JP2791322B2 - ヒト乳頭腫ウイルスｄｎａを含有する組成物 - Google Patents
ヒト乳頭腫ウイルスｄｎａを含有する組成物Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は乳頭腫ウイルス(pap
illomavirus)のＤＮＡを含有する、乳頭腫ウイルス感染
の検出のための組成物に係わる。 【０００２】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】“乳
頭腫ウイルス”という用語は、皮膚又は粘膜の比較的良
性の（ウイルス性）いぼ(warts) から、上皮内腫瘍又は
種々の形態の皮膚ガンに悪化し易い過形成(hyperplasia
s)までの幾つかの形態のウイルス感染症の原因であると
一般的に考えられている多数のウイルスを含むものであ
る。乳頭腫ウイルス感染の中には、特に、これ以降時々
“ＥＶ”と表現されるいぼ状表皮異形成(epidermodyspl
asias verruciformis)があることにも注意しなければな
らない。 【０００３】乳頭腫ウイルスの型の幾つかはすでに報告
されている。本発明の特許出願に於いて、幾つかの新規
の型及び亜型の乳頭腫ウイルスを、その感染患者に於い
て多大の割合で早発皮膚ガンを進行させる傾向のウイル
ス性のいぼ又は散在性斑紋(disseminated macular)病巣
から単離したことが報告されるであろう。 【０００４】最近の研究により免疫因子の重要性及びヒ
ト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）の主要な役割が明らかにさ
れており、これらの因子に、乳頭腫ウイルス感染の病理
に於ける様々な遺伝因子及び化学作用のある放射線に関
する文献中に以前に記載されている役割が追加される。 【０００５】本発明は新たに単離された多数の乳頭腫ウ
イルスの相対的な挙動に関する観察に基づいてなされた
ものであり、その主要なゲノムの性質は以下で定義され
よう。 【０００６】少数のＥＶ例に関する研究によって、６つ
の型のＨＰＶの性質がそれらのゲノムの分子クローニン
グによってすでに明らかにされている（クレムスドルフ
・デー(Kremsdorf, D.) 等、1982年、ジャーナル・ヴイ
ロロジー(J. Virol)．43巻、436-447 頁及びクレムスド
ルフ・デー等、1983年、ジャーナル・ヴイロロジー、48
巻、340-351 頁参照）。異なるグループのゲノムの間で
のクロス−ハイブリダイゼーションが欠如しているか又
は非常に弱いかどうかによって、上記のＨＰＶは３つの
グループに分類された。第１のグループには、或る種の
ＥＶ患者及び一般住民に於いて見られる扁平なウイルス
性いぼと関連のあるＨＰＶ３ａ及び１０が含まれる。Ｈ
ＰＶ３ａに関連するＤＮＡ配列は一人のＥＶ患者のガン
で発見された。第２のグループにはＨＰＶ５，８及び12
が含まれ、ＨＰＶ５及び８のゲノムは複数のＥＶ患者の
ガン中で検出された。第３のグループは現在のところた
った１種のウイルス、ＨＰＶ９である。免疫抑制を呈し
た腎臓移植受容者がＨＰＶ５に感染していると判明した
ことは例外であるが、第２と第３のグループのウイルス
はＥＶ患者の間だけに検出され、彼らの殆んどは幾つか
のウイルスに感染していた。現在文献（以下に示す参考
文献１−５，８，９，13，14，16，18−20）中に記述さ
れている14の型のＨＰＶの中で、４つのものは、珍しい
病気であるＥＶに特に関係のあるものであることが判明
したことに注目すべきである。 【０００７】多数の新規の型及び亜型の乳頭腫ウイルス
を単離し本発明を完成せしめた研究によってイン・ヴイ
トロに於けるより高度に洗練された診断技術開発が可能
になった。より具体的には、本発明は、例えば病巣又は
バイオプシー切片から得られる乳頭腫ウイルスの同定に
関する完璧な技術を提供し、これによって、問題となっ
ている病巣が悪化していく可能性があるかどうかに関す
る予測をもより良く行うようにさせ得るようなより正確
な診断法をもたらす。 【０００８】一般的に言って、乳頭腫ウイルスは、互い
に非常に異なってはいるが、それでも約7000〜8000の塩
基対の大きさを有していることに注意しなければならな
い。加えて、それらのゲノムには前述にもかかわらず或
る程度の相同性があり得る。以下の記載に於いて、乳頭
腫ウイルスの様々な型及び亜型間の相同性の割合（％）
を決定することに言及する。これら相同性の割合は、
“非ストリンジェント(non-stringent) ”又は“非スト
リクト(non-strict)”と呼ばれる条件下、又は“ストリ
ンジェント（緊縮）”又は“ストリクト（厳格）”と呼
ばれる条件下で行なわれるハイブリダイゼーションアッ
セイによって決定される。 【０００９】乳頭腫ウイルスは幾つかの型の乳頭腫ウイ
ルスに区別され得、それらはストリクト又はストリンジ
ェントの条件下で測定された相同性の割合によって区別
され得る。この条件下で、50％より小さい相同性の割合
を示すものは別の型に属する。この点に関して、ストリ
クト又はストリンジェントな条件下で別の型のウイルス
間の相同性の割合は０まで低下し得るということに注意
しなければならない。これと同じ条件下で、50％より大
きい相同性の割合を示すウイルスは同じ型に属するもの
と考えられ、それらはこの同型内の別々の亜型を形成す
る。 【００１０】非ストリクト又は非ストリンジェントな条
件下のハイブリダイゼーションアッセイは、ハイルマン
・シー・エー(Heilman. C. A) 等、1980年、ジャーナル
・ヴイロロジー36巻、395-407 頁及びクロイサン(CROIS
SANT) 等、1982年、シー・アール・アカド・サイエンス
(C. R. Acad. Sc.パリ、294 巻、581-586 頁（ヘテロ二
重鎖分子）に記載されている以下の条件下で単離された
２種のウイルスから取り出されたＤＮＡを相互に接触さ
せるものである。 【００１１】ストリクト又はストリンジェントな条件下
のハイブリダイゼーションアッセイは、クレムスドルフ
・デー等、1982年、ジャーナル・ヴイロロジー、43巻、
436-447 頁、及び1983年、ジャーナル・ヴイロロジー、
48巻、340-35頁、及びデービス・アール・ダヴリュ(Dav
is, R. W) 等、1971年、Methods Enzymol.、21巻、413-
428 頁（ヘテロ二重鎖分子）に記載されている条件下で
単離された２種のウイルスから取り出されたＤＮＡを相
互に接触させるものである。 【００１２】概要的には、１つの同じ型に属する乳頭腫
ウイルスはそれぞれの配列の長さ全体の80〜100 ％に亘
る実質的に同一のヌクレオチド配列を有するハイブリダ
イズ可能な配列を持っているが、これら相同的な配列は
別の型に属する乳頭腫ウイルスの間では60％又はそれ以
下に低下し得ることを言及しておく。非ストリクト又は
非ストリンジェントの条件下で相互にハイブリッドを形
成する別の型の乳頭腫ウイルスからの配列が同一あるい
は類似である程度は同じ型の乳頭腫ウイルスの場合より
必らず明らかに低いものである。 【００１３】本発明者らの研究によって、種々の型の乳
頭腫ウイルスの間の遺伝子の異種性の程度は以前考えら
れていたものよりも大きいこと、そして同時に、これら
種々の型が或る程度の特異性を示す感染形態又はその変
形としばしば関連のあることの２つが明らかになった。 【００１４】 【課題を解決するための手段】本発明は、（ｉ）ＨＰＶ
−１４ａ，ＨＰＶ−１４ｂ，ＨＰＶ−１５，ＨＰＶ−１
７ａ，ＨＰＶ−１７ｂ，ＨＰＶ−１９，ＨＰＶ−２０，
ＨＰＶ−２１，ＨＰＶ−２２，ＨＰＶ−２３，ＨＰＶ−
２４，ＨＰＶ−２８，ＨＰＶ−２９，ＨＰＶ−３１，Ｈ
ＰＶ−３２，ＨＰＶ−ＩＰ２，およびＨＰＶ−ＩＰ４か
らなる群から選択される乳頭腫ウイルスから得られる約
７，０００〜約８，０００塩基対からなり、明細書記載
の図１〜９の制限地図の一つを有するヒト乳頭腫ウイル
ス（ＨＰＶ）の精製されたＤＮＡ、又は該乳頭腫ウイル
スの１つに特異的であり、ストリンジェント条件下で該
乳頭腫ウイルスと安定なハイブリダイゼーションをする
ことができる前記精製ＤＮＡのフラグメント、および
（ii）前記（ｉ）に記載のＨＰＶ ＤＮＡ又はＤＮＡフ
ラグメントとは異なる少なくとも一つの別のＨＰＶ Ｄ
ＮＡ、を含有する、ヒト乳頭腫ウイルス感染の検出のた
めの組成物を提供する。 【００１５】従って本発明は、単離された種々の新規の
乳頭腫ウイルスから単離され得るＤＮＡ及びこれらのＤ
ＮＡから全部又は部分的に構成され得るプローブに関す
るだけではなく、或る乳頭腫ウイルスが発見される患者
の危険の度合及び様々のカテゴリーの感染の診断に最も
有効に用い得る乳頭腫ウイルスの型の混合物（カクテ
ル）からなる組成物にも関するものである。場合によっ
ては以前にすでに単離されている乳頭腫ウイルスのゲノ
ムＤＮＡから構成されたプローブおよびこれを本発明の
ものと組み合わせた混合物も含めて本明細書に記載され
ている乳頭腫ウイルス用プローブの数によって、非常に
正確な診断が実現される。特に、様々の型の乳頭腫ウイ
ルスに起因する感染又はこのような様々の型のウイルス
の影響によって進行悪化する可能性がある感染のいろい
ろなカテゴリーのものがより容易に識別できるようにな
り、或るカテゴリーの感染に於いては、その進行悪化に
よってより深刻な病気に転換するかどうかという危険の
度合をより良く経過予想することができるようになる。
例えば、いぼ状表皮異形成として発現する感染の場合に
はそれが皮膚ガンに進行するかどうかという危険の度合
いをより正確に評価することができる手段を本発明は提
供する。 【００１６】 【発明の実施の形態】以下の表現を簡潔にする為に一般
の方法に従って、乳頭腫ウイルスの全ゲノムを“ＨＰＶ
−ＤＮＡ”という略語で示すことにする。 【００１７】同様に簡略化の為、すでに公知の幾つかの
乳頭腫ウイルスを含むＨＰＶ−ＤＮＡの物理的制限地図
が記載されている添付図を参照する。 【００１８】これらの物理的地図は様々の制限エンドヌ
クレアーゼによる切断部位の位置を与える。この地図の
起点は一般的に単一の切断部位で構成されている。この
起点からの距離はゲノムの全長に対するパーセントで表
わされる。地図の１単位はゲノム長の１％を表わす。 【００１９】本発明はまず第１に最も特別には、7000〜
8000塩基対の範囲の大きさをもつ全てのＤＮＡから選ば
れた各ＨＰＶ−ＤＮＡに関するものであり、これらＤＮ
Ａは図中に表わされる制限地図によって特徴づけられる
ものであり、それはより特定的にはＨＰＶ−２ｄ、ＨＰ
Ｖ−１０ｂ、ＨＰＶ−１４ａ、ＨＰＶ−１４ｂ、ＨＰＶ
−１５、ＨＰＶ−１７ａ、ＨＰＶ−１７ａ、ＨＰＶ−１
９、ＨＰＶ−２０、ＨＰＶ２１、ＨＰＶ−２２、ＨＰＶ
−２３、ＨＰＶ−２４、ＨＰＶ−２８、ＨＰＶ−２９、
ＨＰＶ−３１及びＨＰＶ−３２、ＨＰＶ−ＩＰ２及びＨ
ＰＶ−ＩＰ４で示される乳頭腫ウイルスから得られたＨ
ＰＶ−ＤＮＡに関するものである。 【００２０】ここに列挙したものと同じ型に属すると考
えられ得るＨＰＶ−ＤＮＡに対しても本発明の効果が同
じように及ぶことは言うまでもないことである。 【００２１】新たに特徴づけられたウイルスのＨＰＶ−
ＤＮＡに対応する物理的地図は図中の黒丸で示されてい
る。 【００２２】本発明は同じように、前記ＨＰＶ−ＤＮＡ
のフラグメント又はそれと特にストリクトな条件下でハ
イブリッドを形成し得るものに係る。同様に、本発明は
上記各ＨＰＶ−ＤＮＡの全部又は一部を含む組換えＤＮ
Ａ、そして特にそれぞれＥ１，Ｅ６−Ｅ７，Ｌ１及びＬ
２の遺伝子に対応するフラグメントを含む組換えＤＮＡ
又は前記ＨＰＶ−ＤＮＡの遺伝子間（inter-gene）領域
に対応する配列を含むフラグメント（またはこれを含む
組換えＤＮＡ）にも関するものである。最後に、これら
それぞれのＨＰＶ−ＤＮＡまたは対応するフラグメント
から構成され得るプローブ及び該プローブを用いるイン
・ヴイトロ診断方法に係るものである。 【００２３】ウイルスＤＮＡ調製物は６人のヨーロッパ
のＥＶ患者及び２人の南アメリカのＥＶ患者の良性病巣
を削りとったものから選択的に抽出された（ラツナー・
エム・エー（Lutzner,M.A.) 等、１９８３年、ランセッ
ト（Lancet）ii４２２−４２４頁）。ＨＰＶ−ＤＮＡは
平衡塩化セシウム密度勾配遠心法及び／又はエチジウム
ブロミド存在下のシュークロース勾配沈降法により、ク
レムドルフ等の前記の文献、及びオーツ・ジー（Orth.
G.)等の１９８０年の細胞増殖に関するコールド・スプ
リング・ハーバー会議（Cold Spring Harbor Conf. Cel
l Proliferation)、７巻、２５９−２８２頁に以前記載
された操作方法に従って精製された。このＤＮＡ調製物
は制限エンドヌクレアーゼで処理され、この消化生成物
をアガロースゲル電気泳動によって分離した（クレムス
ドルフ等の前記文献参照）。更に、患者の１人のいぼ状
突起（rerruca warts)から得られたＨＰＶ５，８及び１
２（クレムスドルフ等の前記文献参照）並びにＨＰＶ−
２（ハイルマン・シー・エー等、１９８０年、ジャーナ
ル・ヴイロロジー、３６巻、３９５−４０７頁、及びオ
ーツ・ジー等、１９８０年、細胞増殖に関するコールド
・スプリング・ハーバー会議７巻、２５９−２８２頁参
照）から、以前に特徴づけられた型とは異なる１１の株
が同定され、それによって該ＤＮＡ類の制限酵素切断の
主要なモデルが提供された。新規なＨＰＶの型には番号
が付与され、１つの型に属する亜型には番号の後にそれ
らの同定年代順に従って文字が付与された。（コギン・
ジエイ・アール(Coggin.J.R.) 等、Cancer Res.、３９
巻、５４５−５４６頁）。この新規な１１種のＨＰＶの
ゲノムをエシエリヒア・コリ（Escherichia Coli)Ｋ１
２、Ｃ６００株内にクローン化した（前記のクレムスド
ルフ等の文献、１９８３年参照）。エンドヌクレアーゼ
ＢａｍＨＩによって生成されたＨＰＶ−２４ＤＮＡの２
つのフラグメントは例外として、ＤＮＡは単位長（unit
ary length)の分子形態で挿入された。これらのＤＮＡ
はＡｖａI ，ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII の単一切断部
位を用いてプラスミドｐＢＲ３２２（サトクリフエ・ジ
エイ・ジー（Sutcliffe.J.G.) 、１９７８年Nucleic Ac
ids Res. 、５巻、２７２１−２７２８頁）に挿入する
か、又は単一のＳａｃＩ部位を含む、ＨＰＶ−５のＤＮ
Ａ由来のＨｉｎｄIII Ｂフラグメント（前記のクレムス
ドルフ等、１９８２年）を組込んだ組換えプラスミドに
挿入した。より特異的には、ＨＰＶ１７ｂ及び２２は、
ＨＰＶ−５のＤＮＡ由来のＨｉｎｄIII Ｂフラグメント
を含む組換えプラスミドｐＢＲ３２２及びＨＰＶのＤＮ
Ａをただ１ヶ所で切断する酵素（ＳａｃＩ）で切断した
後、単位長のＤＮＡ分子形態で挿入された。ＨＰＶ−１
４ａのＤＮＡは、ＨｉｎｄIII による該ウイルスＤＮＡ
の不完全消化後に単位長のＤＮＡ分子形態でプラスミド
ｐＢＲ３２２に挿入された。このＨｉｎｄIII はＨＰＶ
−１４ａのゲノムから９６．１％及び３．９％の長さを
持つ２つのフラグメントを生成するものである。ＨＰＶ
−２４のＢａｍ ＨＩ Ａ及びＢフラグメント（それぞ
れゲノム長の８３．１％及び１6．９％に相当する大き
さを持つ）を別々にプラスミドｐＢＲ３２２に挿入し
た。 【００２４】単離したクローン及びそれに対応するＨＰ
Ｖ源を以下の表１に挙げる。 【００２５】 【表１】 【００２６】組換えプラスミドを同定するために、プラ
スミドにウイルス配列を挿入するために用いられたエン
ドヌクレアーゼを含めた２種の制限酵素の混合物で処理
した後組換えＤＮＡ類および非クローン化ＨＰＶ−ＤＮ
Ａ類の消化生成物の電気泳動移動度を比較した。単離さ
れた断片の数およびサイズから、各々の場合に全ウイル
スゲノムが組込まれたことが示された。非クローンＨＰ
Ｖ−ＤＮＡ類或いはプラスミド配列から切除されたＨＰ
Ｖ−ＤＮＡ類をアガロースゲル電気泳動で分析したとこ
ろ（データは示さず）、ＤＮＡサイズの不均一性が認め
られた。ＨＰＶ１４ｂ，１９，２０および２１からのＤ
ＮＡ類は、ＨＰＶ３ａ，５，８および１２のＤＮＡ類と
同様のサイズ（約７７００ヌクレオチド対）を有してい
る〔前掲のクレムスドルフ（KREMSDORF)の論文〕が、Ｈ
ＰＶ１５，１７ａ，１７ｂ，２２および２３のＤＮＡは
これより短くＨＰＶ９のＤＮＡと同様のサイズ（約７２
００ヌクレオチド対）を有している前掲のクレムスドル
フ（KREMSDORF)（１９８２）およびオルス（ORTH) （１
９８０）の論文〕。 【００２７】クローン化ウイルスゲノムの１４個の制限
酵素に対する感受性を分析し、物理的地図が確立された
（図１〜図１０）。或るＨＰＶ−ＤＮＡ類の制限地図を
以下に述べる理由により幾つかの図に繰り返し図示し
た。前記（９）の方法によれば、２２から３３個の切断
部位が局在していた。ＨＰＶ１４ａおよび１４ｂの地図
（図４ａおよび図４ｂ）とＨＰＶ１７ａおよび１７ｂの
地図（図５）を除けば、これらの地図の間には明らかな
相似性は認められなかった。夫々ＨＰＶ１４ａおよび１
４ｂのＤＮＡ上に位置する２１個および３１個の部位の
中で、ＨＰＶ−１４ａのＤＮＡの２個のＢａｍＨＩ切断
部位の１つがＨＰＶ−１４ａのＤＮＡの唯一のＢａｍＨ
Ｉ切断部位と並んでいるときには１５個が共通している
ことが判明した。同様に、唯一のＢａｍＨＩ切断部位が
並んでいるときには、ＨＰＶ−１７ａのＤＮＡ上の２９
個の切断部位のうち２１個がＨＰＶ−１７ｂのＤＮＡ上
（全部で２６部位）でも等しく認められた。これらの地
図と、ＥＶに関連するＨＰＶ類（ＨＰＶ３ａ，５，８，
９，１０および１２）（８，９，１６，１８および２
０）、皮膚いぼに関連するＨＰＶ類（ＨＰＶ１，２，４
および７）、皮膚粘膜あるいは粘膜の病巣に関連するＨ
ＰＶ類（ＨＰＶ６ｂ，１１ａ，１３および１６）（１，
３３，１９）に対して既に確立された地図との間に、Ｅ
Ｖ保有日本人男性から単離されたＨＰＶの地図（２４）
と密接に関連するＨＰＶ−１４ａに対する地図を除いて
は明らかな相似性はみられなかった。この後者の単離Ｈ
ＰＶとＨＰＶ−１４ａとの相違点は、１個の追加Ｂａｍ
ＨＩ部位と１個の追加ＨｉｎｄII部位である。２種のウ
イルスにおいて部位ＡｖａＩ，ＢａｍＨＩ，ＢｇｌＩ，
ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄIIおよびＨｉｎｄIII の位置は同
様であった。交差ハイブリダイゼーション実験により、
これら２種のウイルスが実際に密接に関連していること
が確認された。 【００２８】（矢印で示した）幾つかの部位が所在して
いないことに注目されたい。ゲノムの長さの２％未満の
差しかない切断部位は保存されたもの（ *）とみなし
た。***を生起しない酵素は次の通りであった。ＨＰＶ
１４ａおよび２３のＤＮＡに対してはＰｖｕＩ，Ｓａｌ
ＩおよびＳｍａＩ；ＨＰＶ−１４ｂのＤＮＡに対しては
ＰｖｕＩ，ＳａｃＩ，ＳａｌＩおよびＳｍａＩ；ＨＰＶ
１５，１７ａおよび１７ｂのＤＮＡに対してはＢｇｌ
Ｉ，ＰｖｕＩ，ＳａｌＩ，ＳｍａＩ；ＨＰＶ−１９のＤ
ＮＡに対してはＢｇｌＩ，ＳａｃＩ，ＳａｌＩおよびＳ
ｍａＩ；ＨＰＶ−２０のＤＮＡに対してはＥｃｏＲＩ，
ＰｖｕＩ，ＳａｃＩおよびＳｍａｌＩ；ＨＰＶ−２１の
ＤＮＡに対してはＳａｃＩおよびＳｍａＩ；ＨＰＶ−２
２のＤＮＡに対してはＢａｍＨＩ，ＢｇｌＩ，Ｐｖｕ
Ｉ，ＰｖｕIIおよびＳａｌＩ；ＨＰＶ−２４のＤＮＡに
対してはＢｇｌＩ，ＥｃｏＲＩ，ＰｖｕＩ，ＳａｃＩ，
ＳａｌＩおよびＳｍａＩ。 【００２９】既に特徴付けられたＥＶのＨＰＶ−ＤＮＡ
類（ＨＰＶ３ａ，５，８，９，１０および１２）、皮膚
いぼに関連するＨＰＶ−ＤＮＡ類（ＨＰＶ１，２，４お
よび７）および粘膜病巣に関連するＨＰＶ−ＤＮＡ類
（ＨＰＶ６ｂ，１１ａ，１３および１６）と新たに特徴
付けられたＨＰＶ−ＤＮＡ類との間、並びに新たに特徴
付けられたＨＰＶ−ＤＮＡ類のＤＮＡ間の配列相同の有
無を研究した。ろ紙上への付着、および飽和液相中での
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションとそれに続くＳ
１ヌクレアーゼ消化によるハイブリダイゼーション実験
は、前記した（８，９）偏性（ストリクトまたはストリ
ンジェント）条件下で実施した。特に、ＨＰＶ類のＤＮ
Ａ類は、前記したように（１３）“ニック翻訳”で標識
し、アルカリ性ショ糖勾配（５〜２０％）での沈降によ
り分離させた。標識（４０００ｃｐｍ）ＨＰＶ−ＤＮＡ
類を、前記したように（８，９）牛胸腺ＤＮＡ（２０μ
ｇ）あるいは非標識ＨＰＶ−ＤＮＡ（０．２０μｇ）の
存在下でＮａＣｌ ０．４８Ｍ／ＥＤＴＡ１ｍＭ（ｐＨ
６．８）中、６８℃でインキュベートした。ＨＰＶ−Ｄ
ＮＡプローブの比活性は５．３×１０7 から２×１０8
ｃｐｍ／μｇの間で変化した。ハイブリダイゼーション
の程度を、Ｓ１ヌクレアーゼに抵抗する画分を目安にし
て調べた。数は、プローブの自然復元（４〜１５％）に
ついて校正し相同ハイブリダイゼーション（７５〜９５
％）について１００％に正規化した値を表わす。ＮＤは
“測定せず”の略号である。上記条件下におけるＨＰＶ
−ＤＮＡ類間の交差ハイブリダイゼーションの相対量
を、標識ＨＰＶ−ＤＮＡを非標識ＨＰＶ−ＤＮＡとのハ
イブリダイゼーションの％として表２に示す。 【００３０】 【表２】【００３１】ＨＰＶ１、２、４、６ｂ，７および１１ａ
のゲノムと32Ｐ標識の新たにクローン化されたＥＶのＨ
ＰＶ−ＤＮＡ類との間、或いはＥＶの非標識ＨＰＶ−Ｄ
ＮＡ類とＨＰＶ１３，１６および１８に特異なプローブ
との間の交差ハイブリダイゼーションは全くないか或い
は殆んどないことに注目されたい。同様に、飽和再結合
（saturation reassociation) により、ＨＰＶ１４ａ，
１４ｂ，１５，１７ａ，１７ｂ，１９，２０，２１，２
２，２３および２４のＤＮＡ類とＨＰＶ１ａおよび１１
ａのＤＮＡ類との間に交差ハイブリダイゼーションは殆
んど認められなかった（表２）。新たにクローン化され
たＨＰＶ類のＤＮＡ類では、強力な交差ハイブリダイゼ
ーションを示したＨＰＶ１７ａおよび１７ｂ、ＨＰＶ１
４ａおよび１４ｂを除いて、相互間かつＥＶに関連する
他のＨＰＶ（ＨＰＶ３ａ，５，８，９，１０および１
２）のゲノムとの間での交差ハイブリダイゼーションは
殆んど或いは全くみられなかったし、認められたにせよ
５０％未満であった。これらの知見から、新しいウイル
ス類が９個の新しいタイプ（型）（ＨＰＶ１４，１５，
１７，１９，２０，２１，２２，２３および２４）と２
個のサブタイプ（亜型）即ちタイプ１４（ＨＰＶ−１４
ａと１４ｂ）及びタイプ１７（ＨＰＶ−１７ａと１７
ｂ）とに分類されることが確認された。 【００３２】同様に、別のＨＰＶ類は、分子ハイブリダ
イゼーションの偏性（ストリクト）条件下での配列相同
性の有無に基づいて分類された。これらのグループ（Ａ
からＨ）を表３に示す。この表には、これらＨＰＶ類
（単独で或いは組合せて）のキヤリアの中で診断された
疾患およびその発癌性が示されている。 【００３３】 【表３】【００３４】ＨＰＶ５，８，１２，１４，１９，２０，
２１，２２および２３のＤＮＡ類では、これらの間の交
差ハイブリダイゼーション（グループ相同）のレベルは
５〜３８％であり、ＨＰＶ５，８および１２のＤＮＡ類
との場合を除いて顕著な交差ハイブリダイゼーション
（４〜１３％）は示さない。従って、これらのウイルス
類は前に定義した（９）ＥＶのＨＰＶ類のグループの１
部を形成する。 【００３５】同様に、相互間で約２０％の交差ハイブリ
ダイゼーションを示しかつＨＰＶ−９のＤＮＡと約６％
の交差ハイブリダイゼーションを示すＨＰＶ９，１５お
よび１７のＤＮＡ類は等しく、前記した（９）ＥＶのＨ
ＰＶ類のグループに属する。タイプ１３と３１のＨＰＶ
類は一つの同じグループに属するものと考えられうる。
また最後に、他のＨＰＶ類のゲノムと殆んど相同性を示
さないタイプ１，２，４，２４および３２のＨＰＶ類
は、相互にかつ従来のグループとは異なる他のグループ
の第１のメンバーを形成するものとして考えられる。 【００３６】本発明はまた特に、上記したＨＰＶ−ＤＮ
Ａ類から由来されるＤＮＡ断片（フラグメント）および
特に遺伝子Ｅ６−Ｅ７，Ｅ１，Ｌ２，Ｌ１およびそれら
の遺伝子間領域にそれぞれ対応するＤＮＡ断片に関す
る。原点として採った部位に対するこれら各種断片の相
対位置および長さを表４に示す（図１〜図９）。 【００３７】 【表４】【００３８】ＨＰＶ−１のゲノム上の遺伝子の位置は、
このゲノムのヌクレオチド配列から推論された〔オー．
ダノス（Ｏ．ＤＡＮＯＳ），エム．カチンカ（Ｍ．ＫＡ
ＴＩＮＫＡ）およびエム．ヤニブ（Ｍ．ＹＡＮＩＶ）の
パテント〕。ハイブリダイゼーションの偏性条件（Ｔｍ
−２９℃）あるいはあまり偏性でない条件（Ｔｍ−４０
℃）下で形成されたヘテロ二重鎖分子を電子顕微鏡分析
した後、ＨＰＶ−３，５，８，９，１０ａ，１２，１
４，１５，１７および２４のゲノムの物理的地図をＨＰ
Ｖ−１の物理的地図および遺伝子地図と関連させて配列
し、ＨＰＶ−３１のそれをＨＰＶ６ｂの物理的地図およ
び遺伝子地図と関連して配列した〔イー．シュワルツ
（Ｅ．ＳＣＨＷＡＲＺ）ら、エンボジェー（ＥＭＢＯ
Ｊ．）１９８３，２，２３４１−２３４８〕。保存され
た制限酵素部位を並列させた後、ＨＰＶ１０ｂ，２８お
よび２９の物理的地図をＨＰＶ３ａおよび１０ａの物理
的地図に対して配列した。 【００３９】表４に示した配位の値は、図１〜図９に示
した物理的地図上で、遺伝子Ｅ６，Ｅ７，Ｅ１，Ｌ２お
よびＬ１およびＨＰＶ−１ａのゲノムに関するかＨＰＶ
−３１の場合にはＨＰＶ−６ｂのゲノムに関する遺伝子
間領域と相同なゲノムセグメントの５′および３′末端
の位置を示す。 【００４０】遺伝子間領域（調節要素を含む）および隣
接のＥ６とＥ７遺伝子（多分腫瘍中で発現される形質転
換の主要遺伝子に相当する）は、別のグループに属する
多くのＨＰＶタイプのゲノム間で（非偏性ハイブリダイ
ゼーション条件下で）形成された、或いは同じグループ
に属する多くのＨＰＶタイプのゲノム間で（偏性ハイブ
リダイゼーション条件下で）形成されたヘテロ二重鎖分
子の電子顕微鏡分析により検出されうる配列相同性を示
さない。遺伝子ＥＩ（ウイルスＤＮＡの複製に主に関係
する）および遺伝子Ｌ１（ウイルス粒子の主要抗原決定
基を有するウイルスカプシドの主要タンパク質のコーデ
ィング）は、別のグループに属するＨＰＶタイプのゲノ
ム間で（非偏性ハイブリダイゼーション条件下で）形成
された、或いは同じグループに属するＨＰＶ類のゲノム
間で（偏性条件下で）形成されたヘテロ二重鎖の分析に
より検出されうる配列相同性を示す。 【００４１】Ｅ１およびＬ１領域を含む組換えプラスミ
ドから作成されたプローブを用いて、ケースに応じて偏
性或いは非偏性条件下での分子ハイブリダイゼーション
実験により最大数のＨＰＶタイプを検出することが理論
的に可能である。遺伝子間領域および遺伝子Ｅ６および
Ｅ７を含む組換えプラスミドから作成されたプローブ
は、或るＨＰＶタイプあるいは関連するＨＰＶタイプを
特異的に検出することができる。 【００４２】Ｌ２領域（ウイルスカプシドのマイナーな
成分に対するコーディング）は、各種ＨＰＶタイプの中
で種々のヌクレオチド配列保存度を示す。 【００４３】ウイルスＨＰＶ−ＩＰ２ およびＨＰＶ−
ＩＰ４ を単離する条件およびこれらのウイルスからＨ
ＰＶ−ＤＮＡ類を得る条件を以下により詳しく記載す
る。 【００４４】新生物および性器ガンに関連した新しいタ
イプのＨＰＶ（ＨＰＶ−ＩＰ２ ）の分子クローニング
および特徴づけ 新しいタイプのＨＰＶは、ＨＰＶタイプ１６に特異な放
射性プローブを用いる非偏性条件下でのハイブリダイゼ
ーションにより子宮頸管ガンから抽出されたＤＮＡ中に
存在していることがみとめられた。偏性ハイブリダイゼ
ーション条件下でハイブリダイゼーションを実施したと
きには交差ハイブリダイゼーションは検出されなかっ
た。このＨＰＶ−ＤＮＡの多数の制限酵素に対する感度
の研究から、酵素ＢｇｌIIがウイルスＤＮＡを１度切断
していることが知見された。腫瘍から抽出されたＤＮＡ
をエンドヌクレアーゼＢｇｌIIで消化した後、８ｋｂ
（パピローマウイルスのゲノムのサイズ）のＤＮＡ分子
を含有する画分をショ糖勾配での遠心により精製した。
８ｋｂ分子を、ＢａｍＨＩ部位でバクテリオフアージλ
Ｌ４７．１のＤＮＡに挿入されたプラスミドＰＬ １
５．５（ＢｇｌIIおよびＢａｍＨＩによる単一の切断部
位を含む）から構成されるベクターのＢｇｌII部位に挿
入した。組換えＤＮＡを包膜し宿主細菌〔大腸菌（Esch
erichia coli ）菌株ＬＡ１０１〕に感染後、組換えフ
ァージに相当する溶菌領域（プラーク）を感染細菌培養
物のレプリカを放射性ＨＰＶ−１６からのＤＮＡを用い
て非偏性条件下でハイブリダイゼーションすることによ
り検出した。ウイルス配列の全体を含む幾つかの組換え
バクテリオフアージを単離した。挿入酵素ＢｇｌIIによ
りフアージＤＮＡを切断すると、非偏性条件下でＨＰＶ
−１６プローブとハイブリダイズする８ｋｂフラグメン
トが得られる。原腫瘍のＤＮＡおよび組換えフアージの
ＤＮＡを酵素ＢｇｌIIおよびＰｓｔＩの混合物で切断す
ると、総分子量がパピロマウイルスのゲノムのサイズに
等しい同一の５個のフラグメントが得られる。新しいＨ
ＰＶのＤＮＡを組換えパクテリオファージのＤＮＡから
切除し、電気溶離（electroelution）により精製し、プ
ラスミドＰＬ１５．５で再クローン化した。ウイルスＤ
ＮＡの制限地図が、２１個の切断部位を位置決めしうる
（図９）１８種の制限酵素に対するこのＤＮＡの感受性
に基いて確立された。こうして確立された地図は今まで
に同定されたＨＰＶ類のゲノムの地図とは異なってい
る。新しいＨＰＶのＤＮＡと今までに同定されたＨＰＶ
類のＤＮＡとの配列相同性を、偏性条件下で行なわれた
レプリカの分子ハイブリダイゼーション実験で分析し
た。検知された相同性は常に５％未満であった。ＨＰＶ
−１６のゲノムで相同性が最大であった。子宮頸管ガン
からの特性づけられた新しいウイルスは新しいタイプの
ＨＰＶであり、これを仮にＨＰＶ−ＩＰ２ と呼称す
る。 【００４５】ＨＰＶ−ＩＰ２ のＤＮＡとＨＰＶ−１の
ＤＮＡとの間で各種条件下で形成されたヘテロ二重鎖分
子を電子顕微鏡で分析すると、これら２種のゲノムの物
理的地図の配列およびＨＰＶ−ＩＰ２ のＤＮＡが担持
している種々の遺伝子の理論的位置決めが可能であっ
た。 【００４６】 【表５】 【００４７】精製ＨＰＶ−ＩＰ２ のＤＮＡから作成し
た放射性プローブを使用すれば、これらウイルスの病原
力が測定できる。ＨＰＶ−ＩＰ２ のＤＮＡは、調べた
外性器のボウエノイド丘疹（Bewenoid papula)１４例中
１例に、侵入性子宮頸ガン５１例中２例に、子宮頸部の
上皮内新生物（neoplasie)２８例中１例にみとめられ
た。従って、ＨＰＶ−ＩＰ２ は、ＨＰＶ−１８に比べ
てやや弱くＨＰＶ−１６に比べてかなり弱い腫瘍形成能
を有する性器向性タイプ（genito-tropic type)のＨＰ
Ｖである。性器新生物、特に子宮頸管ガンの進行の危険
性を示すＨＰＶ類のタイプを診断あるいはスクリーニン
グするための分子プローブを作成することを目的とする
ＨＰＶ−ＤＮＡ混合物中に組み入れることが必要であ
る。 【００４８】皮膚の前ガン病巣に関連する新しいタイプ
のＨＰＶ（ＨＰＶ−ＩＰ４ ）の分子クローニングおよ
び特徴づけ 新しいタイプのＨＰＶが、光線（紫外線）角化症の生
検、前ガン皮膚病巣から抽出されたＤＮＡ中に、ＨＰＶ
タイプ５，８および１４に特異な放射性プローブを含む
混合物を用いる偏性条件下での分子ハイブリダイゼーシ
ョンにより証明された。ハイブリダイゼーションをタイ
プ１，２，３，７，１０，１３，１６，１８，２８，Ｉ
Ｐ−１（前にＨＰＶ−３１と呼称した）、ＩＰ−２およ
びＩＰ−３（前にＨＰＶ−３２と呼称した）に特異なプ
ローブを用いて行なった場合には交差ハイブリダイゼー
ションは検知されなかった。 【００４９】このＨＰＶのＤＮＡの幾つかの制限酵素に
対する感受性を調べたところ、酵素ＥｃｏＲＩがウイル
スＤＮＡを１度切断していることが知見された。エンド
ヌクレアーゼＥｃｏＲＩにより生検から抽出されたＤＮ
Ａを消化させた後、８ｋｂ（パピローマウイルスのゲノ
ムのサイズ）のＤＮＡ分子を含む画分をショ糖勾配によ
る遠心で精製した。８ｋｂ分子をＥｃｏＲＩ部位でバク
テリオファージλｇｔｗｅｓ．λＢのＤＮＡに挿入し
た。組換えＤＮＡを包膜し、宿主細菌〔大腸菌（Escher
icｈia coli ）菌株ＬＡ１０１〕の感染後、組換えファ
ージに相当する溶菌プラークを、非偏性条件下でＨＰＶ
−８および１４からのＤＮＡ類の放射性混合物により感
染細菌性培養物のレプリカ（複製物）をハイブリダイゼ
ーションすることにより検出した。ウイルス配列の全体
を含む幾つかの組換えバクテリオファージを単離した。
挿入酵素ＥｃｏＲＩによりファージＤＮＡを切断する
と、非偏性条件下でＨＰＶ−５，８および１４に特異な
プローブをハイブリダイズする８ｋｂフラグメントが得
られる。原病巣のＤＮＡおよび組換えファージのＤＮＡ
を酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩの混合物で切断する
と、総分子量がパピローマウイルスのゲノムのサイズに
等しい同一の６個のフラグメントが得られる。新しいＨ
ＰＶのＤＮＡを組換えバクテリオファージのＤＮＡから
切除し、電気溶離で精製し、プラスミドｐＳＰ６５で再
クローン化した。ウイルスＤＮＡの制限地図をこのＤＮ
Ａの１５種の制限酵素に対する感受性によって確立し
た。これにより２３個の切断部位の位置決めが可能とな
った（図１０）。こうして確立された地図は、今までに
同定されたＨＰＶ類のゲノムの地図と異なっていた。新
しいＨＰＶのＤＮＡと今までに同定されたＨＰＶ類のＤ
ＮＡとの配列相同を、偏性条件下で行なったレプリカに
対する分子ハイブリダイゼーション実験により調べた。
いぼ状表皮異形成病巣中で既に同定された或るタイプの
ＨＰＶ類（ＨＰＶ−５，８，１２，１４，１９，２０，
２１および２５）のＤＮＡと新しいＨＰＶのＤＮＡとの
間の相同性は５０％未満であったが、他のタイプのＨＰ
Ｖ類との相同性は認められなかった。こうして光線角皮
症からの特性づけられた新しいウイルスは新しいタイプ
のＨＰＶであり、これを仮にＨＰＶ−ＩＰ４ と呼称す
る。 【００５０】精製ＨＰＶ−ＩＰ４ のＤＮＡから作成さ
れた放射性プローブを使用すると、調べたいぼ状表皮異
形成患者１７例中４２％に、分析した光線角皮症の生検
ｙ中ｘでＨＰＶ−ＩＰ４ が検出された。皮膚ガンの頻
繁な進行を特徴とする病気のいぼ状表皮異形成の患者で
高率であったことと、皮膚の有棘細胞ガンの前駆体と考
えられる光線角化症の病巣の割合に対する関連比から、
ＨＰＶ−ＩＰ４ は腫瘍形成能を有する皮膚向性タイプ
のＨＰＶである。皮膚のガンあるいは前ガン病巣の進行
の危険を示すＨＰＶタイプを診断もしくはスクリーニン
グするための分子プローブを作成することを目的として
いるＨＰＶ−ＤＮＡ類混合物にはこれを組み入れなけれ
ばならない。 【００５１】本発明は更に、特に各種ＨＰＶ−ＤＮＡ類
の混合物（あるいはこれらＨＰＶ−ＤＮＡ類もしくはそ
れらからの配列を含有するプローブ）に関し、これら混
合物は、多分感染の進行可能性を予知するために各種形
態のパピローマウイルス感染を診断するべく組合せて使
用されうる。本発明の好ましい混合物を表６に例示す
る。 【００５２】 【表６】【００５３】この表には、混合物を使用して特に診断可
能な疾患の性質も示した。図１〜図９の制限地図の分類
は表６の“構成”欄に示した分類（グループ分け）と一
致していることは注目すべきことである。このために、
添附図面の幾つかの図面に幾つかのプローブが数回示さ
れているのである。 【００５４】これらの各混合物は、本発明の新しいプロ
ーブの少なくとも１つを包含するものとして定義づけら
れうる。換言すれば、本発明の診断用組成物は次のもの
を含むものとして定義づけられうる。 【００５５】（１）少なくともＨＰＶ−２ｄのＤＮＡ、
（２）ＨＰＶ１０ｂ，２８および／又は２９のＤＮＡの
少なくとも１種、（３）ＨＰＶ１７および／又は２４の
ＤＮＡの少なくとも１種、（４）ＨＰＶ１４，１５，１
７，１９，２０，２１，２２および／又は２３のＤＮＡ
の少なくとも１種、（５）ＨＰＶ１５および／又は１７
のＤＮＡの少なくとも１種、（６）ＨＰＶ−２４のＤＮ
Ａ、（７）ＨＰＶ−１４および３２のＤＮＡ、（８）Ｈ
ＰＶ−３１のＤＮＡ、（９）ＨＰＶ−３２のＤＮＡ。 【００５６】９種のグループのＤＮＡは全ゆる状況下で
互いに異なるように選択されると理解されたい。 【００５７】各種形態のいぼあるいは他の皮膚もしくは
粘膜病巣から多くのＨＰＶ類が単離されうるが、表に示
した各タイプの疾患の診断に１種あるいは２種以上のＨ
ＰＶ−ＤＮＡ類を含有する混合物を使用することが好ま
しい。なぜなら他のＨＰＶ−ＤＮＡ類は同タイプの疾患
に同様に介在(intervene) しうると考えられていたから
である。感染の性質およびその進行可能性の診断は、使
用するプローブの数が増すにつれてより有効となるであ
ろう。加えて、各種プローブ混合物を用いて行なうハイ
ブリダイゼーションアッセイにより、罹患疾患の識別
（鑑別）診断を同等にかなりの確率で行ないうる。 【００５８】表６には、本発明者らの研究所で単離され
たＨＰＶ−ＤＮＡ類から形成されたプローブのみを記載
した。勿論前記した理由で、別の研究所の研究過程で得
られた同じタイプの感染症を患っている患者において何
度も検出されている他のＨＰＶ−ＤＮＡ類を添加するこ
とにより各種混合物を有利に改良しうる。例えば混合物
７は、上皮内新生物や皮膚ガンへの移行の危険性を有す
るいぼ状表皮異形成中にみられる他のＨＰＶ−ＤＮＡ類
を添加することによってのみ改良されうる。表６におい
て、いくつかの混合物が同じ疾患の診断に特有なものと
して表示されていることに注目されたい。いろいろな混
合物により、腫瘍形成(cancerization)のリスクの少な
い感染症とそのリスクの高い感染症とを区別しうる。例
えば、診断が下される患者から得たウイルスサンプルが
混合物７とハイブリダイゼーションすれば、サンプルが
混合物３のプローブとそれ以上にハイブリダイズした場
合に比べて皮膚ガンに進行するリスクが高いことが示唆
される。 【００５９】同様に、混合物５により検出されたＥＶの
症例では混合物６を用いて検出されたこれら症例に比べ
て腫瘍形成のリスクは高い。混合物４は、混合物５を用
いて検出される症例に比べてより高いリスクを有するＥ
Ｖ症例を識別できるであろう。 【００６０】さらに以下に異なるＨＰＶ−ＤＮＡ（ある
いはこれらのＨＰＶ−ＤＮＡを含むプローブあるいはＨ
ＰＶ−ＤＮＡの配列）のその他の混合物を記載する。こ
れらは任意に、起り得る感染の進行の予後経過を測定す
る目的で、異なる形の乳頭腫ウイルス感染の全般的診断
に組み合わせて使用することができる。 【００６１】本発明に一致する好ましい混合物は前記表
６に特定されている。本表はまた表の左側に記載した混
合物の使用によって格別に診断し得る疾患の性質も示し
ている。本表に特定したその他のＨＰＶ−ＤＮＡの制限
地図は図１〜９に示されている。 【００６２】ＨＰＶ−ＩＰ２ は、性器腫瘍特に子宮頸
ガンの進行の危険性の検知に使用できる格別な代表的プ
ローブと考えられることを指摘しておく。 【００６３】従って本発明は格別に、前記表において混
合物番号として示した１〜１０の番号をつけて示した１
０のグループを少なくとも含む診断用キットにも係る。 【００６４】これまでは特に、クローン化ＨＰＶ−ＤＮ
Ａ全体のプローブとしての使用について考慮してきた。
しかしそれらはこれらの異なるＤＮＡのクローン化フラ
グメント、特に遺伝子Ｅ１あるいはＬ１及び遺伝子Ｅ６
−Ｅ７によって置き換ることもできる。 【００６５】ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＨＰＶ−ＤＮＡ
検知の基本的原理は当然、厳格（ストリクト）あるいは
弱厳格条件で行なわれるハイブリダイゼーションを含
む。 【００６６】操作は例えば下記のように行なわれるが、
記載する診断方法は当然、本発明のプローブ及びプロー
ブの混合物の使用条件を制限するものではないと解され
るものである。 【００６７】クローン化ＨＰＶのＤＮＡ混合物より得た
プローブを使用する試験の目的は、バイオプシー中、病
変部から採取して得た細胞中、あるいはカルノイ(Carno
y)混合液（エタノール、クロロホルム、酢酸、６：３：
１）により固定されパラフィン中に含まれるバイオプシ
ー部分中のＨＰＶの存在を明らかにし、ＨＰＶのタイプ
を同定することである。試験は、原理は公知の方法によ
る試料からのＤＮＡの予抽出を必要とし、ＨＰＶ−ＤＮ
Ａ混合物から調製した放射性プローブ（32ｐあるいは35
ｓで標識されている）を使用した厳格あるいは弱厳格条
件下での分子ハイブリダイゼーションによるこのＤＮＡ
の分析を含む。一般には、各試験はいくつかのプローブ
混合物を必要とする。 【００６８】いくつかのハイブリダイゼーション方法が
使用し得る。例えばスポットハイブリダイゼーション法
が使用できる。本方法はＤＮＡの変性の後、ＤＮＡアリ
コートをメンブラン（ニトロセルロースあるいはジーン
スクリーンプラス〔Genescreeuplus〕上に沈積させ、各
メンブランを通常の条件下でプローブ混合物とハイブリ
ダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーションさせたメ
ンブランを放射線写真フィルム上に接触露光させること
により放射性ハイブリッドの検知を行なうことから成
る。またレプリカに対するハイブリダイゼーション法を
使用することもできる。本方法は、制限酵素でのＤＮＡ
処理により得られたＤＮＡフラグメントのアガロースゲ
ル電気泳動による分離、アルカリ変性後の該フラグメン
トのメンブラン（ニトロセルロースあるいはジーンスク
リーンプラス）上への転写、及び通常の条件下での異な
るプローブ混合物とのそれらのハイブリダイゼーション
から成る。放射性ハイブリッドの形成はやはり、メンブ
ランの放射性写真フィルム上への接触露光によって検知
する。 【００６９】放射性プローブは、ニックトランスレーシ
ョン法により標識されたＨＰＶ−ＤＮＡ、あるいは例え
ばＳＰ６型のようなベクター中にインサートされたウイ
ルスＤＮＡの転写により調製されたＲＮＡにより構成さ
れる。放射性プローブを使用すると格別な好感度という
利点が得られるが、例えばビオチン化されており、それ
自体標識された抗体あるいは酵素的、蛍光的あるいはそ
の他の標識を有する抗体により認識可能な抗体によって
認識され得るような非放射性プローブの使用を除外する
ものではない。 【００７０】プローブの選択は標本の性質に依る。例え
ばＥＶを有している可能性がある患者の場合、混合物
１，２，３，４，５，６及び７が使用される。混合物１
及び２はＥＶ及び皮膚イボの異なる診断を可能とする。
プローブ３はＥＶに関連するＨＰＶの３つのグループの
それぞれの最もよく検知されるものを含んでおり、プロ
ーブ７はＥＶのガンに関連するＨＰＶのＤＮＡを含んで
おり、大多数のＥＶの場合の診断を可能にするものであ
り、特にガンに発展し易いＨＰＶのタイプに感染した患
者の同定の診断を可能にするものである。混合物４，５
及び６の使用により、同一の患者に感染したＨＰＶの一
つ以上のタイプを区別することができる。 【００７１】従って本発明はさらに、上記したプローブ
のいくつかを含むセットあるいはキットにも係り、特に ──上記した１９のＨＰＶ−ＤＮＡのタイプあるいはサ
ブタイプのそれぞれの代表的なもの、あるいは ──プローブの混合物、好ましくは前記に規定したプロ
ーブの種々のグループあるいは混合物を含むものであ
る。これらのキットは、患者から得たウイルス調製物と
種々のグループあるいは混合物との間のハイブリダイゼ
ーションによるｉｎｖｉｔｒｏでの診断試験を目的とす
るものである。 【００７２】言うまでもなく今まで記載したことから、
本発明は特異的に想定されるその実施態様あるいは適用
に限定されるものではなく、それどころか全ての変形例
を包含するものであり、特定番号を付され図面中に制限
地図を示したＨＰＶ−ＤＮＡの特許請求の範囲における
記載は、特許請求の範囲が前記した定義に従って同じタ
イプに分類されるこのＨＰＶ−ＤＮＡに共通なＨＰＶ−
ＤＮＡを全て包含することを示すものであり、特に同じ
サブタイプに属するＨＰＶ−ＤＮＡにおいてはなおさら
そうである。 【００７３】さらに図面に示したＨＰＶ−３２から得ら
れたＤＮＡに関して、それが以下の酵素、ＡｖａＩ，Ｂ
ａｌＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，ＥｃｏＲＩ，Ｈｉｎｄ
III，ＮｄｅＩ，ＮｒｕＩ，ＰｖｕＩ，ＰｖｕII，Ｓａ
ｃＩ，ＳａｌＩ，ＳｍａＩ，ＴｔｈIIIあるいはＸｍａ
Ｉのいずれによっても切断されないことが特に指摘され
る。 【００７４】また、下記の組換えＤＮＡは１９８４年１
１月３０日に下記の受託番号でＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ（ナショ
ナルコレクション・オブ・カルチュア・オブ・マイクロ
オーガニズム・オブ・インスティテュート・バスツー
ル、パリ）に寄託されていることも特記しておく。 【００７５】 ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ２ｄ ………… Ｎｏ．Ｉ−３７９ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ１０ｂＡ ………… Ｎｏ．Ｉ−３８０ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ１０ｂＢ ………… Ｎｏ．Ｉ−３８１ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ１４ａ ………… Ｎｏ．Ｉ−３８２ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ１４ｂ ………… Ｎｏ．Ｉ−３８３ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ１５ ………… Ｎｏ．Ｉ−３８４ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ１７ａ ………… Ｎｏ．Ｉ−３８５ ｐＨＰＶ５ ＨｉｎｄIII Ｂ／ＨＰＶ１７ｂ … Ｎｏ．Ｉ−３８６ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ１９ ………… Ｎｏ．Ｉ−３８７ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ２０ ………… Ｎｏ．Ｉ−３８８ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ２１ ………… Ｎｏ．Ｉ−３８９ ｐＨＰＶ５ ＨｉｎｄIII Ｂ／ＨＰＶ２２ …… Ｎｏ．Ｉ−３９０ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ２３ ………… Ｎｏ．Ｉ−３９１ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ２４ａ ………… Ｎｏ．Ｉ−３９２ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ２４ｂ ………… Ｎｏ．Ｉ−３９３ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ２８ ………… Ｎｏ．Ｉ−３９４ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ２９ ………… Ｎｏ．Ｉ−３９５ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ３１ ………… Ｎｏ．Ｉ−３９６ ｐＳＰ６４／ＨＰＶ３２ ………… Ｎｏ．Ｉ−３９７ ｐＬＩ５５／ＩＰ２ ………… Ｎｏ．Ｉ−４５０ ｐＳＰ６５／ＩＰ４ ………… Ｎｏ．Ｉ−４４９ 本発明はさらに、前に言及した異なる乳頭腫ウイルスか
ら得た遺伝子Ｅ６及びＥ７の発現の産物にも特に係る。
それ等は有効量で投与すれば乳頭腫ウイルスに関連する
腫瘍の進行に対する抵抗性を宿主に生起することができ
るワクチンの活性主成分として使用することができる。 【００７６】本発明はまた、哺乳動物の免疫化により得
られる血清にも係る。該血清は患者に有効量で特に非経
口的に投与可能な血清調製物とし得、それは対応する乳
頭腫ウイルスのタイプあるいはサブタイプにより生起さ
れた感染を退行させ得る。 【００７７】問題の種類の発現のポリペプチド生成物を
得ること、特に適当なプロモータのコントロール下にベ
クターにＥ６及び／又はＥ７配列を結合すること、乳頭
腫ウイルスが問題のプロモーターを認識し易く、それに
関する配列を発現し易い細胞宿主の形質転換から成る遺
伝子工学の技術によるものは、同業の通常の能力を有す
る者に対して強調する必要はない。 【００７８】このように本発明は、問題の種類の主成分
（発現生成物あるいは対応抗体）を生理的に許容可能な
薬理学的担体と共に含む、薬理学的使用を目的とする組
成物にも係る。特に問題の種類の組成物が非経口的に投
与される場合は、担体は注射可能な飽和溶液により構成
される。 【００７９】最後に、参照した文献の書誌目録を以下に
記した。これは読者が本テキストを十分に理解するため
に有用であると考えられる範囲において、先行技術水準
の記載の要件を満すものである。この理由から、これら
の文献の内容は記載の一部と考えられるべきものであ
る。 【００８０】参 考 文 献 （１）エム・ダースト(M.Durst) 他、プロク・ナトル・
アカド・スシ(Proc.Nafl.Acad.Sci)、Ｕ．Ｓ．Ａ，８
０：３８１２−３８１５。 【００８１】（２）ジエイ・アール・コギン・ジュニア
(Coggin, j.r.,Jr) 他、１９７９、カンサー・レス(Can
cer Res.) ，３９：５４５−５４６。 【００８２】（３）エル・ギスマン(Gissmann,L.) 他、
１９８２、ジエイ・ヴイロル(J.Virol.)４４：３９３−
４００。 【００８３】（４）エム・グリーン(Green,M.)他、１９
８２、プロク・ナトル・アカド・スシ、Ｕ．Ｓ．Ａ．，
７９：４４２３７−４４４１。 【００８４】（５）シー・エー・ハイルマン(Heilman,
C.A.)他、１９８０、ヴイロル(Virol.)３６：３９５：
４０７。 【００８５】（６）エス・ジヤブロンスカ(Jablonska,
S.)他、１９７２、カンサー・レス、３２：５８３−５
８９。 【００８６】（７）エス・ジヤブロンスカ他、１９８
２、スプリンガー・セミン・イムノ・パソール(Springa
r Semin.Immuno-pathol.) ５：３３−６２。 【００８７】（８）デー・クレムスドルフ(Kremsdorf,
D.)他、１９８２、ジエイ・ヴイロル、４３：４３６−
４４７。 【００８８】（９）デー・クレムスドルフ他、１９８
３、ジエイ・ヴイロル、４８：３４０−３５１。 【００８９】（10）エム・エー・ルツツナー(Lutzner,
M.A.)他、１９７８、ブル・カンサー(Bull.Cancer) 、
６５：１６９−１８２。 【００９０】（11）エム・エー・ルツツナー他、１９８
３、ランセツト(Lancet)ｉｉ：４２２−４２４。 【００９１】（12）エム・ミゴツツイ(Migozzi,M) 他、
１９６５、ブル・ソク・フランク・デーム・シフ(Bull.
Soc.Franc.Derm.Syph.) 、７２：７４７−７４８。 【００９２】（13）ジー・オルス(Orth,G.) 他、１９８
０、コールド・スプリング・ハーバー・コンフ・セル・
プロリフアレーシヨン(Cold Spring Harbor Conf.Cell
Proliferation)、７：２５９−２８２。 【００９３】（14）ジー・オルス他、１９８１、ジエイ
・インベスト・ダーマトール(J.Invest.Dermatol.)７
６：９７−１０２。 【００９４】（15）ジー・オルス他、１９７９、カンサ
ー・レス３９：１０７４−１０８２。 【００９５】（16）アール・エス・オストロウ(Ostrow,
R.S.) 他、１９８２、プロク・ナトル・アカド・スシ、
Ｕ．Ｓ．Ａ．，７９：１６３４−１６３８。 【００９６】（17）アール・エス・オストロウ他、１９
８３、アン・アカド・ダーマトール(Ann,Acad.Dermato
l) ，８：３９８−４０４。 【００９７】（18）エツチ・フイスター(Pfister,H.)
他、１９８３、カンサー・レス：４３：１４３６−１４
４１。 【００９８】（19）エツチ・フイスター他、１９８３、
ジエイ・ヴイロル、４７：３６３−３６６。 【００９９】（20）エツチ・フイスター他、１９８１、
イント・ジエイ・カンサー(Int.J.Cancer)、２７：６４
５−６５０。 【０１００】（21）エル・エー・リユーダ(Rueda,L.A.)
他、１９７６、メド・カツト・アイ・エル・エー(Med.C
ut.I.L.A.)、２：１１３−１３６。 【０１０１】（22）エム・リユイター(M.Ruiter)他、ジ
エイ・インベスト・ダーマトール、４７：２４７−２５
２。 【０１０２】（23）ジエイ・ジー・シユトクリフエ(Sut
cliffe,J.G.)、１９７８、ニユークレイツク・アシズ・
レス(Nucleic Acids Res) ，５：２７２１−２７２８。 【０１０３】（24）テイー・ツモリ(Tsumori,T.)他、１
９８３、ジエイ・ジエン・ヴイロル(J.Gen.Virol.)、６
４：９６７−９６９。
illomavirus)のＤＮＡを含有する、乳頭腫ウイルス感染
の検出のための組成物に係わる。 【０００２】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】“乳
頭腫ウイルス”という用語は、皮膚又は粘膜の比較的良
性の（ウイルス性）いぼ(warts) から、上皮内腫瘍又は
種々の形態の皮膚ガンに悪化し易い過形成(hyperplasia
s)までの幾つかの形態のウイルス感染症の原因であると
一般的に考えられている多数のウイルスを含むものであ
る。乳頭腫ウイルス感染の中には、特に、これ以降時々
“ＥＶ”と表現されるいぼ状表皮異形成(epidermodyspl
asias verruciformis)があることにも注意しなければな
らない。 【０００３】乳頭腫ウイルスの型の幾つかはすでに報告
されている。本発明の特許出願に於いて、幾つかの新規
の型及び亜型の乳頭腫ウイルスを、その感染患者に於い
て多大の割合で早発皮膚ガンを進行させる傾向のウイル
ス性のいぼ又は散在性斑紋(disseminated macular)病巣
から単離したことが報告されるであろう。 【０００４】最近の研究により免疫因子の重要性及びヒ
ト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）の主要な役割が明らかにさ
れており、これらの因子に、乳頭腫ウイルス感染の病理
に於ける様々な遺伝因子及び化学作用のある放射線に関
する文献中に以前に記載されている役割が追加される。 【０００５】本発明は新たに単離された多数の乳頭腫ウ
イルスの相対的な挙動に関する観察に基づいてなされた
ものであり、その主要なゲノムの性質は以下で定義され
よう。 【０００６】少数のＥＶ例に関する研究によって、６つ
の型のＨＰＶの性質がそれらのゲノムの分子クローニン
グによってすでに明らかにされている（クレムスドルフ
・デー(Kremsdorf, D.) 等、1982年、ジャーナル・ヴイ
ロロジー(J. Virol)．43巻、436-447 頁及びクレムスド
ルフ・デー等、1983年、ジャーナル・ヴイロロジー、48
巻、340-351 頁参照）。異なるグループのゲノムの間で
のクロス−ハイブリダイゼーションが欠如しているか又
は非常に弱いかどうかによって、上記のＨＰＶは３つの
グループに分類された。第１のグループには、或る種の
ＥＶ患者及び一般住民に於いて見られる扁平なウイルス
性いぼと関連のあるＨＰＶ３ａ及び１０が含まれる。Ｈ
ＰＶ３ａに関連するＤＮＡ配列は一人のＥＶ患者のガン
で発見された。第２のグループにはＨＰＶ５，８及び12
が含まれ、ＨＰＶ５及び８のゲノムは複数のＥＶ患者の
ガン中で検出された。第３のグループは現在のところた
った１種のウイルス、ＨＰＶ９である。免疫抑制を呈し
た腎臓移植受容者がＨＰＶ５に感染していると判明した
ことは例外であるが、第２と第３のグループのウイルス
はＥＶ患者の間だけに検出され、彼らの殆んどは幾つか
のウイルスに感染していた。現在文献（以下に示す参考
文献１−５，８，９，13，14，16，18−20）中に記述さ
れている14の型のＨＰＶの中で、４つのものは、珍しい
病気であるＥＶに特に関係のあるものであることが判明
したことに注目すべきである。 【０００７】多数の新規の型及び亜型の乳頭腫ウイルス
を単離し本発明を完成せしめた研究によってイン・ヴイ
トロに於けるより高度に洗練された診断技術開発が可能
になった。より具体的には、本発明は、例えば病巣又は
バイオプシー切片から得られる乳頭腫ウイルスの同定に
関する完璧な技術を提供し、これによって、問題となっ
ている病巣が悪化していく可能性があるかどうかに関す
る予測をもより良く行うようにさせ得るようなより正確
な診断法をもたらす。 【０００８】一般的に言って、乳頭腫ウイルスは、互い
に非常に異なってはいるが、それでも約7000〜8000の塩
基対の大きさを有していることに注意しなければならな
い。加えて、それらのゲノムには前述にもかかわらず或
る程度の相同性があり得る。以下の記載に於いて、乳頭
腫ウイルスの様々な型及び亜型間の相同性の割合（％）
を決定することに言及する。これら相同性の割合は、
“非ストリンジェント(non-stringent) ”又は“非スト
リクト(non-strict)”と呼ばれる条件下、又は“ストリ
ンジェント（緊縮）”又は“ストリクト（厳格）”と呼
ばれる条件下で行なわれるハイブリダイゼーションアッ
セイによって決定される。 【０００９】乳頭腫ウイルスは幾つかの型の乳頭腫ウイ
ルスに区別され得、それらはストリクト又はストリンジ
ェントの条件下で測定された相同性の割合によって区別
され得る。この条件下で、50％より小さい相同性の割合
を示すものは別の型に属する。この点に関して、ストリ
クト又はストリンジェントな条件下で別の型のウイルス
間の相同性の割合は０まで低下し得るということに注意
しなければならない。これと同じ条件下で、50％より大
きい相同性の割合を示すウイルスは同じ型に属するもの
と考えられ、それらはこの同型内の別々の亜型を形成す
る。 【００１０】非ストリクト又は非ストリンジェントな条
件下のハイブリダイゼーションアッセイは、ハイルマン
・シー・エー(Heilman. C. A) 等、1980年、ジャーナル
・ヴイロロジー36巻、395-407 頁及びクロイサン(CROIS
SANT) 等、1982年、シー・アール・アカド・サイエンス
(C. R. Acad. Sc.パリ、294 巻、581-586 頁（ヘテロ二
重鎖分子）に記載されている以下の条件下で単離された
２種のウイルスから取り出されたＤＮＡを相互に接触さ
せるものである。 【００１１】ストリクト又はストリンジェントな条件下
のハイブリダイゼーションアッセイは、クレムスドルフ
・デー等、1982年、ジャーナル・ヴイロロジー、43巻、
436-447 頁、及び1983年、ジャーナル・ヴイロロジー、
48巻、340-35頁、及びデービス・アール・ダヴリュ(Dav
is, R. W) 等、1971年、Methods Enzymol.、21巻、413-
428 頁（ヘテロ二重鎖分子）に記載されている条件下で
単離された２種のウイルスから取り出されたＤＮＡを相
互に接触させるものである。 【００１２】概要的には、１つの同じ型に属する乳頭腫
ウイルスはそれぞれの配列の長さ全体の80〜100 ％に亘
る実質的に同一のヌクレオチド配列を有するハイブリダ
イズ可能な配列を持っているが、これら相同的な配列は
別の型に属する乳頭腫ウイルスの間では60％又はそれ以
下に低下し得ることを言及しておく。非ストリクト又は
非ストリンジェントの条件下で相互にハイブリッドを形
成する別の型の乳頭腫ウイルスからの配列が同一あるい
は類似である程度は同じ型の乳頭腫ウイルスの場合より
必らず明らかに低いものである。 【００１３】本発明者らの研究によって、種々の型の乳
頭腫ウイルスの間の遺伝子の異種性の程度は以前考えら
れていたものよりも大きいこと、そして同時に、これら
種々の型が或る程度の特異性を示す感染形態又はその変
形としばしば関連のあることの２つが明らかになった。 【００１４】 【課題を解決するための手段】本発明は、（ｉ）ＨＰＶ
−１４ａ，ＨＰＶ−１４ｂ，ＨＰＶ−１５，ＨＰＶ−１
７ａ，ＨＰＶ−１７ｂ，ＨＰＶ−１９，ＨＰＶ−２０，
ＨＰＶ−２１，ＨＰＶ−２２，ＨＰＶ−２３，ＨＰＶ−
２４，ＨＰＶ−２８，ＨＰＶ−２９，ＨＰＶ−３１，Ｈ
ＰＶ−３２，ＨＰＶ−ＩＰ２，およびＨＰＶ−ＩＰ４か
らなる群から選択される乳頭腫ウイルスから得られる約
７，０００〜約８，０００塩基対からなり、明細書記載
の図１〜９の制限地図の一つを有するヒト乳頭腫ウイル
ス（ＨＰＶ）の精製されたＤＮＡ、又は該乳頭腫ウイル
スの１つに特異的であり、ストリンジェント条件下で該
乳頭腫ウイルスと安定なハイブリダイゼーションをする
ことができる前記精製ＤＮＡのフラグメント、および
（ii）前記（ｉ）に記載のＨＰＶ ＤＮＡ又はＤＮＡフ
ラグメントとは異なる少なくとも一つの別のＨＰＶ Ｄ
ＮＡ、を含有する、ヒト乳頭腫ウイルス感染の検出のた
めの組成物を提供する。 【００１５】従って本発明は、単離された種々の新規の
乳頭腫ウイルスから単離され得るＤＮＡ及びこれらのＤ
ＮＡから全部又は部分的に構成され得るプローブに関す
るだけではなく、或る乳頭腫ウイルスが発見される患者
の危険の度合及び様々のカテゴリーの感染の診断に最も
有効に用い得る乳頭腫ウイルスの型の混合物（カクテ
ル）からなる組成物にも関するものである。場合によっ
ては以前にすでに単離されている乳頭腫ウイルスのゲノ
ムＤＮＡから構成されたプローブおよびこれを本発明の
ものと組み合わせた混合物も含めて本明細書に記載され
ている乳頭腫ウイルス用プローブの数によって、非常に
正確な診断が実現される。特に、様々の型の乳頭腫ウイ
ルスに起因する感染又はこのような様々の型のウイルス
の影響によって進行悪化する可能性がある感染のいろい
ろなカテゴリーのものがより容易に識別できるようにな
り、或るカテゴリーの感染に於いては、その進行悪化に
よってより深刻な病気に転換するかどうかという危険の
度合をより良く経過予想することができるようになる。
例えば、いぼ状表皮異形成として発現する感染の場合に
はそれが皮膚ガンに進行するかどうかという危険の度合
いをより正確に評価することができる手段を本発明は提
供する。 【００１６】 【発明の実施の形態】以下の表現を簡潔にする為に一般
の方法に従って、乳頭腫ウイルスの全ゲノムを“ＨＰＶ
−ＤＮＡ”という略語で示すことにする。 【００１７】同様に簡略化の為、すでに公知の幾つかの
乳頭腫ウイルスを含むＨＰＶ−ＤＮＡの物理的制限地図
が記載されている添付図を参照する。 【００１８】これらの物理的地図は様々の制限エンドヌ
クレアーゼによる切断部位の位置を与える。この地図の
起点は一般的に単一の切断部位で構成されている。この
起点からの距離はゲノムの全長に対するパーセントで表
わされる。地図の１単位はゲノム長の１％を表わす。 【００１９】本発明はまず第１に最も特別には、7000〜
8000塩基対の範囲の大きさをもつ全てのＤＮＡから選ば
れた各ＨＰＶ−ＤＮＡに関するものであり、これらＤＮ
Ａは図中に表わされる制限地図によって特徴づけられる
ものであり、それはより特定的にはＨＰＶ−２ｄ、ＨＰ
Ｖ−１０ｂ、ＨＰＶ−１４ａ、ＨＰＶ−１４ｂ、ＨＰＶ
−１５、ＨＰＶ−１７ａ、ＨＰＶ−１７ａ、ＨＰＶ−１
９、ＨＰＶ−２０、ＨＰＶ２１、ＨＰＶ−２２、ＨＰＶ
−２３、ＨＰＶ−２４、ＨＰＶ−２８、ＨＰＶ−２９、
ＨＰＶ−３１及びＨＰＶ−３２、ＨＰＶ−ＩＰ２及びＨ
ＰＶ−ＩＰ４で示される乳頭腫ウイルスから得られたＨ
ＰＶ−ＤＮＡに関するものである。 【００２０】ここに列挙したものと同じ型に属すると考
えられ得るＨＰＶ−ＤＮＡに対しても本発明の効果が同
じように及ぶことは言うまでもないことである。 【００２１】新たに特徴づけられたウイルスのＨＰＶ−
ＤＮＡに対応する物理的地図は図中の黒丸で示されてい
る。 【００２２】本発明は同じように、前記ＨＰＶ−ＤＮＡ
のフラグメント又はそれと特にストリクトな条件下でハ
イブリッドを形成し得るものに係る。同様に、本発明は
上記各ＨＰＶ−ＤＮＡの全部又は一部を含む組換えＤＮ
Ａ、そして特にそれぞれＥ１，Ｅ６−Ｅ７，Ｌ１及びＬ
２の遺伝子に対応するフラグメントを含む組換えＤＮＡ
又は前記ＨＰＶ−ＤＮＡの遺伝子間（inter-gene）領域
に対応する配列を含むフラグメント（またはこれを含む
組換えＤＮＡ）にも関するものである。最後に、これら
それぞれのＨＰＶ−ＤＮＡまたは対応するフラグメント
から構成され得るプローブ及び該プローブを用いるイン
・ヴイトロ診断方法に係るものである。 【００２３】ウイルスＤＮＡ調製物は６人のヨーロッパ
のＥＶ患者及び２人の南アメリカのＥＶ患者の良性病巣
を削りとったものから選択的に抽出された（ラツナー・
エム・エー（Lutzner,M.A.) 等、１９８３年、ランセッ
ト（Lancet）ii４２２−４２４頁）。ＨＰＶ−ＤＮＡは
平衡塩化セシウム密度勾配遠心法及び／又はエチジウム
ブロミド存在下のシュークロース勾配沈降法により、ク
レムドルフ等の前記の文献、及びオーツ・ジー（Orth.
G.)等の１９８０年の細胞増殖に関するコールド・スプ
リング・ハーバー会議（Cold Spring Harbor Conf. Cel
l Proliferation)、７巻、２５９−２８２頁に以前記載
された操作方法に従って精製された。このＤＮＡ調製物
は制限エンドヌクレアーゼで処理され、この消化生成物
をアガロースゲル電気泳動によって分離した（クレムス
ドルフ等の前記文献参照）。更に、患者の１人のいぼ状
突起（rerruca warts)から得られたＨＰＶ５，８及び１
２（クレムスドルフ等の前記文献参照）並びにＨＰＶ−
２（ハイルマン・シー・エー等、１９８０年、ジャーナ
ル・ヴイロロジー、３６巻、３９５−４０７頁、及びオ
ーツ・ジー等、１９８０年、細胞増殖に関するコールド
・スプリング・ハーバー会議７巻、２５９−２８２頁参
照）から、以前に特徴づけられた型とは異なる１１の株
が同定され、それによって該ＤＮＡ類の制限酵素切断の
主要なモデルが提供された。新規なＨＰＶの型には番号
が付与され、１つの型に属する亜型には番号の後にそれ
らの同定年代順に従って文字が付与された。（コギン・
ジエイ・アール(Coggin.J.R.) 等、Cancer Res.、３９
巻、５４５−５４６頁）。この新規な１１種のＨＰＶの
ゲノムをエシエリヒア・コリ（Escherichia Coli)Ｋ１
２、Ｃ６００株内にクローン化した（前記のクレムスド
ルフ等の文献、１９８３年参照）。エンドヌクレアーゼ
ＢａｍＨＩによって生成されたＨＰＶ−２４ＤＮＡの２
つのフラグメントは例外として、ＤＮＡは単位長（unit
ary length)の分子形態で挿入された。これらのＤＮＡ
はＡｖａI ，ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII の単一切断部
位を用いてプラスミドｐＢＲ３２２（サトクリフエ・ジ
エイ・ジー（Sutcliffe.J.G.) 、１９７８年Nucleic Ac
ids Res. 、５巻、２７２１−２７２８頁）に挿入する
か、又は単一のＳａｃＩ部位を含む、ＨＰＶ−５のＤＮ
Ａ由来のＨｉｎｄIII Ｂフラグメント（前記のクレムス
ドルフ等、１９８２年）を組込んだ組換えプラスミドに
挿入した。より特異的には、ＨＰＶ１７ｂ及び２２は、
ＨＰＶ−５のＤＮＡ由来のＨｉｎｄIII Ｂフラグメント
を含む組換えプラスミドｐＢＲ３２２及びＨＰＶのＤＮ
Ａをただ１ヶ所で切断する酵素（ＳａｃＩ）で切断した
後、単位長のＤＮＡ分子形態で挿入された。ＨＰＶ−１
４ａのＤＮＡは、ＨｉｎｄIII による該ウイルスＤＮＡ
の不完全消化後に単位長のＤＮＡ分子形態でプラスミド
ｐＢＲ３２２に挿入された。このＨｉｎｄIII はＨＰＶ
−１４ａのゲノムから９６．１％及び３．９％の長さを
持つ２つのフラグメントを生成するものである。ＨＰＶ
−２４のＢａｍ ＨＩ Ａ及びＢフラグメント（それぞ
れゲノム長の８３．１％及び１6．９％に相当する大き
さを持つ）を別々にプラスミドｐＢＲ３２２に挿入し
た。 【００２４】単離したクローン及びそれに対応するＨＰ
Ｖ源を以下の表１に挙げる。 【００２５】 【表１】 【００２６】組換えプラスミドを同定するために、プラ
スミドにウイルス配列を挿入するために用いられたエン
ドヌクレアーゼを含めた２種の制限酵素の混合物で処理
した後組換えＤＮＡ類および非クローン化ＨＰＶ−ＤＮ
Ａ類の消化生成物の電気泳動移動度を比較した。単離さ
れた断片の数およびサイズから、各々の場合に全ウイル
スゲノムが組込まれたことが示された。非クローンＨＰ
Ｖ−ＤＮＡ類或いはプラスミド配列から切除されたＨＰ
Ｖ−ＤＮＡ類をアガロースゲル電気泳動で分析したとこ
ろ（データは示さず）、ＤＮＡサイズの不均一性が認め
られた。ＨＰＶ１４ｂ，１９，２０および２１からのＤ
ＮＡ類は、ＨＰＶ３ａ，５，８および１２のＤＮＡ類と
同様のサイズ（約７７００ヌクレオチド対）を有してい
る〔前掲のクレムスドルフ（KREMSDORF)の論文〕が、Ｈ
ＰＶ１５，１７ａ，１７ｂ，２２および２３のＤＮＡは
これより短くＨＰＶ９のＤＮＡと同様のサイズ（約７２
００ヌクレオチド対）を有している前掲のクレムスドル
フ（KREMSDORF)（１９８２）およびオルス（ORTH) （１
９８０）の論文〕。 【００２７】クローン化ウイルスゲノムの１４個の制限
酵素に対する感受性を分析し、物理的地図が確立された
（図１〜図１０）。或るＨＰＶ−ＤＮＡ類の制限地図を
以下に述べる理由により幾つかの図に繰り返し図示し
た。前記（９）の方法によれば、２２から３３個の切断
部位が局在していた。ＨＰＶ１４ａおよび１４ｂの地図
（図４ａおよび図４ｂ）とＨＰＶ１７ａおよび１７ｂの
地図（図５）を除けば、これらの地図の間には明らかな
相似性は認められなかった。夫々ＨＰＶ１４ａおよび１
４ｂのＤＮＡ上に位置する２１個および３１個の部位の
中で、ＨＰＶ−１４ａのＤＮＡの２個のＢａｍＨＩ切断
部位の１つがＨＰＶ−１４ａのＤＮＡの唯一のＢａｍＨ
Ｉ切断部位と並んでいるときには１５個が共通している
ことが判明した。同様に、唯一のＢａｍＨＩ切断部位が
並んでいるときには、ＨＰＶ−１７ａのＤＮＡ上の２９
個の切断部位のうち２１個がＨＰＶ−１７ｂのＤＮＡ上
（全部で２６部位）でも等しく認められた。これらの地
図と、ＥＶに関連するＨＰＶ類（ＨＰＶ３ａ，５，８，
９，１０および１２）（８，９，１６，１８および２
０）、皮膚いぼに関連するＨＰＶ類（ＨＰＶ１，２，４
および７）、皮膚粘膜あるいは粘膜の病巣に関連するＨ
ＰＶ類（ＨＰＶ６ｂ，１１ａ，１３および１６）（１，
３３，１９）に対して既に確立された地図との間に、Ｅ
Ｖ保有日本人男性から単離されたＨＰＶの地図（２４）
と密接に関連するＨＰＶ−１４ａに対する地図を除いて
は明らかな相似性はみられなかった。この後者の単離Ｈ
ＰＶとＨＰＶ−１４ａとの相違点は、１個の追加Ｂａｍ
ＨＩ部位と１個の追加ＨｉｎｄII部位である。２種のウ
イルスにおいて部位ＡｖａＩ，ＢａｍＨＩ，ＢｇｌＩ，
ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄIIおよびＨｉｎｄIII の位置は同
様であった。交差ハイブリダイゼーション実験により、
これら２種のウイルスが実際に密接に関連していること
が確認された。 【００２８】（矢印で示した）幾つかの部位が所在して
いないことに注目されたい。ゲノムの長さの２％未満の
差しかない切断部位は保存されたもの（ *）とみなし
た。***を生起しない酵素は次の通りであった。ＨＰＶ
１４ａおよび２３のＤＮＡに対してはＰｖｕＩ，Ｓａｌ
ＩおよびＳｍａＩ；ＨＰＶ−１４ｂのＤＮＡに対しては
ＰｖｕＩ，ＳａｃＩ，ＳａｌＩおよびＳｍａＩ；ＨＰＶ
１５，１７ａおよび１７ｂのＤＮＡに対してはＢｇｌ
Ｉ，ＰｖｕＩ，ＳａｌＩ，ＳｍａＩ；ＨＰＶ−１９のＤ
ＮＡに対してはＢｇｌＩ，ＳａｃＩ，ＳａｌＩおよびＳ
ｍａＩ；ＨＰＶ−２０のＤＮＡに対してはＥｃｏＲＩ，
ＰｖｕＩ，ＳａｃＩおよびＳｍａｌＩ；ＨＰＶ−２１の
ＤＮＡに対してはＳａｃＩおよびＳｍａＩ；ＨＰＶ−２
２のＤＮＡに対してはＢａｍＨＩ，ＢｇｌＩ，Ｐｖｕ
Ｉ，ＰｖｕIIおよびＳａｌＩ；ＨＰＶ−２４のＤＮＡに
対してはＢｇｌＩ，ＥｃｏＲＩ，ＰｖｕＩ，ＳａｃＩ，
ＳａｌＩおよびＳｍａＩ。 【００２９】既に特徴付けられたＥＶのＨＰＶ−ＤＮＡ
類（ＨＰＶ３ａ，５，８，９，１０および１２）、皮膚
いぼに関連するＨＰＶ−ＤＮＡ類（ＨＰＶ１，２，４お
よび７）および粘膜病巣に関連するＨＰＶ−ＤＮＡ類
（ＨＰＶ６ｂ，１１ａ，１３および１６）と新たに特徴
付けられたＨＰＶ−ＤＮＡ類との間、並びに新たに特徴
付けられたＨＰＶ−ＤＮＡ類のＤＮＡ間の配列相同の有
無を研究した。ろ紙上への付着、および飽和液相中での
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションとそれに続くＳ
１ヌクレアーゼ消化によるハイブリダイゼーション実験
は、前記した（８，９）偏性（ストリクトまたはストリ
ンジェント）条件下で実施した。特に、ＨＰＶ類のＤＮ
Ａ類は、前記したように（１３）“ニック翻訳”で標識
し、アルカリ性ショ糖勾配（５〜２０％）での沈降によ
り分離させた。標識（４０００ｃｐｍ）ＨＰＶ−ＤＮＡ
類を、前記したように（８，９）牛胸腺ＤＮＡ（２０μ
ｇ）あるいは非標識ＨＰＶ−ＤＮＡ（０．２０μｇ）の
存在下でＮａＣｌ ０．４８Ｍ／ＥＤＴＡ１ｍＭ（ｐＨ
６．８）中、６８℃でインキュベートした。ＨＰＶ−Ｄ
ＮＡプローブの比活性は５．３×１０7 から２×１０8
ｃｐｍ／μｇの間で変化した。ハイブリダイゼーション
の程度を、Ｓ１ヌクレアーゼに抵抗する画分を目安にし
て調べた。数は、プローブの自然復元（４〜１５％）に
ついて校正し相同ハイブリダイゼーション（７５〜９５
％）について１００％に正規化した値を表わす。ＮＤは
“測定せず”の略号である。上記条件下におけるＨＰＶ
−ＤＮＡ類間の交差ハイブリダイゼーションの相対量
を、標識ＨＰＶ−ＤＮＡを非標識ＨＰＶ−ＤＮＡとのハ
イブリダイゼーションの％として表２に示す。 【００３０】 【表２】【００３１】ＨＰＶ１、２、４、６ｂ，７および１１ａ
のゲノムと32Ｐ標識の新たにクローン化されたＥＶのＨ
ＰＶ−ＤＮＡ類との間、或いはＥＶの非標識ＨＰＶ−Ｄ
ＮＡ類とＨＰＶ１３，１６および１８に特異なプローブ
との間の交差ハイブリダイゼーションは全くないか或い
は殆んどないことに注目されたい。同様に、飽和再結合
（saturation reassociation) により、ＨＰＶ１４ａ，
１４ｂ，１５，１７ａ，１７ｂ，１９，２０，２１，２
２，２３および２４のＤＮＡ類とＨＰＶ１ａおよび１１
ａのＤＮＡ類との間に交差ハイブリダイゼーションは殆
んど認められなかった（表２）。新たにクローン化され
たＨＰＶ類のＤＮＡ類では、強力な交差ハイブリダイゼ
ーションを示したＨＰＶ１７ａおよび１７ｂ、ＨＰＶ１
４ａおよび１４ｂを除いて、相互間かつＥＶに関連する
他のＨＰＶ（ＨＰＶ３ａ，５，８，９，１０および１
２）のゲノムとの間での交差ハイブリダイゼーションは
殆んど或いは全くみられなかったし、認められたにせよ
５０％未満であった。これらの知見から、新しいウイル
ス類が９個の新しいタイプ（型）（ＨＰＶ１４，１５，
１７，１９，２０，２１，２２，２３および２４）と２
個のサブタイプ（亜型）即ちタイプ１４（ＨＰＶ−１４
ａと１４ｂ）及びタイプ１７（ＨＰＶ−１７ａと１７
ｂ）とに分類されることが確認された。 【００３２】同様に、別のＨＰＶ類は、分子ハイブリダ
イゼーションの偏性（ストリクト）条件下での配列相同
性の有無に基づいて分類された。これらのグループ（Ａ
からＨ）を表３に示す。この表には、これらＨＰＶ類
（単独で或いは組合せて）のキヤリアの中で診断された
疾患およびその発癌性が示されている。 【００３３】 【表３】【００３４】ＨＰＶ５，８，１２，１４，１９，２０，
２１，２２および２３のＤＮＡ類では、これらの間の交
差ハイブリダイゼーション（グループ相同）のレベルは
５〜３８％であり、ＨＰＶ５，８および１２のＤＮＡ類
との場合を除いて顕著な交差ハイブリダイゼーション
（４〜１３％）は示さない。従って、これらのウイルス
類は前に定義した（９）ＥＶのＨＰＶ類のグループの１
部を形成する。 【００３５】同様に、相互間で約２０％の交差ハイブリ
ダイゼーションを示しかつＨＰＶ−９のＤＮＡと約６％
の交差ハイブリダイゼーションを示すＨＰＶ９，１５お
よび１７のＤＮＡ類は等しく、前記した（９）ＥＶのＨ
ＰＶ類のグループに属する。タイプ１３と３１のＨＰＶ
類は一つの同じグループに属するものと考えられうる。
また最後に、他のＨＰＶ類のゲノムと殆んど相同性を示
さないタイプ１，２，４，２４および３２のＨＰＶ類
は、相互にかつ従来のグループとは異なる他のグループ
の第１のメンバーを形成するものとして考えられる。 【００３６】本発明はまた特に、上記したＨＰＶ−ＤＮ
Ａ類から由来されるＤＮＡ断片（フラグメント）および
特に遺伝子Ｅ６−Ｅ７，Ｅ１，Ｌ２，Ｌ１およびそれら
の遺伝子間領域にそれぞれ対応するＤＮＡ断片に関す
る。原点として採った部位に対するこれら各種断片の相
対位置および長さを表４に示す（図１〜図９）。 【００３７】 【表４】【００３８】ＨＰＶ−１のゲノム上の遺伝子の位置は、
このゲノムのヌクレオチド配列から推論された〔オー．
ダノス（Ｏ．ＤＡＮＯＳ），エム．カチンカ（Ｍ．ＫＡ
ＴＩＮＫＡ）およびエム．ヤニブ（Ｍ．ＹＡＮＩＶ）の
パテント〕。ハイブリダイゼーションの偏性条件（Ｔｍ
−２９℃）あるいはあまり偏性でない条件（Ｔｍ−４０
℃）下で形成されたヘテロ二重鎖分子を電子顕微鏡分析
した後、ＨＰＶ−３，５，８，９，１０ａ，１２，１
４，１５，１７および２４のゲノムの物理的地図をＨＰ
Ｖ−１の物理的地図および遺伝子地図と関連させて配列
し、ＨＰＶ−３１のそれをＨＰＶ６ｂの物理的地図およ
び遺伝子地図と関連して配列した〔イー．シュワルツ
（Ｅ．ＳＣＨＷＡＲＺ）ら、エンボジェー（ＥＭＢＯ
Ｊ．）１９８３，２，２３４１−２３４８〕。保存され
た制限酵素部位を並列させた後、ＨＰＶ１０ｂ，２８お
よび２９の物理的地図をＨＰＶ３ａおよび１０ａの物理
的地図に対して配列した。 【００３９】表４に示した配位の値は、図１〜図９に示
した物理的地図上で、遺伝子Ｅ６，Ｅ７，Ｅ１，Ｌ２お
よびＬ１およびＨＰＶ−１ａのゲノムに関するかＨＰＶ
−３１の場合にはＨＰＶ−６ｂのゲノムに関する遺伝子
間領域と相同なゲノムセグメントの５′および３′末端
の位置を示す。 【００４０】遺伝子間領域（調節要素を含む）および隣
接のＥ６とＥ７遺伝子（多分腫瘍中で発現される形質転
換の主要遺伝子に相当する）は、別のグループに属する
多くのＨＰＶタイプのゲノム間で（非偏性ハイブリダイ
ゼーション条件下で）形成された、或いは同じグループ
に属する多くのＨＰＶタイプのゲノム間で（偏性ハイブ
リダイゼーション条件下で）形成されたヘテロ二重鎖分
子の電子顕微鏡分析により検出されうる配列相同性を示
さない。遺伝子ＥＩ（ウイルスＤＮＡの複製に主に関係
する）および遺伝子Ｌ１（ウイルス粒子の主要抗原決定
基を有するウイルスカプシドの主要タンパク質のコーデ
ィング）は、別のグループに属するＨＰＶタイプのゲノ
ム間で（非偏性ハイブリダイゼーション条件下で）形成
された、或いは同じグループに属するＨＰＶ類のゲノム
間で（偏性条件下で）形成されたヘテロ二重鎖の分析に
より検出されうる配列相同性を示す。 【００４１】Ｅ１およびＬ１領域を含む組換えプラスミ
ドから作成されたプローブを用いて、ケースに応じて偏
性或いは非偏性条件下での分子ハイブリダイゼーション
実験により最大数のＨＰＶタイプを検出することが理論
的に可能である。遺伝子間領域および遺伝子Ｅ６および
Ｅ７を含む組換えプラスミドから作成されたプローブ
は、或るＨＰＶタイプあるいは関連するＨＰＶタイプを
特異的に検出することができる。 【００４２】Ｌ２領域（ウイルスカプシドのマイナーな
成分に対するコーディング）は、各種ＨＰＶタイプの中
で種々のヌクレオチド配列保存度を示す。 【００４３】ウイルスＨＰＶ−ＩＰ２ およびＨＰＶ−
ＩＰ４ を単離する条件およびこれらのウイルスからＨ
ＰＶ−ＤＮＡ類を得る条件を以下により詳しく記載す
る。 【００４４】新生物および性器ガンに関連した新しいタ
イプのＨＰＶ（ＨＰＶ−ＩＰ２ ）の分子クローニング
および特徴づけ 新しいタイプのＨＰＶは、ＨＰＶタイプ１６に特異な放
射性プローブを用いる非偏性条件下でのハイブリダイゼ
ーションにより子宮頸管ガンから抽出されたＤＮＡ中に
存在していることがみとめられた。偏性ハイブリダイゼ
ーション条件下でハイブリダイゼーションを実施したと
きには交差ハイブリダイゼーションは検出されなかっ
た。このＨＰＶ−ＤＮＡの多数の制限酵素に対する感度
の研究から、酵素ＢｇｌIIがウイルスＤＮＡを１度切断
していることが知見された。腫瘍から抽出されたＤＮＡ
をエンドヌクレアーゼＢｇｌIIで消化した後、８ｋｂ
（パピローマウイルスのゲノムのサイズ）のＤＮＡ分子
を含有する画分をショ糖勾配での遠心により精製した。
８ｋｂ分子を、ＢａｍＨＩ部位でバクテリオフアージλ
Ｌ４７．１のＤＮＡに挿入されたプラスミドＰＬ １
５．５（ＢｇｌIIおよびＢａｍＨＩによる単一の切断部
位を含む）から構成されるベクターのＢｇｌII部位に挿
入した。組換えＤＮＡを包膜し宿主細菌〔大腸菌（Esch
erichia coli ）菌株ＬＡ１０１〕に感染後、組換えフ
ァージに相当する溶菌領域（プラーク）を感染細菌培養
物のレプリカを放射性ＨＰＶ−１６からのＤＮＡを用い
て非偏性条件下でハイブリダイゼーションすることによ
り検出した。ウイルス配列の全体を含む幾つかの組換え
バクテリオフアージを単離した。挿入酵素ＢｇｌIIによ
りフアージＤＮＡを切断すると、非偏性条件下でＨＰＶ
−１６プローブとハイブリダイズする８ｋｂフラグメン
トが得られる。原腫瘍のＤＮＡおよび組換えフアージの
ＤＮＡを酵素ＢｇｌIIおよびＰｓｔＩの混合物で切断す
ると、総分子量がパピロマウイルスのゲノムのサイズに
等しい同一の５個のフラグメントが得られる。新しいＨ
ＰＶのＤＮＡを組換えパクテリオファージのＤＮＡから
切除し、電気溶離（electroelution）により精製し、プ
ラスミドＰＬ１５．５で再クローン化した。ウイルスＤ
ＮＡの制限地図が、２１個の切断部位を位置決めしうる
（図９）１８種の制限酵素に対するこのＤＮＡの感受性
に基いて確立された。こうして確立された地図は今まで
に同定されたＨＰＶ類のゲノムの地図とは異なってい
る。新しいＨＰＶのＤＮＡと今までに同定されたＨＰＶ
類のＤＮＡとの配列相同性を、偏性条件下で行なわれた
レプリカの分子ハイブリダイゼーション実験で分析し
た。検知された相同性は常に５％未満であった。ＨＰＶ
−１６のゲノムで相同性が最大であった。子宮頸管ガン
からの特性づけられた新しいウイルスは新しいタイプの
ＨＰＶであり、これを仮にＨＰＶ−ＩＰ２ と呼称す
る。 【００４５】ＨＰＶ−ＩＰ２ のＤＮＡとＨＰＶ−１の
ＤＮＡとの間で各種条件下で形成されたヘテロ二重鎖分
子を電子顕微鏡で分析すると、これら２種のゲノムの物
理的地図の配列およびＨＰＶ−ＩＰ２ のＤＮＡが担持
している種々の遺伝子の理論的位置決めが可能であっ
た。 【００４６】 【表５】 【００４７】精製ＨＰＶ−ＩＰ２ のＤＮＡから作成し
た放射性プローブを使用すれば、これらウイルスの病原
力が測定できる。ＨＰＶ−ＩＰ２ のＤＮＡは、調べた
外性器のボウエノイド丘疹（Bewenoid papula)１４例中
１例に、侵入性子宮頸ガン５１例中２例に、子宮頸部の
上皮内新生物（neoplasie)２８例中１例にみとめられ
た。従って、ＨＰＶ−ＩＰ２ は、ＨＰＶ−１８に比べ
てやや弱くＨＰＶ−１６に比べてかなり弱い腫瘍形成能
を有する性器向性タイプ（genito-tropic type)のＨＰ
Ｖである。性器新生物、特に子宮頸管ガンの進行の危険
性を示すＨＰＶ類のタイプを診断あるいはスクリーニン
グするための分子プローブを作成することを目的とする
ＨＰＶ−ＤＮＡ混合物中に組み入れることが必要であ
る。 【００４８】皮膚の前ガン病巣に関連する新しいタイプ
のＨＰＶ（ＨＰＶ−ＩＰ４ ）の分子クローニングおよ
び特徴づけ 新しいタイプのＨＰＶが、光線（紫外線）角化症の生
検、前ガン皮膚病巣から抽出されたＤＮＡ中に、ＨＰＶ
タイプ５，８および１４に特異な放射性プローブを含む
混合物を用いる偏性条件下での分子ハイブリダイゼーシ
ョンにより証明された。ハイブリダイゼーションをタイ
プ１，２，３，７，１０，１３，１６，１８，２８，Ｉ
Ｐ−１（前にＨＰＶ−３１と呼称した）、ＩＰ−２およ
びＩＰ−３（前にＨＰＶ−３２と呼称した）に特異なプ
ローブを用いて行なった場合には交差ハイブリダイゼー
ションは検知されなかった。 【００４９】このＨＰＶのＤＮＡの幾つかの制限酵素に
対する感受性を調べたところ、酵素ＥｃｏＲＩがウイル
スＤＮＡを１度切断していることが知見された。エンド
ヌクレアーゼＥｃｏＲＩにより生検から抽出されたＤＮ
Ａを消化させた後、８ｋｂ（パピローマウイルスのゲノ
ムのサイズ）のＤＮＡ分子を含む画分をショ糖勾配によ
る遠心で精製した。８ｋｂ分子をＥｃｏＲＩ部位でバク
テリオファージλｇｔｗｅｓ．λＢのＤＮＡに挿入し
た。組換えＤＮＡを包膜し、宿主細菌〔大腸菌（Escher
icｈia coli ）菌株ＬＡ１０１〕の感染後、組換えファ
ージに相当する溶菌プラークを、非偏性条件下でＨＰＶ
−８および１４からのＤＮＡ類の放射性混合物により感
染細菌性培養物のレプリカ（複製物）をハイブリダイゼ
ーションすることにより検出した。ウイルス配列の全体
を含む幾つかの組換えバクテリオファージを単離した。
挿入酵素ＥｃｏＲＩによりファージＤＮＡを切断する
と、非偏性条件下でＨＰＶ−５，８および１４に特異な
プローブをハイブリダイズする８ｋｂフラグメントが得
られる。原病巣のＤＮＡおよび組換えファージのＤＮＡ
を酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩの混合物で切断する
と、総分子量がパピローマウイルスのゲノムのサイズに
等しい同一の６個のフラグメントが得られる。新しいＨ
ＰＶのＤＮＡを組換えバクテリオファージのＤＮＡから
切除し、電気溶離で精製し、プラスミドｐＳＰ６５で再
クローン化した。ウイルスＤＮＡの制限地図をこのＤＮ
Ａの１５種の制限酵素に対する感受性によって確立し
た。これにより２３個の切断部位の位置決めが可能とな
った（図１０）。こうして確立された地図は、今までに
同定されたＨＰＶ類のゲノムの地図と異なっていた。新
しいＨＰＶのＤＮＡと今までに同定されたＨＰＶ類のＤ
ＮＡとの配列相同を、偏性条件下で行なったレプリカに
対する分子ハイブリダイゼーション実験により調べた。
いぼ状表皮異形成病巣中で既に同定された或るタイプの
ＨＰＶ類（ＨＰＶ−５，８，１２，１４，１９，２０，
２１および２５）のＤＮＡと新しいＨＰＶのＤＮＡとの
間の相同性は５０％未満であったが、他のタイプのＨＰ
Ｖ類との相同性は認められなかった。こうして光線角皮
症からの特性づけられた新しいウイルスは新しいタイプ
のＨＰＶであり、これを仮にＨＰＶ−ＩＰ４ と呼称す
る。 【００５０】精製ＨＰＶ−ＩＰ４ のＤＮＡから作成さ
れた放射性プローブを使用すると、調べたいぼ状表皮異
形成患者１７例中４２％に、分析した光線角皮症の生検
ｙ中ｘでＨＰＶ−ＩＰ４ が検出された。皮膚ガンの頻
繁な進行を特徴とする病気のいぼ状表皮異形成の患者で
高率であったことと、皮膚の有棘細胞ガンの前駆体と考
えられる光線角化症の病巣の割合に対する関連比から、
ＨＰＶ−ＩＰ４ は腫瘍形成能を有する皮膚向性タイプ
のＨＰＶである。皮膚のガンあるいは前ガン病巣の進行
の危険を示すＨＰＶタイプを診断もしくはスクリーニン
グするための分子プローブを作成することを目的として
いるＨＰＶ−ＤＮＡ類混合物にはこれを組み入れなけれ
ばならない。 【００５１】本発明は更に、特に各種ＨＰＶ−ＤＮＡ類
の混合物（あるいはこれらＨＰＶ−ＤＮＡ類もしくはそ
れらからの配列を含有するプローブ）に関し、これら混
合物は、多分感染の進行可能性を予知するために各種形
態のパピローマウイルス感染を診断するべく組合せて使
用されうる。本発明の好ましい混合物を表６に例示す
る。 【００５２】 【表６】【００５３】この表には、混合物を使用して特に診断可
能な疾患の性質も示した。図１〜図９の制限地図の分類
は表６の“構成”欄に示した分類（グループ分け）と一
致していることは注目すべきことである。このために、
添附図面の幾つかの図面に幾つかのプローブが数回示さ
れているのである。 【００５４】これらの各混合物は、本発明の新しいプロ
ーブの少なくとも１つを包含するものとして定義づけら
れうる。換言すれば、本発明の診断用組成物は次のもの
を含むものとして定義づけられうる。 【００５５】（１）少なくともＨＰＶ−２ｄのＤＮＡ、
（２）ＨＰＶ１０ｂ，２８および／又は２９のＤＮＡの
少なくとも１種、（３）ＨＰＶ１７および／又は２４の
ＤＮＡの少なくとも１種、（４）ＨＰＶ１４，１５，１
７，１９，２０，２１，２２および／又は２３のＤＮＡ
の少なくとも１種、（５）ＨＰＶ１５および／又は１７
のＤＮＡの少なくとも１種、（６）ＨＰＶ−２４のＤＮ
Ａ、（７）ＨＰＶ−１４および３２のＤＮＡ、（８）Ｈ
ＰＶ−３１のＤＮＡ、（９）ＨＰＶ−３２のＤＮＡ。 【００５６】９種のグループのＤＮＡは全ゆる状況下で
互いに異なるように選択されると理解されたい。 【００５７】各種形態のいぼあるいは他の皮膚もしくは
粘膜病巣から多くのＨＰＶ類が単離されうるが、表に示
した各タイプの疾患の診断に１種あるいは２種以上のＨ
ＰＶ−ＤＮＡ類を含有する混合物を使用することが好ま
しい。なぜなら他のＨＰＶ−ＤＮＡ類は同タイプの疾患
に同様に介在(intervene) しうると考えられていたから
である。感染の性質およびその進行可能性の診断は、使
用するプローブの数が増すにつれてより有効となるであ
ろう。加えて、各種プローブ混合物を用いて行なうハイ
ブリダイゼーションアッセイにより、罹患疾患の識別
（鑑別）診断を同等にかなりの確率で行ないうる。 【００５８】表６には、本発明者らの研究所で単離され
たＨＰＶ−ＤＮＡ類から形成されたプローブのみを記載
した。勿論前記した理由で、別の研究所の研究過程で得
られた同じタイプの感染症を患っている患者において何
度も検出されている他のＨＰＶ−ＤＮＡ類を添加するこ
とにより各種混合物を有利に改良しうる。例えば混合物
７は、上皮内新生物や皮膚ガンへの移行の危険性を有す
るいぼ状表皮異形成中にみられる他のＨＰＶ−ＤＮＡ類
を添加することによってのみ改良されうる。表６におい
て、いくつかの混合物が同じ疾患の診断に特有なものと
して表示されていることに注目されたい。いろいろな混
合物により、腫瘍形成(cancerization)のリスクの少な
い感染症とそのリスクの高い感染症とを区別しうる。例
えば、診断が下される患者から得たウイルスサンプルが
混合物７とハイブリダイゼーションすれば、サンプルが
混合物３のプローブとそれ以上にハイブリダイズした場
合に比べて皮膚ガンに進行するリスクが高いことが示唆
される。 【００５９】同様に、混合物５により検出されたＥＶの
症例では混合物６を用いて検出されたこれら症例に比べ
て腫瘍形成のリスクは高い。混合物４は、混合物５を用
いて検出される症例に比べてより高いリスクを有するＥ
Ｖ症例を識別できるであろう。 【００６０】さらに以下に異なるＨＰＶ−ＤＮＡ（ある
いはこれらのＨＰＶ−ＤＮＡを含むプローブあるいはＨ
ＰＶ−ＤＮＡの配列）のその他の混合物を記載する。こ
れらは任意に、起り得る感染の進行の予後経過を測定す
る目的で、異なる形の乳頭腫ウイルス感染の全般的診断
に組み合わせて使用することができる。 【００６１】本発明に一致する好ましい混合物は前記表
６に特定されている。本表はまた表の左側に記載した混
合物の使用によって格別に診断し得る疾患の性質も示し
ている。本表に特定したその他のＨＰＶ−ＤＮＡの制限
地図は図１〜９に示されている。 【００６２】ＨＰＶ−ＩＰ２ は、性器腫瘍特に子宮頸
ガンの進行の危険性の検知に使用できる格別な代表的プ
ローブと考えられることを指摘しておく。 【００６３】従って本発明は格別に、前記表において混
合物番号として示した１〜１０の番号をつけて示した１
０のグループを少なくとも含む診断用キットにも係る。 【００６４】これまでは特に、クローン化ＨＰＶ−ＤＮ
Ａ全体のプローブとしての使用について考慮してきた。
しかしそれらはこれらの異なるＤＮＡのクローン化フラ
グメント、特に遺伝子Ｅ１あるいはＬ１及び遺伝子Ｅ６
−Ｅ７によって置き換ることもできる。 【００６５】ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＨＰＶ−ＤＮＡ
検知の基本的原理は当然、厳格（ストリクト）あるいは
弱厳格条件で行なわれるハイブリダイゼーションを含
む。 【００６６】操作は例えば下記のように行なわれるが、
記載する診断方法は当然、本発明のプローブ及びプロー
ブの混合物の使用条件を制限するものではないと解され
るものである。 【００６７】クローン化ＨＰＶのＤＮＡ混合物より得た
プローブを使用する試験の目的は、バイオプシー中、病
変部から採取して得た細胞中、あるいはカルノイ(Carno
y)混合液（エタノール、クロロホルム、酢酸、６：３：
１）により固定されパラフィン中に含まれるバイオプシ
ー部分中のＨＰＶの存在を明らかにし、ＨＰＶのタイプ
を同定することである。試験は、原理は公知の方法によ
る試料からのＤＮＡの予抽出を必要とし、ＨＰＶ−ＤＮ
Ａ混合物から調製した放射性プローブ（32ｐあるいは35
ｓで標識されている）を使用した厳格あるいは弱厳格条
件下での分子ハイブリダイゼーションによるこのＤＮＡ
の分析を含む。一般には、各試験はいくつかのプローブ
混合物を必要とする。 【００６８】いくつかのハイブリダイゼーション方法が
使用し得る。例えばスポットハイブリダイゼーション法
が使用できる。本方法はＤＮＡの変性の後、ＤＮＡアリ
コートをメンブラン（ニトロセルロースあるいはジーン
スクリーンプラス〔Genescreeuplus〕上に沈積させ、各
メンブランを通常の条件下でプローブ混合物とハイブリ
ダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーションさせたメ
ンブランを放射線写真フィルム上に接触露光させること
により放射性ハイブリッドの検知を行なうことから成
る。またレプリカに対するハイブリダイゼーション法を
使用することもできる。本方法は、制限酵素でのＤＮＡ
処理により得られたＤＮＡフラグメントのアガロースゲ
ル電気泳動による分離、アルカリ変性後の該フラグメン
トのメンブラン（ニトロセルロースあるいはジーンスク
リーンプラス）上への転写、及び通常の条件下での異な
るプローブ混合物とのそれらのハイブリダイゼーション
から成る。放射性ハイブリッドの形成はやはり、メンブ
ランの放射性写真フィルム上への接触露光によって検知
する。 【００６９】放射性プローブは、ニックトランスレーシ
ョン法により標識されたＨＰＶ−ＤＮＡ、あるいは例え
ばＳＰ６型のようなベクター中にインサートされたウイ
ルスＤＮＡの転写により調製されたＲＮＡにより構成さ
れる。放射性プローブを使用すると格別な好感度という
利点が得られるが、例えばビオチン化されており、それ
自体標識された抗体あるいは酵素的、蛍光的あるいはそ
の他の標識を有する抗体により認識可能な抗体によって
認識され得るような非放射性プローブの使用を除外する
ものではない。 【００７０】プローブの選択は標本の性質に依る。例え
ばＥＶを有している可能性がある患者の場合、混合物
１，２，３，４，５，６及び７が使用される。混合物１
及び２はＥＶ及び皮膚イボの異なる診断を可能とする。
プローブ３はＥＶに関連するＨＰＶの３つのグループの
それぞれの最もよく検知されるものを含んでおり、プロ
ーブ７はＥＶのガンに関連するＨＰＶのＤＮＡを含んで
おり、大多数のＥＶの場合の診断を可能にするものであ
り、特にガンに発展し易いＨＰＶのタイプに感染した患
者の同定の診断を可能にするものである。混合物４，５
及び６の使用により、同一の患者に感染したＨＰＶの一
つ以上のタイプを区別することができる。 【００７１】従って本発明はさらに、上記したプローブ
のいくつかを含むセットあるいはキットにも係り、特に ──上記した１９のＨＰＶ−ＤＮＡのタイプあるいはサ
ブタイプのそれぞれの代表的なもの、あるいは ──プローブの混合物、好ましくは前記に規定したプロ
ーブの種々のグループあるいは混合物を含むものであ
る。これらのキットは、患者から得たウイルス調製物と
種々のグループあるいは混合物との間のハイブリダイゼ
ーションによるｉｎｖｉｔｒｏでの診断試験を目的とす
るものである。 【００７２】言うまでもなく今まで記載したことから、
本発明は特異的に想定されるその実施態様あるいは適用
に限定されるものではなく、それどころか全ての変形例
を包含するものであり、特定番号を付され図面中に制限
地図を示したＨＰＶ−ＤＮＡの特許請求の範囲における
記載は、特許請求の範囲が前記した定義に従って同じタ
イプに分類されるこのＨＰＶ−ＤＮＡに共通なＨＰＶ−
ＤＮＡを全て包含することを示すものであり、特に同じ
サブタイプに属するＨＰＶ−ＤＮＡにおいてはなおさら
そうである。 【００７３】さらに図面に示したＨＰＶ−３２から得ら
れたＤＮＡに関して、それが以下の酵素、ＡｖａＩ，Ｂ
ａｌＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，ＥｃｏＲＩ，Ｈｉｎｄ
III，ＮｄｅＩ，ＮｒｕＩ，ＰｖｕＩ，ＰｖｕII，Ｓａ
ｃＩ，ＳａｌＩ，ＳｍａＩ，ＴｔｈIIIあるいはＸｍａ
Ｉのいずれによっても切断されないことが特に指摘され
る。 【００７４】また、下記の組換えＤＮＡは１９８４年１
１月３０日に下記の受託番号でＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ（ナショ
ナルコレクション・オブ・カルチュア・オブ・マイクロ
オーガニズム・オブ・インスティテュート・バスツー
ル、パリ）に寄託されていることも特記しておく。 【００７５】 ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ２ｄ ………… Ｎｏ．Ｉ−３７９ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ１０ｂＡ ………… Ｎｏ．Ｉ−３８０ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ１０ｂＢ ………… Ｎｏ．Ｉ−３８１ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ１４ａ ………… Ｎｏ．Ｉ−３８２ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ１４ｂ ………… Ｎｏ．Ｉ−３８３ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ１５ ………… Ｎｏ．Ｉ−３８４ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ１７ａ ………… Ｎｏ．Ｉ−３８５ ｐＨＰＶ５ ＨｉｎｄIII Ｂ／ＨＰＶ１７ｂ … Ｎｏ．Ｉ−３８６ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ１９ ………… Ｎｏ．Ｉ−３８７ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ２０ ………… Ｎｏ．Ｉ−３８８ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ２１ ………… Ｎｏ．Ｉ−３８９ ｐＨＰＶ５ ＨｉｎｄIII Ｂ／ＨＰＶ２２ …… Ｎｏ．Ｉ−３９０ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ２３ ………… Ｎｏ．Ｉ−３９１ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ２４ａ ………… Ｎｏ．Ｉ−３９２ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ２４ｂ ………… Ｎｏ．Ｉ−３９３ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ２８ ………… Ｎｏ．Ｉ−３９４ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ２９ ………… Ｎｏ．Ｉ−３９５ ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ３１ ………… Ｎｏ．Ｉ−３９６ ｐＳＰ６４／ＨＰＶ３２ ………… Ｎｏ．Ｉ−３９７ ｐＬＩ５５／ＩＰ２ ………… Ｎｏ．Ｉ−４５０ ｐＳＰ６５／ＩＰ４ ………… Ｎｏ．Ｉ−４４９ 本発明はさらに、前に言及した異なる乳頭腫ウイルスか
ら得た遺伝子Ｅ６及びＥ７の発現の産物にも特に係る。
それ等は有効量で投与すれば乳頭腫ウイルスに関連する
腫瘍の進行に対する抵抗性を宿主に生起することができ
るワクチンの活性主成分として使用することができる。 【００７６】本発明はまた、哺乳動物の免疫化により得
られる血清にも係る。該血清は患者に有効量で特に非経
口的に投与可能な血清調製物とし得、それは対応する乳
頭腫ウイルスのタイプあるいはサブタイプにより生起さ
れた感染を退行させ得る。 【００７７】問題の種類の発現のポリペプチド生成物を
得ること、特に適当なプロモータのコントロール下にベ
クターにＥ６及び／又はＥ７配列を結合すること、乳頭
腫ウイルスが問題のプロモーターを認識し易く、それに
関する配列を発現し易い細胞宿主の形質転換から成る遺
伝子工学の技術によるものは、同業の通常の能力を有す
る者に対して強調する必要はない。 【００７８】このように本発明は、問題の種類の主成分
（発現生成物あるいは対応抗体）を生理的に許容可能な
薬理学的担体と共に含む、薬理学的使用を目的とする組
成物にも係る。特に問題の種類の組成物が非経口的に投
与される場合は、担体は注射可能な飽和溶液により構成
される。 【００７９】最後に、参照した文献の書誌目録を以下に
記した。これは読者が本テキストを十分に理解するため
に有用であると考えられる範囲において、先行技術水準
の記載の要件を満すものである。この理由から、これら
の文献の内容は記載の一部と考えられるべきものであ
る。 【００８０】参 考 文 献 （１）エム・ダースト(M.Durst) 他、プロク・ナトル・
アカド・スシ(Proc.Nafl.Acad.Sci)、Ｕ．Ｓ．Ａ，８
０：３８１２−３８１５。 【００８１】（２）ジエイ・アール・コギン・ジュニア
(Coggin, j.r.,Jr) 他、１９７９、カンサー・レス(Can
cer Res.) ，３９：５４５−５４６。 【００８２】（３）エル・ギスマン(Gissmann,L.) 他、
１９８２、ジエイ・ヴイロル(J.Virol.)４４：３９３−
４００。 【００８３】（４）エム・グリーン(Green,M.)他、１９
８２、プロク・ナトル・アカド・スシ、Ｕ．Ｓ．Ａ．，
７９：４４２３７−４４４１。 【００８４】（５）シー・エー・ハイルマン(Heilman,
C.A.)他、１９８０、ヴイロル(Virol.)３６：３９５：
４０７。 【００８５】（６）エス・ジヤブロンスカ(Jablonska,
S.)他、１９７２、カンサー・レス、３２：５８３−５
８９。 【００８６】（７）エス・ジヤブロンスカ他、１９８
２、スプリンガー・セミン・イムノ・パソール(Springa
r Semin.Immuno-pathol.) ５：３３−６２。 【００８７】（８）デー・クレムスドルフ(Kremsdorf,
D.)他、１９８２、ジエイ・ヴイロル、４３：４３６−
４４７。 【００８８】（９）デー・クレムスドルフ他、１９８
３、ジエイ・ヴイロル、４８：３４０−３５１。 【００８９】（10）エム・エー・ルツツナー(Lutzner,
M.A.)他、１９７８、ブル・カンサー(Bull.Cancer) 、
６５：１６９−１８２。 【００９０】（11）エム・エー・ルツツナー他、１９８
３、ランセツト(Lancet)ｉｉ：４２２−４２４。 【００９１】（12）エム・ミゴツツイ(Migozzi,M) 他、
１９６５、ブル・ソク・フランク・デーム・シフ(Bull.
Soc.Franc.Derm.Syph.) 、７２：７４７−７４８。 【００９２】（13）ジー・オルス(Orth,G.) 他、１９８
０、コールド・スプリング・ハーバー・コンフ・セル・
プロリフアレーシヨン(Cold Spring Harbor Conf.Cell
Proliferation)、７：２５９−２８２。 【００９３】（14）ジー・オルス他、１９８１、ジエイ
・インベスト・ダーマトール(J.Invest.Dermatol.)７
６：９７−１０２。 【００９４】（15）ジー・オルス他、１９７９、カンサ
ー・レス３９：１０７４−１０８２。 【００９５】（16）アール・エス・オストロウ(Ostrow,
R.S.) 他、１９８２、プロク・ナトル・アカド・スシ、
Ｕ．Ｓ．Ａ．，７９：１６３４−１６３８。 【００９６】（17）アール・エス・オストロウ他、１９
８３、アン・アカド・ダーマトール(Ann,Acad.Dermato
l) ，８：３９８−４０４。 【００９７】（18）エツチ・フイスター(Pfister,H.)
他、１９８３、カンサー・レス：４３：１４３６−１４
４１。 【００９８】（19）エツチ・フイスター他、１９８３、
ジエイ・ヴイロル、４７：３６３−３６６。 【００９９】（20）エツチ・フイスター他、１９８１、
イント・ジエイ・カンサー(Int.J.Cancer)、２７：６４
５−６５０。 【０１００】（21）エル・エー・リユーダ(Rueda,L.A.)
他、１９７６、メド・カツト・アイ・エル・エー(Med.C
ut.I.L.A.)、２：１１３−１３６。 【０１０１】（22）エム・リユイター(M.Ruiter)他、ジ
エイ・インベスト・ダーマトール、４７：２４７−２５
２。 【０１０２】（23）ジエイ・ジー・シユトクリフエ(Sut
cliffe,J.G.)、１９７８、ニユークレイツク・アシズ・
レス(Nucleic Acids Res) ，５：２７２１−２７２８。 【０１０３】（24）テイー・ツモリ(Tsumori,T.)他、１
９８３、ジエイ・ジエン・ヴイロル(J.Gen.Virol.)、６
４：９６７−９６９。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＰＶ１ａ，ＨＰＶ２ｄおよびＨＰＶ４ａの制
限地図を示す。 【図２】ＨＰＶ３ａ，ＨＰＶ１０ａ，ＨＰＶ１０ｂ，Ｈ
ＰＶ２８およびＨＰＶ２９の制限地図を示す。 【図３】ＨＰＶ−５ａ，ＨＰＶ−１７ａおよびＨＰＶ−
２４の制限地図を示す。 【図４ａ】ＨＰＶ−５ａ，ＨＰＶ−８，ＨＰＶ−１２，
ＨＰＶ−１４ａおよびＨＰＶ−１４ｂの制限地図を示
す。 【図４ｂ】ＨＰＶ−１９，ＨＰＶ−２０，ＨＰＶ−２
１，ＨＰＶ−２２およびＨＰＶ−２３の制限地図を示
す。 【図５】ＨＰＶ−９，ＨＰＶ−１５，ＨＰＶ−１７ａお
よびＨＰＶ−１７ｂの制限地図を示す。 【図６】ＨＰＶ−２４の制限地図を示す。 【図７】ＨＰＶ−５ａ，ＨＰＶ−８，ＨＰＶ−１４ｂお
よびＨＰＶ−３２の制限地図を示す。 【図８】ＨＰＶ−１３およびＨＰＶ−３１の制限地図を
示す。 【図９】ＨＰＶ−ＩＰ２およびＨＰＶ−ＩＰ４の制限地
図を示す。
限地図を示す。 【図２】ＨＰＶ３ａ，ＨＰＶ１０ａ，ＨＰＶ１０ｂ，Ｈ
ＰＶ２８およびＨＰＶ２９の制限地図を示す。 【図３】ＨＰＶ−５ａ，ＨＰＶ−１７ａおよびＨＰＶ−
２４の制限地図を示す。 【図４ａ】ＨＰＶ−５ａ，ＨＰＶ−８，ＨＰＶ−１２，
ＨＰＶ−１４ａおよびＨＰＶ−１４ｂの制限地図を示
す。 【図４ｂ】ＨＰＶ−１９，ＨＰＶ−２０，ＨＰＶ−２
１，ＨＰＶ−２２およびＨＰＶ−２３の制限地図を示
す。 【図５】ＨＰＶ−９，ＨＰＶ−１５，ＨＰＶ−１７ａお
よびＨＰＶ−１７ｂの制限地図を示す。 【図６】ＨＰＶ−２４の制限地図を示す。 【図７】ＨＰＶ−５ａ，ＨＰＶ−８，ＨＰＶ−１４ｂお
よびＨＰＶ−３２の制限地図を示す。 【図８】ＨＰＶ−１３およびＨＰＶ−３１の制限地図を
示す。 【図９】ＨＰＶ−ＩＰ２およびＨＰＶ−ＩＰ４の制限地
図を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:92）
(Ｃ１２Ｑ 1/68
Ｃ１２Ｒ 1:92）
(72)発明者 ミツシエル・フアーヴル
フランス国、75015・パリ、リユ・ギル
ー、７
(72)発明者 デイナ・クレムスドルフ
フランス国、75013・パリ、リユ・エス
キロル、35
(72)発明者 オデール・クロワツサン
フランス国、75013・パリ、リユ・オー
ギユスト・ランソン、19
(72)発明者 ジエラール・ペオ−アルノーデ
フランス国、93100・モントロイユ、ア
ヴニユ・ポール・シニヤツク、25
(72)発明者 シルヴイ・ボードウノン
フランス国、77450・エズブリ、モント
リ、アヴニユ・フオツシユ、108
(56)参考文献 Ｊ．ＩＮＶＥＳＴ．ＤＥＲＭＡＴＯ
Ｌ．ＶＯＬ．80 （1983） Ｐ．436−
440
Ｊ．ＶＩＲＯＬ．，ＶＯＬ．43
（1982） Ｐ．436−447
Ｊ．ＶＩＲＯＬ．，ＶＯＬ．48
（1983） Ｐ．340−351
ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ，ＡＣＡＤ．ＳＣ
Ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，ＶＯＬ．80
（1983） Ｐ．3812−3815
(58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名)
C12Q 1/68
G01N 33/574
G01N 33/577
C12N 15/37
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．（ｉ）ＨＰＶ−１４ａ，ＨＰＶ−１４ｂ，ＨＰＶ−
１５，ＨＰＶ−１７ａ，ＨＰＶ−１７ｂ，ＨＰＶ−１
９，ＨＰＶ−２０，ＨＰＶ−２１，ＨＰＶ−２２，ＨＰ
Ｖ−２３，ＨＰＶ−２４，ＨＰＶ−２８，ＨＰＶ−２
９，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３２，ＨＰＶ−ＩＰ２，お
よびＨＰＶ−ＩＰ４からなる群から選択される乳頭腫ウ
イルスから得られる約７，０００〜約８，０００塩基対
からなり、明細書記載の図１〜９の制限地図の一つを有
するヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）の精製されたＤＮ
Ａ、又は該乳頭腫ウイルスの１つに特異的であり、スト
リンジェント条件下で該乳頭腫ウイルスと安定なハイブ
リダイゼーションをすることができる前記精製ＤＮＡの
フラグメント、および（ii）前記（ｉ）に記載のＨＰＶ
ＤＮＡ又はＤＮＡフラグメントとは異なる少なくとも
一つの別のＨＰＶ ＤＮＡ、を含有する、ヒト乳頭腫ウ
イルス感染の検出のための組成物。
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