JP2886627B2 - Method for producing phospholipid - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はリン脂質の製造方法に関し、詳しくは、従来
より用いられている食品、化粧品用乳化剤としての用途
だけでなく、生理活性を利用して医薬品や、磁性粉体へ
の特異な分散作用を利用した磁気記録媒体への用途に広
く利用できるような自由な脂肪酸組成を有するリン脂質
を製造する方法に関するものである。The present invention relates to a method for producing a phospholipid, and more specifically, it utilizes not only the conventionally used emulsifier for food and cosmetics, but also its physiological activity. And a method for producing a phospholipid having a free fatty acid composition which can be widely used for a drug or a magnetic recording medium utilizing a specific dispersing action in a magnetic powder.

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕[Problems to be solved by conventional technology and invention]

従来よりリン脂質の製造方法としては、グリセロホス
ホリルコリンのようなグリセロリン酸と脂肪酸から酸無
水物法、酸クロリド法等によりホスファチジルコリン等
のリン脂質を製造する方法が知られている。Conventionally, as a method for producing a phospholipid, a method for producing a phospholipid such as phosphatidylcholine from glycerophosphoric acid such as glycerophosphorylcholine and a fatty acid by an acid anhydride method, an acid chloride method, or the like has been known.

しかしこのようなリン脂質の化学反応による合成反応
では、縮合剤などによる脂肪酸の劣化が起こるという問
題点や、反応方法が煩雑かつコスト高となる欠点があ
る。However, such a synthetic reaction by a phospholipid chemical reaction has a problem that a fatty acid is degraded by a condensing agent or the like, and has a drawback that the reaction method is complicated and costly.

また天然の動植物起源のリン脂質を得る方法として
は、溶剤分別、珪酸カラム分離などの方法により抽出す
る方法が一般に行われているが、いずれも色素や混在す
る糖脂質などを分離することが難しくかつ溶剤を多種多
量に必要とした。またそのようにして得られたリン脂質
のアシル基を構成する脂肪酸はその起源により一定の分
子量分布を漏った物で、単一のもしくは要求にあった脂
肪酸組成のリン脂質を得ることは事実上不可能であっ
た。In addition, as a method for obtaining phospholipids of natural animal and plant origin, extraction by a method such as solvent fractionation or silica column separation is generally performed, but it is difficult to separate pigments or mixed glycolipids, etc. In addition, a large amount of solvents were required. In addition, the fatty acid constituting the acyl group of the thus obtained phospholipid has a certain molecular weight distribution due to its origin, and it is actually possible to obtain a phospholipid having a single or required fatty acid composition. Was impossible.

他方、リパーゼについてはトリグリセリド、ジグリセ
リド、モノグリセリド等のエステル結合を加水分解する
こと、また、リン脂質のsn−１位のエステル結合を1,3
位位置特異性リパーゼが加水分解すること、またsn−１
−２位のエステル結合に次いては位置特異性の無いリパ
ーゼにより加水分解されることが報告されている。On the other hand, lipase hydrolyzes ester bonds such as triglycerides, diglycerides, and monoglycerides, and the ester bond at the sn-1 position of phospholipids is 1,3.
Site-specific lipase is hydrolyzed, and sn-1
It has been reported that, following the ester bond at the -2 position, hydrolysis is carried out by a lipase having no regiospecificity.

そこでこのリパーゼを利用しリン脂質の分解及びその
エステル交換反応について検討されてきている。例え
ば、ポリアルキレングリコール修飾リパーゼによるホス
ファチジルコリンのエステル交換方法（特開昭63−1056
86号公報）や、有機溶媒相と水相の容積比が1:9〜9:1の
範囲で微生物のリン脂質のエステル交換能を有する酵素
（リパーゼ）によりエステル交換反応を行う方法（特開
平２−35093号公報）や、八木らによる報告（Journal o
f Fermentation and Bioengineering,Vol.69,No.1,23−
25,1990）がある。これらのようにエステル交換により
リン脂質のアルキル基をある程度改質することはでき
る。しかし天然のリン脂質を原料とすると、そのアルキ
ル基の組成との平衡反応であるためにアルキル基の組成
を均一にすることや、特定の部位（sn−１と、sn−２の
区別を行って）に自由に所望のアルキル基を導入する事
は出来なかった。また分解反応が同時に起こるためその
抑制が困難であった。Thus, the use of this lipase to study the degradation of phospholipids and the transesterification thereof has been studied. For example, a method of transesterifying phosphatidylcholine with a polyalkylene glycol-modified lipase (JP-A-63-1056)
No. 86) and a method of performing a transesterification reaction with an enzyme (lipase) capable of transesterifying a microbial phospholipid in a volume ratio of an organic solvent phase to an aqueous phase in the range of 1: 9 to 9: 1 (Japanese Patent Laid-Open No. 2-35093) and a report by Yagi et al. (Journal o)
f Fermentation and Bioengineering, Vol. 69, No. 1, 23−
25, 1990). As described above, the alkyl group of the phospholipid can be modified to some extent by transesterification. However, when a natural phospholipid is used as a raw material, the composition of the alkyl group is made uniform because of an equilibrium reaction with the composition of the alkyl group, and specific sites (sn-1 and sn-2 are distinguished from each other). The desired alkyl group could not be freely introduced into (1). In addition, since the decomposition reaction occurs simultaneously, it was difficult to suppress the decomposition reaction.

また、リパーゼを用いることにより、低温で高度不飽
和脂肪酸を劣化させずにエステル交換を行うことが出来
たが、反応系にリパーゼ水溶液系及び水飽和溶剤系など
の水添加の系を用いて反応を行っているために反応平衡
が加水分解に傾くかまたはエステル交換に留まってい
た。しかもエステル交換反応は、分解反応が同時に起こ
るためにリン脂質の回収率は低下せざるを得なかった。In addition, transesterification could be performed at a low temperature without deteriorating highly unsaturated fatty acids by using lipase.However, the reaction was performed using a water-added system such as a lipase aqueous solution system and a water-saturated solvent system. , The reaction equilibrium tended toward hydrolysis or remained transesterified. Moreover, in the transesterification reaction, since the decomposition reaction occurs at the same time, the recovery rate of the phospholipid must be reduced.

〔課題を解決するための手段〕[Means for solving the problem]

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究の結
果、本発明を完成するに到った。The present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, completed the present invention.

即ち、本発明は、単一の脂肪酸組成を有するリン脂質
と、任意の脂肪酸又はその低級アルコールエステルと
を、1,3位位置特異性リパーゼの存在下、エステル交換
反応させるに際し、反応系を微水反応系に保ちながら反
応させることを特徴とする、目的とする脂肪酸組成を有
するリン脂質の製造方法を提供するものである。That is, the present invention provides a microscopic reaction system when a phospholipid having a single fatty acid composition is transesterified with an arbitrary fatty acid or a lower alcohol ester thereof in the presence of a 1,3-position-specific lipase. An object of the present invention is to provide a method for producing a phospholipid having a target fatty acid composition, wherein the reaction is carried out while maintaining a water reaction system.

本発明において用いられる単一の脂肪酸組成を有する
リン脂質としては特に限定されず、いかなる方法で得ら
れたものでも良い。例えば、リパーゼもしくはエステラ
ーゼの存在下で、単一脂肪酸又はその低級アルコールエ
ステルと、グリセロリン酸又はその塩又はその誘導体と
を、エステル合成もしくはエステル交換反応させて単一
の脂肪酸組成を持つジアシルグリセロリン脂質を製造す
る方法、或いは化学的合成法により単一の脂肪酸組成を
有するリン脂質を得る方法等により得られたものが挙げ
られる。The phospholipid having a single fatty acid composition used in the present invention is not particularly limited, and may be obtained by any method. For example, in the presence of lipase or esterase, a diacylglycerophospholipid having a single fatty acid composition by ester synthesis or transesterification of a single fatty acid or a lower alcohol ester thereof and glycerophosphoric acid or a salt or a derivative thereof. Examples thereof include those obtained by a production method, a method of obtaining a phospholipid having a single fatty acid composition by a chemical synthesis method, and the like.

上記のグリセロリン酸の塩としてはグリセロリン酸の
金属塩またはアンモニウム塩などがあり、例えばグリセ
ロリン酸２ナトリウム塩、グリセロリン酸カルシウム塩
等が挙げられる。また、グリセロリン酸の誘導体として
はグリセロホスホリルコリン、グリセロホスホリルエタ
ノールアミンのほか、以下の式（Ｉ）で示されるような
誘導体が挙げられる。Examples of the glycerophosphoric acid salt include a metal salt or an ammonium salt of glycerophosphoric acid, and examples thereof include disodium glycerophosphate and calcium glycerophosphate. Examples of the glycerophosphoric acid derivative include glycerophosphorylcholine, glycerophosphorylethanolamine, and a derivative represented by the following formula (I).

（式中、Ｘは置換基を有してもよい炭素数１〜24のアル
キル基或いはアルケニル基、他価アルコール残基、糖残
基、又はアルキレンオキサイド重合体残基を示す。） 式（Ｉ）で表される誘導体の具体例としては次の式で
表される誘導体が挙げられる。 (In the formula, X represents an alkyl or alkenyl group having 1 to 24 carbon atoms which may have a substituent, a polyhydric alcohol residue, a sugar residue, or an alkylene oxide polymer residue.) Specific examples of the derivative represented by the formula (1) include a derivative represented by the following formula.

（１） Ｘが置換基を有してもよい炭素数１〜24のアル
キル基或いはアルケニル基である例 （式中、Ｒは置換基を有してもよい炭素数１〜24のアル
キル基或いはアルケニル基を示す。） （２） Ｘが多価アルコール残基である例 （Ｘがグリセリン残基の場合） （Ｘがプロピレングリコール残基の場合） （３） Ｘが糖残基である例 （式中、Ｒ′はグルコース、フルクトース、ガラクトー
ス、シュークロース等の残基である。） （４） Ｘがアルキレンオキサイド重合体残基である例 本発明において脂肪酸としては、炭素数が６〜24程度
の直鎖飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、高度不飽和脂肪酸、
分岐脂肪酸が使用される。また脂肪酸の低級アルコール
エステルとしては、上記脂肪酸と炭素数１〜６の直鎖一
価アルコールのエステル化合物が好ましく用いられる。(1) Examples in which X is an optionally substituted alkyl or alkenyl group having 1 to 24 carbon atoms (Wherein, R represents an alkyl group or an alkenyl group having 1 to 24 carbon atoms which may have a substituent.) (2) Example in which X is a polyhydric alcohol residue (When X is a glycerin residue) (When X is a propylene glycol residue) (3) Example in which X is a sugar residue (In the formula, R 'is a residue of glucose, fructose, galactose, sucrose, etc.) (4) Example in which X is an alkylene oxide polymer residue In the present invention, as the fatty acid, a linear saturated fatty acid having about 6 to 24 carbon atoms, an unsaturated fatty acid, a highly unsaturated fatty acid,
Branched fatty acids are used. As the lower alcohol ester of a fatty acid, an ester compound of the above fatty acid and a linear monohydric alcohol having 1 to 6 carbon atoms is preferably used.

本発明において用いられ1,3位位置特異性をもつリパ
ーゼとしては、リゾプス属、ムコール属、アスペルギル
ス属、クロモバクテリウム属、ペニシリウム属、及び豚
すい臓リパーゼなどのリパーゼが挙げられる。またジア
シルグリセロリン脂質の製造に使用できるリパーゼ及び
エステラーゼは、微生物の生産する酵素に限らず動植物
起源のものであっても良い。例えば、上記の1,3位位置
特異性をもつリパーゼ、或いはキャンディダ属、シュウ
ドモナス属、ストレプトマイセス属、デオトリカム属な
どの位置特異性の低いリパーゼが用いられる。The lipase having the 1,3-position specificity used in the present invention includes lipases such as Rhizopus, Mucor, Aspergillus, Chromobacterium, Penicillium, and pig pancreatic lipase. The lipase and esterase that can be used in the production of diacylglycerophospholipids are not limited to enzymes produced by microorganisms but may be of animal or plant origin. For example, a lipase having the above-mentioned 1,3-position specificity, or a lipase having a low positional specificity such as Candida, Pseudomonas, Streptomyces, and Deotricum is used.

特に本発明において、ジアシルグリセロリン脂質の製
造時において、リパーゼとしてトリグリセリドの位置特
異性のあるリパーゼと特異性の無いリパーゼとの両方を
用いて反応させることとが必要である。特にグリセロリ
ン酸又はその塩又はその誘導体に対し1,3位位置特異性
リパーゼのモノアシル化反応の活性が位置特異性の無い
リパーゼよりも高いことを利用し、先ず1,3位位置特異
性リパーゼによりモノアシル化を行い、反応系を均一相
とした後、減圧下で、位置特異性の無いリパーゼにより
ジアシル化を行うことによりより効率良くジアシルグリ
セロリン脂質を製造することができる。In particular, in the present invention, when producing diacylglycerophospholipids, it is necessary to react both lipase having regiospecificity and non-specific lipase of triglyceride as lipase. In particular, utilizing the fact that the activity of the monoacylation reaction of the 1,3-position-specific lipase for glycerophosphate or a salt or a derivative thereof is higher than that of a lipase having no regiospecificity, After performing monoacylation to make the reaction system a homogeneous phase, diacylation is performed with a lipase having no regiospecificity under reduced pressure, whereby a diacylglycerophospholipid can be produced more efficiently.

本発明においては、水及び有機溶剤に不溶性の担体上
に固定化したリパーゼを使用することが必要である。用
いられる担体としては、脱水条件下でも高活性を保つよ
うな固定化酵素が得られるものが好ましく、例えば、ア
ニオン交換樹脂、カチオン交換樹脂、両性イオン交換樹
脂、キレート樹脂などが挙げられるが、特に多孔性の水
酸基を持つ樹脂が好ましく、好ましい樹脂としては、強
塩基性陰イオン交換樹脂（II型）、グルカミン型キレー
ト樹脂などが挙げられる。In the present invention, it is necessary to use a lipase immobilized on a carrier insoluble in water and an organic solvent. As the carrier to be used, those capable of obtaining an immobilized enzyme that maintains high activity even under dehydration conditions are preferable, and examples thereof include an anion exchange resin, a cation exchange resin, an amphoteric ion exchange resin, and a chelate resin. A resin having a porous hydroxyl group is preferable, and examples of a preferable resin include a strongly basic anion exchange resin (II type) and a glucamine type chelate resin.

本発明においては、単一の脂肪酸組成を有するリン脂
質と、任意の脂肪酸又はその低級アルコールエステルと
を、1,3位位置特異性リパーゼの存在下で、エステル交
換反応させるに際しては、生成する水又は低級アルコー
ルを反応系外に除き、反応系を微水反応系に保ちながら
反応を行うことが必要である。本発明で微水系とは、反
応全系中の水分含量が０％を越え、10％以下、好ましく
は０％を越え、５％以下である系をいう。In the present invention, when a phospholipid having a single fatty acid composition and an arbitrary fatty acid or a lower alcohol ester thereof are subjected to a transesterification reaction in the presence of a 1,3-position-specific lipase, water produced is Alternatively, it is necessary to remove the lower alcohol out of the reaction system and carry out the reaction while keeping the reaction system in a slightly water reaction system. In the present invention, the term "slightly aqueous system" refers to a system in which the water content in the whole reaction system is more than 0% and 10% or less, preferably more than 0% and 5% or less.

また更に、単一の脂肪酸組成を有するジアシルグリセ
ロリン脂質を製造する際にも生成する水又は低級アルコ
ールを反応系外に除きながら反応を行うことが好まし
い。水または低級アルコールを系外へ除く方法として
は、反応後期または全反応にわたり、減圧条件下または
窒素等の不活性ガス気流下で反応を行う方法や、モレキ
ュラーシーブや脱水剤を添加して反応を行う方法などが
挙げられる。Furthermore, it is preferable to carry out the reaction while removing water or a lower alcohol generated outside the reaction system when producing a diacylglycerophospholipid having a single fatty acid composition. As a method of removing water or a lower alcohol from the system, a method in which the reaction is carried out at a reduced pressure or under an inert gas stream such as nitrogen over the latter half of the reaction or the whole reaction, or a method in which a molecular sieve or a dehydrating agent is added to carry out the reaction. And the like.

また、単一の脂肪酸組成を有するジアシルグリセロリ
ン脂質を製造する際には、グリセロリン酸又はその塩又
はその誘導体を粉末状のまま脂肪酸または脂肪酸エステ
ルと反応させても良いが、グリセロリン酸又はその塩又
はその誘導体の水溶液として反応させても良い。また溶
媒として脂肪酸またはそのエステルを溶解する溶媒を用
いて反応を行っても良い。尚、溶媒を用いて反応を行う
場合には、反応途中から減圧下で溶媒も除去する等の方
法を取る必要がある。より具体的には、グリセロリン酸
又はその塩又はその誘導体の水溶液のpHは２〜10、好ま
しくは５〜８であり、濃度は10％以上、好ましくは飽和
溶液に近いほど良い。グリセロリン酸又はその塩又は誘
導体と脂肪酸またはそのエステルとの反応比率は、モル
比で２倍以上あれば良いが、脂肪酸もしくはそのエステ
ルを分散媒として使用する場合や、より反応を速めるた
めにその比率を上げることは問題がない。尚、生成した
グリセロリン脂質を溶剤分別（アセトン沈澱）などで回
収する場合には、分散媒として使用する脂肪酸又はその
エステルを10倍程度に抑えることが好ましい。また分散
媒として、反応に使用する脂肪酸種が低融点のものであ
る場合、同種の脂肪酸組成のトリグリセリドを使用する
方法が好ましいが、脂肪酸及びそのエステルを溶解分散
させ、リパーゼまたはエステラーゼを失活させない溶媒
なら特に規定はしない。例えば無極性のヘキサン、シク
ロヘキサン、ベンゼン、トルエン等や、クロロホルム、
ジクロロエタン等のハロゲン化物も使用できる。When producing a diacylglycerophospholipid having a single fatty acid composition, glycerophosphoric acid or a salt or a derivative thereof may be reacted with a fatty acid or a fatty acid ester in powder form, but glycerophosphoric acid or a salt thereof or The reaction may be carried out as an aqueous solution of the derivative. The reaction may be performed using a solvent that dissolves a fatty acid or an ester thereof as a solvent. When the reaction is carried out using a solvent, it is necessary to take a method such as removing the solvent under reduced pressure during the reaction. More specifically, the pH of the aqueous solution of glycerophosphoric acid or a salt or derivative thereof is 2 to 10, preferably 5 to 8, and the concentration is 10% or more, and is preferably as close to a saturated solution as possible. The reaction ratio between glycerophosphoric acid or a salt or derivative thereof and a fatty acid or an ester thereof may be at least twice as much as a molar ratio. However, when a fatty acid or an ester thereof is used as a dispersing medium, or the reaction ratio is increased to further accelerate the reaction. There is no problem raising. When the generated glycerophospholipid is recovered by solvent separation (acetone precipitation) or the like, it is preferable to reduce the number of fatty acids or esters thereof used as a dispersion medium to about 10 times. When the fatty acid species used in the reaction has a low melting point as the dispersion medium, a method using triglycerides having the same fatty acid composition is preferable, but the fatty acid and its ester are dissolved and dispersed, and the lipase or esterase is not deactivated. There is no particular limitation for solvents. For example, non-polar hexane, cyclohexane, benzene, toluene, and chloroform,
Halides such as dichloroethane can also be used.

反応温度については特に限定はしないが20〜100℃で
酵素の失活しない温度であれば良い。酵素反応の初期に
水分が多く存在する場合は35℃以下の穏和な条件で酵素
失活を抑えることが好ましく、逆に水及び低級アルコー
ルを反応系内から除く場合には、できるだけ高温で反応
することが望ましい。尚、グリセロリン脂質に導入する
脂肪酸又はそのエステルが、高度不飽和脂肪酸である場
合は反応温度は70℃以下で、できるだけ抗酸化剤（例え
ばトコフェノール）などを添加することも好ましい。一
般的には、フリーの酵素や菌体粉末などを使用する場合
は20〜50℃で、固定化酵素や耐熱性の酵素を使用する場
合は40〜100℃で使用すると良い。The reaction temperature is not particularly limited, but may be any temperature at 20 to 100 ° C. that does not inactivate the enzyme. When a large amount of water is present at the beginning of the enzymatic reaction, it is preferable to suppress the inactivation of the enzyme under mild conditions of 35 ° C or less. Conversely, when water and lower alcohols are removed from the reaction system, the reaction is performed at as high a temperature as possible. It is desirable. When the fatty acid or its ester to be introduced into the glycerophospholipid is a highly unsaturated fatty acid, the reaction temperature is preferably 70 ° C. or less, and it is also preferable to add an antioxidant (eg, tocophenol) as much as possible. Generally, it is preferable to use the enzyme at 20 to 50 ° C. when using a free enzyme or cell powder, and at 40 to 100 ° C. when using an immobilized enzyme or a heat-resistant enzyme.

〔実施例〕〔Example〕

以下、参考例、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。Hereinafter, the present invention will be described in more detail by reference examples and examples, but the present invention is not limited to these examples.

参考例 グリセロリン酸２ナトリウム６水和物（関東化学
（株）製）10gを水5mlに溶解後、オレイン酸エチル（東
京化成（株）製）32gを窒素気流下で撹拌混合後、リゾ
プス・ジャポニカス由来の酵素（大阪細研製、オリパー
ゼ4S）を多孔性樹脂に固定化したもの1000Uを添加し40
℃で12時間反応後、キャンジタ・アンタルクティカ由来
の固定化酵素（Novo社製）50Uを添加し、減圧下で反応
を24時間、50℃で反応した。Reference Example After dissolving 10 g of disodium glycerophosphate hexahydrate (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.) in 5 ml of water, 32 g of ethyl oleate (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was stirred and mixed under a nitrogen stream, followed by Rhizopus japonica. Immobilized on porous resin with an enzyme derived from yeast (Olipase 4S, Osaka Seiken Co., Ltd.)
After the reaction at 12 ° C. for 12 hours, 50 U of immobilized enzyme derived from Candida antarctica (Novo) was added, and the reaction was carried out at 50 ° C. for 24 hours under reduced pressure.

反応後は、ヘキサン10mlを添加し、反応終了品を濾別
しヘキサン相を回収した。そのヘキサン相を50mlの水で
水洗した後、ヘキサン相を減圧除去した。After the reaction, 10 ml of hexane was added, and the reaction-completed product was separated by filtration to collect a hexane phase. After washing the hexane phase with 50 ml of water, the hexane phase was removed under reduced pressure.

この反応終了品から未反応の脂肪酸を除去するため冷
アセトン中で撹拌後、遠心分離し沈澱を回収した。回収
した生成物は4.2gであった。この一部を取り高速液体ク
ロマトグラフィー（ガスクロ工業（株）製:Unisil Q NH
₂、溶離条件アセトニトリル：エタノール:10mMリン酸２
水素アンモニウム溶液＝40:50:10）にて分析を行った。
結果は、ホスファチジン酸（PA）88％、リゾホスファチ
ジン酸（Ｌ−PA）12％であった。After stirring in cold acetone to remove unreacted fatty acids from the reaction-completed product, the precipitate was collected by centrifugation. The recovered product weighed 4.2 g. A part of this is taken and high performance liquid chromatography (Gascro Industry Co., Ltd .: Unisil Q NH
_2. Elution conditions acetonitrile: ethanol: 10 mM phosphoric acid 2
The analysis was performed with ammonium hydrogen solution = 40: 50: 10).
The results were 88% phosphatidic acid (PA) and 12% lysophosphatidic acid (L-PA).

このリン脂質をクロロホルムに溶解させシリカゲルカ
ラムにてクロロホルム：メタノール＝2:3で溶出された
画分を集めたホスファチジン酸として98％のもの3gを得
た。The phospholipid was dissolved in chloroform, and the fraction eluted with chloroform: methanol = 2: 3 on a silica gel column was collected to obtain 3 g of 98% phosphatidic acid as phosphatidic acid.

参考例２ 参考例１で得られた構成脂肪酸がオレイン酸のみであ
るホスファチジン酸2gにラウリン酸エチル10gを加え、
窒素気流下撹拌しながら、リゾプス・ジャポニカス由来
の酵素（大阪細研製、オリパーゼ4S、水分7.5％）1000U
を添加し、50℃で24時間反応せしめた。Reference Example 2 10 g of ethyl laurate was added to 2 g of phosphatidic acid in which the constituent fatty acid obtained in Reference Example 1 was only oleic acid,
1000 U of enzyme derived from Rhizopus japonicas (Olipase 4S, 7.5% water content) while stirring under a nitrogen stream
Was added and reacted at 50 ° C. for 24 hours.

反応後は、ヘキサン100mlを添加し、反応終了品を濾
別しヘキサン相を回収した。そのヘキサン相を50mlの水
で水洗した後、ヘキサン相を減圧除去した。After the reaction, 100 ml of hexane was added, the reaction-terminated product was separated by filtration, and the hexane phase was recovered. After washing the hexane phase with 50 ml of water, the hexane phase was removed under reduced pressure.

この反応終了品から未反応の脂肪酸を除去するため冷
アセトン中で撹拌後、遠心分離し沈澱を回収した。After stirring in cold acetone to remove unreacted fatty acids from the reaction-completed product, the precipitate was collected by centrifugation.

この一部を取り高速液体クロマトグラフィー（ガスク
ロ工業（株）製:Unisil Q NH₂、溶離条件アセトニトリ
ル：エタノール:10mMリン酸２水素アンモニウム溶液＝4
0:50:10）にて分析を行った。結果は、α−ラウロイル
−β−オレオイル−グリセロールリン酸が34％であり、
未反応のジオレオイルグリセロールリン酸は66％であっ
た。A part of this was taken and high performance liquid chromatography (Gascro Industry Co., Ltd .: Unisil Q NH ₂ , elution conditions: acetonitrile: ethanol: 10 mM ammonium dihydrogen phosphate solution = 4
(0:50:10). The result is 34% α-lauroyl-β-oleoyl-glycerol phosphate,
Unreacted dioleoylglycerol phosphate was 66%.

実施例１ 参考例２において固定化酵素の効果を見るためにリゾ
プス・ジャポニカス由来の酵素（大阪細研製、サイケン
100）を多孔性アニオン樹脂に固定化した固定化酵素
（水分10％のもの）1000Uを用いた他は同じ条件で反応
せしめ、参考例２と同様の後処理、分析を行った。Example 1 In order to see the effect of the immobilized enzyme in Reference Example 2, an enzyme derived from Rhizopus japonicas (manufactured by Osaka Seiken, Saiken)
The reaction was carried out under the same conditions except that 1000 U of immobilized enzyme (100%) immobilized on a porous anion resin was used, and the same post-treatment and analysis as in Reference Example 2 were performed.

結果は、α−ラウロイル−β−オレオイル−グリセロ
ールリン酸が63％であり、未反応のジオレオイルグリセ
ロールリン酸は37％であった。As a result, α-lauroyl-β-oleoyl-glycerol phosphate was 63%, and unreacted dioleoylglycerol phosphate was 37%.

実施例２ 実施例１において、ラウリン酸エステルに代えてステ
アリン酸エチルを13g用い、溶媒としてヘキサン100mlを
用いた他は同じ条件で反応せしめ、実施例１と同様の後
処理、分析を行った。Example 2 A reaction was carried out under the same conditions as in Example 1 except that 13 g of ethyl stearate was used instead of lauric ester and 100 ml of hexane was used as a solvent.

結果は、α−ステアロイル−β−オレオイル−グリセ
ロールリン酸が47％であり、未反応のジオレオイルグリ
セロールリン酸は53％であった。As a result, α-stearoyl-β-oleoyl-glycerol phosphate was 47%, and unreacted dioleoylglycerol phosphate was 53%.

比較例 参考例２において、リゾプス・ジャポニカス由来の酵
素（大阪細研製、オリパーゼ4S）に代えてキャンジダ・
シリンドラッセ由来の酵素（名糖産業、リパーゼMY）20
00Uを用いた他は同一条件で反応せしめた。反応後、参
考例２と同様に後処理、分析を行った。Comparative Example In Reference Example 2, Candida albicans was used instead of Rhizopus japonicas-derived enzyme (Olipase 4S, manufactured by Osaka Seiken).
Enzymes derived from syrindrasse (Meito Sangyo, Lipase MY) 20
The reaction was carried out under the same conditions except that 00U was used. After the reaction, post-treatment and analysis were performed in the same manner as in Reference Example 2.

結果は、α−ラウロイル−β−オレオイル−グリセロ
ールリン酸が3.9％、α−オレオイル−β−ラウロイル
−グリセロールリン酸が1.9％、α，β−ジラウロイル
−グリセロールリン酸が0.6％、未反応のジオレオイル
グリセロールリン酸が44.4％、β−オレオイル−グリセ
ロリン酸47.7％、その他のリゾリン脂質1.5％であっ
た。As a result, 3.9% of α-lauroyl-β-oleoyl-glycerol phosphate, 1.9% of α-oleoyl-β-lauroyl-glycerol phosphate, 0.6% of α, β-dilauroyl-glycerol phosphate, unreacted Dioleoyl glycerol phosphate was 44.4%, β-oleoyl-glycerophosphate 47.7%, and other lysophospholipid 1.5%.

〔発明の効果〕〔The invention's effect〕

本発明の方法により、目的とする脂肪酸組成を有する
不純物の無いリン脂質を低温かつ穏和な条件で製造する
ことが可能となった。そのため、高度不飽和アルキル基
の導入されたリン脂質を任意に得ることや、一定のアル
キル組成を持つリン脂質の入手が容易に行えるようにな
った。ADVANTAGE OF THE INVENTION By the method of this invention, it became possible to produce the phospholipid which has the objective fatty acid composition and which has no impurity under low temperature and mild conditions. Therefore, it has become possible to easily obtain a phospholipid into which a highly unsaturated alkyl group is introduced, and to easily obtain a phospholipid having a fixed alkyl composition.

以上のことにより、いままで食品、化粧品等の乳化剤
として使用する場合に、その着色、臭い、糖脂質等の不
純物により使用濃度、範囲が制限されていたが、このよ
うな制限に縛られることなく使用できるようになった。
また、磁気記録媒体などに分散剤としてのリン脂質が使
用されてきているが、本発明により天然にないリン脂質
や自由な脂肪酸組成を有するリン脂質を入手することに
より、純度及び高温、広域pHでの乳化安定性の高いリン
脂質を自由に得ることが可能となった。By the above, when used as an emulsifier for foods, cosmetics, etc., its concentration, use concentration and range were limited by its coloring, odor, impurities such as glycolipids, but without being restricted by such restrictions Now available.
Further, phospholipids as a dispersant have been used in magnetic recording media and the like.However, by obtaining phospholipids having a non-naturally occurring phospholipid or a free fatty acid composition according to the present invention, purity and high temperature, a wide range of pH can be obtained. It has become possible to freely obtain a phospholipid having a high emulsification stability in the above method.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 9/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (58) Field surveyed (Int. Cl. ⁶ , DB name) C12P 9/00 CA (STN) REGISTRY (STN)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】トリグリセリドの位置特異性のある水及び
有機溶剤に不溶性の担体上に固定化したリパーゼと特異
性の無い水及び有機溶剤に不溶性の担体上に固定化した
リパーゼとの両方の存在下で、単一脂肪酸又はその低級
アルコールエステルと、グリセロリン酸又はその塩又は
その誘導体とを、エステル合成もしくはエステル交換反
応させて単一の脂肪酸組成を持つジアシルグリセロリン
脂質を製造した後、この単一の脂肪酸組成を持つジアシ
ルグリセロリン脂質と、任意の脂肪酸又はその低級アル
コールエステルとを、水及び有機溶剤に不溶性の担体上
に固定化した1,3位位置特異性リパーゼの存在下に、反
応系の水分を微水に保ちながらエステル交換反応させる
ことを特徴とする、目的とする脂肪酸組成を有するグリ
セロリン脂質の製造方法。1. The presence of both a lipase immobilized on a carrier insoluble in water and an organic solvent having trispecificity of triglyceride and a lipase immobilized on a carrier insoluble in water and an organic solvent having no specificity. A single fatty acid or a lower alcohol ester thereof and glycerophosphoric acid or a salt or a derivative thereof are ester-synthesized or transesterified to produce a diacylglycerophospholipid having a single fatty acid composition. A diacylglycerophospholipid having a fatty acid composition of, and any fatty acid or lower alcohol ester thereof, is immobilized on a carrier insoluble in water and an organic solvent, in the presence of a 1,3-position-specific lipase, Production of glycerophospholipid having desired fatty acid composition, characterized in that transesterification is carried out while keeping water at a low level Law. 【請求項２】単一の脂肪酸組成を持つジアシルグリセロ
リン脂質の製造時において、生成する水又は低級アルコ
ールを反応系外に除きながら反応を行うことを特徴とす
る請求項１記載の製造方法。2. The process according to claim 1, wherein the reaction is carried out while producing diacylglycerophospholipid having a single fatty acid composition while removing generated water or lower alcohol outside the reaction system.