JP3005400B2 - 抗原または抗体濃度の測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、被検液中の抗原または
抗体濃度の測定方法に関する。詳しくは、試薬の測定限
界を超えた被検液を中の抗原または抗体の濃度を高精度
で且つ正確に測定することが可能な抗原または抗体濃度
の測定方法である。

【０００２】

【従来の技術】従来、不溶性担体粒子に物理吸着あるい
は共有結合の形成により抗体または抗原を固定化した不
溶性担体粒子（以下、固定化担体粒子と略す）と血清や
尿などの被検液中の対応する抗原との間における抗原抗
体反応に基づく凝集反応あるいは凝集阻止反応を観察す
ることにより、被検液中の対応する抗原を測定する免疫
学的測定方法が知られている。

【０００３】また、上記の固定化担体粒子の分散液より
なる試薬と複数の被検液とを反応させて得られる反応液
中の不溶性担体の凝集状態の定量方法としては、反応液
に光を照射し、その散乱光または透過光の強度より各被
検液中の抗原または抗体の濃度を求める方法が一般的で
ある。

【０００４】かかる方法は、測定の自動化が可能なこと
から、被検液中の抗原または抗体の濃度を自動的に定量
可能な自動分析機を利用して広く普及している。

【０００５】従来より行われていた一般的な測定方法を
臨床的診断に用いる場合について説明すると、抗原また
は抗体の濃度が個体間ないしは採取時期などで顕著に異
なると予想される場合においては、まず所定の測定条件
下で抗原または抗体の濃度を測定し、抗原または抗体の
濃度が該試薬の測定範囲を外れた被検液については、測
定条件の内、試薬に関する条件は実質的に変えず、測定
に供する被検液の濃度を増減して再度同様な測定する方
法が一般的に採用されていた。

【０００６】例えば、検体中の抗原または抗体濃度が高
く、所定の測定条件下で初回測定時に測定上限を超すも
のが存在する場合、（Ａ）被検液を所定倍数に希釈して
被検液の濃度を調整して再度測定し、得られた測定値に
所定希釈倍数を乗じる測定方法、（Ｂ）被検液量を初回
測定条件より減じて測定する方法がある。

【０００７】また、検体中の抗原または抗体濃度が低
く、所定の測定条件下で初回測定時に測定下限に満たな
いものが存在する場合、（Ｃ）被検液を所定倍数に濃縮
して再度測定する方法、（Ｄ）被検液の量を初回測定条
件より増して測定する方法がある。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記し
た従来の方法には以下のような欠点が存在する。

【０００９】即ち、（Ａ）の方法は、測定項目によって
強弱はあるが、希釈液の性状により、測定値が干渉を受
ける場合があり、希釈液の選定が困難な場合がある。ま
た、希釈操作を精度良く正確に行う方法にも注意を必要
とし、用手で希釈する場合は誤差要因を含む欠点があ
る。また自動分析機に希釈機能が付加されている場合は
用手希釈より良好な精度および正確性が期待できるが、
通常この方法では単位時間当りの測定数すなわち処理能
力が半減したり、希釈液の使用が制限を受けて使用でき
ない場合があるなどの欠点がある。また、自動分析機に
よる希釈では、分取に所定の液量以上の量の被検液がな
いと、機械的な希釈が不能となり、必要以上に貴重な被
検液を使用するという問題もある。

【００１０】また、（Ｂ）の方法では、自動分析機で再
現良く分注できる被検液量の下限が存在し、初回測定条
件が自動分析機の下限に近ければこの方法は採用できな
い。また、自動分析機の試料分注量の上限と下限の範囲
内で初回測定と被検液量を減じた再測定の各試料分注量
が設定できても、自動分析機の分注精度は一般に検体量
と反比例するため、再測定の値は相対的に精度が不良と
なる。

【００１１】更に、（Ｃ）の方法においては、被検液の
濃縮縮操作中に少なからず変性を受ける欠点があり、か
つ濃縮操作自体が煩雑で迅速性にも劣るため自動分析装
置を用いる大量迅速測定には不適である。

【００１２】更にまた、（Ｄ）の方法によれば、自動分
析機では少量の被検液でも再現良く分注できる様に工夫
されている反面、再現良く分注できる被検液の量の上限
が存在する。そのため、初回測定条件が被検液の分注量
の上限に近ければこの方法は採用できない。また、自動
分析機の試料分注量の上限と下限の範囲内で初回測定と
試料量を増した再測定の各試料分注量が設定できても、
反応液中の検体濃度が被検液の増加に比例して増すた
め、該被検液中の測定対象のみならず反応に干渉する物
質の反応液中の濃度も比例して増加する。従って、この
方法では本来期待される反応以外の非特異的な反応が発
生し、抗原または抗体の濃度を正確に測定することがで
きないという欠点もある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、自動分析
機を使用した場合においても、抗原または抗体の濃度が
試薬の測定範囲を外れた被検液を含む可能性のある多数
の被検液を短時間に且つ精度良く測定し得るに好適な測
定方法を確立する目的で鋭意研究してきた。

【００１４】その結果、上記抗原または抗体の濃度が試
薬の測定範囲を外れた被検液について、反応液中の被検
液の割合を実質的に変えることなく、該反応に関与しな
い液体の該試薬中の不溶性担体粒子に対する割合を増減
して、試薬と混合後の反応液中における不溶性担体粒子
の濃度を変え、再度抗原または抗体の濃度を測定するこ
とにより、かかる問題を解決することができることを見
い出し、本発明を完成するに至った。

【００１５】 即ち、本発明は、抗体または抗原を固定
させた不溶性担体粒子の分散液よりなる試薬と、多数の
被検液とを反応させ、反応液中における不溶性担体粒子
の凝集状態により該被検液の抗原または抗体の濃度を測
定する方法において、予め不溶性担体粒子の特定濃度を
低減させた試薬により被検液の全てを測定して、その測
定値が所定の基準値未満である大部分の被検液を確認し
た後、次に所定の基準値以上である残余の被検液につい
て特定濃度の試薬により再測定することを特徴とする抗
原または抗体濃度の測定方法である。

【００１６】本発明で用いる不溶性担体粒子は、保存時
及び測定時に接触する液に対して実質的に不溶性であれ
ば、有機高分子体、無機高分子体の区別なく公知のもの
が特に制限なく使用できる。例えば、ポリスチレン、ス
チレンーブタジエン共重合体、スチレンーメタクリル酸
共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイ
ンーエチレングリコールジメタクリレート共重体の様な
乳化重合法により得られる有機高分子ラテックス粒子な
どの有機高分子物質の微粒子、あるいはシリカ、シリカ
ーアルミナ、アルミナの様な無機酸化物または該無機酸
化物などにシランカップリング処理などの操作で官能基
を導入した無機粒子等の材質よりなる粒子が挙げられ
る。

【００１７】また、不溶性単体粒子の形状も限定される
ものではない。一般に好適に使用されるものを例示する
と、平均粒子径が１．０μｍ程度以下、好ましくは０．
０５〜０．４μｍの不溶性担体粒子である。

【００１８】本発明において、不溶性担体粒子に固定化
する抗体または抗原は特に限定的でなく、公知のものが
使用できる。一般的に好適に使用される代表的なものを
例示すれば、変性ガンマグロブリン、抗核因子、ヒトア
ルブミン、抗ヒトアルブミン抗体、イムノグロブリンＧ
（ＩｇＧ）、抗ヒトＩｇＧ抗体、イムノグロブリンＡ
（ＩｇＡ）、抗ヒトＩｇＡ抗体イムノグロブリンＭ（Ｉ
ｇＭ）、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＥ抗体、ストレ
プトリジンＯ、ストレプトキナーゼ、ヒアルロニダー
ゼ、Ｃ−反応性蛋白質（ＣＲＰ）、抗ヒトＣＲＰ抗体、
抗ヒトアルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）抗体、抗
ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体、抗ヒト絨毛性ゴナド
トロピン（ｈＣＧ）抗体、抗エストロゲン抗体、抗イン
シュリン抗体、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）、抗ＨＢｓ
抗体、梅毒トレポネマ（ＴＰ）抗原、風疹抗原、インフ
ルエンザ抗原、補体Ｃ１ｑ、抗Ｃ１ｑ抗体、抗Ｃ３抗
体、抗Ｃ４抗体、抗トランスフェリン抗体などがある。

【００１９】本発明においては、不溶性担体粒子に測定
対象である被検液中の抗原または抗体と反応しうる抗体
または抗原を選択して固定化する。かかる固定化の方法
は、物理的吸着、化学的共有結合の形成のいずれでも良
いが、物理的吸着能の高い蛋白質例えば抗体や高分子量
蛋白の固定には物理的吸着が好適であり、物理的吸着能
の低いホルモン類、ハプテン類の固定には化学的共有結
合の形成が好適に用いられる。これらの固定化方法につ
いてはすでに多くの方法が提案されており、固定化する
抗体の特性に合わせて公知の方法から適当な固定化方法
を選択して実施すれば良い。例えば、分散媒中で抗体ま
たは抗原を必要に応じて緩衝液または架橋剤の存在下に
不溶性担体粒子と混合すれば良い。

【００２０】不溶性担体粒子に抗体を固定化する際の分
散媒および固定化担体粒子の分散媒は特に限定的ではな
く公知のものが使用されるが、固定化担体粒子の保存中
の安定性と、凝集反応時の反応の再現性の観点からみて
適宜選べば良く、また上記の架橋剤を使用する場合には
分散媒中の成分が架橋剤と反応しない分散媒を用いる必
要がある。好適に使用される分散媒としては、リン酸緩
衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、トリス−塩
酸緩衝液、塩化アンモニウム−アンモニア緩衝液、など
の緩衝液が挙げられる。

【００２１】本発明において、試薬は、抗体または抗原
を固定化した不溶性担体粒子を被検液との反応に実質的
に関与しない液体に懸濁させることにより得ることがで
きる。 上記被検液との反応に実質的に関与しない液体
は、かかる機能を有するものであれば特に制限されな
い。一般には上記分散媒の中から選択されるが、その他
に、水、生理食塩水等も有効に使用することができる。

【００２２】また、試薬における、不溶性担体粒子の濃
度は特に限定されるものではないが、一般には反応時に
０．００５重量％以上、好ましくは０．０１〜０．５重
量％の範囲より決定することが好ましい。

【００２３】更に、試薬は、固定化担体粒子の懸濁液の
みから成る形態の一液型試薬のみならず、該固定化担体
粒子を含む懸濁液と他の試薬成分を含む液或いは該懸濁
液の希釈液よりなる２成分から成る二液型試薬、また、
他の試薬成分を含む三液型試薬として使用することがで
きる。

【００２４】本発明において、上記試薬と被検液は一定
の割合で混合され、反応液中の不溶性担体粒子の凝集状
態により被検液中の抗原または抗体の濃度が測定され
る。

【００２５】一般に、かかる濃度の測定方法は、反応の
進行に対する散乱光または透過光の強度の差が比較的大
きく、感度に優れ、且つ被検液中に通常共存する乳ビ、
ヘモグロビン、ビリルビン等の干渉が比較的少なく、さ
らに自動分析機に搭載した光学系の直線性が比較的良好
となる波長域、例えば４００〜１０００ｎｍ、好ましく
は５００〜９５０ｎｍの範囲の波長の光線を反応液に照
射し、反応開始後の２点以上の特定時間における上記反
応液の散乱光または透過光の強度の差を測定し、予め作
製した検量線より各被検液中の抗原または抗体の濃度を
求めることにより行われる。

【００２６】不溶性担体粒子の粒子径については、粒子
径が大きい場合、凝集にともなう粒子径の変化量は大き
いが凝集反応速度は遅くなる傾向があり、粒子径が小さ
いとブラウン運動性が活発で凝集反応速度は速いが、一
次粒子径が小さいために凝集反応にともなう粒子径の変
化量は小さくなる傾向がある。

【００２７】そのため、これらの点を勘案して、測定感
度が高くなるよう、上記粒子径と測定波長とを適宜組み
合わせて実施すると好適である。

【００２８】本発明において、重要な要件は、抗原また
は抗体の濃度が試薬の測定範囲を外れた被検液につい
て、その抗原または抗体の濃度の再測定を、初回測定時
の反応液中の固定化担体粒子濃度に対する該再測定時の
当該粒子濃度との比（以下、粒子濃度比と略す。）を、
試薬と被検液との反応に実質的に関与しない液体の該不
溶性担体粒子に対する割合を増減することにより変える
ことが重要である。

【００２９】上記粒子濃度比の変更方法は、反応液中に
おける被検液の割合を実質的に変更しないものであれば
特に制限されるものではない。

【００３０】例えば、粒子濃度比を下げる方法として
は、試薬と被検液との反応に実質的に関与しない液体に
よって不溶性担体粒子を含む試薬を希釈する方法、ま
た、二液性試薬の場合は、上記希釈する方法の他、該不
溶性担体を含む試薬成分を減少させ、かかる減少分に見
合う量の該液体を他の試薬成分の希釈或いは反応に実質
的に関与しない液体を別途反応系に供給する方法が挙げ
られる。

【００３１】また、粒子濃度比を上げる方法としては、
試薬調製時に不溶性担体粒子と混合する分散媒の量を減
少させて試薬濃度を上げる方法が挙げられる。

【００３２】また、上記粒子濃度比の変更は、一般的
に、希釈する場合は上記の粒子濃度比が２／３以下とな
るように、濃縮する場合は上記の粒子濃度比が１．５以
上となる様に設定すれば良好な効果が得られる。

【００３３】本発明の方法による被検液中の抗原または
抗体濃度の測定方法は、例えば以下の如く実施し得る。

【００３４】まず、初回測定条件を設定するために、使
用する自動分析機に試薬をセットする。一般的な自動分
析機には、試料分注、試薬分注、試料及び試薬からなる
反応液の撹拌、反応液の保温、反応液の透過光あるいは
散乱光強度の測定と濃度の演算、測定結果の出力などを
自動的に行う機能があり、反応を行う光学セル、多波長
測定できる分光光学計を搭載している。また、試薬の保
冷、光学セルの洗浄、被検液の希釈、などの諸機能を付
加した自動分析機もある。

【００３５】尚、２液型試薬を使用する場合、自動分析
機においては試薬の添加順に、第１の試薬成分である緩
衝液を反応液１（以下、Ｒ１と略す。）と呼び、第２の
試薬成分である、固定化担体粒子を含む懸濁液を反応液
２（以下、Ｒ２と略す。）と呼ぶ。

【００３６】次いで、測定対象となる抗体または抗原を
含む被検液をセットする。

【００３７】また、測定に先立ち、測定波長を決める
が、固定化担体粒子の粒子径により好適な測定波長域が
存在するため、この波長域の中で自動分析機の分光計の
直線性、感度と反応時の固定化担体粒子の濃度とを勘案
して決定すれば良い。

【００３８】初回測定条件を設定するにあたり、被検
液、Ｒ１、Ｒ２の暫定的な使用量を設定して測定し、上
記複数の被検液に対する反応開始後の２以上の時点にお
ける反応液の散乱光または透過光の強度（以下、光学密
度と呼ぶ。）を測定し、反応開始後の経過時間に対して
上記光学密度をプロットしていわゆるタイムコースを得
る。各被検液のタイムコースが単調増加する２時点間
で、かつその２時点間の光学密度の差が各被検液ごとの
差異が大きい特定の２時点を選ぶ。次いで、２時点間の
光学密度の差を被検液濃度に対してプロットして検量線
を得る。検量線は直線、曲線に関わらず任意の関数から
選んだ検量線式で近似して近似式の係数を決定する。自
動分析機によっては検量線の作成も自動的に実施するも
のがある。

【００３９】次いで、この検量線を使用して種々の被検
液を測定し、暫定的な測定条件下において上記検量線を
用いて種々の被検液を測定する。例えば一定間隔で希釈
した被検液を測定して希釈直線性を評価し、同一被検液
を複数回繰り返し測定して再現性を評価し、特異性およ
び再現性が良好な測定範囲を見極める。この範囲が臨床
的に意義の大きい境界値や濃度分布の最頻値を含まない
場合や、通常存在する濃度分布幅の上限または下限に対
して偏る場合には、暫定的に決めた測定条件を見直して
再度測定条件の検討を繰り返す。

【００４０】尚、既に他の自動分析機で初回測定条件が
決定できている場合などは、その条件を当該自動分析機
の条件に換算して設定すれば良い。

【００４１】初回測定条件を決定すれば、一般的な濃度
の被検液は測定が可能である。かかる初回測定を複数の
被検液に対して実施し、その測定範囲を外れる被検液が
存在する場合、本発明においては、前記方法の一態様に
よれば、初回測定時のＲ２中の固定化担体粒子濃度とは
異なる再測定のためのＲ２の当該粒子濃度が設定され
る。

【００４２】即ち、被検液中の測定対象物の濃度が初回
測定条件の測定上限を超える場合には、例えば、当該粒
子濃度比を２として、再測定時の当該粒子濃度を初回の
２倍に設定する。逆に被検液中の測定対象物の濃度が初
回測定条件の測定下限を超える場合には例えば当該粒子
濃度比を１／２として、再測定時の当該粒子濃度を初回
の１／２に設定する。

【００４３】上記方法において、試薬の不溶性担体粒子
濃度以外の測定条件は基本的に変えないが、測定波長な
どは再測定条件における光学密度を勘案して適宜設定す
れば良い。

【００４４】再測定用の試薬の不溶性担体粒子の濃度調
整は前記方法によって適宜実施すればよい。この場合、
自動分析機で試薬をセットする場所に余裕がある場合に
は調製し直した再測定用試薬も初回測定用の試薬と併せ
てセットすれば良いし、自動分析機で試薬をセットする
場所に余裕が無い場合には既にセットした初回測定用試
薬と再測定用試薬とを差し替えるだけの簡単な操作で本
発明が実施できる。

【００４５】また、前記方法において、検量線は、各々
の測定条件下で別途作成するのが一般的である。

【００４６】初回測定条件の測定範囲を超える被検液
は、上記で設定した再測定条件下で測定するが、かかる
場合でも測定範囲を外れる場合は、再度当該粒子濃度を
設定しなおせば良い。

【００４７】初回測定で測定範囲内に入るのか、外れた
かの判定および再測定の実施も自動分析機の機種によっ
ては自動的に実施でき、最終測定結果を出力することが
可能である。また、この作業を手動で実施する場合も初
回測定値とその測定範囲とを比較して再測定の要否を判
断し、必要な場合には再測定開始の指示をするのみで最
終結果を得ることができる。

【００４８】本発明の測定方法において、不溶性担体粒
子の濃度を増したために、反応液の散乱光ないし透過光
強度が分光系の可使範囲を超す場合には測定波長を初回
測定条件より長波長側に変えれば良い。逆に、不溶性担
体粒子の濃度を減じたため、反応液の散乱光ないし透過
光強度が低下して光学系の再現性に問題が生じる場合に
は測定波長を初回測定条件より短波長側に変えれば良
い。

【００４９】

【発明の効果】以上の説明より理解されるように、本発
明によれば、複数の被検液中の抗原または抗体の濃度
を、抗体または抗原を固定化させた不溶性担体粒子の分
散液よりなる試薬と複数の被検液とを一定の割合で反応
させ、該反応液中の不溶性担体粒子の凝集状態により各
被検液中の抗原または抗体の濃度を測定するに際し、該
試薬の測定範囲を外れた被検液について、上記の反応に
実質的に関与しない液体の該不溶性担体粒子に対する割
合を増減し、反応液中における不溶性担体粒子の濃度を
変えて抗原または抗体の濃度を測定することにより、抗
原または抗体の濃度が試薬の測定範囲を外れた被検液を
含む可能性のある多数の被検液の該抗原または抗体の濃
度を短時間に且つ精度良く測定することが可能である。

【００５０】従って、試薬の濃度を一定にして、被検液
を操作して測定範囲を外れた被検液を測定していた従来
の測定方法の有する以下の欠点を効果的に防止できる。

【００５１】被検液の希釈ないし被検液量の低減が必要
な場合、被検液が無駄に消費される、被検液が少ないと
再測定不能、希釈液の選定が困難、希釈操作に起因する
誤差、少量試料の採取誤差などの問題がある。被検液の
濃縮ないし被検液量の増量が必要な場合、濃縮操作中の
変性、濃縮操作自体が煩雑で迅速性に劣る、反応液中の
被検液濃度に比例して干渉物質濃度も増加し本来期待さ
れる以外の非特異的な反応が発生して異常値を来す。

【００５２】本発明の方法によれば、あらかじめ反応液
中の固定化担体粒子濃度を変えて試薬を調製し、検量線
を作成しておくのみの簡単な態様でかかる測定を行うこ
とが可能であり、特に、自動分析機を用いた大量迅速処
理に好適な測定が可能となる。

【００５３】即ち、自動分析機を使用した測定方法にあ
っては、予め独立して検量線が作製された濃度の異なる
試薬を詰めた試薬瓶を差替えるのみの簡単な操作によ
り、最初の測定で試薬の測定範囲を外れた被検液の測定
精度及び正確性を損なうことなく抗原または抗体の濃度
を測定することができる。

【００５４】

【実施例】以下、実施例によりさらに本発明を詳細に説
明するが本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。

【００５５】実施例１ （１）Ｃ−反応性蛋白質測定試薬の調製 平均粒子径０．１２３μｍのポリスチレンラテックス粒
子をトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５、以下トリス緩
衝液と略す。）で希釈し、ラテックス濃度が１重量％の
懸濁液を調製する。次いでＣ−反応性蛋白質（以下「Ｃ
ＲＰ」と略す）をヤギに免疫して得た抗ＣＲＰ抗血清よ
り塩析処理により分画した抗ＣＲＰヤギＩｇＧ分画をト
リス緩衝液で希釈し、蛋白濃度２ｍｇ／ｍｌの溶液を調
製する。上記ラテックス懸濁液１容に抗ＣＲＰヤギＩｇ
Ｇ分画の１容を加え３７℃で２時間反応させる。さらに
ウシ血清アルブミンを最終濃度で０．０５重量％添加し
た後遠心分離し、上清を除去した後沈澱をトリス緩衝液
に再分散し、ラテックス濃度を０．２５％に調製しラテ
ックス試液（Ｒ２）を得た。

【００５６】一方、トリス緩衝液に食塩０．０５ｍｏｌ
／ｌ、ウシ血清アルブミンを０．５重量％、塩化コリン
５重量％となる様に添加した緩衝液（Ｒ１）を調製し、
Ｒ１とＲ２とよりなるＣＲＰ測定試薬を得た。

【００５７】（２）初回測定条件の設定 ＣＲＰは個体並びに病態によっては５０ｍｇ／ｄｌを超
す異常高濃度を示す一方、健常人では０．１ｍｇ／ｄｌ
以下にも分布する蛋白質抗原である。自動分析機として
東芝（株）社製のＴＢＡ−８０ＦＲ型自動分析機を用
い、上記で得たＣＲＰ測定試薬のＲ１を装置内で、３７
℃に保温されたの光学セル中に３００μｌ分注し、ここ
へ被検液としてヒト血清をそのまま試料として３μｌ添
加して攪拌し、約５分間３７℃に保った。その後、ＣＲ
Ｐ測定試薬のＲ２を５０μｌ添加して攪拌し、凝集反応
を開始させた。

【００５８】以上の操作は自動的に実施され反応開始後
約３０秒後と１２０秒後の間の約９０秒間の波長５７２
ｎｍに於ける吸光度の変化を測定した。

【００５９】（３）検量線の作成とＣＲＰ濃度既知試料
の測定 ＣＲＰ濃度３．４０ｍｇ／ｄｌの血清とトリス緩衝液を
各々被検液として上記の初回測定条件で各々５回ずつ測
定した。その結果、ＣＲＰ濃度３．４０ｍｇ／ｄｌの血
清とトリス緩衝液の上記吸光度の変化量は平均で各々
０．１９４と０．００１となった。この値より検量線は
ｙ＝（ｘ−０．００１）／０．０５６８となった。

【００６０】次いでＣＲＰ濃度２９．８ｍｇ／ｄｌの血
清をトリス緩衝液で希釈し、ＣＲＰ濃度が０．１４、
０．４１、１．２４、３．７３、５．６０、７．４６、
１１．２、１４．９、２２．４、２９．８ｍｇ／ｄｌの
被検液を得て、同様に上記の初回測定条件でそれぞれ測
定した。

【００６１】各５回の測定結果より平均値、標準偏差、
および標準偏差を平均値で除してパーセント表示した変
動係数を求めた。

【００６２】また、平均値を上記検量線に代入して得た
平均値を各被検液の既知濃度で除して平均回収率を求め
た。得られた結果を表１にまとめた。

【００６３】表１より、正確性に優れる平均回収率０．
９５〜１．０５の濃度範囲は０．４１〜１６．８ｍｇ／
ｄｌの間であり、０．１４及び２２．４、２９．８ｍｇ
／ｄｌは測定範囲外となった。

【００６４】また、精度に優れる変動係数５％以内の範
囲は、０．４１ｍｇ／ｄｌ以上となり、０．１４ｍｇ／
ｄｌは測定範囲外となった。

【００６５】（４）再測定条件 上記（１）で得たＣＲＰ試薬のラテックス試液（Ｒ２）
をトリス緩衝液で２．５倍に希釈してラテックス濃度が
０．１０％のＲ２を調製した。反応時のラテックス濃度
を変えた以外は（３）と同様に操作して測定を実施し、
検量線Ｙ＝（Ｘ−０．００２）／０．０２５３を得た。

【００６６】試薬を上記Ｒ２を使用したものに変えた結
果、ＣＲＰ濃度が０．１４ｍｇ／ｄｌの試料に対する回
収率は０．９８、再現性は４％を示し、測定下限は０．
１４ｍｇ／ｄｌまでとなった。

【００６７】

【表１】

【００６８】実施例２、比較例１ 固定化担体粒子を用いた光学的な測定方法においてはリ
ウマチ因子（以下、ＲＦと略す。）が固定化した抗体と
反応性を有しており、誤って高値を示す場合がある事が
知られている。

【００６９】ＲＦ濃度が１０００国際単位／ｍｌ以上の
ＲＦ異常高値の血清を含む５種類の被検液につき、先
ず、本発明の方法とは測定原理が異なるが各種ＣＲＰの
測定方法のうち比較的干渉物質の影響を受けにくい単純
免疫拡散法を測定原理とする、ヘキスト社製『商品名：
ＬＣパルチゲンＣＲＰ』でＣＲＰ濃度を測定したとこ
ろ、各々０．２７、４．３、１．１５、７．９、１０．
８ｍｇ／ｄｌを示した。

【００７０】上記被検液を実施例１で行った方法に準じ
て測定した結果を表２に示す。

【００７１】一方、上記において、測定範囲を外れた検
体液について、被検液量を２．５倍とした以外は上記の
初回測定時と同じ試薬を使用してと同様な操作で測定し
て比較例１として表２に併せて示した。

【００７２】実施例１では、測定範囲を外れた被検液の
ＲＦ強陽性被検液についてもＬＣパルチゲンに対する回
収率が１．００に近く良好な正確性を示したが、比較例
１の測定値は誤差が大きく、被検液中の干渉物質の影響
を受けたものと考えられた。

【００７３】

【表２】

【００７４】実施例３ 被検液中のＣＲＰ濃度が初回測定条件の測定上限であ
る、ＣＲＰ濃度１４．９ｍｇ／ｄｌを超えた検体液の再
測定条件として上記実施例１の（１）で得たＣＲＰ測定
試薬のラテックス試液（Ｒ２）中のラテックス濃度を２
倍に調製し、ラテックス濃度が０．５０％のＲ２を得
た。

【００７５】上記のＲ１を使用した試薬を使用して、反
応時のラテックス濃度及び測定波長を７００ｎｍに変え
た以外は実施例１の（３）と同様に操作して、検量線Ｙ
＝（Ｘ−０．００４）／０．０３０６を得た。

【００７６】その結果、ＣＲＰ濃度が２２．４及び２
９．８ｍｇ／ｄｌの被検液に対する回収率は０．９９及
び０．９７、再現性は１．０及び０．９％を示し、測定
範囲の上限は２９．８ｍｇ／ｄｌまでとなった。

【００７７】上記方法の更に具体的な実施の態様とし
て、病院外来患者でＣＲＰの測定依頼があった２００被
検液を使用した実験を実施した。

【００７８】先ず、実施例１の初回測定条件で測定した
ところ、９被検液が測定上限１４．９ｍｇ／ｄｌを超し
た。実施例１では測定上限を超えた被検液の入ったサン
プルカップを集め、濃度を変えた試薬ビンを自動分析機
にセットし替えて再測定するのみの操作で簡単に再測定
することができた。

【００７９】一方、従来法の被検液を希釈する方法を実
施しようとしたところ、希釈装置にかけるために多量の
被検液量を必要とし、残試料が９０μｌ及び１１０μｌ
程度と少ない被検液があり、この２被検液は元被検液の
残液が少なく、他の追加測定が不能となった。

【００８０】実施例４、比較例２ （１）梅毒ＴＰ抗体測定試薬の調製 梅毒抗原であるトレポネーマ・パリダム（以下、ＴＰと
略す。）の１×１０⁹個／ｍｌ分散液と１％ｎ−オクチ
ル−β−Ｄ−グルコシド水溶液中とを等量混合し、室温
下１時間インキュベートした後に、３０００ｒｐｍで３
０分間遠心分離して抗原を含む上清を得た。この上清を
０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）で２０倍に希
釈して感作用抗原とした。

【００８１】平均粒子径０．１５４μｍのポリスチレン
ラテックス粒子を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．
２、以下リン酸緩衝液と略す。）で希釈し、ラテックス
濃度が１重量％の懸濁液を調製する。次いで上記ラテッ
クス懸濁液１容に感作用抗原液１容を加え３７℃で２時
間反応させる。さらにウシ血清アルブミンを最終濃度で
０．０５重量％添加した後遠心分離し、上清を除去した
後沈澱をリン酸緩衝液に再分散し、再度遠心分離して上
清を除去した後沈澱をリン酸緩衝液に再分散してラテッ
クス濃度を０．２０％に調製し、試薬のラテックス試液
（Ｒ２）を得た。

【００８２】これとは別にリン酸緩衝液に食塩０．０５
ｍｏｌ／ｌ、ウシ血清アルブミンを０．５重量％、塩化
コリン５重量％となる様に添加した試薬の緩衝液（Ｒ
１）を調製し、Ｒ１とＲ２とよりなる梅毒ＴＰ抗体測定
試薬を得た。

【００８３】（２）個別被検液の初回測定 自動分析機として、（株）アナリィティカルインスツル
メンツ社製の全自動免疫化学分析装置５０１Ｘを用い
（１）で得た梅毒ＴＰ抗体測定試薬のＲ１、Ｒ２をセッ
トした。

【００８４】初回測定条件は被検液が１５μｌ、Ｒ１が
３００μｌ、Ｒ２が５０μｌとした。検量線を作成する
為、ＷＨＯ標準品で値づけして得た梅毒ＴＰ抗体標準液
（５００ユニット／ｍｌ）を所定の位置にセットし、自
動的に２倍希釈系列を作成して波長６６０ｎｍにおける
散乱光強度を測定した。被検液をＲ１で希釈後３７℃で
約４分保温した後、Ｒ２を添加して攪拌し、攪拌後４５
秒、１９５秒、４２０秒に測光したデータより２種の特
定時間（１５０秒間と３７５秒間）における光学密度の
増加を求めた。低濃度域を測定する第一検量線として攪
拌後４５秒と４２０秒の間の光学密度の増加を用い、第
二検量線として攪拌後４５秒と１９５秒の間の光学密度
の増加を用いて各々３次多項式で近似して２本の検量線
を得た。

【００８５】第一検量線 Ｙ＝1.097×10^-9Ｘ³−5.694
×10-⁶Ｘ²＋4.283×10^-2Ｘ−2.813 第二検量線 Ｙ＝2.683×10^-9Ｘ³−4.313×10-⁶Ｘ²＋0.
1595Ｘ−21.96 なお、測定下限は再現性試験の結果より１０ユニット／
ｍｌとした。ここで２本の検量線を組み合わせて使用す
るが、０から１００ユニット／ｍｌまでは第一検量線、
１００を超えて５００ユニット／ｍｌまでは第二検量線
で検量する様にしきい値を設定した。

【００８６】臨床的に梅毒陰性と診断された患者被検液
につき、本発明の方法とは原理的に異なる検査方法であ
り、一般的にＴＰＨＡ試薬として普及している富士レビ
オ製『商品名：セロディアＴＰ』で測定して判定保留
（抗体価×４０まで陽性、×８０が±）と判定された５
被検液につき、（１）で得た梅毒ＴＰ抗体測定試薬で測
定した。以上の測定結果を表３に示す。

【００８７】次いで、初回の測定条件の内、試薬のＲ２
中の固定化担体粒子濃度を半減した以外は初回測定条件
と同様に検量線を作成し、再測定を行った。

【００８８】一方、比較例として、上記被検液につき、
初回測定条件の内、被検液量を倍増した以外は初回測定
条件と同様に再測定した。

【００８９】結果を表３に示す。

【００９０】尚、初回測定条件の反応液中の固定化担体
粒子濃度は０．０２７％で、上記比較例の固定化担体粒
子濃度は０．０２６％となるが、これらの濃度は実質的
に同一の濃度として取り扱うことができるものである。

【００９１】表３の結果より、セロディアＴＰで判定保
留となった陰性例については、被検液１、２、４におい
て初回測定と比較例の結果が大きく異なり、誤った結果
を示す測定条件であることが判った。

【００９２】この原因は不明であるが被検液中の干渉成
分が臨界的に作用して非特異的な反応を起こしたものと
考えられる。

【００９３】一方、実施例においては初回測定と良く対
応する測定値が得られ、初回測定下限以下の被検液も測
定可能であると判断することができる。

【００９４】

【表３】

【００９５】実施例５ 実施例４の（１）で得た梅毒試薬のラテックス試液（Ｒ
２）を水で４倍に希釈してラテックス濃度を０．０５％
に調製し、実施例３と同様にして全自動免疫化学分析装
置５０１ＸにＲ１及び上記希釈Ｒ２をセットした。被検
液が１５μｌ、Ｒ１が３００μｌ、Ｒ２が５０μｌとし
て実施例４と同様に検量線を作成した。但し、実施例４
と比較して反応の立ち上がりが遅れる傾向が認められた
ため、タイムコースを詳細に観察して光学密度が単調増
加する特定時間間隔を決めた。即ち、実施例４とは異な
り、Ｒ２を添加して撹拌し、撹拌後１０５秒、２５５
秒、４８０秒に測光したデータより２種の特定時間（１
５０秒間と３７５秒間）における光学密度の増加を求め
て２本の検量線を得た。

【００９６】第一検量線 Ｙ＝2.463×10^-9Ｘ³−7.695
×10^-6Ｘ²＋0.1565Ｘ−0.048 第二検量線 Ｙ＝8.094×10^-9Ｘ³−3.311×10^-6Ｘ²＋0.
2591Ｘ−45.14 なお測定範囲は３から１５０ユニット／ｍｌであった。

【００９７】入院患者および、妊婦、胃検診などの外来
患者を対象として採血した血清１００例につき上記測定
条件を初回測定条件として測定したところ、３ユニット
／ｍｌ未満が９６例であり、残り４例は４、７、５８ユ
ニット、及び１５０ユニット／ｍｌ超であった。

【００９８】この中から実施例４の初回測定条件下で別
途実施した臨床的に陽性と判定された陽性被検液の１０
０例に対する最低値１２ユニット／ｍｌより高値を示し
陽性と考えられる２例につき、実施例４の初回測定条件
（ラテックス濃度が０．２０％）を再測定条件として測
定した。

【００９９】この結果、各々６０ユニット／ｍｌ、４７
３ユニット／ｍｌとなった。この２被検液はセロディア
ＴＰでも陽性であり、その後の調査で過去に梅毒に罹患
したが既に治癒したものの、抗ＴＰ抗体を保持している
状態であることが判った。

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗体または抗原を固定させた不溶性担体
   粒子の分散液よりなる試薬と、多数の被検液とを反応さ
   せ、反応液中における不溶性担体粒子の凝集状態により
   該被検液の抗原または抗体の濃度を測定する方法におい
   て、予め不溶性担体粒子の特定濃度を低減させた試薬に
   より被検液の全てを測定して、その測定値が所定の基準
   値未満である大部分の被検液を確認した後、次に所定の
   基準値以上である残余の被検液について特定濃度の試薬
   により再測定することを特徴とする抗原または抗体濃度
   の測定方法。
2. 【請求項２】 特定濃度を２／３以下に低減した試薬を
   用いる請求項１の測定方法。