DE10016139A1 - Verfahren zur Bestimmung von löslichem Fibrin - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur quantitativen Messung von löslichem Fibrin in Plasma, das auf der selektiven, spezifischen Stimulation der katalytischen Aktivität des Plasminogenaktivators DSPA durch Fibrin in Anwesenheit von Fibrinogen und dem damit verbundenen Umsatz eines chromogenen Substrats durch DSPA selbst oder durch Plasmin beruht. Die Erfindung dient der Diagnose präthrombotischer oder thrombotischer Zustände und ermöglicht auf Grund ihrer schnellen automatisierbaren Durchführung die zeitnahe Einleitung therapeutischer Maßnahmen. Ferner kann sie auch zur sensitiven Überwachung antikoagulatorischer Therapien genutzt werden.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von
löslichem Fibrin. Insbesondere betrifft das Verfahren die
spezifische und hochsensitive Messung von löslichem Fi
brin mittels Desmodus rotundus Speichel Plasminogenakti
vatoren (DSPA).
Venöse Thrombosen und die damit einher gehenden Folgeer
krankungen wie das Postthrombotische-Syndrom oder die
Lungenembolien, welche akut lebensbedrohend sein können,
stellen eine häufige Ursache für Morbidität dar. In der
Bundesrepublik wird die Thrombose-Inzidenz auf 1 : 1000
pro Jahr geschätzt mit einer hohen Mortalitätsrate (Witt
I. APC-Resistenz (Faktor V Mutation): Klinische Bedeu
tung, Pathophysiologie und Diagnostik. Dt Ärzteblatt
1998; 95: A 2316-2323). Die rechtzeitige Diagnose des
präthrombotischen Zustandes würde krankheitsverhütende
antithrombotische Maßnahmen erlauben.
Es ist aber immer noch eine ungelöste Aufgabe in der kli
nischen und laboratoriumsmedizinischen Diagnostik, den
Aktivierungszustand der Gerinnungskaskade vor der Gerinn
selpräzipitation zu quantifizieren. Bei den im Augenblick
verfügbaren Testverfahren für Aktivierungsparameter der
Blutgerinnung wie zum Beispiel der Nachweis der Prothrom
binfragmente 1 + 2 oder von Thrombin-Antithrombin Komplexen
handelt es sich um zeitaufwendige ELISA-Methoden, deren
Durchführung mehrere Stunden in Anspruch nimmt.
Ein weiterer möglicher Parameter zur Detektion einer ak
tivierten Gerinnung ist lösliches Fibrin. Alle bisher
verfügbaren Nachweisverfahren für lösliches Fibrin sind
mit gravierenden Mängeln behaftet, die ihren Einsatz in
der Routine Diagnostik schwierig oder sehr aufwendig gestalten.
Verfahren, die lösliches Fibrin anhand seiner
physikalischen Stoffeigenschaften nachweisen, zum Bei
spiel durch Präzipitation oder Chromatographie sind unge
nau und für die Routinediagnostik nur schlecht automati
sierbar.
Die turbidimetrische Messung von löslichem Fibrin durch
Agglutination von Latex Partikeln (EP-A1 0 139 885) ist
zwar sensitiv und automatisierbar, basiert jedoch auf un
spezifischer Absorption, die durch andere Plasmaproteine
gestört werden kann. Ein weiteres Verfahren beruht auf
der Steigerung der katalytischen Aktivität von tissue-
type Plasminogenaktivator (t-PA) in Anwesenheit von Fi
brin. Der wesentliche Nachteil dieses Verfahrens besteht
jedoch in seiner Unspezifität, da die enzymatische Akti
vität von t-PA auch durch Fibrinogen stimuliert wird.
Dies stellt vor allem deshalb ein Problem dar, weil viele
Krankheitsbilder, bei denen die Bestimmung von löslichem
Fibrin von diagnostischer Bedeutung ist, im Rahmen einer
Akut-Phase-Reaktion mit einem Anstieg der Plasma Fibrino
gen Konzentration einher gehen, wie zum Beispiel Venen
entzündungen, Sepsis, instabile Angina pectoris, akuter
Myokardinfarkt oder der Schlaganfall.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue zu
verlässige und automatisierbare Methode zur Messung von
löslichem Fibrin als frühem diagnostischen Parameter zur
Diagnose von präthrombotischen Zuständen, bereitzustel
len, die auf einer spezifischen biochemischen Reaktion
beruht, die aber nicht durch Anwesenheit von Fibrinogen
gestört wird.
Die Aufgabe wird durch Verfahren zur Bestimmung von lös
lichem Fibrin gelöst, wobei man die zu untersuchende
Plasmaprobe mit einem Plasminogenaktivator der Desmodus-
Speichel-Plasminogen-Aktivatoren-Familie (DSPA) inku
biert.
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, daß man die zu untersu
chende Plasmaprobe weiterhin in der Gegenwart eines für
Plasminogenaktivatoren spezifischen chromogenen Substrats
inkubiert und man die Menge an löslichem Fibrin mittels
Messung des abgespaltenen Chromophors bestimmt.
Erfindungsgemäß vorteilhaft ist es, daß das für Plasmino
genaktivatoren spezifische chromogene Substrat CH3SO2-D-
HHT-Gly-Arg-p-Nitroanilinacetat oder Bz-Ile-Glu-(γ-OR)-
Gly-Arg-pNA oder H-D-Ile-Pro-Arg-pNA-Hydrochlorid oder
pyroGlu-Gly-Arg-pNA-Hydrochlorid ist.
Es ist erfindungsgemäß besonders bevorzugt, daß der Plas
minogenaktivator der Desmodus-Speichel-Plasminogen-
Aktivatoren-Familie aus DSPA alpha 1, alpha 2, beta, gam
ma oder bat-PA ausgewählt ist.
Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, daß man die zu
untersuchende Plasmaprobe in der Gegenwart von Plasmino
gen, einem neutralisierenden Antikörper gegen alpha 2 An
tiplasmin sowie eines für Plasmin spezifischen chromoge
nen Substrats inkubiert.
Vorteilhaft ist es, daß das Plasminogen Glu-Plasminogen
ist.
Vorteilhaft ist ferner, daß man einen neutralisierenden
Antikörper gegen alpha 2 Antiplasmin Verwendet.
Vorteilhaft ist gleichermaßen, daß das für Plasmin spezi
fische chromogene Substrat L-Pyroglutamyl-L-Phenylalanyl-
L-Lysin-p-Nitroanilinhydrochlorid oder H-D-Val-Leu-Lys-
pNA-Hydrochlorid oder H-D-Ile-Pro-Arg-pNA-Hydrochlorid
oder H-D-Pro-Phe-Arg-pNA-Hydrochlorid oder pyroGlu-Pro-
Arg-pNA-Hydrochlorid oder H-D-val-Phe-Lys-pNA-
Hydrochlorid oder H-D-Ala-HHT-Lys-pNA ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist vorteilhaft zur Be
stimmung von löslichem Fibrin zum Nachweis präthromboti
scher und thrombotischer Zustände, zur Risikovorhersage
bei disseminierter intravasaler Koagulopathie sowie
Thrombosen bei prothetischen Herzklappen und funktionel
len cardiac assist Systemen und zur Überwachung antikoa
gulatorischer Therapien.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist
ein Testbesteck zur erfindungsgemäßen Durchführung des
Verfahrens zur Bestimmung von löslichem Fibrin bestehend
aus:
- a) dem Untersuchungsmaterial bestehend aus Vollblut oder Plättchen freiem Plasma, welches mit Zitrat oder EDTA an tikoaguliert ist,
- b) Plasminogenaktivatoren der Desmodus-Speichel- Plasminogen-Aktivator-Familie,
- c) Plasminogen als Substrat für DSPA,
- d) einem neutralisierenden Antikörper gegen alpha 2 Anti plasmin und
- e) Chromogenen Substraten, welche spezifisch durch den Plasminogenaktivator oder durch Plasmin spaltbar sind.
Erfindungsgemäß ist die Verwendung des erfindungsgemäßen
Testbestecks zum Nachweis präthrombotischer und thrombo
tischer Zustände, zur Risikovorhersage bei disseminierter
intravasaler Koagulopathie sowie Thrombosen bei protheti
schen Herzklappen und funktionellen cardiac assist Syste
men und zur Überwachung antikoagulatorischer Therapien.
Die Aufgabe wird also dadurch gelöst, daß ein Plasmino
genaktivator aus der Familie der Desmodus Speichel Plasminogenaktivatoren
(Krätzschmar J, Haendler B, Langer G,
Boidol W, Bringmann P, Alagon A, Donner P Schleuning WD.
The plasminogen activator family from the salivary gland
of the vampir bat Desmodus rotundus: cloning and expres
sion. Gene, 1991; 105: 229-237) verwandt wird, um in ei
ner zu untersuchenden Blut- oder Plasmaprobe die Menge an
löslichem Fibrin zu bestimmen.
Die Erfindung betrifft somit ein neues Verfahren zur
quantitativen Messung von löslichem Fibrin in Plasma, das
auf der selektiven, spezifischen Stimulation der kataly
tischen Aktivität des Plasminogenaktivators DSPA durch
Fibrin auch in Anwesenheit von Fibrinogen und dem damit
verbundenen Umsatz eines chromogenen Substrats durch DSPA
selbst oder durch Plasmin beruht. Der Plasminogenaktiva
tor aus dem Speichel der Vampir Fledermaus (Desmodus ro
tundus) Desmodus salivary plasminogen activator ist nur
in Anwesenheit von Fibrin aktiv. Die Aktivierung des
Plasminogenaktivators und der Umsatz des chromogenen
Substrates sind direkt der Menge an löslichem Fibrin pro
portional.
Erfindungsgemäß wurde das Messverfahren so optimiert, daß
es auf einem modernen Analyse-Automaten etabliert werden
kann. Die Plasmaprobe wird 1 : 10 mit einem Tris-HCL Puffer
verdünnt und mit einem Desmodus Speichel Plasminogenakti
vator versetzt.
Gemessen wird der fibrinstimulierte Umsatz eines chromo
genen Substrates für den Plasminogenaktivator direkt oder
zur Signalverstärkung für Plasmin, das Fibrin-abhängig
aus Plasminogen entsteht. Im zweiten Verfahren muß der
im Plasma enthaltene Plasmin Inhibitor *2-Antiplasmin in
aktiviert werden, zum Beispiel durch Zugabe eines neutra
lisierenden Antikörper. Die Quantifizierung des löslichen
Fibrins erfolgt dann auch durch Spaltung eines chromogenen
Substrates wie zum Beispiel L-Pyroglutamyl-L-
Phenylalanyl-L-Lysine-p-Nitroanilinhydrochlorid.
Messungen von löslichem Fibrin mit diesem neuen Testver
fahren in humanem mit Hemokomplettan substituierten Plas
ma haben gezeigt, daß DSPA wie erwartet eine größere Spe
zifität für Stimulation seiner katalytischen Aktivität
durch Fibrin in Anwesenheit von Fibrinogen besitzt als
Tissue-type Plasminogenaktivator. Darüber hinaus hat sich
überraschenderweise auch gezeigt, daß das neue Testver
fahren weniger störanfällig gegenüber Plasminogenaktiva
tor Inhibitor 1 ist.
Das erfindungsgemäße Testbesteck besteht aus:
- a) dem Untersuchungsmaterial bestehend aus Vollblut oder Plättchen freiem Plasma, die entweder mit Zitrat oder EDTA antikoaguliert wurden,
- b) Plasminogenaktivatoren der Desmodus Speichel Plasmino genaktivator Familie, wie zum Beispiel DSPA alpha 1, al pha 2, beta, gamma, oder bat-PA (Gardell SJ et al. Iso lation, characterization and cDNA cloning of a Vampire bat salivary plasminogen activator. (1989) J Biol Chem 264: 17947-17952),
- c) Plasminogen als Substrat für DSPA, zum Beispiel Glu- Plasminogen,
- d) einem neutralisierenden Antikörper gegen alpha 2 Anti plasmin, zum Beispiel Rabbit anti-human Alpha 2 antiplas min #A0303,
- e) Chromogene Substrate, welche entweder spezifisch durch den Plasminogenaktivator, wie zum Beispiel CH3SO2- HHT.Gly-Arg-p-Nitroanilinacetat oder durch Plasmin, wie zum Beispiel L-Pyroglutamyl-L-Phenylalanyl-L-Lysine-p- Nitroanilinhydrochlorid gespalten werden.
Das Wesen der Erfindung liegt in einer Kombination be
kannter Elemente und neuer Lösungswege, die sich gegenseitig
beeinflussen und in ihrer neuen Gesamtwirkung ei
nen Gebrauchsvorteil und den erstrebten Erfolg ergeben,
der darin liegt, daß nunmehr eine neue zuverlässige Me
thode zur Messung von löslichem Fibrin und damit ein Ver
fahren zur frühen Diagnose präthrombotischer Zustände,
bereitgestellt wird.
Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen er
läutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu
sein.
Lösliches Fibrin (DesaFib) wird in einer Konzentration
von 4 mg/ml in Aqua ad injectionem gelöst. Humanes Zi
tratplasma wird zur Erstellung einer Kalibrationskurve
mit ansteigenden Mengen DesaFib-X von 1,25 µg/ml, 2,5 µg/ml,
5 µg/ml, 10 µg/ml, 20 µg/ml und 40 µg/ml ge
mischt. Diese Proben werden nochmals mit Puffer (0,1 M
Tris-HCL pH 8,0, 0,02% Triton X 100 (v/v)) im Verhältnis
1 : 10 verdünnt. 25 µl verdünnte Probe werden mit 50 µl Rea
genzienlösung (Glu-Plasminogen 0,075 g/l, 0,1 M Tris-HCL
pH 8,0, 0,02% Triton X 100 (v/v)) und 25 µl polyklonalem
Rabbit anti-human Alpha 2 antiplasmin Antiserum gemischt.
Es erfolgt dann die Zugabe von 50 µl DSPA Lösung (0,067 g/l)
und eine Inkubation bei 37°C für 10 Minuten. Die Re
aktion wird durch Zugabe von 50 µl Substratlösung (S2403,
Chromogenix, 0,6 M Arginin 2 M KCl pH 8,2) gestartet. Zur
Bestimmung der Reaktionsrate [mOD/min] wird die Absorpti
on bei 405 nm nach 5 und 10 min gemessen (Fig. 1).
Pool Plasma (Preciclot) wird mit Haemocomplettan
(gereinigtes humanes Fibrinogen, daß einen geringen An
teil an löslichem Fibrin enhält) in aufsteigenden Mengen
(0 mg/dl, 62,5 mg/dl, 125 mg/dl, 250 mg/dl, 500 mg/dl)
versetzt. Diese Proben werden nochmals mit Puffer (0,1 M
Tris-HCL pH 8,0, 0,02% Triton X 100 (v/v)) im Verhältnis
1 : 10 verdünnt. 25 µl verdünnte Probe werden mit 50 µl Rea
genzienlösung (Glu-Plasminogen 0,075 g/l, 0,1 M Tris-HCL
pH 8,0, 0,02% Triton X 100 (v/v)) und 25 µl polyklonalem
Rabbit anti-human Alpha 2 antiplasmin Antiserum gemischt.
Es erfolgt dann die Zugabe von 50 µl DSPA Lösung (5 µg/ml)
oder 50 µl t-PA (5 µg/ml) und eine Inkubation bei
37°C für 10 Minuten. Die Reaktion wird durch Zugabe von
50 µl Substratlösung (S2403, Chromogenix, 0,6 M Arginin 2 M
KCl pH 8,2) gestartet. Zur Bestimmung der Reaktionsrate
[mOD/min] wird die Absorption bei 405 nm nach 5 und 10 min
gemessen (Fig. 2). Der deutlich höhere OD-Anstieg
der mit t-PA gemessenen Proben zeigt, daß auch in diesem
Assay DSPA eine größere Fibrinspezifität besitzt als t-
PA. Dies erlaubt in den folgenden Anwendungsbeispielen
den Einsatz höherer Konzentrationen von DSPA zum Nachweis
von löslichem Fibrin.
Effekte von Heparin und Polybren auf den Fibrin-Nachweis
mit DSPA:
Haemocomplettan (Centeon) ist eine lyophilisierte Präpa
ration von Fibrinogen. Es enthält zu circa 1% Gewichts
prozent lösliches Fibrin. Haemocomplettan wird in einer
Konzentration von 100 mg/ml in Aqua ad injectionem gelöst.
Um vergleichbare Proben mit einem reproduzierbaren
Anteil an löslichem Fibrin zu erhalten, wird humanes Zi
trat-Plasma, in diesem Beispiel Fresh-Frozen-Plasma, mit
aufsteigenden Konzentrationen (0 mg/dl, 125 mg/dl, 250 mg/dl,
500 mg/dl Haemocomplettan) dieser Stammlösung sub
stituiert. Der Einfluß von Heparin auf das neue Verfahren
zur Messung von löslichem Fibrin wird untersucht, indem
das Plasma zusätzlich noch mit unterschiedlichen Heparin
konzentration von 0 bis 3 internationalen Einheiten pro
ml versetzt wird. Auf einem Analysenautomaten, zum Bei
spiel ein Cobas Fara, wird das folgende Messprotokoll
programmiert: 2,5 µl Plasmaprobe werden mit 22,5 µl Puf
fer (0,1 M Tris-HCL pH 8,0, 0,02% Triton X 100 (v/v))
verdünnt. Es werden dann 75 µl Reagenzienlösung (2 Volu
men Anteile Glu-Plasminogen 0,075 g/l, 1 volumen Anteil
Rabbit anti-human Alpha 2 antiplasmin Antikörper, 0,1 M
Tris-HCL pH 8,0, 0,02% Triton X 100 (v/v)) hinzu pipet
tiert. Es erfolgt dann die Zugabe von 50 µl DSPA Lösung
(0,067 g/l) und eine Inkubation bei 37°C für 10 Minuten.
Die Reaktion wird durch Zugabe von 50 µl Substratlösung
(S2403, Chromogenix, 0,6 M Arginin 2 M KCl pH 8,2) ge
startet. Es werden insgesamt 15 Messungen im Abstand von
20 Sekunden durchgeführt. Die Berechnung der Konzentrati
on erfolgt an Hand einer Kalibrationskurve. Es wird, wie
in Fig. 3 dargestellt, deutlich, daß es in Anwesenheit
von Heparin zu einer starken Abnahme des Meßsignals
kommt, die bei hohen Konzentrationen von löslichem Fibrin
dosis-abhängig zu sein scheint.
Antagonisierung der Heparineffekte durch Polybren:
Um die Möglichkeit zu untersuchen, die durch Heparin her
vorgerufene Abnahme des Meßsignals durch Zugabe von Poly
bren zu antagonisieren, wurden die Plasmaproben wie oben
beschrieben mit löslichem Fibrin in der Form des Haemo
complettans und Heparin versehen.
Im automatisierten Messprotokoll wurde der Verdünnungs
puffer für die Proben durch einen Polybren-(0,13%) halti
gen Trispuffer ersetzt. Das restliche Protokoll wurde wie
oben bereits beschrieben durchgeführt.
2,5 µl Plasmaprobe werden mit 22,5 µl Puffer (0,1 M Tris-
HCL pH 8,0, 0,02% Triton X 100 (v/v), Polybren 0,13%
(w/v)) verdünnt. Es werden dann 75 µl Reagenzienlösung (2
Volumemanteile Glu-Plasminogen 0,075 g/l, 1 Volumenanteil
Rabbit anti-human Alpha 2 antiplasmin Antikörper, 0,1 M
Tris-HCL pH 8,0, 0,02% Triton X 100 (v/v), Polybren 0,13%
(w/v)) hinzu pipettiert. Es erfolgt dann die Zugabe von
50 µl DSPA Lösung (0,067 g/l) und eine Inkubation bei
37°C für 10 Minuten. Die Reaktion wird durch Zugabe von
50 µl Substratlösung (S2403, Chromogenix, 0,6 M Arginin 2
M KCl pH 8,2) gestartet. Es werden insgesamt 15 Messungen
im Abstand von 20 Sekunden durchgeführt. Die Berechnung
der Konzentration erfolgt an Hand einer Kalibrationskur
ve.
Die Heparin vermittelte Signalabnahme konnte durch die in
diesem Assay benutzte Polybrenkonzentration von (0,13%)
aufgehoben werden (Fig. 4).
Claims (11)
1. Verfahren zur Bestimmung von löslichem Fibrin, wobei
man die zu untersuchende Plasmaprobe mit einem Plas
minogenaktivator der Desmodus-Speichel-Plasminogen-
Aktivatoren-Familie (DSPA) inkubiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man die zu untersuchende Plasmaprobe weiterhin in
der Gegenwart eines für Plasminogenaktivatoren spezi
fischen chromogenen Substrats inkubiert und man die
Menge an löslichem Fibrin mittels Messung des abge
spaltenen Chromophors bestimmt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn
zeichnet, daß der Plasminogenaktivator der Desmodus-
Speichel-Plasminogen-Aktivatoren-Familie aus DSPA al
pha 1, alpha 2, beta, gamma oder bat-PA ausgewählt
ist.
4. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende
Plasmaprobe in der Gegenwart von Plasminogen, einem
neutralisierenden Antikörper gegen alpha 2 Antiplas
min sowie eines für Plasmin spezifischen chromogenen
Substrats inkubiert.
5. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß das Plasminogen Glu-
Plasminogen ist.
6. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß man einen neutralisieren
den Antikörper gegen alpha 2 Antiplasmin verwendet.
7. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß das für Plasminogenakti
vatoren spezifische chromogene Substrat CH3SO2-D-HHT-
Gly-Arg-p-Nitroanilinacetat oder Bz-Ile-Glu-(γ-OR)-
Gly-Arg-pNA oder H-D-Ile-Pro-Arg-pNA-Hydrochlorid
oder pyroGlu-Gly-Arg-pNA-Hydrochlorid ist.
6. Verfahren nach gemäß einem der voranstehenden Ansprü
che, dadurch gekennzeichnet, daß für Plasmin spezifi
sche chromogene Substrat L-Pyroglutamyl-L-
Phenylalanyl-L-Lysin-p-Nitroanilinhydrochlorid oder
H-D-Val-Leu-Lys-pNA-Hydrochlorid oder H-D-Ile-Pro-
Arg-pNA-Hydrochlorid oder H-D-Pro-Phe-Arg-pNA-
Hydrochlorid oder pyroGlu-Pro-Arg-pNA-Hydrochlorid
oder H-D-Val-Phe-Lys-pNA-Hydrochlorid oder H-D-Ala-
HHT-Lys-pNA ist.
9. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche zum
Nachweis präthrombotischer und thrombotischer Zustän
de, zur Risikovorhersage bei disseminierter intrava
saler Koagulopathie sowie Thrombosen bei protheti
schen Herzklappen und funktionellen cardiac assist
Systemen und zur Überwachung antikoagulatorischer
Therapien.
10. Testbesteck zur Bestimmung von löslichem Fibrin be
stehend aus:
- a) dem Untersuchungsmaterial bestehend aus Vollblut oder Plättchen freiem Plasma, welches mit Zitrat oder EDTA antikoaguliert ist,
- b) Plasminogenaktivatoren der Desmodus-Speichel- Plasminogen-Aktivator-Familie,
- c) Plasminogen als Substrat für DSPA,
- d) einem neutralisierenden Antikörper gegen alpha 2 Antiplasmin und
- e) Chromogenen Substraten, welche spezifisch durch den Plasminogenaktivator oder durch Plasmin spaltbar sind.
11. Verwendung des Testbestecks nach Anspruch 10 zum
Nachweis präthrombotischer und thrombotischer Zustän
de, zur Risikovorhersage bei disseminierter intrava
saler Koagulopathie sowie Thrombosen bei protheti
schen Herzklappen und funktionellen cardiac assist
Systemen und zur Überwachung antikoagulatorischer
Therapien.
Priority Applications (3)
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