JP3017887B2 - Methods for inactivating prionene, viruses and other infectious agents - Google Patents
Methods for inactivating prionene, viruses and other infectious agentsInfo
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Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、生体物質又はビオゲン
物質、特にはアルブミンを得るための出発物質として適
した血漿又は血清中に存在するプリオネン,ウイルス及
び他の感染因子、例えば細菌を不活化する方法に関する
ものである。The present invention relates to the inactivation of prionene, viruses and other infectious agents, such as bacteria, present in plasma or serum which are suitable as starting materials for obtaining biological or biogenic substances, in particular albumin. How to do it.
【0002】[0002]
【従来の技術】動物(またはヒト)の材料から蛋白質を
調製する際には、出発物質に存在していた感染性粒子に
よる汚染の危険性が常にある。最近の一般的な例とし
て、HIV−ウイルス(AIDSの病原因子) による多
くのヒトの感染が挙げられるが、これは、例えば、血友
病患者に対する血液製剤の投与によるものであった。こ
れらの感染は、特にAIDS因子が発見される以前のこ
とであり、以降は、供血者の検査、即ち、スクリーニン
グが行なわれている。それに加えて、製造元は、場合に
よって供血者の血液中に存在することのあるHIV−ウ
イルスを血清蛋白質の精製及び治療薬の大量生産時に除
去する方法を検討している。BACKGROUND OF THE INVENTION In preparing proteins from animal (or human) material, there is always the risk of contamination by infectious particles that were present in the starting material. A recent common example is the transmission of many humans with the HIV-virus (the pathogen of AIDS), for example, by administration of blood products to hemophiliac patients. These infections were before the discovery of the AIDS factor, in particular, and donors have been examined or screened since then. In addition, manufacturers are exploring ways to remove HIV-viruses, which may be present in the donor's blood, during serum protein purification and mass production of therapeutics.
【0003】この病原因子の性質が解明されるにつれ、
一層簡便且つ迅速にこれを崩壊する方法の開発が更に可
能になるものと考えられる。歴史上見出された初めての
感染性粒子である細菌に対しては、数十年来周知の方法
(蒸気滅菌,乾熱滅菌,低温滅菌,濾過滅菌,エチレン
オキシド滅菌,放射線滅菌など)があり、それらはすべ
て一定の技術水準に達している。[0003] As the nature of this virulence factor is elucidated,
It is thought that it would be possible to develop a method for disintegrating this more easily and quickly. For bacteria, the first infectious particles found in history, there are several well-known methods for decades (steam sterilization, dry heat sterilization, low temperature sterilization, filtration sterilization, ethylene oxide sterilization, radiation sterilization, etc.). All have reached a certain technical level.
【0004】20世紀に入って初めて発見されたウイルス
(多様な病原因子群)を除去する方法もあるが、すべて
の病原因子に対する特異的な方法はまだ見出されていな
い。多くのウイルスはpHを4に下げれば完全な崩壊を招
くが、高濃度の有機溶媒によって不活化される種類のウ
イルスもある。[0004] Although there is a method for removing a virus (various group of pathogenic factors) first discovered in the twentieth century, a specific method for all pathogenic factors has not been found yet. Although many viruses cause complete disintegration when the pH is lowered to 4, some viruses are inactivated by high concentrations of organic solvents.
【0005】数年前、分子生物学の定説に疑問を投げ掛
けるような新しいグループの病原因子が出現し、学術誌
に登場するようになった。この因子をプリオネンとい
う。このプリオネンの物性はまだ明らかでないが、科学
者のなかには、プリオネンを極微小のウイルス、即ち、
数種の外皮蛋白質を有する小さな棒状の核酸と考えるも
のがいる。一方、プリオネンに前記核酸の存在を証明出
来ないため、プリオネンはDNA又はRNAをもたない
感染性蛋白質が関連しているという革新的な結論を導き
出す科学者が大部分である。これは、核酸(遺伝物質)
が感染性粒子の複製にとって不可欠であるという定説に
対する最初の反論である。[0005] A few years ago, a new group of virulence factors emerged that cast doubt on molecular biology theories and began to appear in academic journals. This factor is called prionene. Although the physical properties of this prionene are not yet clear, some scientists consider prionene to be a very small virus,
Some consider small rod-shaped nucleic acids with several coat proteins. On the other hand, most scientists have come to the groundbreaking conclusion that prionene is related to infectious proteins without DNA or RNA, since prionene cannot prove the presence of the nucleic acid. This is nucleic acid (genetic material)
Is the first objection to the belief that is essential for the replication of infectious particles.
【0006】プリオネンの性質に関しては、まだ不明の
ところが多く、ヒト又は動物がかかる数種の疾病が知ら
れているだけであるが、これに対する治療の方法がない
ため、この疾病は致死的疾病である。潜伏期が30年にも
わたる感染症にかかわる問題なので、治療薬の研究と創
製は極めて難しいが、消費の増大は当然見込まれてい
る。これらの疾病の一つには、BSE(ウシの海綿状脳
症)−英国で生じている未解明のウシ伝染病−がある。
一般的で、非常に類似した疾病として、ヒツジ及びヤギ
におけるスクラピー(おそらく、現在のBSE疾病の起
源)が挙げられる。[0006] The nature of prionene remains largely unknown, and only a few such diseases are known to humans or animals, but since there is no cure for it, this disease is a fatal disease. is there. Research and creation of therapeutics is extremely difficult because the incubation period is related to infectious diseases spanning 30 years, but consumption is expected to increase. One of these diseases is BSE (bovine spongiform encephalopathy)-an unexplained bovine epidemic that occurs in the UK.
Common and very similar diseases include scrapie in sheep and goats (probably the current source of BSE disease).
【0007】ヒトの場合では、クールー(パプアニュー
ギニアで祭儀の際に見られる疾病),ヤコブ・クロイツ
フェルト症候群及びゲルシュタットマン・シュトロイッ
スラー症候群などがある。これらの珍しい疾病は、幸い
にして、発病率が低く、百万分の1程度であるが、アル
ツハイマー病と非常に良く類似している。[0007] In the case of humans, there are kuru (disease seen at festivals in Papua New Guinea), Jacob-Creuzfeld syndrome and Gerstadtmann-Straussler syndrome. Fortunately, these rare diseases have a low incidence, on the order of one millionth, but are very similar to Alzheimer's disease.
【0008】BSEは、スクラピーにかかったヒツジを
処分する動物処理施設からの動物用飼料の投与によっ
て、英国で蔓延したという証拠がある。残念ながら、ヒ
トにも対応する疾病があり、これはヒトの脳下垂体から
ヒト成長ホルモン(分泌物質)を製造するに際して、製
造元の責任でクロイツフェルド・ヤコブ症候群の病原因
子が混入したことによるものである。これらの疾病の多
くは、このホルモンの投与患者で既に発現しており、若
年者から50歳以上の人まで認められている。[0008] There is evidence that BSE was widespread in the United Kingdom through the administration of animal feed from animal processing facilities that disposed of scraped sheep. Unfortunately, there is a corresponding disease in humans, due to the incorporation of Creutzfeld-Jakob syndrome pathogens at the manufacturer's responsibility in producing human growth hormone (secretory substance) from the human pituitary gland. It is. Many of these diseases have already been expressed in patients receiving this hormone, and have been observed in young people up to 50 years of age.
【0009】この新たな型の疾病からは、潜在的な危険
性が指摘されている。この新たな病原因子であるプリオ
ネンに関する知識が乏しいために、治療に対しても全く
同様に危険性を評価することは困難である。また、プリ
オネンは殆ど全く核酸をもっていないこと、及びそのプ
リオネン蛋白質はある宿主によってコードされた後に病
原体へと変化すること、が考えられる。その他、プリオ
ネンは、抗体形成のような免疫応答を生じないため、診
断が非常に困難である。[0009] Potential dangers are pointed out from this new type of disease. Poor knowledge of this new virulence factor, prionene, makes it just as difficult to assess the risk for treatment. It is also possible that prionene has almost no nucleic acid, and that the prionene protein is transformed into a pathogen after being encoded by a host. In addition, prionene does not generate an immune response such as antibody formation, and is very difficult to diagnose.
【0010】プリオネンを崩壊させる試みがなされてい
るが、一つの大きな問題点がある。即ち、プリオネン
は、あらゆる物理的及び化学的方法に対して、極めて強
い抵抗性を示すが、好ましくは高温で高濃度の鉱酸又は
アルカリ溶液での処理、次亜塩素酸−アルカリ溶液での
処理、または150℃以上の温度によって除去されること
が今までに知られている。しかし、このような強力な処
理では、いかなる生物学的治療薬もただちに崩壊される
か、少なくとも効果が失われることは明らかである。Attempts have been made to destroy prionene, but there is one major problem. That is, prionene exhibits extremely strong resistance to all physical and chemical methods, but is preferably treated with a high concentration of a mineral acid or alkali solution at a high temperature, or with a hypochlorite-alkali solution. , Or it is known to be removed by temperatures above 150 ° C. However, it is clear that such a powerful treatment will immediately destroy, or at least lose effect, any biological therapeutics.
【0011】今まで、プリオネンを含まない生体物質を
調製するために、以前上記の伝染病が発生していない地
域から出発物質を入手することが試みられていたが、潜
伏期間が30年と極めて長いため、この方法では、まだ大
きな危険性が含まれていると考えられる。上記のように
免疫応答が生じないので、出発物質のスクリーニングに
よって、プリオネンの存在を確認することは出来ない。
生物学的試験(マウスの脳への目的物質の注射、病理学
的反応に対する評価、マウスの解剖、分子生物学的及び
組織学的所見ならびにマウスの脳への再注射による確
認)は、約14カ月を要し、多用されているので、出発物
質の対照のためばかりでなく、完成した薬剤の過剰付加
試験に対しても適当であり、この試験は、新たな製造方
法(プリオネン添加後)の有効性を調べるためにも有用
である。実験動物が飼育され、試験が行なわれる(P3
ゾーン)、特殊な実験室中の確実な安全装置下で行なわ
れなければならない。[0011] Until now, in order to prepare prionene-free biological materials, it has been attempted to obtain starting materials from an area where the above-mentioned infectious diseases have not occurred, but the incubation period is extremely long, 30 years. Due to the length, this method is considered to still carry significant risks. Since no immune response is generated as described above, screening for starting materials cannot confirm the presence of prionene.
Biological tests (injection of target substance into mouse brain, evaluation for pathological response, mouse dissection, molecular biological and histological findings, and confirmation by re-injection into mouse brain) It is time consuming and heavily used, so it is suitable not only for starting material control but also for the overloading test of the finished drug, which is a new production method (after adding prionene). It is also useful for checking effectiveness. Experimental animals are bred and tested (P3
Zone), must be performed under secure equipment in special laboratories.
【0012】[0012]
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明が解決
しようとする課題は、生体物質又はビオゲン物質を分解
せずに、既知のすべてのウイルス群を崩壊させると共
に、これらの物質中に存在するプリオネンを確実に除去
する方法を提供することである。SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly, an object of the present invention is to destroy all known virus groups without decomposing biological substances or biogen substances, and to exist in these substances. It is to provide a method for reliably removing prionene.
【0013】[0013]
【課題を解決するための手段】本発明は上記課題を解決
することを目的としてなされたもので、その構成は、あ
らゆる生体物質又はビオゲン物質、特にはアルブミンを
得るための出発物質として適した血漿又は血清中に存在
するプリオネン、ウイルス及び他の感染因子をカオトロ
ピック試薬で不活化する方法であって、前記物質をカオ
トロピック試薬で処理する前又はパイロジェンを含まな
い滅菌水で希釈した後、1g/lの界面活性剤を添加し、7
0℃の温度で撹拌した後、得られた溶液を前記カオトロ
ピック試薬で12〜18時間常温で処理することを特徴とす
るものである。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and has a constitution comprising a plasma suitable as a starting material for obtaining any biological substance or biogen substance, particularly albumin. Alternatively, a method of inactivating prionene, virus and other infectious agents present in serum with a chaotropic reagent, wherein the substance is treated with a chaotropic reagent or diluted with sterile pyrogen-free water at 1 g / l. Add surfactant and add 7
After stirring at a temperature of 0 ° C., the resulting solution is treated with the chaotropic reagent at room temperature for 12 to 18 hours.
【0014】即ち、プリオネンをカオトロピック試薬で
長時間常温(20〜25℃)で処理することは、画期的であ
るといえよう。この種の処理によって、例えば、アルブ
ミンのような生体物質が分解されることはない。また、
その処理によって、ウイルス及び細菌は確実に除去され
る。That is, it can be said that treating prionene with a chaotropic reagent at room temperature (20 to 25 ° C.) for a long time is epoch-making. This type of treatment does not degrade, for example, biological materials such as albumin. Also,
The treatment ensures that viruses and bacteria are removed.
【0015】カオトロピック試薬としては、全体量に対
して6〜8モルの尿素、又は全体量に対して1〜2モル
のナトリウムチオシアネートを添加することが好まし
い。これらの試薬は処理後、透析,膜濾過又はゲル濾過
クロマトグラフィによって、取り除くことが出来る。As the chaotropic reagent, it is preferable to add 6 to 8 mol of urea based on the whole amount, or 1 to 2 mol of sodium thiocyanate based on the whole amount. After treatment, these reagents can be removed by dialysis, membrane filtration or gel filtration chromatography.
【0016】病原因子を除去する確実性を高めるために
は、カオトロピック試薬での処理の前又はパイロジェン
を含まない滅菌水での希釈後に生体物質又はビオゲン物
質をpH約6.5に調節し、約1g/lの界面活性剤、特にはア
ニオン性界面活性剤を添加することが好ましい。界面活
性剤としては、アルキルスルフェート又はその誘導体、
好ましくはナトリウムアルキルスルフェート、及び/又
はサルコシネート、好ましくはナトリウム(N−ラウリ
ルサルコシネート)、及び/又はアルキルスルフォネー
トもしくはその誘導体のいずれか又はその混合物を添加
することが出来る。目的に応じて、希釈塩酸の投与によ
り、そのpH値を調節する。To increase the certainty of removing the pathogenic agent, the biological or biogen material is adjusted to a pH of about 6.5 before treatment with the chaotropic reagent or after dilution with sterile pyrogen-free water, to a pH of about 1 g / g. It is preferred to add 1 surfactant, especially an anionic surfactant. As the surfactant, alkyl sulfate or a derivative thereof,
Preferably, sodium alkyl sulfate and / or sarcosinate, preferably sodium (N-lauryl sarcosinate), and / or any of alkyl sulfonates or derivatives thereof or a mixture thereof can be added. If necessary, the pH value is adjusted by the administration of dilute hydrochloric acid.
【0017】更に、8〜10容量%のメチルアルコール又
はエチルアルコールを添加することが好ましい。Further, it is preferable to add 8 to 10% by volume of methyl alcohol or ethyl alcohol.
【0018】最後は、界面活性剤、場合によってはメチ
ルアルコール又はエチルアルコールの添加後、約70℃で
ゆっくり撹拌しながら、生体物質又はビオゲン物質を加
熱して、この温度では少なくとも15分間、好ましくは約
30分間更に撹拌し、その後、これを急速に冷却し、pH値
を4〜4.2に低下させて沈殿したグロブリンを分離す
る。Finally, after the addition of the surfactant, optionally methyl alcohol or ethyl alcohol, the biological or biogenic substance is heated at about 70 ° C. with slow stirring, at this temperature for at least 15 minutes, preferably about
The mixture is further stirred for 30 minutes, after which it is cooled rapidly and the pH is lowered to 4-4.2 to separate out the precipitated globulin.
【0019】本発明方法では、アルブミンとして、例え
ば、ウシ血清アルブミン(BSA)が選ばれる。それが
大量に使用され、材料源である「ウシ」がBSEによっ
て危険にさらされているからであり、更に、これに対す
るヒトの類似物であるヒト血清アルブミン(HSA)が
極めて重要な治療薬だからである。この方法は変更を加
えずに直接HSAの産出に転用可能であり、また、この
方法は、動物又はヒト起源の他の蛋白質に修飾を加える
ことができる。例えば、血清及びIgGを挙げることが出
来る。In the method of the present invention, for example, bovine serum albumin (BSA) is selected as the albumin. Because it is used in large quantities and the source of material "bovine" is endangered by BSE, and because its human analogue, human serum albumin (HSA), is a very important therapeutic agent It is. The method can be diverted directly to the production of HSA without modification, and the method can modify other proteins of animal or human origin. For example, serum and IgG can be mentioned.
【0020】本発明方法をBSAに適用する場合の例は
次のとおりである。それからBSA又はHSAを得られ
る血漿又は血清を水で希釈した後、そのpH値を6.5に調
製して、強力な界面活性剤、好ましくはナトリウムラウ
リルスフェート(ドデシル硫酸ナトリウム)もしくは類
似体、ナトリウム−(N−ラウリルサルコシネート)又
は他の類似体(1g/l)の存在下で、エチルアルコール
又はメチルアリコールを添加して、15〜30分間70℃の温
度で撹拌する。その後、直ちにpH値を4.0〜4.2に調節
し、沈殿したグロブリンを除いて、清澄な溶液を中和す
る。An example in which the method of the present invention is applied to BSA is as follows. After diluting the plasma or serum from which BSA or HSA is obtained with water, the pH value is adjusted to 6.5 and a strong surfactant, preferably sodium lauryl sulfate (sodium dodecyl sulfate) or an analogue, sodium- In the presence of (N-lauryl sarcosinate) or other analogues (1 g / l), add ethyl alcohol or methyl alicol and stir at a temperature of 70 ° C. for 15-30 minutes. Thereafter, the pH is immediately adjusted to 4.0-4.2 to remove the precipitated globulin and neutralize the clear solution.
【0021】高濃度の強いカオトロピック試薬(好まし
くは、尿素6〜8モル又はナトリウムチオシアネート1
〜2モル)を添加してから、この溶液を室温で16時間放
置し、その後、この試薬を、好ましくは、クロマトグラ
フィ、透析又は膜濾過によって除去することが出来る。
次いで、塩が除かれた溶液を、濃縮してから添加物を加
え、濾過滅菌して滅菌状態で他の容器に移し変えるか、
特には凍結乾燥によって乾固させる。溶液の熱後処理
(安定剤の存在下での「パスツール滅菌」)又は粉末の
熱後処理(蒸気注入)を組み合わせることが出来る。High concentrations of strong chaotropic reagents (preferably 6-8 moles of urea or sodium thiocyanate 1
22 mol), the solution is left at room temperature for 16 hours, after which the reagent can be removed, preferably by chromatography, dialysis or membrane filtration.
Then, the salt-free solution is concentrated and then added with an additive, sterilized by filtration, and transferred to another container in a sterilized state, or
In particular, it is made to dry by freeze-drying. The thermal post-treatment of the solution ("pasteur sterilization" in the presence of stabilizers) or of the powder (steam injection) can be combined.
【0022】尚、上記における血清又は血漿に代えて、
アルブミンが存在する他のいずれの出発物質、例えば、
胎盤血,コーン法による血漿分画された画分なども使用
される。In addition, instead of the above-mentioned serum or plasma,
Any other starting material for which albumin is present, for example,
Placental blood and a fraction obtained by plasma fractionation by the cone method are also used.
【0023】而して、有効性は、生物学的実験モデルに
おいて、原料血漿へのスクラピー/プリオネンの添加、
及びマウスの脳へのアルブミン溶液の注射によって証明
された。同様に、ウシのウイルス性下痢(BVD)ウイ
ルス、ウシの感染性鼻気管炎ウイルス、3型パライフル
エンザウイルス、口蹄病ウイルス、レトロ−ビスナウイ
ルス、及びヒツジのパラポクスウイルスといった従来の
ウイルスを高濃度で投与することによっても証明され
た。こうして処理されたアルブミン溶液は自己滅菌性が
あり、細菌の崩壊が見られた。Thus, the efficacy was determined by adding scrapie / prionene to the source plasma in a biological experimental model,
And by injection of the albumin solution into the mouse brain. Similarly, conventional viruses such as bovine viral diarrhea (BVD) virus, bovine infectious rhinotracheitis virus, type 3 pararifleenza virus, foot and mouth disease virus, retro-visna virus, and sheep parapoxvirus are It has also been demonstrated by administration at high concentrations. The albumin solution thus treated was self-sterilizing, and the bacteria were destroyed.
【0024】[0024]
【実施例】次に本発明の実施例について説明する。3g
のウシの凍結乾燥血漿(蛋白質2g に相当)を35mlの蒸
留滅菌水に溶解し、これに水とは混合しない4mlのエタ
ノールを添加した後、希塩酸でpHを6.5に調節し、45mg
(=0.1%)のラウリル酸ナトリウム(少なくとも純度9
5%)を溶解させた。総容量は44mlとなった。これに、
十分な安全施設(P3レベル実験室、層流フードなど)
のもとで、20%のスクラピー/脳/ホモジネート(力
価:2.10LD/g)225μl又は高濃度のウイルス溶液を添加
して均質化した。Next, an embodiment of the present invention will be described. 3g
Of bovine lyophilized plasma (equivalent to 2 g of protein) was dissolved in 35 ml of distilled sterilized water, and 4 ml of ethanol immiscible with water was added thereto, and the pH was adjusted to 6.5 with dilute hydrochloric acid.
(= 0.1%) sodium laurate (at least 9% pure)
5%) was dissolved. The total volume was 44 ml. to this,
Sufficient safety facilities (P3 level laboratory, laminar flow hood, etc.)
225 μl of 20% scrapie / brain / homogenate (titer: 2.10 LD / g) or a highly concentrated virus solution was added thereto to homogenize.
【0025】この溶液を70℃の水浴中に入れた。10分
後、内容物の温度は同様に70℃であり、続いて、上記の
処理をなお30分間行なった。10分間ごとに1分間マグネ
ットスターラーで撹拌した。インキュベーション終了
後、試料を氷上に移して冷却し、冷却された溶液を、20
0μlの塩酸でpHを4.2とし、更に均質化した。This solution was placed in a 70 ° C. water bath. After 10 minutes, the temperature of the contents was likewise 70 ° C., and the above treatment was continued for another 30 minutes. The mixture was stirred with a magnetic stirrer for 1 minute every 10 minutes. At the end of the incubation, the sample is transferred to ice and cooled, and the cooled solution is
The pH was adjusted to 4.2 with 0 μl of hydrochloric acid and homogenized.
【0026】このものを10分間4℃で6000rpm(4000 g
に相当) の遠心力によって沈殿したグロブリンを除去し
た。透明な上澄は傾斜法によって得られ、純粋なウシア
ルブミン溶液(容量:20.5ml)であった。This is 6000 rpm (4000 g) at 4 ° C. for 10 minutes.
Globulin) was removed by centrifugal force. The clear supernatant was obtained by decanting and was a pure bovine albumin solution (volume: 20.5 ml).
【0027】この溶液を、苛性ソーダ溶液250μlの添加
によって中和した(pH 7.0)。その後、15gの尿素を添
加して、容量を30mlに増量した結果、濃度は8モルとな
った。これらの溶液を、16時間室温(21℃)に放置し
た。The solution was neutralized (pH 7.0) by adding 250 μl of a sodium hydroxide solution. Thereafter, 15 g of urea was added to increase the volume to 30 ml, resulting in a concentration of 8 molar. These solutions were left at room temperature (21 ° C.) for 16 hours.
【0028】尿素の除去には、以下のように、ゲル濾過
クロマトグラフィ法を利用した。500mlの滅菌蒸留水に
溶かした15gのセファデックスG50(ファルマシア社、ウ
プサラ)を加熱し、一晩放置した。膨潤したゲルを、直
径5cm,高さ30cmのアクリル製カラムに充填し、滅菌蒸
留水(200ml)で洗浄した。流速は7.5ml/minであった。
この溶液30mlをカラムにかけてから、水100mlで洗浄し
た。得られた画分を50mlと40mlとに分けた。その後は、
溶出液中に蛋白質は全く認められなかった。この90mlを
凍結乾燥したところ、0.7gのウシ血清アルブミンが得ら
れた。For the removal of urea, gel filtration chromatography was used as follows. 15 g of Sephadex G50 (Pharmacia, Uppsala) dissolved in 500 ml of sterile distilled water was heated and left overnight. The swollen gel was packed in an acrylic column having a diameter of 5 cm and a height of 30 cm, and washed with sterilized distilled water (200 ml). The flow rate was 7.5 ml / min.
30 ml of this solution was applied to a column and washed with 100 ml of water. The obtained fraction was divided into 50 ml and 40 ml. After that,
No protein was observed in the eluate. This 90 ml was freeze-dried to obtain 0.7 g of bovine serum albumin.
【0029】数種の実験では、クロマトグラフィに代わ
るものとして、アミコンS-1モデル(カットオフ値:10,
000d)での膜濾過によって尿素を除去した。その際、約
1000mlの蒸留水で膜濾過を行ない、約50mlに濃縮してか
ら、凍結乾燥した。In some experiments, the Amicon S-1 model (cutoff value: 10,
The urea was removed by membrane filtration at 000d). At that time, about
The membrane was filtered with 1000 ml of distilled water, concentrated to about 50 ml, and then lyophilized.
【0030】次に、各種の生物学的試験について説明す
る。尚、これらの試験の結果は表1に示すとおりであっ
た。 スクラピー/BSEに関する生物学的試験: 上記のアルブミンを3mlの生理食塩水に溶解し、マウス
の脳の半分ごとに20μlの試薬を注射した。マウスの総
数は136匹、また、その系統は C57/B16であった。この
スクラピー/接種物(力価:2.10 LD/g)、即ち、8倍
希釈したものを陽性対照とし、また、スクラピー/接種
物を含まずに調製した上記のようなウシ血清アルブミン
を陰性対照とした。すべての接種は、12匹の動物1匹づ
つ行なった。即ち、12回繰り返したことになる。この試
験の結果は、陽性対照のものは罹病が確認されたのに対
し、陰性対照のものに病気や死亡は認められなかった。Next, various biological tests will be described. The results of these tests were as shown in Table 1. Biological test for scrapie / BSE: The above albumin was dissolved in 3 ml of saline and 20 μl of the reagent was injected into each half of the mouse brain. The total number of mice was 136, and the strain was C57 / B16. This scrapie / inoculum (titer: 2.10 LD / g), ie, an 8-fold dilution was used as a positive control, and bovine serum albumin as above prepared without scrapie / inoculum was used as a negative control. did. All inoculations were performed one by one with 12 animals. That is, it has been repeated 12 times. The results of this test showed that the positive control was ill, whereas the negative control did not show any illness or death.
【0031】従来のウイルスを使用した場合の生物学的
試験: 上記のBSAを細胞培養液に溶解した。この培地は哺乳
動物細胞用の栄養培地として使用され、哺乳動物細胞は
特異的ウイルスの宿主細胞となり得る。陽性(ウイルス
株溶液)及び陰性(培地のみ)の対照、ならびにアルブ
ミンの非特異的細胞障害試験を加えることによって試験
を行なった。この結果は、被験ウイルス株のいずれで
も、感染性ウイルス粒子は生存出来ず、この客観的な方
法によって、致死率は1/106(百万分の一)を超えた。Biological test using conventional virus: The above BSA was dissolved in a cell culture solution. This medium is used as a nutrient medium for mammalian cells, which can be host cells for specific viruses. The test was performed by adding positive (virus strain solution) and negative (medium only) controls, and a non-specific cytotoxicity test for albumin. The results show that no infectious virions were able to survive in any of the test virus strains, and with this objective method the mortality exceeded 1/10 6 (parts per million).
【0032】類似した試験で、血漿からのアルブミンの
調製に際して、界面活性剤として、N−ラウリルサルコ
シネートとラウリルスルフェートが同等の有効性を示す
ことを確かめたが、感染性物質の投与は行なわなかっ
た。測定されたパラメータは、両界面活性剤が98%以上
のもとでのBSAの収率及び純度であった。In a similar test, N-lauryl sarcosinate and lauryl sulphate were shown to be equally effective as surfactants in the preparation of albumin from plasma, but the administration of infectious substances Did not do. The parameters measured were the yield and purity of BSA with both surfactants above 98%.
【0033】インフルエンザウイルスのリボヌクレオ蛋
白質−粒子(核酸−蛋白質の相互作用を調べる実験モデ
ル)を処理する際、及びゼラチン−フィプロネクチンの
ような親和性結合を解離させる際、カオトロピック試薬
として、当量の尿素とナトリウムチオシアネートを試用
して有効性を証明した。In treating influenza virus ribonucleoprotein-particles (experimental model for examining nucleic acid-protein interactions) and dissociating affinity bonds such as gelatin-fipronectin, an equivalent amount of chaotropic reagent is used. Urea and sodium thiocyanate have been tried to prove their effectiveness.
【0034】[0034]
【表1】 [Table 1]
【0035】[0035]
【発明の効果】本発明は上述のとおりであって、あらゆ
る生体物質又はビオゲン物質、特にはアルブミンを得る
ための出発物質として適した血漿又は血清中に存在する
プリオネン、ウイルス及び他の感染因子をカオトロピッ
ク試薬で不活化する方法であって、前記物質をカオトロ
ピック試薬で処理する前又はパイロジェンを含まない滅
菌水で希釈した後、1g/lの界面活性剤を添加し、70℃
の温度で撹拌した後、得られた溶液をカオトロピック試
薬で12〜18時間常温で処理することにより、不活化する
方法であるから、生体物質又はビオゲン物質を分解せず
に、既知のすべてのウイルス群を崩壊させると共に、こ
れらの物質中に存在するプリオネンを簡易にしかも確実
に除去することが出来る。The present invention has been described above, and it is intended to remove prionene, virus and other infectious agents present in plasma or serum, which are suitable as starting materials for obtaining any biological substance or biogen substance, especially albumin. A method of inactivating with a chaotropic reagent, wherein before the substance is treated with the chaotropic reagent or diluted with sterile pyrogen-free water, 1 g / l of a surfactant is added, and 70 ° C.
After stirring at a temperature of 12 ° C., the resulting solution is treated with a chaotropic reagent at room temperature for 12 to 18 hours to inactivate the biological solution. The group can be disintegrated, and the prionene present in these substances can be easily and reliably removed.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI A61P 31/12 A61P 31/12 (56)参考文献 Proc.Natl.Acad.Sc i.USA Vol.79,No.17 (1982)p5220−5224 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) A01N 61/00 WPI(DIALOG)──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI A61P 31/12 A61P 31/12 (56) Reference Proc. Natl. Acad. Sc i. USA Vol. 79, no. 17 (1982) p5220-5224 (58) Fields investigated (Int. Cl. 7 , DB name) A01N 61/00 WPI (DIALOG)
Claims (9)
にはアルブミンを得るための出発物質として適した血漿
又は血清中に存在するプリオネン、ウイルス及び他の感
染因子をカオトロピック試薬で不活化する方法であっ
て、前記物質をカオトロピック試薬で処理する前又はパ
イロジェンを含まない滅菌水で希釈した後、1g/lの界
面活性剤を添加し、70℃の温度で撹拌した後、得られた
溶液を前記カオトロピック試薬で12〜18時間常温で処理
することを特徴とするプリオネン、ウイルス及び他の感
染因子の不活化方法。1. A method for inactivating with a chaotropic reagent any prionene, virus and other infectious agents present in plasma or serum which are suitable as starting materials for obtaining any biological or biogenic substance, in particular albumin. Before treating the substance with a chaotropic reagent or diluting with sterile pyrogen-free water, adding 1 g / l of a surfactant and stirring at a temperature of 70 ° C., the obtained solution was treated with the chaotropic reagent. A method for inactivating prionene, virus and other infectious agents, which is carried out at room temperature for 12 to 18 hours.
して6〜8モル濃度の尿素を使用することを特徴とする
請求項1に記載の方法。2. The method according to claim 1, wherein urea is used as a chaotropic reagent in a concentration of 6 to 8 mol based on the total amount.
して1〜2モル濃度のナトリウムチオシアネートを使用
することを特徴とする請求項1に記載の方法。3. The method according to claim 1, wherein sodium thiocyanate is used as a chaotropic reagent in a concentration of 1 to 2 mol based on the total amount.
はゲル濾過クロマトグラフィによる処理後に除去するこ
とを特徴とする請求項1ないし3のいずれかに記載の方
法。4. The method according to claim 1, wherein the chaotropic reagent is removed after treatment by dialysis, membrane filtration or gel filtration chromatography.
ロジェンを含まない滅菌水での希釈後、生体物質又はビ
オゲン物質のpH値を6.5の弱酸性に調節し、1g/lのアニ
オン系界面活性剤を添加することを特徴とする請求項1
ないし4のいずれかに記載の方法。5. Before the treatment with a chaotropic reagent or after dilution with sterile pyrogen-free water, the pH of the biological substance or biogen substance is adjusted to a weak acidity of 6.5, and 1 g / l of an anionic surfactant is added. 2. The method according to claim 1, wherein said additive is added.
5. The method according to any one of items 1 to 4.
ト又はその誘導体、又は、ナトリウムアルキルスルフェ
ート及び/又はサルコシネート、若しくは、ナトリウム
(N−ラウリルサルコシネート)及び/又はアルキルス
ルフォネート若しくはその誘導体を添加することを特徴
とする請求項5に記載の方法。6. As a surfactant, alkyl sulfate or a derivative thereof, or sodium alkyl sulfate and / or sarcosinate, or sodium (N-lauryl sarcosinate) and / or alkyl sulfonate or a derivative thereof is used. 6. The method according to claim 5, wherein the addition is performed.
とを特徴とする請求項5又は6に記載の方法。7. The method according to claim 5, wherein the pH value is adjusted by administering dilute hydrochloric acid.
チルアルコールを添加することを特徴とする請求項5な
いし7のいずれかに記載の方法。8. The method according to claim 5, wherein 8 to 10% by volume of methyl alcohol or ethyl alcohol is added.
コール又はエチルアルコールの添加後、70℃でゆっくり
撹拌しながら生体物質又はビオゲン物質を加熱して、こ
の温度で15〜30分間更に撹拌してから、これを急速に冷
却し、pH値を4〜4.2の強酸性に低下させて、沈殿した
グロブリンを分離することを特徴とする請求項1ないし
8のいずれかに記載の方法。9. After addition of the surfactant, optionally methyl alcohol or ethyl alcohol, the biological or biogenic substance is heated with gentle stirring at 70 ° C. and further stirred at this temperature for 15 to 30 minutes, 9. The process according to claim 1, wherein the globulins are rapidly cooled and the pH is lowered to a strongly acidic pH of 4 to 4.2 to separate the precipitated globulin.
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