へ転移する能力。注意深く制御された
インビトロでの研究から、正常および新生物性細胞の増
殖を特徴付ける因子を定義する手がかりが得られ、細胞
増殖および分化を制御する特定の蛋白質の同定が導かれ
た。raf遺伝子はA−、B−およびc-rafと名付けられた
関連する蛋白質をコードする遺伝子ファミリーの一員で
ある。raf遺伝子は高度に保存されたセリン−トレオニ
ンー特異的プロテインキナーゼをコードする。これらの
酵素は異なるように発現される;最も十分に特徴付けら
れているc-rafは試験されたすべての器官およびすべて
の細胞株で発現されている。A−およびB-rafは各々尿
性器および脳組織で発現されている。c-rafプロテイン
キナーゼ活性および細胞内分布はリン酸化を通してマイ
トジェンにより制御される。上皮増殖因子、酸性線維芽
細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インシュリン、顆
粒球−マクロファージコロニー刺激因子、インターロイ
キン−2、インターロイキン−3およびエリトロポイエ
チンを含む種々の増殖因子は、c-rafのリン酸化を誘導
することが示されている。従って、c-rafは多数の増殖
因子をそれらの正味の効果(細胞増殖)と結合させ、正
常細胞信号伝達経路において基本的な役割を果たしてい
ると考えられている。 ある種の異常増殖状態はraf発現に付随すると考えら
れており、従ってraf発現の阻害に応答すると考えられ
ている。raf蛋白質発現の異常な高レベルはまた形質転
換および異常な細胞増殖にも関係することが示唆されて
いる。これらの異常な増殖状態はraf発現の阻害に応答
的であると考えられている。異常な増殖状態の例は、
癌、腫瘍、過生、肺線維症、脈管形成、乾癬、アテロー
ム、および血管形成術後の狭窄または再狭窄のような血
管内の平滑筋増殖のような過増殖障害である。rafがそ
の一部となっている細胞信号伝達経路もまた、例えば、
組織移植片拒否反応、エンドトキシンショックおよび糸
球体腎炎のようなT細胞増殖(T細胞活性化および増
殖)により特徴付けられる炎症性障害と関係することが
示唆されている。 raf遺伝子発現の除去または減少が異常な細胞増殖を
停止または逆転させることが観察された。このことはra
f発現のレベルが異常に高くはない場合においても観察
された。raf遺伝子の発現を調節しうる物質の組成物を
提供することが非常に待望されている。細胞、組織およ
び動物におけるraf遺伝子の検出法を提供することが非
常に待望されている。また、異常なraf遺伝子発現に付
随する異常な増殖状態の診断および治療の方法を提供す
ることも待望されている。さらに、raf遺伝子の検出お
よび研究のためのキットおよび試薬も待望されている。
ここで”異常な"raf遺伝子発現とは、raf蛋白質の発現
のレベルが異常に高いこと、または異常な増殖状況また
は状態におけるraf発現のレベルとして定義される。 本発明はrafをコードする核酸を標的とするオリゴヌ
クレオチドを用いる。オリゴヌクレオチドとそれがハイ
ブリダイズするその相補的核酸標的との間のこの関係は
通常”アンチセンス”と称されている。本発明の文脈に
おいて、選択された核酸標的へのオリゴヌクレオチド
の”標的化”は多段階過程である。この過程は通常、そ
の機能が調節されるべき核酸配列を同定することから始
まる。それは例えば、その発現が特定の疾病状態に付随
する細胞性遺伝子(または遺伝子から作られるmRNA)ま
たは感染作因からの外来性核酸であろう。本発明におい
て、標的はrafをコードする核酸である;別の表現で
は、raf遺伝子またはraf遺伝子から発現されるmRNAであ
る。標的化過程にはまた、所望の効果(遺伝子発現の調
節)が得られるように、オリゴヌクレオチドとの相互作
用を起こす核酸配列内の一つまたは複数の部位の決定が
含まれる。一つまたは複数の部位が同定されたら、標的
に十分相補的な(即ち、十分な特異性で十分よくハイブ
リダイズし、所望の調節が得られる)オリゴヌクレオチ
ドが選択される。 本発明の文脈において、”調節”とは阻害または刺激
を意味している。raf遺伝子発現の阻害は現在のところ
調節の好適な形である。この調節は例えば、本出願の実
施例に教示されるように、mRNA発現のノーザンブロット
アッセイまたは蛋白質発現のウェスタンブロットアッセ
イのような本分野では日常的な方法により測定しうる。
本出願の実施例に教示されるように、細胞増殖または腫
瘍細胞増殖に対する効果も測定可能である。本発明の文
脈において、”ハイブリダイゼーション”とは、通常相
対する核酸鎖または核酸鎖の二つの領域の相補的塩基間
の水素結合(ワトソンークリック温基対形成としても知
られている)を意味している。グアニンおよびシトシン
は相補的塩基の例であり、それらの間で三つの水素結合
が形成されることが知られている。アデニンおよびチミ
ンは相補的塩基の例であり、それらの間で二つの水素結
合が形成される。”特異的にハイブリダイズ可能”およ
び”相補的”とは、DNAまたはRNA標的とオリゴヌクレオ
チドとの間で安定かつ特異的な結合が起こるように十分
な程度の相補性を示すのに使用される術語である。特異
的にハイブリダイズ可能であるためには、オリゴヌクレ
オチドはその標的核酸配列と100%相補的である必要は
ないことが理解されるであろう。標的へのオリゴヌクレ
オチドの結合が標的分子の正常な機能を妨害して有用性
の消失を起こす場合、および特異的結合が望まれる条件
下、即ち、インビボアッセイまたは治療的処置の場合に
は生理的条件下、またはインビトロアッセイの場合には
アッセイが実施される条件下で、非標的配列へのオリゴ
ヌクレオチドの非特異的結合を避けるために十分な程度
の相補性がある場合、オリゴヌクレオチドは特異的にハ
イブリダイズ可能である。 本発明においては、c-rafをコードするmRNAを標的と
するオリゴヌクレオチドが提供される。本発明に従う
と、mRNAは三文字遺伝コードを用いて蛋白質をコードす
るための情報を運ぶコード領域のみを含むだけでなく、
5′−非翻訳領域、3′−非翻訳領域、5′キャップ領
域、イントロン領域およびイントロン/エクソンまたは
スプライス連結リボヌクレオチドとして知られているよ
うな領域を形成する付随するリボヌクレオチドを含むこ
とを当業者は理解するであろう。従って、これらの付随
するリボヌクレオチド並びにコードリボヌクレオチドの
全部または一部を標的とするオリゴヌクレオチドを処方
することができる。妨害されるべきメッセンジャーRNA
の機能には、蛋白質翻訳の部位へのRNAのトランスロケ
ーション、RNAからの実際の蛋白質の翻訳、RNAのスプラ
イシングまたは成熟およびおそらくはRNAにより行われ
ているであろう独立した触媒活性のような生存のための
すべての機能が含まれる。RNA機能のそのような妨害の
全体的な効果はraf蛋白質発現の妨害を起こすことであ
る。 本発明はraf遺伝子発現調節のためのオリゴヌクレオ
チドを提供する。そのようなオリゴヌクレオチドはc-ra
fをコードする核酸を標的とする。 本発明の文脈において、述語”オリゴヌクレオチド”
とは、天然に存在する塩基、糖および糖間(主鎖)結合
からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマーのオ
リゴマーまたはポリマーを意味している。述語”オリゴ
ヌクレオチド”はまた、同様に機能する天然に存在しな
いモノマー、またはそれらの一部を含むオリゴマーも含
まれる。修飾は、1つまたはそれ以上の塩基、糖または
主鎖結合、またはこれらの組み合わせの上に行うことが
でき、このような修飾は当該技術分野でよく知られてい
る。修飾または置換オリゴヌクレオチドは、例えば、促
進された細胞取り込みおよびヌクレアーゼ存在下での増
加した安定性等の性質のため天然型よりもしばしば好適
である。 オリゴヌクレオチドはキメラオリゴヌクレオチドであ
ってもよい。本発明の文脈において”キメラオリゴヌク
レオチド”または”キメラ”とは、各々少なくとも一つ
のヌクレオチドから作られた二つまたはそれ以上の化学
的に異なる領域を含むオリゴヌクレオチドである。これ
らのオリゴヌクレオチドは典型的には、一つまたはそれ
以上の有利な性質(例えば、ヌクレアーゼ耐性の増加、
細胞内への取り込みの増加、RNA標的に対する結合親和
性の増加)を与える少なくとも一つの修飾されたヌクレ
オチド領域およびRNaseH切断のための基質である領域を
含む。一つの好適な態様において、キメラオリゴヌクレ
オチドは、標的結合親和性を増加させるために修飾され
た少なくとも一つの領域、および通常はRNaseHのための
基質として働く領域を含む。その標的(この場合、raf
をコードする核酸)に対するオリゴヌクレオチドの親和
性は、オリゴヌクレオチドと標的が解離する温度である
オリゴヌクレオチド/標的対のTmを測定することにより
日常的に決定される;解離は分光学的に検出される。Tm
が高いほど標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性は
強い。そのような修飾はオリゴヌクレオチド内に日常的
に組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは与えられ
た標的に対し、2′−デオキシオリゴヌクレオチドより
高いTm(即ちより強い標的結合親和性)を有しているこ
とが示された。そのような増加した親和性の効果はraf
遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害を非
常に増強することである。RNaseHはRNA:DNAデュープレ
ックスのRNA鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼで
ある;従ってこの酵素の活性化はRNA標的の切断を生
じ、このことによりアンチセンス阻害の効率を非常に促
進しうる。RNA標的の切断はゲル電気泳動により日常的
に示すことができる。別の好適な態様において、ヌクレ
アーゼ耐性を増強するためにキメラオリゴヌクレオチド
も修飾される。細胞は核酸を分解しうる種々のエキソ−
およびエンド−ヌクレアーゼを含む。多数のヌクレオチ
ドおよびヌクレオシド修飾が、これらを取り込んだオリ
ゴヌクレオチドを天然のオリゴヌクレオチドよりヌクレ
アーゼ消化に対してより耐性とすることが示されてい
る。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを細胞抽
出物または単離ヌクレアーゼ溶液とともにインキュベー
トし、通常はゲル電気泳動により、時間に関して残存す
る無傷のオリゴヌクレオチドの程度を測定することによ
り日常的に測定される。ヌクレアーゼ耐性を増強するよ
うに修飾されているオリゴヌクレオチドは非修飾オリゴ
ヌクレオチドより長く無傷のままで残る。ヌクレアーゼ
耐性を増強または与えるための種々のオリゴヌクレオチ
ド修飾が示されている。いくつかの場合、標的結合親和
性を増強させるオリゴヌクレオチド修飾はまた、独立し
てヌクレアーゼ耐性を増強しうる。 本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのヌ
クレオチド上の2′位においてメトキシエトキシ(2′
−O-CH2CH2OCH3)修飾を含む。この修飾は、オリゴヌク
レオチドのその標的に対する親和性およびオリゴヌクレ
オチドのヌクレアーゼ耐性の両方を増加させることが示
されている。本発明に従うオリゴヌクレオチドは好適に
は約8から約50ヌクレオチドの長さである。本発明の文
脈においては、8から50個のモノマーを有する上記のよ
うな天然に存在しないオリゴマーを含むことが理解され
るであろう。 本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドはよく
知られた固相合成技術により都合よく日常的に作製する
ことができる。Martin,P.,Helv.Chim.Acta 1995,78,486
-504。そのような合成のための装置はApplied Biosyste
msを含むいくつかの会社から販売されている。そのよう
な合成のために他の手段を用いてもよい;オリゴヌクレ
オチドの実際の合成は日常的に仕事をする人の手腕の範
囲内である。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導
体のような他のオリゴヌクレオチドを製造するために同
様の技術を使用することもよく知られている。また、蛍
光標識、ビオチニル化または他のコンジュゲート化され
たオリゴヌクレオチドを合成するために、同様の技術お
よびビオチン、フルオレセイン、アクリジンまたはソラ
ーレン修飾アミダイトおよび/または制御細孔ガラス
(CPG)(Glen Research,Sterling VA)のような市販品
として入手可能な修飾アミダイトおよびCPG産物の使用
もよく知られている。 c-raf mRNAの一部を標的とするある種のオリゴヌクレ
オチドがraf発現の阻害および細胞過増殖の妨害に特に
有用であることが見いだされた。アンチセンスオリゴヌ
クレオチドを用いるc-raf発現の阻害のための方法も同
様に細胞過増殖の妨害に有用である。本発明の方法にお
いては、組織または細胞をオリゴヌクレオチドと接触さ
せる。本発明の文脈において、組織または細胞を一つま
たは複数のオリゴヌクレオチドど”接触”させるとは、
インビトロまたはエクスビボで細胞懸濁液または組織試
料ヘオリゴヌクレオチドを加えるか(通常は液体担体中
で)、または動物内の細胞または組織にオリゴヌクレオ
チドを投与することを意味している。 治療のため、細胞の過増殖を阻害する方法および異常
な増殖性状態を処置する方法が提供される。治療組成物
の処方および続いての投与は本分野の技術範囲であると
考えられる。一般に、治療のためには、本発明に従った
オリゴヌクレオチドを、医薬として受容可能な担体中、
特定の疾患の性質、その重態度および患者の全体の状態
に依存して変化するであろう用量および期間、そのよう
な治療が必要と思われる患者に投与する。本発明の医薬
組成物は、局所または全身処置が望まれるか、または処
置される領域に依存して多くの方法で投与されるであろ
う。局所(目、膣、直腸、鼻孔内を含む)、経口または
例えば、静脈内滴注、静脈注射または皮下、腹腔内もし
くは筋肉内注射による非経口で投与されるであろう。 局所投与のための処方には、軟膏、ローション、クリ
ーム、ゲル、ドロップ、座剤、スプレー、水剤および散
剤が含まれるであろう。通常の医薬担体、水性、粉末ま
たは油性基剤、増粘剤などが必要であるかまたは望まし
いであろう。被覆コンドーム、グローブなどもまた有用
である。 経口投与のための組成物には散剤または顆粒剤、懸濁
剤または水または非水媒質溶液剤、カプセル剤、サッシ
ェ剤または錠剤が含まれる。増粘剤、芳香剤、希釈剤、
乳化剤、分散補助剤または結合剤も望ましいであろう。 非経口投与のための処方には無菌水溶液が含まれ、そ
れは緩衝剤、希釈剤および他の適当な添加物を含んでい
てもよい。 そのような医薬担体に加えて、オリゴヌクレオチドの
取り込みを容易にするためにカチオン性脂質が処方に含
まれていてもよい。取り込みを容易にするそのような組
成物の一つはリポフェクチン(BRL,Bethesda MD)であ
る。 投与用量は処置されるべき状態の重度および応答度に
依存し、処置進行は治療が達成されるかまたは疾患状態
の軽減が達成されるまで数日から数カ月続く。至適投与
計画は体内の薬剤蓄積の測定から計算しうる。当業者は
容易に至適投与量、投与法および繰り返し頻度を決定し
うる。至適投与量は個々のオリゴヌクレオチドの相対的
有効性に依存して変化するであろうが、一般的にはイン
ビトロおよびインビボの動物実験からのEC50に基づいて
計算しうる。例えば、化合物の分子量(オリゴヌクレオ
チド配列および化学構造から導かれる)およびIC50のよ
うな有効量(実験的に求められる)が与えられると、mg
/kgでの投与量が日常的に計算される。 本発明はまた、癌、乾癬または血管狭窄またはアテロ
ームのような過増殖性疾患を有すると疑われる患者から
の組織または他の試料における異常増殖状態の診断にも
適している。細胞増殖を阻害する本発明のオリゴヌクレ
オチドの能力は、そのような状態を診断するために用い
られる。多くのアッセイが本発明を用いて計画できる
が、そのようなアッセイは一般にそのような阻害を検出
および通常は定量化しうるように選択された条件下で組
織試料を本発明のオリゴヌクレオチドと接触させること
を含んでいるであろう。同様に、本発明は有効な処置計
画が設計しうるように、他の病因を有する腫瘍からraf
付随性腫瘍を区別するために使用しうる。 本発明のオリゴヌクレオチドはまた研究目的にも使用
されるであろう。従って、オリゴヌクレオチドにより示
される特異的ハイブリダイゼーションは、アッセイ、精
製、細胞生成物の調製および当業者により認められるで
あろう他の方法論で使用されるであろう。 本発明のオリゴヌクレオチドはまたraf発現の検出お
よび診断に有用である。例えば、ポリヌクレオチドキナ
ーゼによる5′末端の32P標識により放射性標識オリゴ
ヌクレオチドを製造しうる。Sambrook et al.,Molecula
r Cloning.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor L
aboratory Press,1989,第2巻,p10.59。次に、放射性標
識オリゴヌクレオチドをraf発現が疑われる組織または
細胞試料と接触させ、試料を洗浄して非結合オリゴヌク
レオチドを除去する。試料に残存している放射活性は結
合されたオリゴヌクレオチドを示しており(それはraf
の存在を示している)、シンチレーションカウンターま
たは他の通常の手段により定量しうる。放射性標識オリ
ゴを用いて組織のオートラジオグラフィーを実施し、研
究、診断または治療の目的でraf発現の局在化、分布ま
たは量を決定することができる。そのような研究におい
ては、組織切片を放射性標識オリゴヌクレオチドで処理
し、上記のように洗浄し、次にルーチンオートラジオグ
ラフィー法に従って写真乳化剤へ暴露する。現像すると
乳化剤はrafを発現している範囲に銀粒子のイメージを
与える。銀粒子の定量によりraf発現を検出することが
できる。 raf発現の蛍光検出のための類似のアッセイは、放射
性標識の代わりにフルオレセインまたは他の蛍光性標識
とコンジュゲートさせた本発明のオリゴヌクレオチドを
用いて開発することができる。そのようなコンジュゲー
トは、蛍光標識アミダイトまたはCPG(例えば、Glen Re
search、Sterling VAから入手可能なフルオレセイン標
識アミダイトおよびCPG。Glen Research、Sterling VA
の1993年のDNA研究用製品カタログp.21を参照された
い)を使用した固相合成の間に日常的に製造される。 各々のこれらのアッセイの様式は本分野では既知であ
る。当業者は本発明の教示に従って容易にこれらの既知
のアッセイをraf発現の検出に適用でき、raf発現を検出
する新規かつ有用な手段が提供される。 配列番号1を有するオリゴヌクレオチドによるc-raf発
現の阻害 ヒトc-rafを標的とするホスホロチオエートデオキシ
オリゴヌクレオチドは、Genbank c-raf配列HUMRAFR(Ge
nbankリストx03484)を用いて設計し、合成し、ノーザ
ンブロットアッセイを用いてT24膀胱癌細胞でのc-raf m
RNA発現の阻害について試験した。c-rafの3′UTRを標
的とするオリゴヌクレオチドISIS5132(TCCCGCCTGT GAC
ATGCATT;配列番号1)は、90%を越える阻害を示した。 配列番号1を有し、両側を2′−O-CH2CH2OCH3修飾を
有する6ヌクレオチドによりフランクされた8ヌクレオ
チドのデオキシヌクレオチド中央領域を有する2つのオ
リゴヌクレオチドを合成した。これらの化合物は、一方
のISIS10755(CIBA1440としても知られている)が均一
なホスホロチオエート主鎖を有するのに対し、他方のIS
IS10754(CIBA1439またはCGP69845としても知られてい
る)が中央領域(主鎖結合7-14)にホスホロチオエート
主鎖を有し残りの(フランキング)領域にホスホジエス
テル主鎖を有する点において異なる。これらのオリゴヌ
クレオチドがT24細胞においてc-raf mRNA発現を阻害す
る能力について試験した。IC50(50%阻害を与えるオリ
ゴヌクレオチド濃度)を計算し、これらのオリゴヌクレ
オチドの相補物に対する親和性を示すTmのデータととも
に表1に示す。ISIS10755およびISIS10754の両方とも、
IC50が非常に低いため好ましい。 rafに対するISIS5132の特異性 raf mRNAに対するISIS5132の特異性は、このオリゴヌ
クレオチドがT24細胞においてHa-ras mRNAならびにc-ra
f mRNAを阻害する能力について試験するノーザンブロッ
トアッセイにより示された。Ha-rasは形質転換および腫
瘍発生への関与が示唆されている細胞性癌遺伝子であ
る。ISIS5132はHa-ras mRNAレベルに影響を与えること
なくc-raf mRNAをほとんど完全になくすことが示され
た。 キメラオリゴヌクレオチド 配列番号:1を有するキメラオリゴヌクレオチドを合成
した。これらのオリゴヌクレオチドは2′−O−メチル
修飾ヌクレオチドの二つの領域により隣接される6,8ま
たは10デオキシヌクレオチドの中心”ギャップ”領域を
有していた。主鎖は一様にホスホロチオエートであっ
た。ノーザンブロット分析において、これらのオリゴヌ
クレオチドの三つすべて(ISIS6720,6−デオキシギャッ
プ;ISIS6717,8−デオキシギャップ;ISIS6729,10−デオ
キシギャップ)は、T24細胞におけるc-raf mRNA発現の7
0%を超える阻害を示した。8−デオキシギャップ化合
物(6717)は90%を超える阻害を示した。2′−O−プ
ロピルまたは2′フルオロ修飾ヌクレオチドのいずれか
により隣接される8−デオキシヌクレオチドギャップを
有する配列番号1のオリゴヌクレオチドもまた活性であ
ることが認められた。 癌細胞増殖の阻害 ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドISIS5132(配
列番号:1)がT24膀胱癌細胞増殖を阻害することが示さ
れた。細胞をリポフェクチン(オリゴヌクレオチド取り
込みを増加させるカチオン性脂質)とともに種々の濃度
のオリゴヌクレオチドで処理した。表2に示すように細
胞増殖の用量依存性阻害が示され、ここで”なし”は非
処理対照(オリゴヌクレオチドなし)を示し、”対照”
は陰性対照オリゴヌクレオチドで処理したことを示して
いる。結果は非処理対照と比較したパーセント阻害とし
て示されている。 T24ヒト膀胱癌腫瘍に対するISIS5132の効果 ヌードマウスにおいて皮下ヒトT24膀胱癌腫移植片を
確立させ、ISIS5132および関連しない対照ホスホロチオ
エートオリゴヌクレオチドを25mg/kgの用量で週に3回
腹腔内に投与することにより処理した。この予備的研究
において、ISIS5132は11日後対照と比較して35%腫瘍増
殖を阻害した。オリゴヌクレオチド処理腫瘍は研究期間
を通して対照腫瘍より小さかった。 MDA-MB231乳癌腫瘍に対するISIS5132の効果 ヌードマウスにおいて皮下ヒトMDA-MB231乳癌腫移植
片を確立させ、ISIS5132および関連しない対照ホスホロ
チオエートオリゴヌクレオチドを0.6mg/kgまたは6.0mg/
kgの用量で1日1回静脈内に投与することにより処理し
た。ISIS5132は27日後(研究の終了日)対照と比較して
約80%腫瘍増殖を阻害した。 ISIS5132はまた、ヌードマウス中のMDA-MB231移植片
に対し腹腔内に投与しても有効であった。オリゴヌクレ
オチドは1日1回0.6mg/kgまたは6.0mg/kgで投与した。
27日後(研究の終了日)、腫瘍体積は対照と比較して57
%(0.6mg/kg)または64%(6.0mg/kg)阻害された。 MDA-MB231腫瘍におけるc-raf RNAレベルに対するISIS
5132の効果 RNAをMDA-MB231腫瘍移植片から単離し、ノーザンブロ
ットを実施してraf RNAレベルに対するオリゴヌクレオ
チドの効果を評価した。ISIS5132は27日後に、静脈内投
与の場合は67%および腹腔内投与の場合は39%、raf RN
Aレベルを減少させた(いずれも6mg/kg)。 Colo205ヒト結腸癌腫瘍に対するISIS5132の効果 ヌードマウスにおいて皮下ヒトColo205結腸癌腫移植
片を確立させ、ISIS5132および関連しない対照ホスホロ
チオエートオリゴヌクレオチドを、6.0mg/kgの用量で1
日1回静脈内に投与することにより処理した。この研究
において、ISIS5132は25日後に対照と比較して40%以上
腫瘍増殖を阻害した。A549ヒト肺腺癌腫瘍に対するISIS
5132の効果 皮下ヒトA549肺腺癌異種移植片をオスBalb/cヌードマ
ウスで確立させ、0.006から6.0mg/kgの範囲の用量での
静脈内注射による毎日の投与によりISIS5132および対照
オリゴヌクレオチドで処理した。図1に示されるよう
に、ISIS5132はすべての用量で用量応答的に腫瘍サイズ
を減少させた。スクランブル化rafオリゴヌクレオチドI
SIS10353はどの用量でも効果はなかった。 A549ヒト肺腺癌腫瘍に対するISIS5132およびCGP69845の
効果 皮下ヒトA549肺腺癌異種移植片をオスBalb/cヌードマ
ウスで確立させ、0.006から6.0mg/kgの範囲の用量での
静脈内注射による毎日の投与によりISIS5132(配列番号
1)または配列番号1のメトキシエトキシ(2′−O−
CH2CH2OCH3)体(CGP69845)で処理した。図2に示され
るように、ISIS5132はすべての用量で用量応答的に腫瘍
サイズを減少させた。メトキシエトキシ(2′−O−CH
2CH2OCH3)オリゴヌクレオチド(CGP69845)は、より低
い用量でISIS5132と同様の効果を有しており、6.0mg/kg
ではISIS5132より高い阻害効果を有していた。 A549腫瘍細胞におけるc-raf RNAレベルに対するISIS513
2の効果 A549腫瘍移植片からRNAを単離し、ノーザンブロット
を実施してraf RNAレベルに対するオリゴヌクレオチド
の効果を評価した。ISIS5132は、オリゴ処理から8時間
後に始まってraf RNAレベルを段々と減少させた。実験
を13日目で終了させた時、RNAレベルはまだ減少しつつ
あり、対照の約15%のレベルに達していた。 ラットおよびマウスc-rafを標的とするオリゴヌクレオ
チドの同定 rafキナーゼにより媒介されると考えられている多く
の状態は、ヒトにおける研究を実施することができな
い。例えば、組織移植片拒否反応はraf発現を妨害する
ことにより改善されるように見える状態である;しか
し、明らかにこのことはヒト移植患者ではなく動物で評
価されねばならない。別のそのような例は再狭窄であ
る。しかしながら、これらの状態はここで使用したラッ
トおよびマウスモデルのような動物モデルでは試験可能
である。これらのデータは、c-rafを標的とするアンチ
センスオリゴヌクレオチドの療法的有用性の追加の証拠
を提供する。 ラットおよびマウス細胞でc-raf発現を阻害するため
のオリゴヌクレオチド配列が同定された。ラットおよび
マウスc-raf遺伝子は高度に相同的な領域を有してい
る;ヒトc-rafを標的とするオリゴヌクレオチドの評価
から得られた情報を用いて、ラットおよびマウス両方の
c-raf mRNA配列を標的とする一連のオリゴヌクレオチド
を設計し、合成した。これらのオリゴヌクレオチドをノ
ーザンブロット分析を用いてマウスbEND細胞およびラッ
トA-10細胞での活性についてスクリーニングした。2つ
のオリゴヌクレオチド、ISIS11061およびISIS10707は、
400nMの用量で、マウスbEND細胞において、c-raf RNAレ
ベルを90%より大きく阻害することが認められた。これ
らの2つのオリゴヌクレオチドは、200nMの用量で、ラ
ットA-10細胞においてraf RNAレベルをほぼ完全に阻害
した。ISIS10707のIC50は、マウスbEND細胞において170
nMであり、ラットA-10細胞において85nMであることが見
いだされた。ISIS11061のIC50は、マウスbEND細胞にお
いて85nMであり、ラットA-10細胞において30nMであると
判定された。 マウスにおける内在性c-raf mRNA発現に対するISIS1106
1の効果 マウスに3日間毎日ISIS11061(50mg/kg)ま
たは対照オリゴヌクレオチドまたは対照塩溶液を腹腔内
に注射した。動物を殺し、器官をノーザンブロット分析
によりc-raf mRNA発現について分析した。ISIS11061は
肝臓のc-raf mRNAのレベルを約70%減少させることが観
察された。対照オリゴヌクレオチドはc-raf発現には何
の影響も与えなかった。ISIS11061の効果はc-rafに特異
的であった;A-rafおよびG3PDH RNAレベルはオリゴヌク
レオチド処理により影響を受けなかった。 c-rafに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドはマウ
ス心臓同種移植モデルにおいて生存を延長させる 同種移植拒否反応を防止するc-rafアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドISIS11061の治療的効果を決定するた
め、マウス血管新生化異所性心臓移植モデルにおける活
性についてこのオリゴヌクレオチドを試験した。本質的
にはIsobe etal.,Circulation 1991,84,1246-1255によ
り記載されているように、一次血管新生化移植片として
C57BI10マウスからの心臓をC3Hマウスの腹部腔内へ移植
した。オリゴヌクレオチドを7日間アルゼットポンプを
通して連続的に静脈内投与した。非処理マウスの平均同
種移植片生存時間は7.83±0.75日であった(7、7、
8、8、8、9日)。20mg/kgまたは40mg/kgのISIS1106
1で7日間処理したマウスの同種移植片はすべて少なく
とも11日生存していた(20mg/kgでは11、11、12日、お
よび40mg/kgでは>11、>11、>11日)。 ラットで行われた試験的研究では、Lewisラットから
の心臓をACIラットの腹部腔内へ移植した。ラットにア
ルゼットポンプを通して20mg/kgのISIS11061を7日間投
与した。非処理ラットの平均同種移植片生存時間は8.86
±0.69日であった(8、8、9、9、9、9、10日)。
オリゴヌクレオチド処理ラットの平均同種移植片生存時
間は15.3±1.15日であった(14、16、16日)。 平滑筋細胞増殖に対するc-rafを標的とするアンチセン
スオリゴヌクレオチドの効果 平滑筋細胞増殖は、例えば血管形成術後のアテローム
および再狭窄のような血管狭窄の原因である。A-10ラッ
ト平滑筋細胞の増殖に対するISIS11061の効果を決定す
るために実験を行った。培養細胞をISIS11061(リポフ
ェクチンを加えて)を添加して、または添加せずに増殖
させ、ウシ胎児血清で刺激後24時間および48時間に細胞
増殖を測定した。ISIS11061(500nM)は用量応答的に血
清刺激細胞増殖を阻害することが観察され、24時間およ
び48時間後の最大阻害は各々46%および75%であった。
この化合物について200nMのIC50値が得られた。非相関
対照オリゴヌクレオチドは500nMの用量まで影響を与え
なかった。 ラットにおける再狭窄に対するc-rafを標的とするアン
チセンスオリゴヌクレオチドの効果 血管形成術再狭窄のラット頚動脈障害モデルは開発さ
れており、c−myc癌遺伝子を標的とするアンチセンス
オリゴヌクレオチドの再狭窄に対する効果を評価するた
めに使用されてきた。Bennett et al.,J.Cli,Invest.1
994,93,820-828。このモデルを用いて再狭窄に対するラ
ットc-rafを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチ
ド(特にISIS11061)の効果を評価することができる。
バルーンカテーテルによる頚動脈損傷に続いて、オリゴ
ヌクレオチドを静脈内注射、アルゼットポンプを通した
連続的静脈内投与またはBennettらにより記載されてい
るようなプルロニックゲルマトリックスでの頚動脈への
直接投与により投与する。回復後、ラットを殺し、頚動
脈を顕微鏡により調べて、ルミナール切片に対する処理
の効果を決定する。 本発明は以下の実施例によりさらに例示されるが、そ
れらは例示のためだけであり、本発明を特定の態様に制
限することを意図しているものではない。 実施例 実施例1 オリゴヌクレオチドの合成および特性付け 非修飾DNAオリゴヌクレオチドはヨウ素による酸化を
行う標準ホスホルアミダイト化学を用いて自動化DNA合
成機(Applied Biosystemsモデル380B)で合成した。β
−シアノエチルジイソプロピル ホスホルアミダイトは
Applied Biosystems(Foster City,CA)から購入した。
ホスホロチオエート オリゴヌクレオチドについては、
標準酸化ボトルをホスファイト結合の段階的チオ化のた
めに0.2M H-1,2−ベンゾジチオール−3−オン1,1−ジ
オキシドのアセトニトリル溶液で置き換えた。チオ化サ
イクル待ち時間は68秒に増加し、続いてキャッピング工
程を行った。2′−O−メチル ホスホロチオエート
オリゴヌクレオチドは2′−O−メチル β−シアノエ
チルジイソプロピル−ホスホルアミダイト(Chemgenes,
Needham MA)および非修飾オリゴヌクレオチドのための
標準サイクル(ただし、テトラゾールおよび塩基のパル
ス運搬後の待ち時間を360秒に延長した)を用いて合成
した。合成の開始に使用した3′−塩基は2′−デオキ
シリボヌクレオチドであった。2′−O−プロピルオリ
ゴヌクレオチドはこの工程をわずかに変更して製造し
た。 2′−フルオロ ホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドは5′−ジメトキシトリチル−3′−ホスホルアミ
ダイトを用いて合成し、1990年1月11日に出願された米
国特許出願第463,358号および1990年8月13日に出願さ
れた第566,977号(これらは本出願と同一の譲渡人に譲
渡されており、ここに引例として包含されている)に開
示されているように製造した。2′−フルオロ オリゴ
ヌクレオチドはホスホルアミダイト化学を用い、および
標準DNA合成プロトコールをわずかに変更して製造され
た:脱保護は室温でメタノール性アンモニアを用いて達
成された。 メトキシエトキシ(2′−O−CH2CH2OCH3)オリゴヌ
クレオチドは、Martin,P.,Helv.Chim.Acta 1995,78,486
-504の方法にしたがって合成した。 制御細孔ガラスカラム(Applied Biosystems)から切
断し、濃水酸化アンモニウム中55℃で18時間脱保護した
後、オリゴヌクレオチドを2.5容量のエタノールで0.5M
NaClから二度沈澱させて精製した。分析ゲル電気泳動は
20%アクリルアミド、8M尿素、45mMトリスーホウ酸緩衝
液、pH7.0で実施した。オリゴデオキシヌクレオチドお
よびそれらのホスホロチオエート類似体は完全長物質の
80%を超えることが電気泳動から判断された。 実施例2 c-raf mRNA発現阻害のノーザンブロット分析 ヒト膀胱癌細胞株T24はAmerican Type Culture Colle
ction(Rockville MD)から得た。細胞は10%熱不活性
化ウシ胎児血清および各々50U/mlのペニシリンおよびス
トレプトマイシンを補給したL−グルタミンを含むマッ
コイ5A培地(Gibco BRL,Gaithersburg MD)で増殖させ
た。細胞は100mmプレートに播種した。それらが70%コ
ンフルエントに達したとき、オリゴヌクレオチドで処理
した。プレートを10mlの前もって温めたPBSおよび2.5μ
lのDOTMAを含む5mlのOpti-MEM還元血清培地で洗浄し
た。次にリポフェクチンを含むオリゴヌクレオチドを所
望の濃度まで添加した。処理して4時間後、培地をマッ
コイ培地に置き換えた。オリゴヌクレオチド処理後24か
ら72時間後に細胞を集め、標準CsCl精製法を用いてRNA
を単離した。Kingston,R.E.,Current Protocols in Mol
ecular Biology,(F.M.Ausbel,R.Brent,R.E.Kingston,
D.D.Moore,J.A.Smith,J.G.Seidman and K.Strahl,ed
s),John Wiley and Sons,NY。全RNAはCsClクッション
上での細胞溶解物の遠心分離により単離した。RNA試料
は1.2%アガロースーホルムアルデヒド ゲルを通して
電気泳動し,12-14時間以上かけてキャピラリー拡散によ
りハイブリダイゼーション膜に移した。RNAはStratalin
ker(Stratagene,La Jolla,CA)内でUV光へ暴露するこ
とにより膜と架橋させ、ランダムープライム化32P−標
識c-raf cDNAプローブ(ATCCから得られた)または対照
としてG3PDHプローブとハイブリダイズさせた。RNAはPh
osphorimager(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)を
用いて定量した。 実施例3 T24細胞におけるc-rafキナーゼ蛋白質発現の
特異的阻害 T24細胞をT=0およびT=24時間目にオリゴヌクレ
オチド(200nM)およびリポフェクチンで処理した。蛋
白質抽出物をT=48時間に調製し、アクリルアミドで電
気泳動し、c-raf(UBI,Lake Placid,NY)またはA-raf
(Transduction Laboratories、Knoxville,TN)に対す
るポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロットによ
り分析した。放射性標識第二抗体を使用し、raf蛋白質
はPhosphorimager(Molecular Dynamics,Sunnyvale,C
A)を用いて定量した。 実施例4 細胞増殖のアンチセンス阻害 第0日にT24細胞を種々の濃度のオリゴヌクレオチド
およびリポフェクチンで2時間処理した(50nMオリゴヌ
クレオチドおよび2μg/mlリポフェクチン;100nMオリゴ
ヌクレオチドおよび2μg/mlリポフェクチン;250nMオリ
ゴヌクレオチドおよび6μg/mlリポフェクチンまたは50
0nMオリゴヌクレオチドおよび10μg/mlリポフェクチ
ン)。第1日に細胞を所望のオリゴヌクレオチド濃度で
2時間、2回目の処理を行った。第2日に細胞を計数し
た。 実施例5 ヌードマウスにおけるT24ヒト膀胱癌腫瘍異
種移植片に対するISIS5132の効果 5x106のT24細胞をヌードマウスの右内側腿の皮下に移
植した。オリゴヌクレオチド(塩溶液に懸濁したISIS51
32および非相関対照ホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チド)を腫瘍細胞接種4日後から週に3回投与した。塩
溶液のみの対照もまた実施した。オリゴヌクレオチドは
腹腔内注射により与えた。オリゴヌクレオチド用量は25
mg/kgであった。処理から11、15および18日目に腫瘍サ
イズを測定し、腫瘍体積を計算した。 実施例6 ヌードマウスにおけるMDA-MB231ヒト乳癌腫
瘍異種移植片に対するISIS5132の効果 5x106のMDA-MB231細胞をヌードマウスの右内側腿の皮
下に移植した。オリゴヌクレオチド(塩溶液に懸濁した
ISIS5132および非相関対照ホスホロチオエートオリゴヌ
クレオチド)を腫瘍細胞接種10日後から毎日1回投与し
た。塩溶液のみの対照もまた実施された。オリゴヌクレ
オチドは0.6mg/kgまたは6.0mg/kgの用量で静脈内注射に
より与えた。腫瘍細胞接種の10、13、16、20、23および
27日後に腫瘍サイズを測定し、腫瘍体積を計算した。 腹腔内オリゴヌクレオチド投与においては、オリゴヌ
クレオチドを腫瘍細胞接種10日後から毎日1回投与し
た。塩溶液のみの対照もまた実施された。オリゴヌクレ
オチドは0.6mg/kgまたは6.0mg/kgの用量で腹腔内注射に
より与えた。腫瘍細胞接種の10、13、16、20、23および
27日後に腫瘍サイズを測定し、腫瘍体積を計算した。 実施例7 ヌードマウスにおけるColo205ヒト結腸癌腫
瘍異種移植片に対するISIS5132の効果 5x106のColo205細胞をヌードマウスの右内側腿の皮下
に移植した。オリゴヌクレオチド(塩溶液に懸濁したIS
IS5132および非相関対照ホスホロチオエートオリゴヌク
レオチド)を腫瘍細胞接種5日後から毎日1回投与し
た。塩溶液のみの対照もまた実施された。オリゴヌクレ
オチドは静脈内注射により与えた。オリゴヌクレオチド
用量は6mg/kgであった。腫瘍細胞接種の5、8、11、1
4、18、22および25日後に腫瘍サイズを測定し、腫瘍体
積を計算した。 実施例8 ヌードマウスにおける異種移植片を用いたra
f付随腫瘍のための診断アッセイ 本アッセイを用いて、raf発現により生じる腫瘍を診
断し他の腫瘍と区別する。腫瘍のバイオプシ試料を処理
して(例えば、コラゲナーゼまたはトリプシンまたは他
の常法により)、腫瘍の塊を解離させた。5x106の腫瘍
細胞を2匹またはそれ以上のヌードマウスの右内側腿の
皮下に移植した。塩溶液に懸濁したアンチセンスオリゴ
ヌクレオチド(例えば、ISIS5132)を腫瘍細胞接種4日
後から週に3回1匹またはそれ以上のマウスに投与し
た。対照マウスには塩溶液のみを投与した。オリゴヌク
レオチド用量は25mg/kgであった。処理の11日後に腫瘍
サイズを測定し、腫瘍体積を計算した。オリゴヌクレオ
チド処理マウスの腫瘍体積を対照マウスのものと比較し
た。処理マウスのraf付随腫瘍の体積は対照マウスより
測定可能なほど小さかった。raf発現以外の原因で生じ
る腫瘍はrafを標的とするオリゴヌクレオチドに応答し
ないと予測され、したがってオリゴヌクレオチド処理お
よび対照マウスの腫瘍容量は等しい。 実施例9 raf発現の検出 オリゴヌクレオチドを合成後、ポリヌクレオチドキナ
ーゼで5′末端を32Pで放射性標識した。Sambrook et a
l.,Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press,1989,第2巻,pg.11.31:−
11.32。放射性標識オリゴヌクレオチドを特異的ハイブ
リダイゼーションを起こすことができる条件下、腫瘍バ
イオプシ試料または乾癬が疑われる皮膚試料のようなra
f発現が疑われる組織または細胞試料と接触させ、試料
を洗浄して非結合オリゴヌクレオチドを除去した。試料
に残存する放射活性は結合オリゴヌクレオチドを示し、
シンチレーションカウンターまたは他の通常手段を用い
て定量した。本発明の放射標識オリゴヌクレオチドはま
たオートラジオグラフィーでも使用される。組織切片を
放射性標識オリゴヌクレオチドで処理し、上記のように
洗浄した後、標準オートラジオグラフィー法に従って写
真用感光乳剤を暴露した。乳剤を現像するとrafを発現
している領域の銀粒子のイメージが得られた。raf発現
の程度は銀粒子を定量することにより決定された。 raf発現の蛍光検出のための類似のアッセイは、フル
オレセインまたは他の蛍光標識で標識された本発明のオ
リゴヌクレオチドを使用した。標識化DNAオリゴヌクレ
オチドはヨウ素による酸化を行う標準ホスホルアミダイ
ト化学を用いて自動化DNA合成機(Applied Biosystems
モデル380B)で合成した。β−シアノエチルジイソプロ
ピル ホスホルアミダイトはApplied Biosystems(Fost
er City,CA)から購入した。フルオレセイン−標識アミ
ダイトはGlen Research(Sterling VA)から購入され
た。オリゴヌクレオチドおよび生物試料のインキュベー
ションは放射性標識オリゴヌクレオチドで記載したよう
に実施したが、raf発現を示す蛍光を検出するためには
シンチレーションカウンターの代わりに蛍光光度計また
は蛍光顕微鏡を使用した。 実施例10:A549異種移植片 5x106のA549細胞をヌードマウスの右内側腿の皮下に
移植した。塩溶液に懸濁したオリゴヌクレオチド(ISIS
5132およびCGP69845;ISIS10754としても知られる)を、
0.006から6.0mg/kgの範囲の用量で毎日1回静脈内に注
射することにより投与した。生じた腫瘍は9、12、17お
よび21日後に測定し、腫瘍容量を計算した。 実施例11:内因性c-raf発現に対するオリゴヌクレオチド
の効果 マウスを第1、2および3日に50mg/kgのオリゴヌク
レオチド用量で腹腔内注射することにより処理した。第
4日に動物を殺し、ノーザンブロット分析によるc-raf
mRNAアッセイのために器官を除去した。4群の動物を用
いた:1)オリゴヌクレオチド処理なし(塩溶液);2)陰
性対照オリゴヌクレオチドISIS1082(単純へルペスウイ
ルスを標的とする);3)陰性対照オリゴヌクレオチド41
89(マウス蛋白質キナーゼC−αを標的とする);4)げ
っし類c-rafを標的とするISIS11061。 実施例12:心臓同種移植片モデル 本質的にIsobe etal.,Circulation 1991,84,1246-125
5により記載されているように、一次血管新生化移植片
として心臓をラットまたはマウス(ドナーとは異なる
種)の腹部腔内へ移植した。オリゴヌクレオチドは7日
間アルゼットポンプを通して連続的に静脈内投与した。
心臓同種移植片の生存は腹部腔の第二の心拍の存在を聞
くことによりモニターした。 実施例13:ラットA−10平滑筋細胞を用いる増殖アッセ
イ A10細胞を10%ウシ胎児血清を加えたダルベッコ改良
イーグル培地(DMEM)を含む96−ウェルプレートに入
れ、24時間放置して付着させた。更に24時間0.2%透析
ウシ胎児血清を加えたDMEMで細胞を静止させた。静止の
最後の4時間の間に、細胞を無血清培地に溶解したISIS
11061+リポフェクチン(Gibco-BRL,Bethesda MD)で処
理した。次に、培地を除いて新鮮な培地に交換し、細胞
を10%ウシ胎児血清で刺激した。次にプレートをインキ
ュベーター内に置き、血清刺激の24および48時間後にMT
Sのホルマザンヘの変換により細胞増殖を評価した(Pro
mega 細胞増殖キット)。対照オリゴヌクレオチドISIS1
082(単純ヘルペスウイルスを標的とする非相関オリゴ
ヌクレオチド)もまた試験した。 実施例14:ラット頚動脈再狭窄モデル このモデルはBennett et al.,J.Clin.Invest.1994,9
3,820-828により記載されている。ラット頚動脈のバル
ンカテーテル拡張により動脈内膜過形成を誘導した。ラ
ットを麻酔し、20mlの塩溶液で膨張させたバルン塞栓切
除術カテーテルを通過させることにより総頚動脈損傷を
誘導した。オリゴヌクレオチドはプルロニックゲル溶液
として動脈壁の外膜表面に適用した。オリゴヌクレオチ
ドは4℃で0.25%プルロニックゲル溶液(F127、BASF C
orp.)に所望の用量で溶解した。100μlのゲル溶液を
損傷直後の総頚動脈の末端3分の1に適用した。対照ラ
ットは対照オリゴヌクレオチドを含むゲルまたはオリゴ
ヌクレオチドを含まないゲルで同様に処理した。首の傷
を縫合し、動物を回復させた。14日後にラットを殺して
しゃ血し、パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデ
ヒドで潅流して頚動脈をそのまま固定し、切り出して顕
微鏡用に調製した。動脈の断面積を計算した。 プルロニックゲル投与法と別の方法では、ラットをオ
リゴヌクレオチドの静脈注射または連続的静脈内注入
(アルゼットポンプを通して)により処理する。
Claims (7)
- 【請求項1】配列番号1および少なくとも1つの2′−
O-CH2CH2OCH3修飾を有するアンチセンスオリゴヌクレオ
チド。 - 【請求項2】請求項1記載のオリゴヌクレオチドを含
む、ヒトrafの発現を阻害するための組成物。 - 【請求項3】前記ヒトrafの発現が異常な発現である、
請求項2記載の組成物。 - 【請求項4】請求項1記載のオリゴヌクレオチドを含
む、細胞の過増殖を阻害するための組成物。 - 【請求項5】請求項1記載のオリゴヌクレオチドを含
む、異常な増殖性状態を処置するための組成物。 - 【請求項6】状態が過増殖性疾患である、請求項5記載
の組成物。 - 【請求項7】過増殖性疾患が癌、再狭窄、乾癬またはT
−細胞の活性化および成長により特徴づけられる疾患で
ある、請求項6記載の組成物。
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