JP3045922B2 - DNA extraction purification method and apparatus - Google Patents
DNA extraction purification method and apparatusInfo
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Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、多検体試料からＤＮＡ
を短時間に抽出精製するＤＮＡ抽出精製方法及び装置に
関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention
And a device for extracting and purifying DNA in a short time.
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来、大腸菌等を形質転換した形質転換
体からプラスミドＤＮＡ（核外遺伝子）を抽出精製する
方法として、煮沸法［BOILING METHOD ( Holmes, D. S.
及びM.Quigley, 1981, Anal. Biochem. 114:193) ］や
アルカリ溶菌法［ALKALINE LYSIS METHOD ( Birnboim,
H. C. 及びJ. Doly, 1979, Nucleic Acids Res. 7:151
3) ］等が行われている。しかし、これらの方法は、フ
ェノール，クロロホルム等の危険試薬を使用し、手間の
かかる方法であった。さらに、高純度の精製試料を得る
方法として、塩化セシウム密度勾配遠心分離法によるプ
ラスミドＤＮＡの抽出精製方法がある。この方法は、高
純度精製の代表的なものであるが、実施に長時間を要
し、試料処理本数は、一度に１０本程度である。また、
従来の方法を自動化した機器も開発されているが、この
ような機器も一般的に高価であったり、処理サンプル数
が少ない等の欠点を有しており、実用的には問題があっ
た。2. Description of the Related Art Conventionally, as a method for extracting and purifying plasmid DNA (extranuclear gene) from a transformant transformed with Escherichia coli or the like, a boiling method [BOILING METHOD (Holmes, DS)] has been proposed.
And M. Quigley, 1981, Anal. Biochem. 114: 193)] and the alkaline lysis method [ALKALINE LYSIS METHOD (Birnboim,
HC and J. Doly, 1979, Nucleic Acids Res. 7: 151
3)] etc. are performed. However, these methods use dangerous reagents such as phenol and chloroform and are laborious. Furthermore, as a method for obtaining a highly purified sample, there is a method for extracting and purifying plasmid DNA by cesium chloride density gradient centrifugation. This method is typical of high-purity purification, but it takes a long time to carry out, and the number of sample treatments is about 10 at a time. Also,
Devices that automate the conventional method have also been developed, but such devices are generally expensive and have drawbacks such as a small number of processed samples, and have had practical problems.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】形質転換法は、遺伝子
操作の基本技術であり、ライフサイエンスあるいはバイ
オテクノロジーの研究開発にとって不可欠である。した
がって、この方法によって得られた形質転換体（特に、
大腸菌等を形質転換したもの）から核外遺伝子ＤＮＡ
を、高い安全性のもとに、短時間かつ高純度で抽出精製
することが望まれていた。The transformation method is a basic technique for genetic manipulation and is indispensable for the research and development of life science or biotechnology. Therefore, the transformants obtained by this method (particularly,
E. coli, etc.) from extranuclear gene DNA
It has been desired to extract and purify the compound with high safety in a short time and with high purity.
【０００４】そこで、本発明の目的は、形質転換体で複
製増幅された核外遺伝子ＤＮＡ（プラスミドＤＮＡ）
を、終夜培養液から安価に抽出精製することのできるＤ
ＮＡ抽出精製方法及び装置を提供することにある。[0004] Therefore, an object of the present invention is to provide an extranuclear gene DNA (plasmid DNA) replicated and amplified in a transformant.
Can be extracted and purified at low cost from a culture solution overnight.
An object of the present invention is to provide a method and apparatus for extracting and purifying NA.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、請求項１の発明の要旨は、(1) 形質転換体培養液を
第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジに集菌する工程、
(2) 溶菌及び不要ＲＮＡの分解工程、(3) 第１のＤＮＡ
抽出精製用カートリッジによる不純物濾過工程、(4) 第
２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジでＤＮＡを吸着、洗
浄、溶出する工程を含むプラスミドＤＮＡの抽出精製方
法にある。Means for Solving the Problems To achieve the above object, the gist of the invention of claim 1 is (1) a step of collecting a transformant culture solution into a first cartridge for DNA extraction and purification,
(2) Lysis and degradation of unnecessary RNA, (3) First DNA
(4) a method for extracting and purifying plasmid DNA, which comprises a step of adsorbing, washing, and eluting the DNA with a second cartridge for DNA extraction and purification.
【０００６】上記目的を達成するため、請求項２の発明
の要旨は、少なくとも形質転換体捕集兼溶菌用フィルタ
ー（本明細書中では、トラップフィルターという）及び
メンブランフィルターを含む第１のＤＮＡ抽出精製用カ
ートリッジと、少なくともガラス繊維フィルターとガラ
スパウダー層とメンブランフィルターとを含む第２のＤ
ＮＡ抽出精製用カートリッジとを含むＤＮＡ抽出精製装
置にある。[0006] In order to achieve the above object, the gist of the invention of claim 2 is that at least a first DNA extraction method including a filter for collecting and lysing transformants (referred to as a trap filter in the present specification) and a membrane filter. A second cartridge including a purification cartridge, at least a glass fiber filter, a glass powder layer, and a membrane filter;
And a cartridge for NA extraction and purification.
【０００７】本発明にかかるＤＮＡの抽出精製方法は、
より詳しくは、以下の工程を含むことが好ましい。The method for extracting and purifying DNA according to the present invention comprises:
More specifically, it is preferable to include the following steps.
【０００８】(1) 形質転換体培養液を第１のカートリッ
ジに集菌する工程 この工程に先だって、形質転換体の終夜培養液を調製す
る。ここで、本発明の適用の対象となる形質転換体とし
ては、大腸菌［例えば、大腸菌ＪＭ１０１(ATCC 3387
6)，大腸菌ＨＢ１０１(ATCC 33694)，大腸菌ＪＭ１０９
(ATCC 53323)等］を宿主微生物として、これを形質転換
した形質転換体が代表的なものであるがこの他にアルカ
リ溶菌が可能な微生物を宿主とした形質転換体からの核
外遺伝子ＤＮＡの抽出精製にも用いることができる。こ
の形質転換は、当業者にとって公知の常法（例えば、Ha
nahan,D., 1983, J.Mol.Biol.,166 ,577）に従って行う
ことができる。上記終夜培養液は、通常適当な選択培地
に数時間終夜培養される。選択培地としては、大腸菌の
形質転換体の場合、プラスミド内の薬剤耐性遺伝子のた
め、アンピシリン(ampisilin) を代表とする抗生物質を
含むＬＢ(Luria Bertani) 培地が好ましいが、この他に
も、ＮＺＣＹＭ培地，ＳＯＣ培地等を用いることがで
き、本発明の目的の達成を阻害しない限り、これらに限
定されるものではなく、当業者にとって公知の他の培地
を用いることができる。すなわち、窒素源、炭素源、リ
ン酸塩、マグネシウム塩、微量成分等を含む天然もしく
は人工培地を使用することができる。 (1) The culture medium of the transformant is
Prior to this step, an overnight culture of the transformant is prepared. Here, as a transformant to which the present invention is applied, E. coli [for example, E. coli JM101 (ATCC 3387)]
6), E. coli HB101 (ATCC 33694), E. coli JM109
(ATCC 53323) etc.] as a host microorganism, and a transformant obtained by transforming the host microorganism is typical. In addition, extranuclear gene DNA from a transformant using a microorganism capable of alkaline lysis as a host is also exemplified. It can also be used for extraction and purification. This transformation can be performed by a conventional method known to those skilled in the art (for example, Ha
nahan, D., 1983, J. Mol. Biol., 166 , 577). The above overnight culture is usually cultured overnight in a suitable selective medium for several hours. As a selective medium, in the case of a transformant of Escherichia coli, an LB (Luria Bertani) medium containing an antibiotic represented by ampicillin is preferable because of a drug resistance gene in a plasmid. In addition, NZCYM A medium, an SOC medium, and the like can be used, and are not limited thereto, as long as the achievement of the object of the present invention is not inhibited, and other media known to those skilled in the art can be used. That is, a natural or artificial medium containing a nitrogen source, a carbon source, a phosphate, a magnesium salt, a trace component, and the like can be used.
【０００９】本工程では、調製された終夜培養液を、第
１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジに分注する。In this step, the prepared overnight culture solution is dispensed into a first cartridge for DNA extraction and purification.
【００１０】このように、終夜培養液を分注した第１の
ＤＮＡ抽出精製用カートリッジに真空ポンプによる減圧
操作あるいは遠心分離操作を施し、形質転換体を第１の
ＤＮＡ抽出精製用カートリッジ上に集菌する。すなわ
ち、第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジのトラップフ
ィルターの立体網目構造に捕集され、形質転換体が集菌
される。[0010] As described above, the first DNA extraction / purification cartridge into which the culture solution has been dispensed is subjected to a vacuum operation or a centrifugal separation operation using a vacuum pump, and the transformants are collected on the first DNA extraction / purification cartridge. Bacteria. That is, the transformant is collected on the three-dimensional network structure of the trap filter of the first cartridge for DNA extraction and purification, and the transformant is collected.
【００１１】(2) 溶菌及び不要ＲＮＡの分解工程 この工程では、溶菌用試薬を第１のＤＮＡ抽出精製用カ
ートリッジのトラップフィルター上に添加し、形質転換
体を溶菌させ、核外遺伝子（プラスミドＤＮＡ）を細胞
外に溶出させる。また、この工程では、同時に溶菌用試
薬によって不要なＲＮＡを消化する。したがって、上記
溶菌用試薬は、溶菌を行うための溶菌酵素とＲＮＡを消
化するためのＲＮＡ分解酵素（リボヌクレアーゼ）を含
むことが好ましい。溶菌酵素としては、例えば、細菌細
胞壁加水分解酵素であるリゾチーム(lysozyme)を用いる
ことができ、ＲＮＡ分解酵素としては、例えば、リボヌ
クレアーゼＡ（RNaseA）を使用することができる。これ
らは、一種のみを単独で用いても良く、また二種以上の
ものを組み合わせて用いることもできる。溶出させる核
外遺伝子（プラスミドＤＮＡ）は、周知のとおりベクタ
ーとして利用されるものであり、ここでいうプラスミド
ＤＮＡには、コスミドＤＮＡも当然含まれる。この工程
は、溶菌用試薬を第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジ
のトラップフィルターに添加した後、室温にて５―１０
分間放置して行われる。 (2) Lysis and Degradation of Unwanted RNA In this step, a lysis reagent is added to the trap filter of the first DNA extraction / purification cartridge, the transformant is lysed, and the extranuclear gene (plasmid DNA ) Is eluted extracellularly. In this step, unnecessary RNA is simultaneously digested with a lysis reagent. Therefore, the lysis reagent preferably contains a lytic enzyme for performing lysis and an RNase (ribonuclease) for digesting RNA. As the lytic enzyme, for example, lysozyme which is a bacterial cell wall hydrolase can be used, and as the RNase, for example, ribonuclease A (RNaseA) can be used. These may be used alone or in combination of two or more. The extranuclear gene (plasmid DNA) to be eluted is used as a vector as is well known, and the plasmid DNA herein naturally includes cosmid DNA. In this step, the lysis reagent is added to the trap filter of the first DNA extraction / purification cartridge, and then added at room temperature to 5-10.
It is done by leaving for a minute.
【００１２】(3) 第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジ
による不純物濾過工程 上記(2) の工程を終えた後、第１のＤＮＡ抽出精製用カ
ートリッジのトラップフィルター上に、試料の完全可溶
化処理のための試薬、例えば、０．２Ｎ水酸化ナトリウ
ム・１％ラウリル硫酸ナトリウム溶液を適量添加し、室
温にて２〜５分間放置することにより、試料の完全可溶
化処理を行う。次いで、例えば、３Ｍ酢酸カリウム（ｐ
Ｈ４．８）を適量添加して、室温にて３〜５分間放置
し、塩基性溶液を中和するとともに、細胞構成タンパク
質及び染色体ＤＮＡを凝固処理する。そして、第１のＤ
ＮＡ抽出精製用カートリッジ（当初集菌したもの）に真
空ポンプによる減圧を用いた濾過操作あるいは遠心分離
による濾過操作を施し、プラスミドＤＮＡを含む抽出液
を分離する（第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジの下
部より抽出される）。 (3) First Cartridge for DNA Extraction and Purification
After finishing the process of impurity filtration step above (2) by, on the trap filter of the first DNA extraction and purification cartridge, reagents for complete solubilization treatment of the sample, for example, 0.2 N sodium hydroxide - 1 The sample is completely solubilized by adding an appropriate amount of a sodium lauryl sulfate solution and leaving the mixture at room temperature for 2 to 5 minutes. Then, for example, 3M potassium acetate (p
H4.8) is added in an appropriate amount, and left at room temperature for 3 to 5 minutes to neutralize the basic solution and coagulate cell constituent proteins and chromosomal DNA. And the first D
The NA extraction / purification cartridge (collected at first) is subjected to a filtration operation using a vacuum pump under reduced pressure or a filtration operation by centrifugation to separate an extract containing the plasmid DNA (the first DNA extraction / purification cartridge). Extracted from the bottom).
【００１３】(4) 第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジ
でＤＮＡを吸着、洗浄、溶出する工程 この工程では、まず、上記(3)の工程で得られた抽出液
及び等量のＤＮＡ吸着のための試薬、例えば、８Ｍヨウ
化ナトリウムＮａＩを第２のＤＮＡ抽出精製用カートリ
ッジに添加する。これは、ガラスパウダーへのＤＮＡ吸
着はカオトロピックイオン（chaotropic ion）存在下で
促進されることに基づいている。さらにアガロースゲル
電気泳動で分離したＤＮＡ断片をアガロースゲルから抽
出精製する方法にもガラスパウダーへのＤＮＡ吸着法が
応用されている（Vogelstein, B.及び D. Gillespie, 1
979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:615)。カオトロ
ピックイオンを生成する試薬として、ＬｉＣｌＯ4 ，Ｋ
Ｉ，ＮａＩ，ＬｉＣｌ，ＮａＣＨＯ2 等があるが、Ｎａ
Ｉ（ヨウ化ナトリウム）の入手が容易である。次いで、
この第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジに、真空ポン
プによる減圧を用いた操作あるいは遠心分離による操作
を施し、プラスミドＤＮＡを、吸着させる。このカート
リッジは、後述するように、ガラス繊維フィルター（二
層）とガラスパウダー層とメンブランフィルターとから
成る少なくとも四重の構造である。プラスミドＤＮＡ
は、主として、ガラスパウダー層に吸着される。さら
に、この第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジに洗浄用
緩衝液、例えば、１０ｍＭトリス―塩酸（ｐＨ８．０）
・１ｍＭ ＥＤＴＡ・０．２ＭＮａＣｌ・５０％エタノ
ールを添加し、真空ポンプによる減圧を用いた操作ある
いは遠心分離による操作を施し、洗浄を行う。最後に、
この第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジに、溶出用緩
衝液例えば、滅菌蒸留水／１０ｍＭトリス―塩酸（ｐＨ
８．０）・１ｍＭ ＥＤＴＡを５０―１００μｌ添加し
て、真空ポンプによる減圧を用いた操作あるいは遠心分
離による操作を施し、プラスミドＤＮＡのみを溶出精製
する。 (4) Second Cartridge for DNA Extraction and Purification
In this step, first, the extract obtained in the above step (3) and a reagent for adsorbing an equal amount of DNA, for example, 8M sodium iodide NaI are added to the second step. Add to the cartridge for DNA extraction and purification. This is based on the fact that DNA adsorption to glass powder is promoted in the presence of chaotropic ions. In addition, a DNA adsorption method onto glass powder is also applied to a method for extracting and purifying DNA fragments separated by agarose gel electrophoresis from agarose gel (Vogelstein, B. and D. Gillespie, 1).
979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 615). LiClO 4 , K as a reagent for generating chaotropic ions
I, NaI, LiCl, NaCHO 2, etc.
It is easy to obtain I (sodium iodide). Then
The second cartridge for DNA extraction and purification is subjected to an operation using reduced pressure by a vacuum pump or an operation by centrifugation to adsorb the plasmid DNA. This cartridge has at least a quadruple structure including a glass fiber filter (two layers), a glass powder layer, and a membrane filter, as described later. Plasmid DNA
Is mainly adsorbed to the glass powder layer. Further, a washing buffer such as 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.0) is added to the second cartridge for DNA extraction and purification.
Washing is performed by adding 1 mM EDTA, 0.2 M NaCl, 50% ethanol and performing an operation using reduced pressure by a vacuum pump or an operation by centrifugation. Finally,
An elution buffer such as sterile distilled water / 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH
8.0) Add 50-100 μl of 1 mM EDTA, and perform operation under reduced pressure by a vacuum pump or operation by centrifugation to elute and purify only plasmid DNA.
【００１４】[0014]
【実施例】以下に、本発明にかかるＤＮＡ抽出装置を添
付図面に示した実施例を参照しながら説明し、続いて、
このＤＮＡ抽出装置を用いて行った本発明にかかるＤＮ
Ａ抽出方法の試験例を説明する。しかし、これらの実施
例あるいは試験例は、本発明の技術的範囲を限定する意
図のものではなく、本発明の技術的思想の範囲内におけ
る、変更、付加、修飾は全て本発明の技術的範囲に含ま
れる。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, a DNA extraction device according to the present invention will be described with reference to the embodiments shown in the accompanying drawings.
DN according to the present invention performed using this DNA extraction device
A test example of the A extraction method will be described. However, these examples or test examples are not intended to limit the technical scope of the present invention, and all changes, additions, and modifications within the scope of the technical idea of the present invention are within the technical scope of the present invention. include.
【００１５】図１は、本発明にかかるＤＮＡ抽出装置の
うち、第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジの実施例を
示し、図において、１はトラップフィルター、２はメン
ブランフィルター、３はカートリッジ容器である。FIG. 1 shows an embodiment of a first cartridge for DNA extraction and purification in a DNA extraction apparatus according to the present invention. In the drawing, 1 is a trap filter, 2 is a membrane filter, and 3 is a cartridge container. .
【００１６】トラップフィルター１は、主として形質転
換体である大腸菌等の菌体を捕集し、溶菌するのための
層である。材質としては、ガラス繊維フィルターやポリ
エチレン樹脂フィルターや不織布フィルター等が好まし
く、大腸菌等の菌体を立体的に捕集する特性を備えてい
ることが好ましい。具体的には、東洋濾紙社製のガラス
繊維フィルター、スペイシーケミカル社製のポリエチレ
ン樹脂フィルター等を使用することができる。The trap filter 1 is a layer mainly for collecting and lysing cells such as Escherichia coli which is a transformant. The material is preferably a glass fiber filter, a polyethylene resin filter, a non-woven fabric filter, or the like, and preferably has a property of three-dimensionally collecting cells such as Escherichia coli. Specifically, a glass fiber filter manufactured by Toyo Roshi Kaisha, a polyethylene resin filter manufactured by Spacey Chemical Co., and the like can be used.
【００１７】メンブランフィルター２は、主として凝固
タンパク，染色体ＤＮＡ等の不要物の濾過・除去のため
の層である。材質としては、酢酸セルロース，ポリフッ
化ビニリデン等が好ましく、生物学的不活性，低タンパ
ク吸着性の特性を備えていることが好ましい。具体的に
は、東洋濾紙社製のセルロースアセテートタイプメンブ
ランフィルター、ミリポア社製のデュラポアメンブラン
等を使用することができる。The membrane filter 2 is a layer for mainly filtering and removing unnecessary substances such as coagulated proteins and chromosomal DNA. As the material, cellulose acetate, polyvinylidene fluoride, and the like are preferable, and it is preferable that the material has characteristics of being biologically inert and having low protein adsorption. Specifically, a cellulose acetate type membrane filter manufactured by Toyo Roshi Kaisha, a Durapore membrane manufactured by Millipore, or the like can be used.
【００１８】カートリッジ容器３は、通常、外容器及び
フィルター固定用内筒で構成し、本体部分は、通常、円
柱状とし、大きさとしては、φ１０〜２０ｍｍ，長さ３
０〜５０ｍｍのものを使用することができる。The cartridge container 3 is usually composed of an outer container and an inner cylinder for fixing the filter, and the main body is usually cylindrical, having a size of φ10 to 20 mm and a length of 3 mm.
Those having a size of 0 to 50 mm can be used.
【００１９】なお、図１の実施例では、トラップフィル
ター１、メンブランフィルター２、カートリッジ容器３
のみを模式的に表示しているが、必要に応じて他にマイ
クロチューブを設けることもできる。また、このような
カートリッジを使用する際に、必要な周辺機器、例え
ば、遠心機もしくは真空ポンプ及び吸引用カートリッジ
スタンドを、本発明の適用に伴って使用する。In the embodiment shown in FIG. 1, the trap filter 1, the membrane filter 2, the cartridge container 3
Although only one is schematically shown, other microtubes can be provided as needed. In using such a cartridge, necessary peripheral devices such as a centrifuge or a vacuum pump and a cartridge stand for suction are used in conjunction with the application of the present invention.
【００２０】図２は、本発明にかかるＤＮＡ抽出装置の
うち、第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジの実施例を
示し、図において、２１はガラス繊維フィルター、２２
はガラスパウダー層、２３はガラス繊維フィルター、２
４はメンブランフィルター、２５はカートリッジ容器で
ある。FIG. 2 shows an embodiment of a second cartridge for DNA extraction and purification in the DNA extraction apparatus according to the present invention. In the drawing, reference numeral 21 denotes a glass fiber filter;
Is a glass powder layer, 23 is a glass fiber filter, 2
4 is a membrane filter, 25 is a cartridge container.
【００２１】ガラス繊維フィルター２１，２３は、主と
してプラスミド吸着補助のための層である。材質として
は、微細ホウケイ酸塩ガラス繊維等が好ましく、生化学
的液体に対して不活性の特性を備えていることが好まし
い。具体的には、東洋濾紙社製のＧＡ―１００，２０
０，ＧＣ―５０、ワットマン社製のＧＦシリーズ等を使
用することができる。The glass fiber filters 21 and 23 are layers mainly for assisting plasmid adsorption. The material is preferably a fine borosilicate glass fiber or the like, and preferably has characteristics of being inert to a biochemical liquid. Specifically, GA-100, 20 manufactured by Toyo Roshi Kaisha, Ltd.
0, GC-50, GF series manufactured by Whatman and the like can be used.
【００２２】ガラスパウダー層２２は、主としてＤＮＡ
吸着のための層である。材質としては、シリカマトリッ
クス等が好ましく、水中沈降速度０．２５ｃｍ／ｍｉｎ
以下の特性を備えていることが好ましい。具体的には、
旭硝子社製のガラスパウダー、ＢＩＯ１０１社製のＧＬ
ＡＳＳＭＩＬＫTM等を使用することができる。The glass powder layer 22 is mainly composed of DNA
It is a layer for adsorption. As the material, a silica matrix or the like is preferable, and the sedimentation velocity in water is 0.25 cm / min.
It is preferable to have the following characteristics. In particular,
Asahi Glass Glass Powder, BIO101 GL
ASSMILK ™ or the like can be used.
【００２３】メンブランフィルター２４、カートリッジ
容器２５の機能及び材質等は、上記した図１のメンブラ
ンフィルター２、カートリッジ容器３と同様である。The functions and materials of the membrane filter 24 and the cartridge container 25 are the same as those of the membrane filter 2 and the cartridge container 3 shown in FIG.
【００２４】第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジ作製
はメンブランフィルター，ガラス繊維フィルターを順に
積層した後、ガラスパウダー懸濁液２０〜１００μｌを
添加する。このカートリッジを減圧吸引ないしはスイン
グロータで遠心してガラスパウダーをガラス繊維フィル
ター上に均一に密着させ、さらにガラス繊維フィルター
を積層して四重の層構造カートリッジを作製する。A second cartridge for DNA extraction and purification is prepared by laminating a membrane filter and a glass fiber filter in this order, and then adding 20 to 100 μl of a glass powder suspension. The cartridge is vacuum-suctioned or centrifuged by a swing rotor to uniformly adhere the glass powder on the glass fiber filter, and the glass fiber filter is laminated to produce a four-layer cartridge.
【００２５】なお、図２の実施例では、ガラス繊維フィ
ルター２１、ガラスパウダー層２２、ガラス繊維フィル
ター２３、メンブランフィルター２４、カートリッジ容
器２５のみを模式的に表示しているが、必要に応じて他
にカートリッジフィルターの下に精製ＤＮＡ溶出液を受
けるマイクロチューブを設けることもできる。また、こ
のようなカートリッジを使用する際に、必要な周辺機
器、例えば、遠心機もしくは真空ポンプ及び吸引用カー
トリッジスタンドを、本発明の適用に伴って使用する。In the embodiment of FIG. 2, only the glass fiber filter 21, the glass powder layer 22, the glass fiber filter 23, the membrane filter 24, and the cartridge container 25 are schematically shown. A microtube for receiving the purified DNA eluate may be provided below the cartridge filter. In using such a cartridge, necessary peripheral devices such as a centrifuge or a vacuum pump and a cartridge stand for suction are used in conjunction with the application of the present invention.
【００２６】上記第１，第２のＤＮＡ抽出精製用カート
リッジの各々の層を構成する素材は、それら自体市場に
おいて安価に入手できるものである。したがって、本発
明にかかる装置の提供にあたり製造上のコスト的負担は
小さい。The materials constituting each layer of the first and second cartridges for extracting and purifying DNA can be obtained at low cost in the market. Therefore, in providing the apparatus according to the present invention, the manufacturing cost is small.
【００２７】次に、上記図１，図２に示した第１，第２
のＤＮＡ抽出精製用カートリッジを用いて行った本発明
にかかるＤＮＡ抽出精製方法の試験例を示す。Next, the first and second sections shown in FIGS.
1 shows a test example of the DNA extraction / purification method according to the present invention performed using the DNA extraction / purification cartridge of Example 1.
【００２８】試験例(1) 形質転換体培養液を第１のカートリッジに集菌する
工程 この工程に先だって、形質転換体の終夜培養液を調製し
た。大腸菌［Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１(ATCC 33694)を
宿主微生物として、これをＨａｎａｈａｎの方法（Hana
han,D., 1983, J.Mol.Biol.,166 ,577）に従い形質転換
した形質転換体を使用した。選択培地としては、アンピ
シリン(ampisilin) を含むルリア・ベルタニ(LuriaBert
ani) 培地を使用した。この培地の組成は、以下のとお
りであった。 Bacto-tryptone ： １０ｇ／Ｌ Bacto-yeast extract ： ５ｇ／Ｌ NaCl ： １０ｇ／Ｌ Ampicilin ： ３５〜５０ｍｇ／Ｌ 水酸化ナトリウムによってｐＨを７．５に調整した。こ
の培地３ｍｌを使用して、終夜培養を行った。なお、培
地の容量は、図１，図２の第１，第２のＤＮＡ抽出精製
用カートリッジを用いる場合、１―３ｍｌとすることが
好適である。調製された終夜培養液を、第１のＤＮＡ抽
出精製用カートリッジに分注した。このように、終夜培
養液を分注した第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジに
遠心分離操作を施し、形質転換体を第１のＤＮＡ抽出精
製用カートリッジのトラップフィルターに補集した。Test Example (1) Collecting the culture of the transformant into the first cartridge
Step Prior to this step, an overnight culture of the transformant was prepared. E. coli [ E. Coli HB101 The (ATCC 33694) as a host microorganism, which Hanahan method (Hana
Han, D., 1983, J. Mol. Biol., 166 , 577). As a selection medium, Luria Bertani containing ampicilin was used.
ani) Medium was used. The composition of this medium was as follows. Bacto-tryptone: 10 g / L Bacto-yeast extract: 5 g / L NaCl: 10 g / L Ampicilin: 35-50 mg / L The pH was adjusted to 7.5 with sodium hydroxide. Using 3 ml of this medium, culture was performed overnight. When the first and second cartridges for DNA extraction and purification shown in FIGS. 1 and 2 are used, the volume of the medium is preferably 1-3 ml. The prepared overnight culture solution was dispensed into a first cartridge for DNA extraction and purification. As described above, the first cartridge for DNA extraction and purification to which the culture solution was dispensed overnight was subjected to centrifugation, and the transformant was collected on the trap filter of the first cartridge for DNA extraction and purification.
【００２９】(2) 溶菌及び不要ＲＮＡの分解工程 ２００μｌの溶菌用試薬を上記第１のＤＮＡ抽出精製用
カートリッジのトラップフィルターに添加し、形質転換
体を溶菌させ、核外遺伝子（プラスミドＤＮＡ）を細胞
外に溶出させた。また、この工程で、同時に溶菌用試薬
によって不要なＲＮＡを消化した。上記溶菌用試薬は、
溶菌酵素としては、リゾチーム(lysozyme)を含み、ＲＮ
Ａ分解酵素として、リボヌクレアーゼＡを含むものをを
使用した。本工程は、溶菌用試薬を第１のＤＮＡ抽出精
製用カートリッジのトラップフィルターに添加した後、
室温にて１０分間放置して行った。 (2) Lysis and Degradation Step of Unwanted RNA 200 μl of the lysis reagent is added to the trap filter of the first cartridge for DNA extraction and purification, the transformant is lysed, and the extranuclear gene (plasmid DNA) is added. Eluted outside the cells. In this step, unnecessary RNA was simultaneously digested with a lysis reagent. The lysis reagent,
Lytic enzymes include lysozyme, RN
As the A-degrading enzyme, one containing ribonuclease A was used. In this step, after adding the lysis reagent to the trap filter of the first cartridge for DNA extraction and purification,
The test was carried out by leaving at room temperature for 10 minutes.
【００３０】(3) 第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジ
による不純物濾過工程 上記(2) の工程を終えた後、第１のＤＮＡ抽出精製用カ
ートリッジのトラップフィルターに、試料の完全可溶化
処理のための試薬として０．２Ｎ水酸化ナトリウム・１
％ラウリル硫酸ナトリウム溶液を４００μｌ添加し、室
温にて５分間放置することにより、試料の完全可溶化処
理を行った。次いで、３Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ４．８）
を３００μｌ添加して、室温にて５分間放置し、塩基性
溶液を中和するとともに、細胞構成タンパク質及び染色
体ＤＮＡを凝固処理した。そして、第１のＤＮＡ抽出精
製用カートリッジ（当初集菌したもの）に遠心分離によ
る濾過操作を施し、プラスミドＤＮＡを含む抽出液を分
離した（第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジの下部よ
り抽出した）。 (3) First Cartridge for DNA Extraction and Purification
After the above step (2) is completed, 0.2 N sodium hydroxide / 1, as a reagent for complete solubilization of the sample, is added to the trap filter of the first DNA extraction / purification cartridge.
The sample was completely solubilized by adding 400 μl of a 100% sodium lauryl sulfate solution and leaving it at room temperature for 5 minutes. Then, 3M potassium acetate (pH 4.8)
Was added and left at room temperature for 5 minutes to neutralize the basic solution and to coagulate cell constituent proteins and chromosomal DNA. Then, a filtration operation by centrifugation was performed on the first cartridge for DNA extraction and purification (collected at the beginning), and an extract containing plasmid DNA was separated (extracted from the lower portion of the first cartridge for DNA extraction and purification). .
【００３１】(4) 第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジ
でＤＮＡを吸着、洗浄、溶出する工程 この工程では、まず、上記(3) の工程で得られた抽出液
及び等量のＤＮＡ吸着のための試薬として８Ｍヨウ化ナ
トリウムＮａＩを第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジ
に添加した。次いで、この第２のＤＮＡ抽出精製用カー
トリッジに、遠心分離による操作を施し、プラスミドＤ
ＮＡを、このカートリッジのガラス繊維フィルター及び
ガラスパウダーに吸着させた。。さらに、この第２のＤ
ＮＡ抽出精製用カートリッジに洗浄用緩衝液として、１
０ｍＭトリス―塩酸（ｐＨ８．０）・１ｍＭ ＥＤＴＡ
・０．２ＭＮａＣｌ・５０％エタノールを３５０μｌ添
加し、遠心分離による操作を施し、洗浄を行った。最後
に、この第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジに、溶出
用緩衝液として、蒸留水／１０ｍＭトリス―塩酸（ｐＨ
８．０）・１ｍＭ ＥＤＴＡを１００μｌ添加して、遠
心分離による操作を施し、プラスミドＤＮＡのみを溶出
精製した。 (4) Second Cartridge for DNA Extraction and Purification
In this step, first, the extract obtained in the above step (3) and 8M sodium iodide NaI as a reagent for adsorbing an equal amount of DNA are subjected to the second DNA extraction. Added to the purification cartridge. Next, the second cartridge for DNA extraction and purification was subjected to an operation by centrifugation to obtain plasmid D.
NA was adsorbed on the glass fiber filter and glass powder of the cartridge. . Furthermore, this second D
As a washing buffer in a cartridge for NA extraction and purification, 1
0 mM Tris-HCl (pH 8.0) 1 mM EDTA
・ 350 μl of 0.2 M NaCl · 50% ethanol was added thereto, and an operation by centrifugation was performed to perform washing. Finally, distilled water / 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH
8.0) 100 μl of 1 mM EDTA was added, and the mixture was centrifuged to elute and purify only the plasmid DNA.
【００３２】図３に、上記試験例で精製されたプラスミ
ドＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分離の結果を示す。
夾雑物であるＲＮＡ，染色体由来ＤＮＡ，タンパク質の
混入は全く見られず、塩化セシウム密度勾配超遠心分離
精製プラスミドＤＮＡと同等以上の純度が得られた。し
たがって、各種解析実験に支障なく使用可能であること
が確認された。FIG. 3 shows the results of agarose gel electrophoresis separation of the plasmid DNA purified in the above test example.
No contamination of RNA, DNA derived from chromosome, or protein, which is a contaminant, was observed at all, and purity equal to or higher than that of plasmid DNA purified by cesium chloride density gradient ultracentrifugation was obtained. Therefore, it was confirmed that it can be used without any trouble in various analysis experiments.
【００３３】[0033]
【発明の効果】以上より明らかなように、本発明によれ
ば、形質転換体で複製増幅された核外遺伝子ＤＮＡ（プ
ラスミドＤＮＡ）を、終夜培養液から安価に抽出精製す
ることのできるＤＮＡ抽出精製方法及び装置が提供され
る。As is clear from the above, according to the present invention, DNA extraction that enables inexpensive extraction and purification of extranuclear gene DNA (plasmid DNA) replicated and amplified in a transformant from an overnight culture. A purification method and apparatus are provided.
【図１】第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジの構造を
示す模式図である。FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of a first cartridge for DNA extraction and purification.
【図２】第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジの構造を
示す模式図である。FIG. 2 is a schematic view showing the structure of a second cartridge for DNA extraction and purification.
【図３】試験例の電気泳動の結果を示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing the results of electrophoresis of a test example.
１ トラップフィルター ２ メンブランフィルター ３ カートリッジ容器 ２１ ガラス繊維フィルター ２２ ガラスパウダー層 ２３ ガラス繊維フィルター ２４ メンブランフィルター ２５ カートリッジ容器 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Trap filter 2 Membrane filter 3 Cartridge container 21 Glass fiber filter 22 Glass powder layer 23 Glass fiber filter 24 Membrane filter 25 Cartridge container
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12M 1/00 - 1/42 C07H 21/00 - 21/04 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)────────────────────────────────────────────────── ─── Continued on the front page (58) Field surveyed (Int. Cl. 7 , DB name) C12M 1/00-1/42 C07H 21/00-21/04 C12N 15/00-15/90 BIOSIS (DIALOG) ) WPI (DIALOG)
Claims (4)
培養液を集菌し、該トラップフィルター上に溶菌試薬を
添加して上記形質転換体を溶菌させ、核外遺伝子を細胞
外に溶出させると共に不要なＲＮＡを消化し、さらに、
試料の完全溶化処理を行うと共に細胞構成タンパク質及
び染色体ＤＮＡを凝固処理し、上記核外遺伝子を含む抽
出液を分離し、しかる後に下部より該抽出液を抽出する
第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジと、上記抽出液中
の核外遺伝子をガラスパウダーに吸着し、該ガラスパウ
ダーを洗浄し、しかる後に溶出用緩衝液を添加して核外
遺伝子のみを溶出精製する第２のＤＮＡ抽出精製用カー
トリッジとを含むＤＮＡ抽出精製装置。1. A culture of a transformant culture is collected with a trap filter, a lysis reagent is added to the trap filter to lyse the transformant, extranuclear genes are eluted outside the cell, and unnecessary RNA is added. Digestion, and
A first DNA extraction / purification cartridge for performing complete solubilization of the sample, coagulating cell constituent proteins and chromosomal DNA, separating an extract containing the extranuclear gene, and then extracting the extract from the lower part; A second DNA extraction and purification cartridge for adsorbing the extranuclear gene in the extract to glass powder, washing the glass powder, and then adding an elution buffer to elute and purify only the extranuclear gene. A DNA extraction and purification device comprising:
ブランフィルターを含む第１のＤＮＡ抽出精製用カート
リッジと、少なくともガラス繊維フィルターとガラスパ
ウダー層とメンブランフィルターとを含む第２のＤＮＡ
抽出精製用カートリッジとを含むＤＮＡ抽出精製装置。2. A first DNA extraction / purification cartridge including at least a trap filter and a membrane filter, and a second DNA including at least a glass fiber filter, a glass powder layer, and a membrane filter.
A DNA extraction / purification apparatus comprising an extraction / purification cartridge.
直接使用する請求項２の第１のＤＮＡ抽出精製用カート
リッジ。3. The first cartridge for DNA extraction and purification according to claim 2, which is directly used for implementing the apparatus for DNA extraction and purification according to claim 2.
直接使用する請求項２の第２のＤＮＡ抽出精製用カート
リッジ。4. The second cartridge for DNA extraction and purification according to claim 2, which is used directly for implementing the DNA extraction and purification apparatus according to claim 2.
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