JP2001333763A - Automatic separation and extraction apparatus and extraction method using the apparatus - Google Patents
Automatic separation and extraction apparatus and extraction method using the apparatusInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、医学、農学、理
学、薬学における遺伝子工学分野または分子生物学分野
において、遺伝子物質（染色体、ゲノムＤＮＡ、プラス
ミドＤＮＡ，ＲＮＡ）の分離，抽出，回収作業を行う自
動分離抽出装置及びその抽出方法に関するものである。The present invention relates to the separation, extraction and recovery of genetic materials (chromosomes, genomic DNA, plasmid DNA, RNA) in the fields of genetic engineering or molecular biology in medicine, agriculture, science, and pharmacy. The present invention relates to an automatic separation / extraction device and an extraction method therefor.
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来から遺伝子物質であるプラスミドＤ
ＮＡの抽出作業には、遠心機または吸引機を有する抽出
装置が使用されている。プラスミドＤＮＡを抽出する工
程は、大腸菌培養液から大腸菌を遠心分離する集菌工程
（ａ）と、集菌した大腸菌を溶かし内包物を取り出す溶
菌工程（ｂ）と、取り出した内包物からプラスミドＤＮ
Ａを取り出す精製工程（ｃ）とに大別することができ、
これら工程（ａ）〜（ｃ）には分離作業が存在してい
る。例えば集菌工程（ａ）では培養液と大腸菌とを分離
し、溶菌工程（ｂ）では大腸菌の殻と内包物であるプラ
スミドＤＮＡ等とを分離し、精製工程（ｃ）ではプラス
ミドＤＮＡと他の不要物とを分離している。2. Description of the Related Art Conventionally, plasmid D which is a genetic material
An extraction device having a centrifuge or a suction device is used for the NA extraction operation. The steps of extracting plasmid DNA include a bacteria collection step (a) of centrifuging Escherichia coli from the Escherichia coli culture solution, a lysis step (b) of dissolving the collected Escherichia coli and removing inclusions, and a plasmid DN from the removed inclusions.
A can be roughly classified into a purification step (c) for extracting A,
Separation work exists in these steps (a) to (c). For example, in the cell collection step (a), the culture solution and Escherichia coli are separated, in the lysis step (b), the shell of Escherichia coli and plasmid DNA or the like as inclusions are separated, and in the purification step (c), the plasmid DNA and other E. coli are separated. Separated from unnecessary materials.
【０００３】上記分離作業には、図４に示すよう遠心機
による遠心分離法（１）と、図５に示すよう吸引機によ
るフィルタ分離法（２）とがある。遠心分離法（１）と
は、サンプルを収容する９６穴のディープウェルを有す
るマイクロプレートから成るサンプルプレート１６（以
下ディーププレートと称す）を遠心機にかけた後、当該
遠心機による遠心力を利用して上記サンプルを上清と沈
殿物とに分離するものである。これに対して、フィルタ
分離法（２）とは、９６穴のディープウェルを有する廃
液用マイクロプレート１８（以下廃液用プレートと称
す）と、この廃液用プレート１８上に着脱可能に配され
且つサンプルの注入されるフィルタ付プレート１７を有
するプレート組体２７を吸引機にかけた後、当該吸引機
の吸引力を利用して上記サンプルをフィルタ１７aでト
ラップされる物質とフィルタ１７aを透過し廃液用プレ
ート１８で保持される物質とに分離するものである。な
お、上記プレート組体２７の形状は、図４に示すディー
ププレート１６の形状と同形状を成している。[0003] The separation operation includes a centrifugal separation method (1) using a centrifugal machine as shown in FIG. 4 and a filter separation method (2) using a suction machine as shown in FIG. The centrifugation method (1) is a method in which a sample plate 16 (hereinafter, referred to as a deep plate) formed of a microplate having a 96-well deep well for accommodating a sample is centrifuged, and the centrifugal force of the centrifuge is used. To separate the sample into a supernatant and a precipitate. On the other hand, the filter separation method (2) includes a waste liquid microplate 18 having a 96-well deep well (hereinafter referred to as a waste liquid plate), After the plate assembly 27 having the filter-equipped plate 17 to be injected is applied to the suction device, the sample is permeated through the filter 17a and the waste liquid plate by using the suction force of the suction device to transmit the sample through the filter 17a. This is separated from the substance held at 18. The shape of the plate assembly 27 is the same as the shape of the deep plate 16 shown in FIG.
【０００４】次に上述した２つの分離法（１），（２）
によるプラスミドＤＮＡ抽出のプロトコールを図６及び
図７を用いて説明する。図６及び図７に示すよう遺伝子
物質の分離抽出として例えばプラスミドＤＮＡの場合に
は一般的に「アルカリＳＤＳ法」が用いられている。こ
のアルカリＳＤＳ法とは、プラスミドＤＮＡの入った大
腸菌を界面活性剤であるＳＤＳ（ソディウムドデシルサ
ルフェイト）により破壊し、同時に行なうアルカリ処理
によって大腸菌の染色体を変性させ、プラスミドＤＮＡ
のみを抽出するものである。Next, the above two separation methods (1) and (2)
A protocol for plasmid DNA extraction according to the present invention will be described with reference to FIGS. 6 and 7. FIG. As shown in FIGS. 6 and 7, for example, in the case of plasmid DNA, the "alkaline SDS method" is generally used for separation and extraction of genetic material. In the alkaline SDS method, Escherichia coli containing plasmid DNA is destroyed by SDS (sodium dodecyl sulfate), which is a surfactant, and the chromosome of Escherichia coli is denatured by alkali treatment that is carried out simultaneously.
Only those that are extracted.
【０００５】上記方法によるプラスミドＤＮＡの抽出工
程には、「培養した大腸菌を遠心により沈殿させ、沈殿
以外の溶液である培養液を除き、そして沈殿にグルコー
スの入ったトリス等の緩衝液を加え、沈殿がなくなるま
で攪拌し、この溶液にＳＤＳの入ったアルカリ溶液を加
え温和に攪拌後、５分間程度放置し、その後、酸性溶液
を加えて液を中性にし、懸濁する」作業があるが、この
作業は図６及び図７の第１工程〜第５工程に示すよう双
方の分離法（１），（２）にて共通して行われているも
のである。そして、共通の作業工程を経た後、上述した
分離法（１）または分離法（２）のどちらか一方の処理
法に従ってプラスミドＤＮＡを抽出している。[0005] In the step of extracting plasmid DNA by the above-mentioned method, "the cultured Escherichia coli is sedimented by centrifugation, the culture solution other than the sediment is removed, and a buffer such as Tris containing glucose is added to the sediment. Stir until the precipitate disappears, add an alkaline solution containing SDS to this solution, stir gently, leave it for about 5 minutes, and then add an acidic solution to neutralize the solution and suspend it. This operation is common to both separation methods (1) and (2) as shown in the first to fifth steps of FIGS. After passing through a common working process, plasmid DNA is extracted according to one of the above-mentioned separation methods (1) and (2).
【０００６】以下に上述した分離法（１）または分離法
（２）の第６工程以降を説明する。 ［遠心分離法（１）］図６の第６工程〜第１１工程に示
すよう、懸濁した溶液を遠心することで、染色体、ＲＮ
Ａ、タンパク質等の不要物を沈殿させ、上清中にプラス
ミドＤＮＡを存在させることができるため、この上清を
別の容器に移し、エタノールかイソプロパノールを加え
て遠心により沈殿させる。遠心後、沈殿以外の溶液を除
去し、沈殿に洗浄液を入れて洗浄し、遠心により再沈殿
させ、沈殿物以外の溶液を除去する。この洗浄工程を２
回以上繰り返した後、沈殿しているプラスミドＤＮＡに
滅菌蒸留水又はＴＥ等の適当な緩衝液を分注した後、攪
拌を行いプラスミドＤＮＡ溶液を得る。 ［フィルタ分離法（２）］図７の第６工程〜第９工程に
示すよう、懸濁した溶液をプラスミドＤＮＡとそれ以外
の不要物とを分けるためのフィルタ（以下フィルタＡと
称す）に分注し、そのフィルタＡを吸引装置内に置いた
プラスミドＤＮＡを吸着させ易くするための溶液が入っ
たプラスミドＤＮＡを吸着させるフィルタ（以下フィル
タＢと称す）上にのせ吸引を行なうことにより、フィル
タＡ内の懸濁溶液からプラスミドＤＮＡ溶液のみをフィ
ルタＢに移す。その後、フィルタＡを吸引装置から取り
除き、フィルタＢの下に空の容器を置いて再び吸引装置
内に置き、吸引を行なうことによりプラスミドＤＮＡを
フィルタに吸着させ、溶液をフィルタＢの下の容器に通
過させる。フィルタＢに洗浄液を分注し、吸引を行なう
ことによりフィルタＢ内のプラスミドＤＮＡを洗浄す
る。この洗浄工程を２回以上繰り返した後、フィルタＢ
の下の容器を別の空の容器に変え、フィルタに滅菌蒸留
水又はＴＥ等の適当な緩衝液を入れて吸引を行い、フィ
ルタＢ内のプラスミドＤＮＡをフィルタＢの下の容器に
溶出させプラスミドＤＮＡを得る。なお、上述したよう
に第６工程〜第９工程における機器として吸引機を用い
て説明したが、この吸引機の代わりに遠心機を用いても
可能である。Hereinafter, the sixth and subsequent steps of the above-described separation method (1) or (2) will be described. [Centrifugation method (1)] As shown in the sixth step to the eleventh step of FIG.
A. Unnecessary substances such as proteins are precipitated, and plasmid DNA can be present in the supernatant. Therefore, the supernatant is transferred to another container, ethanol or isopropanol is added, and the supernatant is precipitated by centrifugation. After the centrifugation, the solution other than the precipitate is removed, and the precipitate is washed with a washing solution, and re-precipitated by centrifugation to remove the solution other than the precipitate. This washing step is
After repetition of at least twice, an appropriate buffer such as sterilized distilled water or TE is dispensed to the precipitated plasmid DNA, and the mixture is stirred to obtain a plasmid DNA solution. [Filter Separation Method (2)] As shown in the sixth to ninth steps of FIG. 7, the suspended solution is divided into filters (hereinafter, referred to as filters A) for separating plasmid DNA from other unnecessary substances. The filter A is placed on a filter (hereinafter referred to as a filter B) for adsorbing plasmid DNA containing a solution for facilitating adsorption of plasmid DNA, which is placed in a suction device, and suction is performed. Transfer only the plasmid DNA solution from the suspension solution into filter B. Thereafter, the filter A is removed from the suction device, and an empty container is placed under the filter B and placed again in the suction device. By performing suction, the plasmid DNA is adsorbed on the filter, and the solution is transferred to the container below the filter B. Let it pass. The washing solution is dispensed to the filter B, and the plasmid DNA in the filter B is washed by suction. After repeating this washing step two or more times, the filter B
Change the container below to another empty container, put sterile distilled water or an appropriate buffer such as TE into the filter, aspirate, and elute the plasmid DNA in filter B into the container below filter B. Obtain DNA. Note that, as described above, a suction machine has been described as an apparatus in the sixth to ninth steps, but a centrifuge may be used instead of the suction machine.
【０００７】[0007]
【発明が解決しようとする課題】最近、生物の設計図で
あるゲノムの解析が盛んになるにつれ、数万サンプル／
日以上の遺伝子を処理する自動分離抽出機が求められて
おり、更に遺伝子の抽出は少量、多サンプルに移行しつ
つある。また、ゲノム解析は、第一段階である塩基配列
解析から第二段階である遺伝子の機能解析へと移行しつ
つあることから、これに伴い解析試料として高純度な遺
伝子が求められている。このような状況下、プラスミド
ＤＮＡ等の抽出に際しては、濃度の揃ったＤＮＡを低コ
ストで且つ効率良く回収する必要（目的）があった。現
在、プラスミドＤＮＡの抽出には、上述したよう遠心分
離法（１）またはフィルタ分離法（２）が広く用いられ
ているが、双方の分離法（１），（２）のうちどちらか
一方の処理法を行っていたのでは、決して「濃度の揃っ
たＤＮＡを低コストで且つ効率良く回収する」という目
的を達成することはできなかった。その理由を以下に纏
めて詳述する。 ［遠心分離法（１）］図６に示すプロトコールでは、第
１工程，第６工程，第９工程，第１０工程で分離作業を
伴うが、これら行程は全て遠心機にて行えるため、プラ
スミドＤＮＡの全自動抽出化が図れる。しかも本分離法
であれば消耗品は、試薬及びプレート（２個）のみであ
ることから「抽出作業にかかるコストを低減することが
できる」という特徴が得られると共に、ディーププレー
ト（マイクロプレート）を用いているため「プラスミド
ＤＮＡを５〜１０μｇ程度回収することができる」とい
う特徴が得られる。Recently, as the analysis of genomes, which are blueprints of living organisms, has become popular, tens of thousands of samples /
There is a need for an automatic separation and extraction machine that processes genes for more than a day, and furthermore, the extraction of genes is shifting to small and multiple samples. In addition, since the genome analysis is shifting from base sequence analysis, which is the first stage, to functional analysis of the gene, which is the second stage, a high-purity gene is required as an analysis sample along with this. Under such circumstances, when extracting plasmid DNA or the like, there has been a need (purpose) to efficiently recover DNA of uniform concentration at low cost. At present, the centrifugation method (1) or the filter separation method (2) is widely used for extracting plasmid DNA as described above, but either one of the two separation methods (1) and (2) is used. By performing the treatment method, the objective of "recovering DNA with a uniform concentration at low cost and efficiently" could never be achieved. The reason is summarized and described in detail below. [Centrifugation method (1)] In the protocol shown in FIG. 6, the separation operation is involved in the first, sixth, ninth and tenth steps. Can be fully extracted automatically. In addition, according to the present separation method, since the consumables are only the reagent and the plate (two pieces), the feature that "the cost for the extraction work can be reduced" can be obtained, and the deep plate (microplate) can be used. Since it is used, a characteristic that "about 5 to 10 μg of plasmid DNA can be recovered" is obtained.
【０００８】しかし、本分離法では、９６穴ディーププ
レートの各穴にそれぞれ異なるサンプルを入れて分離し
ているのが通常であることから、サンプル毎に回収量の
バラツキが生じてしまうと共に、大腸菌の種類や培養状
況などによって抽出したプラスミドＤＮＡ中にゲノムＤ
ＮＡ，ＲＮＡ，タンパク質等の不要物が入り混じってし
まいプラスミドＤＮＡの純度が低下してしまうことから
「濃度の揃ったＤＮＡを効率良く回収する」ことができ
ないという問題があった。なお、プラスミドＤＮＡ抽出
後の処理として、シーケンサを用いてＤＮＡ配列を決定
する作業があるが、この作業を行う場合にはシーケンサ
にかける全サンプル濃度を揃える工程を要していたため
手間を有していた。However, in the present separation method, different samples are usually put in each hole of a 96-well deep plate and separated, so that the amount of recovery varies for each sample and E. coli Genome D in the plasmid DNA extracted depending on the type of
Since unnecessary substances such as NA, RNA, and protein are mixed and the purity of the plasmid DNA is reduced, there has been a problem that it is not possible to efficiently recover DNA having a uniform concentration. In addition, as a process after plasmid DNA extraction, there is a work of determining a DNA sequence using a sequencer. However, performing this work requires a process of adjusting the concentration of all samples to be applied to the sequencer, which is troublesome. Was.
【０００９】以上のことから、本分離法は「低コスト化
を図ることができるが、濃度の揃ったＤＮＡを効率良く
回収することができない」という特徴がある。 ［フィルタ分離法（２）］図７に示すプロトコールで
は、第１工程，第６工程，第７工程，第８工程，第９工
程で分離作業を伴うが、第１工程の分離だけは信頼性重
視の面から通常、遠心機で分離されている。よって、第
１工程の分離を遠心機で行った後、別装置である吸引機
型抽出装置を使用してプラスミドＤＮＡを抽出している
ため、全工程を上記抽出装置だけでは行えなかった。つ
まり全自動抽出装置とは呼べなかった。As described above, the present separation method has a feature that "cost can be reduced, but DNA having a uniform concentration cannot be efficiently recovered". [Filter Separation Method (2)] In the protocol shown in FIG. 7, separation work is involved in the first, sixth, seventh, eighth, and ninth steps, but only the separation in the first step is reliable. Because of the emphasis, they are usually separated by a centrifuge. Therefore, after the separation in the first step was performed by a centrifuge, the plasmid DNA was extracted using a suction device, which is a separate device, so that the entire process could not be performed using only the extraction device. In other words, it could not be called a fully automatic extraction device.
【００１０】上記抽出装置による本分離法では、フィル
タの効果により抽出したプラスミドＤＮＡ中にゲノムＤ
ＮＡ，ＲＮＡ，タンパク質等の不要物が入り混じること
を抑えられることから、上記分離法（１）に較べてプラ
スミドＤＮＡの純度が向上すると共に、フィルタを用い
ているためサンプルの種類に関係なく回収量（５μｇ程
度）を一定にすることができることから「濃度の揃った
ＤＮＡを効率良く回収することができる」という特徴が
得られる。勿論これによりシーケンス処理前に行われる
濃度を揃えるための行程を不要とすることができ作業に
かかる手間をなくすことができる。なお、回収量は使用
するフィルタの大きさによって異なる。[0010] In this separation method using the above-mentioned extraction apparatus, the genome D is contained in the plasmid DNA extracted by the effect of the filter.
Since the inclusion of unnecessary substances such as NA, RNA, and protein can be suppressed, the purity of plasmid DNA is improved as compared with the above-mentioned separation method (1). In addition, since a filter is used, collection can be performed regardless of the type of sample. Since the amount (approximately 5 μg) can be kept constant, the characteristic that “a DNA having a uniform concentration can be efficiently recovered” can be obtained. Needless to say, this eliminates the need for a process for adjusting the density, which is performed before the sequence processing, and can save time and effort for the operation. The amount of recovery differs depending on the size of the filter used.
【００１１】しかし、本分離法では、消耗品としてプレ
ート（３個）及びフィルタ（２個）を使用することから
「抽出作業に関しコスト高になってしまう」という問題
があった。However, in this separation method, there is a problem that "the cost for the extraction operation is increased" because plates (three) and filters (two) are used as consumables.
【００１２】また、本分離法における第６工程〜第９工
程は、上述したように吸引機を用いてフィルタ処理する
方法以外に、遠心機を用いる方法がある。一般にフィル
タ法の場合には、小スペース化やスピード化に適する吸
引型抽出装置が多く使用されているが、例えば分離する
溶液中にゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等の不要物
が少量でも混入しているとフィルタが目詰まりしてしま
い分離が不確実なものとなってしまったり、また一つの
穴のフィルタが破損し貫通してしまうと、そこだけを空
気が通過してしまい他の穴に収容されているサンプルが
処理されないという問題があった。ところが遠心機を用
いる方法の場合には、全てのサンプルに一様の遠心力を
与えられるため、確実にフィルタ処理を行うことができ
るという利点がある。In the sixth to ninth steps in the present separation method, there is a method using a centrifugal machine in addition to the method of performing the filter treatment using the suction machine as described above. Generally, in the case of the filter method, a suction-type extraction device suitable for reducing the space and speed is often used.For example, even if a small amount of unnecessary substances such as genomic DNA, RNA, and protein are mixed in a solution to be separated. If the filter is clogged, the separation becomes uncertain, or if the filter in one hole breaks and penetrates, only the air passes through it and is housed in the other hole There is a problem that the sample is not processed. However, in the case of the method using a centrifuge, there is an advantage that a uniform centrifugal force can be applied to all the samples, so that the filter processing can be surely performed.
【００１３】以上のことから、本分離法は「濃度の揃っ
たＤＮＡを効率良く回収することができるが、抽出装置
の全自動化が図り難くく、更に使用するプレート及びフ
ィルタの数が多いためコスト高になってしまう」という
特徴がある。As described above, the present separation method can be used to "recover DNA with a uniform concentration efficiently, but it is difficult to fully automate the extraction apparatus, and the cost is high due to the large number of plates and filters used. It will be expensive. "
【００１４】本発明の目的は、上記問題を解消し、濃度
の揃ったプラスミドＤＮＡを低コストで且つ効率良く回
収することのできる新たな自動分離抽出装置及びその抽
出方法を提供することである。An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems and to provide a new automatic separation / extraction apparatus and a method for extracting plasmid DNA having a uniform concentration at low cost and efficiently.
【００１５】[0015]
【課題を解決するための手段】上記目的は、試料容器内
の収容物を分離するための遠心機と、遠心機に試料容器
を搬入／搬出するための移送手段と、移送手段により搬
入／搬出される試料容器を載置するためのターンテーブ
ルと、ターンテーブル上に載置された試料容器内の分離
液を排除／抽出するための液処理部と、試料容器に試薬
を注入するための分注部と、試料容器の収容物を攪拌す
るための攪拌部とを備えた自動分離抽出装置において、
試料容器と隣合う位置にフィルタ付容器を設けることに
より達成される。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a centrifuge for separating contents contained in a sample container, transfer means for loading / unloading the sample container into / from the centrifuge, and loading / unloading by the transfer means. A turntable for mounting a sample container to be loaded, a liquid processing unit for removing / extracting a separated liquid in the sample container mounted on the turntable, and a component for injecting a reagent into the sample container. In the automatic separation and extraction device equipped with a pouring section and a stirring section for stirring the contents of the sample container,
This is achieved by providing a container with a filter at a position adjacent to the sample container.
【００１６】また、試料容器の大腸菌培養液から大腸菌
を遠心分離する集菌工程と、集菌した大腸菌を溶かし内
包物を取り出す溶菌工程と、取り出した内包物からプラ
スミドＤＮＡを取り出す精製工程とを有するプラスミド
ＤＮＡの抽出工程において、集菌工程において培養液と
大腸菌との遠心分離を行った後、溶菌工程にて大腸菌の
殻と内包物であるプラスミドＤＮＡとの遠心分離を行
い、その後の精製工程ではフィルタを用いてプラスミド
ＤＮＡと他の不要物とを遠心分離することにより達成さ
れる。Further, the method has a bacteria collection step of centrifuging Escherichia coli from the culture solution of Escherichia coli in a sample container, a lysis step of dissolving the collected Escherichia coli and removing inclusions, and a purification step of removing plasmid DNA from the removed inclusions. In the plasmid DNA extraction step, after performing the centrifugation of the culture solution and Escherichia coli in the cell collection step, the Escherichia coli shell and the plasmid DNA that is the inclusion substance are centrifuged in the lysis step, and in the subsequent purification step, This is achieved by centrifuging the plasmid DNA and other unwanted matter using a filter.
【００１７】[0017]
【発明の実施の形態】本実施例になる自動分離抽出装置
１０を図１乃至図３を用いて説明する。図１は本実施例
になるターンテーブル１５などを有する自動分離抽出装
置１０を示す外観図、図２はフィルタ１７の移動を示す
模式図、図３は本実施例になる自動分離抽出装置１０の
分離工程を示すプロトコールである。図１に示す自動分
離抽出装置１０は、抽出等処理装置１１と、分離装置と
しての遠心分離装置１２と、容器移送手段としてのロボ
ットハンド１３と、操作／制御部１４とを有している。
抽出等処理装置１１は、回転駆動自在な円環状に形成さ
れたターンテーブル１５を有しており、このターンテー
ブル１５は、ディープウェルをもつマイクロプレート１
６からなる試料容器（以下「ディーププレート」と称
す）と、ディーププレート１６の左隣にフィルタ１７ａ
又はシート状フィルタからなるガラスファイバフィルタ
を有するフィルタ付容器１７と、このフィルタ付容器１
７が載置される他の試料容器である廃液用マイクロプレ
ート１８（以下、「廃液用プレート」と称す）と、その
左隣にフィルタ１７の載っていないプラスミドＤＮＡ用
マイクロプレート１９（以下「プラスミドＤＮＡ用プレ
ート」と称す）を載置するための載置部２０が複数個
（本例では１６個）設けられている。なお、抽出等処理
装置１１内のディーププレート１６、フィルタ付容器１
７及び廃液用プレートから構成されるプレート組体２７
の移動は、ターンテーブル１５の回転により行われる。DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS An automatic separation / extraction apparatus 10 according to the present embodiment will be described with reference to FIGS. FIG. 1 is an external view showing an automatic separation and extraction device 10 having a turntable 15 and the like according to the present embodiment, FIG. 2 is a schematic diagram showing movement of a filter 17, and FIG. It is a protocol showing a separation step. The automatic separation and extraction device 10 shown in FIG. 1 includes an extraction and other processing device 11, a centrifugal separation device 12 as a separation device, a robot hand 13 as a container transfer means, and an operation / control unit 14.
The processing device 11 for extraction etc. has a turntable 15 formed in an annular shape that can be driven to rotate. The turntable 15 is a microplate 1 having a deep well.
6 (hereinafter referred to as “deep plate”) and a filter 17 a
Or, a container 17 with a filter having a glass fiber filter made of a sheet filter, and the container 1 with the filter
A waste liquid microplate 18 (hereinafter, referred to as a “waste liquid plate”), which is another sample container on which the sample 7 is placed, and a plasmid DNA microplate 19 (hereinafter, “plasmid A plurality of (16 in this example) mounting portions 20 for mounting DNA plates) are provided. In addition, the deep plate 16 in the extraction processing apparatus 11, the container 1 with a filter, and the like.
Plate assembly 27 composed of plate 7 and waste liquid plate
Is performed by the rotation of the turntable 15.
【００１８】上記抽出等処理装置１１には、ターンテー
ブル１５に載置したディーププレート１６に試薬を分注
する分注部２１と、ターンテーブル１５に載置したディ
ーププレート１６内の沈殿物以外の液体を抽出するため
の液抽出部２３と、ターンテーブル１５に載置したディ
ーププレート１６内の沈殿物以外の液体を排除するため
の液排除部２２とを有する。ここで、液抽出部２３及び
液排除部２２は上記液処理部に相当する。分注部２１に
は、ディーププレート１６の収容物を攪拌するための攪
拌部２４が設けられている。The extraction and treatment apparatus 11 includes a dispensing section 21 for dispensing a reagent to a deep plate 16 placed on a turntable 15 and a dispenser other than the sediment in the deep plate 16 placed on the turntable 15. It has a liquid extracting part 23 for extracting liquid and a liquid removing part 22 for removing liquid other than sediment in the deep plate 16 placed on the turntable 15. Here, the liquid extracting unit 23 and the liquid removing unit 22 correspond to the liquid processing unit. The dispensing unit 21 is provided with a stirring unit 24 for stirring the contents of the deep plate 16.
【００１９】遠心装置１２は、遠心装置１２に関する駆
動制御を行なう駆動制御部２６と、高速回転することに
よって設置されたディーププレート１６に遠心力を及ぼ
し、比重差によって遠心分離を行なうロータ２５とを有
する。ロータ２５には、遠心分離の対象ディーププレー
ト１６が設置される。The centrifugal apparatus 12 includes a drive control section 26 for controlling the driving of the centrifugal apparatus 12 and a rotor 25 for applying a centrifugal force to the deep plate 16 installed by rotating at a high speed and performing centrifugal separation by a difference in specific gravity. Have. The deep plate 16 to be centrifuged is installed on the rotor 25.
【００２０】ロボットハンド１３は、該ターンテーブル
１５及び遠心装置１２に対し、ディーププレート１６を
搬入し及び搬出するものである。ロボットハンド１３
は、ディーププレート１６を側面ゴム板のハンドリング
アームに挟持する。ロボットハンドは、上下、スライド
機構を有する。なお、ディーププレート１６、プレート
組２７の大きさ、特に高さが異なっているものでも問題
なく移送操作が行えるよう制御されている。The robot hand 13 carries the deep plate 16 in and out of the turntable 15 and the centrifugal device 12. Robot hand 13
Holds the deep plate 16 between the handling arms of the side rubber plates. The robot hand has a vertical and a slide mechanism. The transfer operation is controlled without any problem even if the deep plate 16 and the plate set 27 have different sizes, especially heights.
【００２１】該自動分離抽出装置１０によるプラスミド
ＤＮＡの抽出を図３を用いて説明する。第１工程とし
て、１．５ｍｌ／穴の大腸菌培養液の入った９６穴ディ
ープウェルプレート１６と、その左隣に8M グアニジン
塩酸溶液 の入った９６サンプル用ガラスファイバフィ
ルタ１７を載せた廃液用プレート１８と、フィルタ１７
を載せた廃液用プレート１８（プラスミドＤＮＡ用）の
左隣にプラスミドＤＮＡ用プレート１８を該ターンテー
ブル１５に載置し、該ディーププレート１６をロボット
ハンド１３により遠心装置１２内のロータ２５に搬入
し、遠心を行なうことにより大腸菌を沈殿させる。な
お、一般に遠心分離を行う場合には偶数個のプレートを
用いて行うが、ダミープレートを使用することによって
奇数個のプレートを処理可能であることからプレートの
枚数にこだわる必要はなくスムースに遠心分離を行うこ
とができる。遠心後、遠心装置１２内のロータ２５から
ロボットハンド１３により該ディーププレート１６を搬
出し、ターンテーブル１５に搬入する。そして第２工程
であるターンテーブル１５上にある該ディーププレート
１６内の大腸菌の沈殿物以外の培養液を液排出部２２に
より除去する。この培養液の除去は液を吸引するアスピ
ーションを用いても良い。次に第３工程である該ディー
ププレート１６内の大腸菌の沈殿物に50mM グルコー
ス、25mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA(pH8.0) という
組成である溶液を分注部２１に分注し、攪拌部２４によ
り攪拌を行い、該ディーププレート１６内の大腸菌を懸
濁する。この懸濁は、攪拌部２４ではなく、分注部２１
によるピペッティングでも可能である。そして第４工程
としてこの菌体懸濁溶液に0.2N NaOH、1％ SDSという組
成である溶液を分注部２１により分注し、数分間放置す
る。その後、第５工程として5M 酢酸カリウム 60ml、酢
酸 11.5mlを蒸留水を加えて100mlに調製した溶液を分注
部２１により分注し、攪拌部２４により攪拌する。この
攪拌は、攪拌部２４ではなく、分注部２１によるピペッ
ティングでも可能である。この処理溶液の入った該ディ
ーププレート１６をロボットハンド１３により遠心装置
１２内のロータ２５に搬入し、第６工程として遠心を行
なうことにより粗プラスミドＤＮＡ画分を上清に、それ
以外の不要物を沈殿物として回収する。遠心後、遠心装
置１２内のロータ２５からロボットハンド１３により該
ディーププレート１６を搬出し、ターンテーブル１５に
搬入する。そして第７工程としてディーププレート１６
内の粗プラスミドＤＮＡ画分である上清を、液抽出部２
３により8M グアニジン塩酸溶液の入ったフィルタ付容
器上に移し、該フィルタ付容器１７の載った廃液用プレ
ート１８をロボットハンド１３により遠心装置１２内の
ロータ２５に搬入し、第８工程として遠心によりプラス
ミドＤＮＡをフィルタ１７ａに吸着させる。遠心後、遠
心装置１２内のロータ２５からロボットハンド１３によ
りフィルタ付容器１７の載った廃液用プレート１８を搬
出し、ターンテーブル１５に搬入する。フィルタ１７に
移す粗プラスミドＤＮＡ画分である上清と8M グアニジ
ン塩酸溶液は等量であれば良い。またプラスミドＤＮＡ
をフィルタ１７ａへ吸着させ易くするための吸着緩衝液
はグアニジン塩酸溶液の変わりにヨウ化カリウム溶液を
用いても良い。そして第９工程としてプラスミドＤＮＡ
が吸着したフィルタ１７ａに80％ エチルアルコール溶
液を分注部２１により分注し、該フィルタ１７ａの載っ
た廃液用プレート１８をロボットハンド１３により遠心
装置１２内のロータ２５に搬入し、遠心を行なう。遠心
後、遠心装置１２内のロータ２５からロボットハンド１
３によりフィルタ付容器１７の載った廃液用プレート１
９を搬出し、ターンテーブル１５に搬入する。この操作
はプラスミドＤＮＡの洗浄であり、適当回数繰り返す。
その後フィルタ付容器１７を２時間程度放置し乾燥させ
る。そして第１０工程として乾燥させたフィルタ付容器
１７のみを該フィルタ付容器１７の載った廃液用プレー
ト１８からロボットハンド１３によりの掴み上げ、その
ままその左隣にあるプラスミドＤＮＡ用プレート１９に
移動し、該プラスミドＤＮＡ用プレート１９の上に載せ
る。プラスミドＤＮＡ用プレート１９の上のフィルタ付
容器１７に分注部２１を用いて滅菌蒸留水又はTE緩衝液
を分注し、フィルタ付容器１７の載ったプラスミドＤＮ
Ａ用プレート１９をロボットハンド１３により遠心装置
１２内のロータ２５に搬入し、遠心を行ない、プラスミ
ドＤＮＡをフィルタ１７ａから該フィルタ１７ａの下の
プラスミドＤＮＡ用プレート１９に溶出させる。遠心
後、遠心装置１２内のロータ２５からロボットハンド１
３によりフィルタ付容器１７ａの載ったプラスミドＤＮ
Ａ用プレート１９を搬出し、ターンテーブル１５に搬入
する。なお、本実施例では全工程を自動化しているが、
乾燥後の工程を別作業として行っても良い。The extraction of plasmid DNA by the automatic separation / extraction apparatus 10 will be described with reference to FIG. As a first step, a 96-well deep well plate 16 containing a 1.5 ml / well E. coli culture solution and a waste liquid plate 18 on which a 96-sample glass fiber filter 17 containing an 8M guanidine hydrochloride solution are placed on the left side. And the filter 17
The plasmid DNA plate 18 is placed on the turntable 15 on the left side of the waste liquid plate 18 (for plasmid DNA) on which the plate is mounted, and the deep plate 16 is carried into the rotor 25 in the centrifugal device 12 by the robot hand 13. Then, E. coli is precipitated by centrifugation. In general, when performing centrifugation, an even number of plates are used.However, since an odd number of plates can be processed by using a dummy plate, there is no need to stick to the number of plates, and the centrifugation is performed smoothly. It can be performed. After the centrifugation, the deep plate 16 is carried out from the rotor 25 in the centrifugal device 12 by the robot hand 13 and carried into the turntable 15. Then, the culture solution other than the E. coli precipitate in the deep plate 16 on the turntable 15 which is the second step is removed by the liquid discharge unit 22. For the removal of the culture solution, an aspiration for sucking the solution may be used. Next, a solution having a composition of 50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), and 10 mM EDTA (pH 8.0) was dispensed into the dispensing unit 21 in the third step, which was the precipitation of E. coli in the deep plate 16. The mixture is poured and stirred by the stirring unit 24 to suspend the E. coli in the deep plate 16. This suspension is supplied to the dispensing section 21 instead of the stirring section 24.
It is also possible by pipetting. Then, as a fourth step, a solution having a composition of 0.2 N NaOH and 1% SDS is dispensed into the cell suspension solution by the dispensing unit 21 and left for several minutes. Thereafter, as a fifth step, a solution prepared by adding 60 ml of 5M potassium acetate and 11.5 ml of acetic acid to 100 ml by adding distilled water is dispensed by the dispensing section 21 and stirred by the stirring section 24. This stirring can be performed not by the stirring unit 24 but also by pipetting by the dispensing unit 21. The deep plate 16 containing the processing solution is carried into the rotor 25 in the centrifugal device 12 by the robot hand 13 and centrifuged as a sixth step, whereby the crude plasmid DNA fraction is converted into a supernatant, and other unnecessary substances are removed. Is collected as a precipitate. After the centrifugation, the deep plate 16 is carried out from the rotor 25 in the centrifugal device 12 by the robot hand 13 and carried into the turntable 15. And as the seventh step, the deep plate 16
The supernatant which is the crude plasmid DNA fraction in the
The waste liquid plate 18 on which the 8 M guanidine hydrochloride solution is stored is transferred to the rotor 25 in the centrifugal device 12 by the robot hand 13 by centrifugation as an eighth step. The plasmid DNA is adsorbed on the filter 17a. After the centrifugation, the waste liquid plate 18 on which the container 17 with the filter is placed is carried out from the rotor 25 in the centrifugal device 12 by the robot hand 13 and carried into the turntable 15. It is sufficient that the supernatant, which is the crude plasmid DNA fraction transferred to the filter 17, and the 8M guanidine hydrochloride solution are equivalent. Also, plasmid DNA
As an adsorption buffer for facilitating the adsorption of guanidine on the filter 17a, a potassium iodide solution may be used instead of the guanidine hydrochloride solution. And as the ninth step, the plasmid DNA
The 80% ethyl alcohol solution is dispensed by the dispensing unit 21 to the filter 17a to which the filter 17a is adsorbed, and the waste liquid plate 18 on which the filter 17a is loaded is loaded into the rotor 25 in the centrifugal device 12 by the robot hand 13 and centrifuged. . After the centrifugation, the robot hand 1 is moved from the rotor 25 in the centrifugal device 12.
3. Waste liquid plate 1 on which container 17 with filter is placed
9 is carried out and carried into the turntable 15. This operation is washing of plasmid DNA, and is repeated an appropriate number of times.
Thereafter, the filter-equipped container 17 is left to dry for about 2 hours. As a tenth step, only the container 17 with the filter dried is picked up by the robot hand 13 from the waste liquid plate 18 on which the container 17 with the filter is placed, and is moved to the plasmid DNA plate 19 on the left side as it is, Place on the plasmid DNA plate 19. Sterile distilled water or TE buffer is dispensed into the filter-equipped container 17 on the plasmid DNA plate 19 using the dispensing unit 21, and the plasmid DN on which the filter-equipped container 17 is placed is placed.
The plate A for A is carried into the rotor 25 in the centrifugal device 12 by the robot hand 13 and centrifuged to elute plasmid DNA from the filter 17a into the plate 19 for plasmid DNA below the filter 17a. After the centrifugation, the robot hand 1 is moved from the rotor 25 in the centrifugal device 12.
3. Plasmid DN on container 17a with filter
The A plate 19 is carried out and carried into the turntable 15. In this example, all processes are automated,
The process after drying may be performed as a separate operation.
【００２２】よって、本実施例になる自動分離抽出装置
は、人手を必要としないように自動化することで、煩雑
な処理を人手から開放し、且つ人因的ミスがなくなり、
収量、純度共に均一な遺伝子の抽出が可能になる。ま
た、複数個の穴が設けられた一般にマイクロプレートと
呼ばれているプレート又はマイクロチューブ集合体であ
り、大量又は多数の標本について一括処理を行なうこと
ができるので、迅速且つ効率的に処理を行なうことがで
き、ゲノム解析で必要不可欠である大規模な塩基配列決
定等に多大な威力を発揮することができる。更にフィル
タ又はシート状フィルタを使用すると共に遠心機による
遠心力を用いて行うため、フィルタの目詰まりが起きな
いので高純度の標本を確実に得ることができ且つフィル
タ又はシート状フィルタの使用枚数を精製工程時の1枚
のみとすることができるので、ランニングコストを半分
以下にすることができる。Therefore, the automatic separation and extraction apparatus according to the present embodiment is automated so that no manual operation is required, so that complicated processing is released from manual operation and human error is eliminated.
Gene extraction with uniform yield and purity becomes possible. Also, it is a plate or micro tube assembly generally called a micro plate provided with a plurality of holes, and can process a large amount or a large number of samples at once, so that processing can be performed quickly and efficiently. This makes it possible to exert enormous power in large-scale base sequence determination and the like, which is indispensable for genome analysis. Further, since the filter or the sheet filter is used and the centrifugal force of the centrifugal machine is used, the clogging of the filter does not occur, so that a high-purity sample can be reliably obtained. Since only one sheet can be used in the purification step, the running cost can be reduced to half or less.
【００２３】なお、これらの実施の形態は、本発明をよ
り良く理解させるために具体的に説明したものであっ
て、別形態を制限するものではない。従って、発明の主
旨を変向しない範囲で変向可能である。These embodiments are specifically described for better understanding of the present invention, and do not limit another embodiment. Therefore, it is possible to change the direction without changing the gist of the invention.
【００２４】[0024]
【発明の効果】 本発明によれば、濃度の揃ったプラス
ミドＤＮＡを低コストで且つ効率良く回収することので
きる新たな自動分離抽出装置及びその抽出方法を提供す
ることができる。According to the present invention, it is possible to provide a new automatic separation / extraction apparatus capable of efficiently recovering plasmid DNA having a uniform concentration at low cost and a method for extracting the same.
【図１】 本発明になるターンテーブルを有する自動分
離抽出装置を示す外観図である。FIG. 1 is an external view showing an automatic separation and extraction device having a turntable according to the present invention.
【図２】 本発明になるフィルタの移動を示す模式図で
ある。FIG. 2 is a schematic diagram showing movement of a filter according to the present invention.
【図３】 本発明になる自動分離抽出装置の分離工程を
示すプロトコールである。FIG. 3 is a protocol showing a separation step of the automatic separation and extraction apparatus according to the present invention.
【図４】 従来における遠心力を用いる分離法を示す模
式図である。FIG. 4 is a schematic view showing a conventional separation method using centrifugal force.
【図５】 従来におけるあフィルタを用いる分離法を示
す模式図である。FIG. 5 is a schematic diagram showing a conventional separation method using a filter.
【図６】 従来における遠心力を用いる分離法を示すプ
ロトコールである。FIG. 6 is a protocol showing a conventional separation method using centrifugal force.
【図７】 従来におけるフィルタを用いる分離法を示す
プロトコールである。FIG. 7 is a protocol showing a conventional separation method using a filter.
１０は自動分離抽出装置、１１は抽出等処理装置、１２
は遠心分離装置、１３はロボットハンド、１４は操作／
制御部、１５はターンテーブル、１６はディーププレー
ト、１７はガラスファイバフィルタ、１８は廃液用マイ
クロプレート、１９はプラスミドＤＮＡ用マイクロプレ
ート、２０は載置部、２１は分注部、２２は液排除部、
２３は液抽出部、２４は攪拌部、２５はロータ、２６は
駆動制御部、２７はプレート組体である。10 is an automatic separation and extraction device, 11 is an extraction processing device, 12
Is a centrifugal separator, 13 is a robot hand, 14 is an operation /
Control section, 15 is a turntable, 16 is a deep plate, 17 is a glass fiber filter, 18 is a microplate for waste liquid, 19 is a microplate for plasmid DNA, 20 is a mounting section, 21 is a dispensing section, and 22 is a liquid exclusion. Department,
23 is a liquid extraction unit, 24 is a stirring unit, 25 is a rotor, 26 is a drive control unit, and 27 is a plate assembly.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA19 CA01 CA11 CA20 DA06 EA04 4B029 AA07 AA23 BB01 BB20 FA15 4D057 AA03 AB01 AC01 AC02 AC05 AD01 AE11 BA15 BA20 BA24 BB02 BC01 BC03 BC07 BC11 CB01 CB04 CB08 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page F term (reference) 4B024 AA19 CA01 CA11 CA20 DA06 EA04 4B029 AA07 AA23 BB01 BB20 FA15 4D057 AA03 AB01 AC01 AC02 AC05 AD01 AE11 BA15 BA20 BA24 BB02 BC01 BC03 BC07 BC11 CB01 CB04 CB08
Claims (10)
心機と、該遠心機に該試料容器を搬入／搬出するための
移送手段と、該移送手段により搬入／搬出される前記試
料容器を載置するためのターンテーブルと、該ターンテ
ーブル上に載置された前記試料容器内の分離液を排除／
抽出するための液処理部と、前記試料容器に試薬を注入
するための分注部と、前記試料容器の収容物を攪拌する
ための攪拌部とを備えた自動分離抽出装置において、前
記試料容器と隣合う位置にフィルタ付容器を設けること
を特徴とした自動分離抽出装置。1. A centrifuge for separating contents contained in a sample container, transfer means for loading / unloading the sample container into / from the centrifuge, and the sample container loaded / unloaded by the transfer means A turntable on which the sample is placed, and removing the separated liquid in the sample container placed on the turntable.
An automatic separation / extraction apparatus comprising: a liquid processing unit for extraction; a dispensing unit for injecting a reagent into the sample container; and a stirring unit for stirring the contents of the sample container. An automatic separation and extraction device, characterized in that a filter-equipped container is provided at a position adjacent to the device.
する液を保持してなるプレート上に設けることを特徴と
した請求項１記載の自動分離抽出装置。2. The automatic separation / extraction apparatus according to claim 1, wherein the filter-equipped container is provided on a plate holding a liquid permeating the filter.
他の試料容器との間に設けることを特徴とした請求項１
記載の自動分離抽出装置。3. The filter-equipped container is provided between the sample container and another sample container.
The automatic separation / extraction device according to claim 1.
スファイバ製であることを特徴とした請求項１，２記載
の自動分離抽出装置。4. The automatic separation and extraction device according to claim 1, wherein the filter of the container with the filter is made of glass fiber.
カレジンを用いたものであることを特徴とした請求項
１，２記載の自動分離抽出装置。5. The automatic separation and extraction device according to claim 1, wherein the filter of the container with a filter uses silica resin.
個の穴を有するマイクロプレート或いはマイクロチュー
ブ集合体であることを特徴とした請求項１記載の自動分
離抽出装置。6. The automatic separation / extraction apparatus according to claim 1, wherein the sample container and the other sample containers are a microplate or a microtube assembly having a plurality of holes.
タを１つだけ使用することを特徴とした請求項１記載の
自動分離抽出装置。7. The automatic separation / extraction device according to claim 1, wherein only one filter is used for the extraction of the genetic material.
心分離する集菌工程と、集菌した大腸菌を溶かし内包物
を取り出す溶菌工程と、取り出した内包物からプラスミ
ドＤＮＡを取り出す精製工程とを有するプラスミドＤＮ
Ａの抽出工程において、前記集菌工程にて培養液と大腸
菌との遠心分離を行った後、前記溶菌工程にて大腸菌の
殻と内包物であるプラスミドＤＮＡとの遠心分離を行
い、その後、前記精製工程にてフィルタ付容器を用いて
プラスミドＤＮＡを回収するための遠心分離を行うこと
を特徴とした自動分離抽出装置の抽出方法。8. A method comprising the steps of: a bacteria collection step of centrifuging Escherichia coli from a culture solution of Escherichia coli in a sample container; a lysis step of dissolving the collected Escherichia coli to remove inclusions; and a purification step of removing plasmid DNA from the removed inclusions. Plasmid DN
In the extraction step of A, after the centrifugation of the culture solution and Escherichia coli in the harvesting step, centrifugation of the Escherichia coli shell and the plasmid DNA that is the inclusion is performed in the lysis step. An extraction method for an automatic separation / extraction device, comprising performing centrifugation for recovering plasmid DNA using a container with a filter in a purification step.
吸着している前記フィルタ付容器を取り外した後、その
フィルタ付容器を他の試料容器上に配すステップを有す
ることを特徴とした請求項８記載の自動分離抽出装置の
抽出方法。9. The method according to claim 8, wherein the purifying step includes a step of removing the filter-equipped container to which the plasmid DNA is adsorbed, and then disposing the filter-equipped container on another sample container. The extraction method of the automatic separation and extraction device according to the above.
製工程における分離作業には、何れも遠心機による遠心
力が用いられており、更に全工程の処理は自動化されて
いることを特徴とした請求項８記載の自動分離抽出装置
の抽出方法。10. The centrifugal force of a centrifuge is used in all of the separation operations in the cell collection step, the lysis step, and the purification step, and the processing of all steps is automated. An extraction method for the automatic separation and extraction device according to claim 8.
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|---|---|---|---|
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