JP2968052B2 - 微生物によるヒト血清アルブミンの製造方法 - Google Patents
微生物によるヒト血清アルブミンの製造方法Info
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトの治療に使用され
るヒト血清アルブミン(HSA)を組換えDNA技術を
使って微生物中で製造する方法に関する。1つの局面に
おいて本発明は、ヒト血清アルブミンまたはその生物学
的に活性な部分をコードしているDNA配列が有効に発
現するようにプロモーター系と機能可能に結合されてい
る微生物発現ビヒクル(ベクター)の構築方法およびそ
のように構築された発現ビヒクルに係る。もう1つ別の
局面において本発明は、上記発現ビヒクルで形質転換さ
れ、したがって上記のDNA配列を発現させる微生物に
係る。さらにもう1つ別の局面において本発明は、前記
発現の目的産物を、たとえばヒトの治療に有用な医薬組
成物の如き実用製品に変換する手段と方法に係る。本発
明の好ましい実施態様においては、成熟ヒト血清アルブ
ミンが直接産生されるように適切に配列された特定の発
現ベクターが提供される。
るヒト血清アルブミン(HSA)を組換えDNA技術を
使って微生物中で製造する方法に関する。1つの局面に
おいて本発明は、ヒト血清アルブミンまたはその生物学
的に活性な部分をコードしているDNA配列が有効に発
現するようにプロモーター系と機能可能に結合されてい
る微生物発現ビヒクル(ベクター)の構築方法およびそ
のように構築された発現ビヒクルに係る。もう1つ別の
局面において本発明は、上記発現ビヒクルで形質転換さ
れ、したがって上記のDNA配列を発現させる微生物に
係る。さらにもう1つ別の局面において本発明は、前記
発現の目的産物を、たとえばヒトの治療に有用な医薬組
成物の如き実用製品に変換する手段と方法に係る。本発
明の好ましい実施態様においては、成熟ヒト血清アルブ
ミンが直接産生されるように適切に配列された特定の発
現ベクターが提供される。
【0002】さらに別の一面において本発明は、ポリペ
プチドまたはその生物学的に活性な部分をコードしてい
るcDNAを調製するための新規な方法に関する。この
局面では、既知のエンドヌクレアーゼ制限部位に隣接す
る、目的とするポリペプチドのmRNAの1部分に相当
する合成プライマーDNAを利用して、逆転写によっ
て、該ポリペプチドの配列をコードしている一連のDN
Aフラグメントを得る方法と手段が提供される。これら
のフラグメントは、全体として所望のタンパク質コード
配列を表わすが、個々のフラグメントは重複するDNA
配列を含んでおり、その重複する配列内に共通のエンド
ヌクレアーゼ制限部位をもっている。このようにするこ
とにより、それぞれのフラグメントを選択的に切断(開
裂)・結合して、所望のポリペプチドをコードしている
全cDNA配列を適切な解読枠内で容易に組立てること
ができる。本発明によって、通常の逆転写酵素法および
/または化学合成によっては得ることができない高分子
量タンパク質のcDNAを得ることができる。
プチドまたはその生物学的に活性な部分をコードしてい
るcDNAを調製するための新規な方法に関する。この
局面では、既知のエンドヌクレアーゼ制限部位に隣接す
る、目的とするポリペプチドのmRNAの1部分に相当
する合成プライマーDNAを利用して、逆転写によっ
て、該ポリペプチドの配列をコードしている一連のDN
Aフラグメントを得る方法と手段が提供される。これら
のフラグメントは、全体として所望のタンパク質コード
配列を表わすが、個々のフラグメントは重複するDNA
配列を含んでおり、その重複する配列内に共通のエンド
ヌクレアーゼ制限部位をもっている。このようにするこ
とにより、それぞれのフラグメントを選択的に切断(開
裂)・結合して、所望のポリペプチドをコードしている
全cDNA配列を適切な解読枠内で容易に組立てること
ができる。本発明によって、通常の逆転写酵素法および
/または化学合成によっては得ることができない高分子
量タンパク質のcDNAを得ることができる。
【0003】本発明のバックグラウンドを明らかにする
ために、そしてある場合には、実施に関する詳細を提供
するために、参考文献を本明細書の末尾に一括して挙
げ、個々の文献に番号を付して読者の参考に供した。以
下の記載において、()中の数字は文献番号を表わすも
のとする。
ために、そしてある場合には、実施に関する詳細を提供
するために、参考文献を本明細書の末尾に一括して挙
げ、個々の文献に番号を付して読者の参考に供した。以
下の記載において、()中の数字は文献番号を表わすも
のとする。
【0004】
(A)ヒト血清アルブミン
ヒト血清アルブミン(HSA)は、成人の血清中に存在
する主要なタンパク質である。これは肝臓で生産され、
血流中で正常な浸透圧を維持する役目を果たしており、
また種々の血清分子を運搬する担体としての機能をもっ
ている(文献1、2)。胎児においてはHSAに対応し
てα−フェトプロテインがあり、これらの比較実験が、
ラットの血清アルブミンとα−フェトプロテインの比較
実験と同様に行なわれている(文献3〜8)。HSAの
完全なタンパク質配列は既に公表されている(文献9〜
12)。この発表されているHSAのタンパク質配列
は、約20残基が一致しておらず、成熟タンパク質のア
ミノ酸総数も異なっている[アミノ酸数584(文献
9)、585(文献12)]。ある研究によると、HS
Aは初め「プレプロ」(prepro)配列を含む前駆
体分子として合成される(文献13、14)。さらに、
牛(文献15)とラット(文献16)の血清アルブミン
の前駆体は配列も決定されている。
する主要なタンパク質である。これは肝臓で生産され、
血流中で正常な浸透圧を維持する役目を果たしており、
また種々の血清分子を運搬する担体としての機能をもっ
ている(文献1、2)。胎児においてはHSAに対応し
てα−フェトプロテインがあり、これらの比較実験が、
ラットの血清アルブミンとα−フェトプロテインの比較
実験と同様に行なわれている(文献3〜8)。HSAの
完全なタンパク質配列は既に公表されている(文献9〜
12)。この発表されているHSAのタンパク質配列
は、約20残基が一致しておらず、成熟タンパク質のア
ミノ酸総数も異なっている[アミノ酸数584(文献
9)、585(文献12)]。ある研究によると、HS
Aは初め「プレプロ」(prepro)配列を含む前駆
体分子として合成される(文献13、14)。さらに、
牛(文献15)とラット(文献16)の血清アルブミン
の前駆体は配列も決定されている。
【0005】医療にアルブミンを利用し得る根拠は、血
液量不足(症)、低タンパク血症およびショックを処置
できる点にある。現在アルブミンは、毛細管の細孔を通
過し得ない溶質(コロイド)によって起こる血漿コロイ
ド浸透圧を改善するのに使用されている。アルブミンは
透過率が低いので基本的に血管内に留まっている。細胞
膜をはさむ両側において非拡散性粒子の濃度が異なって
いると、その両側の粒子の濃度が等しくなるまで隔膜を
通して水が移行する。この浸透現象過程において、アル
ブミンは血中の液体含量を維持する上で重要な働きをす
る。従って、アルブミンを投与する基本的な治療上の意
義は、外科手術、ショック、火傷、浮腫を起こす低タン
パク血症の場合のように、血管からの液体の損失がある
ような状態を処置する点に存する。アルブミンはまた、
診断にも利用することができ、他のタンパク質と非特異
的に結合し得る能力を有するが故に種々の診断溶液に使
用することができる。
液量不足(症)、低タンパク血症およびショックを処置
できる点にある。現在アルブミンは、毛細管の細孔を通
過し得ない溶質(コロイド)によって起こる血漿コロイ
ド浸透圧を改善するのに使用されている。アルブミンは
透過率が低いので基本的に血管内に留まっている。細胞
膜をはさむ両側において非拡散性粒子の濃度が異なって
いると、その両側の粒子の濃度が等しくなるまで隔膜を
通して水が移行する。この浸透現象過程において、アル
ブミンは血中の液体含量を維持する上で重要な働きをす
る。従って、アルブミンを投与する基本的な治療上の意
義は、外科手術、ショック、火傷、浮腫を起こす低タン
パク血症の場合のように、血管からの液体の損失がある
ような状態を処置する点に存する。アルブミンはまた、
診断にも利用することができ、他のタンパク質と非特異
的に結合し得る能力を有するが故に種々の診断溶液に使
用することができる。
【0006】現在、ヒト血清アルブミンは全血の分画に
よって生産されており、合理的な価格で多量に得ること
はできない。組換えDNA技術を応用すると、ヒト血清
アルブミンを効率よく生産するように遺伝子操作した微
生物を使って、該アルブミンを豊富に生産することが可
能になる。本発明は組換えDNA技術により、従来より
も廉価にかつ多量に、純粋なHSAを生産することを可
能にしたものである。本発明はまた、ヒト血清アルブミ
ンのDNA配列構造およびそれから演繹されるアミノ酸
配列についての知見を提供するものであり、これはヒト
血清アルブミンおよびそれに関連するタンパク質、たと
えばα−フェトプロテインの進化論的性質、調節作用お
よび機能的性質を解明するのに役立つものである。
よって生産されており、合理的な価格で多量に得ること
はできない。組換えDNA技術を応用すると、ヒト血清
アルブミンを効率よく生産するように遺伝子操作した微
生物を使って、該アルブミンを豊富に生産することが可
能になる。本発明は組換えDNA技術により、従来より
も廉価にかつ多量に、純粋なHSAを生産することを可
能にしたものである。本発明はまた、ヒト血清アルブミ
ンのDNA配列構造およびそれから演繹されるアミノ酸
配列についての知見を提供するものであり、これはヒト
血清アルブミンおよびそれに関連するタンパク質、たと
えばα−フェトプロテインの進化論的性質、調節作用お
よび機能的性質を解明するのに役立つものである。
【0007】さらに詳細には、本発明によって、HSA
mRNAのタンパク質コード部分と3’非翻訳部分の
全配列を含むcDNAクローンが単離される。これらの
cDNAクローンを使用して、微生物株中でtrpプロ
モーターの制御下に成熟HSAタンパク質を発現させる
ための組換え発現ビヒクルを構築した。本発明はまた、
HSAの完全なヌクレオチド配列(DNA配列)および
その推定アミノ酸配列を開示する。
mRNAのタンパク質コード部分と3’非翻訳部分の
全配列を含むcDNAクローンが単離される。これらの
cDNAクローンを使用して、微生物株中でtrpプロ
モーターの制御下に成熟HSAタンパク質を発現させる
ための組換え発現ビヒクルを構築した。本発明はまた、
HSAの完全なヌクレオチド配列(DNA配列)および
その推定アミノ酸配列を開示する。
【0008】本明細書において、「成熟ヒト血清アルブ
ミン」の発現とは、ヒト血清アルブミンmRNAの翻訳
直後には付随しているプレ配列(プレプロ)を伴なって
いないヒト血清アルブミンを微生物により生産すること
をいう。本発明によれば、成熟ヒト血清アルブミンは翻
訳開始信号(ATG)(これはまた、アルブミンの最初
のアミノ酸に結合しているアミノ酸のメチオニンをコー
ドしている)から直接発現される。このメチオニンは微
生物によって自然に切断され、その結果ヒト血清アルブ
ミンが直接得られる。また、成熟ヒト血清アルブミン
は、通常のリーダー以外のタンパク質と共に発現させる
ことができ、この融合タンパク質部分は細胞内または細
胞外で特異的に切断することができる(英国特許公開第
2007676 A号参照)。最後に、成熟ヒト血清アルブミン
は微生物のシグナルポリペプチドと結合させて生産する
こともでき、このシグナルポリペプチドはその融合体を
細胞壁に輸送し、そこでこのシグナルはプロセッシング
を受けて取り除かれ、成熟ヒト血清アルブミンが分泌さ
れる。
ミン」の発現とは、ヒト血清アルブミンmRNAの翻訳
直後には付随しているプレ配列(プレプロ)を伴なって
いないヒト血清アルブミンを微生物により生産すること
をいう。本発明によれば、成熟ヒト血清アルブミンは翻
訳開始信号(ATG)(これはまた、アルブミンの最初
のアミノ酸に結合しているアミノ酸のメチオニンをコー
ドしている)から直接発現される。このメチオニンは微
生物によって自然に切断され、その結果ヒト血清アルブ
ミンが直接得られる。また、成熟ヒト血清アルブミン
は、通常のリーダー以外のタンパク質と共に発現させる
ことができ、この融合タンパク質部分は細胞内または細
胞外で特異的に切断することができる(英国特許公開第
2007676 A号参照)。最後に、成熟ヒト血清アルブミン
は微生物のシグナルポリペプチドと結合させて生産する
こともでき、このシグナルポリペプチドはその融合体を
細胞壁に輸送し、そこでこのシグナルはプロセッシング
を受けて取り除かれ、成熟ヒト血清アルブミンが分泌さ
れる。
【0009】(B)組換えDNA技術
組換えDNA技術の出現によって、多種多様な有用ポリ
ペプチドの微生物による調整された生産が可能となっ
た。多くの哺乳動物ポリペプチド、たとえばヒト成長ホ
ルモンやヒトおよびハイブリッド白血球インターフェロ
ンが既に種々の微生物により生産されている。この技術
によって種々の有用なポリペプチドの微生物による生産
が可能となり、種々の薬物を標的に向かわしめる応用
(drug-targeting application)に有用なワクチン、ホ
ルモン、酵素および抗体を微生物に生産させることがで
きるようになった。
ペプチドの微生物による調整された生産が可能となっ
た。多くの哺乳動物ポリペプチド、たとえばヒト成長ホ
ルモンやヒトおよびハイブリッド白血球インターフェロ
ンが既に種々の微生物により生産されている。この技術
によって種々の有用なポリペプチドの微生物による生産
が可能となり、種々の薬物を標的に向かわしめる応用
(drug-targeting application)に有用なワクチン、ホ
ルモン、酵素および抗体を微生物に生産させることがで
きるようになった。
【0010】組換えDNA技術の基本的な要素はプラス
ミド、すなわち、細菌中にしばしば細胞当たり複数個存
在する2本鎖DNAの染色体外ループである。このプラ
スミドDNAにコードされている情報には、このプラス
ミドを娘細胞中で再生するのに必要となる情報(すなわ
ちレプリコンまたは複製起点)および通常、1種または
それ以上の表現型選択特性、たとえば所望のプラスミド
を含有している宿主細胞のクローンを選択培地中で認識
して優先的に成長させるのに役立つ抗生物質耐性、が含
まれている。細菌プラスミドを使用することの利点は、
これらが種々の制限エンドヌクレアーゼ、すなわち「制
限酵素」で特異的に開裂することができることであり、
それぞれの制限酵素はプラスミドDNA上の別々の位置
を認識する。次いで異種の遺伝子または遺伝子フラグメ
ントを、開裂部位またはこれに隣接する改造末端で、端
と端とをつなぎ合せることによりこのプラスミドに挿入
することができる(ここで「異種(外来性)」という用
語は、問題にしている微生物には通常存在しない遺伝子
またはその微生物によって通常は産生されないポリペプ
チド配列を表わすのに使用し、一方、「同種」という用
語は、対応する野性株の微生物中に存在する遺伝子、あ
るいはそれによって産生されるポリペプチドを表わすの
に使用するものとする)。このようにして、いわゆる複
製可能な発現ビヒクルが形成される。
ミド、すなわち、細菌中にしばしば細胞当たり複数個存
在する2本鎖DNAの染色体外ループである。このプラ
スミドDNAにコードされている情報には、このプラス
ミドを娘細胞中で再生するのに必要となる情報(すなわ
ちレプリコンまたは複製起点)および通常、1種または
それ以上の表現型選択特性、たとえば所望のプラスミド
を含有している宿主細胞のクローンを選択培地中で認識
して優先的に成長させるのに役立つ抗生物質耐性、が含
まれている。細菌プラスミドを使用することの利点は、
これらが種々の制限エンドヌクレアーゼ、すなわち「制
限酵素」で特異的に開裂することができることであり、
それぞれの制限酵素はプラスミドDNA上の別々の位置
を認識する。次いで異種の遺伝子または遺伝子フラグメ
ントを、開裂部位またはこれに隣接する改造末端で、端
と端とをつなぎ合せることによりこのプラスミドに挿入
することができる(ここで「異種(外来性)」という用
語は、問題にしている微生物には通常存在しない遺伝子
またはその微生物によって通常は産生されないポリペプ
チド配列を表わすのに使用し、一方、「同種」という用
語は、対応する野性株の微生物中に存在する遺伝子、あ
るいはそれによって産生されるポリペプチドを表わすの
に使用するものとする)。このようにして、いわゆる複
製可能な発現ビヒクルが形成される。
【0011】DNAの組換えは微生物の外で行ない、得
られた複製可能な「組換え」発現ビヒクル(またはプラ
スミド)は、形質転換として知られている工程によって
微生物に挿入することができ、そしてこの形質転換体を
増殖させることによって異種遺伝子をもった組換えビヒ
クルを多量に得ることができる。さらに、プラスミド中
でコードされているDNAの情報の転写と翻訳を支配し
ている部分に関して適切な位置にこの遺伝子を挿入する
と、得られる発現ビヒクルは、その挿入された遺伝子が
コードしているポリペプチド配列を実際に生産するのに
使用することができる。この過程を発現という。
られた複製可能な「組換え」発現ビヒクル(またはプラ
スミド)は、形質転換として知られている工程によって
微生物に挿入することができ、そしてこの形質転換体を
増殖させることによって異種遺伝子をもった組換えビヒ
クルを多量に得ることができる。さらに、プラスミド中
でコードされているDNAの情報の転写と翻訳を支配し
ている部分に関して適切な位置にこの遺伝子を挿入する
と、得られる発現ビヒクルは、その挿入された遺伝子が
コードしているポリペプチド配列を実際に生産するのに
使用することができる。この過程を発現という。
【0012】発現はプロモーターとして知られているD
NA領域で始まる。発現の転写段階ではDNAが巻きも
どされ、DNAの意味のあるコード鎖が、全DNA配列
の5′末端から3′末端へ向かってメッセンジャーRN
Aが合成されるときの鋳型として露出される。次にメッ
センジャーRNAがリボゾームに結合し、ここでこのメ
ッセンジャーRNAはDNAがコードしているアミノ酸
配列をもったポリペプチド鎖に翻訳される。各アミノ酸
は3個のヌクレオチド、すなわち「コドン」によってコ
ードされている。このコドンは全体で「構造遺伝子」、
すなわちDNA配列の中で発現されるポリペプチド産物
のアミノ酸配列をコードしている部分を構成している。
NA領域で始まる。発現の転写段階ではDNAが巻きも
どされ、DNAの意味のあるコード鎖が、全DNA配列
の5′末端から3′末端へ向かってメッセンジャーRN
Aが合成されるときの鋳型として露出される。次にメッ
センジャーRNAがリボゾームに結合し、ここでこのメ
ッセンジャーRNAはDNAがコードしているアミノ酸
配列をもったポリペプチド鎖に翻訳される。各アミノ酸
は3個のヌクレオチド、すなわち「コドン」によってコ
ードされている。このコドンは全体で「構造遺伝子」、
すなわちDNA配列の中で発現されるポリペプチド産物
のアミノ酸配列をコードしている部分を構成している。
【0013】翻訳は「開始」信号(通常はATG、これ
は得られるメッセンジャーRNAではAUGとなる)で
始まる。いわゆる停止コドン−これは構造遺伝子の最
後に転写される−は翻訳の終了、従ってそれ以上のア
ミノ酸単位の生産の停止を指令する。生成した産物は、
宿主細胞を溶解し、適当な方法で他のタンパク質から精
製・単離することにより回収することができる。
は得られるメッセンジャーRNAではAUGとなる)で
始まる。いわゆる停止コドン−これは構造遺伝子の最
後に転写される−は翻訳の終了、従ってそれ以上のア
ミノ酸単位の生産の停止を指令する。生成した産物は、
宿主細胞を溶解し、適当な方法で他のタンパク質から精
製・単離することにより回収することができる。
【0014】実際、組換えDNA技術を使うと、全体が
異種のポリペプチドを発現させることができ(いわゆる
直接発現)、あるいはまた同種ポリペプチドのアミノ酸
配列の一部と融合した異種ポリペプチドを発現させるこ
ともできる。後者の場合、所望の生物活性産物は、細胞
外の環境で開裂されるまで、この融合した同種/異種ポ
リペプチドの中で不活性化されている(Wetzel, Americ
an Scientist, 6 8, 664 (1980)参照)。
異種のポリペプチドを発現させることができ(いわゆる
直接発現)、あるいはまた同種ポリペプチドのアミノ酸
配列の一部と融合した異種ポリペプチドを発現させるこ
ともできる。後者の場合、所望の生物活性産物は、細胞
外の環境で開裂されるまで、この融合した同種/異種ポ
リペプチドの中で不活性化されている(Wetzel, Americ
an Scientist, 6 8, 664 (1980)参照)。
【0015】組換えDNA技術が完全にその期待を裏切
らないものであるとしても、所望のポリペプチド産物が
コントロールされた環境のもとで、しかも高収率で得ら
れるように、挿入された遺伝子の発現が最適となるよう
な系を工夫しなければならない。
らないものであるとしても、所望のポリペプチド産物が
コントロールされた環境のもとで、しかも高収率で得ら
れるように、挿入された遺伝子の発現が最適となるよう
な系を工夫しなければならない。
【0016】(C)技術の現況
Sargent らは、一連の組換えDNAプラスミドとして、
ラット血清アルブミンのメッセンジャーRNAのクロー
ニングについて記載している(Proc.Natl.Acad.Sci.(US
A), 78, 243 (1981)参照)。これはこのタンパク質産物
の進化仮説を研究するために、クローンのヌクレオチド
配列を決定しようとして行なわれた。すなわち、彼等は
調製したcDNAフラグメントを組立ててみるようなこ
とはしなかったのである。
ラット血清アルブミンのメッセンジャーRNAのクロー
ニングについて記載している(Proc.Natl.Acad.Sci.(US
A), 78, 243 (1981)参照)。これはこのタンパク質産物
の進化仮説を研究するために、クローンのヌクレオチド
配列を決定しようとして行なわれた。すなわち、彼等は
調製したcDNAフラグメントを組立ててみるようなこ
とはしなかったのである。
【0017】一方、Dugaiczyk らはヒト血清アルブミン
のヒト遺伝子についての研究を要約して発表している
(Journal of Supramolecular Structure and Cellular
Biochemistry. Supplement 5, 1981, Alan R. Liss, I
nc. NY. 参照)。彼等はcDNAフラグメントを得た
が、α−フェトプロテインおよび血清アルブミン遺伝子
の基礎的な分子生物学を研究する目的以外には、このフ
ラグメントをクローニングしたり生産したりした形跡が
ない。
のヒト遺伝子についての研究を要約して発表している
(Journal of Supramolecular Structure and Cellular
Biochemistry. Supplement 5, 1981, Alan R. Liss, I
nc. NY. 参照)。彼等はcDNAフラグメントを得た
が、α−フェトプロテインおよび血清アルブミン遺伝子
の基礎的な分子生物学を研究する目的以外には、このフ
ラグメントをクローニングしたり生産したりした形跡が
ない。
【0018】
【発明の概要】本発明は、組換えDNA技術を使ってヒ
ト血清アルブミンを直接形態で好都合に効率よく生産す
ることができることを見い出した事実に基くものであ
る。この生産物は、アルブミンの補給が必要な場合のヒ
トの治療に使用するのに好適である。この生産物は遺伝
子操作をほどこした微生物によって生産されるので、現
在の血液の分画技術による生産よりもずっと効率よくH
SAを製造し、単離することが可能である。本発明の重
要性は、約2000塩基以上のmRNA転写体に相当す
る非常に長いタンパク質−アミノ酸584個−を生
産するように微生物を遺伝子操作することに成功した点
にある。
ト血清アルブミンを直接形態で好都合に効率よく生産す
ることができることを見い出した事実に基くものであ
る。この生産物は、アルブミンの補給が必要な場合のヒ
トの治療に使用するのに好適である。この生産物は遺伝
子操作をほどこした微生物によって生産されるので、現
在の血液の分画技術による生産よりもずっと効率よくH
SAを製造し、単離することが可能である。本発明の重
要性は、約2000塩基以上のmRNA転写体に相当す
る非常に長いタンパク質−アミノ酸584個−を生
産するように微生物を遺伝子操作することに成功した点
にある。
【0019】本発明の目的は上記のようにして生産され
るヒト血清アルブミンならびにその生産の手段および方
法を提供することにある。さらに本発明の目的は、直接
発現できる形態でHSAをコードしている遺伝子配列を
有する複製可能なDNA発現ビヒクルを提供することに
ある。さらに本発明のもう1つの目的は、上記の発現ビ
ヒクルで形質転換した微生物株およびHSAを産生する
ことができる該形質転換株の微生物培養物を提供するこ
とにある。また、本発明は、上記のHSA遺伝子配列、
DNA発現ビヒクル、微生物株および培養物を調製する
のに有用な種々の方法、ならびにその特定具体例を提供
する。さらに本発明は、別の態様において、共通の制限
エンドヌクレアーゼ部位をコードしている領域において
重複している個々のcDNAフラグメントを調製し得る
ように、既知の制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接する
領域に相当する配列をもった合成DNAプライマー配列
を利用して、微生物宿主にとって異種のポリペプチド、
たとえばヒト血清アルブミンをコードしているcDNA
配列を調製する方法を提供するものである。この態様に
よると、前記フラグメントを正確に切断・連結して、所
望のポリペプチドを適切にコードするDNA配列を調製
することができる。
るヒト血清アルブミンならびにその生産の手段および方
法を提供することにある。さらに本発明の目的は、直接
発現できる形態でHSAをコードしている遺伝子配列を
有する複製可能なDNA発現ビヒクルを提供することに
ある。さらに本発明のもう1つの目的は、上記の発現ビ
ヒクルで形質転換した微生物株およびHSAを産生する
ことができる該形質転換株の微生物培養物を提供するこ
とにある。また、本発明は、上記のHSA遺伝子配列、
DNA発現ビヒクル、微生物株および培養物を調製する
のに有用な種々の方法、ならびにその特定具体例を提供
する。さらに本発明は、別の態様において、共通の制限
エンドヌクレアーゼ部位をコードしている領域において
重複している個々のcDNAフラグメントを調製し得る
ように、既知の制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接する
領域に相当する配列をもった合成DNAプライマー配列
を利用して、微生物宿主にとって異種のポリペプチド、
たとえばヒト血清アルブミンをコードしているcDNA
配列を調製する方法を提供するものである。この態様に
よると、前記フラグメントを正確に切断・連結して、所
望のポリペプチドを適切にコードするDNA配列を調製
することができる。
【0020】特に、本発明はヒト血清アルブミンをコー
ドしている下記ヌクレオチド配列から実質的に成る単離
されたDNA配列を提供する。
ドしている下記ヌクレオチド配列から実質的に成る単離
されたDNA配列を提供する。
【0021】
GAT GCA CAC AAG AGT GAG GTT GCT CAT CGG TTT AAA GAT TTG GGA GAA GAA AAT
TTC AAA GCC TTG GTG TTG ATT GCC TTT GCT CAG TAT CTT CAG CAG TGT CCA TTT
GAA GAT CAT GTA AAA TTA GTG AAT GAA GTA ACT GAA TTT GCA AAA ACA TGT GTA
GCT GAT GAG TCA GCT GAA AAT TGT GAC AAA TCA CTT CAT ACC CTT TTT GGA GAC
AAA TTA TGC ACA GTT GCA ACT CTT CGT GAA ACC TAT GGT GAA ATG GCT GAC TGC
TGT GCA AAA CAA GAA CCT GAG AGA AAT GAA TGC TTC TTG CAA CAC AAA GAT GAC
AAC CCA AAC CTC CCC CGA TTG GTG AGA CCA GAG GTT GAT GTG ATG TGC ACT GCT
TTT CAT GAC AAT GAA GAG ACA TTT TTG AAA AAA TAC TTA TAT GAA ATT GCC AGA
AGA CAT CCT TAC TTT TAT GCC CCG GAA CTC CTT TTC TTT GCT AAA AGG TAT AAA
GCT GCT TTT ACA GAA TGT TGC CAA GCT GCT GAT AAA GCT GCC TGC CTG TTG CCA
AAG CTC GAT GAA CTT CGG GAT GAA GGG AAG GCT TCG TCT GCC AAA CAG AGA CTC
AAA TGT GCC AGT CTC CAA AAA TTT GGA GAA AGA GCT TTC AAA GCA TGG GCA GTG
GCT CGC CTG AGC CAG AGA TTT CCC AAA GCT GAG TTT GCA GAA GTT TCC AAG TTA
GTG ACA GAT CTT ACC AAA GTC CAC ACG GAA TGC TGC CAT GGA GAT CTG CTT GAA
TGT GCT GAT GAC AGG GCG GAC CTT GCC AAG TAT ATC TGT GAA AAT CAG GAT TCG
ATC TCC AGT AAA CTG AAG GAA TGC TGT GAA AAA CCT CTG TTG GAA AAA TCC CAC
TGC ATT GCC GAA GTG GAA AAT GAT GAG ATG CCT GCT GAC TTG CCT TCA TTA GCT
GCT GAT TTT GTT GAA AGT AAG GAT GTT TGC AAA AAC TAT GCT GAG GCA AAG GAT
GTC TTC CTG GGC ATG TTT TTG TAT GAA TAT GCA AGA AGG CAT CCT GAT TAC TCT
GTC GTG CTG CTG CTG AGA CTT GCC AAG ACA TAT GAA ACC ACT CTA GAG AAG TGC
TGT GCC GCT GCA GAT CCT CAT GAA TGC TAT GCC AAA GTG TTC GAT GAA TTT AAA
CCT CTT GTG GAA GAG CCT CAG AAT TTA ATC AAA CAA AAC TGT GAG CTT TTT AAG
CAG CTT GGA GAG TAC AAA TTC CAG AAT GCG CTA TTA GTT CGT TAC ACC AAG AAA
GTA CCC CAA GTG TCA ACT CCA ACT CTT GTA GAG GTC TCA AGA AAC CTA GGA AAA
GTG GGC AGC AAA TGT TGT AAA CAT CCT GAA GCA AAA AGA ATG CCC TGT GCA GAA
GAC TAT CTA TCC GTG GTC CTG AAC CAG TTA TGT GTG TTG CAT GAG AAA ACG CCA
GTA AGT GAC AGA GTC ACA AAA TGC TGC ACA GAG TCC TTG GTG AAC AGG CGA CCA
TGC TTT TCA GCT CTG GAA GTC GAT GAA ACA TAC GTT CCC AAA GAG TTT AAT GCT
GAA ACA TTC ACC TTC CAT GCA GAT ATA TGC ACA CTT TCT GAG AAG GAG AGA CAA
ATC AAG AAA CAA ACT GCA CTT GTT GAG CTT GTG AAA CAC AAG CCC AAG GCA ACA
AAA GAG CAA CTG AAA GCT GTT ATG GAT GAT TTC GCA GCT TTT GTA GAG AAG TGC
TGC AAG GCT GAC GAT AAG GAG ACC TGC TTT GCC GAG GAG GGT AAA AAA CTT GTT
GCT GCA AGT CAA GCT GCC TTA GGC TTA 。
【0022】本発明においては、上記ヌクレオチド配列
の均等物、即ち上記ヌクレオチド配列にヌクレオチド又
はヌクレオチド配列の置換、欠失又は付加を含有するヌ
クレオチド配列であって、上記ヌクレオチド配列によっ
てコードされる生物活性と同じ生物活性を有するポリペ
プチドをコードする当該ヌクレオチド配列も包含され
る。
の均等物、即ち上記ヌクレオチド配列にヌクレオチド又
はヌクレオチド配列の置換、欠失又は付加を含有するヌ
クレオチド配列であって、上記ヌクレオチド配列によっ
てコードされる生物活性と同じ生物活性を有するポリペ
プチドをコードする当該ヌクレオチド配列も包含され
る。
【0023】さらに、本発明は、形質転換された微生物
中で前記ヌクレオチド配列からなるDNA配列を発現す
ることができる複製可能な微生物用発現ビヒクル、この
微生物用発現ビヒクルで形質転換された微生物、さら
に、前記ヌクレオチド配列から実質的に成るDNAを含
むベクターを構築し、このベクターで宿主細胞を形質転
換し、形質転換された細胞を培養し、前記ヒト血清アル
ブミンを回収することからなるヒト血清アルブミンの製
造方法も提供する。
中で前記ヌクレオチド配列からなるDNA配列を発現す
ることができる複製可能な微生物用発現ビヒクル、この
微生物用発現ビヒクルで形質転換された微生物、さら
に、前記ヌクレオチド配列から実質的に成るDNAを含
むベクターを構築し、このベクターで宿主細胞を形質転
換し、形質転換された細胞を培養し、前記ヒト血清アル
ブミンを回収することからなるヒト血清アルブミンの製
造方法も提供する。
【0024】
【好ましい実施態様の説明】本明細書においては、宿主
として用いられる微生物にとって異種である代表的なポ
リペプチドとしてヒト血清アルブミン(HSA)の発現
について記載する。同様に、ここでは、英国特許出願公
開第2055382 A号に記載されている微生物E.coli
K−12株294(end A,thi- ,hsr- , k
hsm+ )を使用した。この菌株はAmerican Type Cult
ure CollectionにATCC寄託番号No.31446 で寄託
されている。
として用いられる微生物にとって異種である代表的なポ
リペプチドとしてヒト血清アルブミン(HSA)の発現
について記載する。同様に、ここでは、英国特許出願公
開第2055382 A号に記載されている微生物E.coli
K−12株294(end A,thi- ,hsr- , k
hsm+ )を使用した。この菌株はAmerican Type Cult
ure CollectionにATCC寄託番号No.31446 で寄託
されている。
【0025】本発明の最も好ましい実施態様において
は、上記のE.coli K−12株294だけでなく
その他の既知のE.co li株、たとえばE.coli
B、E.coli χ 1776および E.col
i W 3110も含めたE.coli、またはその他
の微生物株について本発明を説明する。これらの菌株の
多くは公認の微生物寄託機関、たとえば American Type
Culture Collection (ATCC)に寄託され、そこから分
譲が可能である(ATCCカタログ参照、さらに***特
許公開第2644432号公報参照)。これらのその他
の微生物としては、たとえば枯草菌(Bacillus subtili
s )などの桿菌類(Bacilli )、およびその他の腸内細
菌、たとえばねずみチフス菌(Salmonella typhimuriu
m)および霊菌(Serratia marcesans)などを挙げるこ
とができる。この場合、異種の遺伝子配列をそれぞれの
菌体内で複製し、発現し得るプラスミドを利用する。酵
母、たとえば Saccharomyces cerevisiae も、インター
フェロンタンパク質をコードしている遺伝子を酵母プロ
モーターの制御下で発現させることによって該タンパク
質を生産するための宿主微生物として好適に使用するこ
とができる(Hitzemanらによる同時係属中の米国特許出
願、譲受人:ジェネンテック社ら、出願日:1981年2月
25日、代理人名簿番号:100/43参照。ここで引
用したことによってその開示内容は本明細書中に含まれ
るものとする)。
は、上記のE.coli K−12株294だけでなく
その他の既知のE.co li株、たとえばE.coli
B、E.coli χ 1776および E.col
i W 3110も含めたE.coli、またはその他
の微生物株について本発明を説明する。これらの菌株の
多くは公認の微生物寄託機関、たとえば American Type
Culture Collection (ATCC)に寄託され、そこから分
譲が可能である(ATCCカタログ参照、さらに***特
許公開第2644432号公報参照)。これらのその他
の微生物としては、たとえば枯草菌(Bacillus subtili
s )などの桿菌類(Bacilli )、およびその他の腸内細
菌、たとえばねずみチフス菌(Salmonella typhimuriu
m)および霊菌(Serratia marcesans)などを挙げるこ
とができる。この場合、異種の遺伝子配列をそれぞれの
菌体内で複製し、発現し得るプラスミドを利用する。酵
母、たとえば Saccharomyces cerevisiae も、インター
フェロンタンパク質をコードしている遺伝子を酵母プロ
モーターの制御下で発現させることによって該タンパク
質を生産するための宿主微生物として好適に使用するこ
とができる(Hitzemanらによる同時係属中の米国特許出
願、譲受人:ジェネンテック社ら、出願日:1981年2月
25日、代理人名簿番号:100/43参照。ここで引
用したことによってその開示内容は本明細書中に含まれ
るものとする)。
【0026】
【図面の説明】第1図はプラスミドpHSA1の構造を
示している。
示している。
【0027】(A) 1番上の線はヒト血清アルブミン
タンパク質をコードしているmRNAを表わしており、
その下は後に詳述するcDNAクローンF−47、F−
61およびB−44に含まれる領域を示している。成熟
HSA mRNAの最初と最後のアミノ酸コドンは、円
で囲った1および585でそれぞれ示してある。pHS
A1の構造中に含まれる制限エンドヌクレアーゼ部位は
垂直の線で示してある。この図にはヌクレオチドのおお
よその寸法目盛も示してある。
タンパク質をコードしているmRNAを表わしており、
その下は後に詳述するcDNAクローンF−47、F−
61およびB−44に含まれる領域を示している。成熟
HSA mRNAの最初と最後のアミノ酸コドンは、円
で囲った1および585でそれぞれ示してある。pHS
A1の構造中に含まれる制限エンドヌクレアーゼ部位は
垂直の線で示してある。この図にはヌクレオチドのおお
よその寸法目盛も示してある。
【0028】(B) 完成したプラスミドpHSA1を
示す。図(A)のcDANクローンから導かれたHSA
コード領域は図(A)に対応させて示してある。選択さ
れた制限部位ならびに末端コドン番号1および585も
図(A)と同様に示した。E.coli trpプロモ
ーター/オペレーター領域は、その転写の方向を示す矢
印で示してある。G:CはオリゴdG:dCテールを示
している。左端のXbaI部位および開始コドンATG
は合成により付加した。pHSA1のpBR322由来
部分のテトラサイクリン(Tc)およびアンピシリン
(Ap)耐性遺伝子は太線で示してある。
示す。図(A)のcDANクローンから導かれたHSA
コード領域は図(A)に対応させて示してある。選択さ
れた制限部位ならびに末端コドン番号1および585も
図(A)と同様に示した。E.coli trpプロモ
ーター/オペレーター領域は、その転写の方向を示す矢
印で示してある。G:CはオリゴdG:dCテールを示
している。左端のXbaI部位および開始コドンATG
は合成により付加した。pHSA1のpBR322由来
部分のテトラサイクリン(Tc)およびアンピシリン
(Ap)耐性遺伝子は太線で示してある。
【0029】第2図は細菌により合成されたHSAの免
疫沈降の結果を示している。
疫沈降の結果を示している。
【0030】アルブミン発現プラスミドpHSA1で形
質転換したE.coli細胞(レーン4および5)また
は対照プラスミドpLeIFA25(同じ発現ビヒクル
中にインターフェロンα遺伝子を含有している)で形質
転換したE.coli細胞(レーン2、3および7)を
35S−メチオニン添加培地中で増殖させた。レーン2、
4および7の試料は、トリプトファンを含まないM9培
地でtrpプロモーターによる発現を誘発した。レーン
3および5の試料は、trpプロモーターを抑制するた
めにトリプトファン含有LBブロス中で増殖させた。こ
こに挙げたSDS−ポリアクリルアミドゲルのオートラ
ジオグラフの各試料レーンは、密度A550 =1の細胞
0.75mlから免疫沈降した標識タンパク質を含んでい
る。レーン1および6は放射活性タンパク質標準品(B
RL)を含んでおり、その分子量が左側にキロダルトン
で示してある。細菌によって合成されたHSA(レーン
4)は、68,000ダルトンの14C−標準牛血清アルブミン
標品と共に移動する。pHSA1の抑制培養に対して誘
発培養で血清アルブミンの生産が増大していることは、
富化培地に対する最少培地の35S−メチオニンプール比
活性の違いよりも、プラスミドにコードされているタン
パク質の合成レベルが高いことを示している(データは
示されていない)。60,000ダルトンのシャープなバンド
は明らかに加工品である。このバンドは誘発pHSA1
および抑制pHSA1の両者ならびに対照形質転換体で
みられ、プレイミュン(preimmune )(レーン7)およ
び抗−HSA IgG(レーン2〜5)に結合する。レ
ーン4の47,000ダルトンにみられる小さいバンドは、明
らかにプラスミドにコードされているものであり、早め
に終了した細菌合成HSAを表わしているかもしれな
い。
質転換したE.coli細胞(レーン4および5)また
は対照プラスミドpLeIFA25(同じ発現ビヒクル
中にインターフェロンα遺伝子を含有している)で形質
転換したE.coli細胞(レーン2、3および7)を
35S−メチオニン添加培地中で増殖させた。レーン2、
4および7の試料は、トリプトファンを含まないM9培
地でtrpプロモーターによる発現を誘発した。レーン
3および5の試料は、trpプロモーターを抑制するた
めにトリプトファン含有LBブロス中で増殖させた。こ
こに挙げたSDS−ポリアクリルアミドゲルのオートラ
ジオグラフの各試料レーンは、密度A550 =1の細胞
0.75mlから免疫沈降した標識タンパク質を含んでい
る。レーン1および6は放射活性タンパク質標準品(B
RL)を含んでおり、その分子量が左側にキロダルトン
で示してある。細菌によって合成されたHSA(レーン
4)は、68,000ダルトンの14C−標準牛血清アルブミン
標品と共に移動する。pHSA1の抑制培養に対して誘
発培養で血清アルブミンの生産が増大していることは、
富化培地に対する最少培地の35S−メチオニンプール比
活性の違いよりも、プラスミドにコードされているタン
パク質の合成レベルが高いことを示している(データは
示されていない)。60,000ダルトンのシャープなバンド
は明らかに加工品である。このバンドは誘発pHSA1
および抑制pHSA1の両者ならびに対照形質転換体で
みられ、プレイミュン(preimmune )(レーン7)およ
び抗−HSA IgG(レーン2〜5)に結合する。レ
ーン4の47,000ダルトンにみられる小さいバンドは、明
らかにプラスミドにコードされているものであり、早め
に終了した細菌合成HSAを表わしているかもしれな
い。
【0031】第3図はヒト血清アルブミンのヌクレオチ
ド配列およびアミノ酸配列を示している。
ド配列およびアミノ酸配列を示している。
【0032】HSA mRNAの成熟タンパク質コード
領域と3′非翻訳領域のDNA配列は組換えプラスミド
pHSA1から決定し、プレプロペプチドコード領域お
よび5′非翻訳領域のDNA配列はプラスミドP−14
から決定した(後述)。予想されたアミノ酸がこのDN
A配列の上に示されており、成熟タンパク質の最初の残
基から番号付けしてある。先行する24個のアミノ酸は
プレプロペプチドからなる。Dayhoff (文献9)および
Moulonら(文献12)によって報告されているHSAの
タンパク質配列と一致しない5個のアミノ酸残基には下
線を引いた。上記のヌクレオチド配列は多分、HSA
mRNAの真の5′末端まで伸びていない。アルブミン
の直接発現用プラスミドpHSA1においては、成熟タ
ンパク質コード領域の直前にE.coli trpプロ
モーター/オペレーターリーダー/ペプチドリボゾーム
結合部位(文献36、37)、人工のXbaI部位およ
び人工の開始コドンATGがあり、プレプロ領域は切り
取られている。pHSA1においてHSAの第1コドン
の前のヌクレオチドは5′−TCACGTAAAAAG
GGTATCTAGATGである。
領域と3′非翻訳領域のDNA配列は組換えプラスミド
pHSA1から決定し、プレプロペプチドコード領域お
よび5′非翻訳領域のDNA配列はプラスミドP−14
から決定した(後述)。予想されたアミノ酸がこのDN
A配列の上に示されており、成熟タンパク質の最初の残
基から番号付けしてある。先行する24個のアミノ酸は
プレプロペプチドからなる。Dayhoff (文献9)および
Moulonら(文献12)によって報告されているHSAの
タンパク質配列と一致しない5個のアミノ酸残基には下
線を引いた。上記のヌクレオチド配列は多分、HSA
mRNAの真の5′末端まで伸びていない。アルブミン
の直接発現用プラスミドpHSA1においては、成熟タ
ンパク質コード領域の直前にE.coli trpプロ
モーター/オペレーターリーダー/ペプチドリボゾーム
結合部位(文献36、37)、人工のXbaI部位およ
び人工の開始コドンATGがあり、プレプロ領域は切り
取られている。pHSA1においてHSAの第1コドン
の前のヌクレオチドは5′−TCACGTAAAAAG
GGTATCTAGATGである。
【0033】
(A)cDNAの合成およびクローニング
リボヌクレオシド−バナジル錯体法(文献17)または
グアニジニウムチオシアネート法(文献18)のいずれ
かにより、バイオプシー(生検)または死体から得たヒ
トの迅速凍結肝臓標本からポリ(A)+ RNAを調製し
た。cDNAの合成反応は、基本的に文献19に記載さ
れた方法に従い、ホスホトリエステル法(文献20)に
より製造したオリゴ−デオキシヌクレオチドまたはオリ
ゴ(dT)12-18 (Collaborative Research)のいずれ
かをプライマーとして用いて行なった。典型的なcDN
A合成反応では、25〜35μgのポリ(A)+ RNA
と40〜80pmolのオリゴヌクレオチドプライマーを5
0mMのNaCl中で5分間90°に加熱した。この反
応混合物を、最終濃度が20mMトリスHCl(pH
8.3)、20mM KCl、8mM MgCl2 、3
0mMジチオトレイット、1mMのdATP、dCT
P、dGTP、dTTP(生産物の回収を追跡するため
に32P−dCTP(Amersham)を加える)となるように
し、42℃で5分間アニーリングした。100単位のA
MV逆転写酵素(BRL)を加え、42℃で45分間イ
ンキュベートした。2本目のDNA鎖の合成、S1処
理、ポリアクリルアミドゲル上でのサイズ選択、デオキ
シ(C)テイリングおよび,PstIにより開裂されデ
オキシ(G)テイリングされたpBR322へのアニー
リングは既述の方法(文献21、22)で行なった。ア
ニーリングした混合物を使い、発表されている方法(文
献24)に従ってE.coli K−12株294(文
献23)を形質転換した。
グアニジニウムチオシアネート法(文献18)のいずれ
かにより、バイオプシー(生検)または死体から得たヒ
トの迅速凍結肝臓標本からポリ(A)+ RNAを調製し
た。cDNAの合成反応は、基本的に文献19に記載さ
れた方法に従い、ホスホトリエステル法(文献20)に
より製造したオリゴ−デオキシヌクレオチドまたはオリ
ゴ(dT)12-18 (Collaborative Research)のいずれ
かをプライマーとして用いて行なった。典型的なcDN
A合成反応では、25〜35μgのポリ(A)+ RNA
と40〜80pmolのオリゴヌクレオチドプライマーを5
0mMのNaCl中で5分間90°に加熱した。この反
応混合物を、最終濃度が20mMトリスHCl(pH
8.3)、20mM KCl、8mM MgCl2 、3
0mMジチオトレイット、1mMのdATP、dCT
P、dGTP、dTTP(生産物の回収を追跡するため
に32P−dCTP(Amersham)を加える)となるように
し、42℃で5分間アニーリングした。100単位のA
MV逆転写酵素(BRL)を加え、42℃で45分間イ
ンキュベートした。2本目のDNA鎖の合成、S1処
理、ポリアクリルアミドゲル上でのサイズ選択、デオキ
シ(C)テイリングおよび,PstIにより開裂されデ
オキシ(G)テイリングされたpBR322へのアニー
リングは既述の方法(文献21、22)で行なった。ア
ニーリングした混合物を使い、発表されている方法(文
献24)に従ってE.coli K−12株294(文
献23)を形質転換した。
【0034】(B) 32P−標識プローブ を用いた組換え
プラスミドのスクリーニング E.coli 形質転換体を5μg/mlのテトラサイクリ
ン含有LB寒天平板上で増殖させ、ニトロセルロースフ
ィルターペーパー(Schleicher and Schuell,BA85)に
移し、in situコロニースクリーニング法(文献
25)の改良法を使用するハイブリダイゼーションによ
って試験した。ヌクレオチド12〜16個の長さを有す
る32P−末端標識(文献26)オリゴデオキシヌクレオ
チドフラグメントを直接ハイブリダイゼーションプロー
ブとして用いた。あるいは、オリゴ(dT)またはオリ
ゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いてRNAから
32P−cDNAプローブを合成した(文献19)。フィ
ルターを5×Denhardt′s溶液(文献27)、5×SS
C(1×SSC=1.5M NaCl、0.15Mクエ
ン酸ナトリウム)、50mM燐酸ナトリウム(pH6.
8)、20μg/mlサケ***DNA中、4°〜42°の
温度で1夜ハイブリダイズさせ、32P−標識プローブの
長さに応じて4°〜42°の温度で、1〜0.2×SS
Cの濃度の塩(0.1%SDS含有)中で洗浄した(文
献28)。DuPont Lightning−Plus増強スクリーンを用
い、乾燥したフィルターをX線フィルム(コダックXR
−2)に−80°で感光させた。
プラスミドのスクリーニング E.coli 形質転換体を5μg/mlのテトラサイクリ
ン含有LB寒天平板上で増殖させ、ニトロセルロースフ
ィルターペーパー(Schleicher and Schuell,BA85)に
移し、in situコロニースクリーニング法(文献
25)の改良法を使用するハイブリダイゼーションによ
って試験した。ヌクレオチド12〜16個の長さを有す
る32P−末端標識(文献26)オリゴデオキシヌクレオ
チドフラグメントを直接ハイブリダイゼーションプロー
ブとして用いた。あるいは、オリゴ(dT)またはオリ
ゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いてRNAから
32P−cDNAプローブを合成した(文献19)。フィ
ルターを5×Denhardt′s溶液(文献27)、5×SS
C(1×SSC=1.5M NaCl、0.15Mクエ
ン酸ナトリウム)、50mM燐酸ナトリウム(pH6.
8)、20μg/mlサケ***DNA中、4°〜42°の
温度で1夜ハイブリダイズさせ、32P−標識プローブの
長さに応じて4°〜42°の温度で、1〜0.2×SS
Cの濃度の塩(0.1%SDS含有)中で洗浄した(文
献28)。DuPont Lightning−Plus増強スクリーンを用
い、乾燥したフィルターをX線フィルム(コダックXR
−2)に−80°で感光させた。
【0035】(C)DNAの調製および制限酵素分析
プラスミドDNAを大量スケール(文献29)または少
量スケール(miniprep、文献30)で調製し、制限酵素
(New England Biolabs, BRL)で開裂した。スラブゲル
電気泳動条件およびゲルからのDNAフラグメントの電
気溶出については文献31に記載されている。
量スケール(miniprep、文献30)で調製し、制限酵素
(New England Biolabs, BRL)で開裂した。スラブゲル
電気泳動条件およびゲルからのDNAフラグメントの電
気溶出については文献31に記載されている。
【0036】(D)DNAの配列決定
DNAの配列決定は、末端標識DNAフラグメントを用
いてMaxamおよびGilbertの方法(文献2
6)と、合成オリゴヌクレオチド(文献20)プライマ
ーを用いてファージM13mp7)サブクローン(文献
33)からの1本鎖DNAに対するジデオキシチェイン
ターミネーション法(文献32)とを両方共用いて行な
った。各領域は独立して数回配列決定した。
いてMaxamおよびGilbertの方法(文献2
6)と、合成オリゴヌクレオチド(文献20)プライマ
ーを用いてファージM13mp7)サブクローン(文献
33)からの1本鎖DNAに対するジデオキシチェイン
ターミネーション法(文献32)とを両方共用いて行な
った。各領域は独立して数回配列決定した。
【0037】(E)HSAの直接発現のためのアルブミ
ン遺伝子の5′末端の構築 プラスミドF−47の約1200bpのPstIインサ
ート10μg(約16pmol)を水中で5分間煮沸し、1
00pmol の32P−末端標識5′プライマー(dATG
GATGCACACAAG)と混合した。この混合物を
氷で冷やし、0℃で最終容量を120μl(6mMトリ
スHCl(pH7.5)、6mM MgCl2 、60m
M NaCl、0.5mMのdATP、dCTP、dG
TP、dTTP)とした。10単位のDNAポリメラー
ゼI Klenowフラグメント(Boehringer−Mannheim)を
添加し、この混合物を24℃で5時間インキュベートし
た。フェノール/クロロホルム抽出の後、生成物をHp
aIIで消化し、5%ポリアクリルアミドゲル中で電気
泳動させ、所望の450bpフラグメントを電気溶出し
た。
ン遺伝子の5′末端の構築 プラスミドF−47の約1200bpのPstIインサ
ート10μg(約16pmol)を水中で5分間煮沸し、1
00pmol の32P−末端標識5′プライマー(dATG
GATGCACACAAG)と混合した。この混合物を
氷で冷やし、0℃で最終容量を120μl(6mMトリ
スHCl(pH7.5)、6mM MgCl2 、60m
M NaCl、0.5mMのdATP、dCTP、dG
TP、dTTP)とした。10単位のDNAポリメラー
ゼI Klenowフラグメント(Boehringer−Mannheim)を
添加し、この混合物を24℃で5時間インキュベートし
た。フェノール/クロロホルム抽出の後、生成物をHp
aIIで消化し、5%ポリアクリルアミドゲル中で電気
泳動させ、所望の450bpフラグメントを電気溶出し
た。
【0038】ベクタープラスミドpLeIF A25
(文献21)のXbaI消化によって生成した1本鎖部
分を充填してブラント(平滑)DNA末端を生成せしめ
るために、10μMまでのデオキシヌクレオシドトリホ
スフェートおよび10単位のDNAポリメラーゼI Kl
enowフラグメントをこの制限エンドヌクレアーゼ反応混
合物に加え、12°で10分間インキュベートした。制
限エンドヌクレアーゼフラグメント(ほぼ等モル、0.
1〜1μg)をアニーリングし、20μlの50mMト
リスHCl(pH7.6)、10mM MgCl2 、
0.1mM EDTA、5mMジチオトレイット、1m
M rATP中、50単位のT4 リガーゼ(N.E.Biolab
s )を用いて12℃で1夜連結した。プラスミドの構築
についての詳細は後述する。
(文献21)のXbaI消化によって生成した1本鎖部
分を充填してブラント(平滑)DNA末端を生成せしめ
るために、10μMまでのデオキシヌクレオシドトリホ
スフェートおよび10単位のDNAポリメラーゼI Kl
enowフラグメントをこの制限エンドヌクレアーゼ反応混
合物に加え、12°で10分間インキュベートした。制
限エンドヌクレアーゼフラグメント(ほぼ等モル、0.
1〜1μg)をアニーリングし、20μlの50mMト
リスHCl(pH7.6)、10mM MgCl2 、
0.1mM EDTA、5mMジチオトレイット、1m
M rATP中、50単位のT4 リガーゼ(N.E.Biolab
s )を用いて12℃で1夜連結した。プラスミドの構築
についての詳細は後述する。
【0039】(F)タンパク質の分析
組換えE.coli株の培養物2mlをLBまたはM9 培
地(5μg/mlのテトラサイクリン添加)中で密度A
550 =1.0まで増殖させ、ペレット化し、洗浄し、再
びペレット化し、2mlのLBまたは補足M9 (M9 +
0.2%グルコース、1μg/mlチアミン、20μg/
mlの標準アミノ酸、ただしメチオニンは2μg/mlであ
り、トリプトファンは除く)に懸濁した。各増殖培地は
5μg/mlのテトラサイクリンおよび100μCiの35
S−メチオニン(NEN;1200Ci/ミリモル)も含ん
でいた。1時間37℃でインキュベートした後、バクテ
リアをペレット化し、凍結・融解し、200μlの50
mMトリスHCl(pH7.5)、0.12mM Na
EDTAに再懸濁し、リゾチームを1mg/mlまで、NP
40を0.2%まで、NaClを0.35Mまで添加し
てから10分間氷の上に置いた。溶菌物(lysate)を1
0mM MgCl2 に調節し、50μg/mlのDNase
I(Worthington)と共に氷上で30分間インキュベート
した。おだやかに遠心分離して不溶性物質を除去した。
試料を、文献34に記載されているようにして、家兎抗
−HSA(Cappel Labs )およびぶどう状球菌性アブソ
ーベント(Pansorbin ;Cal Biochem )で免疫沈降さ
せ、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(文献3
5)にかけた。
地(5μg/mlのテトラサイクリン添加)中で密度A
550 =1.0まで増殖させ、ペレット化し、洗浄し、再
びペレット化し、2mlのLBまたは補足M9 (M9 +
0.2%グルコース、1μg/mlチアミン、20μg/
mlの標準アミノ酸、ただしメチオニンは2μg/mlであ
り、トリプトファンは除く)に懸濁した。各増殖培地は
5μg/mlのテトラサイクリンおよび100μCiの35
S−メチオニン(NEN;1200Ci/ミリモル)も含ん
でいた。1時間37℃でインキュベートした後、バクテ
リアをペレット化し、凍結・融解し、200μlの50
mMトリスHCl(pH7.5)、0.12mM Na
EDTAに再懸濁し、リゾチームを1mg/mlまで、NP
40を0.2%まで、NaClを0.35Mまで添加し
てから10分間氷の上に置いた。溶菌物(lysate)を1
0mM MgCl2 に調節し、50μg/mlのDNase
I(Worthington)と共に氷上で30分間インキュベート
した。おだやかに遠心分離して不溶性物質を除去した。
試料を、文献34に記載されているようにして、家兎抗
−HSA(Cappel Labs )およびぶどう状球菌性アブソ
ーベント(Pansorbin ;Cal Biochem )で免疫沈降さ
せ、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(文献3
5)にかけた。
【0040】(G)cDNAクローニング
オリゴ(dT)をプライマーとして用いて得られた最初
のcDNAクローンをコロニーハイブリダイゼーション
によってスクリーニングした。そのために、肝臓の全c
DNA(豊富なRNA種を含有するクローンを同定する
ため)と、HSAのアミノ酸546〜549および29
4〜297をコードする可能な配列変化を表わすように
合成された4種の11塩基からなるオリゴデオキシヌク
レオチドを2組プライマーとして用いて肝臓のmRNA
から得られた2個の32P標識cDNAとを使用した。陽
性コロニーの中には、期待されたHSA mRNA配列
のタンパク質コード領域の3′側を 1/2以上含有するも
のがなかった。(これらの組換え体の最大のものをB−
44と命名した。)現在の方法では期待するサイズ(約
2000bp)のmRNAを直接コピーすることができ
ないので、B−44の5′末端近くの領域のアンチメッ
セージ(非コード)鎖に相当する合成オリゴデオキシヌ
クレオチドを製造した。B−44のヌクレオチド配列か
ら、アミノ酸369〜373に相当する12塩基のオリ
ゴデオキシヌクレオチドを構築した。これをプライマー
として使用して、肝臓mRNAのcDNAを合成し、B
−44組換え体と重複しているがHSAメッセージの
5′部分を含んでいるcDNAクローンをpBR322
中で生成した。得られた約400個のクローンを、既に
決定されていたmRNA配列中で僅か上流に位置する1
6塩基のオリゴデオキシヌクレオチドフラグメントとの
コロニーハイブリダイゼーションによってスクリーニン
グした。約40%のコロニーが両プローブとハイブリダ
イズした。ハイブリダイズするプラスミドを含有してい
なかったコロニーの多くは、自身をプライマーとして生
じたRNAか、または逆転写の間に夾雑オリゴ(dT)
をプライマーとして生じたRNAに由来するものか、あ
るいはスクリーニングに使用した配列を含んでいる3′
領域を失ったものであると考えられる。ハイブリダイズ
するコロニーから得た少量(miniprep)のプラスミドD
NAをPstIで消化した。3個の組換えプラスミド
が、HSAメッセージの残りの5′部分をコードするの
に十分大きいインサートを含んでいた。これらのうちの
2つ(F−15およびF−47)は、遺伝子の5′末端
コード部分を含んでいたが、B−44と結合させて完全
なアルブミン遺伝子を再形成させるのに必要なPstI
部位までは延びていなかった。組換え体F−61はこの
PstI部位をもっていたが5′末端が欠けていた。こ
の部分的長さのクローンF−47、F−61およびB−
44に共通する制限エンドヌクレアーゼ部位を使って、
全メッセージ配列をこれら3つの部分から再構築するこ
とができた(第1図参照)。
のcDNAクローンをコロニーハイブリダイゼーション
によってスクリーニングした。そのために、肝臓の全c
DNA(豊富なRNA種を含有するクローンを同定する
ため)と、HSAのアミノ酸546〜549および29
4〜297をコードする可能な配列変化を表わすように
合成された4種の11塩基からなるオリゴデオキシヌク
レオチドを2組プライマーとして用いて肝臓のmRNA
から得られた2個の32P標識cDNAとを使用した。陽
性コロニーの中には、期待されたHSA mRNA配列
のタンパク質コード領域の3′側を 1/2以上含有するも
のがなかった。(これらの組換え体の最大のものをB−
44と命名した。)現在の方法では期待するサイズ(約
2000bp)のmRNAを直接コピーすることができ
ないので、B−44の5′末端近くの領域のアンチメッ
セージ(非コード)鎖に相当する合成オリゴデオキシヌ
クレオチドを製造した。B−44のヌクレオチド配列か
ら、アミノ酸369〜373に相当する12塩基のオリ
ゴデオキシヌクレオチドを構築した。これをプライマー
として使用して、肝臓mRNAのcDNAを合成し、B
−44組換え体と重複しているがHSAメッセージの
5′部分を含んでいるcDNAクローンをpBR322
中で生成した。得られた約400個のクローンを、既に
決定されていたmRNA配列中で僅か上流に位置する1
6塩基のオリゴデオキシヌクレオチドフラグメントとの
コロニーハイブリダイゼーションによってスクリーニン
グした。約40%のコロニーが両プローブとハイブリダ
イズした。ハイブリダイズするプラスミドを含有してい
なかったコロニーの多くは、自身をプライマーとして生
じたRNAか、または逆転写の間に夾雑オリゴ(dT)
をプライマーとして生じたRNAに由来するものか、あ
るいはスクリーニングに使用した配列を含んでいる3′
領域を失ったものであると考えられる。ハイブリダイズ
するコロニーから得た少量(miniprep)のプラスミドD
NAをPstIで消化した。3個の組換えプラスミド
が、HSAメッセージの残りの5′部分をコードするの
に十分大きいインサートを含んでいた。これらのうちの
2つ(F−15およびF−47)は、遺伝子の5′末端
コード部分を含んでいたが、B−44と結合させて完全
なアルブミン遺伝子を再形成させるのに必要なPstI
部位までは延びていなかった。組換え体F−61はこの
PstI部位をもっていたが5′末端が欠けていた。こ
の部分的長さのクローンF−47、F−61およびB−
44に共通する制限エンドヌクレアーゼ部位を使って、
全メッセージ配列をこれら3つの部分から再構築するこ
とができた(第1図参照)。
【0041】さらに5′方向にのびるもう1つのcDN
Aクローンは、同様のオリゴデオキシヌクレオチド(ア
ミノ酸コドン番号175〜179に相当するプライマ
ー)を用いたcDNA合成によって得た。このcDNA
クローン(P−14)は成熟HSA発現プラスミドの構
築には使用しなかったが、これによってHSA mRN
Aの「プレプロ」ペプチドコード領域と5′非コード領
域のDNA配列を決定することができた。
Aクローンは、同様のオリゴデオキシヌクレオチド(ア
ミノ酸コドン番号175〜179に相当するプライマ
ー)を用いたcDNA合成によって得た。このcDNA
クローン(P−14)は成熟HSA発現プラスミドの構
築には使用しなかったが、これによってHSA mRN
Aの「プレプロ」ペプチドコード領域と5′非コード領
域のDNA配列を決定することができた。
【0042】得られた成熟HSA mRNA配列を、t
rpプロモーター/オペレーターによってE.coli
中で成熟タンパク質を直接発現させるためのベクタープ
ラスミドに結合した。プラスミドpLeIFA25はヒ
トの白血球インターフェロンA(IFNα2)の発現を
指令する(文献21)。このプラスミドをXbaIで消
化し、その開裂部位を、DNAポリメラーゼI Klenow
フラグメントとデオキシヌクレオシドトリホスフェート
を用いて充填してブラントDNA末端を形成させた。次
いでPstIで消化した後、E.coli trpプロ
モーター、オペレーターおよび人工的にブラント末端に
したXbaI開裂部位を末端にもつtrpリーダーペプ
チドのリボゾーム結合部位の300bpフラグメントお
よびpBR322配列を含んでいる「ベクター」フラグ
メントをゲルで精製した。クローンF−47のDNA配
列分析により決定したHSAの最初の4個のアミノ酸を
コードしている12個のヌクレオチドとその直前の開始
コドンATGを含むように、15個の塩基からなるオリ
ゴデオキシヌクレオチドを設計した。「プライマー修
復」と呼ばれる操作で、F−47のPstIフラグメン
トを含有している遺伝子を変性し、過剰の15−mer
(15量体)とアニーリングし、DNAポリメラーゼI
Klenowフラグメントおよびデオキシヌクレオシドトリ
ホスフェートと反応させた。この反応で、アニーリング
したオリゴヌクレオチドの下流に新しい第2の鎖が延
び、コドン番号1の上流の1本鎖DNAが減成(分解)
し、次いで上流でATGに相補的な3個のヌクレオチド
が補足される。さらに、この生成物を、上で調製したベ
クターフラグメントにブラント末端で連結させると、そ
の初めのアデノシン残基がXbaI制限部位を再生す
る。この「プライマー修復」反応に続いて、このDNA
をHpaIIで消化し、成熟アルブミン遺伝子の5′部分
を含有している450bpフラグメントをゲルで精製し
た(第1図参照)。このフラグメントをアニーリング
し、ベクターフラグメントおよびゲル単離したF−47
のHpaII−PstI部分に連結し、E.coli細胞
の形質転換に使用した。少量の(minipreps )プラスミ
ドを検査のために制限エンドヌクレアーゼで消化した結
果、trpプロモーター/オペレーターに正確に連結さ
れた成熟アルブミンコード領域の5′部分を含有してい
る組換え体A−26が確認された。組立の最終段階とし
て、A−26プラスミドをBglIIとPstIで消化
し、約4kbフラグメントをゲルで精製した。これをア
ニーリングして、F−61から精製した390bpのP
stI/BglII部分消化フラグメントおよびB−44
の1000bp PstIフラグメントに連結した。得
られた形質転換体を制限エンドヌクレアーゼで分析した
結果、成熟タンパク質を直接発現するように適切に配置
された全HSAコード配列を含有するプラスミドが確認
された。このような組換え体プラスミドの1つをpHS
A1と命名した。pHSA1を含有するE.coliを
トリプトファンを含んでいない最少培地で増殖させる
と、HSA抗体と特異的に反応し、SDSポリアクリル
アミド電気泳動でHSAと共に移動するタンパク質が産
生する(第2図参照。同じ組換え体を富化ブロス中で増
殖させるとこのようなタンパク質は産生しない。このこ
とは、E.coli中での推定HSAタンパク質の産生
が、設計したとおりtrpプロモーター/オペレーター
の制御下で行われることを示している。組換えプラスミ
ドにおけるHSA構造遺伝子の完全性を確かめるため
に、pHSA1をDNA配列分析にかけた。
rpプロモーター/オペレーターによってE.coli
中で成熟タンパク質を直接発現させるためのベクタープ
ラスミドに結合した。プラスミドpLeIFA25はヒ
トの白血球インターフェロンA(IFNα2)の発現を
指令する(文献21)。このプラスミドをXbaIで消
化し、その開裂部位を、DNAポリメラーゼI Klenow
フラグメントとデオキシヌクレオシドトリホスフェート
を用いて充填してブラントDNA末端を形成させた。次
いでPstIで消化した後、E.coli trpプロ
モーター、オペレーターおよび人工的にブラント末端に
したXbaI開裂部位を末端にもつtrpリーダーペプ
チドのリボゾーム結合部位の300bpフラグメントお
よびpBR322配列を含んでいる「ベクター」フラグ
メントをゲルで精製した。クローンF−47のDNA配
列分析により決定したHSAの最初の4個のアミノ酸を
コードしている12個のヌクレオチドとその直前の開始
コドンATGを含むように、15個の塩基からなるオリ
ゴデオキシヌクレオチドを設計した。「プライマー修
復」と呼ばれる操作で、F−47のPstIフラグメン
トを含有している遺伝子を変性し、過剰の15−mer
(15量体)とアニーリングし、DNAポリメラーゼI
Klenowフラグメントおよびデオキシヌクレオシドトリ
ホスフェートと反応させた。この反応で、アニーリング
したオリゴヌクレオチドの下流に新しい第2の鎖が延
び、コドン番号1の上流の1本鎖DNAが減成(分解)
し、次いで上流でATGに相補的な3個のヌクレオチド
が補足される。さらに、この生成物を、上で調製したベ
クターフラグメントにブラント末端で連結させると、そ
の初めのアデノシン残基がXbaI制限部位を再生す
る。この「プライマー修復」反応に続いて、このDNA
をHpaIIで消化し、成熟アルブミン遺伝子の5′部分
を含有している450bpフラグメントをゲルで精製し
た(第1図参照)。このフラグメントをアニーリング
し、ベクターフラグメントおよびゲル単離したF−47
のHpaII−PstI部分に連結し、E.coli細胞
の形質転換に使用した。少量の(minipreps )プラスミ
ドを検査のために制限エンドヌクレアーゼで消化した結
果、trpプロモーター/オペレーターに正確に連結さ
れた成熟アルブミンコード領域の5′部分を含有してい
る組換え体A−26が確認された。組立の最終段階とし
て、A−26プラスミドをBglIIとPstIで消化
し、約4kbフラグメントをゲルで精製した。これをア
ニーリングして、F−61から精製した390bpのP
stI/BglII部分消化フラグメントおよびB−44
の1000bp PstIフラグメントに連結した。得
られた形質転換体を制限エンドヌクレアーゼで分析した
結果、成熟タンパク質を直接発現するように適切に配置
された全HSAコード配列を含有するプラスミドが確認
された。このような組換え体プラスミドの1つをpHS
A1と命名した。pHSA1を含有するE.coliを
トリプトファンを含んでいない最少培地で増殖させる
と、HSA抗体と特異的に反応し、SDSポリアクリル
アミド電気泳動でHSAと共に移動するタンパク質が産
生する(第2図参照。同じ組換え体を富化ブロス中で増
殖させるとこのようなタンパク質は産生しない。このこ
とは、E.coli中での推定HSAタンパク質の産生
が、設計したとおりtrpプロモーター/オペレーター
の制御下で行われることを示している。組換えプラスミ
ドにおけるHSA構造遺伝子の完全性を確かめるため
に、pHSA1をDNA配列分析にかけた。
【0043】(H)DNA配列分析
MaxamおよびGilbertの化学的分解法(文献
26)と、1本鎖M13mP7ファージ誘導体から誘導
された鋳型を用いたジデオキシチェインターミネーショ
ン法(文献32,33)とにより、pHSA1のアルブ
ミンcDNA部分(およびその周辺領域)を完全に配列
決定した。全てのヌクレオチドは少なくとも2回配列決
定した。このDNA配列をHSAタンパク質の推定アミ
ノ酸配列と共に第3図に示してある。成熟HSAコード
領域より5′側のDNA配列もcDNAクローンP−1
4から決定し、第3図に示してある。
26)と、1本鎖M13mP7ファージ誘導体から誘導
された鋳型を用いたジデオキシチェインターミネーショ
ン法(文献32,33)とにより、pHSA1のアルブ
ミンcDNA部分(およびその周辺領域)を完全に配列
決定した。全てのヌクレオチドは少なくとも2回配列決
定した。このDNA配列をHSAタンパク質の推定アミ
ノ酸配列と共に第3図に示してある。成熟HSAコード
領域より5′側のDNA配列もcDNAクローンP−1
4から決定し、第3図に示してある。
【0044】DNA配列分析の結果、人工の開始コドン
および完全な成熟HSAコード配列が所望通りE.co
li trpプロモーター/オペレーターのすぐ後に続
いていることが確認された。このATGイニシエーター
は、trpリーダーペプチド(文献37)の推定E.c
oliリボゾーム結合配列(文献36)からヌクレオチ
ド9個分だけ後にある。
および完全な成熟HSAコード配列が所望通りE.co
li trpプロモーター/オペレーターのすぐ後に続
いていることが確認された。このATGイニシエーター
は、trpリーダーペプチド(文献37)の推定E.c
oliリボゾーム結合配列(文献36)からヌクレオチ
ド9個分だけ後にある。
【0045】pHSA1のDNA配列の翻訳により、5
85個のアミノ酸からなる成熟HSAタンパク質が予想
される。種々報告されているHSAタンパク質配列は約
20個のアミノ酸で一致していない。本発明による配列
は、Moulonら(文献12)のものと11個の残基
が異なっており、もともとMoulonら(文献12)
の文献とBehrensら(文献10)の報告に基くと
考えられるDayhoffカタログ(文献9)に記載さ
れているものとは28個の残基が異なっている。これら
の違いのほとんどは、隣接残基の対の逆位(inversion
)であるか、またはグルタミン−グルタミン酸の不一
致である。本発明の配列では、Dayhoff(文献
9)およびMoulonら(文献12)の両者と異なっ
ているのは585個の残基のうちの5個だけであり、こ
れらの5個の違いのうち3個はグルタミンとグルタミン
酸が入れ替ったものである(第3図において下線を引い
た部分“。全ての不一致の部分について、ヌクレオチド
の配列決定を注意深く再チェックした所、DNA配列決
定操作の誤りがこれらの不一致の原因になっているとは
考えられなかった。cDNAのクローニングで人工的加
工がなされた可能性を除外することはできない。しか
し、種々の報告におけるアミノ酸配列の違いについて他
の説明が可能である。それらの1つは、インビボまたは
タンパク質の配列決定中におけるアミド化の変化(グル
タミンとグルタミン酸の識別に影響がある)である(文
献38)。HSAタンパク質の多形性が相違の原因にな
っているかもしれない。20種以上のHSAの遺伝的変
異体がタンパク質電気泳動(文献39)により検出され
ているが、アミノ酸配列レベルではまだ分析されていな
い。また、本発明で予測されたHSAタンパク質配列は
585個のアミノ酸の長さであり、Moulon(文献
12)とは一致するがDayhoff(文献9)とは一
致しないことも注目に値する。この違いはアミノ酸15
6〜157におけるPhe−Pheペアの1個のフェニ
ルアラニン(Phe)残基の欠失(文献9)によって説
明される。
85個のアミノ酸からなる成熟HSAタンパク質が予想
される。種々報告されているHSAタンパク質配列は約
20個のアミノ酸で一致していない。本発明による配列
は、Moulonら(文献12)のものと11個の残基
が異なっており、もともとMoulonら(文献12)
の文献とBehrensら(文献10)の報告に基くと
考えられるDayhoffカタログ(文献9)に記載さ
れているものとは28個の残基が異なっている。これら
の違いのほとんどは、隣接残基の対の逆位(inversion
)であるか、またはグルタミン−グルタミン酸の不一
致である。本発明の配列では、Dayhoff(文献
9)およびMoulonら(文献12)の両者と異なっ
ているのは585個の残基のうちの5個だけであり、こ
れらの5個の違いのうち3個はグルタミンとグルタミン
酸が入れ替ったものである(第3図において下線を引い
た部分“。全ての不一致の部分について、ヌクレオチド
の配列決定を注意深く再チェックした所、DNA配列決
定操作の誤りがこれらの不一致の原因になっているとは
考えられなかった。cDNAのクローニングで人工的加
工がなされた可能性を除外することはできない。しか
し、種々の報告におけるアミノ酸配列の違いについて他
の説明が可能である。それらの1つは、インビボまたは
タンパク質の配列決定中におけるアミド化の変化(グル
タミンとグルタミン酸の識別に影響がある)である(文
献38)。HSAタンパク質の多形性が相違の原因にな
っているかもしれない。20種以上のHSAの遺伝的変
異体がタンパク質電気泳動(文献39)により検出され
ているが、アミノ酸配列レベルではまだ分析されていな
い。また、本発明で予測されたHSAタンパク質配列は
585個のアミノ酸の長さであり、Moulon(文献
12)とは一致するがDayhoff(文献9)とは一
致しないことも注目に値する。この違いはアミノ酸15
6〜157におけるPhe−Pheペアの1個のフェニ
ルアラニン(Phe)残基の欠失(文献9)によって説
明される。
【0046】ラット血清アルブミンcDNAクローン
(文献16)のDNA配列と比較すると、本発明の成熟
HSA配列はヌクレオチドレベルで74%、アミノ酸レ
ベルで73%が一致(homology)している(ラ
ットのSAタンパク質はHSAよりアミノ酸1個だけ短
く、HSAのカルボキシ末端残基がラットタンパク質に
は存在しない)。両タンパク質において、35個のシス
テイン残基は全て同じ位置に存在している。HSAの予
測された「プレプロ」ペプチド領域は、ラットcDNA
クローン(文献16)から報告されているものと、76
%のヌクレオチド、および75%のアミノ酸が一致して
いる。種間の配列相同性は、比較できる3′非翻訳領域
(発表されているラットのcDNAクローンはmRNA
の3′末端の前で終了している)の部分では低下してい
る。HSA cDNAは、ポリ(A)付加部位からヌク
レオチド28個分だけ前にヘキサヌクレオチドAATA
AAを含んでいる。これはProudfootおよびB
rownleeによって初めて注目された真核細胞mR
NAに共通の特徴である(文献40)。
(文献16)のDNA配列と比較すると、本発明の成熟
HSA配列はヌクレオチドレベルで74%、アミノ酸レ
ベルで73%が一致(homology)している(ラ
ットのSAタンパク質はHSAよりアミノ酸1個だけ短
く、HSAのカルボキシ末端残基がラットタンパク質に
は存在しない)。両タンパク質において、35個のシス
テイン残基は全て同じ位置に存在している。HSAの予
測された「プレプロ」ペプチド領域は、ラットcDNA
クローン(文献16)から報告されているものと、76
%のヌクレオチド、および75%のアミノ酸が一致して
いる。種間の配列相同性は、比較できる3′非翻訳領域
(発表されているラットのcDNAクローンはmRNA
の3′末端の前で終了している)の部分では低下してい
る。HSA cDNAは、ポリ(A)付加部位からヌク
レオチド28個分だけ前にヘキサヌクレオチドAATA
AAを含んでいる。これはProudfootおよびB
rownleeによって初めて注目された真核細胞mR
NAに共通の特徴である(文献40)。
【0047】医薬組成物
本発明に係る化合物は、既知の方法に従って製剤化し
て、医薬上有用な組成物を製造することができる。すな
わち、本発明のポリペプチドを薬学的に許容し得る担体
と配合する。好適な担体およびその製剤化法はE.W.Mart
inの Remington′s Pharmaceutical Sciences に記載さ
れている(詳細は文献を参照されたい)。このような組
成物は、本発明に係る蛋白質の有効量と共に、受容者に
有効に投与するのに適した薬学的に許容し得る組成物を
調製するために適当な量の担体を含んでいる。1つの好
ましい投与方法は非経口投与である。
て、医薬上有用な組成物を製造することができる。すな
わち、本発明のポリペプチドを薬学的に許容し得る担体
と配合する。好適な担体およびその製剤化法はE.W.Mart
inの Remington′s Pharmaceutical Sciences に記載さ
れている(詳細は文献を参照されたい)。このような組
成物は、本発明に係る蛋白質の有効量と共に、受容者に
有効に投与するのに適した薬学的に許容し得る組成物を
調製するために適当な量の担体を含んでいる。1つの好
ましい投与方法は非経口投与である。
【0048】文 献
1.Rosenoer,V,M., Oratz,M., Rothschild,M.A. eds.
(1977) Albumin Structure, Function and Uses,Pergam
on Press,Oxford. 2.Peters.T. (1977) Clin.Chem. (Winston-Salem,N.
C.) 23, 5-12. 3.Ruoslahti,E. and Terry,W.D. (1976) Nature 260,
804-805. 4.Sala-Trepat,J.M., Dever,J., Sargent,T.D., Thom
as,K., Sell,S. and Bonner,J. (1979) Biochemistry 1
8, 2167-2178. 5.Jagodzinski,L.L., Sargent,T.D., Yang,M.Glacki
n,C.and Bonner,J.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78,
3521-3525. 6.Ruoslahti,E. and Terry,W.D. (1976) Nature 260,
804-805). 7.Yachnin,S., Hsu,R., Heinrikson,R.L. and Mille
r,J.B. (1977) Biochim.Biophys. Acta 493, 418-428. 8.Aoyagi,Y., Ikenaka,T. and Ichida,F. (1977) Can
cer Research 37, 3663-3667. 9.Dayhoff,M. (1978) Atlas of Protein Sequence an
d Structure, Vol.5.Suppl.3, p.266, National Biomed
ical Research Foundation, Washington. 10.Behrens,P.Q., Spiekerman,A.M. and Brown,J.R.(1
975) Fed.Proc.34, 591. 11.Brown,J.R. (1977) in Rosenoer et al. (1977),
pp.27-52. 12.Meloun,B., Moravek,L. and Kostka,V. (1975) Feb
s Letters 58, 134-137. 13.Judah,J.O., Gamble,M., and Steadman, J.H., (19
73)Biochem. J. 134, 1083-1091 14.Russell,J.H. and Geller,D.M. (1973) Biochem.Bi
ophys.Res.Commun. 55,239-245. 15.MacGillivray, R.T., Chung, D.W. and Davie, E.
W. (1979) Eur. J. Biochem. 98, 477-485. 16.Sargent, T.D., Yang, M. and Bonner, J. (1981)
Proc. Natl. Acad. Sci.USA 78, 243-246. 17.Berger, S.L. and Birkenmeier,C.S. (1979) Bioch
emistry 18, 5143-5149. 18.Ullrich, A., Shine, J., Chirgwin, R., Pictet,
R., Tischer,E., Rutter,W.J. and Goodman, H.M. (197
7) Science 196, 1313-1315. 19.Goeddel, D.V., Yelverton, E., Ullrich, A., Hey
neker, H.L., Miozzari,G., Holmes, W., Seeburg, P.
H., Dull,T., May, L., Stebbing, N., Crea,R., Maed
a, S., McCandliss, R., Sloma, A., Tabor, J.M., Gro
ss, M.,Familletti, P.C. and Pestka, S. (1980) Natu
re 287, 411-416. 20.Crea, R. and Horn, T. (1980) Nucleic Acids Re
s. 8, 2331-2348. 21.Goeddel, D.V., Heyneker, H.L., Hozumi, T., Are
ntzen,R., Itakura, K.,Yansura, D.G., Ross, M.J., M
iozzari, G., Crea, R. and Seeburg, P.H.(1979) Natu
re 281, 544-548. 22.Goeddel, D.V., Shepard, H.M., Yelverton, E., L
eung, D. and Crea, R.(1980) Nucleic Acids Res. 8,
4057-4074. 23.Backman, K., Ptashne,M. and Gilbert,W. (1976)
Proc. Natl. Acad. Sci.USA 73, 4174-4178. 24.Hershfield, V., Boyer, H.W., Yanofsky,C., Love
tt, M.A. and Helinski,D.R. (1974) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 71, 3455-3459. 25.Grunstein, M., and Hogness, D.S. (1975) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA3961-3965. 26.Maxam,A.M. and Gilbert, W. (1980) Methods Enzy
mol. 65, 499-560. 27.Denhardt, D.T. (1966) Biochem. Biophys. Res. C
ommun. 23, 461-467. 28.Wallace,R.B., Johnson, M.J., Hirose, T., Miyak
e, T., Kawashima, E.H.and Itakura, K. (1981) Nucle
ic Acids Research 9, 879-893. 29.Blin, N. and Stafford, D.W. (1976) Nucleic Aci
ds Res. 3, 2303-2308. 30.Birnboim, H.C. and Doly, J. (1979) Nucleic Ac
ids Research 7, 1513-1523. 31.Lawn, R.M., Adelman, J., Franke, A.E., Houck,
C. M., Gross, M.,Najarian, R. and Goeddel, D.V. (1
981) Nucleic Acids Research 9, 1045-1052. 32.Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. (197
7) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 74, 5463-5467. 33.Messing, J., Crea, R. and Seeburg, P.H. (1981)
Nucleic Acids Res. 9309-322. 34.Kessler, S.W. (1976) J. Immunology 117, 1482-1
490. 35.Laemmli, U.K. (1970) Nature 277, 680-685. 36.Shine, J. and Dalgarno, L. (1974) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 71,1342-1346. 37.Platt, T., Squires, C. and Yanofsky, C. (1976)
J. Mol. Biol. 103,411-420. 38.Robinson, A.B. and Rudd, C.J. (1974) Current
Topics in CellularRegulation, 247-295. 39.Weitkamp, L.R., Salzano, F.M., Neel, J.V., Por
ta, F., Geerdink, R.A.and Tarnoky, A.L. (1973) An
n. Hum. Genet., Lond. 36, 381-391. 40.Proudfoot, N.J. and Brownlee, G.G. (1976) Natu
re 263, 211-214. 41.Gorin, M.B., Cooper,D.L., Eiferman, F., Van de
Rijn,P. and Tilghman,S.M. (1981) J. Mol. Biol. 25
6, 1954-1959. 42.Kiousois, D., Eiferman, F., Van de Rijn, P., G
orin, M.B., Ingram,R.S. and Tilghman, S.M. (1981)
J.Mol. Biol. 256, 1960-1967.
(1977) Albumin Structure, Function and Uses,Pergam
on Press,Oxford. 2.Peters.T. (1977) Clin.Chem. (Winston-Salem,N.
C.) 23, 5-12. 3.Ruoslahti,E. and Terry,W.D. (1976) Nature 260,
804-805. 4.Sala-Trepat,J.M., Dever,J., Sargent,T.D., Thom
as,K., Sell,S. and Bonner,J. (1979) Biochemistry 1
8, 2167-2178. 5.Jagodzinski,L.L., Sargent,T.D., Yang,M.Glacki
n,C.and Bonner,J.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78,
3521-3525. 6.Ruoslahti,E. and Terry,W.D. (1976) Nature 260,
804-805). 7.Yachnin,S., Hsu,R., Heinrikson,R.L. and Mille
r,J.B. (1977) Biochim.Biophys. Acta 493, 418-428. 8.Aoyagi,Y., Ikenaka,T. and Ichida,F. (1977) Can
cer Research 37, 3663-3667. 9.Dayhoff,M. (1978) Atlas of Protein Sequence an
d Structure, Vol.5.Suppl.3, p.266, National Biomed
ical Research Foundation, Washington. 10.Behrens,P.Q., Spiekerman,A.M. and Brown,J.R.(1
975) Fed.Proc.34, 591. 11.Brown,J.R. (1977) in Rosenoer et al. (1977),
pp.27-52. 12.Meloun,B., Moravek,L. and Kostka,V. (1975) Feb
s Letters 58, 134-137. 13.Judah,J.O., Gamble,M., and Steadman, J.H., (19
73)Biochem. J. 134, 1083-1091 14.Russell,J.H. and Geller,D.M. (1973) Biochem.Bi
ophys.Res.Commun. 55,239-245. 15.MacGillivray, R.T., Chung, D.W. and Davie, E.
W. (1979) Eur. J. Biochem. 98, 477-485. 16.Sargent, T.D., Yang, M. and Bonner, J. (1981)
Proc. Natl. Acad. Sci.USA 78, 243-246. 17.Berger, S.L. and Birkenmeier,C.S. (1979) Bioch
emistry 18, 5143-5149. 18.Ullrich, A., Shine, J., Chirgwin, R., Pictet,
R., Tischer,E., Rutter,W.J. and Goodman, H.M. (197
7) Science 196, 1313-1315. 19.Goeddel, D.V., Yelverton, E., Ullrich, A., Hey
neker, H.L., Miozzari,G., Holmes, W., Seeburg, P.
H., Dull,T., May, L., Stebbing, N., Crea,R., Maed
a, S., McCandliss, R., Sloma, A., Tabor, J.M., Gro
ss, M.,Familletti, P.C. and Pestka, S. (1980) Natu
re 287, 411-416. 20.Crea, R. and Horn, T. (1980) Nucleic Acids Re
s. 8, 2331-2348. 21.Goeddel, D.V., Heyneker, H.L., Hozumi, T., Are
ntzen,R., Itakura, K.,Yansura, D.G., Ross, M.J., M
iozzari, G., Crea, R. and Seeburg, P.H.(1979) Natu
re 281, 544-548. 22.Goeddel, D.V., Shepard, H.M., Yelverton, E., L
eung, D. and Crea, R.(1980) Nucleic Acids Res. 8,
4057-4074. 23.Backman, K., Ptashne,M. and Gilbert,W. (1976)
Proc. Natl. Acad. Sci.USA 73, 4174-4178. 24.Hershfield, V., Boyer, H.W., Yanofsky,C., Love
tt, M.A. and Helinski,D.R. (1974) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 71, 3455-3459. 25.Grunstein, M., and Hogness, D.S. (1975) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA3961-3965. 26.Maxam,A.M. and Gilbert, W. (1980) Methods Enzy
mol. 65, 499-560. 27.Denhardt, D.T. (1966) Biochem. Biophys. Res. C
ommun. 23, 461-467. 28.Wallace,R.B., Johnson, M.J., Hirose, T., Miyak
e, T., Kawashima, E.H.and Itakura, K. (1981) Nucle
ic Acids Research 9, 879-893. 29.Blin, N. and Stafford, D.W. (1976) Nucleic Aci
ds Res. 3, 2303-2308. 30.Birnboim, H.C. and Doly, J. (1979) Nucleic Ac
ids Research 7, 1513-1523. 31.Lawn, R.M., Adelman, J., Franke, A.E., Houck,
C. M., Gross, M.,Najarian, R. and Goeddel, D.V. (1
981) Nucleic Acids Research 9, 1045-1052. 32.Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. (197
7) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 74, 5463-5467. 33.Messing, J., Crea, R. and Seeburg, P.H. (1981)
Nucleic Acids Res. 9309-322. 34.Kessler, S.W. (1976) J. Immunology 117, 1482-1
490. 35.Laemmli, U.K. (1970) Nature 277, 680-685. 36.Shine, J. and Dalgarno, L. (1974) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 71,1342-1346. 37.Platt, T., Squires, C. and Yanofsky, C. (1976)
J. Mol. Biol. 103,411-420. 38.Robinson, A.B. and Rudd, C.J. (1974) Current
Topics in CellularRegulation, 247-295. 39.Weitkamp, L.R., Salzano, F.M., Neel, J.V., Por
ta, F., Geerdink, R.A.and Tarnoky, A.L. (1973) An
n. Hum. Genet., Lond. 36, 381-391. 40.Proudfoot, N.J. and Brownlee, G.G. (1976) Natu
re 263, 211-214. 41.Gorin, M.B., Cooper,D.L., Eiferman, F., Van de
Rijn,P. and Tilghman,S.M. (1981) J. Mol. Biol. 25
6, 1954-1959. 42.Kiousois, D., Eiferman, F., Van de Rijn, P., G
orin, M.B., Ingram,R.S. and Tilghman, S.M. (1981)
J.Mol. Biol. 256, 1960-1967.
【図1】第1図(A)はヒト血清アルブミンをコードし
ているmRNA、ならびにcDNAクローンF−47、
F−61およびB−44に含まれる領域を示す模式図で
ある。
ているmRNA、ならびにcDNAクローンF−47、
F−61およびB−44に含まれる領域を示す模式図で
ある。
【図2】第1図(B)はプラスミドpHSA1の模式図
である。
である。
【図3】第2図は細菌により合成されたHSAの免疫沈
降結果を示す図である。
降結果を示す図である。
【図4】第3図(A)はヒト血清アルブミンのヌクレオ
チド配列およびアミノ酸配列を示す模式図である。
チド配列およびアミノ酸配列を示す模式図である。
【図5】第3図(B)はヒト血清アルブミンのヌクレオ
チド配列およびアミノ酸配列を示す模式図である。
チド配列およびアミノ酸配列を示す模式図である。
【図6】第3図(C)はヒト血清アルブミンのヌクレオ
チド配列およびアミノ酸配列を示す模式図である。
チド配列およびアミノ酸配列を示す模式図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
(C12N 1/19
C12R 1:865)
(56)参考文献 Victohy M.Rosenno
er著「Albmin Structu
re Function and Us
es」Pergamon Press
(1977)p.27−51
Febs Letters,58,p.
134〜137(1975)
J.Call.Biol Vol.87
p.111a Abstract D832
(1980)
Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 78(1)p.243−246
(198)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 1.ヒト血清アルブミンの製造方法であって、天然のヒ
ト血清アルブミンをコードする下記DNA配列、又は下
記DNA配列にヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列
の置換、欠失もしくは付加を含有するDNA配列であっ
て、天然のヒト血清アルブミンをコードするDNA配列
を含むベクターによって宿主細胞を形質転換し、得られ
た形質転換体を培養し、ヒト血清アルブミンを回収する
ことを特徴とする方法。 GAT GCA CAC AAG AGT GAG GTT GCT CAT CGG TTT AAA GAT TTG GGA GAA GAA AAT TTC AAA GCC TTG GTG TTG ATT GCC TTT GCT CAG TAT CTT CAG CAG TGT CCA TTT GAA GAT CAT GTA AAA TTA GTG AAT GAA GTA ACT GAA TTT GCA AAA ACA TGT GTA GCT GAT GAG TCA GCT GAA AAT TGT GAC AAA TCA CTT CAT ACC CTT TTT GGA GAC AAA TTA TGC ACA GTT GCA ACT CTT CGT GAA ACC TAT GGT GAA ATG GCT GAC TGC TGT GCA AAA CAA GAA CCT GAG AGA AAT GAA TGC TTC TTG CAA CAC AAA GAT GAC AAC CCA AAC CTC CCC CGA TTG GTG AGA CCA GAG GTT GAT GTG ATG TGC ACT GCT TTT CAT GAC AAT GAA GAG ACA TTT TTG AAA AAA TAC TTA TAT GAA ATT GCC AGA AGA CAT CCT TAC TTT TAT GCC CCG GAA CTC CTT TTC TTT GCT AAA AGG TAT AAA GCT GCT TTT ACA GAA TGT TGC CAA GCT GCT GAT AAA GCT GCC TGC CTG TTG CCA AAG CTC GAT GAA CTT CGG GAT GAA GGG AAG GCT TCG TCT GCC AAA CAG AGA CTC AAA TGT GCC AGT CTC CAA AAA TTT GGA GAA AGA GCT TTC AAA GCA TGG GCA GTG GCT CGC CTG AGC CAG AGA TTT CCC AAA GCT GAG TTT GCA GAA GTT TCC AAG TTA GTG ACA GAT CTT ACC AAA GTC CAC ACG GAA TGC TGC CAT GGA GAT CTG CTT GAA TGT GCT GAT GAC AGG GCG GAC CTT GCC AAG TAT ATC TGT GAA AAT CAG GAT TCG ATC TCC AGT AAA CTG AAG GAA TGC TGT GAA AAA CCT CTG TTG GAA AAA TCC CAC TGC ATT GCC GAA GTG GAA AAT GAT GAG ATG CCT GCT GAC TTG CCT TCA TTA GCT GCT GAT TTT GTT GAA AGT AAG GAT GTT TGC AAA AAC TAT GCT GAG GCA AAG GAT GTC TTC CTG GGC ATG TTT TTG TAT GAA TAT GCA AGA AGG CAT CCT GAT TAC TCT GTC GTG CTG CTG CTG AGA CTT GCC AAG ACA TAT GAA ACC ACT CTA GAG AAG TGC TGT GCC GCT GCA GAT CCT CAT GAA TGC TAT GCC AAA GTG TTC GAT GAA TTT AAA CCT CTT GTG GAA GAG CCT CAG AAT TTA ATC AAA CAA AAC TGT GAG CTT TTT AAG CAG CTT GGA GAG TAC AAA TTC CAG AAT GCG CTA TTA GTT CGT TAC ACC AAG AAA GTA CCC CAA GTG TCA ACT CCA ACT CTT GTA GAG GTC TCA AGA AAC CTA GGA AAA GTG GGC AGC AAA TGT TGT AAA CAT CCT GAA GCA AAA AGA ATG CCC TGT GCA GAA GAC TAT CTA TCC GTG GTC CTG AAC CAG TTA TGT GTG TTG CAT GAG AAA ACG CCA GTA AGT GAC AGA GTC ACA AAA TGC TGC ACA GAG TCC TTG GTG AAC AGG CGA CCA TGC TTT TCA GCT CTG GAA GTC GAT GAA ACA TAC GTT CCC AAA GAG TTT AAT GCT GAA ACA TTC ACC TTC CAT GCA GAT ATA TGC ACA CTT TCT GAG AAG GAG AGA CAA ATC AAG AAA CAA ACT GCA CTT GTT GAG CTT GTG AAA CAC AAG CCC AAG GCA ACA AAA GAG CAA CTG AAA GCT GTT ATG GAT GAT TTC GCA GCT TTT GTA GAG AAG TGC TGC AAG GCT GAC GAT AAG GAG ACC TGC TTT GCC GAG GAG GGT AAA AAA CTT GTT GCT GCA AGT CAA GCT GCC TTA GGC TTA 2. 宿主細胞が真核細胞であることを特徴とする請求
項1に記載の方法。 3.真核細胞がSaccharomyces cerevisiaeであることを
特徴とする請求項2に記載の方法。
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