JP3003152B2 - 遊離ヘモグロビンの測定法及びそれに用いる遊離ヘモグロビン測定用試薬キット - Google Patents
遊離ヘモグロビンの測定法及びそれに用いる遊離ヘモグロビン測定用試薬キットInfo
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は遊離ヘモグロビンの測定法及びそれに用いる
遊離ヘモグロビン測定用試薬キットに関する。更に詳細
には、臨床検査領域等で用いられ、遊離ヘモグロビン
を、簡便且つ迅速に測定することができる遊離ヘモグロ
ビンの測定法及びそれに用いる遊離ヘモグロビン測定用
試薬キットに関する。
遊離ヘモグロビン測定用試薬キットに関する。更に詳細
には、臨床検査領域等で用いられ、遊離ヘモグロビン
を、簡便且つ迅速に測定することができる遊離ヘモグロ
ビンの測定法及びそれに用いる遊離ヘモグロビン測定用
試薬キットに関する。
［従来の技術］ 大量輸血、体外循環、血液透析、臓器灌流などでは、
しばしば高度溶血を起こすために溶血性腎障害をはじめ
種々の合併症が懸念される。その病因となるヘモグロビ
ンはハプトグロビンと結合していない遊離ヘモグロビン
といわれており、臨床的には血漿及び血清中のヘモグロ
ビンはハプトグロビン結合型ヘモグロビンと遊離ヘモグ
ロビンに分けて測定することが必要となっている。
しばしば高度溶血を起こすために溶血性腎障害をはじめ
種々の合併症が懸念される。その病因となるヘモグロビ
ンはハプトグロビンと結合していない遊離ヘモグロビン
といわれており、臨床的には血漿及び血清中のヘモグロ
ビンはハプトグロビン結合型ヘモグロビンと遊離ヘモグ
ロビンに分けて測定することが必要となっている。
このように、血漿、血清等に含まれる遊離ヘモグロビ
ンの測定は臨床上重要な意義を有し、その測定方法とし
ては、セルロースアセテート膜電気泳動法による方法
や、簡易分別定量法による方法、遊離ヘモグロビン吸着
定量法（カラム法）が従来から知られている。
ンの測定は臨床上重要な意義を有し、その測定方法とし
ては、セルロースアセテート膜電気泳動法による方法
や、簡易分別定量法による方法、遊離ヘモグロビン吸着
定量法（カラム法）が従来から知られている。
上記のセルロースアセテート膜電気泳動法による遊離
ヘモグロビンの測定は、まずシアンメトヘモグロビン法
で検体（血漿及び血清）中の総ヘモグロビン量を定量す
る。次に同一検体につき、セルロースアセテート膜電気
泳動法で遊離ヘモグロビン、ハプトグロビン−ヘモグロ
ビン複合体、メトヘモアルブミン（アルブミン結合型ヘ
モグロビン）画分に分離し、ペルオキシダーゼ反応によ
りヘモグロビンを染色した後、各画分における染色度を
デンシトメーターでスキャンニングし、総ヘモグロビン
（遊離ヘモグロビン＋ハプトグロビン−ヘモグロビン複
合体＋メトヘモアルブミン）量に対する遊離ヘモグロビ
ン量の比率を求める。求めた比率を予めシアンメトヘモ
グロビン法で定量した総ヘモグロビン量に乗じて検体中
の遊離ヘモグロビン量が算出される。
ヘモグロビンの測定は、まずシアンメトヘモグロビン法
で検体（血漿及び血清）中の総ヘモグロビン量を定量す
る。次に同一検体につき、セルロースアセテート膜電気
泳動法で遊離ヘモグロビン、ハプトグロビン−ヘモグロ
ビン複合体、メトヘモアルブミン（アルブミン結合型ヘ
モグロビン）画分に分離し、ペルオキシダーゼ反応によ
りヘモグロビンを染色した後、各画分における染色度を
デンシトメーターでスキャンニングし、総ヘモグロビン
（遊離ヘモグロビン＋ハプトグロビン−ヘモグロビン複
合体＋メトヘモアルブミン）量に対する遊離ヘモグロビ
ン量の比率を求める。求めた比率を予めシアンメトヘモ
グロビン法で定量した総ヘモグロビン量に乗じて検体中
の遊離ヘモグロビン量が算出される。
簡易分別定量法による遊離ヘモグロビンの測定は、シ
アンメトヘモグロビン法による総ヘモグロビンの定量と
一元免疫拡散法（Mancini法）による総ハプトグロビン
の定量を行ない、ハプトグロビン−ヘモグロビンとの結
合比を用いて、遊離ヘモグロビン量を算出するものであ
る。なお、一元免疫拡散法で総ハプトグロビンを定量す
るに当たっては、予め、澱粉ゲル電気泳動法又は免疫電
気泳動法もしくはアクリルアミドゲル電気泳動法でハプ
トグロビンの血清型を識別しておき、血清型別に作成し
た標準曲線を用いるか、又はプール血清を用いて作成し
た標準曲線を用いる場合は標準曲線から求めた測定値に
ハプトグロビンの血清型別の係数を乗じて定量値としな
ければならない。
アンメトヘモグロビン法による総ヘモグロビンの定量と
一元免疫拡散法（Mancini法）による総ハプトグロビン
の定量を行ない、ハプトグロビン−ヘモグロビンとの結
合比を用いて、遊離ヘモグロビン量を算出するものであ
る。なお、一元免疫拡散法で総ハプトグロビンを定量す
るに当たっては、予め、澱粉ゲル電気泳動法又は免疫電
気泳動法もしくはアクリルアミドゲル電気泳動法でハプ
トグロビンの血清型を識別しておき、血清型別に作成し
た標準曲線を用いるか、又はプール血清を用いて作成し
た標準曲線を用いる場合は標準曲線から求めた測定値に
ハプトグロビンの血清型別の係数を乗じて定量値としな
ければならない。
また、遊離ヘモグロビン吸着定量法による遊離ヘモグ
ロビンの測定は、ハプトグロビン固定化セファロースを
均一に充填した円筒状カラムに一定量の検体（血漿又は
血清）を注入し、約３倍〜10倍量の生理食塩水で洗浄し
た後、ハプトグロビン固定化セファロースに吸着した遊
離ヘモグロビンによる着色部分の長さを計測することに
より遊離ヘモグロビン量を求めるものである。
ロビンの測定は、ハプトグロビン固定化セファロースを
均一に充填した円筒状カラムに一定量の検体（血漿又は
血清）を注入し、約３倍〜10倍量の生理食塩水で洗浄し
た後、ハプトグロビン固定化セファロースに吸着した遊
離ヘモグロビンによる着色部分の長さを計測することに
より遊離ヘモグロビン量を求めるものである。
［発明が解決しようとする課題］ 上記の従来技術において、セルロースアセテート膜電
気泳動法による方法は、総ヘモグロビン量に分画比を乗
じて、間接的に遊離ヘモグロビン量を求める方法である
ため、測定操作が煩雑で長時間を要すると共に総ヘモグ
ロビンの定量限界及びセルロースアセテート膜電気泳動
法の検出限界以下の遊離ヘモグロビンについては測定で
きないという問題がある。
気泳動法による方法は、総ヘモグロビン量に分画比を乗
じて、間接的に遊離ヘモグロビン量を求める方法である
ため、測定操作が煩雑で長時間を要すると共に総ヘモグ
ロビンの定量限界及びセルロースアセテート膜電気泳動
法の検出限界以下の遊離ヘモグロビンについては測定で
きないという問題がある。
簡易分別定量法による測定方法では、総ヘモグロビン
量と総ハプトグロビン量から間接的に遊離ヘモグロビン
量を求める方法であるため、総ヘモグロンの定量限界以
下の遊離ヘモグロビンについては測定できない。更に総
ハプトグロビンの定量限界以下のハプトグロビン量と結
合したヘモグロビンは結果的に遊離ヘモグロビンとして
算出されるという問題がある。
量と総ハプトグロビン量から間接的に遊離ヘモグロビン
量を求める方法であるため、総ヘモグロンの定量限界以
下の遊離ヘモグロビンについては測定できない。更に総
ハプトグロビンの定量限界以下のハプトグロビン量と結
合したヘモグロビンは結果的に遊離ヘモグロビンとして
算出されるという問題がある。
遊離ヘモグロビン吸着定量法による測定方法では、ハ
プトグロビン固定化セファロースを充填したカラムに一
定量の検体（血清又は血漿）を注入し、ハプトグロビン
固定化セファロースに吸着した遊離ヘモグロビンによっ
て着色したカラムの着色層の長さを計測することによっ
て検体中の遊離ヘモグロビン量を求める方法であるた
め、カラム内のハプトグロビン固定化セファロースの均
一性、検体の注入方法、洗浄方法等によって着色層の長
さが異なる上に、着色層の終末点が不明確であり、定量
性、再現性に欠けるという問題がある。
プトグロビン固定化セファロースを充填したカラムに一
定量の検体（血清又は血漿）を注入し、ハプトグロビン
固定化セファロースに吸着した遊離ヘモグロビンによっ
て着色したカラムの着色層の長さを計測することによっ
て検体中の遊離ヘモグロビン量を求める方法であるた
め、カラム内のハプトグロビン固定化セファロースの均
一性、検体の注入方法、洗浄方法等によって着色層の長
さが異なる上に、着色層の終末点が不明確であり、定量
性、再現性に欠けるという問題がある。
また、上記の従来技術の測定法は何れも使用される試
薬類の調製及び測定操作が煩雑であると共に測定結果が
得られるまでに長時間を要する欠点があり、検体中の遊
離ヘモグロビンの有無を迅速に測定したいような定性的
測定には適用し難いという問題がある。
薬類の調製及び測定操作が煩雑であると共に測定結果が
得られるまでに長時間を要する欠点があり、検体中の遊
離ヘモグロビンの有無を迅速に測定したいような定性的
測定には適用し難いという問題がある。
本発明は、上記の従来技術の欠点を解消すべくなされ
たもので、検体（例えば、血清、血漿、尿、糞便等）中
の遊離ヘモグロビンを、簡便な操作で迅速且つ特異的に
測定（定量及び定性）できる遊離ヘモグロビンの測定法
及びそれに用いる遊離ヘモグロビン測定用試薬キットを
提供することを目的とする。
たもので、検体（例えば、血清、血漿、尿、糞便等）中
の遊離ヘモグロビンを、簡便な操作で迅速且つ特異的に
測定（定量及び定性）できる遊離ヘモグロビンの測定法
及びそれに用いる遊離ヘモグロビン測定用試薬キットを
提供することを目的とする。
［課題を解決するための手段及び作用］ 本発明の遊離ヘモグロビンの測定法は、ヒトハプトグ
ロビンを固相に結合させたハプトグロビン固定化固相
に、遊離ヘモグロビン含有検体を接触させて検体中の遊
離ヘモグロビンを固相上のヒトハプトグロビンと結合さ
せ、次いで過酸化物試薬溶液及び発色試薬溶液を作用さ
せ、当該溶液の光学的変化を測定することを特徴とする
ものである。また、本発明の遊離ヘモグロビン測定用試
薬キットは、上記測定法に使用する測定用キットで、ヒ
トハプトグロビンを固相に結合させたハプトグロビン固
定化固相、過酸化物試薬及び発色試薬とからなることを
特徴とするものである。
ロビンを固相に結合させたハプトグロビン固定化固相
に、遊離ヘモグロビン含有検体を接触させて検体中の遊
離ヘモグロビンを固相上のヒトハプトグロビンと結合さ
せ、次いで過酸化物試薬溶液及び発色試薬溶液を作用さ
せ、当該溶液の光学的変化を測定することを特徴とする
ものである。また、本発明の遊離ヘモグロビン測定用試
薬キットは、上記測定法に使用する測定用キットで、ヒ
トハプトグロビンを固相に結合させたハプトグロビン固
定化固相、過酸化物試薬及び発色試薬とからなることを
特徴とするものである。
本発明は上記の構成よりなり、ヒトハプトグロビンを
固相に結合させたハプトグロビン固定化固相は遊離ヘモ
グロビン含有検体中の遊離ヘモグロビンと特異的に結合
するので、当該固相上には遊離ヘモグロビンのみを選択
的に固定化することができる。そしてヘモグロビンはペ
ルオキシダーゼ様活性を有するので、遊離ヘモグロビン
が固定化された固相に過酸化物試薬及び発色試薬を作用
させると呈色色素等が生じ、その光学的変化を測定する
ことにより、遊離ヘモグロビンの有無を判別することが
できる。また、当該光学的変化量は、ハプトグロビン固
定化固相に結合した遊離ヘモグロビン量によって定ま
り、また、ハプトグロビン固定化固相に結合する遊離ヘ
モグロビン量は検体中の遊離ヘモグロビン量によって定
まる。従って、光学的変化量は検体中の遊離ヘモグロビ
ン量に相関するので、光学的変化量を測定することによ
り検体中の遊離ヘモグロビン量を定量することができ
る。
固相に結合させたハプトグロビン固定化固相は遊離ヘモ
グロビン含有検体中の遊離ヘモグロビンと特異的に結合
するので、当該固相上には遊離ヘモグロビンのみを選択
的に固定化することができる。そしてヘモグロビンはペ
ルオキシダーゼ様活性を有するので、遊離ヘモグロビン
が固定化された固相に過酸化物試薬及び発色試薬を作用
させると呈色色素等が生じ、その光学的変化を測定する
ことにより、遊離ヘモグロビンの有無を判別することが
できる。また、当該光学的変化量は、ハプトグロビン固
定化固相に結合した遊離ヘモグロビン量によって定ま
り、また、ハプトグロビン固定化固相に結合する遊離ヘ
モグロビン量は検体中の遊離ヘモグロビン量によって定
まる。従って、光学的変化量は検体中の遊離ヘモグロビ
ン量に相関するので、光学的変化量を測定することによ
り検体中の遊離ヘモグロビン量を定量することができ
る。
本発明で使用されるハプトグロビン固定化固相の調製
に用いられるヒトハプトグロビンは、例えば、ヒト血漿
から既知の手段（臨床ハプトグロビン、大城盃著：永井
書店発行、第223頁参照）で調製したヒトハプトグロビ
ン、さらに必要に応じてそれを抗ヒトヘモグロビン抗体
を結合させたアフィニティクロマトグラフィーに付して
ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体（吸着画分）を除
いて精製したヒトハプトグロビン（未吸着画分）が用い
られる。ハプトグロビン固定化固相の調製は、上記で得
られたヒトハプトグロビンを、例えば、吸着法、ブロム
シアン法などの既知の手段（酵素免疫測定法、第３版：
医学書院発行、第395頁参照）で固相上に固定化するこ
とにより調製できる。ヒトハプトグロビンを固定化する
固相材料としては、酵素免疫測定法等で従来から使用さ
れている固相材料のいずれも用いることができ、例え
ば、アガロース、セファロース等の多糖類、ガラス、セ
ラミックス、プラスチック等が例示される。これらの材
料の形状は特に限定されないが、測定操作の便宜性等か
ら、例えば、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、セルロ
ース膜等のプラスチック膜（シート及びフィルム）、プ
ラスチックチューブ又はプラスチックボールがより好ま
しい。特に、取扱の容易な点から、プラスチック等の支
持体の一端に、ハプトグロビンを上記のプラスチック膜
に結合させたハプトグロビン固定化膜を固着したスティ
ック状とするのが好ましい。固相上に固定化されるヒト
ハプトグロビン量は特に限定されず、所望する感度等に
より適宜調整され、この調整は固相に導入するプロムシ
アン基、ヒトハプトグロビン濃度等を調整することによ
り行うことができ、固定化に使用されるヒトハプトグロ
ビン溶液のヒトハプトグロビン濃度は５μg/ml〜5mg/ml
程度が好ましい。
に用いられるヒトハプトグロビンは、例えば、ヒト血漿
から既知の手段（臨床ハプトグロビン、大城盃著：永井
書店発行、第223頁参照）で調製したヒトハプトグロビ
ン、さらに必要に応じてそれを抗ヒトヘモグロビン抗体
を結合させたアフィニティクロマトグラフィーに付して
ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体（吸着画分）を除
いて精製したヒトハプトグロビン（未吸着画分）が用い
られる。ハプトグロビン固定化固相の調製は、上記で得
られたヒトハプトグロビンを、例えば、吸着法、ブロム
シアン法などの既知の手段（酵素免疫測定法、第３版：
医学書院発行、第395頁参照）で固相上に固定化するこ
とにより調製できる。ヒトハプトグロビンを固定化する
固相材料としては、酵素免疫測定法等で従来から使用さ
れている固相材料のいずれも用いることができ、例え
ば、アガロース、セファロース等の多糖類、ガラス、セ
ラミックス、プラスチック等が例示される。これらの材
料の形状は特に限定されないが、測定操作の便宜性等か
ら、例えば、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、セルロ
ース膜等のプラスチック膜（シート及びフィルム）、プ
ラスチックチューブ又はプラスチックボールがより好ま
しい。特に、取扱の容易な点から、プラスチック等の支
持体の一端に、ハプトグロビンを上記のプラスチック膜
に結合させたハプトグロビン固定化膜を固着したスティ
ック状とするのが好ましい。固相上に固定化されるヒト
ハプトグロビン量は特に限定されず、所望する感度等に
より適宜調整され、この調整は固相に導入するプロムシ
アン基、ヒトハプトグロビン濃度等を調整することによ
り行うことができ、固定化に使用されるヒトハプトグロ
ビン溶液のヒトハプトグロビン濃度は５μg/ml〜5mg/ml
程度が好ましい。
ハプトグロビン固定化固相に結合した遊離ヘモグロビ
ンのベルオキシダーゼ様活性の測定は、ペルオキシダー
ゼを標識酵素として用いた酵素免疫測定法と実質的に同
様に行うことができるので、遊離ヘモグロビンのペルオ
シダーゼ様活性の測定に用いられる過酸化物試薬及び発
色試薬も、上記酵素免疫測定法で用いられているものと
同様なものを用いることができる。より具体的には、過
酸化物試薬としては、例えば、過酸化水素、過酸化スト
ロンチウム、過酸化バリウム、過酸化水素クメン、ジメ
チルヘキサン過酸化物等が挙げられ、特に過酸化水素が
好ましい。また、発色試薬としては、倒えば、3,3′,5,
5′−テトラメチルベンジジン、3,3′,5,5′−テトラメ
チルベンジジン・ジハイドロクロライド、オルトフェニ
レンジアミン、ベンジジン、オルトトリジン、オルトジ
アニシジン、ジフェニルアミン、グアヤックチンキ、ア
ミドピリン、ヘモグリーン、フェノルフタレイン等が挙
げられ、特に、3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジン
及びオルトフェニレンジアミンが好ましい。
ンのベルオキシダーゼ様活性の測定は、ペルオキシダー
ゼを標識酵素として用いた酵素免疫測定法と実質的に同
様に行うことができるので、遊離ヘモグロビンのペルオ
シダーゼ様活性の測定に用いられる過酸化物試薬及び発
色試薬も、上記酵素免疫測定法で用いられているものと
同様なものを用いることができる。より具体的には、過
酸化物試薬としては、例えば、過酸化水素、過酸化スト
ロンチウム、過酸化バリウム、過酸化水素クメン、ジメ
チルヘキサン過酸化物等が挙げられ、特に過酸化水素が
好ましい。また、発色試薬としては、倒えば、3,3′,5,
5′−テトラメチルベンジジン、3,3′,5,5′−テトラメ
チルベンジジン・ジハイドロクロライド、オルトフェニ
レンジアミン、ベンジジン、オルトトリジン、オルトジ
アニシジン、ジフェニルアミン、グアヤックチンキ、ア
ミドピリン、ヘモグリーン、フェノルフタレイン等が挙
げられ、特に、3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジン
及びオルトフェニレンジアミンが好ましい。
次に、本発明の測定法の一例をより具体的に説明す
る。まず、適当な固相材料上に前述の方法にて精製ヒト
ハプトグロビンを固定化し、ハプトグロビン固定化固相
を調製する。次いで、ハプトグロビン固定化固相を、必
要に応じて精製水等で適当な濃度に希釈した遊離ヘモグ
ロビン含有検体（例えば、血漿、血清、尿等）に浸漬
し、検体中の遊離ヘモグロビンのみをハプトグロビン固
定化固相上のハプトグロビンに特異的に結合させる。そ
の後、必要に応じて、ハプトグロビン固定化固相を精製
水等で洗浄する。洗浄操作は、ハプトグロビン固定化固
相の形状により適宜な方法にて行うことができ、例え
ば、ハプトグロビン固定化固相が膜状の場合には、精製
水中に浸漬又は精製水中で振盪することにより、またハ
プトグロビン固定化固相が粒状の場合には、洗浄上清を
吸引除去することにより行われる。かかる洗浄操作によ
り、ハプトグロビン固定化固相に非特異的に結合（吸
着）しているおそれのあるハプトグロビン−ヘモグロビ
ン複合体を除去し、ハプトグロビン固定化固相上にはハ
プトグロビンと特異的に結合したヘモグロビンのみを残
すことができる。かくして固定化された遊離ヘモグロビ
ンに、前述の過酸化物試薬溶液及び発色試薬溶液を作用
させて光学的変化を測定することにより、遊離ヘモグロ
ビンのペルオキシダーゼ様活性を測定し、検体中の遊離
ヘモグロビンを測定する。光学的変化の測定方法として
は、例えば、比色法、螢光法、化学発光法等が挙げら
れ、特に吸光度測定法で行うのが簡便であり、また操作
性に優れるので好ましい。なお、検体中の遊離ヘモグロ
ビン量を定量するには、上記の測定法において、遊離ヘ
モグロビン含有検体の代りに、濃度既知の遊離ヘモグロ
ビン標準液を適宜希釈した試料液を用い、上記と同様な
操作を行うことによって、遊離ヘモグロビン濃度と光学
的変化量との関係式（検量線）を作成し、遊離ヘモグロ
ビン検体で測定された光学的変化量と検量線とを対比す
ることにより、検体中の遊離ヘモグロビン量を求めるこ
とができる。また、遊離ヘモグロビンを定性的に判別す
る際には、反応液の発色又は消色を目視等により観察す
ることにより行うこともできる。
る。まず、適当な固相材料上に前述の方法にて精製ヒト
ハプトグロビンを固定化し、ハプトグロビン固定化固相
を調製する。次いで、ハプトグロビン固定化固相を、必
要に応じて精製水等で適当な濃度に希釈した遊離ヘモグ
ロビン含有検体（例えば、血漿、血清、尿等）に浸漬
し、検体中の遊離ヘモグロビンのみをハプトグロビン固
定化固相上のハプトグロビンに特異的に結合させる。そ
の後、必要に応じて、ハプトグロビン固定化固相を精製
水等で洗浄する。洗浄操作は、ハプトグロビン固定化固
相の形状により適宜な方法にて行うことができ、例え
ば、ハプトグロビン固定化固相が膜状の場合には、精製
水中に浸漬又は精製水中で振盪することにより、またハ
プトグロビン固定化固相が粒状の場合には、洗浄上清を
吸引除去することにより行われる。かかる洗浄操作によ
り、ハプトグロビン固定化固相に非特異的に結合（吸
着）しているおそれのあるハプトグロビン−ヘモグロビ
ン複合体を除去し、ハプトグロビン固定化固相上にはハ
プトグロビンと特異的に結合したヘモグロビンのみを残
すことができる。かくして固定化された遊離ヘモグロビ
ンに、前述の過酸化物試薬溶液及び発色試薬溶液を作用
させて光学的変化を測定することにより、遊離ヘモグロ
ビンのペルオキシダーゼ様活性を測定し、検体中の遊離
ヘモグロビンを測定する。光学的変化の測定方法として
は、例えば、比色法、螢光法、化学発光法等が挙げら
れ、特に吸光度測定法で行うのが簡便であり、また操作
性に優れるので好ましい。なお、検体中の遊離ヘモグロ
ビン量を定量するには、上記の測定法において、遊離ヘ
モグロビン含有検体の代りに、濃度既知の遊離ヘモグロ
ビン標準液を適宜希釈した試料液を用い、上記と同様な
操作を行うことによって、遊離ヘモグロビン濃度と光学
的変化量との関係式（検量線）を作成し、遊離ヘモグロ
ビン検体で測定された光学的変化量と検量線とを対比す
ることにより、検体中の遊離ヘモグロビン量を求めるこ
とができる。また、遊離ヘモグロビンを定性的に判別す
る際には、反応液の発色又は消色を目視等により観察す
ることにより行うこともできる。
上記の測定方法において、検体中の遊離ヘモグロビン
濃度は1mg/dl以上であればよく、遊離ヘモグロビンの定
量を行う場合には、１〜100mg/dl程度、好ましくは５〜
50mg/dl程度に調整する。また、使用される過酸化物試
薬溶液における過酸化物試薬濃度は、例えば過酸化水素
水の場合、通常、0.01〜1.0W/V％程度、好ましくは0.05
〜0.1W/V％程度に調整され、発色試薬溶液における発色
試薬濃度は、例えば3,3′,5,5′−テトラメチルベンジ
ジンの場合、通常、0.1〜4mM程度、好ましくは1.0〜3.0
mM程度に調整される。過酸化物試薬溶液と発色試薬溶液
は、通常、等量に混合して用いられる。なお、上記の測
定は、通常、室温で行われ、10〜15分間程度で終了す
る。
濃度は1mg/dl以上であればよく、遊離ヘモグロビンの定
量を行う場合には、１〜100mg/dl程度、好ましくは５〜
50mg/dl程度に調整する。また、使用される過酸化物試
薬溶液における過酸化物試薬濃度は、例えば過酸化水素
水の場合、通常、0.01〜1.0W/V％程度、好ましくは0.05
〜0.1W/V％程度に調整され、発色試薬溶液における発色
試薬濃度は、例えば3,3′,5,5′−テトラメチルベンジ
ジンの場合、通常、0.1〜4mM程度、好ましくは1.0〜3.0
mM程度に調整される。過酸化物試薬溶液と発色試薬溶液
は、通常、等量に混合して用いられる。なお、上記の測
定は、通常、室温で行われ、10〜15分間程度で終了す
る。
本発明の遊離ヘモグロビン測定用試薬キットは、ヒト
ハプトグロビンを固相に結合させたハプトグロビン固定
化固相、過酸化物試薬及び発色試薬とで少なくとも構成
される。該ハプトグロビン固定化固相は保存性及び安定
性を向上させるため、通常、凍結乾燥手段等を用いて乾
燥状態とされる。また、過酸化物試薬及び発色試薬は、
通常、水溶液とされ、必要に応じて、安定化剤（例え
ば、過酸化水素の場合にはリン酸、尿酸等、オルトフェ
ニレンジアミンの場合には金属マスキング剤等）を添加
してもよい。本発明の試薬キットには、追加的に、ヒト
ハプトグロビンが固定化されていない固相を比較対照用
として含んでいてもよく、さらに検量線作成に使用する
遊離ヘモグロビン標準液を含んでいてもよい。
ハプトグロビンを固相に結合させたハプトグロビン固定
化固相、過酸化物試薬及び発色試薬とで少なくとも構成
される。該ハプトグロビン固定化固相は保存性及び安定
性を向上させるため、通常、凍結乾燥手段等を用いて乾
燥状態とされる。また、過酸化物試薬及び発色試薬は、
通常、水溶液とされ、必要に応じて、安定化剤（例え
ば、過酸化水素の場合にはリン酸、尿酸等、オルトフェ
ニレンジアミンの場合には金属マスキング剤等）を添加
してもよい。本発明の試薬キットには、追加的に、ヒト
ハプトグロビンが固定化されていない固相を比較対照用
として含んでいてもよく、さらに検量線作成に使用する
遊離ヘモグロビン標準液を含んでいてもよい。
［発明の効果］ 本発明の遊離ヘモグロビンの測定法及び遊離ヘモグロ
ビン測定用試薬キットによれば、遊離ヘモグロビンと特
異的に結合し得るハプトグロビン固定化固相が用いられ
ているので、検体（例えば、血清、血漿、尿、糞便等）
に含まれる遊離ヘモグロビンを高感度且つ直接的に測定
することができ、また遊離ヘモグロビンのペルオシダー
ゼ様活性を利用しているので、使用される試薬類の調製
が容易であり、さらに測定操作も簡便であると共に短時
間で測定が終了するという利点を有し、遊離ヘモグロビ
ンの定量的及び定性的測定に広く用いることができると
いう効果を奏する。
ビン測定用試薬キットによれば、遊離ヘモグロビンと特
異的に結合し得るハプトグロビン固定化固相が用いられ
ているので、検体（例えば、血清、血漿、尿、糞便等）
に含まれる遊離ヘモグロビンを高感度且つ直接的に測定
することができ、また遊離ヘモグロビンのペルオシダー
ゼ様活性を利用しているので、使用される試薬類の調製
が容易であり、さらに測定操作も簡便であると共に短時
間で測定が終了するという利点を有し、遊離ヘモグロビ
ンの定量的及び定性的測定に広く用いることができると
いう効果を奏する。
［実施例］ 以下、本発明を製造例及び実施例に基づいてより詳細
に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるもので
はない。
に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるもので
はない。
製造例１ ハプトグロビン固定化膜の調製 ヘモグロビンを含まない正常人プール血漿より調製し
た精製ヒトハプトグロビン（（株）ミドリ十字製）を、
PBS（リン酸塩緩衝化生理食塩水）でヒトハプトグロビ
ン濃度が1mg/mlになるように溶解してヒトハプトグロビ
ン溶液を調製した。
た精製ヒトハプトグロビン（（株）ミドリ十字製）を、
PBS（リン酸塩緩衝化生理食塩水）でヒトハプトグロビ
ン濃度が1mg/mlになるように溶解してヒトハプトグロビ
ン溶液を調製した。
次いで、ニトロセルロース膜（45×50×0.05mm）を、
上記ヒトハプトグロビン溶液に室温で約16時間浸漬した
後、濾紙上で軽く水分を除去し、次いで0.25％ウシ血清
アルブミンを含有するPBSに室温で約16時間浸漬した。
その後、ニトロセルロース膜を減圧乾燥し、15×5mmに
切断してハプトグロビン固定化膜を調製した。
上記ヒトハプトグロビン溶液に室温で約16時間浸漬した
後、濾紙上で軽く水分を除去し、次いで0.25％ウシ血清
アルブミンを含有するPBSに室温で約16時間浸漬した。
その後、ニトロセルロース膜を減圧乾燥し、15×5mmに
切断してハプトグロビン固定化膜を調製した。
製造例２ 遊離ヘモグロビンの標準液の調製 ウィリアムズ（Williams,Anal.Biochem.Vol.54,137〜
145,1973）の方法によって調製したヒトヘモグロビンか
ら、抗ヒトハプトグロビン抗体を結合させたアフィニテ
ィクロマトグラフィーにより未吸着画分を分取し、吸着
画分（ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体）を除去し
た。分取した未吸着画分につき、シアンメトヘモグロビ
ン法でヘモグロビン量を測定し、遊離ヘモグロビン標準
液とした。
145,1973）の方法によって調製したヒトヘモグロビンか
ら、抗ヒトハプトグロビン抗体を結合させたアフィニテ
ィクロマトグラフィーにより未吸着画分を分取し、吸着
画分（ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体）を除去し
た。分取した未吸着画分につき、シアンメトヘモグロビ
ン法でヘモグロビン量を測定し、遊離ヘモグロビン標準
液とした。
実施例１ 血清中の遊離ヘモグロビンの測定（定性） 製造例１で調製したハプトグロビン固定化膜（膜ａと
いう）を用いて、ヒト血清（37検体）中の遊離ヘモグロ
ビンの定性的測定を下記の方法で行った。
いう）を用いて、ヒト血清（37検体）中の遊離ヘモグロ
ビンの定性的測定を下記の方法で行った。
膜ａ及び対照としてのハプトグロビン非固定化膜（膜
ｂという）を、検体（ヒト血清）の収容されているチュ
ーブに同時に浸漬し、室温、１分間インキュベートし
た。検体より膜ａ及びｂを取出し、注射用水（約30ml）
の入った容器に入れ、蓋をした後、容器を上下に激しく
振盪（20回程度）して洗浄した。この洗浄操作を、水を
代えて繰り返した（計３回）。容器より膜ａ及びｂを取
り出し、濾紙上で軽く水分を除去した。
ｂという）を、検体（ヒト血清）の収容されているチュ
ーブに同時に浸漬し、室温、１分間インキュベートし
た。検体より膜ａ及びｂを取出し、注射用水（約30ml）
の入った容器に入れ、蓋をした後、容器を上下に激しく
振盪（20回程度）して洗浄した。この洗浄操作を、水を
代えて繰り返した（計３回）。容器より膜ａ及びｂを取
り出し、濾紙上で軽く水分を除去した。
一方、濃度0.1W/V％の過酸化水素水と濃度2mMの3,
3′,5,5′−テトラメチルベンジジン溶液を1:1で混合し
た溶液を調製し、この溶液を1mlずつチューブ２本に採
取し、各チューブに上記膜ａ及びｂをそれぞれ浸漬し
た。室温で５分間インキュベートした後、膜ｂを対照と
して膜ａの発色を観察し、発色が認められた検体を遊離
ヘモグロビン陽性（＋）と、発色が認められない検体を
遊離ヘモグロビン陰性（−）と判別した。
3′,5,5′−テトラメチルベンジジン溶液を1:1で混合し
た溶液を調製し、この溶液を1mlずつチューブ２本に採
取し、各チューブに上記膜ａ及びｂをそれぞれ浸漬し
た。室温で５分間インキュベートした後、膜ｂを対照と
して膜ａの発色を観察し、発色が認められた検体を遊離
ヘモグロビン陽性（＋）と、発色が認められない検体を
遊離ヘモグロビン陰性（−）と判別した。
比較試験として、遊離ヘモグロビン分別定量法（臨床
ハプトグロビン、大城盃著：永井書店発行、第28頁参
照）に基づき、同一の血清検体について遊離ヘモグロビ
ンの定量を行い、上記本発明の測定法との相関を調べ
た。その結果を第１表に示す。なお、第１表中、分別定
量法の欄において、＋は遊離ヘモグロビンが認められた
検体、−は遊離ヘモグロビンが認められなかった検体を
意味する。
ハプトグロビン、大城盃著：永井書店発行、第28頁参
照）に基づき、同一の血清検体について遊離ヘモグロビ
ンの定量を行い、上記本発明の測定法との相関を調べ
た。その結果を第１表に示す。なお、第１表中、分別定
量法の欄において、＋は遊離ヘモグロビンが認められた
検体、−は遊離ヘモグロビンが認められなかった検体を
意味する。
第１表に示されるように、本発明の測定法の結果は、
分別定量法の結果とよく相関していた。
分別定量法の結果とよく相関していた。
実施例２ 遊離ヘモグロビン標準品による検量線の作成 製造例２で得た遊離ヘモグロビン標準液を、1ml中の
遊離ヘモグロビン量が0.5〜100mg/dl程度となるように
精製水で希釈し、種々の濃度の遊離ヘモグロビン標準試
料液を調製した。
遊離ヘモグロビン量が0.5〜100mg/dl程度となるように
精製水で希釈し、種々の濃度の遊離ヘモグロビン標準試
料液を調製した。
次いで、得られた遊離ヘモグロビン標準試料液を検体
として、実施例１と同様な方法で測定を行って発色させ
た後、2N硫酸（0.1ml）を添加して反応を停止させ、試
料液の450nmにおける吸光度を測定した。吸光度測定
は、各標準試料液について３回行い、その平均値を求
め、遊離ヘモグロビン濃度に対して吸光度をプロット
し、検量線を作成した。得られた検量線を第１図に示
す。
として、実施例１と同様な方法で測定を行って発色させ
た後、2N硫酸（0.1ml）を添加して反応を停止させ、試
料液の450nmにおける吸光度を測定した。吸光度測定
は、各標準試料液について３回行い、その平均値を求
め、遊離ヘモグロビン濃度に対して吸光度をプロット
し、検量線を作成した。得られた検量線を第１図に示
す。
実施例３ 前記の分別定量法により予め遊離ヘモグロビン量を測
定したヒト血清（24検体）につき、実施例１と同様な方
法で測定を行い、発色した試料液に2N硫酸（0.1ml）を
添加して反応を停止させ、試料液の450nmにおける吸光
度を測定した。
定したヒト血清（24検体）につき、実施例１と同様な方
法で測定を行い、発色した試料液に2N硫酸（0.1ml）を
添加して反応を停止させ、試料液の450nmにおける吸光
度を測定した。
次に、測定された吸光度と実施例２で得られた検量線
とを対比して、各ヒト血清中の遊離ヘモグロビン量を求
めた。その結果を第２表に示す。
とを対比して、各ヒト血清中の遊離ヘモグロビン量を求
めた。その結果を第２表に示す。
第２表に示されるように、分別定量法の測定値と本発
明測定法の測定値とはよく相関していることが明らかと
なった。
明測定法の測定値とはよく相関していることが明らかと
なった。
【図面の簡単な説明】 第１図は、ハプトグロビン固定化膜を用いて本発明の方
法により遊離ヘモグロビンを測定した場合の遊離ヘモグ
ロビン濃度と吸光度との関係を示す図である。
法により遊離ヘモグロビンを測定した場合の遊離ヘモグ
ロビン濃度と吸光度との関係を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−198997（ＪＰ，Ａ) 欧州公開117689（ＥＰ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 3/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】ヒトハプトグロビンを固相に結合させたハ
プトグロビン固定化固相に、遊離ヘモグロビン含有検体
を接触させて検体中の遊離ヘモグロビンを固相上のヒト
ハプトグロビンと結合させ、次いで過酸化物試薬溶液及
び発色試薬溶液を作用させ、当該溶液の光学的変化を測
定することを特徴とする遊離ヘモグロビンの測定法。 - 【請求項２】ヒトハプトグロビンを固相に結合させたハ
プトグロビン固定化固相、過酸化物試薬及び発色試薬と
からなる遊離ヘモグロビン測定用試薬キット。 - 【請求項３】ハプトグロビン固定化固相の固相が、プラ
スチック膜、プラスチックボール又はプラスチックチュ
ーブである請求項２記載の遊離ヘモグロビン測定用試薬
キット。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2070388A JP3003152B2 (ja) | 1990-03-20 | 1990-03-20 | 遊離ヘモグロビンの測定法及びそれに用いる遊離ヘモグロビン測定用試薬キット |
| CA 2038360 CA2038360A1 (en) | 1990-03-20 | 1991-03-15 | Process for assaying free hemoglobin and reagent kit for assaying free hemoglobin |
| EP19910104327 EP0448072A3 (en) | 1990-03-20 | 1991-03-20 | Process for assaying free hemoglobin and reagent kit for assaying free hemoglobin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2070388A JP3003152B2 (ja) | 1990-03-20 | 1990-03-20 | 遊離ヘモグロビンの測定法及びそれに用いる遊離ヘモグロビン測定用試薬キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03272698A JPH03272698A (ja) | 1991-12-04 |
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Family
ID=13430012
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2070388A Expired - Fee Related JP3003152B2 (ja) | 1990-03-20 | 1990-03-20 | 遊離ヘモグロビンの測定法及びそれに用いる遊離ヘモグロビン測定用試薬キット |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0448072A3 (ja) |
| JP (1) | JP3003152B2 (ja) |
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| EP0805981A1 (en) * | 1995-01-25 | 1997-11-12 | Therakos, Inc. | Disposable hemolysis detector |
| GB9723773D0 (en) | 1997-11-12 | 1998-01-07 | Univ Glasgow | Haptoglobin assay |
| GB9924180D0 (en) * | 1999-10-12 | 1999-12-15 | Univ Glasgow | Assays for mastitis |
| JP3541352B2 (ja) * | 2000-06-09 | 2004-07-07 | アークレイ株式会社 | リポ蛋白質とヘモグロビンまたはヘモグロビン類似物質との選択的複合体、該複合体を利用する測定法、及び測定キット |
| CN108802404A (zh) * | 2018-07-24 | 2018-11-13 | 郑州伊美诺生物技术有限公司 | 牛血清中血红蛋白的定量检测方法 |
| US20220043008A1 (en) * | 2018-09-26 | 2022-02-10 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Hemoglobin assay reagent, assay kit and assay method |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB708996A (en) * | 1954-04-15 | 1954-05-12 | Miles Lab | Improvements in or relating to diagnostic compositions |
| JPS54150885A (en) * | 1978-05-17 | 1979-11-27 | Green Cross Corp | Hemoglobin measuring kit |
| DE3265794D1 (en) * | 1981-07-16 | 1985-10-03 | Hoffmann La Roche | Method for the detection of human occult blood in human stool samples |
| EP0117689A1 (en) * | 1983-03-01 | 1984-09-05 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Improved specimen slide for occult blood testing |
| US4447542A (en) * | 1983-04-04 | 1984-05-08 | Miles Laboratories, Inc. | Analytical test composition, device and method for the determination of peroxidatively active substances |
| DE3314308A1 (de) * | 1983-04-20 | 1984-10-25 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und reagens zur bestimmung des haemoglobin-haptoglobin komplexes in gegenwart von freiem haemoglobin |
| JPS6162864A (ja) * | 1984-09-05 | 1986-03-31 | Konishiroku Photo Ind Co Ltd | 抗原の検出方法 |
| DE3711055A1 (de) * | 1987-04-02 | 1988-10-13 | Miles Inc | Neue dicyanoethylarylderivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung als redoxindikatoren |
| SU1536313A1 (ru) * | 1987-11-16 | 1990-01-15 | 2-й Московский государственный медицинский институт им.Н.И.Пирогова | Способ определени мукоцилиарной недостаточности у больных хроническими бронхолегочными заболевани ми |
-
1990
- 1990-03-20 JP JP2070388A patent/JP3003152B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-03-15 CA CA 2038360 patent/CA2038360A1/en not_active Abandoned
- 1991-03-20 EP EP19910104327 patent/EP0448072A3/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0448072A3 (en) | 1992-03-18 |
| EP0448072A2 (en) | 1991-09-25 |
| CA2038360A1 (en) | 1991-09-21 |
| JPH03272698A (ja) | 1991-12-04 |
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