JP2899430B2 - 安定化されたヒルディンのスルホネ−ト、サルフェ−ト、ホスホネ−ト、及びホスフェ−ト誘導体 - Google Patents
安定化されたヒルディンのスルホネ−ト、サルフェ−ト、ホスホネ−ト、及びホスフェ−ト誘導体Info
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- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Description
【産業上の利用分野】本発明は抗凝固剤として有用な新
規なペプチドに関する。
規なペプチドに関する。
【従来の技術】抗凝固剤は、薬理学的処理、例えば急性
の深部静脈血栓、肺塞栓症、急性の四肢の動脈塞栓、心
筋梗塞、及び伝染性静脈内凝固の治療に有用である。抗
凝固剤の予防的な投与は、リウマチ性又は動脈硬化性の
心臓病を有する患者の塞栓症の再発の防止及び手術によ
るある種の血栓塞栓合併症の防止をすると信じられてい
る。抗凝固剤の投与は又冠状動脈及び脳血管病の治療に
有用であることが示されている。静脈血栓、特に心臓筋
肉及び脳に供給している動脈中のものは死亡の主要な原
因である。ヒルディン(Hirudin)は、蛭の唾液腺から単
離された65残基のポリペプチドである。それはトロンビ
ンに特異的な阻害剤である抗凝固剤である。これは非常
に強力であるが蛭抽出物から単離されたヒルディンの臨
床的な使用は、限られた量、高価であること、及びこの
寸法のあらゆる外来の蛋白質の投与に続いて一般的にお
きるアレルギ−反応のために出来そうもないことであ
る。本発明者は以前に抗凝固活性に寄与しているヒルデ
ィンの特異的な領域を発見した。この領域は化学的に合
成され、その類似体の或るものはトロンビンの認識場所
に結合するようだが、空間的に分離されている酵素開裂
場所には結合しない。この合成ペプチドの結合は、フィ
ブリンの生産及び凝血形成に前提条件となるトロンビン
認識場所に、フィブリノ−ゲンが結合することを競走的
に防止する。これらの前に報告された式X−A1−A2−
A3−A4−A5−A6−A7−A8−A9−A10−Yのペプ
チドは、有意義な抗凝固活性を有している。上式中Xは
水素、1〜6個の炭素原子の1又は2個のアルキル基、2〜1
0個の炭素原子の1又は2個のアシル基、カルボベンジロ
キシ又はt-ブトキシカルボニルから選ばれるアミノ末端
残基であり、A1は、結合又は任意のアミノ酸の1〜11の
残基を含有しているペプチドであり、A2は、Phe、SubP
he、β-(2-及び3-チエニル)アラニン、β-(2-及び3-フ
ラニル)アラニン、β-(2-、3-及び4-ピリジル)アラニ
ン、β-(ベンゾチエニル-2-及び3-イル)アラニン、β-
(1-及び2-ナフチル)アラニン、Tyr又はTrpであり、A3
は、Glu又はAspであり、A4は、任意のアミノ酸であ
り、A5は、Ile、Val、Leu、Nle、又はPheであり、A6
は、Pro、Hyp、3,4-デヒドロPro、チアゾリジン-4-カル
ボキシレ−ト、Sar、NMePgl、又はD-Alaであり、A
7は、任意のアミノ酸であり、A8は、任意のアミノ酸で
あり、A9は、Tyr、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、Ch
a、及びProから選ばれる親油性アミノ酸であるか、又は
これらの親油性アミノの少なくとも一つを含有している
ジペプチドであり、A10は、結合、又は1〜5個の任意の
アミノ酸残基を含有しているペプチド断片であり、Yは
OH、C1〜C6アルコキシ、アミノ、モノ又はジ(C1〜C4)
アルキル置換アミノ、又はベンジルアミノから選ばれる
カルボキシ末端残基である。
の深部静脈血栓、肺塞栓症、急性の四肢の動脈塞栓、心
筋梗塞、及び伝染性静脈内凝固の治療に有用である。抗
凝固剤の予防的な投与は、リウマチ性又は動脈硬化性の
心臓病を有する患者の塞栓症の再発の防止及び手術によ
るある種の血栓塞栓合併症の防止をすると信じられてい
る。抗凝固剤の投与は又冠状動脈及び脳血管病の治療に
有用であることが示されている。静脈血栓、特に心臓筋
肉及び脳に供給している動脈中のものは死亡の主要な原
因である。ヒルディン(Hirudin)は、蛭の唾液腺から単
離された65残基のポリペプチドである。それはトロンビ
ンに特異的な阻害剤である抗凝固剤である。これは非常
に強力であるが蛭抽出物から単離されたヒルディンの臨
床的な使用は、限られた量、高価であること、及びこの
寸法のあらゆる外来の蛋白質の投与に続いて一般的にお
きるアレルギ−反応のために出来そうもないことであ
る。本発明者は以前に抗凝固活性に寄与しているヒルデ
ィンの特異的な領域を発見した。この領域は化学的に合
成され、その類似体の或るものはトロンビンの認識場所
に結合するようだが、空間的に分離されている酵素開裂
場所には結合しない。この合成ペプチドの結合は、フィ
ブリンの生産及び凝血形成に前提条件となるトロンビン
認識場所に、フィブリノ−ゲンが結合することを競走的
に防止する。これらの前に報告された式X−A1−A2−
A3−A4−A5−A6−A7−A8−A9−A10−Yのペプ
チドは、有意義な抗凝固活性を有している。上式中Xは
水素、1〜6個の炭素原子の1又は2個のアルキル基、2〜1
0個の炭素原子の1又は2個のアシル基、カルボベンジロ
キシ又はt-ブトキシカルボニルから選ばれるアミノ末端
残基であり、A1は、結合又は任意のアミノ酸の1〜11の
残基を含有しているペプチドであり、A2は、Phe、SubP
he、β-(2-及び3-チエニル)アラニン、β-(2-及び3-フ
ラニル)アラニン、β-(2-、3-及び4-ピリジル)アラニ
ン、β-(ベンゾチエニル-2-及び3-イル)アラニン、β-
(1-及び2-ナフチル)アラニン、Tyr又はTrpであり、A3
は、Glu又はAspであり、A4は、任意のアミノ酸であ
り、A5は、Ile、Val、Leu、Nle、又はPheであり、A6
は、Pro、Hyp、3,4-デヒドロPro、チアゾリジン-4-カル
ボキシレ−ト、Sar、NMePgl、又はD-Alaであり、A
7は、任意のアミノ酸であり、A8は、任意のアミノ酸で
あり、A9は、Tyr、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、Ch
a、及びProから選ばれる親油性アミノ酸であるか、又は
これらの親油性アミノの少なくとも一つを含有している
ジペプチドであり、A10は、結合、又は1〜5個の任意の
アミノ酸残基を含有しているペプチド断片であり、Yは
OH、C1〜C6アルコキシ、アミノ、モノ又はジ(C1〜C4)
アルキル置換アミノ、又はベンジルアミノから選ばれる
カルボキシ末端残基である。
【発明が解決しようとする課題】前に報告したペプチド
の所望の治療活性を保持しつつ、トロンビンに対するよ
り大きな親和性、及び/又は、代謝分解に対するより大
きな安定性を有する修正ペプチドを提供することは有意
義である。
の所望の治療活性を保持しつつ、トロンビンに対するよ
り大きな親和性、及び/又は、代謝分解に対するより大
きな安定性を有する修正ペプチドを提供することは有意
義である。
【課題を解決する手段】出願人は新しい類の修正ペプチ
ドを発見した。これは前に報告したペプチドの所望の治
療活性を保持するが、トロンビンに対するより大きな親
和性、及び/又は、代謝分解に対するより大きな安定性
を有する。 式 X−A1−A2−A3−A4−A5−A6−A7−A8−A9−A10−Y 1 〔式中Xは水素、1〜6個の炭素原子の1又は2個のアルキ
ル基、2〜10個の炭素原子の1又は2個のアシル基、カル
ボベンジロキシ又はt-ブトキシカルボニルから選ばれる
アミノ末端残基であり、A1は、結合、任意のアミノ酸
の1〜11個の残基を含有しているペプチド、又はA1'で
あり、A2は、Phe、SubPhe、β-(2-及び3-チエニル)ア
ラニン、β-(2-及び3-フラニル)アラニン、β-(2-、3-
及び4-ピリジル)アラニン、β-(ベンゾチエニル-2-及び
3-イル)アラニン、β-(1-及び2-ナフチル)アラニン、Ty
r、Trp、又はA2'であり、A3は、Glu、Asp又はA3'で
あり、A4は、任意のアミノ酸又はA4'であり、A5は、
Ile、Val、Leu、Nle、又はPheであり、A6は、Pro、Hy
p、3,4-デヒドロPro、チアゾリジン-4-カルボキシレ−
ト、Sar、NMePgl、又はD-Alaであり、A7は、任意のア
ミノ酸又はA7'であり、A8は、任意のアミノ酸又は
A8'であり、A9は、Tyr、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、V
al、Cha及びProから選ばれる親油性アミノ酸であるか、
又はこれらの親油性アミノの少なくとも一つを含有して
いるジペプチドであるか、又はA9'であり、A10は、結
合、又は任意のアミノ酸の1〜5個の残基を含有している
ペプチド断片であるか、A10'であるか、又は残基の一
つがA10'である1〜5個の任意のアミノ酸の残基を含有
するペプチド断片であり、YはOH、(C1〜C6)アルコキ
シ、アミノ、モノ又はジ(C1〜C4)アルキル置換アミノ、
又はベンジルアミノから選択されるカルボキシ末端残基
であり、A1'は構造式
ドを発見した。これは前に報告したペプチドの所望の治
療活性を保持するが、トロンビンに対するより大きな親
和性、及び/又は、代謝分解に対するより大きな安定性
を有する。 式 X−A1−A2−A3−A4−A5−A6−A7−A8−A9−A10−Y 1 〔式中Xは水素、1〜6個の炭素原子の1又は2個のアルキ
ル基、2〜10個の炭素原子の1又は2個のアシル基、カル
ボベンジロキシ又はt-ブトキシカルボニルから選ばれる
アミノ末端残基であり、A1は、結合、任意のアミノ酸
の1〜11個の残基を含有しているペプチド、又はA1'で
あり、A2は、Phe、SubPhe、β-(2-及び3-チエニル)ア
ラニン、β-(2-及び3-フラニル)アラニン、β-(2-、3-
及び4-ピリジル)アラニン、β-(ベンゾチエニル-2-及び
3-イル)アラニン、β-(1-及び2-ナフチル)アラニン、Ty
r、Trp、又はA2'であり、A3は、Glu、Asp又はA3'で
あり、A4は、任意のアミノ酸又はA4'であり、A5は、
Ile、Val、Leu、Nle、又はPheであり、A6は、Pro、Hy
p、3,4-デヒドロPro、チアゾリジン-4-カルボキシレ−
ト、Sar、NMePgl、又はD-Alaであり、A7は、任意のア
ミノ酸又はA7'であり、A8は、任意のアミノ酸又は
A8'であり、A9は、Tyr、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、V
al、Cha及びProから選ばれる親油性アミノ酸であるか、
又はこれらの親油性アミノの少なくとも一つを含有して
いるジペプチドであるか、又はA9'であり、A10は、結
合、又は任意のアミノ酸の1〜5個の残基を含有している
ペプチド断片であるか、A10'であるか、又は残基の一
つがA10'である1〜5個の任意のアミノ酸の残基を含有
するペプチド断片であり、YはOH、(C1〜C6)アルコキ
シ、アミノ、モノ又はジ(C1〜C4)アルキル置換アミノ、
又はベンジルアミノから選択されるカルボキシ末端残基
であり、A1'は構造式
【化25】 {式中nは1〜2の整数であり、R1、R2、及びR3はそ
れぞれ独立に水素及びメチル基から選択され、X'は−
NH−、−O−、又は−S−基であるか又は結合であ
り、Y'は−SO3H又は−PO3H2基であり、そしてZ
は結合であるか、−NH−、−N(C1−C4アルキル)−
基、又は(C1−C4)アルキル基である}の基であり、A
2'は構造式
れぞれ独立に水素及びメチル基から選択され、X'は−
NH−、−O−、又は−S−基であるか又は結合であ
り、Y'は−SO3H又は−PO3H2基であり、そしてZ
は結合であるか、−NH−、−N(C1−C4アルキル)−
基、又は(C1−C4)アルキル基である}の基であり、A
2'は構造式
【化26】 {式中R1とR2はそれぞれ独立に水素又はメチル基であ
り、X'は−NH−、−O−、又は−S−基であるか又
は結合であり、Y'は−SO3H又は−PO3H2基であ
る}の基であり、A3'及びA4'はそれぞれ独立に構造式
り、X'は−NH−、−O−、又は−S−基であるか又
は結合であり、Y'は−SO3H又は−PO3H2基であ
る}の基であり、A3'及びA4'はそれぞれ独立に構造式
【化27】 {式中nは1〜3の整数であり、R1とR2はそれぞれ独立
に水素及びメチル基から選択され、X'は−NH−、−
O−、又は−S−基であるか又は結合であり、Y'は−
SO3H又は−PO3H2基である}の基であり、A7'と
A8'はそれぞれ独立に構造式
に水素及びメチル基から選択され、X'は−NH−、−
O−、又は−S−基であるか又は結合であり、Y'は−
SO3H又は−PO3H2基である}の基であり、A7'と
A8'はそれぞれ独立に構造式
【化28】 {式中nは1〜3の整数であり、R1、R2、及びR3はそ
れぞれ独立に水素及びメチル基から選択され、X'は−
NH−、−O−、又は−S−基であるか又は結合であ
り、Y'は−SO3H又は−PO3H2基である}の基であ
り、A9'は構造式
れぞれ独立に水素及びメチル基から選択され、X'は−
NH−、−O−、又は−S−基であるか又は結合であ
り、Y'は−SO3H又は−PO3H2基である}の基であ
り、A9'は構造式
【化29】 {式中R1とR2はそれぞれ独立に水素又はメチル基であ
り、Mは結合であるか、式
り、Mは結合であるか、式
【化30】 のうちの一つの基であり、X'は−NH−、−O−、又
は結合であり、Y'は−SO3H又は−PO3H2基であ
る}の基であり、A10'はA1'、A2'、A3'、A4'、
A7'、A8'及びA9'からなる群から選択される任意の一
員であるが、但し、A1、A2、A3、A4、A7、A8、A
9及びA10の少なくとも一つはそれぞれA1'、A2'、
A3'、A4'、A7'、A8'、A9'及びA10'からなる群か
ら選択されることを、更にA9'がThr(SO3H)であるとき
はA1、A2、A3、A4、A7、A8及びA10の少なくとも
一つはそれぞれA1'、A2'、A3'、A4'、A7'、A8'及
びA10'からなる群から選択されることを条件とする〕
のペプチド誘導体又は製薬上受入れられるその酸付加塩
は有用な抗凝固剤である。次の一般的なアミノ酸の略号
がこの明細書を通じて使用される。 Gly − グリシン Ala − アラニン Val − バリン Leu − ロイシン Ile − イソロイシン Cha − シクロヘキシルアラニン、 Orn − オルニチン Pro − プロリン Phe − フェニルアラニン Trp − トリプトファン Met − メチオニン Ser − セリン Thr − スレオニン Cys − システイン Tyr − チロシン Asn − アスパラギン Gln − グルタミン Asp − アスパラギン酸 Glu − グルタミン酸 Lys − リジン Arg − アルギニン His − ヒスチジン Nle − ノルロイシン Hyp − ヒドロキシプロリン Glt − グルタリル Mal − マレイル Npa − β-(2-ナフチル)アラニン、 3,4-デヒドロPro−3,4-デヒドロプロリン、 Tyr(SO3H) − チロシンサルフェ−ト、 Pgl − フェニルグリシン、 NMePgl − N-メチルフェニルグリシン、 Sar − サルコシン(N-メチルグリシン)、 pSubPhe − パラ置換フェニルアラニン、 SubPhe − オルソ、メタ又はパラ、モノ又はジ
置換フェニルアラニン、 DAla − D-アラニン、 Ac − アセチル、 Suc − サクシニル、 pClPhe − パラクロロフェニルアラニン、 Pnh − p-アミノフェニルアラニン、 Pno − パラニトロフェニルアラニン、 アルキル基及びアルコキシ基のアルキル部分は直鎖、分
枝鎖、又は環状のアルキル基を含むものとし、例えば、
メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イ
ソブチル、第三ブチル、ペンチル、イソペンチル、第二
ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、
シクロヘキシル及びシクロペンチルメチルである。2〜1
0個の炭素原子のアシル基は、直鎖、分枝鎖、環状、飽
和及び不飽和の、基当たり1〜2個のカルボニル基を有す
るアシル基を含むものとし、例えば、アセチル、ベンゾ
イルサクシニル、マレイル及びグルタリルである。ハロ
ゲン基はフルオロ、クロロ、ブロモ又はヨ−ド基であ
る。「任意のアミノ酸」という用語は、本明細書では、
天然のアミノ酸、並びに、天然のペプチドの合成類似体
を製造するときにペプチド化学技術で一般的に使用され
る他の「非蛋白」α-アミノ酸を含む。天然のアミノ酸
はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシ
ン、セリン、メチオニン、スレオニン、フェニルアラニ
ン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリ
ン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グル
タミン酸、グルタミン、アルギニン、オルニチン、及び
リジンである。又「非蛋白」α-アミノ酸の例は、ノル
ロイシン、ノルバリン、アロイソロイシン、ホモアルギ
ニン、チアプロリン、デヒドロプロリン、ヒドロキシプ
ロリン(Hyp)、ホモセリン、シクロヘキシルグリシン
(Chg)、α-アミノ-n-酪酸(Aba)、シクロヘキシルア
ラニン(Cha)、アミノフェニル酪酸(Pba); フェニル
部分のオルソ、メタ、又はパラ位置で、次の(C1〜C4)ア
ルキル、(C1〜C4)アルコキシ、ハロゲン、又はニトロ基
の一又は二個で、又はメチレンジオキシ基で置換され
た、モノ又はジ置換されているフェニルアラニン;β-2
-及び3-チエニルアラニン、β-2-及び3-フラニルアラニ
ン、β-2-,3-及び4-ピリジルアラニン、β-(ベンゾチエ
ニル-2-及び3-イル)アラニン、β-(1-及び2-ナフチル)-
アラニン; セリン、スレオニン、又はチロシンのO-ア
ルキル化誘導体、S-アルキル化システイン、チロシンの
O-サルフェ−トエステル、3,5-ジヨ−ドチロシン、及び
天然のアミノ酸のD-異性体である。「親油性のアミノ
酸」という用語には、Tyr、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、
His及びProが含まれる。グリシンを例外として天然のア
ミノ酸は不斉炭素原子を含有する。他に特定的に示され
ていない限り、本明細書で述べられる光学活性アミノ酸
はL-立体配置である。例えば、A1又はA10基の任意の
アミノ酸はD-又はL-立体配置であり得る。慣例にしたが
って本明細書で記載されるペプチドの構造はアミノ末端
が鎖の左側、カルボキシ末端が鎖の右側であるように記
載される。本発明のペプチド誘導体は各々構成アミノ酸
側鎖の一つ又は二つの上に、負に荷電した基、即ちA1'
A2'A3'A4'A7'A8'A9'A10'の側鎖を有する。勿論
本発明の化合物は静電的に中性でなければならない。従
って、ペプチド誘導体の電荷を中和するように、正に荷
電した対イオンが各分子の負に荷電したペプチド誘導体
と関連していなければならない。任意の正に荷電した種
が負に荷電したペプチド誘導体を中和出来るが、出願人
は製薬上受入れられる陽イオン、即ち所望の効果を達成
するのに投与される投与量で実質的に毒性が無く、独立
して有意義な薬理活性を有しない陽イオンだけを考えに
いれている。例えば、これらの塩にはアルカリ金属、例
えばナトリウム及びカリウム、アルカリ土類金属例えば
カルシウム及びマグネシウム、アルミニウムを含めたII
IA属の軽金属、有機第一級、第二級、及び第三級アミ
ン、例えばトリエチルアミンを含めたトリアルキルアミ
ン、プロカイン、ジベンジルアミン、1-エタナミン、N,
N'-ジベンジルエチルエタナミン、ジヒドロアビエチル
アミン、N-(低級)アルキルピペリジン、及び任意の他の
適当なアミンとのものが含まれる。ナトリウム塩が好ま
しい。式1のポリペプチドは任意の無毒性の有機又は無
機酸と製薬上受け入れられる塩を形成できる。適当な塩
を形成する無機酸の例には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、
燐酸、及び酸金属塩、例えばオルト燐酸一水素ナトリウ
ム及び硫酸水素カリウムが含まれる。適当な塩を形成す
る有機酸の例にはモノ、ジ及びトリカルボン酸が含まれ
る。そのような酸の例には、例えば酢酸、グリコ−ル
酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル
酸、フマ−ル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコ
ルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香
酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、桂皮酸、サリ
チル酸、2-フェノキシ安息香酸及びスルホン酸、例えば
メタンスルホン酸及び2-ヒドロキシエタンスルホン酸が
含まれる。カルボキシ末端アミノ酸の塩には任意の適当
な無機又は有機塩基と形成される無毒のカルボン酸塩が
含まれる。化合物の任意の一般基がそうであるようにあ
る基が好ましい。本発明者は式1のペプチド誘導体であ
ってXが水素、アセチル、又はサクシニルであるものが
好ましいと考える。また、A1が結合、又は A2がPhe、β-2-及び3-チエニルアラニン、Tyr、Trp、N
pa、pClPhe又はA2'であり、A3がGlu、A3'であり、A
4がGlu、Asp、Pro、Ala又はA4'であり、A5がIle、Leu
であり、A6がPro、Sar、D-Ala、Hyp又はNMePglであ
り、A7がGlu、Gln、Asp、Ala又はA7'であり、A8がGl
u、Asp、Ala又はA8'であり、A9が、Cha、Pro、Ala-Ty
r、Ala-Cha、Tyr-Cha、Tyr-Leu、Ala-Phe、Tyr-Tyr又は
A9'であり、ここでA9'がPhe(pNHSO3H)であり、A
10が、Glu、Asn、Asp-Glu、Pro、Gln、Ala、結合、D-Ly
s、Lys、D-Asp、Orn、又はA10'であり、Yが、OH又はN
H2であるものが好ましい。特に好ましいのは、式1のペ
プチド誘導体であってXがアセチルでありかつA1がGly
-Asp又はAspであるか、又はXがSucでありかつA1が結
合であり、ここでA2がTyr、又はA2'、(ただしA2'は
Tyr(SO3H)又はPhe(pNHSO3H))A3がGlu、A4がGlu又はP
ro、A5がIle、A6がPro、A7がGlu、A8がGlu又はAl
a、A9がAla、Cha、A9'又はAla-A9'であり、ここでA
9'がPhe(pNHSO3H)であるもの、A10がD-Glu、そしてY
がOH又はNH2であるものである。本発明のペプチドは当
業者に容易に知られ得る種々の手順で製造できる。その
ような手順には固相連続及びブロック合成、遺伝子クロ
−ニング及びこれらの技術の組み合わせが含まれる。固
相連続手順は自動化されたペプチド合成機の使用による
など確立された自動方法を用いて実施できる。この手順
に於いてα−アミノ保護アミノ酸は樹脂支持体に結合さ
れる。使用される樹脂支持体は、慣用的にこの技術でポ
リペプチドの固相合成に用いられる任意の適当な樹脂で
あり得、好ましくは0.5〜約3%のジビニルベンゼンで架
橋されているポリスチレンで、クロロメチル化又はヒド
ロキシメチル化のいずれかがされていて、最初に導入さ
れるαアミノ保護アミノ酸とエステル形成の場所が与え
られているものである。ヒドロキシメチル樹脂の例はボ
ダンスキ−等、Chem. Ind. (London) 38,1597-98 (196
6)に記載されている。クロロメチル化樹脂はバイオ ラ
ド ラボラトリ−、カリフォルニア州、リッチモンドか
ら市販されており、そのような樹脂の製造はスチュワ−
ト等、「固相ペプチド合成」(フリ−マン アンド カン
パニ−、サンフランシスコ 1969)1章、1〜6頁に記載さ
れている。保護されたアミノ酸はギシン、Helv. Chem.
Acta, 56, 1476 (1973)の手順によって樹脂に結合でき
る。多くの樹脂結合保護アミノ酸が市販されている。例
としてカルボキシ末端がThr残基である本発明のポリペ
プチドを製造するには、第三級ブチルオキシカルボニル
(Boc)保護Thrであって、ベンジル化されたヒドロキシ
メチル化されたフェニルアセタミドメチル(PAM)樹脂
に結合されたものを使用出来、これは市販されている。
α-アミノ保護アミノ酸を樹脂支持体に結合した後に保
護基を任意の適当な手順、例えば塩化メチレン中のトリ
フルオロ酢酸、トリフルオロ酢酸のみ、又はジオキサン
中のHClを使用することによって除去される。脱保護は0
℃から室温の間の温度で実施される。特定のα-アミノ
保護基の除去のための他の標準の開裂試薬及び条件を使
用できる。α-アミノ保護基の除去の後、他のアミノ保
護アミノ酸を所望の順序で段階的に結合する。別の方法
として複数のアミノ酸基を樹脂支持アミノ酸配列と結合
する前に溶液方法で結合することが出来る。ポリペプチ
ド配列に導入される各アミノ酸とともに使用するアミノ
保護基は、任意のこの技術で知られた保護基であり得
る。α-アミノ保護基の類の内、考慮に入れられている
ものは(1)アシル型保護基、例えばホルミル、トリフ
ルオロアセチル、フタリル、トルエンスルホニル(tosy
l)、ベンゼンスルホニル、ニトロフェニルスルフェニ
ル、トリチルスルフェニル、o-ニトロフェノキシアセチ
ル及びα-クロロブチリル、(2)芳香族ウレタン型保
護基、例えばベンジロキシカルボニル及び置換ベンジロ
キシカルボニル、例えばp-クロロベンジルオキシカルボ
ニル、p-ニトロベンジル-カルボニル、p-ブロモベンジ
ルオキシカルボニル、p-メトキシベンジルオキシカルボ
ニル、1-(p-ビフェニリル)-1-メチルエトキシカルボニ
ル、α,α-ジメチル-3,5-ジメトキシベンジロキシカル
ボニル及びベンズヒドロキシカルボニル、(3)脂肪族
ウレタン保護基、例えば第三ブチルオキシカルボニル
(Boc)、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロ
ピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル及びアリロ
キシカルボニル、(4)シクロアルキルウレタン型保護
基、例えばシクロペンチロキシカルボニル、アダマンチ
ロキシカルボニル及びシクロヘキロキシカルボニル、
(5)チオウレタン型保護基、例えばフェニルチオカル
ボニル、(6)アルキル型保護基、例えばトリフェニル
メチル(トリチル)及びベンジル、及び(7)トリアル
キルシラン基、例えばトリメチルシランである。好まし
いα-アミノ保護基は第三ブチルオキシカルボニルであ
る。適当な結合剤の選択は、当業者の行い得る範囲内の
ものである。加えられるべきアミノ酸がGln、Asn又はAr
gであるときに特に適した結合剤はN,N'-ジイソプロピル
カルボジイミド及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾ−ルで
ある。これらの試薬の使用はニトリル及びラクタムの形
成を防止する。他の結合剤は(1)カルボジイミド類
(例えば、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド及びN
-エチル-N'-(γ-ジメチルアミノプロピルカルボジイミ
ド))、(2)シアナミド類(例えば、N,N-ジベンジル
シアナミド)、(3)ケテンイミン類、(4)イソキサ
ゾリウム塩(例えば、N-エチル-5-フェニル-イソキサゾ
リウム-3'-スルフォネ−ト)、(5)1〜4個の窒素原子
を環中に含む芳香族性の単環式窒素含有複素環アミド、
例えばイミダゾリド類、ピラゾリド類、及び1,2,4-トリ
アゾリド類である。有用な特定の複素環アミド類にはN,
N'-カルボニルジイミダゾ−ル及びN,N-カルボニル-ジ-
1,2,4-トリアゾ−ル、(6)アルコキシ化アセチレン
(例えば、エトキシアセチレン)、(7)アミノ酸のカル
ボニル部分と混合無水物を形成する試薬(例えば、エチ
ルクロロホルメ−ト及びイソブチルクロロホルメ−ト)
又は結合されるべきアミノ酸の対称的な無水物(例え
ば、Boc-Ala-O-Ala-Boc)及び(8)一つの環窒素上に
ヒドロキシル基を有する窒素含有複素環化合物(例え
ば、N-ヒドロキシフタルイミド、N-ヒドロキシコハク酸
イミド及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾ−ル)である。
他の活性化試薬及びペプチド結合に於けるそれらの用途
は、カプ−ル,J. Pharm. Sci.,59,1-27頁(1970)に
より記載されている。本発明者等は結合試薬として対称
無水物を使用するのがArg、Asn及びGln以外の全てのア
ミノ酸に対し好ましいと考えている。各々の保護された
アミノ酸又はアミノ酸配列は、約4倍の過剰で固相反応
器に導入されカップリングをジメチルホルムアミド対塩
化メチレン(1:1)の媒体中又はジメチルホルムアミド単
独の中、又は好ましくは塩化メチレン単独の中で実施す
る。不完全なカップリングが生じた場合には、カップリ
ング手順を固相反応器中の次のアミノ酸のカップリング
の前にα-アミノ保護基の除去前に繰り返す。合成の各
段階に於けるカップリング反応の成功はイ−.カイザ−
等,Analyt. Biochem. 34,595(1970)により記載され
るニンヒドリン反応によってモニタ−する。 所望のア
ミノ酸配列が得られた後にペプチドを樹脂から除去す
る。これは加水分解、例えば樹脂結合ポリペプチドを希
弗化水素酸中のジメチルスルフィド、p-クレゾ−ル、及
びチオクレゾ−ルの溶液で処理することによって成し得
る。固相ペプチド合成の技術で知られているように、ア
ミノ酸の多くは鎖製造の間に保護を必要とする官能基を
有している。適当な保護基の使用及び選択は、当業者の
能力の範囲内であり、保護されるべきアミノ酸及びペプ
チド上の他の保護されたアミノ酸残基の存在に依存す
る。そのような側鎖保護基の選択は、α-アミノ部分の
保護基の開裂の間に、開裂によって除去されないもので
なければならないという点で臨界的である。例えば、リ
ジンに対する適した側鎖保護基はベンジロキシカルボニ
ル及び置換ベンジロキシカルボニルであり、この置換基
はハロ(例えばクロロ、ブロモ、フルオロ)及びニト
ロ、(例えば2-クロロベンジロキシカルボニル、p-ニト
ロベンジロキシカルボニル、3,4-ジクロロベンジロキシ
カルボニル)、トシル、t-アミロキシカルボニル、t-ブ
チロキシカルボニル及びジイソプロピルメトキシカルボ
ニルである。スレオニンとセリンのアルコ−ル性ヒドロ
キシル基は、アセチル、ベンゾイル、第三ブチル、トリ
チル、ベンジル、2,6-ジクロロベンジル、又はベンジロ
キシカルボニル基で保護できる。好ましい保護基はベン
ジルである。これらの基はこの分野で良く知られた手順
で除去できる。典型的には保護基の除去はペプチド鎖が
完了した後になしうるが、保護基は任意の他の適当な時
間に除去できる。ホスホリル化を準備する手順はエル.
オトバス ジュニア等、Int. J. Pept. Protein Res. 3
4: 129-133(1989); ジェ−.ダブリュ.ペリッチ等、Te
t. Lett. 27:1377-1380(1986);ジェ−.ダブリュ.ペリ
ッチ等、Tet. Lett. 27:1373-1376(1986)で知られてい
る。サルフェ−トを製造する方法はティ−.ナカハラ
等、Anal.Bio. Chem. 154: 193-199(1986)及びジェ−.
マルティネズ等、J. Med. Chem. 25: 589-593(1982)で
知られている。S-サルフェ−トを製造する手順はア−
ル.ディ−.コ−ル、Met. Enzymol. 11:206(1967)で知ら
れている。本発明のアルコ−ルペプチド誘導体の抗凝固
投与量は、治療されるべき患者血栓症状のひどさ、及び
選ばれるペプチド誘導体に依存し、一日当たり患者体重
キログラム当たり0.2mg〜250mgである。特定の患者に対
する適当な投与量は容易に決定され得る。好ましくは1
〜4回の毎日の投与がなされ典型的には投与当たり5mg〜
100mgの活性化合物が投与される。抗凝固療法は種々の
血栓症状、特に冠状動脈及び脳血管病の処置及び予防に
示唆されている。この分野で経験を積んだ者は、抗凝固
療法を要求するような状況に容易に気がつく。本明細書
で使用する「患者」という用語は、哺乳類、例えば人を
含めた霊長類、羊、馬、牛、豚、犬、猫、ラット及びマ
ウスを意味するものとする。ペプチド誘導体の幾つかは
経口投与の後腸を通過してもこわれないままであり得る
が、本発明者は非経口投与、例えば皮下、静脈内、筋肉
内又は腹腔内投与、デポ−注射による投与、移植製剤に
よる投与又は粘膜への適用、例えば鼻、喉及び気管支に
対する適用、例えば本発明のペプチド誘導体をスプレ−
又は乾燥粉末形で含有しているエロゾルの缶に於ける投
与が好ましいと考えている。化合物の非経口投与は、表
面活性剤及び他の製薬上受け入れられる助剤の添加有り
又は無しで、水又は油の様な滅菌液体であり得る製薬担
体と共に生理学的に受け入れられる希釈剤中の化合物の
溶液又は懸濁液の注射可能な投与物として投与され得
る。これらの製剤中で使用できる油の例は石油、動物、
植物、又は合成起源のもの、例えばピ−ナツ油、大豆
油、及び鉱油である。一般に、水、塩水、デキストロ−
ス水溶液及び関連糖溶液、エタノ−ル及びグリコ−ル
類、例えばプロピレングリコ−ル又はポリエチレングリ
コ−ルが好ましい液体担体で、特に注射溶液に良い。化
合物は、デポ−注射又は移植製剤の形態で投与すること
が出来、これらは活性成分の持続放出を可能とするよう
な方法で処方され得る。活性成分は、ペレット又は小シ
リンダ−形に圧縮され皮下又は筋肉内にデポ−注射又は
移植片として移植される。移植片は生物分解可能な重合
体又は合成シリコン、例えばシラスチック、即ちダウ-
コ−ニング コ−ポレ−ションにより製造されたシリコ
ンゴムなどの不活性物質を使用することが出来る。
は結合であり、Y'は−SO3H又は−PO3H2基であ
る}の基であり、A10'はA1'、A2'、A3'、A4'、
A7'、A8'及びA9'からなる群から選択される任意の一
員であるが、但し、A1、A2、A3、A4、A7、A8、A
9及びA10の少なくとも一つはそれぞれA1'、A2'、
A3'、A4'、A7'、A8'、A9'及びA10'からなる群か
ら選択されることを、更にA9'がThr(SO3H)であるとき
はA1、A2、A3、A4、A7、A8及びA10の少なくとも
一つはそれぞれA1'、A2'、A3'、A4'、A7'、A8'及
びA10'からなる群から選択されることを条件とする〕
のペプチド誘導体又は製薬上受入れられるその酸付加塩
は有用な抗凝固剤である。次の一般的なアミノ酸の略号
がこの明細書を通じて使用される。 Gly − グリシン Ala − アラニン Val − バリン Leu − ロイシン Ile − イソロイシン Cha − シクロヘキシルアラニン、 Orn − オルニチン Pro − プロリン Phe − フェニルアラニン Trp − トリプトファン Met − メチオニン Ser − セリン Thr − スレオニン Cys − システイン Tyr − チロシン Asn − アスパラギン Gln − グルタミン Asp − アスパラギン酸 Glu − グルタミン酸 Lys − リジン Arg − アルギニン His − ヒスチジン Nle − ノルロイシン Hyp − ヒドロキシプロリン Glt − グルタリル Mal − マレイル Npa − β-(2-ナフチル)アラニン、 3,4-デヒドロPro−3,4-デヒドロプロリン、 Tyr(SO3H) − チロシンサルフェ−ト、 Pgl − フェニルグリシン、 NMePgl − N-メチルフェニルグリシン、 Sar − サルコシン(N-メチルグリシン)、 pSubPhe − パラ置換フェニルアラニン、 SubPhe − オルソ、メタ又はパラ、モノ又はジ
置換フェニルアラニン、 DAla − D-アラニン、 Ac − アセチル、 Suc − サクシニル、 pClPhe − パラクロロフェニルアラニン、 Pnh − p-アミノフェニルアラニン、 Pno − パラニトロフェニルアラニン、 アルキル基及びアルコキシ基のアルキル部分は直鎖、分
枝鎖、又は環状のアルキル基を含むものとし、例えば、
メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イ
ソブチル、第三ブチル、ペンチル、イソペンチル、第二
ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、
シクロヘキシル及びシクロペンチルメチルである。2〜1
0個の炭素原子のアシル基は、直鎖、分枝鎖、環状、飽
和及び不飽和の、基当たり1〜2個のカルボニル基を有す
るアシル基を含むものとし、例えば、アセチル、ベンゾ
イルサクシニル、マレイル及びグルタリルである。ハロ
ゲン基はフルオロ、クロロ、ブロモ又はヨ−ド基であ
る。「任意のアミノ酸」という用語は、本明細書では、
天然のアミノ酸、並びに、天然のペプチドの合成類似体
を製造するときにペプチド化学技術で一般的に使用され
る他の「非蛋白」α-アミノ酸を含む。天然のアミノ酸
はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシ
ン、セリン、メチオニン、スレオニン、フェニルアラニ
ン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリ
ン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グル
タミン酸、グルタミン、アルギニン、オルニチン、及び
リジンである。又「非蛋白」α-アミノ酸の例は、ノル
ロイシン、ノルバリン、アロイソロイシン、ホモアルギ
ニン、チアプロリン、デヒドロプロリン、ヒドロキシプ
ロリン(Hyp)、ホモセリン、シクロヘキシルグリシン
(Chg)、α-アミノ-n-酪酸(Aba)、シクロヘキシルア
ラニン(Cha)、アミノフェニル酪酸(Pba); フェニル
部分のオルソ、メタ、又はパラ位置で、次の(C1〜C4)ア
ルキル、(C1〜C4)アルコキシ、ハロゲン、又はニトロ基
の一又は二個で、又はメチレンジオキシ基で置換され
た、モノ又はジ置換されているフェニルアラニン;β-2
-及び3-チエニルアラニン、β-2-及び3-フラニルアラニ
ン、β-2-,3-及び4-ピリジルアラニン、β-(ベンゾチエ
ニル-2-及び3-イル)アラニン、β-(1-及び2-ナフチル)-
アラニン; セリン、スレオニン、又はチロシンのO-ア
ルキル化誘導体、S-アルキル化システイン、チロシンの
O-サルフェ−トエステル、3,5-ジヨ−ドチロシン、及び
天然のアミノ酸のD-異性体である。「親油性のアミノ
酸」という用語には、Tyr、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、
His及びProが含まれる。グリシンを例外として天然のア
ミノ酸は不斉炭素原子を含有する。他に特定的に示され
ていない限り、本明細書で述べられる光学活性アミノ酸
はL-立体配置である。例えば、A1又はA10基の任意の
アミノ酸はD-又はL-立体配置であり得る。慣例にしたが
って本明細書で記載されるペプチドの構造はアミノ末端
が鎖の左側、カルボキシ末端が鎖の右側であるように記
載される。本発明のペプチド誘導体は各々構成アミノ酸
側鎖の一つ又は二つの上に、負に荷電した基、即ちA1'
A2'A3'A4'A7'A8'A9'A10'の側鎖を有する。勿論
本発明の化合物は静電的に中性でなければならない。従
って、ペプチド誘導体の電荷を中和するように、正に荷
電した対イオンが各分子の負に荷電したペプチド誘導体
と関連していなければならない。任意の正に荷電した種
が負に荷電したペプチド誘導体を中和出来るが、出願人
は製薬上受入れられる陽イオン、即ち所望の効果を達成
するのに投与される投与量で実質的に毒性が無く、独立
して有意義な薬理活性を有しない陽イオンだけを考えに
いれている。例えば、これらの塩にはアルカリ金属、例
えばナトリウム及びカリウム、アルカリ土類金属例えば
カルシウム及びマグネシウム、アルミニウムを含めたII
IA属の軽金属、有機第一級、第二級、及び第三級アミ
ン、例えばトリエチルアミンを含めたトリアルキルアミ
ン、プロカイン、ジベンジルアミン、1-エタナミン、N,
N'-ジベンジルエチルエタナミン、ジヒドロアビエチル
アミン、N-(低級)アルキルピペリジン、及び任意の他の
適当なアミンとのものが含まれる。ナトリウム塩が好ま
しい。式1のポリペプチドは任意の無毒性の有機又は無
機酸と製薬上受け入れられる塩を形成できる。適当な塩
を形成する無機酸の例には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、
燐酸、及び酸金属塩、例えばオルト燐酸一水素ナトリウ
ム及び硫酸水素カリウムが含まれる。適当な塩を形成す
る有機酸の例にはモノ、ジ及びトリカルボン酸が含まれ
る。そのような酸の例には、例えば酢酸、グリコ−ル
酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル
酸、フマ−ル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコ
ルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香
酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、桂皮酸、サリ
チル酸、2-フェノキシ安息香酸及びスルホン酸、例えば
メタンスルホン酸及び2-ヒドロキシエタンスルホン酸が
含まれる。カルボキシ末端アミノ酸の塩には任意の適当
な無機又は有機塩基と形成される無毒のカルボン酸塩が
含まれる。化合物の任意の一般基がそうであるようにあ
る基が好ましい。本発明者は式1のペプチド誘導体であ
ってXが水素、アセチル、又はサクシニルであるものが
好ましいと考える。また、A1が結合、又は A2がPhe、β-2-及び3-チエニルアラニン、Tyr、Trp、N
pa、pClPhe又はA2'であり、A3がGlu、A3'であり、A
4がGlu、Asp、Pro、Ala又はA4'であり、A5がIle、Leu
であり、A6がPro、Sar、D-Ala、Hyp又はNMePglであ
り、A7がGlu、Gln、Asp、Ala又はA7'であり、A8がGl
u、Asp、Ala又はA8'であり、A9が、Cha、Pro、Ala-Ty
r、Ala-Cha、Tyr-Cha、Tyr-Leu、Ala-Phe、Tyr-Tyr又は
A9'であり、ここでA9'がPhe(pNHSO3H)であり、A
10が、Glu、Asn、Asp-Glu、Pro、Gln、Ala、結合、D-Ly
s、Lys、D-Asp、Orn、又はA10'であり、Yが、OH又はN
H2であるものが好ましい。特に好ましいのは、式1のペ
プチド誘導体であってXがアセチルでありかつA1がGly
-Asp又はAspであるか、又はXがSucでありかつA1が結
合であり、ここでA2がTyr、又はA2'、(ただしA2'は
Tyr(SO3H)又はPhe(pNHSO3H))A3がGlu、A4がGlu又はP
ro、A5がIle、A6がPro、A7がGlu、A8がGlu又はAl
a、A9がAla、Cha、A9'又はAla-A9'であり、ここでA
9'がPhe(pNHSO3H)であるもの、A10がD-Glu、そしてY
がOH又はNH2であるものである。本発明のペプチドは当
業者に容易に知られ得る種々の手順で製造できる。その
ような手順には固相連続及びブロック合成、遺伝子クロ
−ニング及びこれらの技術の組み合わせが含まれる。固
相連続手順は自動化されたペプチド合成機の使用による
など確立された自動方法を用いて実施できる。この手順
に於いてα−アミノ保護アミノ酸は樹脂支持体に結合さ
れる。使用される樹脂支持体は、慣用的にこの技術でポ
リペプチドの固相合成に用いられる任意の適当な樹脂で
あり得、好ましくは0.5〜約3%のジビニルベンゼンで架
橋されているポリスチレンで、クロロメチル化又はヒド
ロキシメチル化のいずれかがされていて、最初に導入さ
れるαアミノ保護アミノ酸とエステル形成の場所が与え
られているものである。ヒドロキシメチル樹脂の例はボ
ダンスキ−等、Chem. Ind. (London) 38,1597-98 (196
6)に記載されている。クロロメチル化樹脂はバイオ ラ
ド ラボラトリ−、カリフォルニア州、リッチモンドか
ら市販されており、そのような樹脂の製造はスチュワ−
ト等、「固相ペプチド合成」(フリ−マン アンド カン
パニ−、サンフランシスコ 1969)1章、1〜6頁に記載さ
れている。保護されたアミノ酸はギシン、Helv. Chem.
Acta, 56, 1476 (1973)の手順によって樹脂に結合でき
る。多くの樹脂結合保護アミノ酸が市販されている。例
としてカルボキシ末端がThr残基である本発明のポリペ
プチドを製造するには、第三級ブチルオキシカルボニル
(Boc)保護Thrであって、ベンジル化されたヒドロキシ
メチル化されたフェニルアセタミドメチル(PAM)樹脂
に結合されたものを使用出来、これは市販されている。
α-アミノ保護アミノ酸を樹脂支持体に結合した後に保
護基を任意の適当な手順、例えば塩化メチレン中のトリ
フルオロ酢酸、トリフルオロ酢酸のみ、又はジオキサン
中のHClを使用することによって除去される。脱保護は0
℃から室温の間の温度で実施される。特定のα-アミノ
保護基の除去のための他の標準の開裂試薬及び条件を使
用できる。α-アミノ保護基の除去の後、他のアミノ保
護アミノ酸を所望の順序で段階的に結合する。別の方法
として複数のアミノ酸基を樹脂支持アミノ酸配列と結合
する前に溶液方法で結合することが出来る。ポリペプチ
ド配列に導入される各アミノ酸とともに使用するアミノ
保護基は、任意のこの技術で知られた保護基であり得
る。α-アミノ保護基の類の内、考慮に入れられている
ものは(1)アシル型保護基、例えばホルミル、トリフ
ルオロアセチル、フタリル、トルエンスルホニル(tosy
l)、ベンゼンスルホニル、ニトロフェニルスルフェニ
ル、トリチルスルフェニル、o-ニトロフェノキシアセチ
ル及びα-クロロブチリル、(2)芳香族ウレタン型保
護基、例えばベンジロキシカルボニル及び置換ベンジロ
キシカルボニル、例えばp-クロロベンジルオキシカルボ
ニル、p-ニトロベンジル-カルボニル、p-ブロモベンジ
ルオキシカルボニル、p-メトキシベンジルオキシカルボ
ニル、1-(p-ビフェニリル)-1-メチルエトキシカルボニ
ル、α,α-ジメチル-3,5-ジメトキシベンジロキシカル
ボニル及びベンズヒドロキシカルボニル、(3)脂肪族
ウレタン保護基、例えば第三ブチルオキシカルボニル
(Boc)、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロ
ピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル及びアリロ
キシカルボニル、(4)シクロアルキルウレタン型保護
基、例えばシクロペンチロキシカルボニル、アダマンチ
ロキシカルボニル及びシクロヘキロキシカルボニル、
(5)チオウレタン型保護基、例えばフェニルチオカル
ボニル、(6)アルキル型保護基、例えばトリフェニル
メチル(トリチル)及びベンジル、及び(7)トリアル
キルシラン基、例えばトリメチルシランである。好まし
いα-アミノ保護基は第三ブチルオキシカルボニルであ
る。適当な結合剤の選択は、当業者の行い得る範囲内の
ものである。加えられるべきアミノ酸がGln、Asn又はAr
gであるときに特に適した結合剤はN,N'-ジイソプロピル
カルボジイミド及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾ−ルで
ある。これらの試薬の使用はニトリル及びラクタムの形
成を防止する。他の結合剤は(1)カルボジイミド類
(例えば、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド及びN
-エチル-N'-(γ-ジメチルアミノプロピルカルボジイミ
ド))、(2)シアナミド類(例えば、N,N-ジベンジル
シアナミド)、(3)ケテンイミン類、(4)イソキサ
ゾリウム塩(例えば、N-エチル-5-フェニル-イソキサゾ
リウム-3'-スルフォネ−ト)、(5)1〜4個の窒素原子
を環中に含む芳香族性の単環式窒素含有複素環アミド、
例えばイミダゾリド類、ピラゾリド類、及び1,2,4-トリ
アゾリド類である。有用な特定の複素環アミド類にはN,
N'-カルボニルジイミダゾ−ル及びN,N-カルボニル-ジ-
1,2,4-トリアゾ−ル、(6)アルコキシ化アセチレン
(例えば、エトキシアセチレン)、(7)アミノ酸のカル
ボニル部分と混合無水物を形成する試薬(例えば、エチ
ルクロロホルメ−ト及びイソブチルクロロホルメ−ト)
又は結合されるべきアミノ酸の対称的な無水物(例え
ば、Boc-Ala-O-Ala-Boc)及び(8)一つの環窒素上に
ヒドロキシル基を有する窒素含有複素環化合物(例え
ば、N-ヒドロキシフタルイミド、N-ヒドロキシコハク酸
イミド及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾ−ル)である。
他の活性化試薬及びペプチド結合に於けるそれらの用途
は、カプ−ル,J. Pharm. Sci.,59,1-27頁(1970)に
より記載されている。本発明者等は結合試薬として対称
無水物を使用するのがArg、Asn及びGln以外の全てのア
ミノ酸に対し好ましいと考えている。各々の保護された
アミノ酸又はアミノ酸配列は、約4倍の過剰で固相反応
器に導入されカップリングをジメチルホルムアミド対塩
化メチレン(1:1)の媒体中又はジメチルホルムアミド単
独の中、又は好ましくは塩化メチレン単独の中で実施す
る。不完全なカップリングが生じた場合には、カップリ
ング手順を固相反応器中の次のアミノ酸のカップリング
の前にα-アミノ保護基の除去前に繰り返す。合成の各
段階に於けるカップリング反応の成功はイ−.カイザ−
等,Analyt. Biochem. 34,595(1970)により記載され
るニンヒドリン反応によってモニタ−する。 所望のア
ミノ酸配列が得られた後にペプチドを樹脂から除去す
る。これは加水分解、例えば樹脂結合ポリペプチドを希
弗化水素酸中のジメチルスルフィド、p-クレゾ−ル、及
びチオクレゾ−ルの溶液で処理することによって成し得
る。固相ペプチド合成の技術で知られているように、ア
ミノ酸の多くは鎖製造の間に保護を必要とする官能基を
有している。適当な保護基の使用及び選択は、当業者の
能力の範囲内であり、保護されるべきアミノ酸及びペプ
チド上の他の保護されたアミノ酸残基の存在に依存す
る。そのような側鎖保護基の選択は、α-アミノ部分の
保護基の開裂の間に、開裂によって除去されないもので
なければならないという点で臨界的である。例えば、リ
ジンに対する適した側鎖保護基はベンジロキシカルボニ
ル及び置換ベンジロキシカルボニルであり、この置換基
はハロ(例えばクロロ、ブロモ、フルオロ)及びニト
ロ、(例えば2-クロロベンジロキシカルボニル、p-ニト
ロベンジロキシカルボニル、3,4-ジクロロベンジロキシ
カルボニル)、トシル、t-アミロキシカルボニル、t-ブ
チロキシカルボニル及びジイソプロピルメトキシカルボ
ニルである。スレオニンとセリンのアルコ−ル性ヒドロ
キシル基は、アセチル、ベンゾイル、第三ブチル、トリ
チル、ベンジル、2,6-ジクロロベンジル、又はベンジロ
キシカルボニル基で保護できる。好ましい保護基はベン
ジルである。これらの基はこの分野で良く知られた手順
で除去できる。典型的には保護基の除去はペプチド鎖が
完了した後になしうるが、保護基は任意の他の適当な時
間に除去できる。ホスホリル化を準備する手順はエル.
オトバス ジュニア等、Int. J. Pept. Protein Res. 3
4: 129-133(1989); ジェ−.ダブリュ.ペリッチ等、Te
t. Lett. 27:1377-1380(1986);ジェ−.ダブリュ.ペリ
ッチ等、Tet. Lett. 27:1373-1376(1986)で知られてい
る。サルフェ−トを製造する方法はティ−.ナカハラ
等、Anal.Bio. Chem. 154: 193-199(1986)及びジェ−.
マルティネズ等、J. Med. Chem. 25: 589-593(1982)で
知られている。S-サルフェ−トを製造する手順はア−
ル.ディ−.コ−ル、Met. Enzymol. 11:206(1967)で知ら
れている。本発明のアルコ−ルペプチド誘導体の抗凝固
投与量は、治療されるべき患者血栓症状のひどさ、及び
選ばれるペプチド誘導体に依存し、一日当たり患者体重
キログラム当たり0.2mg〜250mgである。特定の患者に対
する適当な投与量は容易に決定され得る。好ましくは1
〜4回の毎日の投与がなされ典型的には投与当たり5mg〜
100mgの活性化合物が投与される。抗凝固療法は種々の
血栓症状、特に冠状動脈及び脳血管病の処置及び予防に
示唆されている。この分野で経験を積んだ者は、抗凝固
療法を要求するような状況に容易に気がつく。本明細書
で使用する「患者」という用語は、哺乳類、例えば人を
含めた霊長類、羊、馬、牛、豚、犬、猫、ラット及びマ
ウスを意味するものとする。ペプチド誘導体の幾つかは
経口投与の後腸を通過してもこわれないままであり得る
が、本発明者は非経口投与、例えば皮下、静脈内、筋肉
内又は腹腔内投与、デポ−注射による投与、移植製剤に
よる投与又は粘膜への適用、例えば鼻、喉及び気管支に
対する適用、例えば本発明のペプチド誘導体をスプレ−
又は乾燥粉末形で含有しているエロゾルの缶に於ける投
与が好ましいと考えている。化合物の非経口投与は、表
面活性剤及び他の製薬上受け入れられる助剤の添加有り
又は無しで、水又は油の様な滅菌液体であり得る製薬担
体と共に生理学的に受け入れられる希釈剤中の化合物の
溶液又は懸濁液の注射可能な投与物として投与され得
る。これらの製剤中で使用できる油の例は石油、動物、
植物、又は合成起源のもの、例えばピ−ナツ油、大豆
油、及び鉱油である。一般に、水、塩水、デキストロ−
ス水溶液及び関連糖溶液、エタノ−ル及びグリコ−ル
類、例えばプロピレングリコ−ル又はポリエチレングリ
コ−ルが好ましい液体担体で、特に注射溶液に良い。化
合物は、デポ−注射又は移植製剤の形態で投与すること
が出来、これらは活性成分の持続放出を可能とするよう
な方法で処方され得る。活性成分は、ペレット又は小シ
リンダ−形に圧縮され皮下又は筋肉内にデポ−注射又は
移植片として移植される。移植片は生物分解可能な重合
体又は合成シリコン、例えばシラスチック、即ちダウ-
コ−ニング コ−ポレ−ションにより製造されたシリコ
ンゴムなどの不活性物質を使用することが出来る。
【実施例】本発明は、次の非限定実施例により説明され
る。実施例1 Suc-Tyr-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Pnh(SO3)-D-Glu-OH
の製造 0.5ミリモルの0.56mmol/g Boc-D-Glu(Bzl)メリフィ−ル
ド樹脂を用いて固相法によってペプチドSuc-Tyr-Pro-Il
e-Pro-Glu-Glu-Ala-Pno-D-Glu-OHが合成された。N-α-B
oc-ニトロフェニルアラニンの場合を除いて、2.0mモルN
-α-Boc-アミノ酸(ペプチドインタ−ナショナル)で二
重対称無水物カップリングが実行された。N-α-Boc-ニ
トロフェニルアラニンの場合にはDCC/HOBT法によって結
合された。用いられた側鎖保護はGlu(Bzl)、Tyr(2-BrZ)
であった。N-α-Bocの合成が完了したら保護を塩化メチ
レン中の50%トリフルオロ酢酸で除去した。ペプチドは
ジメチルホルムアミド中の無水コハク酸でN-末端キャッ
プされ、ジメチルホルムアミドで4回洗浄され、塩化メ
チレンで4回洗浄され、真空で乾燥された。ペプチドを
脱保護し、-5℃で45分間、5%アニソ−ルを含有している
無水HFで樹脂から開裂した。HFを真空で-5℃で除去
し、ペプチドを樹脂から50%水性アセトニトリル及び30%
水性酢酸で抽出し、そして凍結乾燥した。ペプチドをラ
イニンダイナマックス(Rainin Dynamax)21.4 x 250mm
C18カラム上で逆相HPLCによって0.1%水性トリフ
ルオロ酢酸緩衝液中で15分かけて、20〜23%アセトニト
リル線形勾配で精製した。0.1%水性トリフルオロ酢酸
緩衝液中で分あたり1%の15〜40%アセトニトリル線形
勾配で、分析用HPLCによってヴィダック(Vydac)2
18TP54カラム(4.6 x 250mm C18)上で純度をチェック
し、FABマススペクトル及びアミノ酸分析で同一性を
確認した。精製したペプチドのp-ニトロフェニルアラニ
ンを1時間アルゴン下で室温で、10%Pd/Cと無水メタ
ノ−ル中の乾燥蟻酸アンモニウムで、p-アミノフェニル
アラニンに還元した。触媒を瀘去し、溶媒を廻転蒸発器
上で室温で除去し、ペプチドを50%アセトニトリルに溶
解し、凍結乾燥した。ペプチドを15〜19%のアセトニト
リル線形勾配を用いて上の様に精製し、純度及び同一性
を確認した。乾燥したp-アミノフェニルペプチドを1時
間アルゴン下で室温で無水ピリジン及びジメチルホルム
アミド中の三酸化硫黄-ピリジン錯体で、p-スルホニル
アミノフェニルに転換した。反応を水で停止させ、飽和
炭酸ナトリウム溶液でpHを7に調節し、凍結乾燥した。
ペプチドをpH 6.0の10mモル酢酸アンモニウム緩衝液中
で15分間にわたって0〜10%のアセトニトリル勾配物
で、ライニンダイナマックス(Rainin Dynamax)21.4 x
250mm C18カラム上で逆相HPLCによって精製し
た。純粋なフラクションを一緒にし、凍結乾燥し、次に
脱イオン水中で2回再溶解し、凍結乾燥した。同定は分
析用HPLC、正及び負のイオンFAB−MS及びアミ
ノ酸分析で確認したが、サルフェ−トアミドが第一に破
壊される結合である場合には、正のFAB−MSではフ
ラグメント化はみることができなかった。プロトンNM
R及びUVスペクトルはp-アミノフェニルアラニンが硫
酸化されており、チロシン残基がそのままであったこと
を確認した。 実施例2〜8の化合物が同様に製造された。実施例2 Suc-Tyr(SO3H)-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Phe(pNHS
O3H)-D-Glu-OH 実施例3 Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(pNHSO3H)-D-Glu
-OH 実施例4 Suc-Phe(pNHSO3H)-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D
-Glu-OH 実施例5 Suc-Tyr(SO3H)-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Gl
u-OH 実施例6 Suc-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Tyr(SO3H)-D-Gl
u-OH 実施例7 Suc-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr(SO3H)-Leu-D-Gl
u-OH 実施例8 Suc-Tyr-Ser(SO3H)-Pro-Ile-Pro-Ser(SO3H)-Ser(SO3H)-
Ala-Cha-Ser(SO3H)-OH 実施例1〜8のペプチドの性質は以下の通りである。
る。実施例1 Suc-Tyr-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Pnh(SO3)-D-Glu-OH
の製造 0.5ミリモルの0.56mmol/g Boc-D-Glu(Bzl)メリフィ−ル
ド樹脂を用いて固相法によってペプチドSuc-Tyr-Pro-Il
e-Pro-Glu-Glu-Ala-Pno-D-Glu-OHが合成された。N-α-B
oc-ニトロフェニルアラニンの場合を除いて、2.0mモルN
-α-Boc-アミノ酸(ペプチドインタ−ナショナル)で二
重対称無水物カップリングが実行された。N-α-Boc-ニ
トロフェニルアラニンの場合にはDCC/HOBT法によって結
合された。用いられた側鎖保護はGlu(Bzl)、Tyr(2-BrZ)
であった。N-α-Bocの合成が完了したら保護を塩化メチ
レン中の50%トリフルオロ酢酸で除去した。ペプチドは
ジメチルホルムアミド中の無水コハク酸でN-末端キャッ
プされ、ジメチルホルムアミドで4回洗浄され、塩化メ
チレンで4回洗浄され、真空で乾燥された。ペプチドを
脱保護し、-5℃で45分間、5%アニソ−ルを含有している
無水HFで樹脂から開裂した。HFを真空で-5℃で除去
し、ペプチドを樹脂から50%水性アセトニトリル及び30%
水性酢酸で抽出し、そして凍結乾燥した。ペプチドをラ
イニンダイナマックス(Rainin Dynamax)21.4 x 250mm
C18カラム上で逆相HPLCによって0.1%水性トリフ
ルオロ酢酸緩衝液中で15分かけて、20〜23%アセトニト
リル線形勾配で精製した。0.1%水性トリフルオロ酢酸
緩衝液中で分あたり1%の15〜40%アセトニトリル線形
勾配で、分析用HPLCによってヴィダック(Vydac)2
18TP54カラム(4.6 x 250mm C18)上で純度をチェック
し、FABマススペクトル及びアミノ酸分析で同一性を
確認した。精製したペプチドのp-ニトロフェニルアラニ
ンを1時間アルゴン下で室温で、10%Pd/Cと無水メタ
ノ−ル中の乾燥蟻酸アンモニウムで、p-アミノフェニル
アラニンに還元した。触媒を瀘去し、溶媒を廻転蒸発器
上で室温で除去し、ペプチドを50%アセトニトリルに溶
解し、凍結乾燥した。ペプチドを15〜19%のアセトニト
リル線形勾配を用いて上の様に精製し、純度及び同一性
を確認した。乾燥したp-アミノフェニルペプチドを1時
間アルゴン下で室温で無水ピリジン及びジメチルホルム
アミド中の三酸化硫黄-ピリジン錯体で、p-スルホニル
アミノフェニルに転換した。反応を水で停止させ、飽和
炭酸ナトリウム溶液でpHを7に調節し、凍結乾燥した。
ペプチドをpH 6.0の10mモル酢酸アンモニウム緩衝液中
で15分間にわたって0〜10%のアセトニトリル勾配物
で、ライニンダイナマックス(Rainin Dynamax)21.4 x
250mm C18カラム上で逆相HPLCによって精製し
た。純粋なフラクションを一緒にし、凍結乾燥し、次に
脱イオン水中で2回再溶解し、凍結乾燥した。同定は分
析用HPLC、正及び負のイオンFAB−MS及びアミ
ノ酸分析で確認したが、サルフェ−トアミドが第一に破
壊される結合である場合には、正のFAB−MSではフ
ラグメント化はみることができなかった。プロトンNM
R及びUVスペクトルはp-アミノフェニルアラニンが硫
酸化されており、チロシン残基がそのままであったこと
を確認した。 実施例2〜8の化合物が同様に製造された。実施例2 Suc-Tyr(SO3H)-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Phe(pNHS
O3H)-D-Glu-OH 実施例3 Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(pNHSO3H)-D-Glu
-OH 実施例4 Suc-Phe(pNHSO3H)-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D
-Glu-OH 実施例5 Suc-Tyr(SO3H)-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Gl
u-OH 実施例6 Suc-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Tyr(SO3H)-D-Gl
u-OH 実施例7 Suc-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr(SO3H)-Leu-D-Gl
u-OH 実施例8 Suc-Tyr-Ser(SO3H)-Pro-Ile-Pro-Ser(SO3H)-Ser(SO3H)-
Ala-Cha-Ser(SO3H)-OH 実施例1〜8のペプチドの性質は以下の通りである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シモン ジェン タン マオ アメリカ合衆国 45140 オハイオ州 ラブランドケントンスラン コ−ト 9373 (56)参考文献 特開 昭63−215698(JP,A) (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C07K 14/815 A61K 38/58 C07K 7/06 CA(STN) EPAT(QUESTEL) REGISTRY(STN) WPI/L(QUESTEL)
Claims (9)
- 【請求項1】 Suc-Tyr-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Pnh(SO3H)-glu-OH、 Suc-Tyr(SO3H)-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Phe(pNHSO3H)-glu-OH、 Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(pNHSO3H)-glu-OH、 Suc-Phe(pNHSO3H)-Gle-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-glu-OH、 Suc-Tyr(SO3H)-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH、 Suc-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Tyr(SO3H)-D-Glu-OH、 Suc-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr(SO3H)-Leu-D-Glu-OH、及び Suc-Tyr-Ser(SO3H)-Pro-Ile-Pro-Ser(SO3H)-Ser(SO3H)-Ala-Cha-Ser(SO3H)-OH 、 からなる群から選択されるペプチド誘導体又は製薬上受
け入れられるその酸付加塩。 - 【請求項2】Suc-Tyr-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Pnh(SO
3H)-glu-OHである請求項1に記載のペプチド誘導体又は
製薬上受け入れられるその酸付加塩。 - 【請求項3】Suc-Tyr(SO3H)-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-
Ala-Phe(pNHSO3H)-glu-OHである請求項1に記載のペプ
チド誘導体又は製薬上受け入れられるその酸付加塩。 - 【請求項4】Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(pN
HSO3H)-glu-OHである請求項1に記載のペプチド誘導体
又は製薬上受け入れられるその酸付加塩。 - 【請求項5】Suc-Phe(pNHSO3H)-Gle-Pro-Ile-Pro-Glu-G
lu-Ala-Cha-glu-OHである請求項1に記載のペプチド誘
導体又は製薬上受け入れられるその酸付加塩。 - 【請求項6】Suc-Tyr(SO3H)-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-
Ala-Cha-D-Glu-OHである請求項1に記載のペプチド誘導
体又は製薬上受け入れられるその酸付加塩。 - 【請求項7】Suc-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Ty
r(SO3H)-D-Glu-OHである請求項1に記載のペプチド誘導
体又は製薬上受け入れられるその酸付加塩。 - 【請求項8】Suc-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr(SO
3H)-Leu-D-Glu-OHである請求項1に記載のペプチド誘導
体又は製薬上受け入れられるその酸付加塩。 - 【請求項9】Suc-Tyr-Ser(SO3H)-Pro-Ile-Pro-Ser(SO
3H)-Ser(SO3H)-Ala-Cha-Ser(SO3H)-OHである請求項1に
記載のペプチド誘導体又は製薬上受け入れられるその酸
付加塩。
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