JP2846116B2 - 鶏貧血症ウィルス（ｃａｖ）組換え核酸、それを含むｃａｖ診断キット、および原核細胞または真核細胞、ならびにｃａｖ２本鎖ｄｎａの製造方法 - Google Patents

鶏貧血症ウィルス（ｃａｖ）組換え核酸、それを含むｃａｖ診断キット、および原核細胞または真核細胞、ならびにｃａｖ２本鎖ｄｎａの製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、DNA（およびRNA）組替え技術、診断、免
疫、ワクチンによる遺伝子技術（遺伝子組替え）の分野
に関する。さらに鶏貧血症ウィルス（CAV）のDNA遺伝子
の検出とクローニングと、継続分析およびその応用に関
する発明である。
発明の背景 鶏の伝染性貧血症の原因は現在のところCAVに分類さ
れていない。そのウィルスは1979年日本で最初に分離さ
れ、若鶏中でこれによって起こる一連の貧血症にその名
が与えられた（Yuasaら,1979）。CAV伝染の他の症状
は、骨髄の萎縮症、胸腺中のリンパ球の死亡症である。
傷害は腎臓と肝臓に起こる。
１日雛は、最も影響を受ける。これらの動物は昏睡状
態で、食欲不振と一時的貧血症が４〜７日観察され、約
半分はCAV感染後に２〜３週間で死ぬ。孵化後の日数が
増加すると、自然抵抗もまた増加する。７日雛は感染後
一時的貧血症だけが起こる。14日雛は感染しても貧血症
にならない。
CAV感染に対する予防とCAV症状の減少は、体液の免疫
性の欠乏機構に強く関係する。Vielitz（1989）は、層
の中でCAVに感染した肝臓の懸濁液によって制御して暴
露することによって免疫性物質を入手し、効果的に予防
する方法を発達させた。ドイツでは、この免疫法が実際
に使われたが全く危険がないわけではなかった。
LelystadにおけるCentraal Diergeneeskundig Instit
uut（CDI）で分離された家畜舎内に飼育された動物実験
では、抗体物質の防護値を確立した。ここで制御された
暴露とは、組織培養で繁殖されたCAVで実行されてい
る。CAVに対する抗体物質の存在は、予防接種された母
親動物から１日雛のCAV感染を完全に予防する。CAV症状
はほとんど起こらない。この有効な予防はまた免疫され
た層を入手することによって得られ、特別の無菌原菌
（SPF）の雛を同じ免疫された層の卵黄で接種すること
で得られる。CAV抗体の管理によってCAV感染に関する効
果的予防は４週間持続する。そして予防が完成する。こ
れらの実験は、母親動物のワクチンによる抗体物質が実
際の立場で重要な予防の役割を果すことを示している。
CAV感染を免れた雛の中で胸腺リンパ球の特別な固体
群の減少が起こる（Jeurissenら,1989）。胸腺萎縮症
は、CAVに起因する免疫低下の原因の可能性がある。そ
の結果、特別なワクチンは、たとえばNewcastle病のよ
うに効果が少なくなる。CAVは、Marek病およびGumboro
病に認められる増加した損失で群の中で分離され、（In
fection Bursal Disease Virus,IBDY;Yuasaら、1980）
そしてレオウィルスと関連して青翼病の動物の中で分離
された（Engstrem,1988a;Engstremら,1988b）。二
重免疫の実験で他の雛ウィルスに関連してCAVの強めた
性質が公開された（たとえばMarek病ウィルス、MDV,De
Boerら,1989a）。最近急激に減少された接種反応はNewc
astle病とCAVにおいて免疫管理にエアゾールワクチン処
理後の我々自身の実験で観察された。そのためCAVは、
他のウィルス免疫における免疫抑制と強化効果を導く。
これらのCAVの性質は、実際にウィルス性疾患の発生減
少に影響をおよぼす。
CAVは、世界中に拡がっているようだ。CAVは日本でス
タートしたと考えられるが、その後最初のCAVの単離は
ヨーロッパ、すなわちドイツでVon Blow（1983）によ
って、英国でMcNultyら（1990）によって行われた。オ
ランダにおいて、アメリカ、イスラエル、チュニジアか
らの物質からCAVの単離がBoerら（1988）によって行わ
れた。利用しうる文献データは、単離が１つの血清型に
関して行われたことを示している。しかしいくつかの単
離の分野は、それらの相互の関係のためにそして病原体
の中での異なっている可能性のためにテストされている
（McNultyら,1990）。ブロックの中でCAVの伝播は、お
そらく***物と空気を介する感染によって起こる。子孫
にウィルスの縦への伝播は、しかしまたCAV疫学の中で
重要な役割を演じている。各国でCAVの存在は、血清学
的に証明された。
組織培養の条件下で、CAVは増加している。CAVは、従
来リンパ様白血病（1104−X5細胞;Yuasa,1983）からの
リンパ芽球細胞列で転位された。細胞変位効果（CPE）
のみによるMDV中で（MDCC−MSB1細胞）またはMarek病の
リンパ球からのリンパ芽球細胞列に転移された。
Toddらによる最近の研究（1990）は、CsCl勾配中で1.
33〜1.34g/mlの比重で濃縮した23.5nmの直径をもつウィ
ルス粒子（精製されたCAV物質中での）が記載されてい
る。ウィルスは１つの主なポリペプチド（Mr;50,000）
と2.3キロベースの長さをもつ単一鎖のDNA遺伝子とをも
つ。２つの小さいウィルス、すなわちPorcine Circovir
usおよびウィルスは、Psittacine BeakとFeather Disea
seとを単一鎖DNAと類似のCAVとに結合させる。しかしよ
り小さい遺伝子とより小さいウィルス粒子半径の（Ritc
hieら,1989;Tischerら,1982）CAVは、パルボウィルスに
属することは長い間受入れられた。パルボウィルスの多
くは単一鎖DNAウィルスであるけれども、それらは直鎖D
NAと、より大きい遺伝子とを有し、生きたポリペプチド
の他の組成物の可能性がある。
発明の簡潔な記述 ウィルスの複製と転写に関与する細胞成分は、DNAが
二本鎖形状を有するときに限って機能的であるというこ
とは一般的に受け入れられている。環状一本鎖DNAを有
するウィルスは、それが二本鎖DNAを構成する期間中、
細胞内に存在し得る。本発明者らは、この事実を利用し
た。
本発明者らは、CAV感染1104−X5およびMDCC−MSB1細
胞中、2.3kbの長さを有する二重鎖CAV DNAを同定し、そ
してそれをPIC−20Hにクローンした。前記DNAは、完全
に塩基配列が決定された（図１）。標識したクローン化
CAV−DNAを用いる診断テストにおいて、ウィルス、肝臓
および組織培養調製物中にCAV核酸の存在を立証でき
た。クローンされたCAVは組織培養および動物実験の両
方において、野生型CAVと同一の生物学的、病理性特徴
を有することが見い出された。
PCRとハイブリダイゼーション試験で、クローンされ
た完全なCAVゲノムは、野外のCAVに、典型的であること
が示された。32P標識したDNAプローブを用いたサザン分
析で、全ての野外単離株が2.3kbのDNA分子を含むことが
立証された。制限酵素分析は、クローンされたCAV DNA
が野外単離株のDNAと一致することを示している。ドッ
トブロットアッセイにおいて、ジゴキシゲニンで標識し
たCAV DNAは、異なった野外単離株のDNAと特異的にハイ
ブリダイズすることが証明された。クローンされたCAV
配列に由来する配列（図４）のオリゴヌクレオチドを用
いるPCR試験で、CAV DNAが特異的に増幅され、認識され
た。
発明の詳細な記述 本発明の第１の課題は、鶏貧血症ウィルス（CAV）遺
伝子またはその一部のヌクレオチド配列に応答し、また
はそれを補充するCAV特異、ヌクレオチド配列からなる
差別化されまたは差別化されないDNAまたはRNAの個体中
での組替え遺伝子情報である。
本発明の好ましい実施態様は、前記CAV遺伝子または
その一部のヌクレオチド配列が、図１で示される均一な
ヌクレオチド配列を少なくとも60％含むことを特徴とす
る。
可能な表現として、DNAとRNAから選ばれた核酸、たと
えば裸のDNAまたはRNAの固体中でおよびある方法（たと
えば蛋白質またはウィルス粒子中）で包まれたDNAまた
はRNAの固体中で他の物質（たとえば担体または標識と
して機能する物質）と結合される。DNAは単一鎖または
２重鎖DNAであり得るし、また直鎖状および円状であり
うる。
本発明に関する組替え遺伝子情報の特徴は、CAV特殊
ヌクレオチド配列の中に存在する。このCAV配列は、CAV
全遺伝子を覆う必要はない。実験的な観点から特別な部
分は本出願で最も必要であり好ましい。
第１の好ましい実施態様は、前記CAV遺伝子またはそ
の一部のヌクレオチド配列が、CAV遺伝子中で生じるCAV
蛋白質のためにコード化するヌクレオチド配列かその一
部であることを特徴とすることであり、このようなコー
ド化配列からなる組替えDNAが、たとえばCAVの検出に用
いられ、試料中のメッセンジャRNAがCAV蛋白質またはそ
の一部を製造するための方法として用いられる。「その
一部」という語は、原理的にCAV特殊性として設計され
うる全ての部分から成る。蛋白質レベルでこれは本出願
の最も重要な、たとえば抗体による認識されうる抗原決
定のような課題であろう。
他の実験態様は、前記CAV遺伝子またはその一部のヌ
クレオチド配列が、CAV遺伝子中で生じる制御因子を有
するヌクレオチド配列かその一部であることを特徴とす
る。その一例は、CAV蛋白以外の蛋白質のためにコード
化する配列と結合するCAV促進物／増強物の使用であ
る。たとえば鶏のような家畜やCAVの制御信号が効果的
である他の動物の中の非CAV蛋白質の可能な拡張に使用
することである。
上の場合と一般の場合とに、本発明に関する組替え遺
伝子情報は、またはCAV遺伝子から誘導されないヌクレ
オチド配列からなる。ここで「CAV遺伝子から誘導され
ないヌクレオチド配列」とは、たとえば無核または有核
発現ベクターから誘導されたヌクレオチド配列によって
形成される。かくて本発明は、真核生物の組織中で発現
されるために適した（ウィルス性または非ウィルス性）
ベクター中で、または細菌中で発現するために適したプ
ラスミド中へCAV特定物質配列の挿入の可能性からな
る。さらに「CAV遺伝子から誘導されないヌクレオチド
配列」として本発明に関する組替え遺伝子情報は、CAV
遺伝子中で生じないで制御因子を有するヌクレオチド配
列からなる。
「CAV遺伝子から誘導されないヌクレオチド配列」
は、しかしまたCAV蛋白質以外の蛋白質（の一部）のた
めにコード化するヌクレオチド配列からなる。たとえば
CAV制御信号が非CAV蛋白質（またはその一部）にCAVに
接触しやすい宿主中に発現するために用いられる。
組替えDNAがハイブリッドの生産またはCAV蛋白質が、
非CAV蛋白質のエピトープのための担体として機能す
る、または逆に非CAV蛋白質がCAV蛋白質のエピトープの
ために担体として機能する蛋白質の融合に用いられる。
もし本発明に従う組替え遺伝子情報が、試料中の補充
DNAまたはRNAの検出のために用いられるならば差別化が
必要である。ここで用いる差別化は、DNAやRNAに用いる
のに適する差別化されたDNAまたはRNAの検出を可能に
し、容易にする標識である。当業者の中ではこの目的に
適した多くの標識、たとえば（Ｐ−32のような）放射性
同位元素、（パーオキシダーゼのような）酵素分子、
（ピオチンのような）ハプテン、染料、（無機リン発光
物のような）蛍光物質、および（金やセレンのような）
粒子状標識物が知られている。
また本発明の第２の課題は、特に、診断、免疫化また
は予防接種の目的またはCAVもしくは非CAV蛋白質の製造
のために上で定義された組替え遺伝子情報の使用に関す
る。
さらに本発明は、CAV−DNAまたはCAV−RNAを検出する
方法、たとえばDNA/RNAスロットブロッティング、サザ
ンブロッティング、ノーザンブロッティング、特定部位
における組替え、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるD
NA拡張、S1マッピング、プライマエクステンションの方
法におけるCAV特殊プローブまたはプライマとして前記
の組替え遺伝子情報を使用する方法であり、DNA/RNAス
ロットブロッティング、サザンブロッティング、ノーザ
ンブロッティング、特定部位における組替え、PCRによ
るDNA拡張、S1マッピングのようなCAV−DNAまたはCAV−
RNA検出のための診断器具においてCAV特殊プローブまた
はプライマとして前記の組替え遺伝子情報を用いること
を特徴とする診断器具である。
さらに本発明は、CAVまたは他の病原体に対する予防
を実現するための生きたウィルスワクチンとして、前記
の組替え遺伝子情報を使用する方法であり、CAVまたは
他の病原体に対する免疫化のためのワクチン調合法にお
いて、前記の組替え遺伝子情報および生きたウィルスワ
クチンのために適する１つまたはそれ以上の抗体または
補助物からなることを特徴とするワクチン調合法であ
る。
また本発明は、CAV蛋白質、CAV蛋白以外の蛋白を試験
中または生体中で製造するための方法において、前記の
組替え遺伝子情報を使用する方法であり、前記の組替え
遺伝子情報を含むことを特徴とする原核生物または真核
生物の細胞であり、特に前記の組替え遺伝子情報を含
み、前記遺伝子組替え情報によってエンコードされた少
なくとも１つの蛋白質または蛋白質の部分の実現を可能
にすることを特徴とする原核生物または真核生物の細胞
である。これらの異なった可能性はこの記述の中で広く
説明されるだろう。
本発明の次の課題は、前記の組替え遺伝子情報の試験
管内の転位によって得られ、CAV蛋白質またはそ一部の
ためにコード化するヌクレオチド配列からなることを特
徴とするCAV蛋白質またはその一部であり、前記の組替
え遺伝子情報を含み、CAV蛋白質またはその一部のため
にコード化するヌクレオチド配列からなり、その実現を
可能にする原核生物または真核生物の細胞から単離によ
って得られることを特徴とするCAV蛋白質またはその一
部である。
また蛋白質のレベルについて、本発明は異なった応用
に拡大されている。その実施態様は、診断、免疫化もし
くは予防接種の目的、またはCAV特殊抗体の製造のため
に前記のCAV蛋白質またはその一部を使用する方法であ
る。
より具体的に、CAV特殊抗体を検出するための免疫的
方法、たとえば免疫性過酸化酵素、染料、ELISA、免疫
性蛍光染料を用いる方法において、CAV特殊抗体を結合
する試薬として前記のCAV蛋白質またはその一部を使用
する方法であり、免疫性過酸化酵素、染料、ELISAまた
は、免疫性蛍光染料のような免疫的方法を用いて、CAV
特殊抗体を検出するための診断器具において、CAV特殊
抗体を結合する試薬として前記のCAV蛋白質またはその
一部を含むことを特徴とする診断器具である。
また本発明は、CAVに対する防護を実現するためのサ
ブユニットワクチンとして前記のCAV蛋白質またはその
一部を使用する方法であり、同様にCAVに対する免疫を
有するワクチン調整法において、前記のCAV蛋白質また
はその一部とサブユニットワクチンのために適する任意
の１つまたはそれ以上の抗体と補助体とからなることを
特徴とする調整法である。
また本発明は、CAV特殊ポリクローナルまたはモノク
ローナル抗体を製造するための過程で、前記のCAV蛋白
質またはその一部を使用する方法であり、これらの応用
例は、この記述の中で広く述べられている。
さらに本発明の次の課題は、また前記のCAV蛋白質ま
たはその一部によって製造されたCAV特殊抗体であり、
同様に診断、免疫もしくは予防接種の目的または調整法
の目的のために、前記のCAV特殊抗体を使用する方法で
ある。
より具体的にCAV蛋白質を検出する免疫的方法におい
て試薬を結合するCAV蛋白質として、前記のCAV特殊抗体
を使用する方法であり、同様に免疫的方法でCAV蛋白質
を検出するための診断器具において、試薬を結合するCA
V蛋白質として、前記のCAV特殊抗体を含むことを特徴と
する診断器具である。
さらにその実施態様は、CAV感染に対する受動免疫の
ために、前記のCAV特殊抗体を使用する方法であり、同
様にCAVに対する受動免疫調整法において、前記のCAV特
殊抗体との任意の１つまたはそれ以上の受動免疫に適し
た抗体または補助体とからなることを特徴とする調整法
である。特に、本発明に従う組替え生産物の層で免疫化
することである。
調剤法の応用に関しての一例は、CAV蛋白質の単離お
よび／または精製のための方法で前記の特殊抗体を使用
する方法である。最も重要な用途は、以下の実施例中で
より具体的に説明されるであろう。
実施例 CAV感染細胞から分離した低分子DNAの分析。
精製したウィルスの標本から分離したCAV遺伝子は、
約2300塩基の長さを有する１本鎖DNA分子であることが
証明された（Toddら,1990）。
我々の予想は、CAV感染細胞においてウィルスの環状
１本鎖DNAを加えることによって、環状の２本鎖DNAがま
た生じるということである。環状の２本鎖DNAは、制限
酵素によって切断することができ、そしてそれゆえに１
本鎖DNAとは対象的に直接クローンすることができる。
それゆえに、非感染細胞が存在しないCAV−感染細胞の
低分子断片において、DNA生産物が生じるかどうか調べ
られた。
低分子DNAは、CAV感染MDCC−MSB1,1104−X5細胞およ
び非感染1104−X5細胞から分離された。そのDNAは、ア
ガロース／エチジウムブロミドゲルで分別された。約３
キロベースペア（kbp）の長さを有する（測定値とし
て）大変弱いDNAバンドは、ゲルによって認識できる。
この特定のDNA生産物は、非感染細胞から分離されたDNA
には存在しない。
次のような実験において、その特定DNAは、CAV−感染
細胞においてのみ存在することがより確実になった。感
染細胞から分離されたDNAはアガロースゲル法によって
長さで分別された。2.7〜3.5kbpの長さを有するDNAが分
離された。このようなDNA断片は、他の細胞のDNAの他
に、特定のウィルスDNAを含まなければならないだろ
う。分離されたDNAは、放射能で標識化され、そしてCAV
−感染細胞からの低分子DNAと非感染細胞からの低分子D
NAとのサザン法で、ハイブリッドを形成した。
最高で3kbpのDNA生産物が、CAV感染細胞のブロットで
ハイブリッドを形成し、前記DNA生産物は、非感染細胞
のDNAブロットには存在しなかった。
3kbpの長さは、２本鎖のDNA分子からなるDNAマーカー
で限定される。アガロースゲル中での２本鎖の環状のDN
A分子の動きは、線状DNA断片の動きとは異なっている。
CAV−感染細胞からの3kbpのDNAは、実際には、2.3kbpの
長さの線状形のDNAであり得た。
もし環状の２本鎖DNAのDNA分子を１カ所だけ切断する
制御酵素で処理するならば、2.3kbpの長さ（測定値）を
有する線状DNA分子が形成されなければならない。
この仮定の正しいことは、CAV−感染1104−X5細胞か
ら分離された低分子DNAを６つの異なった制限酵素（Bam
HI、EcoRI、HindIII、KpnI、PstI、およびXbaI）と一緒
に保温することによって個々に証明された。CAV感染110
4−X5細胞から分離され、上記制限酵素で切断された低
分子のDNAのサザンブロットは、上述した放射能で標識
化されたDNAプローブとハイブリッドを形成する。この
ことは、制限酵素BamHI、EcoRI、PstIおよびXbaIでの処
理が2.3kbpの測定された長さを有するDNA分子を生じさ
せるということを示している。BamHIと保温した非感染
細胞のDNAは、このDNA生産物を含まない。その制限酵素
HindIIIは、DNA内を２カ所切断するが、一方、制限酵素
KpnIは切断しない。
上記実験から、CAV感染細胞の低分子DNAについて、2.
3kbpの環状DNA分子が生じ、前記低分子DNAは非感染細胞
には存在しない。そして低分子DNAは、環状２本鎖DNA分
子の形を有するCAV遺伝子であるという結論を下すこと
ができる。
バクテリアのベクターでの２本鎖CAV−DNAのクローニン
グとサブクローニング。
CAV−感染1104−X5細胞の低分子DNAは、BamHI、BcoR
I、PstIおよびXbaIと別々に保温された。そのDNAは、低
融点のアガロースゲルで分離された。４つのDNAの標本
全てから2.3kbpのDNA分子が分離された。クローニング
ベクターpIC−20Hは、低分子のDNAを切断する同じ４つ
の制限酵素で、別々に処理された。
線状ベクターは、“牛の腸のアルカリフォスァター
ゼ”で処理された。
各2.3kbpDNAフラグメントは、pIC−20Hの制限酵素活
性部位に相当するところで連結された。連結生産物は、
大腸菌株HB101に転移された。
４つのクローニング全てには、約2.3kbpの長さを有す
る挿入DNAを含むプラスミドが与えられた。さらに制限
酵素による分析では、少なくとも７つのプラスミドが、
同じDNAフラグメントに含まれていることを示してい
る。
しかしながらベクターの組替え位置は、環状の分子を
切断、開口するために異なった酵素を使用したために異
なっていた。制限酵素BamHI、EcoRI、PstIおよびXbaIに
よる制限酵素地図は、４つの全てのCAV−DNAクローンで
決定された。
４つの“異なった"CAV−DNAプラスミドは、放射能で
標識化され、そしてCAV−感染および非感染細胞から分
離されたDNA（BamHIで分解されたサザンブロット）とハ
イブリッドを形成する。全ての検査クローンは、CAV−
感染細胞中に存在した2.3kbpDNA分子とだけハイブリッ
ドを形成した。
２つのCAV−DNAクローンの生物学的活性。
２つのCAV−クローンpIC−20H/CAV−EcoRIとpIC−20H
/CAV−PstIは、ベクターからCAVを完全に分離するため
に制限酵素で加水分解された。線状のCAV−DNA分子は、
T4−DNAリガーゼで処理された。線状のCAV−DNAsは、こ
のように環状化される。現在２本鎖環状形を有した“ク
ローン化した"CAV−DNAは、感染細胞である野生型CAV−
DNAに取りついた。
MDCC−MSB1と1104−X5細胞には、“クローン化した”
環状CAV−DNAsが導入された。pIC−20H/CAV−EcoRIのク
ローン化によって、非常に細胞変性効果（CPE）が両細
胞タイプに発見された。クローンpIC−20H/CAV−PstI
は、MDCC−MSB1細胞において鮮明なCPEを起こし、そし
て1104−X5細胞において不鮮明なCPEを起こした。しか
しながら1104−X5細胞に導入されたpIC−20H/CAV−PstI
の上澄み液は、MDCC−MSB1細胞で鮮明なCPEを起こす。C
AV−感染細胞から分離したDNAのトランスフェクション
は、またMDCC−MSB1細胞において鮮明なCPEを起こし、
一方1104−X5細胞においては、鮮明なCPEが見られなか
った。MDCC−MSBI細胞はまたは1104−X5細胞のトランス
フェクション後は、CPEは、pIC−20HベクターDNAでは認
められなかった。
サザン分析は、クローン化したCAV−DNAによって得ら
れたウィルスで感染した（６節）MDCC−MSBIおよび1104
−X5細胞の細胞溶菌液において、CAV−DNAが存在してい
たことを示していた。
MDCC−MSBI細胞での中和試験は、導入細胞においてク
ローン化されたDNAによって起こったCPEは、CAV感染の
結果であったことを示していた。CAVを支配した抗体の
中和は、導入された細胞のCAV世代で感染されたMDCC−M
SBI細胞のCPEを妨げた。
１日雛に、その際その筋肉に導入細胞の上澄み液を注
入した。鶏において、その上澄みは野生型のCAVと同じ
臨床症状を起こした。それは総体重で違いが示される成
長の遅れ、青白い骨髄やヘマトリット値の減少（貧血
性）、胸腺萎縮（特定のＴ細胞の集団の不足）および死
亡率などである。ベクター−DNAに導入された細胞の上
澄みは、対照の鶏において全く病気のきざしを示さなか
った。
２本鎖CAV−DNA遺伝子の配列分析。
完全な２本鎖CAV−DNA遺伝子は、サンガー法（Sanger
ら,1977）とマクサム・ギルバート法によって完全に配
列が決定された。M13配列プライマとM13逆配列プライマ
によって、４つのpIC−20H/CAV（BamHI;EcoRI;PstI;Xba
I）クローンの約2100塩基のDNA配列が決定された。それ
からCAV遺伝子は、サブクローン化された。CAV−DNA遺
伝子の５つの異なったサブクローンのDNA配列は、Ｍ・
Ｂプライマと／またはマクサム・ギルバート法によるサ
ンガー法で決定された。このようにして両鎖のCAV遺伝
子のDNA配列が決定された。
CAV（２本鎖）DNAの長さは、2319bpである。環状CAV
遺伝子のEcoRI部位の最初の塩基は、＋１と番号を付け
られた。多くの／最大の読取り枠を含むDNA鎖の配列
が、図１に示されている。そして（＋）鎖と呼ばれてい
る。
この鎖の塩基の構成は、アデニン25.5％、シスチン2
8.7％、グアニン27.7％。チミン18.1％である。CAV遺伝
子とすでに知られているウィルス配列との起こりうる相
同関係のコンピュータ解析は、そのDNAが以前は記述さ
れてなく、また初期に記述されたウィルス属の分野では
形成されていないことを示している。CAV−DNA遺伝子の
配列と形（環状）に関係する限りにおいては、CAVが微
小ウィルスであるという最初の仮説はもはや正しくはな
い。
コンピュータ解析によるCAV遺伝子の組織化が、特徴
付けられた。読取り枠、プロモータ／エンハーサーエレ
メント、ポリアデニル化シグナルと位置、および“複製
の起源は”は予想される。図２はCAVの両DNAに関する予
想した読取り枠（それは300塩基以上であるが）を示し
ている。図2aは、ATGコドンで始まる読取り枠を示して
いる。ATGコドンは、蛋白質に関して最も頻繁に使用さ
れる開始コドンである。このことは、449アミノ酸（51.
6kDa）、216アミノ酸（24Da）および121アミノ酸（13.3
kDa）の長さを有する３つの蛋白質に関して、両DNA鎖の
１つとして、注目すべきである。Toddら（1990）は、精
製したCAVにおいて50−kDaの蛋白質を示している。もし
全ての読取り枠が正確に利用されるならば、約80％のウ
ィルス遺伝子が、蛋白に読取られている。いくつかの領
域が重なっているとしても３つの読取り枠が、１つのRN
Aから読取られることは十分に可能である。RNA分子の予
想した出発点は、位置354と位置2317に加えられたポリ
（Ａ）である。ポリ（Ａ）シグナルのみが、プラス鎖の
位置2287である。
この読取り枠が他のDNA鎖に利用されたことは残念で
ある。なぜならばこの鎖は、幾つかの重要な正規の配列
が欠けているからである。図2bと図2cとは、開始コドン
としてCTGとGTGとを各々に使用した読取り枠を示してい
る。しかしながらこれらの開始コドンが正確に使用され
たことは、ほんの僅かな蛋白質に関してしか記載されて
いない（Hannら,1988）。
分別されたCAV蛋白質とすでに知られている蛋白との
間の類似性についてのコンピュータ解析は、有能なプロ
グラマをもっても配列の存在に関しては、ほんの僅かな
相同した与えられなかった。したがってCAV蛋白質に似
ている蛋白質のタイプが何かを予想することは、困難で
ある。比較的高い成功が、ウィルスコート、DNA結合蛋
白質および血液凝固蛋白質で行われた。これらの結果は
ここには記載していない。
蛋白質の発現は、プロモータ／エンハンサーエレメン
トで規定される（Junes,1990）。真核生物のプロモータ
は、転写物の開始以前はほとんど右側に位置する。CAV
配列は、TATAボックス、SP1ボックスおよびCAATボック
スなどのような一般要素をキャップ部位の上流に含む。
これらのボックスの配列および部位は、真核生物のプロ
モータのほとんどに記述されているそれらのボックスと
非常によく一致する。285位置周辺には、CREB、MLTF、G
TおよびPEA−Ｉなどの４つの異なっった転移因子に関す
る結合部位が、存在するかもしれない。
真核生物の遺伝子は、真核生物のプロモータの強さを
決定するエンハンサーエレメントを含む。かなりのエン
ハンサーエレメントは、21ヌクレオチドの長さを有し、
144位置と260位置との間に位置する。５つの直列繰返し
体である。全ての繰返し体は、19の同一のヌクレオチド
をもつ。最後の２つのヌクレオチドだけが異なる。繰返
し体１は２と同一であり、そして３は５と等しい。繰返
し体１、２および３は、４および５のようにお互いのそ
ばに位置している。繰返し体３と４との間の位置には、
12のヌクレオチドの“欠陥”がある。コンピュータ解析
は、原核生物に記載されたエンハンサーは、充分なCAV
エンハンサーエレメントが備わっている全ての配列を含
んでいることを示している。全ての直列繰返し体は、CA
V−RNAsの転移物の増加を伴うかもしれないATF要素を含
む。その直列繰返し体は、２つのCATCC配列と２つのCAG
CC配列とを含む。最後の配列は、CATTボックスで重なっ
ている。これら４つの配列は、β−グロムリンについて
記載されたCACCCボックスでわずか１つのミスマッチを
有する（表１）。
図３は、CAV−DNA（１本鎖）における（＋）DNA鎖の5
5位置と135位置との間と2180位置と2270位置との間には
大変大きなヘアピン構造が概ね存在していることを示し
ている。DNAのヘアピン構造は、CAV−DNAの複製に伴う
ものかもしれない。2180と2270との間のヘアピン構造
は、CAV−DNAのみでなく、CAV−RNAにも存在し、CAV−R
NAの安定化の役割を果しているらしい。
感染細胞におけるCAV型DNAの相違。
４つの異なったCAV−DNA分子は、CAV−感染細胞のDNA
標本のサザン点検で確認することができる。そのDNA
は、放射能で標示されたクローンpIC−20HDNA/CAV−Eco
RIのDNAとでハイブリッドを形成した。CAV−DNA分子
は、非変性アガロースゲルとSI−ヌクレアーゼの感受性
で測定した長さと形から、それぞれ２本鎖開環（3kb
p）、超螺旋２本鎖DNA（2kbp）、環状１本鎖DNA（0.8kb
p）および１本鎖線状DNAである。ときどきCAVの線状２
本鎖DNA型を確認することができる（2.3kbp）。Toddら
（1990）は、非変性アガロースゲルでの電気泳動移動度
をもとにして、CAVから分離された環状１本鎖DNAについ
て0.8kbpの長さを測定した。
ウィルス標本でのCAV−DNAの検出。
全DNAはCAVから分離され、そしてVon Blow（1989）
によって記載された方法に従って精製された。そのDNA
標本は、完全なクローン化したCAV配列を含む標示され
たCAV−DNAプローブを用いて、サザン法で分析した。精
製したCAVから分離したDNAは、0.8kbpの長さを有するDN
A分子を含む。その長さは非変性アガロースゲルで測定
された。プローブとしてクローン化されたCAV−DNA配列
に由来するオリゴヌクレオチドを用いる、精製したCAV
から分離したDNAのサザン分析によって、（−）DNA差が
ウィルスに含まれていることが証明された。このことか
ら、カプシド中のCAVの１本鎖DNAは、マイナス鎖である
という結論を下せるかもしれない。
CAV体分析物からのDNAのサザン分析。
DNAの標本は、Marek病が広い範囲で起こっている群の
鶏から得られたCAV分離物から調整した。オランダの12
の会社で入手したCAV分離物のDNA標本は、60のサンプル
の収集物から選択的に選ばれた。その中の１社で、Mare
k病に関する高い死亡率が報告された。そのうえ、CAV分
離物は、ほろほろ鶏から由来した。我々によって調べら
れたCAV分離物は、アニマルヘルスサービスによって試
験で立証された胸腺の萎縮後に得られた。
クローン化したCAV−DNA（pIC−20H/CAV−EcoRI）と
他のCAVフィルード分離物との間の類似の度合を研究す
る目的で、MDCC−MSBI細胞を、分離されたCAV鎖で感染
させた。サザン分析で処理された。サザン分析で処理さ
れた全てのDNA標本は、32−Ｐを標本したクローン化し
たCAV−DNAとハイブリッドを形成したDNA分子が含まれ
ていた。他のCAVフィルード分離物のDNA分子は、クロー
ン化したCAVのDNA分子の長さに相当する長さを有し、そ
のDNA分子は、２本鎖または１本鎖である。サザン点染
分析で直接処理されるCAV感染の野生の鶏の組織細胞の
サンプルは、標示されたpIC−20H/CAV−EcoRIでハイブ
リッドを形成したDNA分子を含むことが発見された。
CAVフィルード分離物からのDNAの制限酵素分析。
クローン化したCAV遺伝子に関して他のCAVフィルード
分離物からのDNAの類似性は、制限酵素分解などによっ
てさらによく調べられる。CAV分離物のDNA標本と、クロ
ーン化したCAVのDNA標本は、７つの制限酵素で切断され
ている。その酵素であるBamHI、BglI、Sst1およびXbaI
は、全てDNAsと同一に切断することを実証した。フィル
ード分離物のほとんどのDNAは、２つのAccI部位および
／または２つのHindIII部位を含んでいた。一方ほんの
僅かの分離物のDNAは、EcoRI部位を含む。図５は、クロ
ーン化した制限酵素地図と他のフィルード分離物とを要
約している。制限酵素部位によれば、関連した位置を含
むフィルード分離物の数は、括弧で囲まれている。
CAVフィルード分離物からのDNAのポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）。
クローン化したCAV−DNA配列に由来するオリゴヌクレ
オチドCAV−１とCAV−２（図４）とが合成された。これ
らの合成オリゴヌクレオチドを使用するPCRは、CAVの分
野からDNAを特異的に検出するために処理された。他のC
AV分離物で感染されたMDCC−MSB1細胞から分離されたDN
Aと、非感染細胞から分離されたDNAとは拡大された。拡
大された後、そのDNAは、アガロース／エチジウムプロ
ミドゲルを用いて電気泳動により長さで分別した。拡大
された186bpバンド（その値は理論的に予想される）
は、他のCAV分離物で感染した全ての細胞のDNAサンプル
で確認できた。この特異的なバンドは、非感染細胞から
分離した拡大後のDNAには存在しなかった。全てのフィ
ルード分離物の拡大されたDNAバンドは、アガロースゲ
ルにおいて、同一泳動の割合を示している。この結果
は、他のCAVフィルード分離物の遺伝子の部分に、大き
な欠失や挿入が生じていないことを示している。32−Ｐ
で標識化されたオリゴヌクレオチドCAV−３（図４）を
用いたサザン分析は、186bpの拡大されたDNAはCAV特異
性であり、そして他のDNAバンドはCAV−３プローブとハ
イブリッドを形成していないことを示す。
CAV−PCRの検出感受性を調べた。CAV感染細胞から分
離されたDNAは、除々に溶解され、拡大され、そしてア
ガロース／エチジウムプロミドゲルで分析された。約10
0のCAV感染細胞の中のDNA総量に相当する総量のDNAを含
むサンプルの拡大後、186bpのCAV特異性DNAフラグメン
トが検出された。しかしながら拡大されたDNAが、32−
Ｐで標識化されたCAV−DNAを用いたサザン分析法で指示
されたときはいつでも、１細胞からのDNAに相当するDNA
量は、すでに鮮明に確認できるCAV−特異性DNAバンドと
して生じることが発見された。CAV−PCRは、今まで調査
したCAV−分離物に対して特異的である非常に高感度の
検出方法である。
ジコキシゲニンを標示したCAV−DNAプローブを用いてCA
Vフィールド分離物からのDNAのドットブロット。
PCRを加えることにより、分析物はCAVフィールド分離
物からのDNAの検出に関して発現された。この試験は、
放射能のプローブを使用していない。クローンpIC−20H
/CAV−EcoRIの挿入したCAV−DNAは、11−dUTP−ジコキ
シゲニンで標示された。MDCC−MSB1細胞からのDNA標本
は、それらは別々に他のCAV分離物に感染しているが、
これらはフィルタで吸取られ、ジコキシゲニンを標示し
たDNAプローブとハイブリッドを形成する活性が分析さ
れた。
MDCC−MSB1細胞からのDNA標本は、ジコキシゲニンの
標示されたDNAプローブとハイブリッドを形成した他のC
AV分離物で感染されており、一方、感染していない細胞
の培養液からのDNAは、ハイブリッドを形成しなかっ
た。放射能に標示されていないCAV−DNAプローブを使用
するこのテストは、それゆえにCAVフィールド分離物か
らのDNAの検出について安定である。
応用 DNA。
CAV配列たとえばpIC−20H/CAV−EcoRI−DNAプラスミ
ドまたは部分などは、研究や特殊症状の用途に関して調
べられるための標本として、CAV−DNAおよび／またはRN
Aを証明するために利用することができる。DNAは、放射
能でまたは他の方法でたとえばピオチン／ジコキシゲニ
ンで標識化されるかもしれない。DNA/RNAスラット点
染、サザン／ノーザン分析および試験管内でのハイブリ
ッド形成によって、CAV核酸の存在を立証することがで
きる。ここで使用したCAV配列の部分は、またDNAオリゴ
マーでもある。
クローンpIC−20H/CAV−EcoRIのCAV配列に由来するオ
リゴマーは、非常に低い濃度のCAV−DNA/RNAの由来を明
らかにする。“ポリメラーゼ連鎖反応”（PCR2）に利用
することができる。PCRは、ウィルスの検出にしばしば
利用される大変感度の高い方法である。
上記の応用をもとにした診断用の器具は、実用化が可
能である。
研究目的のためには、CAV−DNAフラグメントを用いた
SIマッピングやプライマーエクステンションのような技
術が重要である。これら２つの方法により、CAV−RNAの
量を計ることができ、そしてより特徴を表すことができ
る。
非転写原子配列でのオリゴマーは、遺伝子の作用を研
究するために利用することができる。これらはまたウィ
ルスの複製を阻害する新しい方法の研究に関するモデル
としても役立つかもしれない。
もしCAV遺伝子の欠失によって、病原性の特性が著し
く取除かれるならば、CAV−DNAは、低分子の遺伝子フラ
グメントに関するトランスフィクションにおいて、キャ
リアとして利用されているかもしれない。
非転写原子配列中のCAVオリゴマーはウィルスのベク
ターを表し、それは生きている動物や試験管内でのCAV
複製または他の遺伝子の作用の研究を可能とするかもし
れない。
RNA。
Sp6/T7ベクターでクローン化したCAV−DNAフラグメン
トが、CAV−RNA生産物を生じる。試験管内転写によって
得られたCAV−RNAsは、試験管内または試験管外でのCAV
蛋白質の合成に利用することができる。このようにたと
えば小麦遺伝子抽出において、RNA分子は、蛋白質に翻
訳されることができる（試験管内翻訳）。試験管内翻訳
によって、得られたCAV蛋白質は、たとえば鶏のリンパ
液において、直接CAVに抗する抗体の由来を明らかにす
るために利用できるかもしれない（下記参照）。CAV−R
NA分子はまたその中で蛋白質を翻訳させるために、顕微
注射によって挿入されるかもしれない。このようにCAV
蛋白質の効果は、細胞レベルで研究されることができ
る。蛋白質と蛋白質および／または蛋白質とDNAの相互
作用はまた分析することができる。
CAV−RNAsはまた、標本中のCAV核酸の由来を明らかに
するためにプローブとして利用することができる。この
分析は、ソルトブロット、サザン、ノーザンおよびサイ
トでのハイブリッド形成分析によって、結論を下すこと
ができる。このような方法は、CAVに関する診断試験の
発展に利用することができる。
蛋白質。
全てのCAV蛋白質は、原核生物または真核生物におい
て発現することができる。このことは、安定した発現ベ
クター中で、クローン化されることが見出せるCAV読取
り枠を必要としている。バクテリアの組織は、CAV読取
り枠の発現に関して安定なT7−プロモータをもとにした
発現ベクターが存在する。バキュロウィルス組織、酵母
およびCHO−テェファ組織は、真核生物の発現組織を可
能とする。それゆえにレトロウィルスベクターのような
ウィルスベクターもまた望ましい。
それらの上に位置するCAV蛋白質またはエピトープ
は、CAVに向かう抗体の由来を明らかにするために利用
することができる。このようにして、CAV感染鶏は追跡
された。
それらの上に位置するCAV蛋白質またはエピトープ
は、免疫性パーオキシターゼ着色、ELISAs、および免疫
性蛍光分析などのような免疫検定に利用されることがで
きる。
それらの上に位置するCAV蛋白質またはエピトープ
は、CAVに抗する体液および／または細胞定着免疫を証
明するのに利用することができる。真核生物および原核
生物のベクター／宿主組織の発現によって得られたCAV
蛋白質は、サブユニットワクチンの効力に関して利用す
ることができる。
それらの上に位置するCAV蛋白質またはエピトープに
よってCAV感染鶏の標本内で、CAV蛋白質と蛋白質とを追
跡することを可能とするCAV特異性の抗体が得られる
（以下を参照）。
抗体。
幾つもの感染テストをへて、母性抗体がCAV感染に対
し、効果的な受動防御を規定することが確認された。母
性抗体は、新しく生まれたひよこに卵黄抽出液を含んだ
CAV抗体を注射するような自然な道筋を通して若いひよ
こに伝えられた。CAV感染に対する受動の防衛はまた、
卵を生むほんの少し前にCAVに感染した産卵鶏からの卵
の卵黄抽出液を注射する方法によっても供給される。
上述したシステムの１つについて表されるCAV蛋白の
産卵鶏への予防注射は、母性抗体の形成をもたらす。こ
れら産卵鶏の若いひよこは、CAV感染に対して守られ
る。
診断テストはCAVに対する抗体に基づいて展開され
る。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体のどちら
も、このために使用される。CAV特異性抗体によって、
標本はCAV蛋白の存在について試験される。
上記CAV抗体の適用は、本発明に関する抗体で可能で
あり、その中で述べられたようなプロセスにて得られ、
自然のCAV抗体に関する限りは同じ方法である。
生体ウィルスワクチン。
生体ウィルスベクターの方法による免疫系のウィルス
性蛋白の供給は、サブユニットワクチンよりも免疫応答
が、結果として良くなるらしい。１つもしくはそれ以上
のCAV読み取り枠（全体または一部分）は、生体ウィル
スベクター内でクローンされる。家畜においては、鶏組
織中でそれ自身が良好な複製を示す生体ウィルスベクタ
ーのみが使われる。鶏への適用のため、ベクターとして
好適なものは、たとえば鶏痘ウィルス、リトローバルベ
クター、ヘルプスウィルスベクター（鶏、ヘルプスウィ
ルス血清型1,2,3）、感染性喉頭気管ビールスそしてま
たCELOのようなアデノウィルスである。上記生体ウィル
スベクターを用いて免疫性付与は、CAVやキャリアウィ
ルスに対して防衛性を有する。
CAV遺伝子中に１つまたはそれ以上の欠失を適用する
ことにより、若いひよこのCAV感染に対する免疫性を与
えるワクチンを開発することができよう。欠失を適用す
るときはCAV感染の病原性形質は削除されなければなら
ないが免疫にする特性は保持されなければならない。
CAV遺伝子はまた、他のウィルスの抗原の発現のため
の生体ウィルスベクターとして都合がよい。これはCAV
蛋白の代わりにまたは加えて「外来」ウィルス蛋白を発
現するようにCAV遺伝子を変化させることが必要であ
る。CAVベクターは、したがってワクチン接種された動
物が組替えベクターにより、ウィルス性蛋白質の発現に
「外来」ウィルスのみまたはCAVに対して防衛を生ずる
ように構成される。
サブユニットワクチン、欠失ワクチンとして生産され
たCAVワクチンまたは他のウィルスベクターは、主に産
卵鶏の予防接種に使われる。けれどもひよこへのワクチ
ン接種、たとえばマークス病に対するワクチンとの組合
わせは、また本発明の使用可能性に残されている。
エンハンサー／プロモータ成分。
CAVプロモータおよびエンハンサーエレメントは、DNA
ベクターにてクローンできる。CAVプロモータ／エンハ
ンサー調節のもと、CAV蛋白または「外来」蛋白は、鶏
細胞と他のタイプの細胞のどちらにおいても発現するこ
とができる。
CAV蛋白は（鶏）の骨髄細胞の機能によるものである
と考えられる。遺伝子療法のモデルシステムとして、
「外来」蛋白は、CAVプロモータ／エンハンサーエレメ
ントにより、随時もとのウィルス姓ベクターと組合わせ
ることで試験管内に骨髄細胞にて発現される。遺伝学的
に変性された骨髄されたは、骨髄、この場合は鶏の骨髄
に移植される。遺伝子フラグメントがとても小さいため
に、CAV遺伝子自身もまた、ベクターとして使用に好適
である。
CAVエンハンサー／プロモータ成分はまた、他の生物
にも活性を有する。ケースとしては、この成分はたとえ
ば遺伝療法のモデルとしてねずみ組織にも使うことがで
きる。
我々のCAVプロモータまたは他のプロモータの調整の
もとでのCAV自身の生成もまた、遺伝療法技術の研究と
開発の可能性を供給する。
クローニングベクターとしての完全または充分なCAV
遺伝子使用の可能性すなわち、鶏組織への真核細胞プラ
スミドの一種のようなものは、発現されたCAV遺伝子の
構造の見地より現実に考えられる展開である。
CAVクローンpIC−20H/CAV−EcoRIの寄託 プラスミドpIC−20H/CAV−EcoRIで形質転換したHB101
細胞のグリセロール株溶液（glycerol stock）は、寄託
（受託）番号CBS 361.90として、1990年９月６日にセン
トラールビュロー ボール シチメルカルチェーレス
（Centraalbureau voor Schimmelcultures），バーン，
オランダ国に寄託された。
図面の説明 図１はクローン化されたCAV−DNA塩基配列である。全
長は、2319の塩基であり、EcoRIの最初のＧがNo.1の位
置で占めている。
図２は、両DNA鎖について、300以上に塩基の長さを有
する予測の読み取り枠（ORF）である。ORFsには、３つ
の異なる開始コドンATG,CTG,GTGが予想され、３つの図
面2A,2B,2Cがそれぞれ示されている。
図３は、１本鎖DNAから成るCAV遺伝子のヘアピン構造
のいくつかの予想図を示している。
図４は、PCRに使われるオリゴヌクレオチドを示す。D
NAの配列とCAV遺伝子上のオリゴヌクレオチドの位置が
示される。CAV遺伝子中のヌクレオチドの位置は、図１
のそれと一致する。
図５は、クローン化したCAV−DNAの制限酵素地図を示
す。括弧内は遺伝子中で適切な制限酵素部位により所有
される総計21のうちの単離CAVの数である。
原料と方法 細胞培養とウィルス。
単離CAVは、サブグループＡ（1104−X5）の鶏白血病
ウィルスまたはマークス病ウィルス（MDCC−MSB1）によ
り引起こされた、鶏腫瘍からのトランスフォームされた
リンパ芽球症質の細胞系にて培養された。細胞培養は約
0.1〜1TCID50/細胞に感染させる。２日後、細胞は収穫
される。細胞はクローンされたCAV−DNAの子ウィルスま
たは単離フィールドに感染させる。CAV−Cux−１、初め
はドイツにてMarek病にかかった鶏の群れから単離され
たもの（Vor Blowら,1983,1985）は、北アイルランド
BelfastのVeterinary Research LaboratoriesのDr.M.S.
McNultyによって提供された。1988年１月アメリカ、New
ark、Delaware大学のDr.J.P.Rosenbergerは、Marek病系
統Ｔ−1704の病毒性の法廷のための２種類の血液サンプ
ルと、その派生物、鶏の初代継体であるMDV−Del−Ｓを
送った。我々はCAV−Ｔ−1704と単離CAV−Del−ＳをMDV
−系Ｔ−1704そしてその派生物MDV−Del−Ｓに感染させ
たSPF−鶏から得た。単離オランダCAVは、60種類の培養
された全てのMDCC−MSB1から選択された。フィルード原
料はGezondheidsdienst Brabant at BoxtelのJ.C.von d
en WijngaardとGezondheidsdienst voor Pluimvee at D
oornのJ.Naberより供給された。我々のSPR群から得られ
た単離CAVはその系列に添加した。
全DNAの単離。
ウィルスと肝臓の調整品は、20mMのトリス塩酸液pH7.
5、2mMのEDTA、0.2％のSDS、0.6mg/mlのプロティナーゼ
Ｋと再懸濁し、37℃で１時間インキュベートされる。調
整品はフェノール−クロロフォルム−イソアミルアルコ
ール（25:24:1）で抽出され、DNAはエタノール法で沈殿
される。DNAペレットは、再び100μｌの10mMトリス塩酸
pH7.5、1mMEDTAに懸濁される。
低分子DNAの抽出分析。
低分子DNAは、Hirtにより述べられた方法（1967）に
従い、CAV感染した1104−X5とMDCC−MSB1細胞および未
感染の1104−X5から単離された。このDNAはアガロース
ゲル上にて分離され、エチジウムプロミドにて染色した
後、直接紫外線によりまたはサザンにて述べられた方法
（1982）にてベトレースフィルタ上にてブロットして分
析する。このブロットはランダムプライムした32−Ｐで
標識化されたDNAとハイブリッドを形成し、2.7〜3.5kb
の長さを持つCAV感染1104−X5細胞の低分子DNAから単離
される。
CAV−DNAのクローニング。
完全なCAV−DNA遺伝子は細菌ベクターpIC−20H中にク
ローンされる。CAV−DNA遺伝子の一部分は、ベクターpI
C−19Rにクローンされる。クローニング段階の全てのプ
ラスミドは,Maniatisらによって述べられた方法（198
2）に原理的に従って遂行された。
CAV−DNAの配列分析。
CAV−DNAプラスミドは、CsC1グラジエントとセファク
リールS500（ファルマシア）クロストグラフィにて精製
された。２本鎖DNAは、T7 DNAポリメラーゼ（ファルマ
シア）またはTaq DNAポリメラーゼ（プロメガ）を用い
る方法により配列される。固方法はファルマシアとプロ
メガの教えに従って行われた。オリゴヌクレオチドは、
ファルマシアのT4ヌクレオチドキナーゼによりリン酸化
される。「ストロングストップ」はMaxamとGilbertによ
る方法（1977）に従って配列される。
クローンCAV−DNA遺伝子の環状化。
完全なCAV−DNA遺伝子を含んだ10μｇのクローンDNA
のプラスミドは制限酵素と温浸され、完全なCAV挿入DNA
はベクタDNAから分離される。23キロベースを有する１
対の線状のCAV−DNA分子のT4−DNAリガーゼ処理によっ
て、環状２本鎖CAV−DNAが生じる。リガーゼ生産物は0.
8％アガロースゲルで分析された。
DEAE−デキストラン トランスフェクション。
1104−X5とMDCC−MSB1細胞のトランスフェクションの
ため、２μｇの再リガーゼ処理したCAV−DNAは、２回25
μｌのMilli−Ｑ水に懸濁され、260μｌのTBSバッファ
と混合される。10mg/ml DEAE−デキストラン15mlを、DN
A混合液に加えられ、混合液は30分温室にてインキュベ
ートされる。
1104−X5細胞。１〜２×106の1104−X5細胞を１プレ
ート上に持つ50mmの組織培養プレートは、２度TBSバッ
ファで洗浄される。TBSバッファは細胞単一層から完全
に除かれ、300μｌのDEAE−デキストラン/DNA−希釈液
が加えられる。細胞は30分間、室温でインキュベートさ
れる。DEAE−デキストラン/DNA混合物は、2mlの25％DMS
O/TBSに置換えられ、細胞単一層は２分間室温にてイン
キュベートされる。細胞はTBSバッファで２度洗浄さ
れ、それから組織培養培地（RPMI1640またはＥ−MEM）
に加えられる。細胞は５％CO2のもと37℃でインキュベ
ートされる。
MDCC−MSB1細胞。約２×106 MDCC−MSB1細胞は卓上遠
心分離機にて1500rpmで遠心分離される。培地は5mlのTB
Sバッファにて置換えられ、細胞は注意深く再度懸濁さ
れる。洗浄は繰返される。TBSバッファは全て除かれ、
細胞ペレットは300μｌのDEAE−デキストラン/DNA混合
物に注意深く再度懸濁され、室温にて30分間インキュベ
ートされる。0.5mlの25％DMSO/TBSが添加され、懸濁液
は室温で３分間インキュベートする。5mlのTBSが添加さ
れ、細胞は卓上遠心分離機にて1500rpmにて遠心分離さ
れる。上澄み液は除かれ、50mlの組織培養培地が加えら
れる。細胞は再度懸濁され遠心分離される。
細胞は5mlの組織培養培地に入れられ、５％CO2のも
と、37℃でインキュベートされる。管理の方法によっ
て、２μｇのpIC−20Hプラスミドがトランスフェクショ
ンに使われる。
試験管内における中和テスト。
MDCC−MSB1細胞はMDCC−MSB1の上澄み液に感染され、
1104−X5細胞はクローン化した“CAV DNA"とトランスフ
ェクトされる。約２×104の細胞が感染させられた。こ
の接種材料のウィルス含有量は、正確にはわからない。
感染細胞培養の培地の半分にCAVに対して直接の中和活
性を持つポリクローナル血清が1:100に希釈され、培地
に加えられる。管理によって、CAV感染MSB1細胞の
「良」の系列は取除かれ、培地に加えられるCAVに対す
る抗血清は存在しない。
１日ひなのCAV感染。
CAV−DNA上澄み液とトランスフェクトされたMDCC−MS
B1の調整DNAと1104−X5細胞は、１日ひなに筋肉内注射
される。ヘマトリット値と体重が最初に測定された後、
感染６日後に検死（解剖）が５羽/1グループのひなで行
われる。ウイルスの分離と免疫組織化学のため、ヘパリ
ン血液、胸腺、骨髄が集められる。免疫組織化学的調査
は胸腺クーペと特にCAV特異性モノクロールCV1−85.1に
つきパーオキシダーゼ染色法によって行なわれる。感染
後14日および28日さらに５羽のひよこの検死（解剖）を
行い、上述の全ての測定が行われる。
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）。
オリゴヌクレオチドはサイクロンDNAシンセサイザー
（Biosearch Inc.USA）の方法にて合成される。配列は
図１に示したCAV−DNA配列から導き出される。PCRはCAV
感染そして非感染のMDCC−MSB1細胞からDNAを単離され
る。本試剤の最終濃度は50mMのKCl、10mMのトリス塩酸
（pH8.3）3mMのMgCl2、0.01％の牛血清アルビミン、200
μＭの各dNTP、１μＭの各オリゴヌクレオチド、そして
２ユニットのTaq−DNAポリメラーゼ（CETUS,USA）が100
μｌに入っている。DNAサンプルは循環的にPerkin Elme
r/Cetusサーマルサイクラー中にて30回93℃で１分間、5
5℃で１分間、72℃で３分間インキュベートされる。増
幅されたDNAの1/10は、２％アガロース／エチジウムプ
ロミドゲル上にてまたはサザンブロット分析法にて特設
分析される。
使用されたDNAプローブは、Maniatisらの方法（198
2）に従って末端に32−Ｐで標識化されたオリゴヌクレ
オチドである。
ドットブロット分析。
pIC−20H/CAV−EcoRIに挿入されたCAV−DNAは分離さ
れ、供給者のプロトコールに従い、ジコキシゲニン−dU
TP（Boehringer,Mnnheim,ドイツ）で標識化される。Bio
trace−RPフィルタは、1.5M NaClと0.15Mクエン酸ナト
リウムで飽和された。DNAサンプルは1mMのEDTAを含む10
mMのトリス塩酸で再度懸濁され、３分間煮沸され、氷上
で冷却され、フィルタ上に置かれる。フィルタは室温で
乾燥され、30分間65℃でインキュベートされる。そのフ
ィルタは、ジコキシゲニンで標識化されたDNAとハイブ
リッドを形成した。ジコキシゲニンで標識化されたDNA
は、供給者のプロトコールによる免疫学的染色法により
可視化された。
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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａ ｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，71（1990）ｐ. 819−823 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 C12N 7/00 C12Q 1/70 A61K 39/12

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）CAV感染された細胞から低分子量DNA
    を単離すること、 （ｂ）アガロース／臭化エチジウム上で前記低分子量DN
    Aを分画すること、 （ｃ）前記分画パターンを感染されていない細胞のDNA
    分画パターンと比較すること、 （ｄ）感染された細胞にのみ存在するDNAを単離するこ
    と、および （ｅ）工程（ｄ）で単離されたDNAが制限酵素分析によ
    って二本鎖であるかどうか調べること、 以上の工程（ａ）〜（ｅ）から成ることを特徴とする鶏
    貧血症ウィルス（CAV）二本鎖DNAの製造方法。
  2. 【請求項２】鶏貧血症ウィルス（CAV）ゲノムまたはそ
    の一部のヌクレオチド配列に対応するCAV特異的なヌク
    レオチド配列を含んで成り、かつ該ヌクレオチド配列が （ａ）CAV感染された細胞から低分子量DNAを単離するこ
    と、 （ｂ）アガロース／臭化エチジウム上で前記低分子量DN
    Aを分画すること、 （ｃ）前記分画パターンを感染されていない細胞のDNA
    分画パターンと比較すること、 （ｄ）感染された細胞にのみ存在するDNAを単離するこ
    と、および （ｅ）工程（ｄ）で単離されたDNAが制限酵素分析によ
    って二本鎖であるかどうか調べること、 以上の工程（ａ）〜（ｅ）によって得られることを特徴
    とする二本鎖DNA分子形状の組換え核酸。
  3. 【請求項３】図１に示すヌクレオチド配列、またはそれ
    に対して少なくとも60％相同性があるヌクレオチド配列
    の少なくともCAV特異的な部分に対応するか、または相
    補的な、CAV特異的なヌクレオチド配列を含んで成り、
    該ヌクレオチド配列が （ａ）CAV感染された細胞から低分子量DNAを単離するこ
    と、 （ｂ）アガロース／臭化エチジウム上で前記低分子量DN
    Aを分画すること、 （ｃ）前記分画パターンを感染されていない細胞のDNA
    分画パターンと比較すること、 （ｄ）感染された細胞にのみ存在するDNAを単離するこ
    と、および （ｅ）工程（ｄ）で単離されたDNAが制限酵素分析によ
    って二本鎖であるかどうか調べること、 以上の工程（ａ）〜（ｅ）によって得られることを特徴
    とする組換え核酸。
  4. 【請求項４】鶏貧血症ウィルス（CAV）ゲノムにあるヌ
    クレオチド配列に対応するか、または相補的なCAV特異
    的なヌクレオチド配列を含んで成り、該ヌクレオチド配
    列が少なくともCAV蛋白質の一部をコードすることを特
    徴とする請求項２または３記載の組換え核酸。
  5. 【請求項５】さらに、原核ベクターまたは真核ベクター
    に由来するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請
    求項２〜４のいずれかに記載の組換え核酸。
  6. 【請求項６】さらに、CAV蛋白質以外の他の溜をコード
    するヌクレオチド配列、または該他の蛋白質の一部をコ
    ードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求
    項２〜５のいずれかに記載の組換え核酸。
  7. 【請求項７】CAVゲノムになく、調節機構を有するヌク
    レオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜６のい
    ずれかに記載の組換え核酸。
  8. 【請求項８】核酸を標識するのに適した、放射性同位
    体、酵素分子、ハプテン、蛍光物質、染料、色素および
    粒子状マーカーから成る群より選ばれる１種以上のマー
    カーで標識したことを特徴とする請求項３〜７のいずれ
    かに記載の組換え核酸。
  9. 【請求項９】CAV DNAまたはCAV RNAを検出する方法にお
    いて、CAV特異的プローブまたはプライマーとして請求
    項２または３記載の組換え核酸を使用することを特徴と
    する検出方法。
  10. 【請求項１０】CAV特異的プローブまたはプライマーと
    して請求項２または３記載の組換え核酸を含むことを特
    徴とするCAV DNAまたはCAV RNAを検出するための診断キ
    ット。
  11. 【請求項１１】CAVまたは他の病原体に対して免疫化す
    るための生きたウィルス性ベクターワクチン調製物であ
    って、請求項２〜８のいずれかに記載の組換え核酸を含
    むことを特徴とするワクチン調製物。
  12. 【請求項１２】請求項２〜８のいずれかに記載の組換え
    核酸を含むことを特徴とする原核細胞または真核細胞。
  13. 【請求項１３】前記組換え核酸によってコードされる少
    なくとも１つの蛋白質または蛋白質の一部を発現するこ
    とが可能であることを特徴とする請求項12記載の原核細
    胞または真核細胞。
  14. 【請求項１４】蛋白質を製造する方法であって、請求項
    ２〜８のいずれかに記載の組換え核酸を用いることを特
    徴とする製造方法。
  15. 【請求項１５】免疫アッセイでCAV特異的抗体を検出す
    るための診断キットを製造する方法において、請求項２
    〜８のいずれかに記載の組換え核酸を用いて蛋白質また
    はその一部を合成し、そして合成された蛋白質またはそ
    の一部をCAV−特異的抗体を結合するための試薬として
    取り入れることを特徴とする診断キットの製造方法。
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