JP2938976B2 - 有核赤血球の迅速な同時分析方法 - Google Patents
有核赤血球の迅速な同時分析方法Info
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Description
を識別し正確にカウントする方法に関する。本発明は特
に、2つの光散乱パラメーターと蛍光との使用によって
全血サンプル中のNRBC及び白血球(“WBC")サブ集団を
同時に識別及びカウントする方法に関する。
要がある。血液研究所は、貧血を診断するための適切な
常套処理手順即ち標準処理手順のセットを供給してい
る。最も重要な検査項目は、(全自動血球計数器で行
う)全血球計算、血液塗抹標本の形態分析、網状赤血球
指数である。従来方法ではNRBCカウント数は血液塗抹標
本の形態分析によって決定されている。染色した血液塗
抹標本を顕微鏡下に観察し、NRBCを手動操作でカウント
する。NRBC濃度は一般には、白血球(“WBC")100個あ
たりのNRBCの数として記録される。通常は、被験者の血
液塗抹標本の同一領域に存在する200個のWBCとNRBCの数
とをカウントし、双方を2で除算してWBC100個あたりの
NRBCの数としてNRBC濃度を表す。手動操作によるこの種
の鏡検方法の主な欠点は、極めて労働集約的なこと、時
間が掛かること、主観的であること、及び、統計が少な
いので不正確なことである。従って、正確な全自動NRBC
カウント法は、かねてから病理学者及び検査技師らによ
って要望されている。
ウント法を全自動化する場合の主要な問題は、NRBCは希
少なイベントであり、RBC集団は極めて多数に存在する
成分であるから、細胞の電気抵抗率(インピーダンス測
定値)または細胞の光散乱特性(光学測定値)の違いに
基づいて赤血球(“RBC")集団中のNRBC集団を検出する
ことが容易ではないことである。RBC集団中でなくWBC集
団中のNRBC集団をカウントする実験も数多く試みられた
が、これらの努力は概して成功をみなかった。
フローサイトメーターで使用される通常の二次元空間識
別方法ではNRBC集団をWBC集団から容易に識別できな
い。検出された信号を常用の二次元の光散乱(前方対側
方)ドットプロットまたは光の散乱対吸収ドットプロッ
トとして観察するとき、NRBC集団をリンパ球集団から分
離することは通常はできない。大部分のNRBC集団の信号
は通常はRBC間質及び血小板(PLT)の信号と混交し、NR
BCクラスターの上端は極めてしばしばリンパ球集団の占
めるスペース内に伸びている。
標)、並びに、Abbott Cell−Dyn(登録商標)3000及び
3500のような全自動的な臨床用血液分析装置は、サンプ
ルのドットプロットがリンパ球クラスターの下方に増加
したノイズ信号を示すならばサンプル中にNRBCが存在す
る可能性があるという“標識”を与えるだけである。ノ
イズレベルの上昇はPLT凝集体、巨大PLTまたは不完全溶
解RBCに起因することもあるので、この種の標識付けは
極めてしばしば誤った陽性結果を生じる。更に、干渉が
生じるため、NRBC含有サンプル中のWBC総数及びWBC百分
率(WBC/Diff)の正確な結果を得ることは極めて難し
い。また、正確なWBC百分率及びNRBCカウント数を得る
ためには、熟練した技師が標識サンプルの血液塗抹標本
を顕微鏡で観察しカウントしなければならない。これは
極めて労働集約的で主観的な方法である。
第5,298,426号が許諾された。この特許は、特定の核染
料によるWBC及びNRBCの染色を含む2段階方法を教示し
ている。この特許の方法では、血液サンプルを、先ず、
蛍光性核染料を含有する酸性低張溶液と混合する。次
に、pH及びオスモル濃度を調整するためにアルカリ性塩
バッファから成る溶液をサンプル/第一試薬の溶液と混
合する。次いで、この最終溶液をフローサイトメーター
に充填し、NRBCを他の有核細胞と共に検出しカウントす
る。
方法に受入れられていない理由はいくつか存在する。第
一に、酸性低張溶液はすべての細胞の細胞膜を損傷し、
すべてのWBCが漏出性になり易く、従って核染料によるN
RBCの選択的染色が不可能である。核物質(DNA)は同じ
であるから、NRBC核だけを染色しWBC核を染色しない公
知の染料は存在しない。Inamiらによって記載された核
染料プロピジウム・イオダイド(propidium iodide)
は、損傷した細胞膜を透過することによって死細胞の核
を染色し、NRBC核だけでなく任意の核のDNAヘリックス
に侵入する常用の生体染色用核染料である。第二に、該
方法は、NRBC核の蛍光信号と、ハウエル−ジョリー体、
好塩基性斑点、溶解網状赤血球及び網状血小板のRNA、W
BCのDNA及び巨核球の断片のような他の核残遺物の蛍光
信号とを分離または識別することができない。第三に、
Inamiらの方法では、サンプルを予め複数の試薬でオフ
ライン処理してプレップサンプルを調製する必要があ
り、この処理後に漸くプレップサンプル/試薬の溶液を
装置に充填できる。
定量的なフローサイトメトリー分析方法が提供される。
方法は、生体染色用核染料をNRBC核に接触させるため及
び生体染色用核染料のWBC透過を最小限に抑制するよう
に全血サンプルのアリコート中のRBC及びNRBC細胞質を
破壊する段階と、染色されたアリコートをフローサイト
メトリーによる光測定法で処理する段階と、第一及び第
二の範囲の散乱角度の散乱光と蛍光(FL)とを含むパラ
メーターに関する少なくとも1つの信号を発生させる段
階と、得られた信号を認定するために、認定された信号
が第二の散乱信号閾値を上回り同時に第一の散乱信号閾
値またはFL閾値を上回る{〔(第一散乱角信号 OR FL
信号)AND 第二散乱角信号〕}信号であることを要求
する組合せ論理を用いて処理する段階と、検出された信
号から蛍光及び散乱光の認定強度信号の三次元プロット
を作成する段階と、作成した三次元プロットからNRBCと
WBCとを識別し、各々の細胞の数を決定する段階とから
成る。
NRBS及びWBCの同時定量分析デバイスが提供される。デ
バイスは、第一及び第二の範囲の散乱角度の散乱光と蛍
光(FLまたはFl)とを含むパラメーターに関する少なく
とも1つの信号を発生させるフローサイトメーターと、
フローサイトメーターから得られた信号をAND/OR論理に
よってデジタル化用に認定するトリプルトリガリング回
路とを含む。認定された信号は、第二の散乱信号閾値を
上回り、同時に、第一の散乱信号閾値またはFL閾値を上
回る{〔(第一散乱角信号 OR FL信号)AND 第二散乱
角信号〕}ことが要求される。
有核赤血球及び白血球の同時定量分析方法が提供され
る。方法は、WBCの染色を最小限に抑制しながらNRBC核
を核染料で染色するために全血サンプルのアリコートか
ら赤血球(“RBC")及びNRBC細胞質を除去してNRBC核を
露出させる段階と、アリコートをフローサイトメトリー
による光測定法で処理する段階と、約0°−約1°の散
乱光消衰(ALL)と約3°−10°の散乱光(IAS)と蛍光
(Fl)とを含むパラメーターに関する少なくとも1つの
信号を発生させる段階と、得られた信号を〔(ALL信
号)OR(Fl信号)AND(3°−10°散乱信号〕から成るA
ND/OR論理を用いて認定する段階と、検出された信号か
ら蛍光及び散乱光の認定強度信号の三次元プロットを作
成する段階と、作成した三次元プロットからNRBCとWBC
とを識別し、各々の細胞の数を決定する段階とから成
る。
有核赤血球及び白血球を定量分析するフローサイトメト
リーデバイスが提供される。デバイスは、約0°−約1
°の散乱光パラメーターと約3°−10°の散乱光パラメ
ーターと蛍光(Fl)パラメーターとに関する少なくとも
1つの信号を発生するフローサイトメーターと、フロー
サイトメーターから得られた信号をAND/OR論理によって
デジタル化用に認定するトリプルトリガリング回路とを
含み、上記論理は、以後の処理に対する信号の妥当性を
検査するために、〔(0°−約1°の散乱信号)OR(Fl
信号)AND(3°−10°散乱信号〕から成る。
床用フローサイトメーターの光学素子の概略図である。
る。
て実施例1に記載のごとく処理した全血サンプルのWB
C、NRBC、RBC間質及び他のバックグラウンドノイズの分
布を示す概略図である。
減損(ALL)トリガだけを用いて実施例1に記載のごと
く処理した全血サンプルのWBC、NRBC、RBC間質及び他の
バックグラウンドノイズの分布を示す概略図である。
リガだけを用いて実施例1に記載のごとく処理した全血
サンプルのWBC、NRBC、RBC間質及び他のバックグラウン
ドノイズの分布を示す概略図である。
実施例1に記載のごとく処理した全血サンプルのNRBC、
RBC間質及び他のバックグラウンドノイズの分布を示す
概略図である。
に使用したトリガよりも高いFL3トリガレベルを用いて
実施例1に記載のごとく処理した全血サンプルのNRBCの
分布を示す概略図である。
ガALL及びFL3を用いて実施例1に記載のごとく処理した
全血サンプルのWBC、NRBC及び他のバックグラウンドノ
イズの分布を示す概略図である。
2つのトリガALL及びFL3と図8よりも高い値に設定され
たFL3トリガレベルとを併用して実施例1に記載のごと
く処理した全血サンプルのWBC及びNRBCの分布を示す概
略図である。
いて実施例1に記載のごとく処理した全血サンプルのWB
C及びNRBCの分布を示す概略図である。
施例1に記載のごとく処理した正常血液サンプルのドッ
トプロット図を示す。
て実施例2に記載のごとく処理したNRBCを含有する異常
血液の細胞図を示す。
に記載のごとく処理したNRBC含有の異常血液の細胞図を
示す。
びIAS)検出方法を用いて処理した56NRBC/100WBCを含む
全血サンプルの分布を示す。
(ALL、FL3及びIAS)検出方法を用いて処理した140NRBC
/100WBCを含む別の全血サンプルの分布を示す。
記載のごとく調製及び処理した線形サンプル群の結果を
示す。
NRBCカウント数(縦座標)と顕微鏡を用いた手動操作に
よるNRBCカウント数(横座標)との相関プロットであ
る。データを実施例7に記載のごとく処理した。
を用いた全血サンプル中のWBC百分率及びNRBCを同時分
析するための全自動方法に関する。本発明方法によれ
ば、NRBCを含有する全血サンプルから正確なNRBCカウン
ト数とWBC百分率データとを同時に得ることが可能であ
る。
屑から生じる信号をトリプルトリガリング方法によって
遮断し、ALLトリガを下回りFL3トリガを上回る信号をNR
BCとして同定しカウントすることである。従って、蛍光
性核落屑が本質的に夾雑しない正確なNRBCカウント数が
得られる。壊れ易い幼若細胞及び死細胞も本発明方法を
利用して検出し得る。
BCを速やかに溶解させて、露出したNRBC核を染色する適
当な核染料を添加した血液希釈剤を血液サンプルと混合
することによってWBC百分率とNRBCとを正確に同時にカ
ウントすることが可能である。血液希釈剤は、1994年8
月29日出願の「全血サンプルを迅速に溶解するための多
目的試薬系(MULTIPURPOSE REAGENT SYSTEM FOR RAPID
LYSIS OF WHOLE BLOOD SAMPLES)」という表題の米国特
許出願No.08/297,662に開示されている。この特許の記
載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。希
釈剤/サンプルの混合物を、照射した光学フローセルに
本質的には一度に1細胞の割合で通す。通過する細胞は
照射光を散乱し、染色された核が存在するならばこの核
が蛍光を発する。散乱光信号及び蛍光信号を公知の手段
によって検出し、検出した信号の処理にトリプルトリガ
リング方法を用いることによって、WBC、WBC百分率及び
NRBCを同定し定量することが可能である。本発明のトリ
プルトリガ方法と特に適合性であることが判明した血液
分析装置は、1994年8月1日出願の「全自動分析の実施
方法及び装置(METHOD AND APPARATUS FOR PERFORMING
AUTOMATED ANALYSIS)」という表題の米国特許出願No.0
8/283,379に開示及び記載されている。この特許の記載
内容は参照によって本発明に含まれるものとする。
A、ハウエル−ジョリー体、網状血小板、巨大血小板、W
BCのDNA、巨核球断片、寄生生物及びRBC断片のような他
の細胞落屑から干渉されることなくWBC百分率とNRBCと
の同時分析が自動的に正確にかつ迅速に行われることで
ある。本発明の別の利点は、WBC、RBC及び血小板をカウ
ントするように標準的に校正された臨床用血液分析装置
において方法を使用することができるので臨床用な有効
性が極めて高いことである。このようなシステムは、臨
床用血液サンプル中の正確なWBC百分率とNRBCとのデー
タ(パーセント及び絶対カウント数)を供給し得る。従
来ではこのようなデータ処理は可能ではなかった。
析を行う前に、NRBCとして同定された信号を全WBC信号
から減算することによって、NRBCを含有する血液サンプ
ル中の正確なWBC百分率の分析を行うことが可能であ
る。NRBCを染色するための1種類の染料が必要なだけで
あり、WBC百分率の分析はWBCサブクラスの光散乱特性の
違いによって行うことができる。
び赤色蛍光(FL3)の三次元空間における独特のトリプ
ルトリガリング方法によって上記の目的を全て達成す
る。
小角散乱(SAS)または軸方向光減損(ALL、前方減衰と
しても知られる)を測定するために1つまたはそれ以上
の検出器を好ましくは前方光路内に配置する。ALLは通
常は、レーザービームの前方を通過し光ダイオードによ
って検出される細胞に起因する光エネルギーの減少であ
る。光減損は通常は、散乱によって生じるものであり、
レーザービームの光路内で検出器に到達する光エネルギ
ーのビーム内の細胞通過に起因する減少であると定義さ
れる(一般にALLは約0°−約1°の角度で検出され
る)。対照的に、前方小角散乱(SAS)は、ビームを通
る細胞から散乱されることによって入射レーザーの外部
(約1°−3°の狭角内)で検出器に到達する光エネル
ギーである。レーザービームが検出器に侵入しないよう
に通常はビームストップが配備されている。ALL測定シ
ステムは、レーザー光線の入射コーンの内部の光を集
め、小角散乱システムはこのコーンの外部の光を集め
る。ALL測定システムにおいて、問題の信号は確実な定
常レーザー信号から減算された負の信号であり、他方、
前方小角散乱測定においては、信号は極めて低いバック
グラウンド光レベルに加えられた小さい正の信号であ
る。光が入射レーザービームよりも広角に散乱すること
以外は前方中角散乱(IAS)は前方小角散乱と同様であ
る。より詳細には、IASはレーザービームの入射線また
は中心線から約3°から10°までの間に環状に散乱する
光に関する。好ましい実施態様においては、ALLはレー
ザー軸から水平方向で約0.3°未満及び垂直方向で約1.2
°未満の角度内に集まり、IASはレーザー軸から約3°
から10°までの間の角度に集まる。
の核に接近し易くなるようにNRBCの細胞質を完全に溶解
させるので、正確な検出及びカウントを行うためのNRBC
の効率的で迅速な染色がはるかに低濃度の染料で可能な
ことである。この条件によれば、NRBC検出において100
を上回る高い信号対雑音(S/N)比が得られる。WBC百分
率とNRBCとの同時的分析を迅速に実施するためにこのシ
ステムに必要な生体染色用染料の濃度はわずかに1〜2
μg/mlであり、これは従来技術の少なくとも50/1以下で
ある。
傷細胞だけを染色する核染料)は核酸に結合しないとき
に比較的高い消衰係数を有し且つ低い蛍光強度を有する
いかなる生体染色用染料でもよい。生体染色用染料のス
ペクトル特性値、即ち消衰(EX)最大値(nm)/発光
(EM)最大値(nm)はシステムで使用されるレーザー光
源と適合性でなければならない。
特性を有しているのが望ましい。
下及びEM最大値は630nm以下)。
料が適正に使用できると認定された。開示されたシステ
ムで使用できる市販の染料としては、YOYO−1、YOYO−
3、TOTO−1、TOTO−3、BO−PRO−1、YO−PRO−1、
TO−PRO−1があり、その他にも多数存在する。異なるE
X最大値をもつ染料をヘリウム−ネオン、キセノンまた
は水銀ランプのような適当な光源で励起させ得ることは
当業者によく知られている。
く市販の染料は、プロピジウムヨージド(PI)、エチジ
ウムブロミド(EBr)、エチジウムホモダイマー−1(E
thD−1)、エチジウムホモダイマー−2(EthD−2)
またはジエチレントリアミン(DTA)である。本発明の
1つの使用例では、使用される生体染色用染料がPIであ
る。pH約6.5、オスモル濃度約260を有しており、酢酸塩
バッファ(約15mM)、塩化アンモニウム(約5.0g/リッ
トル)、炭酸水素カリウム(約2g/リットル)、サポニ
ン(約100mg/リットル)及びホルムアルデヒド(約0.07
%)から成る多目的試薬系(米国特許出願No.08/297,66
2)を使用すると、約42℃で1分間以内にWBC百分率とNR
BCとの同時分析を1段階で実施し得る。
8月1日出願の「全自動分析の実施方法及び装置(METH
OD AND APPARATUS FOR PERFORMING AUTOMATED ANALYSI
S)」という表題の米国特許出願No.08/283,379は、特に
光散乱信号ALL及びIASと種々の蛍光信号とを利用して全
血サンプルから細胞及び細胞サブクラスを識別する全自
動血液分析装置を開示している。以下の記載はこの血液
分析装置を用いた場合に限定されている。しかしながら
これは単なる便宜的な記載であり、本発明がこの分析装
置の使用にのみ限定されることは全くない。
約25μlの全血サンプルの一部分をサンプル吸引プロー
ブを用いて導入する。溶解用試薬は、血液サンプル中の
赤血球画分を溶解させ、NRBCの細胞質を溶解させて、NR
BCが存在するならばその核を露出させるために使用され
る。試薬は、血液の赤血球画分を溶解させることに加え
て、WBC画分を保護するかまたは損傷しないように十分
に穏やかに作用しなければならない。このような溶解用
試薬系の一例が、1994年8月29日出願の「全血サンプル
を迅速に溶解させる多目的試薬系(MULTIPURPOSE REAGE
NT SYSTEM FOR RAPID LYSIS OF WHOLE BLOOD SAMPLE
S)」という表題の米国特許出願No.08/297,662に開示さ
れている。該特許出願の記載内容も参照によって本発明
に含まれるものとする。この試薬系の特徴は、1試薬/1
段階方法で多数の目的を達成し得ることである。この試
薬はすべての壊れ易い白血球の形態を保存すべく十分に
穏やかに作用し、同時に、すべての赤血球を効率的に溶
解させる。双方の目的は、溶解時間の延長を要する血球
疾病性(hemaglobinophathic)のサンプル中でも達成さ
れる。トリプルトリガ方法でいかなる配合の溶解剤を使
用するかに関わりなく、試薬は、末梢血液中に存在し得
るNRBCを効率的に標識する生体染色用核染料を低濃度で
含有してもよくまたはこのような染料と併用されてもよ
い。前述の分析装置と共に使用するためには、屈折率が
被覆溶液(sheath solution)の屈折率と実質的に0.1%
未満まで一致する溶解作用が生じるような成分構成が好
ましい。
カップに11秒間だけ維持する。カップ中で混合物を42℃
±3℃で溶解及び混合させる。この時点で、WBCカップ
の内容物を図1に示す検出用の光学フローセル100に直
接導入する。
スが開始される。細胞流は、溶解剤の添加によって希釈
され、レーザー被照射容積(volume)を希釈剤/被覆溶
液によって包囲された層流サンプル流として一列縦隊で
通過する。被照射容積は、流動軸に垂直な2つの次元の
流体力学的に収束した細胞流、及び、流動軸に平行な1
つの次元のレーザービームの約17ミクロンの垂直方向の
狭窄ビーム幅によって限定されている。この試験を実施
するとき、サンプルの流速は約2.5μl/秒であり、対応
するWBC細胞及びNRBC細胞を感知する被照射容積は約80
×5×17ミクロンの寸法をもつ楕円柱にほぼ等しい。
光減損(ALL)と中角散乱(IAS)とを検出するコンパウ
ンドホトダイオード102と、赤色蛍光を検出する光電子
増倍管104と、図2に示す独特のトリプルトリガ回路と
によって、ALL、IAS及びFL3(赤色蛍光)の三次元の特
徴空間として検出される。トリプルトリガ回路はAND/OR
論理を用いてデジタル化用の信号を認定する。認定され
た信号は、IASトリガよりも大きく、同時に、ALLトリガ
またはFL3トリガよりも大きい信号でなければならな
い。この独特なトリガリング回路の組合せ、及び、平衡
した固定剤を含む溶解特性によって、DNAフラグメン
ト、RBC間質及び血小板のような蛍光性及び非蛍光性の
バックグラウンドを原因とする通常は生じ易い干渉を生
じることなく、露出したNRBC核を速やかに染色し、明白
にかつ曖昧さを残さずにカウントし、WBC百分率を分析
するための細胞のカウント数から除外し得る。
S)及び前方小角散乱(SAS)または軸方向光減損(AL
L、前方消衰としても知られる)を測定するために、前
方光路に配置するのが好ましい。ALLは一般に、レーザ
ービームの前を通る細胞に起因する光エネルギーの減少
であり、光ダイオードによって検出される。光減損は一
般に、散乱に起因するものであり、レーザービームの通
路内で検出器に到達する光エネルギーのビーム内の細胞
通過に起因する減少であると定義される(一般にALLは
約0°−約1°の角度で検出される)。対照的に、前方
小角散乱(SAS)は、ビームを通る細胞から散乱される
ことによって入射レーザービームの外部(但し約1°−
3°の狭角内)で検出器に到達する光エネルギーであ
る。レーザービームが検出器に侵入しないように通常は
ビームストップが配備されている。ALL測定システムは
レーザー光線の入射コーンの内部の光を集めるが、小角
散乱システムはこのコーンの外部の光を集める。ALL測
定システムにおいて、問題の信号は定常状態のレーザー
信号から減算された負の信号であり、他方、前方小角散
乱測定においては、信号は極めて低いバックグラウンド
光レベルに加えられた小さい正の信号である。光が入射
レーザービームよりも広角に散乱すること以外は前方中
角散乱(IAS)は前方小角散乱と同様である。より詳細
には、IASは、レーザービームの入射線即ち中心線から
約3°から10°までの間の環状区域に散乱した光に関す
る。好ましい実施態様において、ALLはレーザー軸から
水平方向で約0.3°未満及び垂直方向で約1.2°未満の角
度に集まり、IASはレーザー軸から約3°から10°まで
の間の角度に集まる。
を通過したときに、検出器102、104、106及び108にパル
スが発生する。これらのパルスの振幅が濾波され、増幅
され、デジタル化され、対応するALL、IAS、FL3、PSS
(偏光した側方散乱)及びDSS(偏光の解消した側方散
乱)から成る5次元の特徴空間にリストモードで記憶さ
れる。フローセル100の標準カウント時間は約10秒であ
る。上記の流速及び希釈率を用いた場合、1μlあたり
7000個のWBC細胞を含む健常被験者の血液の場合、検査
対象としてカウントされる数は5000個であろう。カウン
ト数が少ないサンプルでは、測定の統計を改善するため
にカウント時間が自動的に延長される。測定時間の経過
後、サンプル流を排出管から廃棄し、プローブを洗浄
し、乾燥して、以後のサンプル処理に備える。
間のリストモードデータにアルゴリズムを応用し、30秒
未満の処理時間で以下の細胞型を計数及び/または標識
する。
びIAS信号を検出して収集し、NRBCを分析するためには
染色したNRBC核からFL3信号を収集する。図2に示すト
リプルトリガ回路は、AND/OR論理を用いてこれらの信号
をデジタル化用に認定する。認定されるためには、信号
がIASトリガを上回り、同時にALLトリガまたはFL3トリ
ガのいずれかを上回ることが必要である。
用される信号は以下のラベルに対応する。
の入力に存在する。電圧比較器300、314及び322は、
“+入力”(302、310及び318)を“−入力”(304、31
2及び320)に比較することによって機能し、出力(30
6、316、324)を与える。“+入力”が“−入力”より
も高い電圧を有するときは、出力は高レベルである。
“+入力”が“−入力”よりも低い電圧を有するとき
は、出力が低レベルである。
独立電圧である。
されており、ORゲートの出力328を与える。ORゲートは
その入力を比較することによって機能する。一方の入力
または双方の入力が高レベルのとき、出力は高レベルで
ある。
ト330の入力に接続されている。ANDゲートはその入力を
比較することによって機能し、出力332を導く。これはv
alidトリガ出力である。双方の入力が高レベルの場合に
のみ出力が高レベルとなる。
302がその閾値電圧304よりも大きいか及び/またはFL3
信号310がその閾値電圧312よりも大きいときにのみvali
dトリガ出力332が高いレベルとなる。
示すようにNRBCが前述の三次元の空間に独特のクラスタ
ーを形成し、WBC百分率の光学的分析中にこのNRBCを容
易にカウントすることができ、WBCカウント数から明確
に除外できる。従って、WBC100個あたりのNRBCカウント
数及び患者血液1μlあたりのNRBC絶対数が記録され
る。その結果として、NRBCがWBCカウント総数から減算
され、血液サンプル中のNRBCの存在下でWBC総数及びWBC
百分率の正確な分析が可能である。DNAフラグメント、R
BC間質、ハウエル−ジョリー体、好塩基性斑点、溶解網
状赤血球のRNA、WBCのDNA及び巨核球断片から発生する
蛍光性及び非蛍光性のバックグラウンドノイズは実質的
に除去される。本発明で開示された(ALL、IAS及びFL3
に基づく)トリプルトリガリングプロセスによって、染
色されたNRBC核が種々のバックグラウンドノイズから分
離され、ALL対FL3のドットプロット上で、FL3トリガを
上回るNRBC核から発生したFL3+信号だけがNRBCとして
カウントされる。
領域は以下の細胞型に対応する。
ノイズ、210=NRBC、212=間質 実施例1 EDTA−抗凝固処理新鮮正常血液を、1994年8月1日出
願の「全自動分析の実施方法及び装置(METHOD AND APP
ARATUS FOR PERFORMING AUTOMATED ANALYSIS)」という
表題の米国特許出願No.08/283,379に開示された前述の
臨床用全自動血液分析装置の実験ユニットで処理した。
該特許出願の記載内容は参照によって本発明に含まれる
ものとする。この実施例では上記分析装置を用いて本発
明を実施したが、以下の全ての実施例では必ずしもこの
分析装置を使用しなかった。1994年8月29日出願の「全
血サンプルを迅速に溶解させる多目的試薬系(MULTIPUR
POSE REAGENT SYSTEM FOR RAPID LYSIS OF WHOLE BLOOD
SAMPLES)」という表題の米国特許出願No.08/297,662
に開示された675μlの等張性多目的試薬(pH6.5、260m
Osm/リットル)に、25μlの血液サンプルをオンライン
で混合した。該特許出願の記載内容は参照によって本発
明に含まれるものとする。
アンモニウム(5g/リットル)と、約0.075容量%のホル
ムアルデヒドと、約10mM〜約20mMの酢酸塩バッファと、
約10mMの炭酸水素カリウムと、約0.01重量容量%(即ち
g/100ml)のサポニンとから成る。試薬系のpHは、約6.2
〜約7.0の範囲に調整され、試薬系のオスモル濃度は約2
15〜約270mOsm/リットルの範囲である。
し、ここでサンプルと試薬とを混合し、11秒間インキュ
ベートする。次にWBC百分率及びNRBCの分析を行うため
にこの混合物を(8秒半を要して)フローセルに移し
た。システムの光学素子編成を図1に示す。トリプルト
リガリング回路を使用しないで当業界で常用のALLトリ
ガとFL3トリガとの2つだけを用いて分析を実施した。
図3Aから図10Cまでの全部を参照されたい。
ら得られた光散乱信号(ALL対IAS)の区域を図示してお
り、3つの異なるWBC集団を示す。好塩基球クラスター
は明らかでないが、その理由は、正常血液が好塩基球を
多量に含んでいないからである。好酸球クラスターは示
されていないが、その理由は、好酸球はDSS対PSSドット
プロット(図示せず)を介して分離されるからである。
図11Bに示す中段の細胞図は、標識されたALL信号及びFL
3信号のドットプロット図である。正常血液はNRBCを全
く含まないことに注目されたい。図11B及び11Cに示す下
段のFL3+クラスターは、明らかに前述のようなRNAまた
はDNAを含む細胞落屑である。
は、(47NRBC/100WBCの割合で)NRBCを含む異常血液を
標準検出方法を用いて実施例1に記載のごとく分析した
ときのドットプロット図である。上段の細胞図のリンパ
球集団直下のクラスターはNRBCに属し、下部左隅の小ク
ラスターは、RBC間質(網状細胞、ハウエル−ジョリー
体など)、血小板及びWBCの落屑を含む初期ノイズに属
する。図12Bは、このサンプルの初期ノイズクラスター
が核染料によって鮮明に染色され、FL3チャネル中で染
色されたNRBCクラスターの極めて近傍に随伴し、従っ
て、NRBCを正確にカウントするようにFL3トリガを設定
することが不可能なことを示す。
で)NRBCを含む異常血液を標準検出方法を用いて実施例
1に記載のごとく分析したときのドットプロット図であ
る。図13Aに示す上段の図のリンパ球集団直下のクラス
ターはNRBCに属する。このサンプルではFL3+の初期ノ
イズの増加が観察される。ノイズクラスターはFL3チャ
ネル中でNRBCクラスターの極めて近接に存在する。従っ
て、FL3ノイズはFL3トリガの位置と干渉を生じる。初期
ノイズを完全に除去すべくFL3トリガを十分な高さに設
定すると、図13Bに示すようにFL3トリガを下回るNRBC集
団の一部も失われる。
路(ALL/IAS/FL3)を実施例1から3で使用した分析装
置と同じ分析装置に組み込んで使用した。
プルを実施例1に記載の手順で処理した。結果を図14A
から図14Cに示す。FL3+ノイズクラスターが消滅したこ
とに注目されたい。IASトリガの付加によってノイズ信
号が遮断される。全NRBCの集団を回収するためにFL3ト
リガを十分に低い値に設定した場合にも、FL3トリガを
上回る蛍光性初期ノイズはこの異常血液からもはや出現
しない(NRBCクラスターが円形であることに注目された
い)。
L、FL3及びIAS)で処理した140NRBC/100WBCを含む別の
臨床用全血サンプルのNRBC分布のドットプロット図を示
す。初期ノイズは観察されず、FL3トリガを上回る全NRB
C集団が回収される。このサンプルで注目すべきは、NRB
Cの濃度が極めて高いのでNRBCクラスターの密度が高い
ことである。
理正常ヒト血液に添加することによって線形サンプル群
を調製した。本発明のトリプルトリガ検出方法を用いて
実施例1に記載の手順でサンプルを処理した。ニワトリ
赤血球の細胞質は本発明の方法で溶解し、露出した核だ
けが残った(CEN)。CENは希釈剤中の生体染色用核染料
(PI)によって極めて迅速に染色され蛍光性となる(FL
3)。FL3+ CENをNRBCとしてカウントし、NRBC/100WBC
の数として記録し、また、本発明方法の全血サンプル1
μlあたりの絶対カウント数として記録する。結果を図
16A及び16Bに示す。図中のNRBC/100WBCとNRBC絶対数と
の線形プロット群は、本発明の方法が線形NRBCカウント
数を生じることを証明する。
ルのNRBCカウント数(縦座標)の相関プロットを示す。
結果と標準的な顕微鏡の手動操作によって得られたカウ
ント数(横座標)の結果とを相関させる。手動操作によ
るNRBCカウント数を得るためには、ライト−ギムザによ
って染色した各患者の血液塗抹標本の200個の白血球細
胞のWBC百分率の分析を実施し、また、同一領域に存在
するNRBCカウント数を2で除算して、NRBC/100WBCを記
録した。相関係数(R)は0.973(R2=0.946)であり、
勾配0.86及びY軸切点は1.32である。
Claims (9)
- 【請求項1】フローサイトメトリーによって有核赤血球
(NRBC)を他の細胞から識別する方法であって、 (a)赤血球溶解成分と白血球固定成分と有核赤血球の
核を染色する生体染色用核染料成分とから成る試薬系と
血液サンプルのアリコートとを混合し、 (b)混合アリコートを実質的に一度に1細胞の割合で
光学刺激領域を通過させ、 (c)蛍光(FL)と第一及び第二の範囲の散乱角度の散
乱光とを含むパラメーターに関する少なくとも1つの信
号を発生させ、 (d)得られた信号を認定するために、認定された信号
が第二の散乱信号閾値よりも大きく同時に第一の散乱信
号閾値またはFL閾値よりも大きい信号であることを要求
する論理によって信号を処理し、 (e)検出された信号からFL及び散乱光の強度信号の三
次元プロットを作成し、 (f)作成された三次元プロットと認定された信号とか
ら有核赤血球と白血球とを識別し、各々の細胞数を測定
する段階から成る方法。 - 【請求項2】第一散乱角が約0°−約1°であることを
特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】第一散乱パラメーターが軸方向光減損(AL
L)であることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】ALLが約0°−約1°の角度で得られるこ
とを特徴とする請求項3に記載の方法。 - 【請求項5】第二散乱角が約3°−約10°であることを
特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項6】核染料が、プロピジウムヨージド(PI)、
エチジウムブロミド(EBr)、エチジウムホモダイマー
−1(EthD−1)、エチジウムホモダイマー−2(EthD
−2)及びジエチレントリアミン(DTA)から成る生体
染色用染料のグループから選択されることを特徴とする
請求項1に記載の方法。 - 【請求項7】フローサイトメトリーによって有核赤血球
を他の細胞から識別する方法であって、 (a)赤血球溶解成分と白血球固定成分と有核赤血球の
核を染色する生体染色用核染料成分とから成る試薬系と
血液サンプルのアリコートとを混合し、 (b)混合アリコートを実質的に一度に1細胞の割合で
光学刺激領域を通過させ、 (c)蛍光(FL)と約0°−約1°及び約3°−約10°
の範囲の散乱角度の散乱光とを含むパラメーターに関す
る少なくとも1つの信号を発生させ、少なくとも1つの
散乱光パラメーターが軸方向光減損を含んでおり、 (d)得られた信号を認定するために、認定された信号
が3°−10°の散乱信号閾値よりも大きく同時に0°−
約1°の信号閾値またはFL閾値よりも大きいことを要求
する論理によって信号を処理し、 (e)検出された信号からFL及び散乱光の強度信号の三
次元プロットを作成し、 (f)作成された三次元プロットと認定された信号とか
ら有核赤血球と白血球とを識別し、各々の細胞数を測定
する段階から成る方法。 - 【請求項8】核染料が、プロピジウムヨージド(PI)、
エチジウムブロミド(EBr)、エチジウムホモダイマー
−1(EthD−1)、エチジウムホモダイマー−2(EthD
−2)及びジエチレントリアミン(DTA)から成るグル
ープから選択されることを特徴とする請求項7に記載の
方法。 - 【請求項9】約0°−約1°の散乱光パラメーターと約
3°−10°の散乱光パラメーターと蛍光(Fl)パラメー
ターとに関する少なくとも1つの信号を発生するフロー
サイトメーターと、フローサイトメーターから得られた
信号をAND/OR論理によってデジタル化用に認定するトリ
プルトリガリング回路とを含むフローサイトメトリーデ
バイスであって前記論理は、以後の処理に対する信号の
妥当性を検査するために、〔(0°−約1°の散乱信
号)OR(Fl信号)AND(3°−10°散乱信号〕から成る
血液サンプルから細胞を識別するためのフローサイトメ
トリーデバイス。
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