JP2887848B2 - ゼアキサンチン及びゼアキサンチン含有組成物の製造 - Google Patents

ゼアキサンチン及びゼアキサンチン含有組成物の製造

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、フラボバクテリウム・ムルティボルム（Fl
avobacterium multivorum）種の微生物を使用したゼア
キサンチン（zeaxanthin）の製造、F. multivorumを培
養、及び醗酵させるための栄養培地、F. multivorumの
細胞粒子を含む組成物、更に本発明の微生物によって製
造されるゼアキサンチンを含有する組成物に関する。
発明の技術背景と要約 ゼアキサンチン（3,3′−ジヒドロキシ−β−カロテ
ン）はとうもろこし、卵黄、及び家禽の皮膚を黄色にす
るカロテノイドである。それは飼料添加物として、更に
化粧品及び食品産業において着色料として使用される。
本発明の方法に従って製造された精製ゼアキサンチ
ン、及びその色素を含有した細胞体は、食料品の着色、
または同様に化粧品の着色に使用することができる。特
に、その色素含有細胞体は家禽類の脚、くちばし、皮
膚、脂肪、肉及び卵黄の着色に適している。
ゼアキサンチンは、フラボバクテリウム（Flavobacte
rium）属に属する稀少の細菌種によって、生物学的に合
成される。このFlavobacterium種は、稀な例は別とし
て、全てのものが便宜上２つの種類、すなわち１）強力
なタンパク分解性（ゼラチン、カゼイン及び凝固した血
清を消化・分解する）を持つものと、２）非タンパク分
解性のものに分類される。F. meningosepticum（生物
型IIa）、及びF. indologenes（生物型IIb）は常にタ
ンパク分解性を持ち、他のフラボバクテリア（IIc,IIe,
IIh,IIi及びIIk−２）はタンパク分解性を持たない。F.
multivorumは、現在CDCのIIk−２グループ（非タンパ
ク分解性）のものとして認識されている３種類のうちの
一つである。
家禽飼育・生産者達にとって、特にマリーゴールドや
アルファルファから得えられるキサントフィル（xantho
phylls）についての安定性及び生物学的利用性に関する
問題には、長い歴史がある。それらの性質を評価し、改
良するために多くの仕事がなされている。ほとんどのマ
リーゴールド生産物は溶媒で抽出し、更にケン化しなく
てはならないが、その抽出工程において抗酸化剤の添加
を必要とする（Marusich and Bauerfeind,Carotenoids
As Colorants and Vitamin A Precursors;ed.,J.C.Baue
rfeind,Academic Press,1981）。実施例４で示す食餌実
験では直接、色素の既知量をマリーゴールドから数工程
を経て抽出された物と比較した。このデータから、本発
明の組成物は生物学的に利用性が高く、かつ安定なもの
であり、更に、色素精製物として比べて、マリーゴール
ドから得られるキサントフィルよりも着色速度が速く、
かつ着色度が２〜３倍強いものであることが示唆され
る。Flavobacterium種のうち幾種かのものが、ある培養
条件で及び／またはある種の栄養培地を使用することに
よって、ゼアキサンチンを生産することができると知ら
れている（関連文献項参照）。
さらに、また培地中に含まれる炭素量と窒素量が、実
質的に一定の比で保たれているような条件下で、Flavob
acterium属の培地として、グルコースと他の栄養分が必
要であるが、これらは比較的高価で経費がかかり、更に
培養に長い時間のかかるものである。
これに対し、本発明は、Flavobacterium multivorum
のゼアキサンチン産生微生物を培養することによる、ゼ
アキサンチンの製造方法を提供するものであり、この発
明によって初めて、このFlavobacterium種が色素を産生
することが示された。更に、その微生物を培養する栄養
培地は比較的低コストのものである。その上、公知方法
と比べて培養時間が極めて短く、より効率がよい。
従って、本発明の目的はFlavobacterium multivorum
株、またはそのミュータント（mutant）、もしくはバリ
アント（variant）を用いて、ゼアキサンチンを製造す
る方法を提供することである。本発明の方法によると、
公知微生物及び公知方法に劣らず、より大量のゼアキサ
ンチンを得ること、及びゼアキサンチンを含有する細胞
の細胞産生量を増加させることができる。
本発明のもう一つの目的は、生物学的に有用であるゼ
アキサンチン色素の産生量を増す方法を提供することで
ある。
本発明のもう一つの目的は、培養させ易く、生育が速
く、かつ非病原性の微生物を用いてゼアキサンチンを製
造する方法を提供することである。これらの微生物はま
た、多くの異なった炭素源を含む栄養培地を使用するこ
とができる。
本発明のもう一つの目的は、ゼアキサンチンの生産量
を最大限にし、高い細胞産生量、高いゼアキサンチンの
産生量を与えさらにはゼアキサンチン生産に必要な醗酵
時間を短縮する経済的でかつ、商業的な栄養培地を提供
することである。
別の目的は、ゼアキサンチンを生産する細菌を提供す
ることである。
さらに別の目的は、今までゼアキサンチンを生産する
とは知られていなかった微生物を提供することである。
以上の目的及び他事項に関しては、以下の発明の説
明、及び請求の範囲において明らかにする。
関連文献 米国特許3,891,504号で、ゼアキサンチン製造のため
の組成物、及び方法を開示している。２種類のFlavobac
terium株はATCC Nos.21588と21081として同定されてい
る。これらの菌株は栄養培地、それはグルコース、トリ
プトン及び酵母エキスを含んでいるのだが、この中で醗
酵されたのち、培養温度変更や色素促進剤（乳酸とパル
ミチン酸メチルエステル）を使用する工程へ導入され
た。
米国特許3,841,967号、3,951,742号、及び3,951,743
号では、βカロテン製造と類似の方法を用いたゼアキサ
ンチンの製造方法として、Flavobacterium株（ATCC No
s.21588,21081と11947）を使用することを開示されてい
る。この方法は、培地中の炭素／窒素含量比を常に一定
に保つために継続的に付加的な栄養分を与える以外は、
グルコースをバッチ供給した栄養培地中において、微生
物を生育させることを特徴とする。これらの特許明細書
はまた、大量の色素を生産する細菌株を単離するための
変異方法を開示する。これらのミュータントを用いた方
法は、ゼアキサンチンを高収率で製造することはできる
が、経済的ではない。
米国特許4,026,949号では、ゼアキサンチンのような
カロテノイドの製造において使用される光学活性な中間
体の製造について開示している。この方法で使用される
細菌はFlavobacterium dehydrogenansである。
発明の詳細な説明 本発明は、微生物、Flavobacterium multivorumを使
用するゼアキサンチンの製造に関するものであり、今ま
で本微生物がこの色素を生産するということは知られて
いなかった。本発明は、Flavobacterium multivorum細
胞の単離、及びゼアキサンチンが回収可能な量生産され
る条件で栄養培地中で当該細胞を培養することに関す
る。微生物細胞は醗酵培養液から分離され、バイオマス
（biomass）組成物として使用される。
従って、本発明はFlavobacterium multivorumを使用
するゼアキサンチンの製造方法、Flavobacterium mult
ivorum細胞、又は細胞粒子を含む組成物、及びFlavobac
terium multivorumによって製造されたゼアキサンチン
を含む組成物に関するものである。
本発明において、“Flavobacterium multivorum”な
る用語は、ゼアキサンチンを生産するFlavobacterium属
かつmultivorum種に属する全ての微生物を包含し、それ
らの継代培養体（ミュータントとバリアト）、及び実施
例又はBergey's Manual（1984年出版）に記載されてい
る細菌株と明確に区別できないもの全てをも含む。以下
に、F. multivorumの特徴を述べる。また、F. multiv
orum株AFB−44の分類に関しては参考例３に記述する。
本発明において、“ミュータント”なる語は、様々な手
段によってFlavobacterium multivorumから生産される
ミュータントを意味する。この手段とは、化学的変異
剤、紫外線照射、ファージ暴露などを含むが、これらに
限定されるものではない。これらの方法及び物質は、糖
業者にはよく知れられているものである。本特許出願明
細書に記載のミュータントは、Manual of Methods for
General Bacteriology（ASM 1981,13章）に記載されて
いるようなNTG（ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン）による標準的な突然変異誘起、及び紫外
線照射に付せられることによって得られる。本発明にお
いて、“バリアント”なる語は、Bergey's Manual（198
4年出版）に記載されているものに限定せず、Flavobact
erium multivorumのバリアント全てを意味する。ここ
で用いる“バイオマス”なる語は、Flavobacterium mu
ltivorumの生細胞の醗酵後回収された、非生存のゼアキ
サンチン含有Flavobacterium multivorum細胞、未使用
の培地ソリッドを含む残滓、及びこの物質から得られる
粉末を意味する。かかるバイオマスは、家禽用あるいは
サケ類用飼料として使用される。前述のバイオマスは、
またある種の公知添加物、抗酸化剤、キレート剤及び乳
化剤、更にはこの物質から得られる安定化粉末を含んで
いてもよい。バイオマスは、例えばデンプン、及び／ま
たは残余醗酵粉末、及び／または一種もしくはそれ以上
の粉末を含む不活性キャリアーの中に加えてもよい。
Flavobacterium multivorumは生育し１日経過後、ヒ
ツジ血液寒天プレート上に1mm未満の平坦な未着色のコ
ロニーを形成する。プレート上のペニシリン、バンコマ
イシン及びポリミキシンのディスクの周辺に阻害帯は見
られない。微生物は、強いオキシダーゼ陽性、カタラー
ゼ陽性のグラム陰性桿菌であり、運動性を持たず、強い
スクロース陽性（多くの非醗酵細菌は、スクロース陰性
である。）、更に常にマンニトール陰性及びエタノール
陰性を示し、及び尿素陽性である。
本発明によるゼアキサンチンの製造は、ゼアキサンチ
ンの製造に携わる当業者には自明の慣例培養技術を使用
して実施されうる。例えば米国特許3,891,504号、3,84
1,967号、3,951,742号及び3,951,743号に例示されてい
る。簡単に述べると、公知方法でFlavobacterium mult
ivorum細胞を単離し、得られた黄色培養物を精製して、
細胞内でゼアキサンチンが生産される条件で固体栄養培
地上、または液状の栄養培養液中での培養に付す。細胞
を有機溶媒で抽出し、得られたゼアキサンチンを分光光
度計及び高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用し
て分析する。
しかし、本発明による、ゼアキサンチン製造の好適な
方法は実施例２に示したものである。
好ましくは、本発明の黄色Flavobacterium微生物の単
離、及び純粋培養は次のように行われる。微生物の材料
として使用する、泉（spring）または他の天然源から得
られた材料を生理食塩水中で懸濁する。画線培養物をペ
トリ皿に塗布する。その後、寒天上で生長した黄色コロ
ニーのカロテノイド含有量を調べるFlavobacterium mu
ltivorumのコロニーは、細胞をBergey's Manual（1984
年出版）に掲載されている分類学的記載と比較すること
によって同定することができる。最後に本発明のFlavob
acterium multivorum微生物は、それらのゼアキサンチ
ン含有量によって同定され〔分析学的手法、好適には高
速液体クロマトグラフィーを用いて確認される。F.Quac
kenbush,J.Liquid Chromatography,10（４）pp.643−65
3（1987）〕、単離される。ゼアキサンチン産生微生物
の検出方法は、高速液体クロマトグラフィーを用いた方
法を含むが、必ずしもこれに限定されない。他のF. mu
ltivorum単離方法としては、当業者に公知で、かつ本発
明においての使用が適当であるものが挙げられる。F.
multivorumはまたAmerican Type Culture Collection及
び世界中の様々な公的、私的の寄託機関を通じて入手で
きる。
本発明の方法で使用された微生物は、従来方法で栄養
培地中で培養することができる。微生物の培養におい
て、同化吸収される炭素または窒素を含んだ多くの従来
慣用従来の固体栄養培地（または、従来の液体栄養培地
のいずれか）が使用される。“栄養培地”なる語は、微
生物の生育に必須な同化物質を含む培養培地を意味す
る。これらの物質は、後述するように、特に、容易に同
化されうる炭素源と容易に同化されうる窒素源及びミネ
ラル塩類を含む。更に栄養培地は、後述するように、適
宜ビタミンといった光学活性添加物、色素形成促進剤、
生育因子、塩化ナトリウムといったある種の無機塩（こ
のような培地中に通常含まれているもの）、及び微量成
分を含んでいてもよい。
しかし、本発明によると、好適な培地は以下の表に記
した組成を持つ。
（％は全培地の重量を100％として、重量％で示す） 速やかに同化吸収される窒素源として、無機窒素化合
物だけでなく動物、植物および／または微生物由来の多
くの基質が例示されるが、これらに限定されない。容易
に同化吸収される窒素源としては、大豆粉、魚粉、肉
粉、肉エキス、ペプトン、コーンスティープリカー（co
rn steep liquor）、酵母エキス、アミノ酸類、アンモ
ニウム塩類（例えば、リン酸アンモニウムとか、硫酸ア
ンモニウム）及び蛋白質加水分解物が好ましい。蛋白質
加水分解物としては、特に大豆、豆のような植物性蛋白
質、あるいはピーナッツ蛋白質の酸もしくは酸素加水分
解物、及び／またはトリプトンと呼ばれるカゼインの加
水分解物が挙げられる。窒素源はまた、Flavobacterium
属の細菌培養で得られるカロテノイド色素の生合成過程
で、副生成物として回収されるバイオマスを、酸もしく
は酵素で加水分解して得られる物質、特にゼアキサンチ
ンを製造するために培養されたFlavobacteriumのバイオ
マス、これから色素が抽出されるのであるが、このバイ
オマスの加水分解物によって得られる物質を含んでもよ
い。同化吸収されうる窒素源としては、低コストでかつ
望ましい生育要素を含有している点から、コーンスティ
ープリカーが最も好適である。
容易に同化吸収される炭素源としては、糖類及びそれ
らのポリマー、例えば澱粉、デキストリン、サッカロー
ス、マルトース、ラクトース、グルコース、及び糖みつ
等が例示され、さらに脂肪酸、及びグリセリン等といっ
た多価アルコール等が挙げられるが、これらに限定され
ない。好適な炭素源として、とうもろこし、とうもろこ
し粉、米、ミロ（milo）、小麦、澱粉、ラクテート、ア
セテート及びグルコース飼料が挙げられる。培地中のグ
ルコース量は、約0.035重量％未満である。とうもろこ
し粉が、価格、粒子サイズ及び培地に１〜７重量％の割
合で加えて使用されるという点から最も好ましい。当業
者には、自明のことであるが、とうもろこし、とうもろ
こし粉、及び澱粉は、α−アミラーゼ（Termamyl 120L
として市販）といった澱粉溶解酵素で処理する必要があ
る。この処理によって澱粉はデキストリンへと加水分解
される。この処理を怠ると澱粉は、加熱処理において固
形の塊状になってしまう。しかし、過剰な酵素加水分解
は、収率を減少させることになり、また一方、加水分解
をあまりしないもの、収率を減少させ、醗酵時間を増加
させる原因となる。
栄養培地はまた、培地から元に存在している、もしく
は添加したミネラルまたは有機成分に起因する微量成分
を含んでいてもよい。例えば、硫黄やりんは、栄養培地
中に元から存在している無機または有機成分に起因しう
るが、または栄養培地中に特別に添加してもよい。も
し、所望または必要なら、例えばビタミンといった生育
促進剤または刺激剤を栄養培地に添加してもよい。好適
なミネラルとしては、低濃度の硫酸第一鉄（それは細胞
の生育を促進する）とリン酸二ナトリウムである。
脂肪源としては、例えば石鹸原料、大豆油、ひまわり
油及びオリーブ油などが例示されが、これらのものに限
定されない。好ましくは、石鹸原料である。
培養は、好適には培地にある種の生育因子、または産
生促進添加物を加えて実施される。好ましい生育因子
は、酵母エキスである。
培養工程で使用される菌株は、公知方法に従って、画
線培養プレートから醗酵容器に移すことができる。好適
な方法は、斜面寒天培地及びガラス−フラスコ液培養を
用いた方法である。
本発明の方法によるゼアキサンチンを製造せしめる条
件での微生物の培養は、いずれの一般方法を用いて実施
してもよい。本方法の好適な実施態様としては、培養は
液体培地中で行うことが好ましい。この液内培養に関し
ては、通常に液内培養で用いられるいずれの条件を使用
してもよい。好適には、培養温度を10℃〜35℃に、培地
のpHを約6.5〜8.0の範囲に設定し、およそ24〜72時間醗
酵させるのが好ましい。本発明の栄養培地を使用した培
養の好適な条件は、培養温度が約22℃〜30℃、pHが約7.
2、培養時間が約30〜36時間である。
培地のpHは6.5〜8.0に調整されるが、好ましくは、7.
0〜7.5である。pHの調整には、水酸化ナトリウム、水酸
化カリウムもしくは水酸化アンモニウムの水溶液を使用
するが、これらの物に限定しない。これらは当業者には
既知のものである。
本発明の方法では、色素の形成は、培養菌の増殖に比
例して増加し、約30〜36時間の培養で最大量の色素が得
られる。
培養時間完了後、醗酵培地中でゼアキサンチン含有量
を測定する。このためには、まず遠心分離によりバイオ
マスを栄養基質から分離し、細部からゼアキサンチンを
抽出する。この抽出液中に含まれるゼアキサンチン量
は、同じ溶媒に溶かした合成ゼアキサンチンの標準溶液
と比較することによって、比色定量することができる。
培養が終わると、醗酵ブロスを濃縮し、極性有機溶媒
を用いて、または超臨界流体抽出によって、ゼアキサン
チンを細胞から抽出する。極性有機溶媒としては、例え
ばアセトン、ヘキサン、またはクロロホルムといった塩
素化溶媒が例示されるが、これらに限定されない。例え
ば、F.Favati,et,al.,J.Food Sci.53（５）:1532−1535
（1988）参照のこと。
あるいは、バイオマスを培地から、例えば遠心分離、
デカンテーションまたは濾過等の方法を用いて分類して
もよい。遠心分離法を使用するなら、培地中にベントナ
イトと塩化カルシウムを添加することによって、細胞回
収を増加させることができる（実施例１参照）。好まし
くは、ベントナイトと塩化カルシウムとを醗酵ブロス中
に添加し、その後、全ての生細胞を殺すために加熱処理
する方法である。それからブロスを遠心し、ペースト状
の細胞の塊と未使用の培地ソリッドを回収する。得られ
た細胞ペーストは、使用し易い粘度にまで水を加えてス
ラリーとする。色素の分解を防止または減少させるため
に、このスラリーの中にEDTA（約0.2％）、BHA（約0.05
％）、Tween（約0.1％）、及び酢酸トコフェロール（約
0.015％）を添加しても良い。（ ）内に表示したパー
セント値は、スラリー中の細胞重量に基づいたものであ
る。その後スラリーを、例えばガラスビーズを用いた破
砕器または高圧ホモジナイザーを使用して均一化し、後
に使用するため、乾燥しておく。好ましい乾燥方法は、
スプレー乾燥である。
このバイオマスは、例えばこのまま鶏の飼料中への添
加物として使用してもよいし、またはさらに、前述した
ように極性有機溶媒で抽出してもよい。
この色素含有バイオマスは、好都合なことに、純粋な
ゼアキサンチン色素を単離する必要なく、本発明に従っ
て食料品の着色料として利用することができる。一方、
細胞内のゼアキサンチンは、常法により細胞から分離す
ることができる。ゼアキサンチンの好適な分離、抽出方
法は、細胞体を注意深く乾燥し、その乾燥細胞体を粉砕
し、粉砕した物を不活性有機溶媒で消化し、その溶液を
濾過し、濾過残渣を不活性有機溶媒で溶離することによ
って純粋なゼアキサンチンを単離するものである。この
好適方法の個々のステップは、常套方法を用いて行うこ
とができる。ゼアキサンチンの分離に関して特に好まし
くは、細胞体をスプレー乾燥法にて乾燥する。不活性有
機溶媒としては、低級アルコール、好ましくはエタノー
ル、ケトン、好ましくはアセトン、もしくはハロゲンを
含んだ炭化水素、うち好ましくはクロロホルム等が例示
されるが、これらに限定しない。さらに特に好ましく
は、酢酸エチル、低級アルコールまたはそれらの混合液
中に濃縮残渣をとりだす方法がとられる。更に特に好適
な濾過方法は、シリカゲル、中性酸化アルミニウムまた
はケイ酸マグネシウムに通して、溶液を濾過する方法で
ある。なおより好ましくは、ゼアキサンチンを塩素化炭
化水素、好ましくは塩化メチレン、ジクロロエチレン、
またはジ低級アルキルエーテル、好ましくはジエチルエ
ーテルを用いて溶出することである。もしくは、乾燥粉
末を高圧下、CO2ガスで超臨界抽出法を使用して抽出し
てもよい。
Flavobactiriumによって製造された色素は、95〜99％
までがゼアキサンチンから成っている。試験の結果によ
り、Flavobacteriumが産生したゼアキサンチンがZea ma
ysか単離されるゼアキサンチンと同一の物であることが
確認されている。
ゼアキサンチンを抽出した後に残った、ほとんど色素
を含まない細胞体のほとんどが、家禽を飼育するうえで
理想的な蛋白質（メチオニンやリジン等の必須アミノ
酸）及びビタミン（特にビタミンＢ群のもので、とりわ
けビタミンB12である）の供給源として使用することが
できる。
本発明はまた、参考例３で示すAFB−44株と実質的に
同じ分類学的性質を持ち備えている、F. multivorumの
ミュータント及びバリアントを包含するものである。ニ
ューテーションは上述したように、常套技術を使用して
行うことができる。
この明細書に記した全ての刊行物は、本発明に付随す
る技術に精通している当業者の技術水準を示すものであ
る。ここに挙げた全ての文献は、各々の刊行物もしくは
特許出願を明細書中に開示するために、特にまた個々に
記載したに等しい程度に開示されたものとする。
前述した本発明は、より明確に理解してもらうため
に、実例や例証を挙げて詳細に述べてきたが、言うまで
もなく、後述の請求の範囲に記載した範囲において、変
更、修正して行ってもよい。
実施例 参考例1 F. multivorumの単離 黄橙色色素生産菌を探すため、自然界から得られた様
々なサンプルを、そのままペトリ皿中の寒天培地（2.0
％寒天、0.02％trypticase大豆ブロス、0.02％酵母エキ
ス、及び0.25％塩化ナトリウム）上に画線培養すること
によって、スクリーニングした。その上、それらサンプ
ルは、寒天に画線接種する前に一種の強化方法として、
水を満たしたウィールパック・パック（whirl−pack ba
gs）の中で照明下、室温で３日間インキュベートした
（0.5％塩化ナトリウム存在下）。世界中から集めた多
くの培養菌収集物かから得られた色素生産菌は、trypti
case大豆寒天と１％の酵母エキスから成る斜面培地上で
維持した。本発明に記載のF. multivorum菌株AFB−44
は、ミズーリー州のハイリッジ（High Ridge）近辺に湧
き出る新鮮な水から単離されたものである。
この方法で単離された、または培養菌コレクションか
ら得えられる数百もの菌株は、その後色素スクリーニン
グ用ブロス（121℃で30分間高圧滅菌されたもの）に植
菌した。
培地菌を、照明下25℃で72時間、もしくは菌が充分生
育するまで培養し、25,000rcfで遠心、ペレット化させ
ることによって集菌した。それらは、300ml容のディン
プルフラスコ（底壁に窪みのあるフラスコ）に50mlずつ
小分けして、回転式培養器／振盪器で250rpmにて振盪
し、生長させたものである。集菌し得られた沈澱物を凍
結し、アセトン抽出した。その後、遠心し、得られた抽
出物を乾燥し、再びヘキサン中に浸漬し、アルミナクロ
マトグラフィー装置に付し、キサントフィル精製用のAO
AC法を用いて展開した［Quackenbushら，J.Assoc.Off.A
nal.Chem.56:746−753（1973）］。である、様々なフラ
クション、特にジヒドロキシカロテノイドを集め、その
各フラクションについてベックマン社の走査分光光度計
でそれらの吸収極大値を測定した。
数千からなるスタート単離物から、ゼアキサンチンと
類似の吸収スペクトラムを持ち、かつ類似のクロマトグ
ラフィー保持時間を持つ12検体が見つかった。これらの
単離物を更に生育、抽出して、ゼアキサンチンである確
証を得るために、外部の専門家に逆相HPLCによる同定を
依頼した［Quackenbush F.,J.Liq.Chrom.10(4):643−65
3（1988）］。それらのうち一つの培養菌が、ゼアキサ
ンチンを主な色素として比較的純度よく生産していた
（95％）。
この培養菌は、分類学的評価をするため、内容を明ら
かにせずに、２つの別々の研究所に提出し分析を依頼し
た。双方の研究所の結論は共に、この培養菌は、既知の
ゼアキサンチン産生細菌とは異なるものであるというこ
とであった。この培養菌株は、Flavobacterium multiv
orum株であると特徴づけられた。
本発明はこの菌株でゼアキサンチンが生産されること
を示した初めての報告である。
実施例1 Flavobacterium multivorumの培養 培養菌は、プレートカウントアガー（Plate Count Ag
ar）の傾斜チューブ上で保育する。これらの斜面培養菌
は植菌後、30℃にて24時間培養したものである。これら
の保存用斜面培養菌は、液体培地への接種菌として使用
するため、冷蔵保存しておく。
液体培地の組成は以下の通りである。
この栄養培地は、濃（10N）水酸化ナトリウム水溶液
でpH7.6に調整した。その後、培地を約85℃で30分間加
熱し、澱粉をデキストリンに酵素的に加水分解した。加
熱処理した培地を更に121℃にて、30分間滅菌した。冷
却後この培地に、上述した保存斜面培養菌から、或いは
約24時間前に植菌されたブロス培養液から植菌した。そ
の植菌量は約5V/V％であった。
植菌された栄養培養液の生育条件は、30℃、pH7.2、3
6時間、５重量％量の植菌、更に連続通気をすることで
あった。通気は、溶解酸素量を50％飽和濃度に維持する
のに充分な割合で空気をバブルさせなら、300ml容のデ
ィンプルエルレンマイヤーフラスコ（dimpled Erlenmey
er flasks）に培養液30mlを使用して振盪培養器で200rp
mにて振盪することによって、または醗酵器内で400rpm
にて攪拌することによって行われる。本実験では空気供
給速度を約0.25VVMに設定した。
醗酵およそ12時間後、培養液中にリパーゼとグルコア
ミラーゼを添加した（いずれも少量で、培養液に対し約
0.03重量％、又は醗酵培養液1Lに対し、30リパーゼ単位
及び6AG単位）。
醗酵完了後、醗酵培養液に0.006g/l〜0.01g/lのベン
トナイト及び0.16g/l〜0.4g/lの塩化カルシウムを添加
した後、遠心分離し、Flavobacterium multivorum細胞
を培地から分離、集菌した。それから、全ての生細胞を
殺すため、培養液を50℃に加熱し、さらに遠心して一塊
の濃厚なペースト状細胞と未使用の培地ソリッドを回収
した。その後、細胞ペーストを再びスラリーにし、それ
にEDTA（0.2％）、酢酸トコフェロール（0.015％）、BH
A（0.05％）及びTween80（0.1％）を添加した。そし
て、スラーリーを均一化、ホモジネーションとし、今後
の使用のために乾燥しておく。この乾燥物は、産卵鶏と
食肉用鶏用の食餌研究に使用した。さらに、その乾燥バ
イオマスを、保存安定試験に使用するため、室温で２カ
月間保存した。
以下の実験は、文献や特許書類に記載の他の培地上で
の細胞生長に比べ、本発明の方法が極めて優れ、有用で
あることを示したものである。
以下の組成からなる培地を、記述した方法で、配合調
整後高圧滅菌後、冷却させたのち、F. multivorum種を
植菌する。
培地Ａ、Ｂ及びＣは、関連文献項に挙げた特許に記載
されている培地である。培地Ｄ、Ｅ及びＦが本発明の栄
養培地である。
参考例２ 培地のpHを全て7.5に調整し、定期的にチ
ェックすることによってそのpH値を維持する。このpH調
整はただ培地Ｃにとって重要なものである。培地ＤとＥ
以外の培地は全て、高圧滅菌の直前にあらかじめ80〜90
℃で30分間加熱したのち、121℃で30分間高圧滅菌し
た。培地Ｆ以外の全ての培地に、AFB−44株を5v/v％植
菌し、回転振盪器で250rpmにて、30℃で24時間、その後
26℃で24時間培養し、遠心処理により集菌した。培地Ｅ
（ミュータント用）と培地Ｆには、AFB−44株から誘起
されたミュータントを別々に植菌し、このケースでは、
30℃でちょうど32時間培養しミュータントを生育させ
た。以下の表にこれらの結果を示す。
細菌の生産量は、20,000rcfで10分間遠心後、上清を
デカンテーションし、得られたペレットを105℃で24時
間乾燥することによって計算した。実際の細胞量は、醗
酵液中の不溶解物を除去するために、まず培養液を3,00
0rcfで遠心し得られたペレットを乾燥し、このペレット
の乾燥重量を、通常の細胞生産量から差し引くことによ
って計算した。ゼアキサンチン量は、凍結細胞ペレット
をアセトン抽出したのち、遠心分離し得られた抽出液の
O.D.450値を、分光光度計で測定して求めた。得られた
これらの実験値は、その後吸光係数や希釈度に対する適
当な係数で乗じることによって、実際のゼアキサンチン
量を求めた。
実施例２ さらに、培地Ｄを、他のFlavobacterium mu
ltivorum株を培養するために使用して、他のF. multiv
orum株が本発明の栄養培地でうまく育つかどうかを調べ
た。その結果、その栄養培地がゼアキサンチンの生産量
を改善せしめることが示された。
培地Ｄに、菌株K2361またはK1180（実施例３に記載）
を植菌し、実施例１に従って培養した。K2361は粗細胞
産生量として25g/l、真の細胞産生量として13g/l及び11
μ/ml量のゼアキサンチンを生産した。K1180は粗細胞産
生量として24.5g/l、真の細胞産生量として12.5g/l及び
４μ/ml量のゼアキサンチンを生産した。K2361から得ら
れる結果は、本発明の栄養培地が細胞産生量、及びF.
multivorumのある菌株によって生産されるゼアキサンチ
ン量を改善することを示すものである。K1180から得ら
れる結果は、本発明のより安価な栄養培地によって、高
価な栄養培地を使用した場合と同じ、細胞産生量とゼア
キサンチン量が生じることを示している。
これらの実験結果から、F. multivorumのAFB−44株
について、以下のことが示唆される。
ａ）培地ＤとＥ（本発明品）は、先願の特許文献に記載
の培地Ａ、Ｂ及びＣよりも、極めて大量の細胞産生量と
ゼアキサンチン生産量を生じせしめる。
ｂ）培地ＤとＥは始めは殆ど同じ固形物質を有するもの
であるが、培地Ｅの方がより多くの細胞と色素を生産す
る。
ｃ）培地Ａ、Ｂ及びＣは、培地ＤとＥに比べ非常に高価
であるが、生産量は培地Ｄ、Ｅが優れている。
ｄ）AFB−44株のミュータントを培地Ｅで培養すること
により、32時間という短い培養時間で、極めて大量の細
胞と色素を生産された（言い換えると、より生育が速
い）。培地Ｅ中で、AFB−44ミュータント株は、今まで
確立された方法の中で最も高収量の細胞と色素を生産し
た。
ｅ）石鹸原料は植物油に代用され、同等量のゼアキサン
チンを生産することができる。
参考例３ 他のFlavobacterium微生物との比較 Flavobacterium multivorum（AFB−44）の単離物を
分類学的に他のFlavobacterium種と比較した。ATCC 215
88（もしくは21588L）とATCC 11947については米国特許
第3,841,967号3,951,742号及び3,951,743号に開示され
ている。ATCC 21081に関しては米国特許3,891,504号と
3,841,967号に開示されている。この特許出願されてい
る菌株、ATCC 21588と21081は1984年出版のBergey's Ma
nualに記載されている新分類一覧表によると、Flavobac
terium属に類別されてないのに気付くであろう。
ATCC No.21018は、生長温度要求性と塩の絶対要求性
において、AFB−44株と明らかに異なっている。
ATCC No.21588は、醗酵及び利用様式の多くの点で、
F. multivorumと全く異なっている。F. multivorum株
は、35℃のmotility−nitrate ager及びインフュージョ
ンブロスの中で良く生長するのに対し、ATCC 21588は生
長しない。その上、ATCC 21588はペニシリン、バンコマ
イシン感受性であるのに対して、F. multivorumはそう
ではない。ATCC 21588またはLANA（Ｌ−アラニン−４−
ニトロアニリド）陰性であり、構造的に胞子類似物を生
産することができた。この２つの特徴はFlavobacterium
属にはみられないものである。
分類学的な評価は、色素含有細菌の分類学に熟知した
専門家によって実施された。これによると、F. multiv
orum菌株はATCC 11947、21081及び21588と明らかに異な
るという結果が得られ、この判断は、American Type Cu
lture Collectionの微生物分類サービスからの同じ結論
によって支持された。
〜に対する感受性 No.21588 No.AFB−44 ペニシリン（2U） ＋ − ポリミキシンＢ（300U） ＋ − バンコマイシン（５μｇ） ＋ − 〜上での生長 ATCC ＃21081 AFB−44 TSA*、室温 なし 良好 TSA、30℃ なし 良好 PYEPO**、室温 良好 なし PYEPO,30℃ なし なし * TSA＝Trypticased大豆寒天** PYEPO＝マリーン寒天;0.5％ディフコ（Difco）ペプト
ン、0.1％ディフコ酵母エキスと1.5％寒天を太平洋の海
水で調製したもの ATCC No.21081はグラム陰性桿菌であり、濡れたスラ
イド中では、運動性を示さない。その生育に見られる特
徴は、Berygey's Manual（1984）でのHolmesらによって
現在定義されているFlavobacterium属の特徴とは違うも
のであるが、Bergry's Manual（1984）に記載の、Week
s' Flavobacterium Section IIのある部類のものとは一
致している。また、ATCC 21081は、生長に塩化ナトリウ
ムが必須であり、30℃では生長出来ない。
実施例３ F. multivorum株の比較 前述した方法で単離した後、もとのAFB−44株はゼア
キサンチン生産微生物であると同定された。その菌株
は、まず既知のFlavobacterium株と比較した後、唯一、
既知菌株とは異なるもので、F. multivorum属に属する
ものであることがわかった。始めに広範囲にわたるスク
リーニングした中で、これがゼアキサンチンを生産する
とみなされる唯一のFlavobacterium株であった。このス
クリーニングサンプルは、世界中から集められた５カ所
の公的収集機関におけるFlavobacterium/Cytophage群コ
レクションを、全て包含していた。このことから、我々
はゼアキサンチン色素生産微生物は極めて少ないと判断
した。我々の得た微生物を同定後、更に別のF. multivor
um株類を調査すべきあると、調べた。F. multivorum株
はUCLA−マイクロバイオロジー・デパートメント・コレ
クション（UCLA−Microbiology Department collectio
n）から入手でき、菌株番号はＫ−1213、Ｋ−1204、Ｋ
−1180、Ｋ−2361、Ｋ−2303であり、以下の方法でAFB
−44株と比較した。それらの菌株はまずPCA斜面培地上
で生育させ、そしてディンプルフラスコ中の液体培地に
植菌後、往復振盪させながら30℃で24時間、さらに24℃
で48時間生長させた。その後、遠心分離によって集菌し
た。この培養実験は、また、照明下で行った。サンプル
は凍結ペレットからアセトンで抽出し、この抽出液を窒
素気流下で乾燥し、再びヘキサン中に浸漬し、アルミナ
（中性）カラムクロマトグラフィーに付した。アセトン
／ヘキサン比を増加させることによって、溶出・分画を
行い、各分画液の吸収極大値を走査分光光度計で測定、
検出した。以下に結果を示した。
この実験データから次のことがいえる。
ａ）意外なことに、他のF. multivorum株もゼアキサン
チンを生産する。
ｂ）全てのF. multivorum株が、十分量の色素を生産す
るようである（しかし、本実験ではＫ−2303は十分量の
色素を生産しなかった。すなわち、弱い色素生産菌で、
ゼアキサンチンの生産も見られなかった）。
ｃ）AFB−44のワイルドタイプの菌株は他の菌株より
も、より大量の色素を生産し、更にそのゼアキサンチン
／全カロテノイド比も大きかった。
ｄ）カラムクロマトグラフィーの結果から、全ての菌株
（Ｋ−2303は除く）により生産されるジヒドロキシカロ
テノイドが、主なゼアキサンチンであるようである。
ｅ）公に入手できるF. multivorum株はゼアキサンチン
を生産する。
ｆ）今まで知られていないFlavobacteriumに属する群
が、細胞組成物である一般色素としてゼアキサンチンを
持っている。
実施例４ 以下の食餌研究はバイオマス組織物が、色素材料とな
っている現在の商品と比べて、生物学的利用性、安定
性、さらに着色能力の点で優れていることを示すもので
ある。
実施例１で示したように調整し、２ヵ月間室温で保存
しておいたバイオマス組成物を食肉用の鶏に飼料として
与え、マリーゴールドの花の、安定化したケン化抽出物
と比較した。規定飼料は以下の通りである。
以上の結果から、鶏に有害な影響を認められなかっ
た。更に、バイオマス組成物から得られるゼアキサンチ
ン10ppmは生物学的に有用であり、マリーゴールド抽出
物から得られるキサントフィル25ppmと同等の効果があ
った。それは、自然界で安定化、作られた最良のキサン
トフィル天然材料であり、市販されている。このキサン
トフィルは、改善された色素形成を示し、かつ着色がよ
り早いため生物学的に有用であるに違いない。この結果
から、微生物由来の色素組成物が、高価な抽出、ケン化
処理をしなくても、意外に極めて安定性が高く、生物学
的に有用であることがいえる。さらに、成長データにお
いて、有害な影響は見られないことを付記する。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 23/00 C12N 1/20 A23L 1/275 A61K 7/00 A23K 1/16 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (33)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ゼアキサンチンを産生し得る、フラボバク
    テリウム・ムルティボルムに属する微生物を、少なくと
    も１種類の同化吸収され得る炭素源と少なくとも１種類
    の同化吸収され得る窒素源を含む栄養培地中で培養し、
    得られる培養物からゼアキサンチン含有組成物を回収す
    ることよりなる、ゼアキサンチン含有組成物の製造方
    法。
  2. 【請求項２】栄養培地がコーンスティプリカー、及び酵
    素処理した炭素源を含有する請求の範囲１の方法。
  3. 【請求項３】酵素がα−アミラーゼである請求の範囲２
    記載の方法。
  4. 【請求項４】培地中のグルコース量が約0.035重量％未
    満である請求の範囲１記載の方法。
  5. 【請求項５】同化吸収され得る炭素源が、とうもろこ
    し、米、ミロ（milo）、小麦、麦芽デキストリン、更に
    これら穀類由来の粉及びデンプン、及びグルコースから
    成る群から選択される請求の範囲１記載の方法。
  6. 【請求項６】同化吸収され得る窒素源が、コーンスティ
    プリカー、加水分解されたカゼイン、加水分解された大
    豆、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、アンモニ
    ア、酵母エキス、蛋白質加水分解物及びフラボバクテリ
    ウムバイオマスの加水分解物から成る群から選択される
    請求の範囲１記載の方法。
  7. 【請求項７】培養が、温度約16〜約38℃、pH約6.0〜約
    8.5、培養時間約24〜約72時間で実施される請求の範囲
    １記載の方法。
  8. 【請求項８】少なくとも40g/l量のゼアキサチン含有細
    胞を生産する請求の範囲７記載の方法。
  9. 【請求項９】当該培養工程が、約32時間で実施される請
    求の範囲７記載の方法。
  10. 【請求項１０】栄養培地が水溶液である請求の範囲１記
    載の方法。
  11. 【請求項１１】当該培養工程が、約22〜約34℃の温度範
    囲で実施される請求の範囲７記載の方法。
  12. 【請求項１２】当該培養工程が、pH約6.5〜約8.0で実施
    される請求の範囲１記載の方法。
  13. 【請求項１３】当該培養工程が、約24〜約72時間で実施
    される請求の範囲１記載の方法。
  14. 【請求項１４】当該培養工程が、約32時間内で実質上完
    了する請求の範囲13記載の方法。
  15. 【請求項１５】培養中、栄養培地に、更に酵素を添加す
    ることを含む請求の範囲１記載の方法。
  16. 【請求項１６】当該酵素がグルコアミラーゼ、リパーゼ
    またはそれらの混合物である、請求の範囲15記載の方
    法。
  17. 【請求項１７】同化吸収され得る炭素源及び同化吸収さ
    れ得る窒素源を含む栄養培地で、ゼアキサンチンを産生
    し得るフラボバクテリウム・ムルティボラムに属する微
    生物を培養してゼアキサンチン含有細胞体を生成し、当
    該細胞体からゼアキサンチンを分離することよりなるゼ
    アキサンチンの製造方法。
  18. 【請求項１８】微生物を水性培地中、約22〜約34℃で培
    養する請求の範囲17記載の方法。
  19. 【請求項１９】当該細胞体を不活性有機溶媒で抽出して
    ゼアキサンチンを溶解させ；ゼアキサンチンから溶媒を
    除去することによって、当該細胞体からゼアキサンチン
    を分離する請求の範囲17記載の方法。
  20. 【請求項２０】有機溶媒を蒸発させることによってゼア
    キサンチンから除去する請求の範囲19記載の方法。
  21. 【請求項２１】栄養培地が、約１〜約７重量％の同化吸
    収され得る炭素源、及び約３〜約10重量％の同化吸収さ
    れ得る窒素源を含有したものである請求の範囲１記載の
    方法。
  22. 【請求項２２】培養ステップに続いて、ゼアキサンチン
    を微生物細胞から溶媒抽出する請求の範囲１記載の方
    法。
  23. 【請求項２３】以下の工程からなるゼアキサンチン含有
    組成物の製造方法。 同化吸収され得る窒素源、同化吸収され得る炭素源、ミ
    ネラル塩、脂肪源、及び生長因子から成る栄養培地で、
    ゼアキサンチンを産生し得るフラボバクテリウム・ムル
    ティボラムに属する微生物細胞を醗酵させ、醗酵液を生
    成する； 当該醗酵液から当該組成物を回収する。
  24. 【請求項２４】当該組成物が以下の工程： 当該醗酵液から当該細胞を細胞ペーストとして分離す
    る； このペーストをスラリー化する； このペーストをホモジナイズする； さらに、このペーストを乾燥する； により回収される請求の範囲23記載の方法。
  25. 【請求項２５】当該ペーストを抗酸化剤、キレート剤ま
    たはそれらの混合物と乳化剤の存在下でスラリー化する
    請求の範囲24記載の方法。
  26. 【請求項２６】同化吸収され得る炭素源が、酵素処理さ
    れたものである請求の範囲23記載の方法。
  27. 【請求項２７】同化吸収され得る炭素源が、とうもろこ
    し、米、麦芽、小麦、麦芽デキストリン、これら穀類由
    来の粉及びデンプン、及びグルコースから成る群から選
    択されるものであり、かつ同化吸収され得る窒素源が、
    コーンスティプリカー、加水分解されたカゼイン、加水
    分解された大豆、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウ
    ム、アンモニア、酵母エキス、蛋白質加水分解物及びフ
    ラボバクテリウムバイオマスの加水分解物から成る群か
    ら選択される請求の範囲１記載の方法。
  28. 【請求項２８】約30〜約36時間以内に最大の色素形成結
    果が生じる請求の範囲７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】約32時間以内に最大の色素形成結果が生
    じる請求の範囲28に記載の方法。
  30. 【請求項３０】酵素がα−アミラーゼである請求の範囲
    26記載の方法。
  31. 【請求項３１】ゼアキサンチンを産生し得る、フラボバ
    クテリウム・ムルティボラムに属する微生物をコーンス
    ティープリカー約4.0〜約8.0％、デンプン約3.0〜約5.0
    ％、脂肪源約1.0％、アミラーゼ0.1ml/lよりなる培地中
    で培養し、得られる培養物からゼアキサンチン含有組成
    物を回収することを含むゼアキサンチン含有組成物の製
    造方法。
  32. 【請求項３２】ゼアキサンチンを産生し得る、フラボバ
    クテリウム・ムルティボラムに属する微生物を醗酵させ
    ることによるゼアキサンチン生産のために有用な培地で
    あって、コーンスティープリカー約4.0〜約8.0％、デン
    プン約3.0〜約5.0％、脂肪源約1.0％、アミラーゼ0.1ml
    /lよりなる培地。
  33. 【請求項３３】更に、ゼアキサンチンを産生し得る、フ
    ラボバクテリウム・ムルティボラムに属する微生物を含
    む請求の範囲32記載の培地。
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