ES2869895T3 - Método de purificación de proteínas - Google Patents
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Abstract
Un método para eliminar el ADN contaminante en una muestra que contiene anticuerpos que comprende las siguientes etapas: 1) aplicar la muestra que contiene el anticuerpo a la cromatografía de afinidad sobre Proteína A, seguido de una etapa de elución que implica i) equilibrado de la resina de Proteína A utilizando NaCl 1 M/tampón de citrato-fosfato de 10 a 100 mM a pH 7,5; ii) cargar la muestra de anticuerpo en la resina, seguido de iii) una primera etapa de lavado utilizando NaCl 1 M/tampón de citrato-fosfato de 10 a 100 mM de pH 7,5, y iv) una segunda etapa de lavado utilizando tampón de citrato-fosfato de 10 a 100 mM de pH 7,5, seguido de v) una etapa de elución utilizando HCl 2,5 mM a pH 2,6; 2) ajustar el pH del producto eluido a pH 7 con una solución de Tris 300 mM para formar partículas; y 3) eliminar las partículas resultantes, en donde el anticuerpo es el anticuerpo humanizado anti-receptor de IL-6 hPM-1.
Description
DESCRIPCIÓN
Método de purificación de proteínas
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método para purificar proteínas, más específicamente a un método para eliminar ADN contaminante de una muestra que contiene una proteína fisiológicamente activa tal como moléculas de anticuerpos.
Técnica anterior
Los avances en la tecnología de genes recombinantes han permitido proporcionar un suministro estable de diversas formulaciones de proteínas. En particular, se ha desarrollado y ha entrado en ensayos clínicos en los últimos años una variedad de fármacos de anticuerpos recombinantes, que son más selectivos que los fármacos normales.
En estas formulaciones producidas de forma recombinante que contienen proteínas fisiológicamente activas, existe la necesidad de eliminar el ADN del anfitrión y el ADN contaminante asociado con la contaminación viral. Según los criterios actuales de la Organización Mundial de la Salud (OMS), la cantidad de ADN en los medicamentos biológicos no debe exceder los 100 pg de ADN/dosis. Para cumplir este criterio, en general, un medio acuoso que contiene una proteína fisiológicamente activa obtenida de células anfitrionas se trata mediante cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de hidroxiapatita o una combinación de las mismas con el fin de eliminar el ADN.
En particular, en un caso en el que una proteína fisiológicamente activa es un anticuerpo producido de forma recombinante en células anfitrionas de mamífero, el medio acuoso se trata mediante cromatografía en columna de afinidad sobre Proteína A o Proteína G antes de la purificación mediante varios tipos de cromatografía, basándose en la propiedad de unión de Proteína A o Proteína G a la cadena Fc de IgG.
A modo de ejemplo, en el documento JP 5-504579 A, un medio acuoso que contiene anticuerpo obtenido de cultivo de células de mamífero se aplica a cromatografía en columna de Proteína A/G para adsorber moléculas de anticuerpo en la columna, y a continuación, se eluye con una solución ácida (ácido cítrico aproximadamente 0,1 M, pH 3,0-3,5) para liberar las moléculas de anticuerpo. El producto eluido ácido resultante se aplica secuencialmente a cromatografía en columna de intercambio iónico y cromatografía en columna de exclusión por tamaño para proporciona las moléculas de anticuerpo purificadas.
Sin embargo, estos procedimientos cromatográficos individuales y una combinación de los mismos consumen tiempo, trabajo y costes, además de ser complicados. Además, no proporcionan resultados estables.
Por tanto, existe la necesidad de desarrollar un método más simple y menos costoso para purificar proteínas fisiológicamente activas, especialmente anticuerpos, que pueda asegurar la eliminación del ADN contaminante y que pueda minimizar la pérdida de proteínas fisiológicamente activas.
Divulgación de la invención
Como resultado de esfuerzos extensos e intensos realizados para superar estos problemas, los autores de la presente invención han encontrado el sorprendente hallazgo de que el ADN contaminante se puede eliminar de manera eficiente de una muestra que contiene una proteína fisiológicamente activa sin utilizar complicados procesos cromatográficos en un caso en el que la muestra se convierte en una solución acuosa ácida de baja conductividad, se neutraliza mediante la adición de un tampón para elevar el pH a un nivel neutro y a continuación, se filtra a través de un filtro para eliminar las partículas resultantes. Este hallazgo condujo a la finalización de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones.
Además, la solicitud divulga lo siguiente:
(1) Un método para eliminar el ADN contaminante en una muestra que contiene una proteína fisiológicamente activa, que comprende las siguientes etapas:
1) convertir la muestra que contiene una proteína fisiológicamente activa en una solución acuosa neutra de baja conductividad; y
2) eliminar las partículas resultantes.
(2) Un método para eliminar el ADN contaminante en una muestra que contiene una proteína fisiológicamente activa, que comprende las siguientes etapas:
1) convertir la muestra que contiene una proteína fisiológicamente activa en una solución acuosa ácida o alcalina de baja conductividad;
2) ajustar el pH de la muestra resultante a un nivel neutro; y
3) eliminar las partículas resultantes.
(3) Un método para eliminar el ADN contaminante en una muestra que contiene anticuerpos, que comprende las siguientes etapas:
1) aplicar la muestra que contiene el anticuerpo a cromatografía de afinidad sobre la Proteína A o Proteína G para eluir el anticuerpo con una solución acuosa ácida de baja conductividad; 2) neutralizar el producto eluido resultante mediante la adición de un tampón para elevar el pH a un nivel neutro; y
3) eliminar las partículas resultantes.
(4) El método según los apartados (2) o (3) anteriores, en donde la solución acuosa ácida de baja conductividad tiene una molaridad de 0 a 100 mM.
(5) El método según los apartados (2) o (3) anteriores, en donde la solución acuosa ácida de baja conductividad tiene una fuerza iónica de 0 a 0,2.
(6) El método según los apartados (2) o (3) anteriores, en donde la solución acuosa ácida de baja conductividad tiene una conductividad de 0 a 300 mS/m.
(7) El método según cualquiera de los apartados (2) a (6) anteriores, en donde la solución acuosa ácida se selecciona entre soluciones acuosas de ácido clorhídrico, ácido cítrico y ácido acético.
(8) El método según el apartado (7) anterior, en donde la solución acuosa ácida tiene un pH de 1,5 a 3,9. (9) El método según cualquiera de los apartados (1) a (7) anteriores, en donde el ADN contaminante está presente a una concentración de ADN de 22,5 pg/ml o menos en la muestra tratada que contiene una proteína fisiológicamente activa.
(10) El método según el apartado (3) anterior, en donde el tampón es una solución acuosa de Tris.
(11) El método según el apartado (3) anterior, en donde el tampón se añade para elevar el pH de 4,3 a 7,5. (12) El método según los apartados (1) o (2) anteriores, en donde la proteína fisiológicamente activa es un anticuerpo.
(13) El método según los apartados (3) o (12) anteriores, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado.
(14) El método según el apartado (13) anterior, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado anti receptor de IL-6.
(15) El método según el apartado (13) anterior, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-antígeno HM1.24.
(16) El método según el apartado (13) anterior, en donde el anticuerpo es un anticuerpo peptídico humanizado relacionado con la hormona anti-paratiroidea (anticuerpo anti-PTHrP).
(17) El método según el apartado (13) anterior, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado anti factor tisular.
(18) El método según cualquiera de los apartados (1) a (3) anteriores, en donde las partículas se eliminan mediante filtración a través de un filtro.
(19) Una proteína fisiológicamente activa purificada que se puede obtener mediante el método según los apartados (1) o (2) anteriores.
(20) Un anticuerpo purificado obtenible mediante el método según el apartado (3) anterior.
(21) Un anticuerpo purificado sustancialmente libre de productos conjugados de anticuerpo-ADN en una solución acuosa neutra de baja conductividad.
(22) Un anticuerpo purificado que tiene una concentración de ADN de 22,5 pg/ml o menos.
Mejor modo de llevar a cabo la invención
Los ejemplos de una proteína fisiológicamente activa contenida en una muestra que debe ser purificada mediante el método descrito en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, factores hematopoyéticos tales como factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), eritropoyetina (EPO) y trombopoyetina, citocinas tales como interferones, IL-1 e IL-6, anticuerpos monoclonales, activador del plasminógeno tisular (tPA), uroquinasa, albúmina sérica, factor VIII de coagulación sanguínea, leptina, insulina y factor de crecimiento de células progenitoras (SCF). Entre estas proteínas, se prefieren EPO, G-CSF y anticuerpos que incluyen anticuerpos monoclonales, y son más preferidos los anticuerpos monoclonales.
Por tanto, la presente invención proporciona un método para eliminar ADN contaminante en una muestra que contiene anticuerpos utilizando cromatografía de afinidad de Proteína A, en donde el anticuerpo es anticuerpo humanizado anti-receptor de IL-6 hPM-1 como se reivindica en la reivindicación 1 adjunta.
Una "proteína fisiológicamente activa" se refiere a una proteína que tiene sustancialmente las mismas actividades biológicas que una proteína de mamífero (especialmente humana) fisiológicamente activa. Tal proteína puede ser de origen natural o recombinante, preferiblemente recombinante. Una proteína recombinante incluye aquellas que tienen la misma secuencia de aminoácidos que la proteína nativa correspondiente, así como aquellas que comprenden la deleción, sustitución o adición de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos, pero que conservan las actividades biológicas como se mencionó anteriormente. Adicionalmente, una proteína
fisiológicamente activa incluye aquellas modificadas químicamente con PEG, etc.
Cuando una proteína fisiológicamente activa es una glicoproteína, se puede glicosilar con cadenas de azúcar de cualquier origen, preferiblemente de origen mamífero. Las células de mamífero susceptibles de glicosilación incluyen, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO), células BHK, células COS y células derivadas de seres humanos, siendo las células CHO las más preferidas.
Cuando la proteína fisiológicamente activa es EPO, ésta se puede preparar de cualquier manera, por ejemplo, mediante extracción de orina humana de diversas maneras o mediante producción recombinante en células de ovario de hámster chino (CHO), células BHK, células COS, células derivadas de seres humanos. o similares (p. ej., como se describe en el documento JP 61-12288 A). La EPO así preparada se aísla y purifica de diversas formas antes de su uso. Además, la EPO se puede modificar químicamente con PEG, etc. (véase el documento WO90/12874). La EPO como se emplea en la presente memoria incluye adicionalmente EPO no glicosilada que está modificada químicamente con PEG, etc. Asimismo, también se incluyen análogos de EPO, que se modifican para tener al menos un sitio adicional para la glicosilación ligada a N u O en la secuencia de aminoácidos de EPO (véanse, p. ej., JP 8-151398 A, JP 8-506023 A). En lugar de aumentar el número de sitios de glicosilación, los análogos de EPO también se pueden modificar para tener un aumento del contenido de ácido siálico o similar para lograr cadenas de azúcar adicionales.
Cuando la proteína fisiológicamente activa es G-CSF, se puede utilizar cualquier G-CSF siempre que esté altamente purificado. El G-CSF, como se emplea en la presente memoria, se puede preparar de cualquier manera, por ejemplo, mediante extracción de líneas de células tumorales humanas cultivadas o mediante producción recombinante en células bacterianas tales como E. coli; células de levadura; o células cultivadas derivadas de animales tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células C127 o células COS. El G-CSF así preparado se aísla y purifica de diversas formas antes de su uso. Se prefiere un G-CSF recombinante producido en células de E. coli, células de levadura o células CHO. El más preferido es un G-CSF recombinante producido en células CHO. Además, el G-CSF se puede modificar químicamente con PEG, etc. (véase el documento WO90/12874).
Cuando la proteína fisiológicamente activa es un anticuerpo monoclonal, éste se puede preparar de cualquier manera. Un anticuerpo monoclonal se puede producir, en principio, utilizando técnicas conocidas inmunizando con un antígeno sensibilizado de una manera convencional para la inmunización, fusionando los inmunocitos resultantes con células parentales conocidas de una manera convencional para la fusión celular y a continuación, seleccionando las células productoras de anticuerpos monoclonales en una forma convencional de detección. Adicionalmente, un anticuerpo monoclonal como se emplea en la presente memoria no se limita a los producidos por hibridomas, sino que incluye anticuerpos quiméricos que se modifican artificialmente, por ejemplo, con el propósito de reducir la xenoantigenicidad en seres humanos. Alternativamente, también se pueden utilizar anticuerpos humanizados reformados.
Tales anticuerpos se preparan reemplazando regiones determinantes de complementariedad de anticuerpos humanos por las de anticuerpos de mamíferos no humanos (p. ej., de ratón); También se conocen procedimientos recombinantes convencionales para este propósito. Tales procedimientos conocidos se pueden utilizar para proporcionar anticuerpos humanizados reformados.
Si fuera necesario, se pueden realizar sustituciones de aminoácidos en las regiones marco (FR) de los dominios variables del anticuerpo de modo que las regiones determinantes de la complementariedad de los anticuerpos humanizados reformados formen sitios apropiados de unión al antígeno (Sato y col., Cancer Res. 53: 1-6, 1993). Un anticuerpo humanizado anti-receptor de IL-6 (hPM-1) se puede presentar como un ejemplo preferido para tales anticuerpos humanizados reformados (véase el documento WO92/19759). Además de éste, también se describen un anticuerpo monoclonal humanizado anti-antígeno HM1.24 (véase el documento WO98/14580), un anticuerpo peptídico humanizado relacionado con la hormona paratiroidea (anticuerpo anti-PTHrP) (véase el documento WO98/13388), un anticuerpo humanizado anti-factor tisular (véase el documento WO99/51743) y similares.
Adicionalmente, también se describen anticuerpos humanos producidos en animales transgénicos o mediante tecnología de presentación en fagos, etc.
Como se emplea en la presente memoria, una "muestra que contiene una proteína fisiológicamente activa" o una "muestra que contiene anticuerpos" se refiere preferiblemente a un medio de cultivo de células de mamífero (por ejemplo, células CHO) que contiene una proteína fisiológicamente activa o moléculas de anticuerpo producidas mediante cultivo, que se pueden someter adicionalmente a una purificación parcial u otro tratamiento específico. Como se describe, el ADN contaminante en una muestra que contiene una proteína fisiológicamente activa se elimina mediante un método que comprende las siguientes etapas:
1) convertir la muestra que contiene una proteína fisiológicamente activa en una solución acuosa neutra de
baja conductividad; y
2) eliminar las partículas resultantes.
Como se emplea en la presente memoria, una "solución acuosa neutra de baja conductividad" generalmente se refiere a una solución acuosa de pH 4 a pH 8, preferiblemente de pH 4,5 a pH 7,5, que tiene una molaridad de 0 a 100 mM, preferiblemente de 0 a 50 mM, más preferiblemente de 0 a 30 mM, o tiene una fuerza iónica de 0 a 0,2, preferiblemente de 0 a 0,12, o tiene una conductividad de 0 a 300 mS/m, preferiblemente de 0 a 200 mS/m, más preferiblemente de 0 a 150 mS/m.
El ADN contaminante adicional en una muestra que contiene una proteína fisiológicamente activa se elimina mediante un método que comprende las siguientes etapas:
1) convertir la muestra que contiene una proteína fisiológicamente activa en una solución acuosa ácida o alcalina de baja conductividad;
2) ajustar el pH de la muestra resultante a un nivel neutro; y
3) eliminar las partículas resultantes.
Adicionalmente, lo que es muy ventajoso cuando una proteína fisiológicamente activa es un anticuerpo, es que el ADN contaminante en una muestra que contiene antígeno se elimine mediante un método que comprende las siguientes etapas:
1) aplicar la muestra que contiene el anticuerpo a cromatografía de afinidad sobre Proteína A o Proteína G para eluir el anticuerpo con una solución acuosa ácida de baja conductividad;
2) neutralizar el producto eluido resultante mediante la adición de un tampón para elevar el pH a un nivel neutro; y
3) eliminar las partículas resultantes.
En el método, una muestra que contiene una proteína fisiológicamente activa se convierte en una solución acuosa ácida de baja conductividad, preferiblemente eluyendo la muestra de la cromatografía de afinidad de Proteína A/G con una solución acuosa ácida de baja conductividad. Como se emplea en la presente memoria, una "solución acuosa ácida de baja conductividad" generalmente se refiere a una solución acuosa de pH 1,5 a pH 3,9, preferiblemente de pH 2,0 a pH 3,9, más preferiblemente de pH 2,0 a pH 3,0, que tiene una molaridad de 0 a 100 mM, preferiblemente 0 a 50 mM, más preferiblemente 0 a 30 mM, o tiene una fuerza iónica de 0 a 0,2, preferiblemente 0 a 0,12, o tiene una conductividad de 0 a 300 mS/m, preferiblemente 0 a 200 mS/m, más preferiblemente de 0 a 150 mS/m. La solución acuosa ácida se puede seleccionar entre soluciones acuosas de ácido clorhídrico, ácido cítrico, ácido acético y otros ácidos. El tipo, la conductividad y el pH de la solución acuosa ácida de baja conductividad variarán dependiendo del tipo de proteína o anticuerpo fisiológicamente activos que se vayan a purificar. Los expertos en la técnica determinarán fácilmente las condiciones óptimas para estos parámetros en experimentos preliminares como se describe en la presente memoria.
En el método, después de que una muestra que contiene una proteína fisiológicamente activa se convierta en una solución acuosa ácida de baja conductividad, la muestra resultante se neutraliza mediante la adición de un tampón para elevar el pH a un nivel neutro. Alternativamente, se aplica una muestra que contiene anticuerpo a cromatografía de afinidad en Proteína A o Proteína G, se eluye con una solución acuosa ácida de baja conductividad y a continuación, se neutraliza mediante la adición de un tampón para elevar el pH a un nivel neutro. Un tampón añadido en esta etapa incluye, por ejemplo, tampón Tris-HCl y tampón fosfato, y adicionalmente incluye solución acuosa de Tris, solución acuosa de Na2 HPO4 , solución acuosa de NaOH, etc. Un nivel neutro variará dependiendo del tipo de proteína o anticuerpo fisiológicamente activo que se vaya a purificar. Normalmente varía de pH 4 a pH 8, preferiblemente de pH 4,3 a pH 7,5 y más preferiblemente de pH 4,5 a pH 7,5. Los expertos en la técnica determinarán fácilmente las condiciones óptimas para el tipo de tampón utilizado y un nivel de pH neutro en experimentos preliminares como se describe en la presente memoria.
Asimismo, una "solución acuosa alcalina de baja conductividad", como se emplea en la presente memoria, generalmente se refiere a una solución acuosa de pH 7,5 a pH 13, que tiene una molaridad de 0 a 100 mM, preferiblemente de 0 a 50 mM, más preferiblemente de 0 a 30 mM, o tiene una fuerza iónica de 0 a 0,2, preferiblemente de 0 a 0,12, o tiene una conductividad de 0 a 300 mS/m, preferiblemente de 0 a 200 mS/m, más preferiblemente de 0 a 150 mS/m. El pH de esta solución variará dependiendo del tipo de proteína o anticuerpo fisiológicamente activo que se vaya a purificar.
La solución neutralizada a un nivel de pH neutro en la etapa anterior, a su vez, produce partículas (es decir, se enturbia). Estas partículas se pueden eliminar mediante filtración a través de un filtro para asegurar la eliminación eficaz del ADN contaminante. Los ejemplos de un filtro disponible para filtración incluyen, pero no se limitan a, un sistema de filtro de acetato de celulosa de 1,0-0,2 pm (Corning) o TFF.
Alternativamente, estas partículas también se pueden eliminar mediante centrifugación o cualquier otra técnica para
la eliminación eficaz de partículas; Los procedimientos de eliminación no se limitan a la filtración a través de un filtro. Sin estar ligados a ninguna teoría en particular, los autores de la presente invención estiman que cada una de estas partículas es un producto conjugado formado entre proteína fisiológicamente activa y ADN. La eliminación de partículas por filtración da como resultado una pequeña pérdida de proteína fisiológicamente activa ya que se elimina en forma de productos conjugados de ADN-proteína fisiológicamente activa. Sin embargo, una pérdida tan pequeña constituye sólo un pequeño porcentaje de la cantidad total de proteína fisiológicamente activa; se puede recolectar aproximadamente 90% de la proteína fisiológicamente activa, como se describirá en los Ejemplos siguientes.
Los autores de la presente invención también estiman que la cromatografía en columna de Proteína A/G sola no es suficiente para asegurar una separación eficaz entre el ADN contaminante y la proteína fisiológicamente activa ya que se forman productos conjugados de ADN-proteína en la resina de la columna.
La proteína fisiológicamente activa así purificada está disponible para su uso como formulación farmacéutica después de una purificación adicional mediante cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de hidroxiapatita o combinaciones de las mismas.
El ensayo de ADN cuantitativo se puede realizar mediante, pero no se limita a. Ensayo de ADN Total Umbral junto con extracción de ADN antes del ensayo.
El método descrito en la presente memoria permite eliminar eficazmente el ADN contaminante de una manera muy sencilla hasta una concentración de ADN extremadamente baja (p. ej., 22,5 pg/ml); es significativamente ventajoso en la purificación de proteínas fisiológicamente activas, especialmente moléculas de anticuerpos. El método descrito en la presente memoria también permite la reducción de costes y tiene una gran importancia en este campo técnico. Por tanto, la presente invención proporciona lo siguiente:
1. Un método para eliminar el ADN contaminante en una muestra que contiene anticuerpos que comprende las siguientes etapas:
1) aplicar la muestra que contiene el anticuerpo a cromatografía de afinidad en la Proteína A, seguido de una etapa de elución que implica
i) equilibrar la resina de Proteína A utilizando NaCl 1 M/tampón de citrato-fosfato de 10 a 100 mM a pH 7,5;
ii) cargar la muestra de anticuerpo en la resina, seguido de
iii) una primera etapa de lavado utilizando NaCl 1 M/tampón citrato-fosfato de 10 a 100 mM pH 7,5, y
iv) una segunda etapa de lavado utilizando tampón citrato-fosfato de 10 a 100 mM pH 7,5, seguido de
v) una etapa de elución utilizando HCl 2,5 mM a pH 2,6;
2) ajustar el pH del producto eluido a pH 7 con una solución de Tris 300 mM para formar partículas; y 3) eliminar las partículas resultantes,
en donde el anticuerpo es el anticuerpo humanizado anti-receptor de IL-6 hPM-1.
2. El método según la reivindicación 1, en donde las partículas se eliminan mediante filtración a través de un filtro.
3. Un método para fabricar el anticuerpo humanizado anti-receptor de IL-6 hPM-1 purificado, que comprende las etapas del método según la reivindicación 1.
La presente invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no se pretende que limiten el alcance de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: Examen de la composición de tampón para cromatografía de afinidad de Proteína A en la purificación de hPM-1 (anticuerpo humanizado anti-receptor de IL-6)
(1) Material de prueba (muestra que contiene anticuerpos)
Una muestra que contenía el medio de cultivo (en adelante abreviado como MC) de células CHO que producen anticuerpo hPM-1 (anticuerpo humanizado anti-receptor de IL-6), que se había centrifugado para eliminar las células y almacenado a -80°C, se filtró a través de un Sistema de Filtro de 0,22 pm de Acetato de Celulosa (abreviado como AC) (CORNING) y se utilizó como muestra de prueba para el examen de purificación. El anticuerpo hPM-1 se preparó como se describe en el Ejemplo de referencia 2 del documento JP 8-99902 A utilizando el promotor del
factor de elongación humano 1a mostrado en el Ejemplo 10 del documento WO92/19759.
(2) Aparato utilizado para el examen
Para producto eluido de HCl
HPLC: Bomba inteligente L-6200 (HITACHI)
Detector UV-VIS L-4200 (HITACHI)
Cromato-Integrador D-2500 (HITACHI)
Columna: HR5/2 (Pharmacia), 5 mm D.I. * 20 mmH
Medio: POROS 50A (PerSeptive), 0,4 ml
Lote; A250-039, Código; ESPECIAL
Para partículas
HPLC: Sistema Waters PrepLC4000 (Waters)
Controlador del Sistema Waters2000 (Waters)
Detector de Absorbancia Sintonizable Waters486 (Waters)
Módulo de Datos Waters741 (Waters)
Espectrofotómetro: U-2000 (HITACHI)
Columna: XK26 (Pharmacia), 26 mm D.I. * 100 mmH
Medio: POROS 50A (PerSeptive), 53 ml
Lote; A250-039, Código; ESPECIAL
(3) Análisis y ensayo
ensayo hPM-1:
El hPM-1 se analiza mediante HPLC de fase inversa en una columna PLRP-S (Polymer Laboratories) con un gradiente lineal.
Ensayo de ADN:
El ADN se mide mediante el ensayo Threshold Total DNA. Antes del ensayo, se realiza la extracción de ADN (p. ej., utilizando un kit de extracción de ADN, Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.). Asimismo, para la medición se utiliza un kit de ensayo Threshold Total DNA (Molecular Devices).
Turbidimetría:
Se controla la formación de partículas de cada muestra de prueba midiendo su absorbancia a 660 nm en un espectrofotómetro U-2000 (HITACHI).
(1) Examen de las condiciones de elución
Variando la composición del tampón para la elución en cromatografía de afinidad de Proteína A, se realizó un examen para confirmar e l% de recuperación de hPM-1 y la eliminación del ADN por elución. La muestra que contenía el anticuerpo anterior se aplicó a la columna en las condiciones indicadas en la Tabla 1 a continuación. La resina de Proteína A se equilibró con el tampón de equilibrado indicado en la Tabla 1 y a continuación, se cargó con la muestra que contenía el anticuerpo anterior, seguido de Lavado 1, Lavado 2 y elución. El perfil de elución se controló a a 280 nm para aislar un pico de proteína. En la tabla, Tampón C-P indica tampón de citrato-fosfato.
Tabla 1
No se observaron diferencias cromatografías entre los métodos de elución 1, 2 y 3.
Cada fracción de elución se ajustó a pH 7,0 con una solución de Tris 300 mM, lo que indica que se generaron partículas en las fracciones eluidas con HCl (Métodos de elución 2 y 3). Se realizó un examen adicional para determinar la correlación entre la formación de partículas y el % de recuperación de hPM-1 o la cantidad de ADN residual.
Para examinar la correlación de partículas, el producto eluido de HCl del método de elución 2 se complementó con NaCl y se analizó la correlación entre las concentraciones de NaCl añadidas (0 mM, 50 mM, 100 mM) y varios factores. Para analizar la correlación entre las concentraciones de NaCl añadidas y varios factores, se prepararon muestras filtradas y sin filtrar de la siguiente manera: cada fracción de elución de Proteína A complementada con NaCl se ajustó a pH 7,0 con una solución de Tris 300 mM y a continuación, se filtró o no se filtró a través de un Filtro AC de 0,22 |jm. Se midió el % de recuperación de hPM-1 en las muestras filtradas y sin filtrar (solo muestras filtradas) y la cantidad de ADN residual.
% de Recuperación
Se midió el % de recuperación de hPM-1 para los métodos de elución individuales. Como resultado, el % de recuperación fue tan alto como 98,6% en el Método de elución 1. Por el contrario, el % de recuperación varió de 83,8% a 97,1% en el Método de elución 2 y de 83,5% a 93,7% en el Método de elución 2; se estimó que estas variaciones se debían a la pequeñez de la escala de examen (volumen de resina: 0,4 ml). Cuando se aumentó la escala de purificación, se confirmó que el % de recuperación de hPM-1 se estabilizó en 90% o más (Método de elución 2). Por tanto, también se encontró que el % de recuperación de hPM-1 permanecía alto incluso en la elución de HCl.
Correlación entre las concentraciones de NaCl añadidas y varios factores en el producto eluido de HCl La Tabla 2 resume el análisis de la correlación entre las concentraciones de NaCl añadidas y varios factores en el producto eluido de HCl.
Tabla 2
Para las muestras filtradas, el % de recuperación de hPM-1 fue de 88% con NaCl 100 mM, 86% con NaCl 50 mM y 81% con NaCl 0 mM. La cantidad de ADN residual fue baja a NaCl 0 mM tanto en muestras filtradas como sin filtrar. En particular, la muestra filtrada complementada con NaCl 0 mM tenía un contenido de ADN muy bajo de 11 pg de ADN/mg de hPM-1.
Las muestras de pH ajustado con una turbidez más alta tienden a proporcionar un % de recuperación más bajo de hPM-1 y una cantidad más pequeña de ADN residual después de la filtración. Este resultado sugiere una alta posibilidad de que tanto el hPM-1 como el ADN contribuyan a la formación de partículas. Se estima que el hPM-1 y el ADN probablemente interactúen entre sí para formar partículas ajustando el pH a 7,0. En relación con el % de recuperación superior de hPM-1, es preferible aumentar la concentración de NaCl añadida al producto eluido de HCl.
En relación con la disminución de la cantidad de ADN residual, por otro lado, es deseable eliminar la complementación de NaCl en el producto eluido de HCl.
Referencia
Ejemplo 2: Purificación de anticuerpo humanizado anti-PTHrP
Una muestra que contenía un anticuerpo humanizado anti-PTHrP (un medio de cultivo de cultivo de células CHO, filtrado a través de filtros AC SARTOBRAN P de 0,45 y 0,2 pm (Sartorius)) se purificó mediante cromatografía en columna de afinidad de Proteína A en las condiciones indicadas a continuación. El anticuerpo anti-PTHrP se preparó como se describe en el documento WO98/13388.
Condiciones experimentales
Dispositivo de purificación: AKTA explorer (Amersham Pharmacia Biotech)
Columna: HR5/5, C10, XK-26 (Amersham Pharmacia Biotech) Resina: rProtein A Sepharose Fast Flow Load: carga directa del medio de cultivo (pH 6,6 a pH 7,5) Ajuste de la fracción de elución: las fracciones de elución se ajustan a varios niveles de pH con una solución acuosa de Tris 1 M y a continuación, se filtran a través de Acetato de Celulosa de 0,2 pm (de aquí en adelante abreviado como AC) para eliminar el ADN (las condiciones se examinan en el apartado (1) a continuación).
La columna de Proteína A se equilibró suficientemente con tampón citrato-fosfato que contenía NaCl 150 mM (pH 7,5) y a continuación, se cargó con el MC que contenía el anticuerpo anterior. Posteriormente, la columna se lavó con tampón citrato-fosfato que contenía NaCl 150 mM (pH 7,5) para eliminar las impurezas no unidas, se lavó adicionalmente con tampón citrato-fosfato (pH 7,5) para disminuir la conductividad y a continuación, se eluyó con ácido cítrico acuoso 20 mM. El perfil de elución se controló a A280 nm para aislar un pico de proteína. Esta fracción de elución de Proteína A se utilizó para el siguiente examen de condiciones.
(1) Examen de las condiciones de eliminación del ADN residual en el producto eluido.
Para asegurar la eliminación eficaz del ADN residual, se realizó un examen para determinar el pH óptimo para la filtración a través de un filtro. La fracción de elución de Proteína A se ajustó con una solución acuosa de Tris 1,0 M a los siguientes niveles de pH: 2,7 (sin ajustar), 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 y 7,5. Posteriormente, cada muestra se dejó reposar durante un período de tiempo determinado, se filtró a través de un filtro AC de 0,22 pm y a continuación, se ajustó a pH 7 con una solución acuosa de Tris 1,0 M, seguido de un ensayo de ADN.
La Tabla 3 enumera los niveles de pH examinados y los períodos de reposo, junto con la cantidad de ADN residual.
Tabla 3 Eliminación de ADN residual unidad: /mL
Como se muestra en la tabla, la cantidad de ADN residual estuvo por debajo del límite de detección a pH 5,5 y pH 6,0 en todos los casos en los que las muestras se dejaron reposar durante 0, 6 y 24 horas. Además, la eliminación del ADN residual alcanzó un pico alrededor de pH 5,5 y pH 6,0, mientras que se observó una disminución de la eficacia de la eliminación del ADN a niveles de pH más altos y más bajos.
Referencia
Ejemplo 3: Purificación de anticuerpo monoclonal humanizado anti-antígeno HM1.24
Se purificó una muestra que contenía un anticuerpo monoclonal humanizado anti-antígeno HM1.24 (un medio de cultivo de cultivo de células CHO) mediante cromatografía en columna de afinidad de Proteína A en las condiciones indicadas en la Tabla 4 a continuación. El anticuerpo monoclonal anti-antígeno HM1.24 se preparó como se describe en el documento WO98/14580.
Condiciones experimentales
Columna: rProteína A FF, 5 ml (16 mm DI * 25 mmH)
Velocidad de flujo: 5 mL/min (150 cm/h)
Muestra: carga directa del medio de cultivo
Tabla 4
La columna de Proteína A se equilibró suficientemente con tampón de citrato-fosfato que contenía NaCl 150 mM (pH 7,5) y a continuación, se cargó con el MC que contenía el anticuerpo anterior. Posteriormente, la columna se lavó con tampón de citrato-fosfato que contenía NaCl 150 mM (pH 7,5) para eliminar las impurezas no unidas, se lavó adicionalmente con tampón de citrato-fosfato (pH 7,5) para disminuir la conductividad y a continuación, se eluyó con ácido cítrico acuoso 20 mM. El perfil de elución se controló a A280 nm para aislar un pico de proteína. Esta fracción de elución de Proteína A se utilizó para el siguiente examen de condiciones.
Para asegurar la eliminación eficaz del ADN residual, se realizó un examen para determinar el pH óptimo para la filtración a través de un filtro. La fracción de elución de Proteína A se ajustó con una solución acuosa de Tris 1,0 M a los siguientes niveles de pH (pH = 4,5-7,5). Posteriormente, cada muestra se dejó reposar durante un período de tiempo determinado, se filtró a través de un filtro AC de 0,22 pm y a continuación, se ajustó a pH 7 con una solución acuosa de Tris 1,0 M, seguido de un ensayo de ADN y HPLC de fase inversa para el ensayo del anticuerpo monoclonal humanizado anti-antígeno HM1.24. La Tabla 5 muestra los resultados del ensayo de ADN, mientras que la Tabla 6 muestra el rendimiento del anticuerpo monoclonal humanizado anti-antígeno HM1.24.
Tabla 6 % de Recu eración de anticuer o monoclonal humanizado anti-antí eno HM1.24 mediante filtración
Aunque las muestras purificadas mediante cromatografía de afinidad de Proteína A todavía eran ricas en ADN, el Experimento 1 indicó que la cantidad de ADN disminuía con la disminución del pH en el orden de pH 7,5, pH 6,5 y pH 5,5, y que había una tendencia a eliminar más ADN a las 0 horas que a las 6 horas. En el Experimento 2, se llevó a cabo el mismo experimento en condiciones de pH = 4,5, 5,0 y 5,5, lo que indica que el ADN se eliminó suficientemente en el mismo grado, independientemente del pH y el período de reposo dentro del intervalo de prueba. Además, el cálculo del % de recuperación indicó una pequeña pérdida del anticuerpo monoclonal antiantígeno HM1.24 humanizado.
Referencia
Ejemplo 4: Purificación de eritropoyetina (EPO)
Se utiliza una muestra que contiene EPO (de cultivo de células CHO; Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) para el siguiente examen de las condiciones.
Composición de la muestra que contiene EPO (tampón de fosfato 1 mM);
Para asegurar la eliminación eficaz del ADN residual, se realiza un examen para determinar el pH óptimo para la filtración a través de un filtro. La muestra que contiene EPO se diluye en una solución ácida de baja conductividad (HCl acuoso 2,5 mM) y a continuación, se convierte en una solución acuosa ácida de baja conductividad utilizando ácido clorhídrico al 20%, seguido de la adición de la muestra de ADN. La muestra que contiene EPO así tratada se ajusta con una solución acuosa de Tris 1,0 M al siguiente nivel de pH (pH = 5,0 o 6,6) y a continuación, se filtra a través de un filtro AC de 0,22 pm. Posteriormente, se realiza el ensayo de ADN tanto en fracciones filtradas como sin filtrar. Este examen confirma la reducción eficaz del ADN en la muestra rica en ADN que contiene EPO.
Referencia
Ejemplo 5: Purificación del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF)
Se utiliza una muestra que contiene G-CSF (de cultivo de células CHO; Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) para el siguiente examen de las condiciones.
Composición de la muestra que contiene G-CSF (tampón Tris-HCl 20 mM);
Para asegurar la eliminación eficiente del ADN residual, se realiza un examen para determinar el pH óptimo para la filtración a través de un filtro. La muestra que contiene EPO se diluye en una solución ácida de baja conductividad (HCl acuoso 2,5 mM) y se convierte adicionalmente en una solución acuosa ácida de baja conductividad utilizando ácido clorhídrico al 20%, seguido de la adición de la muestra de ADN. La muestra que contiene G-CSF así tratada se ajusta con una solución acuosa de Tris 1,0 M al siguiente nivel de pH (pH = 4,3 o 6,6) y a continuación, se filtra a través de un filtro AC de 0,22 pm. Posteriormente, se realiza el ensayo de ADN tanto en fracciones filtradas como sin filtrar. Este examen confirma la reducción eficaz del ADN en la muestra rica en ADN que contiene G-CSF.
Referencia
Ejemplo 6: Purificación de albúmina de suero bovino (BSA)
Se utiliza una muestra que contiene BSA para el siguiente examen de condiciones.
Para asegurar la eliminación eficaz del ADN residual, se realiza un examen para determinar el pH óptimo para la filtración a través de un filtro. La muestra que contiene BSA se diluye en una solución ácida de baja conductividad (HCl acuoso 2,5 mM) y a continuación, se convierte en una solución acuosa ácida de baja conductividad utilizando ácido clorhídrico al 20%, seguido de la adición de la muestra de ADN. La muestra que contiene BSA así tratada se ajusta con una solución acuosa de Tris 1,0 M al siguiente nivel de pH (pH = 4,9 o 7,5) y a continuación, se filtra a través de un filtro AC de 0,22 pm. Posteriormente, se realiza el ensayo de ADN tanto en fracciones filtradas como sin filtrar. Este examen confirma la reducción eficaz del ADN en la muestra rica en ADN que contiene BSA.
Claims (3)
1. Un método para eliminar el ADN contaminante en una muestra que contiene anticuerpos que comprende las siguientes etapas:
1) aplicar la muestra que contiene el anticuerpo a la cromatografía de afinidad sobre Proteína A, seguido de una etapa de elución que implica
i) equilibrado de la resina de Proteína A utilizando NaCl 1 M/tampón de citrato-fosfato de 10 a 100 mM a pH 7,5;
ii) cargar la muestra de anticuerpo en la resina, seguido de
iii) una primera etapa de lavado utilizando NaCl 1 M/tampón de citrato-fosfato de 10 a 100 mM de pH 7,5, y
iv) una segunda etapa de lavado utilizando tampón de citrato-fosfato de 10 a 100 mM de pH 7,5, seguido de
v) una etapa de elución utilizando HCl 2,5 mM a pH 2,6;
2) ajustar el pH del producto eluido a pH 7 con una solución de Tris 300 mM para formar partículas; y 3) eliminar las partículas resultantes,
en donde el anticuerpo es el anticuerpo humanizado anti-receptor de IL-6 hPM-1.
2. El método según la reivindicación 1, en donde las partículas se eliminan mediante filtración a través de un filtro.
3. Un método para fabricar el anticuerpo humanizado anti-receptor de IL-6 hPM-1 purificado, que comprende las etapas del método según la reivindicación 1.
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