JP2791322B2 - ヒト乳頭腫ウイルスdnaを含有する組成物 - Google Patents
ヒト乳頭腫ウイルスdnaを含有する組成物Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は乳頭腫ウイルス(pap
illomavirus)のDNAを含有する、乳頭腫ウイルス感染
の検出のための組成物に係わる。 【0002】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】“乳
頭腫ウイルス”という用語は、皮膚又は粘膜の比較的良
性の(ウイルス性)いぼ(warts) から、上皮内腫瘍又は
種々の形態の皮膚ガンに悪化し易い過形成(hyperplasia
s)までの幾つかの形態のウイルス感染症の原因であると
一般的に考えられている多数のウイルスを含むものであ
る。乳頭腫ウイルス感染の中には、特に、これ以降時々
“EV”と表現されるいぼ状表皮異形成(epidermodyspl
asias verruciformis)があることにも注意しなければな
らない。 【0003】乳頭腫ウイルスの型の幾つかはすでに報告
されている。本発明の特許出願に於いて、幾つかの新規
の型及び亜型の乳頭腫ウイルスを、その感染患者に於い
て多大の割合で早発皮膚ガンを進行させる傾向のウイル
ス性のいぼ又は散在性斑紋(disseminated macular)病巣
から単離したことが報告されるであろう。 【0004】最近の研究により免疫因子の重要性及びヒ
ト乳頭腫ウイルス(HPV)の主要な役割が明らかにさ
れており、これらの因子に、乳頭腫ウイルス感染の病理
に於ける様々な遺伝因子及び化学作用のある放射線に関
する文献中に以前に記載されている役割が追加される。 【0005】本発明は新たに単離された多数の乳頭腫ウ
イルスの相対的な挙動に関する観察に基づいてなされた
ものであり、その主要なゲノムの性質は以下で定義され
よう。 【0006】少数のEV例に関する研究によって、6つ
の型のHPVの性質がそれらのゲノムの分子クローニン
グによってすでに明らかにされている(クレムスドルフ
・デー(Kremsdorf, D.) 等、1982年、ジャーナル・ヴイ
ロロジー(J. Virol).43巻、436-447 頁及びクレムスド
ルフ・デー等、1983年、ジャーナル・ヴイロロジー、48
巻、340-351 頁参照)。異なるグループのゲノムの間で
のクロス−ハイブリダイゼーションが欠如しているか又
は非常に弱いかどうかによって、上記のHPVは3つの
グループに分類された。第1のグループには、或る種の
EV患者及び一般住民に於いて見られる扁平なウイルス
性いぼと関連のあるHPV3a及び10が含まれる。H
PV3aに関連するDNA配列は一人のEV患者のガン
で発見された。第2のグループにはHPV5,8及び12
が含まれ、HPV5及び8のゲノムは複数のEV患者の
ガン中で検出された。第3のグループは現在のところた
った1種のウイルス、HPV9である。免疫抑制を呈し
た腎臓移植受容者がHPV5に感染していると判明した
ことは例外であるが、第2と第3のグループのウイルス
はEV患者の間だけに検出され、彼らの殆んどは幾つか
のウイルスに感染していた。現在文献(以下に示す参考
文献1−5,8,9,13,14,16,18−20)中に記述さ
れている14の型のHPVの中で、4つのものは、珍しい
病気であるEVに特に関係のあるものであることが判明
したことに注目すべきである。 【0007】多数の新規の型及び亜型の乳頭腫ウイルス
を単離し本発明を完成せしめた研究によってイン・ヴイ
トロに於けるより高度に洗練された診断技術開発が可能
になった。より具体的には、本発明は、例えば病巣又は
バイオプシー切片から得られる乳頭腫ウイルスの同定に
関する完璧な技術を提供し、これによって、問題となっ
ている病巣が悪化していく可能性があるかどうかに関す
る予測をもより良く行うようにさせ得るようなより正確
な診断法をもたらす。 【0008】一般的に言って、乳頭腫ウイルスは、互い
に非常に異なってはいるが、それでも約7000〜8000の塩
基対の大きさを有していることに注意しなければならな
い。加えて、それらのゲノムには前述にもかかわらず或
る程度の相同性があり得る。以下の記載に於いて、乳頭
腫ウイルスの様々な型及び亜型間の相同性の割合(%)
を決定することに言及する。これら相同性の割合は、
“非ストリンジェント(non-stringent) ”又は“非スト
リクト(non-strict)”と呼ばれる条件下、又は“ストリ
ンジェント(緊縮)”又は“ストリクト(厳格)”と呼
ばれる条件下で行なわれるハイブリダイゼーションアッ
セイによって決定される。 【0009】乳頭腫ウイルスは幾つかの型の乳頭腫ウイ
ルスに区別され得、それらはストリクト又はストリンジ
ェントの条件下で測定された相同性の割合によって区別
され得る。この条件下で、50%より小さい相同性の割合
を示すものは別の型に属する。この点に関して、ストリ
クト又はストリンジェントな条件下で別の型のウイルス
間の相同性の割合は0まで低下し得るということに注意
しなければならない。これと同じ条件下で、50%より大
きい相同性の割合を示すウイルスは同じ型に属するもの
と考えられ、それらはこの同型内の別々の亜型を形成す
る。 【0010】非ストリクト又は非ストリンジェントな条
件下のハイブリダイゼーションアッセイは、ハイルマン
・シー・エー(Heilman. C. A) 等、1980年、ジャーナル
・ヴイロロジー36巻、395-407 頁及びクロイサン(CROIS
SANT) 等、1982年、シー・アール・アカド・サイエンス
(C. R. Acad. Sc.パリ、294 巻、581-586 頁(ヘテロ二
重鎖分子)に記載されている以下の条件下で単離された
2種のウイルスから取り出されたDNAを相互に接触さ
せるものである。 【0011】ストリクト又はストリンジェントな条件下
のハイブリダイゼーションアッセイは、クレムスドルフ
・デー等、1982年、ジャーナル・ヴイロロジー、43巻、
436-447 頁、及び1983年、ジャーナル・ヴイロロジー、
48巻、340-35頁、及びデービス・アール・ダヴリュ(Dav
is, R. W) 等、1971年、Methods Enzymol.、21巻、413-
428 頁(ヘテロ二重鎖分子)に記載されている条件下で
単離された2種のウイルスから取り出されたDNAを相
互に接触させるものである。 【0012】概要的には、1つの同じ型に属する乳頭腫
ウイルスはそれぞれの配列の長さ全体の80〜100 %に亘
る実質的に同一のヌクレオチド配列を有するハイブリダ
イズ可能な配列を持っているが、これら相同的な配列は
別の型に属する乳頭腫ウイルスの間では60%又はそれ以
下に低下し得ることを言及しておく。非ストリクト又は
非ストリンジェントの条件下で相互にハイブリッドを形
成する別の型の乳頭腫ウイルスからの配列が同一あるい
は類似である程度は同じ型の乳頭腫ウイルスの場合より
必らず明らかに低いものである。 【0013】本発明者らの研究によって、種々の型の乳
頭腫ウイルスの間の遺伝子の異種性の程度は以前考えら
れていたものよりも大きいこと、そして同時に、これら
種々の型が或る程度の特異性を示す感染形態又はその変
形としばしば関連のあることの2つが明らかになった。 【0014】 【課題を解決するための手段】本発明は、(i)HPV
−14a,HPV−14b,HPV−15,HPV−1
7a,HPV−17b,HPV−19,HPV−20,
HPV−21,HPV−22,HPV−23,HPV−
24,HPV−28,HPV−29,HPV−31,H
PV−32,HPV−IP2,およびHPV−IP4か
らなる群から選択される乳頭腫ウイルスから得られる約
7,000〜約8,000塩基対からなり、明細書記載
の図1〜9の制限地図の一つを有するヒト乳頭腫ウイル
ス(HPV)の精製されたDNA、又は該乳頭腫ウイル
スの1つに特異的であり、ストリンジェント条件下で該
乳頭腫ウイルスと安定なハイブリダイゼーションをする
ことができる前記精製DNAのフラグメント、および
(ii)前記(i)に記載のHPV DNA又はDNAフ
ラグメントとは異なる少なくとも一つの別のHPV D
NA、を含有する、ヒト乳頭腫ウイルス感染の検出のた
めの組成物を提供する。 【0015】従って本発明は、単離された種々の新規の
乳頭腫ウイルスから単離され得るDNA及びこれらのD
NAから全部又は部分的に構成され得るプローブに関す
るだけではなく、或る乳頭腫ウイルスが発見される患者
の危険の度合及び様々のカテゴリーの感染の診断に最も
有効に用い得る乳頭腫ウイルスの型の混合物(カクテ
ル)からなる組成物にも関するものである。場合によっ
ては以前にすでに単離されている乳頭腫ウイルスのゲノ
ムDNAから構成されたプローブおよびこれを本発明の
ものと組み合わせた混合物も含めて本明細書に記載され
ている乳頭腫ウイルス用プローブの数によって、非常に
正確な診断が実現される。特に、様々の型の乳頭腫ウイ
ルスに起因する感染又はこのような様々の型のウイルス
の影響によって進行悪化する可能性がある感染のいろい
ろなカテゴリーのものがより容易に識別できるようにな
り、或るカテゴリーの感染に於いては、その進行悪化に
よってより深刻な病気に転換するかどうかという危険の
度合をより良く経過予想することができるようになる。
例えば、いぼ状表皮異形成として発現する感染の場合に
はそれが皮膚ガンに進行するかどうかという危険の度合
いをより正確に評価することができる手段を本発明は提
供する。 【0016】 【発明の実施の形態】以下の表現を簡潔にする為に一般
の方法に従って、乳頭腫ウイルスの全ゲノムを“HPV
−DNA”という略語で示すことにする。 【0017】同様に簡略化の為、すでに公知の幾つかの
乳頭腫ウイルスを含むHPV−DNAの物理的制限地図
が記載されている添付図を参照する。 【0018】これらの物理的地図は様々の制限エンドヌ
クレアーゼによる切断部位の位置を与える。この地図の
起点は一般的に単一の切断部位で構成されている。この
起点からの距離はゲノムの全長に対するパーセントで表
わされる。地図の1単位はゲノム長の1%を表わす。 【0019】本発明はまず第1に最も特別には、7000〜
8000塩基対の範囲の大きさをもつ全てのDNAから選ば
れた各HPV−DNAに関するものであり、これらDN
Aは図中に表わされる制限地図によって特徴づけられる
ものであり、それはより特定的にはHPV−2d、HP
V−10b、HPV−14a、HPV−14b、HPV
−15、HPV−17a、HPV−17a、HPV−1
9、HPV−20、HPV21、HPV−22、HPV
−23、HPV−24、HPV−28、HPV−29、
HPV−31及びHPV−32、HPV−IP2及びH
PV−IP4で示される乳頭腫ウイルスから得られたH
PV−DNAに関するものである。 【0020】ここに列挙したものと同じ型に属すると考
えられ得るHPV−DNAに対しても本発明の効果が同
じように及ぶことは言うまでもないことである。 【0021】新たに特徴づけられたウイルスのHPV−
DNAに対応する物理的地図は図中の黒丸で示されてい
る。 【0022】本発明は同じように、前記HPV−DNA
のフラグメント又はそれと特にストリクトな条件下でハ
イブリッドを形成し得るものに係る。同様に、本発明は
上記各HPV−DNAの全部又は一部を含む組換えDN
A、そして特にそれぞれE1,E6−E7,L1及びL
2の遺伝子に対応するフラグメントを含む組換えDNA
又は前記HPV−DNAの遺伝子間(inter-gene)領域
に対応する配列を含むフラグメント(またはこれを含む
組換えDNA)にも関するものである。最後に、これら
それぞれのHPV−DNAまたは対応するフラグメント
から構成され得るプローブ及び該プローブを用いるイン
・ヴイトロ診断方法に係るものである。 【0023】ウイルスDNA調製物は6人のヨーロッパ
のEV患者及び2人の南アメリカのEV患者の良性病巣
を削りとったものから選択的に抽出された(ラツナー・
エム・エー(Lutzner,M.A.) 等、1983年、ランセッ
ト(Lancet)ii422−424頁)。HPV−DNAは
平衡塩化セシウム密度勾配遠心法及び/又はエチジウム
ブロミド存在下のシュークロース勾配沈降法により、ク
レムドルフ等の前記の文献、及びオーツ・ジー(Orth.
G.)等の1980年の細胞増殖に関するコールド・スプ
リング・ハーバー会議(Cold Spring Harbor Conf. Cel
l Proliferation)、7巻、259−282頁に以前記載
された操作方法に従って精製された。このDNA調製物
は制限エンドヌクレアーゼで処理され、この消化生成物
をアガロースゲル電気泳動によって分離した(クレムス
ドルフ等の前記文献参照)。更に、患者の1人のいぼ状
突起(rerruca warts)から得られたHPV5,8及び1
2(クレムスドルフ等の前記文献参照)並びにHPV−
2(ハイルマン・シー・エー等、1980年、ジャーナ
ル・ヴイロロジー、36巻、395−407頁、及びオ
ーツ・ジー等、1980年、細胞増殖に関するコールド
・スプリング・ハーバー会議7巻、259−282頁参
照)から、以前に特徴づけられた型とは異なる11の株
が同定され、それによって該DNA類の制限酵素切断の
主要なモデルが提供された。新規なHPVの型には番号
が付与され、1つの型に属する亜型には番号の後にそれ
らの同定年代順に従って文字が付与された。(コギン・
ジエイ・アール(Coggin.J.R.) 等、Cancer Res.、39
巻、545−546頁)。この新規な11種のHPVの
ゲノムをエシエリヒア・コリ(Escherichia Coli)K1
2、C600株内にクローン化した(前記のクレムスド
ルフ等の文献、1983年参照)。エンドヌクレアーゼ
BamHIによって生成されたHPV−24DNAの2
つのフラグメントは例外として、DNAは単位長(unit
ary length)の分子形態で挿入された。これらのDNA
はAvaI ,BamHI及びHindIII の単一切断部
位を用いてプラスミドpBR322(サトクリフエ・ジ
エイ・ジー(Sutcliffe.J.G.) 、1978年Nucleic Ac
ids Res. 、5巻、2721−2728頁)に挿入する
か、又は単一のSacI部位を含む、HPV−5のDN
A由来のHindIII Bフラグメント(前記のクレムス
ドルフ等、1982年)を組込んだ組換えプラスミドに
挿入した。より特異的には、HPV17b及び22は、
HPV−5のDNA由来のHindIII Bフラグメント
を含む組換えプラスミドpBR322及びHPVのDN
Aをただ1ヶ所で切断する酵素(SacI)で切断した
後、単位長のDNA分子形態で挿入された。HPV−1
4aのDNAは、HindIII による該ウイルスDNA
の不完全消化後に単位長のDNA分子形態でプラスミド
pBR322に挿入された。このHindIII はHPV
−14aのゲノムから96.1%及び3.9%の長さを
持つ2つのフラグメントを生成するものである。HPV
−24のBam HI A及びBフラグメント(それぞ
れゲノム長の83.1%及び16.9%に相当する大き
さを持つ)を別々にプラスミドpBR322に挿入し
た。 【0024】単離したクローン及びそれに対応するHP
V源を以下の表1に挙げる。 【0025】 【表1】 【0026】組換えプラスミドを同定するために、プラ
スミドにウイルス配列を挿入するために用いられたエン
ドヌクレアーゼを含めた2種の制限酵素の混合物で処理
した後組換えDNA類および非クローン化HPV−DN
A類の消化生成物の電気泳動移動度を比較した。単離さ
れた断片の数およびサイズから、各々の場合に全ウイル
スゲノムが組込まれたことが示された。非クローンHP
V−DNA類或いはプラスミド配列から切除されたHP
V−DNA類をアガロースゲル電気泳動で分析したとこ
ろ(データは示さず)、DNAサイズの不均一性が認め
られた。HPV14b,19,20および21からのD
NA類は、HPV3a,5,8および12のDNA類と
同様のサイズ(約7700ヌクレオチド対)を有してい
る〔前掲のクレムスドルフ(KREMSDORF)の論文〕が、H
PV15,17a,17b,22および23のDNAは
これより短くHPV9のDNAと同様のサイズ(約72
00ヌクレオチド対)を有している前掲のクレムスドル
フ(KREMSDORF)(1982)およびオルス(ORTH) (1
980)の論文〕。 【0027】クローン化ウイルスゲノムの14個の制限
酵素に対する感受性を分析し、物理的地図が確立された
(図1〜図10)。或るHPV−DNA類の制限地図を
以下に述べる理由により幾つかの図に繰り返し図示し
た。前記(9)の方法によれば、22から33個の切断
部位が局在していた。HPV14aおよび14bの地図
(図4aおよび図4b)とHPV17aおよび17bの
地図(図5)を除けば、これらの地図の間には明らかな
相似性は認められなかった。夫々HPV14aおよび1
4bのDNA上に位置する21個および31個の部位の
中で、HPV−14aのDNAの2個のBamHI切断
部位の1つがHPV−14aのDNAの唯一のBamH
I切断部位と並んでいるときには15個が共通している
ことが判明した。同様に、唯一のBamHI切断部位が
並んでいるときには、HPV−17aのDNA上の29
個の切断部位のうち21個がHPV−17bのDNA上
(全部で26部位)でも等しく認められた。これらの地
図と、EVに関連するHPV類(HPV3a,5,8,
9,10および12)(8,9,16,18および2
0)、皮膚いぼに関連するHPV類(HPV1,2,4
および7)、皮膚粘膜あるいは粘膜の病巣に関連するH
PV類(HPV6b,11a,13および16)(1,
33,19)に対して既に確立された地図との間に、E
V保有日本人男性から単離されたHPVの地図(24)
と密接に関連するHPV−14aに対する地図を除いて
は明らかな相似性はみられなかった。この後者の単離H
PVとHPV−14aとの相違点は、1個の追加Bam
HI部位と1個の追加HindII部位である。2種のウ
イルスにおいて部位AvaI,BamHI,BglI,
EcoRI,HindIIおよびHindIII の位置は同
様であった。交差ハイブリダイゼーション実験により、
これら2種のウイルスが実際に密接に関連していること
が確認された。 【0028】(矢印で示した)幾つかの部位が所在して
いないことに注目されたい。ゲノムの長さの2%未満の
差しかない切断部位は保存されたもの( *)とみなし
た。***を生起しない酵素は次の通りであった。HPV
14aおよび23のDNAに対してはPvuI,Sal
IおよびSmaI;HPV−14bのDNAに対しては
PvuI,SacI,SalIおよびSmaI;HPV
15,17aおよび17bのDNAに対してはBgl
I,PvuI,SalI,SmaI;HPV−19のD
NAに対してはBglI,SacI,SalIおよびS
maI;HPV−20のDNAに対してはEcoRI,
PvuI,SacIおよびSmalI;HPV−21の
DNAに対してはSacIおよびSmaI;HPV−2
2のDNAに対してはBamHI,BglI,Pvu
I,PvuIIおよびSalI;HPV−24のDNAに
対してはBglI,EcoRI,PvuI,SacI,
SalIおよびSmaI。 【0029】既に特徴付けられたEVのHPV−DNA
類(HPV3a,5,8,9,10および12)、皮膚
いぼに関連するHPV−DNA類(HPV1,2,4お
よび7)および粘膜病巣に関連するHPV−DNA類
(HPV6b,11a,13および16)と新たに特徴
付けられたHPV−DNA類との間、並びに新たに特徴
付けられたHPV−DNA類のDNA間の配列相同の有
無を研究した。ろ紙上への付着、および飽和液相中での
DNA−DNAハイブリダイゼーションとそれに続くS
1ヌクレアーゼ消化によるハイブリダイゼーション実験
は、前記した(8,9)偏性(ストリクトまたはストリ
ンジェント)条件下で実施した。特に、HPV類のDN
A類は、前記したように(13)“ニック翻訳”で標識
し、アルカリ性ショ糖勾配(5〜20%)での沈降によ
り分離させた。標識(4000cpm)HPV−DNA
類を、前記したように(8,9)牛胸腺DNA(20μ
g)あるいは非標識HPV−DNA(0.20μg)の
存在下でNaCl 0.48M/EDTA1mM(pH
6.8)中、68℃でインキュベートした。HPV−D
NAプローブの比活性は5.3×107 から2×108
cpm/μgの間で変化した。ハイブリダイゼーション
の程度を、S1ヌクレアーゼに抵抗する画分を目安にし
て調べた。数は、プローブの自然復元(4〜15%)に
ついて校正し相同ハイブリダイゼーション(75〜95
%)について100%に正規化した値を表わす。NDは
“測定せず”の略号である。上記条件下におけるHPV
−DNA類間の交差ハイブリダイゼーションの相対量
を、標識HPV−DNAを非標識HPV−DNAとのハ
イブリダイゼーションの%として表2に示す。 【0030】 【表2】【0031】HPV1、2、4、6b,7および11a
のゲノムと32P標識の新たにクローン化されたEVのH
PV−DNA類との間、或いはEVの非標識HPV−D
NA類とHPV13,16および18に特異なプローブ
との間の交差ハイブリダイゼーションは全くないか或い
は殆んどないことに注目されたい。同様に、飽和再結合
(saturation reassociation) により、HPV14a,
14b,15,17a,17b,19,20,21,2
2,23および24のDNA類とHPV1aおよび11
aのDNA類との間に交差ハイブリダイゼーションは殆
んど認められなかった(表2)。新たにクローン化され
たHPV類のDNA類では、強力な交差ハイブリダイゼ
ーションを示したHPV17aおよび17b、HPV1
4aおよび14bを除いて、相互間かつEVに関連する
他のHPV(HPV3a,5,8,9,10および1
2)のゲノムとの間での交差ハイブリダイゼーションは
殆んど或いは全くみられなかったし、認められたにせよ
50%未満であった。これらの知見から、新しいウイル
ス類が9個の新しいタイプ(型)(HPV14,15,
17,19,20,21,22,23および24)と2
個のサブタイプ(亜型)即ちタイプ14(HPV−14
aと14b)及びタイプ17(HPV−17aと17
b)とに分類されることが確認された。 【0032】同様に、別のHPV類は、分子ハイブリダ
イゼーションの偏性(ストリクト)条件下での配列相同
性の有無に基づいて分類された。これらのグループ(A
からH)を表3に示す。この表には、これらHPV類
(単独で或いは組合せて)のキヤリアの中で診断された
疾患およびその発癌性が示されている。 【0033】 【表3】【0034】HPV5,8,12,14,19,20,
21,22および23のDNA類では、これらの間の交
差ハイブリダイゼーション(グループ相同)のレベルは
5〜38%であり、HPV5,8および12のDNA類
との場合を除いて顕著な交差ハイブリダイゼーション
(4〜13%)は示さない。従って、これらのウイルス
類は前に定義した(9)EVのHPV類のグループの1
部を形成する。 【0035】同様に、相互間で約20%の交差ハイブリ
ダイゼーションを示しかつHPV−9のDNAと約6%
の交差ハイブリダイゼーションを示すHPV9,15お
よび17のDNA類は等しく、前記した(9)EVのH
PV類のグループに属する。タイプ13と31のHPV
類は一つの同じグループに属するものと考えられうる。
また最後に、他のHPV類のゲノムと殆んど相同性を示
さないタイプ1,2,4,24および32のHPV類
は、相互にかつ従来のグループとは異なる他のグループ
の第1のメンバーを形成するものとして考えられる。 【0036】本発明はまた特に、上記したHPV−DN
A類から由来されるDNA断片(フラグメント)および
特に遺伝子E6−E7,E1,L2,L1およびそれら
の遺伝子間領域にそれぞれ対応するDNA断片に関す
る。原点として採った部位に対するこれら各種断片の相
対位置および長さを表4に示す(図1〜図9)。 【0037】 【表4】【0038】HPV−1のゲノム上の遺伝子の位置は、
このゲノムのヌクレオチド配列から推論された〔オー.
ダノス(O.DANOS),エム.カチンカ(M.KA
TINKA)およびエム.ヤニブ(M.YANIV)の
パテント〕。ハイブリダイゼーションの偏性条件(Tm
−29℃)あるいはあまり偏性でない条件(Tm−40
℃)下で形成されたヘテロ二重鎖分子を電子顕微鏡分析
した後、HPV−3,5,8,9,10a,12,1
4,15,17および24のゲノムの物理的地図をHP
V−1の物理的地図および遺伝子地図と関連させて配列
し、HPV−31のそれをHPV6bの物理的地図およ
び遺伝子地図と関連して配列した〔イー.シュワルツ
(E.SCHWARZ)ら、エンボジェー(EMBO
J.)1983,2,2341−2348〕。保存され
た制限酵素部位を並列させた後、HPV10b,28お
よび29の物理的地図をHPV3aおよび10aの物理
的地図に対して配列した。 【0039】表4に示した配位の値は、図1〜図9に示
した物理的地図上で、遺伝子E6,E7,E1,L2お
よびL1およびHPV−1aのゲノムに関するかHPV
−31の場合にはHPV−6bのゲノムに関する遺伝子
間領域と相同なゲノムセグメントの5′および3′末端
の位置を示す。 【0040】遺伝子間領域(調節要素を含む)および隣
接のE6とE7遺伝子(多分腫瘍中で発現される形質転
換の主要遺伝子に相当する)は、別のグループに属する
多くのHPVタイプのゲノム間で(非偏性ハイブリダイ
ゼーション条件下で)形成された、或いは同じグループ
に属する多くのHPVタイプのゲノム間で(偏性ハイブ
リダイゼーション条件下で)形成されたヘテロ二重鎖分
子の電子顕微鏡分析により検出されうる配列相同性を示
さない。遺伝子EI(ウイルスDNAの複製に主に関係
する)および遺伝子L1(ウイルス粒子の主要抗原決定
基を有するウイルスカプシドの主要タンパク質のコーデ
ィング)は、別のグループに属するHPVタイプのゲノ
ム間で(非偏性ハイブリダイゼーション条件下で)形成
された、或いは同じグループに属するHPV類のゲノム
間で(偏性条件下で)形成されたヘテロ二重鎖の分析に
より検出されうる配列相同性を示す。 【0041】E1およびL1領域を含む組換えプラスミ
ドから作成されたプローブを用いて、ケースに応じて偏
性或いは非偏性条件下での分子ハイブリダイゼーション
実験により最大数のHPVタイプを検出することが理論
的に可能である。遺伝子間領域および遺伝子E6および
E7を含む組換えプラスミドから作成されたプローブ
は、或るHPVタイプあるいは関連するHPVタイプを
特異的に検出することができる。 【0042】L2領域(ウイルスカプシドのマイナーな
成分に対するコーディング)は、各種HPVタイプの中
で種々のヌクレオチド配列保存度を示す。 【0043】ウイルスHPV−IP2 およびHPV−
IP4 を単離する条件およびこれらのウイルスからH
PV−DNA類を得る条件を以下により詳しく記載す
る。 【0044】新生物および性器ガンに関連した新しいタ
イプのHPV(HPV−IP2 )の分子クローニング
および特徴づけ 新しいタイプのHPVは、HPVタイプ16に特異な放
射性プローブを用いる非偏性条件下でのハイブリダイゼ
ーションにより子宮頸管ガンから抽出されたDNA中に
存在していることがみとめられた。偏性ハイブリダイゼ
ーション条件下でハイブリダイゼーションを実施したと
きには交差ハイブリダイゼーションは検出されなかっ
た。このHPV−DNAの多数の制限酵素に対する感度
の研究から、酵素BglIIがウイルスDNAを1度切断
していることが知見された。腫瘍から抽出されたDNA
をエンドヌクレアーゼBglIIで消化した後、8kb
(パピローマウイルスのゲノムのサイズ)のDNA分子
を含有する画分をショ糖勾配での遠心により精製した。
8kb分子を、BamHI部位でバクテリオフアージλ
L47.1のDNAに挿入されたプラスミドPL 1
5.5(BglIIおよびBamHIによる単一の切断部
位を含む)から構成されるベクターのBglII部位に挿
入した。組換えDNAを包膜し宿主細菌〔大腸菌(Esch
erichia coli )菌株LA101〕に感染後、組換えフ
ァージに相当する溶菌領域(プラーク)を感染細菌培養
物のレプリカを放射性HPV−16からのDNAを用い
て非偏性条件下でハイブリダイゼーションすることによ
り検出した。ウイルス配列の全体を含む幾つかの組換え
バクテリオフアージを単離した。挿入酵素BglIIによ
りフアージDNAを切断すると、非偏性条件下でHPV
−16プローブとハイブリダイズする8kbフラグメン
トが得られる。原腫瘍のDNAおよび組換えフアージの
DNAを酵素BglIIおよびPstIの混合物で切断す
ると、総分子量がパピロマウイルスのゲノムのサイズに
等しい同一の5個のフラグメントが得られる。新しいH
PVのDNAを組換えパクテリオファージのDNAから
切除し、電気溶離(electroelution)により精製し、プ
ラスミドPL15.5で再クローン化した。ウイルスD
NAの制限地図が、21個の切断部位を位置決めしうる
(図9)18種の制限酵素に対するこのDNAの感受性
に基いて確立された。こうして確立された地図は今まで
に同定されたHPV類のゲノムの地図とは異なってい
る。新しいHPVのDNAと今までに同定されたHPV
類のDNAとの配列相同性を、偏性条件下で行なわれた
レプリカの分子ハイブリダイゼーション実験で分析し
た。検知された相同性は常に5%未満であった。HPV
−16のゲノムで相同性が最大であった。子宮頸管ガン
からの特性づけられた新しいウイルスは新しいタイプの
HPVであり、これを仮にHPV−IP2 と呼称す
る。 【0045】HPV−IP2 のDNAとHPV−1の
DNAとの間で各種条件下で形成されたヘテロ二重鎖分
子を電子顕微鏡で分析すると、これら2種のゲノムの物
理的地図の配列およびHPV−IP2 のDNAが担持
している種々の遺伝子の理論的位置決めが可能であっ
た。 【0046】 【表5】 【0047】精製HPV−IP2 のDNAから作成し
た放射性プローブを使用すれば、これらウイルスの病原
力が測定できる。HPV−IP2 のDNAは、調べた
外性器のボウエノイド丘疹(Bewenoid papula)14例中
1例に、侵入性子宮頸ガン51例中2例に、子宮頸部の
上皮内新生物(neoplasie)28例中1例にみとめられ
た。従って、HPV−IP2 は、HPV−18に比べ
てやや弱くHPV−16に比べてかなり弱い腫瘍形成能
を有する性器向性タイプ(genito-tropic type)のHP
Vである。性器新生物、特に子宮頸管ガンの進行の危険
性を示すHPV類のタイプを診断あるいはスクリーニン
グするための分子プローブを作成することを目的とする
HPV−DNA混合物中に組み入れることが必要であ
る。 【0048】皮膚の前ガン病巣に関連する新しいタイプ
のHPV(HPV−IP4 )の分子クローニングおよ
び特徴づけ 新しいタイプのHPVが、光線(紫外線)角化症の生
検、前ガン皮膚病巣から抽出されたDNA中に、HPV
タイプ5,8および14に特異な放射性プローブを含む
混合物を用いる偏性条件下での分子ハイブリダイゼーシ
ョンにより証明された。ハイブリダイゼーションをタイ
プ1,2,3,7,10,13,16,18,28,I
P−1(前にHPV−31と呼称した)、IP−2およ
びIP−3(前にHPV−32と呼称した)に特異なプ
ローブを用いて行なった場合には交差ハイブリダイゼー
ションは検知されなかった。 【0049】このHPVのDNAの幾つかの制限酵素に
対する感受性を調べたところ、酵素EcoRIがウイル
スDNAを1度切断していることが知見された。エンド
ヌクレアーゼEcoRIにより生検から抽出されたDN
Aを消化させた後、8kb(パピローマウイルスのゲノ
ムのサイズ)のDNA分子を含む画分をショ糖勾配によ
る遠心で精製した。8kb分子をEcoRI部位でバク
テリオファージλgtwes.λBのDNAに挿入し
た。組換えDNAを包膜し、宿主細菌〔大腸菌(Escher
ichia coli )菌株LA101〕の感染後、組換えファ
ージに相当する溶菌プラークを、非偏性条件下でHPV
−8および14からのDNA類の放射性混合物により感
染細菌性培養物のレプリカ(複製物)をハイブリダイゼ
ーションすることにより検出した。ウイルス配列の全体
を含む幾つかの組換えバクテリオファージを単離した。
挿入酵素EcoRIによりファージDNAを切断する
と、非偏性条件下でHPV−5,8および14に特異な
プローブをハイブリダイズする8kbフラグメントが得
られる。原病巣のDNAおよび組換えファージのDNA
を酵素EcoRIおよびPstIの混合物で切断する
と、総分子量がパピローマウイルスのゲノムのサイズに
等しい同一の6個のフラグメントが得られる。新しいH
PVのDNAを組換えバクテリオファージのDNAから
切除し、電気溶離で精製し、プラスミドpSP65で再
クローン化した。ウイルスDNAの制限地図をこのDN
Aの15種の制限酵素に対する感受性によって確立し
た。これにより23個の切断部位の位置決めが可能とな
った(図10)。こうして確立された地図は、今までに
同定されたHPV類のゲノムの地図と異なっていた。新
しいHPVのDNAと今までに同定されたHPV類のD
NAとの配列相同を、偏性条件下で行なったレプリカに
対する分子ハイブリダイゼーション実験により調べた。
いぼ状表皮異形成病巣中で既に同定された或るタイプの
HPV類(HPV−5,8,12,14,19,20,
21および25)のDNAと新しいHPVのDNAとの
間の相同性は50%未満であったが、他のタイプのHP
V類との相同性は認められなかった。こうして光線角皮
症からの特性づけられた新しいウイルスは新しいタイプ
のHPVであり、これを仮にHPV−IP4 と呼称す
る。 【0050】精製HPV−IP4 のDNAから作成さ
れた放射性プローブを使用すると、調べたいぼ状表皮異
形成患者17例中42%に、分析した光線角皮症の生検
y中xでHPV−IP4 が検出された。皮膚ガンの頻
繁な進行を特徴とする病気のいぼ状表皮異形成の患者で
高率であったことと、皮膚の有棘細胞ガンの前駆体と考
えられる光線角化症の病巣の割合に対する関連比から、
HPV−IP4 は腫瘍形成能を有する皮膚向性タイプ
のHPVである。皮膚のガンあるいは前ガン病巣の進行
の危険を示すHPVタイプを診断もしくはスクリーニン
グするための分子プローブを作成することを目的として
いるHPV−DNA類混合物にはこれを組み入れなけれ
ばならない。 【0051】本発明は更に、特に各種HPV−DNA類
の混合物(あるいはこれらHPV−DNA類もしくはそ
れらからの配列を含有するプローブ)に関し、これら混
合物は、多分感染の進行可能性を予知するために各種形
態のパピローマウイルス感染を診断するべく組合せて使
用されうる。本発明の好ましい混合物を表6に例示す
る。 【0052】 【表6】【0053】この表には、混合物を使用して特に診断可
能な疾患の性質も示した。図1〜図9の制限地図の分類
は表6の“構成”欄に示した分類(グループ分け)と一
致していることは注目すべきことである。このために、
添附図面の幾つかの図面に幾つかのプローブが数回示さ
れているのである。 【0054】これらの各混合物は、本発明の新しいプロ
ーブの少なくとも1つを包含するものとして定義づけら
れうる。換言すれば、本発明の診断用組成物は次のもの
を含むものとして定義づけられうる。 【0055】(1)少なくともHPV−2dのDNA、
(2)HPV10b,28および/又は29のDNAの
少なくとも1種、(3)HPV17および/又は24の
DNAの少なくとも1種、(4)HPV14,15,1
7,19,20,21,22および/又は23のDNA
の少なくとも1種、(5)HPV15および/又は17
のDNAの少なくとも1種、(6)HPV−24のDN
A、(7)HPV−14および32のDNA、(8)H
PV−31のDNA、(9)HPV−32のDNA。 【0056】9種のグループのDNAは全ゆる状況下で
互いに異なるように選択されると理解されたい。 【0057】各種形態のいぼあるいは他の皮膚もしくは
粘膜病巣から多くのHPV類が単離されうるが、表に示
した各タイプの疾患の診断に1種あるいは2種以上のH
PV−DNA類を含有する混合物を使用することが好ま
しい。なぜなら他のHPV−DNA類は同タイプの疾患
に同様に介在(intervene) しうると考えられていたから
である。感染の性質およびその進行可能性の診断は、使
用するプローブの数が増すにつれてより有効となるであ
ろう。加えて、各種プローブ混合物を用いて行なうハイ
ブリダイゼーションアッセイにより、罹患疾患の識別
(鑑別)診断を同等にかなりの確率で行ないうる。 【0058】表6には、本発明者らの研究所で単離され
たHPV−DNA類から形成されたプローブのみを記載
した。勿論前記した理由で、別の研究所の研究過程で得
られた同じタイプの感染症を患っている患者において何
度も検出されている他のHPV−DNA類を添加するこ
とにより各種混合物を有利に改良しうる。例えば混合物
7は、上皮内新生物や皮膚ガンへの移行の危険性を有す
るいぼ状表皮異形成中にみられる他のHPV−DNA類
を添加することによってのみ改良されうる。表6におい
て、いくつかの混合物が同じ疾患の診断に特有なものと
して表示されていることに注目されたい。いろいろな混
合物により、腫瘍形成(cancerization)のリスクの少な
い感染症とそのリスクの高い感染症とを区別しうる。例
えば、診断が下される患者から得たウイルスサンプルが
混合物7とハイブリダイゼーションすれば、サンプルが
混合物3のプローブとそれ以上にハイブリダイズした場
合に比べて皮膚ガンに進行するリスクが高いことが示唆
される。 【0059】同様に、混合物5により検出されたEVの
症例では混合物6を用いて検出されたこれら症例に比べ
て腫瘍形成のリスクは高い。混合物4は、混合物5を用
いて検出される症例に比べてより高いリスクを有するE
V症例を識別できるであろう。 【0060】さらに以下に異なるHPV−DNA(ある
いはこれらのHPV−DNAを含むプローブあるいはH
PV−DNAの配列)のその他の混合物を記載する。こ
れらは任意に、起り得る感染の進行の予後経過を測定す
る目的で、異なる形の乳頭腫ウイルス感染の全般的診断
に組み合わせて使用することができる。 【0061】本発明に一致する好ましい混合物は前記表
6に特定されている。本表はまた表の左側に記載した混
合物の使用によって格別に診断し得る疾患の性質も示し
ている。本表に特定したその他のHPV−DNAの制限
地図は図1〜9に示されている。 【0062】HPV−IP2 は、性器腫瘍特に子宮頸
ガンの進行の危険性の検知に使用できる格別な代表的プ
ローブと考えられることを指摘しておく。 【0063】従って本発明は格別に、前記表において混
合物番号として示した1〜10の番号をつけて示した1
0のグループを少なくとも含む診断用キットにも係る。 【0064】これまでは特に、クローン化HPV−DN
A全体のプローブとしての使用について考慮してきた。
しかしそれらはこれらの異なるDNAのクローン化フラ
グメント、特に遺伝子E1あるいはL1及び遺伝子E6
−E7によって置き換ることもできる。 【0065】in vitroにおけるHPV−DNA
検知の基本的原理は当然、厳格(ストリクト)あるいは
弱厳格条件で行なわれるハイブリダイゼーションを含
む。 【0066】操作は例えば下記のように行なわれるが、
記載する診断方法は当然、本発明のプローブ及びプロー
ブの混合物の使用条件を制限するものではないと解され
るものである。 【0067】クローン化HPVのDNA混合物より得た
プローブを使用する試験の目的は、バイオプシー中、病
変部から採取して得た細胞中、あるいはカルノイ(Carno
y)混合液(エタノール、クロロホルム、酢酸、6:3:
1)により固定されパラフィン中に含まれるバイオプシ
ー部分中のHPVの存在を明らかにし、HPVのタイプ
を同定することである。試験は、原理は公知の方法によ
る試料からのDNAの予抽出を必要とし、HPV−DN
A混合物から調製した放射性プローブ(32pあるいは35
sで標識されている)を使用した厳格あるいは弱厳格条
件下での分子ハイブリダイゼーションによるこのDNA
の分析を含む。一般には、各試験はいくつかのプローブ
混合物を必要とする。 【0068】いくつかのハイブリダイゼーション方法が
使用し得る。例えばスポットハイブリダイゼーション法
が使用できる。本方法はDNAの変性の後、DNAアリ
コートをメンブラン(ニトロセルロースあるいはジーン
スクリーンプラス〔Genescreeuplus〕上に沈積させ、各
メンブランを通常の条件下でプローブ混合物とハイブリ
ダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーションさせたメ
ンブランを放射線写真フィルム上に接触露光させること
により放射性ハイブリッドの検知を行なうことから成
る。またレプリカに対するハイブリダイゼーション法を
使用することもできる。本方法は、制限酵素でのDNA
処理により得られたDNAフラグメントのアガロースゲ
ル電気泳動による分離、アルカリ変性後の該フラグメン
トのメンブラン(ニトロセルロースあるいはジーンスク
リーンプラス)上への転写、及び通常の条件下での異な
るプローブ混合物とのそれらのハイブリダイゼーション
から成る。放射性ハイブリッドの形成はやはり、メンブ
ランの放射性写真フィルム上への接触露光によって検知
する。 【0069】放射性プローブは、ニックトランスレーシ
ョン法により標識されたHPV−DNA、あるいは例え
ばSP6型のようなベクター中にインサートされたウイ
ルスDNAの転写により調製されたRNAにより構成さ
れる。放射性プローブを使用すると格別な好感度という
利点が得られるが、例えばビオチン化されており、それ
自体標識された抗体あるいは酵素的、蛍光的あるいはそ
の他の標識を有する抗体により認識可能な抗体によって
認識され得るような非放射性プローブの使用を除外する
ものではない。 【0070】プローブの選択は標本の性質に依る。例え
ばEVを有している可能性がある患者の場合、混合物
1,2,3,4,5,6及び7が使用される。混合物1
及び2はEV及び皮膚イボの異なる診断を可能とする。
プローブ3はEVに関連するHPVの3つのグループの
それぞれの最もよく検知されるものを含んでおり、プロ
ーブ7はEVのガンに関連するHPVのDNAを含んで
おり、大多数のEVの場合の診断を可能にするものであ
り、特にガンに発展し易いHPVのタイプに感染した患
者の同定の診断を可能にするものである。混合物4,5
及び6の使用により、同一の患者に感染したHPVの一
つ以上のタイプを区別することができる。 【0071】従って本発明はさらに、上記したプローブ
のいくつかを含むセットあるいはキットにも係り、特に ──上記した19のHPV−DNAのタイプあるいはサ
ブタイプのそれぞれの代表的なもの、あるいは ──プローブの混合物、好ましくは前記に規定したプロ
ーブの種々のグループあるいは混合物を含むものであ
る。これらのキットは、患者から得たウイルス調製物と
種々のグループあるいは混合物との間のハイブリダイゼ
ーションによるinvitroでの診断試験を目的とす
るものである。 【0072】言うまでもなく今まで記載したことから、
本発明は特異的に想定されるその実施態様あるいは適用
に限定されるものではなく、それどころか全ての変形例
を包含するものであり、特定番号を付され図面中に制限
地図を示したHPV−DNAの特許請求の範囲における
記載は、特許請求の範囲が前記した定義に従って同じタ
イプに分類されるこのHPV−DNAに共通なHPV−
DNAを全て包含することを示すものであり、特に同じ
サブタイプに属するHPV−DNAにおいてはなおさら
そうである。 【0073】さらに図面に示したHPV−32から得ら
れたDNAに関して、それが以下の酵素、AvaI,B
alI,BamHI,ClaI,EcoRI,Hind
III,NdeI,NruI,PvuI,PvuII,Sa
cI,SalI,SmaI,TthIIIあるいはXma
Iのいずれによっても切断されないことが特に指摘され
る。 【0074】また、下記の組換えDNAは1984年1
1月30日に下記の受託番号でC.N.C.M(ナショ
ナルコレクション・オブ・カルチュア・オブ・マイクロ
オーガニズム・オブ・インスティテュート・バスツー
ル、パリ)に寄託されていることも特記しておく。 【0075】 pBR322/HPV2d ………… No.I−379 pBR322/HPV10bA ………… No.I−380 pBR322/HPV10bB ………… No.I−381 pBR322/HPV14a ………… No.I−382 pBR322/HPV14b ………… No.I−383 pBR322/HPV15 ………… No.I−384 pBR322/HPV17a ………… No.I−385 pHPV5 HindIII B/HPV17b … No.I−386 pBR322/HPV19 ………… No.I−387 pBR322/HPV20 ………… No.I−388 pBR322/HPV21 ………… No.I−389 pHPV5 HindIII B/HPV22 …… No.I−390 pBR322/HPV23 ………… No.I−391 pBR322/HPV24a ………… No.I−392 pBR322/HPV24b ………… No.I−393 pBR322/HPV28 ………… No.I−394 pBR322/HPV29 ………… No.I−395 pBR322/HPV31 ………… No.I−396 pSP64/HPV32 ………… No.I−397 pLI55/IP2 ………… No.I−450 pSP65/IP4 ………… No.I−449 本発明はさらに、前に言及した異なる乳頭腫ウイルスか
ら得た遺伝子E6及びE7の発現の産物にも特に係る。
それ等は有効量で投与すれば乳頭腫ウイルスに関連する
腫瘍の進行に対する抵抗性を宿主に生起することができ
るワクチンの活性主成分として使用することができる。 【0076】本発明はまた、哺乳動物の免疫化により得
られる血清にも係る。該血清は患者に有効量で特に非経
口的に投与可能な血清調製物とし得、それは対応する乳
頭腫ウイルスのタイプあるいはサブタイプにより生起さ
れた感染を退行させ得る。 【0077】問題の種類の発現のポリペプチド生成物を
得ること、特に適当なプロモータのコントロール下にベ
クターにE6及び/又はE7配列を結合すること、乳頭
腫ウイルスが問題のプロモーターを認識し易く、それに
関する配列を発現し易い細胞宿主の形質転換から成る遺
伝子工学の技術によるものは、同業の通常の能力を有す
る者に対して強調する必要はない。 【0078】このように本発明は、問題の種類の主成分
(発現生成物あるいは対応抗体)を生理的に許容可能な
薬理学的担体と共に含む、薬理学的使用を目的とする組
成物にも係る。特に問題の種類の組成物が非経口的に投
与される場合は、担体は注射可能な飽和溶液により構成
される。 【0079】最後に、参照した文献の書誌目録を以下に
記した。これは読者が本テキストを十分に理解するため
に有用であると考えられる範囲において、先行技術水準
の記載の要件を満すものである。この理由から、これら
の文献の内容は記載の一部と考えられるべきものであ
る。 【0080】参 考 文 献 (1)エム・ダースト(M.Durst) 他、プロク・ナトル・
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l) ,8:398−404。 【0097】(18)エツチ・フイスター(Pfister,H.)
他、1983、カンサー・レス:43:1436−14
41。 【0098】(19)エツチ・フイスター他、1983、
ジエイ・ヴイロル、47:363−366。 【0099】(20)エツチ・フイスター他、1981、
イント・ジエイ・カンサー(Int.J.Cancer)、27:64
5−650。 【0100】(21)エル・エー・リユーダ(Rueda,L.A.)
他、1976、メド・カツト・アイ・エル・エー(Med.C
ut.I.L.A.)、2:113−136。 【0101】(22)エム・リユイター(M.Ruiter)他、ジ
エイ・インベスト・ダーマトール、47:247−25
2。 【0102】(23)ジエイ・ジー・シユトクリフエ(Sut
cliffe,J.G.)、1978、ニユークレイツク・アシズ・
レス(Nucleic Acids Res) ,5:2721−2728。 【0103】(24)テイー・ツモリ(Tsumori,T.)他、1
983、ジエイ・ジエン・ヴイロル(J.Gen.Virol.)、6
4:967−969。
illomavirus)のDNAを含有する、乳頭腫ウイルス感染
の検出のための組成物に係わる。 【0002】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】“乳
頭腫ウイルス”という用語は、皮膚又は粘膜の比較的良
性の(ウイルス性)いぼ(warts) から、上皮内腫瘍又は
種々の形態の皮膚ガンに悪化し易い過形成(hyperplasia
s)までの幾つかの形態のウイルス感染症の原因であると
一般的に考えられている多数のウイルスを含むものであ
る。乳頭腫ウイルス感染の中には、特に、これ以降時々
“EV”と表現されるいぼ状表皮異形成(epidermodyspl
asias verruciformis)があることにも注意しなければな
らない。 【0003】乳頭腫ウイルスの型の幾つかはすでに報告
されている。本発明の特許出願に於いて、幾つかの新規
の型及び亜型の乳頭腫ウイルスを、その感染患者に於い
て多大の割合で早発皮膚ガンを進行させる傾向のウイル
ス性のいぼ又は散在性斑紋(disseminated macular)病巣
から単離したことが報告されるであろう。 【0004】最近の研究により免疫因子の重要性及びヒ
ト乳頭腫ウイルス(HPV)の主要な役割が明らかにさ
れており、これらの因子に、乳頭腫ウイルス感染の病理
に於ける様々な遺伝因子及び化学作用のある放射線に関
する文献中に以前に記載されている役割が追加される。 【0005】本発明は新たに単離された多数の乳頭腫ウ
イルスの相対的な挙動に関する観察に基づいてなされた
ものであり、その主要なゲノムの性質は以下で定義され
よう。 【0006】少数のEV例に関する研究によって、6つ
の型のHPVの性質がそれらのゲノムの分子クローニン
グによってすでに明らかにされている(クレムスドルフ
・デー(Kremsdorf, D.) 等、1982年、ジャーナル・ヴイ
ロロジー(J. Virol).43巻、436-447 頁及びクレムスド
ルフ・デー等、1983年、ジャーナル・ヴイロロジー、48
巻、340-351 頁参照)。異なるグループのゲノムの間で
のクロス−ハイブリダイゼーションが欠如しているか又
は非常に弱いかどうかによって、上記のHPVは3つの
グループに分類された。第1のグループには、或る種の
EV患者及び一般住民に於いて見られる扁平なウイルス
性いぼと関連のあるHPV3a及び10が含まれる。H
PV3aに関連するDNA配列は一人のEV患者のガン
で発見された。第2のグループにはHPV5,8及び12
が含まれ、HPV5及び8のゲノムは複数のEV患者の
ガン中で検出された。第3のグループは現在のところた
った1種のウイルス、HPV9である。免疫抑制を呈し
た腎臓移植受容者がHPV5に感染していると判明した
ことは例外であるが、第2と第3のグループのウイルス
はEV患者の間だけに検出され、彼らの殆んどは幾つか
のウイルスに感染していた。現在文献(以下に示す参考
文献1−5,8,9,13,14,16,18−20)中に記述さ
れている14の型のHPVの中で、4つのものは、珍しい
病気であるEVに特に関係のあるものであることが判明
したことに注目すべきである。 【0007】多数の新規の型及び亜型の乳頭腫ウイルス
を単離し本発明を完成せしめた研究によってイン・ヴイ
トロに於けるより高度に洗練された診断技術開発が可能
になった。より具体的には、本発明は、例えば病巣又は
バイオプシー切片から得られる乳頭腫ウイルスの同定に
関する完璧な技術を提供し、これによって、問題となっ
ている病巣が悪化していく可能性があるかどうかに関す
る予測をもより良く行うようにさせ得るようなより正確
な診断法をもたらす。 【0008】一般的に言って、乳頭腫ウイルスは、互い
に非常に異なってはいるが、それでも約7000〜8000の塩
基対の大きさを有していることに注意しなければならな
い。加えて、それらのゲノムには前述にもかかわらず或
る程度の相同性があり得る。以下の記載に於いて、乳頭
腫ウイルスの様々な型及び亜型間の相同性の割合(%)
を決定することに言及する。これら相同性の割合は、
“非ストリンジェント(non-stringent) ”又は“非スト
リクト(non-strict)”と呼ばれる条件下、又は“ストリ
ンジェント(緊縮)”又は“ストリクト(厳格)”と呼
ばれる条件下で行なわれるハイブリダイゼーションアッ
セイによって決定される。 【0009】乳頭腫ウイルスは幾つかの型の乳頭腫ウイ
ルスに区別され得、それらはストリクト又はストリンジ
ェントの条件下で測定された相同性の割合によって区別
され得る。この条件下で、50%より小さい相同性の割合
を示すものは別の型に属する。この点に関して、ストリ
クト又はストリンジェントな条件下で別の型のウイルス
間の相同性の割合は0まで低下し得るということに注意
しなければならない。これと同じ条件下で、50%より大
きい相同性の割合を示すウイルスは同じ型に属するもの
と考えられ、それらはこの同型内の別々の亜型を形成す
る。 【0010】非ストリクト又は非ストリンジェントな条
件下のハイブリダイゼーションアッセイは、ハイルマン
・シー・エー(Heilman. C. A) 等、1980年、ジャーナル
・ヴイロロジー36巻、395-407 頁及びクロイサン(CROIS
SANT) 等、1982年、シー・アール・アカド・サイエンス
(C. R. Acad. Sc.パリ、294 巻、581-586 頁(ヘテロ二
重鎖分子)に記載されている以下の条件下で単離された
2種のウイルスから取り出されたDNAを相互に接触さ
せるものである。 【0011】ストリクト又はストリンジェントな条件下
のハイブリダイゼーションアッセイは、クレムスドルフ
・デー等、1982年、ジャーナル・ヴイロロジー、43巻、
436-447 頁、及び1983年、ジャーナル・ヴイロロジー、
48巻、340-35頁、及びデービス・アール・ダヴリュ(Dav
is, R. W) 等、1971年、Methods Enzymol.、21巻、413-
428 頁(ヘテロ二重鎖分子)に記載されている条件下で
単離された2種のウイルスから取り出されたDNAを相
互に接触させるものである。 【0012】概要的には、1つの同じ型に属する乳頭腫
ウイルスはそれぞれの配列の長さ全体の80〜100 %に亘
る実質的に同一のヌクレオチド配列を有するハイブリダ
イズ可能な配列を持っているが、これら相同的な配列は
別の型に属する乳頭腫ウイルスの間では60%又はそれ以
下に低下し得ることを言及しておく。非ストリクト又は
非ストリンジェントの条件下で相互にハイブリッドを形
成する別の型の乳頭腫ウイルスからの配列が同一あるい
は類似である程度は同じ型の乳頭腫ウイルスの場合より
必らず明らかに低いものである。 【0013】本発明者らの研究によって、種々の型の乳
頭腫ウイルスの間の遺伝子の異種性の程度は以前考えら
れていたものよりも大きいこと、そして同時に、これら
種々の型が或る程度の特異性を示す感染形態又はその変
形としばしば関連のあることの2つが明らかになった。 【0014】 【課題を解決するための手段】本発明は、(i)HPV
−14a,HPV−14b,HPV−15,HPV−1
7a,HPV−17b,HPV−19,HPV−20,
HPV−21,HPV−22,HPV−23,HPV−
24,HPV−28,HPV−29,HPV−31,H
PV−32,HPV−IP2,およびHPV−IP4か
らなる群から選択される乳頭腫ウイルスから得られる約
7,000〜約8,000塩基対からなり、明細書記載
の図1〜9の制限地図の一つを有するヒト乳頭腫ウイル
ス(HPV)の精製されたDNA、又は該乳頭腫ウイル
スの1つに特異的であり、ストリンジェント条件下で該
乳頭腫ウイルスと安定なハイブリダイゼーションをする
ことができる前記精製DNAのフラグメント、および
(ii)前記(i)に記載のHPV DNA又はDNAフ
ラグメントとは異なる少なくとも一つの別のHPV D
NA、を含有する、ヒト乳頭腫ウイルス感染の検出のた
めの組成物を提供する。 【0015】従って本発明は、単離された種々の新規の
乳頭腫ウイルスから単離され得るDNA及びこれらのD
NAから全部又は部分的に構成され得るプローブに関す
るだけではなく、或る乳頭腫ウイルスが発見される患者
の危険の度合及び様々のカテゴリーの感染の診断に最も
有効に用い得る乳頭腫ウイルスの型の混合物(カクテ
ル)からなる組成物にも関するものである。場合によっ
ては以前にすでに単離されている乳頭腫ウイルスのゲノ
ムDNAから構成されたプローブおよびこれを本発明の
ものと組み合わせた混合物も含めて本明細書に記載され
ている乳頭腫ウイルス用プローブの数によって、非常に
正確な診断が実現される。特に、様々の型の乳頭腫ウイ
ルスに起因する感染又はこのような様々の型のウイルス
の影響によって進行悪化する可能性がある感染のいろい
ろなカテゴリーのものがより容易に識別できるようにな
り、或るカテゴリーの感染に於いては、その進行悪化に
よってより深刻な病気に転換するかどうかという危険の
度合をより良く経過予想することができるようになる。
例えば、いぼ状表皮異形成として発現する感染の場合に
はそれが皮膚ガンに進行するかどうかという危険の度合
いをより正確に評価することができる手段を本発明は提
供する。 【0016】 【発明の実施の形態】以下の表現を簡潔にする為に一般
の方法に従って、乳頭腫ウイルスの全ゲノムを“HPV
−DNA”という略語で示すことにする。 【0017】同様に簡略化の為、すでに公知の幾つかの
乳頭腫ウイルスを含むHPV−DNAの物理的制限地図
が記載されている添付図を参照する。 【0018】これらの物理的地図は様々の制限エンドヌ
クレアーゼによる切断部位の位置を与える。この地図の
起点は一般的に単一の切断部位で構成されている。この
起点からの距離はゲノムの全長に対するパーセントで表
わされる。地図の1単位はゲノム長の1%を表わす。 【0019】本発明はまず第1に最も特別には、7000〜
8000塩基対の範囲の大きさをもつ全てのDNAから選ば
れた各HPV−DNAに関するものであり、これらDN
Aは図中に表わされる制限地図によって特徴づけられる
ものであり、それはより特定的にはHPV−2d、HP
V−10b、HPV−14a、HPV−14b、HPV
−15、HPV−17a、HPV−17a、HPV−1
9、HPV−20、HPV21、HPV−22、HPV
−23、HPV−24、HPV−28、HPV−29、
HPV−31及びHPV−32、HPV−IP2及びH
PV−IP4で示される乳頭腫ウイルスから得られたH
PV−DNAに関するものである。 【0020】ここに列挙したものと同じ型に属すると考
えられ得るHPV−DNAに対しても本発明の効果が同
じように及ぶことは言うまでもないことである。 【0021】新たに特徴づけられたウイルスのHPV−
DNAに対応する物理的地図は図中の黒丸で示されてい
る。 【0022】本発明は同じように、前記HPV−DNA
のフラグメント又はそれと特にストリクトな条件下でハ
イブリッドを形成し得るものに係る。同様に、本発明は
上記各HPV−DNAの全部又は一部を含む組換えDN
A、そして特にそれぞれE1,E6−E7,L1及びL
2の遺伝子に対応するフラグメントを含む組換えDNA
又は前記HPV−DNAの遺伝子間(inter-gene)領域
に対応する配列を含むフラグメント(またはこれを含む
組換えDNA)にも関するものである。最後に、これら
それぞれのHPV−DNAまたは対応するフラグメント
から構成され得るプローブ及び該プローブを用いるイン
・ヴイトロ診断方法に係るものである。 【0023】ウイルスDNA調製物は6人のヨーロッパ
のEV患者及び2人の南アメリカのEV患者の良性病巣
を削りとったものから選択的に抽出された(ラツナー・
エム・エー(Lutzner,M.A.) 等、1983年、ランセッ
ト(Lancet)ii422−424頁)。HPV−DNAは
平衡塩化セシウム密度勾配遠心法及び/又はエチジウム
ブロミド存在下のシュークロース勾配沈降法により、ク
レムドルフ等の前記の文献、及びオーツ・ジー(Orth.
G.)等の1980年の細胞増殖に関するコールド・スプ
リング・ハーバー会議(Cold Spring Harbor Conf. Cel
l Proliferation)、7巻、259−282頁に以前記載
された操作方法に従って精製された。このDNA調製物
は制限エンドヌクレアーゼで処理され、この消化生成物
をアガロースゲル電気泳動によって分離した(クレムス
ドルフ等の前記文献参照)。更に、患者の1人のいぼ状
突起(rerruca warts)から得られたHPV5,8及び1
2(クレムスドルフ等の前記文献参照)並びにHPV−
2(ハイルマン・シー・エー等、1980年、ジャーナ
ル・ヴイロロジー、36巻、395−407頁、及びオ
ーツ・ジー等、1980年、細胞増殖に関するコールド
・スプリング・ハーバー会議7巻、259−282頁参
照)から、以前に特徴づけられた型とは異なる11の株
が同定され、それによって該DNA類の制限酵素切断の
主要なモデルが提供された。新規なHPVの型には番号
が付与され、1つの型に属する亜型には番号の後にそれ
らの同定年代順に従って文字が付与された。(コギン・
ジエイ・アール(Coggin.J.R.) 等、Cancer Res.、39
巻、545−546頁)。この新規な11種のHPVの
ゲノムをエシエリヒア・コリ(Escherichia Coli)K1
2、C600株内にクローン化した(前記のクレムスド
ルフ等の文献、1983年参照)。エンドヌクレアーゼ
BamHIによって生成されたHPV−24DNAの2
つのフラグメントは例外として、DNAは単位長(unit
ary length)の分子形態で挿入された。これらのDNA
はAvaI ,BamHI及びHindIII の単一切断部
位を用いてプラスミドpBR322(サトクリフエ・ジ
エイ・ジー(Sutcliffe.J.G.) 、1978年Nucleic Ac
ids Res. 、5巻、2721−2728頁)に挿入する
か、又は単一のSacI部位を含む、HPV−5のDN
A由来のHindIII Bフラグメント(前記のクレムス
ドルフ等、1982年)を組込んだ組換えプラスミドに
挿入した。より特異的には、HPV17b及び22は、
HPV−5のDNA由来のHindIII Bフラグメント
を含む組換えプラスミドpBR322及びHPVのDN
Aをただ1ヶ所で切断する酵素(SacI)で切断した
後、単位長のDNA分子形態で挿入された。HPV−1
4aのDNAは、HindIII による該ウイルスDNA
の不完全消化後に単位長のDNA分子形態でプラスミド
pBR322に挿入された。このHindIII はHPV
−14aのゲノムから96.1%及び3.9%の長さを
持つ2つのフラグメントを生成するものである。HPV
−24のBam HI A及びBフラグメント(それぞ
れゲノム長の83.1%及び16.9%に相当する大き
さを持つ)を別々にプラスミドpBR322に挿入し
た。 【0024】単離したクローン及びそれに対応するHP
V源を以下の表1に挙げる。 【0025】 【表1】 【0026】組換えプラスミドを同定するために、プラ
スミドにウイルス配列を挿入するために用いられたエン
ドヌクレアーゼを含めた2種の制限酵素の混合物で処理
した後組換えDNA類および非クローン化HPV−DN
A類の消化生成物の電気泳動移動度を比較した。単離さ
れた断片の数およびサイズから、各々の場合に全ウイル
スゲノムが組込まれたことが示された。非クローンHP
V−DNA類或いはプラスミド配列から切除されたHP
V−DNA類をアガロースゲル電気泳動で分析したとこ
ろ(データは示さず)、DNAサイズの不均一性が認め
られた。HPV14b,19,20および21からのD
NA類は、HPV3a,5,8および12のDNA類と
同様のサイズ(約7700ヌクレオチド対)を有してい
る〔前掲のクレムスドルフ(KREMSDORF)の論文〕が、H
PV15,17a,17b,22および23のDNAは
これより短くHPV9のDNAと同様のサイズ(約72
00ヌクレオチド対)を有している前掲のクレムスドル
フ(KREMSDORF)(1982)およびオルス(ORTH) (1
980)の論文〕。 【0027】クローン化ウイルスゲノムの14個の制限
酵素に対する感受性を分析し、物理的地図が確立された
(図1〜図10)。或るHPV−DNA類の制限地図を
以下に述べる理由により幾つかの図に繰り返し図示し
た。前記(9)の方法によれば、22から33個の切断
部位が局在していた。HPV14aおよび14bの地図
(図4aおよび図4b)とHPV17aおよび17bの
地図(図5)を除けば、これらの地図の間には明らかな
相似性は認められなかった。夫々HPV14aおよび1
4bのDNA上に位置する21個および31個の部位の
中で、HPV−14aのDNAの2個のBamHI切断
部位の1つがHPV−14aのDNAの唯一のBamH
I切断部位と並んでいるときには15個が共通している
ことが判明した。同様に、唯一のBamHI切断部位が
並んでいるときには、HPV−17aのDNA上の29
個の切断部位のうち21個がHPV−17bのDNA上
(全部で26部位)でも等しく認められた。これらの地
図と、EVに関連するHPV類(HPV3a,5,8,
9,10および12)(8,9,16,18および2
0)、皮膚いぼに関連するHPV類(HPV1,2,4
および7)、皮膚粘膜あるいは粘膜の病巣に関連するH
PV類(HPV6b,11a,13および16)(1,
33,19)に対して既に確立された地図との間に、E
V保有日本人男性から単離されたHPVの地図(24)
と密接に関連するHPV−14aに対する地図を除いて
は明らかな相似性はみられなかった。この後者の単離H
PVとHPV−14aとの相違点は、1個の追加Bam
HI部位と1個の追加HindII部位である。2種のウ
イルスにおいて部位AvaI,BamHI,BglI,
EcoRI,HindIIおよびHindIII の位置は同
様であった。交差ハイブリダイゼーション実験により、
これら2種のウイルスが実際に密接に関連していること
が確認された。 【0028】(矢印で示した)幾つかの部位が所在して
いないことに注目されたい。ゲノムの長さの2%未満の
差しかない切断部位は保存されたもの( *)とみなし
た。***を生起しない酵素は次の通りであった。HPV
14aおよび23のDNAに対してはPvuI,Sal
IおよびSmaI;HPV−14bのDNAに対しては
PvuI,SacI,SalIおよびSmaI;HPV
15,17aおよび17bのDNAに対してはBgl
I,PvuI,SalI,SmaI;HPV−19のD
NAに対してはBglI,SacI,SalIおよびS
maI;HPV−20のDNAに対してはEcoRI,
PvuI,SacIおよびSmalI;HPV−21の
DNAに対してはSacIおよびSmaI;HPV−2
2のDNAに対してはBamHI,BglI,Pvu
I,PvuIIおよびSalI;HPV−24のDNAに
対してはBglI,EcoRI,PvuI,SacI,
SalIおよびSmaI。 【0029】既に特徴付けられたEVのHPV−DNA
類(HPV3a,5,8,9,10および12)、皮膚
いぼに関連するHPV−DNA類(HPV1,2,4お
よび7)および粘膜病巣に関連するHPV−DNA類
(HPV6b,11a,13および16)と新たに特徴
付けられたHPV−DNA類との間、並びに新たに特徴
付けられたHPV−DNA類のDNA間の配列相同の有
無を研究した。ろ紙上への付着、および飽和液相中での
DNA−DNAハイブリダイゼーションとそれに続くS
1ヌクレアーゼ消化によるハイブリダイゼーション実験
は、前記した(8,9)偏性(ストリクトまたはストリ
ンジェント)条件下で実施した。特に、HPV類のDN
A類は、前記したように(13)“ニック翻訳”で標識
し、アルカリ性ショ糖勾配(5〜20%)での沈降によ
り分離させた。標識(4000cpm)HPV−DNA
類を、前記したように(8,9)牛胸腺DNA(20μ
g)あるいは非標識HPV−DNA(0.20μg)の
存在下でNaCl 0.48M/EDTA1mM(pH
6.8)中、68℃でインキュベートした。HPV−D
NAプローブの比活性は5.3×107 から2×108
cpm/μgの間で変化した。ハイブリダイゼーション
の程度を、S1ヌクレアーゼに抵抗する画分を目安にし
て調べた。数は、プローブの自然復元(4〜15%)に
ついて校正し相同ハイブリダイゼーション(75〜95
%)について100%に正規化した値を表わす。NDは
“測定せず”の略号である。上記条件下におけるHPV
−DNA類間の交差ハイブリダイゼーションの相対量
を、標識HPV−DNAを非標識HPV−DNAとのハ
イブリダイゼーションの%として表2に示す。 【0030】 【表2】【0031】HPV1、2、4、6b,7および11a
のゲノムと32P標識の新たにクローン化されたEVのH
PV−DNA類との間、或いはEVの非標識HPV−D
NA類とHPV13,16および18に特異なプローブ
との間の交差ハイブリダイゼーションは全くないか或い
は殆んどないことに注目されたい。同様に、飽和再結合
(saturation reassociation) により、HPV14a,
14b,15,17a,17b,19,20,21,2
2,23および24のDNA類とHPV1aおよび11
aのDNA類との間に交差ハイブリダイゼーションは殆
んど認められなかった(表2)。新たにクローン化され
たHPV類のDNA類では、強力な交差ハイブリダイゼ
ーションを示したHPV17aおよび17b、HPV1
4aおよび14bを除いて、相互間かつEVに関連する
他のHPV(HPV3a,5,8,9,10および1
2)のゲノムとの間での交差ハイブリダイゼーションは
殆んど或いは全くみられなかったし、認められたにせよ
50%未満であった。これらの知見から、新しいウイル
ス類が9個の新しいタイプ(型)(HPV14,15,
17,19,20,21,22,23および24)と2
個のサブタイプ(亜型)即ちタイプ14(HPV−14
aと14b)及びタイプ17(HPV−17aと17
b)とに分類されることが確認された。 【0032】同様に、別のHPV類は、分子ハイブリダ
イゼーションの偏性(ストリクト)条件下での配列相同
性の有無に基づいて分類された。これらのグループ(A
からH)を表3に示す。この表には、これらHPV類
(単独で或いは組合せて)のキヤリアの中で診断された
疾患およびその発癌性が示されている。 【0033】 【表3】【0034】HPV5,8,12,14,19,20,
21,22および23のDNA類では、これらの間の交
差ハイブリダイゼーション(グループ相同)のレベルは
5〜38%であり、HPV5,8および12のDNA類
との場合を除いて顕著な交差ハイブリダイゼーション
(4〜13%)は示さない。従って、これらのウイルス
類は前に定義した(9)EVのHPV類のグループの1
部を形成する。 【0035】同様に、相互間で約20%の交差ハイブリ
ダイゼーションを示しかつHPV−9のDNAと約6%
の交差ハイブリダイゼーションを示すHPV9,15お
よび17のDNA類は等しく、前記した(9)EVのH
PV類のグループに属する。タイプ13と31のHPV
類は一つの同じグループに属するものと考えられうる。
また最後に、他のHPV類のゲノムと殆んど相同性を示
さないタイプ1,2,4,24および32のHPV類
は、相互にかつ従来のグループとは異なる他のグループ
の第1のメンバーを形成するものとして考えられる。 【0036】本発明はまた特に、上記したHPV−DN
A類から由来されるDNA断片(フラグメント)および
特に遺伝子E6−E7,E1,L2,L1およびそれら
の遺伝子間領域にそれぞれ対応するDNA断片に関す
る。原点として採った部位に対するこれら各種断片の相
対位置および長さを表4に示す(図1〜図9)。 【0037】 【表4】【0038】HPV−1のゲノム上の遺伝子の位置は、
このゲノムのヌクレオチド配列から推論された〔オー.
ダノス(O.DANOS),エム.カチンカ(M.KA
TINKA)およびエム.ヤニブ(M.YANIV)の
パテント〕。ハイブリダイゼーションの偏性条件(Tm
−29℃)あるいはあまり偏性でない条件(Tm−40
℃)下で形成されたヘテロ二重鎖分子を電子顕微鏡分析
した後、HPV−3,5,8,9,10a,12,1
4,15,17および24のゲノムの物理的地図をHP
V−1の物理的地図および遺伝子地図と関連させて配列
し、HPV−31のそれをHPV6bの物理的地図およ
び遺伝子地図と関連して配列した〔イー.シュワルツ
(E.SCHWARZ)ら、エンボジェー(EMBO
J.)1983,2,2341−2348〕。保存され
た制限酵素部位を並列させた後、HPV10b,28お
よび29の物理的地図をHPV3aおよび10aの物理
的地図に対して配列した。 【0039】表4に示した配位の値は、図1〜図9に示
した物理的地図上で、遺伝子E6,E7,E1,L2お
よびL1およびHPV−1aのゲノムに関するかHPV
−31の場合にはHPV−6bのゲノムに関する遺伝子
間領域と相同なゲノムセグメントの5′および3′末端
の位置を示す。 【0040】遺伝子間領域(調節要素を含む)および隣
接のE6とE7遺伝子(多分腫瘍中で発現される形質転
換の主要遺伝子に相当する)は、別のグループに属する
多くのHPVタイプのゲノム間で(非偏性ハイブリダイ
ゼーション条件下で)形成された、或いは同じグループ
に属する多くのHPVタイプのゲノム間で(偏性ハイブ
リダイゼーション条件下で)形成されたヘテロ二重鎖分
子の電子顕微鏡分析により検出されうる配列相同性を示
さない。遺伝子EI(ウイルスDNAの複製に主に関係
する)および遺伝子L1(ウイルス粒子の主要抗原決定
基を有するウイルスカプシドの主要タンパク質のコーデ
ィング)は、別のグループに属するHPVタイプのゲノ
ム間で(非偏性ハイブリダイゼーション条件下で)形成
された、或いは同じグループに属するHPV類のゲノム
間で(偏性条件下で)形成されたヘテロ二重鎖の分析に
より検出されうる配列相同性を示す。 【0041】E1およびL1領域を含む組換えプラスミ
ドから作成されたプローブを用いて、ケースに応じて偏
性或いは非偏性条件下での分子ハイブリダイゼーション
実験により最大数のHPVタイプを検出することが理論
的に可能である。遺伝子間領域および遺伝子E6および
E7を含む組換えプラスミドから作成されたプローブ
は、或るHPVタイプあるいは関連するHPVタイプを
特異的に検出することができる。 【0042】L2領域(ウイルスカプシドのマイナーな
成分に対するコーディング)は、各種HPVタイプの中
で種々のヌクレオチド配列保存度を示す。 【0043】ウイルスHPV−IP2 およびHPV−
IP4 を単離する条件およびこれらのウイルスからH
PV−DNA類を得る条件を以下により詳しく記載す
る。 【0044】新生物および性器ガンに関連した新しいタ
イプのHPV(HPV−IP2 )の分子クローニング
および特徴づけ 新しいタイプのHPVは、HPVタイプ16に特異な放
射性プローブを用いる非偏性条件下でのハイブリダイゼ
ーションにより子宮頸管ガンから抽出されたDNA中に
存在していることがみとめられた。偏性ハイブリダイゼ
ーション条件下でハイブリダイゼーションを実施したと
きには交差ハイブリダイゼーションは検出されなかっ
た。このHPV−DNAの多数の制限酵素に対する感度
の研究から、酵素BglIIがウイルスDNAを1度切断
していることが知見された。腫瘍から抽出されたDNA
をエンドヌクレアーゼBglIIで消化した後、8kb
(パピローマウイルスのゲノムのサイズ)のDNA分子
を含有する画分をショ糖勾配での遠心により精製した。
8kb分子を、BamHI部位でバクテリオフアージλ
L47.1のDNAに挿入されたプラスミドPL 1
5.5(BglIIおよびBamHIによる単一の切断部
位を含む)から構成されるベクターのBglII部位に挿
入した。組換えDNAを包膜し宿主細菌〔大腸菌(Esch
erichia coli )菌株LA101〕に感染後、組換えフ
ァージに相当する溶菌領域(プラーク)を感染細菌培養
物のレプリカを放射性HPV−16からのDNAを用い
て非偏性条件下でハイブリダイゼーションすることによ
り検出した。ウイルス配列の全体を含む幾つかの組換え
バクテリオフアージを単離した。挿入酵素BglIIによ
りフアージDNAを切断すると、非偏性条件下でHPV
−16プローブとハイブリダイズする8kbフラグメン
トが得られる。原腫瘍のDNAおよび組換えフアージの
DNAを酵素BglIIおよびPstIの混合物で切断す
ると、総分子量がパピロマウイルスのゲノムのサイズに
等しい同一の5個のフラグメントが得られる。新しいH
PVのDNAを組換えパクテリオファージのDNAから
切除し、電気溶離(electroelution)により精製し、プ
ラスミドPL15.5で再クローン化した。ウイルスD
NAの制限地図が、21個の切断部位を位置決めしうる
(図9)18種の制限酵素に対するこのDNAの感受性
に基いて確立された。こうして確立された地図は今まで
に同定されたHPV類のゲノムの地図とは異なってい
る。新しいHPVのDNAと今までに同定されたHPV
類のDNAとの配列相同性を、偏性条件下で行なわれた
レプリカの分子ハイブリダイゼーション実験で分析し
た。検知された相同性は常に5%未満であった。HPV
−16のゲノムで相同性が最大であった。子宮頸管ガン
からの特性づけられた新しいウイルスは新しいタイプの
HPVであり、これを仮にHPV−IP2 と呼称す
る。 【0045】HPV−IP2 のDNAとHPV−1の
DNAとの間で各種条件下で形成されたヘテロ二重鎖分
子を電子顕微鏡で分析すると、これら2種のゲノムの物
理的地図の配列およびHPV−IP2 のDNAが担持
している種々の遺伝子の理論的位置決めが可能であっ
た。 【0046】 【表5】 【0047】精製HPV−IP2 のDNAから作成し
た放射性プローブを使用すれば、これらウイルスの病原
力が測定できる。HPV−IP2 のDNAは、調べた
外性器のボウエノイド丘疹(Bewenoid papula)14例中
1例に、侵入性子宮頸ガン51例中2例に、子宮頸部の
上皮内新生物(neoplasie)28例中1例にみとめられ
た。従って、HPV−IP2 は、HPV−18に比べ
てやや弱くHPV−16に比べてかなり弱い腫瘍形成能
を有する性器向性タイプ(genito-tropic type)のHP
Vである。性器新生物、特に子宮頸管ガンの進行の危険
性を示すHPV類のタイプを診断あるいはスクリーニン
グするための分子プローブを作成することを目的とする
HPV−DNA混合物中に組み入れることが必要であ
る。 【0048】皮膚の前ガン病巣に関連する新しいタイプ
のHPV(HPV−IP4 )の分子クローニングおよ
び特徴づけ 新しいタイプのHPVが、光線(紫外線)角化症の生
検、前ガン皮膚病巣から抽出されたDNA中に、HPV
タイプ5,8および14に特異な放射性プローブを含む
混合物を用いる偏性条件下での分子ハイブリダイゼーシ
ョンにより証明された。ハイブリダイゼーションをタイ
プ1,2,3,7,10,13,16,18,28,I
P−1(前にHPV−31と呼称した)、IP−2およ
びIP−3(前にHPV−32と呼称した)に特異なプ
ローブを用いて行なった場合には交差ハイブリダイゼー
ションは検知されなかった。 【0049】このHPVのDNAの幾つかの制限酵素に
対する感受性を調べたところ、酵素EcoRIがウイル
スDNAを1度切断していることが知見された。エンド
ヌクレアーゼEcoRIにより生検から抽出されたDN
Aを消化させた後、8kb(パピローマウイルスのゲノ
ムのサイズ)のDNA分子を含む画分をショ糖勾配によ
る遠心で精製した。8kb分子をEcoRI部位でバク
テリオファージλgtwes.λBのDNAに挿入し
た。組換えDNAを包膜し、宿主細菌〔大腸菌(Escher
ichia coli )菌株LA101〕の感染後、組換えファ
ージに相当する溶菌プラークを、非偏性条件下でHPV
−8および14からのDNA類の放射性混合物により感
染細菌性培養物のレプリカ(複製物)をハイブリダイゼ
ーションすることにより検出した。ウイルス配列の全体
を含む幾つかの組換えバクテリオファージを単離した。
挿入酵素EcoRIによりファージDNAを切断する
と、非偏性条件下でHPV−5,8および14に特異な
プローブをハイブリダイズする8kbフラグメントが得
られる。原病巣のDNAおよび組換えファージのDNA
を酵素EcoRIおよびPstIの混合物で切断する
と、総分子量がパピローマウイルスのゲノムのサイズに
等しい同一の6個のフラグメントが得られる。新しいH
PVのDNAを組換えバクテリオファージのDNAから
切除し、電気溶離で精製し、プラスミドpSP65で再
クローン化した。ウイルスDNAの制限地図をこのDN
Aの15種の制限酵素に対する感受性によって確立し
た。これにより23個の切断部位の位置決めが可能とな
った(図10)。こうして確立された地図は、今までに
同定されたHPV類のゲノムの地図と異なっていた。新
しいHPVのDNAと今までに同定されたHPV類のD
NAとの配列相同を、偏性条件下で行なったレプリカに
対する分子ハイブリダイゼーション実験により調べた。
いぼ状表皮異形成病巣中で既に同定された或るタイプの
HPV類(HPV−5,8,12,14,19,20,
21および25)のDNAと新しいHPVのDNAとの
間の相同性は50%未満であったが、他のタイプのHP
V類との相同性は認められなかった。こうして光線角皮
症からの特性づけられた新しいウイルスは新しいタイプ
のHPVであり、これを仮にHPV−IP4 と呼称す
る。 【0050】精製HPV−IP4 のDNAから作成さ
れた放射性プローブを使用すると、調べたいぼ状表皮異
形成患者17例中42%に、分析した光線角皮症の生検
y中xでHPV−IP4 が検出された。皮膚ガンの頻
繁な進行を特徴とする病気のいぼ状表皮異形成の患者で
高率であったことと、皮膚の有棘細胞ガンの前駆体と考
えられる光線角化症の病巣の割合に対する関連比から、
HPV−IP4 は腫瘍形成能を有する皮膚向性タイプ
のHPVである。皮膚のガンあるいは前ガン病巣の進行
の危険を示すHPVタイプを診断もしくはスクリーニン
グするための分子プローブを作成することを目的として
いるHPV−DNA類混合物にはこれを組み入れなけれ
ばならない。 【0051】本発明は更に、特に各種HPV−DNA類
の混合物(あるいはこれらHPV−DNA類もしくはそ
れらからの配列を含有するプローブ)に関し、これら混
合物は、多分感染の進行可能性を予知するために各種形
態のパピローマウイルス感染を診断するべく組合せて使
用されうる。本発明の好ましい混合物を表6に例示す
る。 【0052】 【表6】【0053】この表には、混合物を使用して特に診断可
能な疾患の性質も示した。図1〜図9の制限地図の分類
は表6の“構成”欄に示した分類(グループ分け)と一
致していることは注目すべきことである。このために、
添附図面の幾つかの図面に幾つかのプローブが数回示さ
れているのである。 【0054】これらの各混合物は、本発明の新しいプロ
ーブの少なくとも1つを包含するものとして定義づけら
れうる。換言すれば、本発明の診断用組成物は次のもの
を含むものとして定義づけられうる。 【0055】(1)少なくともHPV−2dのDNA、
(2)HPV10b,28および/又は29のDNAの
少なくとも1種、(3)HPV17および/又は24の
DNAの少なくとも1種、(4)HPV14,15,1
7,19,20,21,22および/又は23のDNA
の少なくとも1種、(5)HPV15および/又は17
のDNAの少なくとも1種、(6)HPV−24のDN
A、(7)HPV−14および32のDNA、(8)H
PV−31のDNA、(9)HPV−32のDNA。 【0056】9種のグループのDNAは全ゆる状況下で
互いに異なるように選択されると理解されたい。 【0057】各種形態のいぼあるいは他の皮膚もしくは
粘膜病巣から多くのHPV類が単離されうるが、表に示
した各タイプの疾患の診断に1種あるいは2種以上のH
PV−DNA類を含有する混合物を使用することが好ま
しい。なぜなら他のHPV−DNA類は同タイプの疾患
に同様に介在(intervene) しうると考えられていたから
である。感染の性質およびその進行可能性の診断は、使
用するプローブの数が増すにつれてより有効となるであ
ろう。加えて、各種プローブ混合物を用いて行なうハイ
ブリダイゼーションアッセイにより、罹患疾患の識別
(鑑別)診断を同等にかなりの確率で行ないうる。 【0058】表6には、本発明者らの研究所で単離され
たHPV−DNA類から形成されたプローブのみを記載
した。勿論前記した理由で、別の研究所の研究過程で得
られた同じタイプの感染症を患っている患者において何
度も検出されている他のHPV−DNA類を添加するこ
とにより各種混合物を有利に改良しうる。例えば混合物
7は、上皮内新生物や皮膚ガンへの移行の危険性を有す
るいぼ状表皮異形成中にみられる他のHPV−DNA類
を添加することによってのみ改良されうる。表6におい
て、いくつかの混合物が同じ疾患の診断に特有なものと
して表示されていることに注目されたい。いろいろな混
合物により、腫瘍形成(cancerization)のリスクの少な
い感染症とそのリスクの高い感染症とを区別しうる。例
えば、診断が下される患者から得たウイルスサンプルが
混合物7とハイブリダイゼーションすれば、サンプルが
混合物3のプローブとそれ以上にハイブリダイズした場
合に比べて皮膚ガンに進行するリスクが高いことが示唆
される。 【0059】同様に、混合物5により検出されたEVの
症例では混合物6を用いて検出されたこれら症例に比べ
て腫瘍形成のリスクは高い。混合物4は、混合物5を用
いて検出される症例に比べてより高いリスクを有するE
V症例を識別できるであろう。 【0060】さらに以下に異なるHPV−DNA(ある
いはこれらのHPV−DNAを含むプローブあるいはH
PV−DNAの配列)のその他の混合物を記載する。こ
れらは任意に、起り得る感染の進行の予後経過を測定す
る目的で、異なる形の乳頭腫ウイルス感染の全般的診断
に組み合わせて使用することができる。 【0061】本発明に一致する好ましい混合物は前記表
6に特定されている。本表はまた表の左側に記載した混
合物の使用によって格別に診断し得る疾患の性質も示し
ている。本表に特定したその他のHPV−DNAの制限
地図は図1〜9に示されている。 【0062】HPV−IP2 は、性器腫瘍特に子宮頸
ガンの進行の危険性の検知に使用できる格別な代表的プ
ローブと考えられることを指摘しておく。 【0063】従って本発明は格別に、前記表において混
合物番号として示した1〜10の番号をつけて示した1
0のグループを少なくとも含む診断用キットにも係る。 【0064】これまでは特に、クローン化HPV−DN
A全体のプローブとしての使用について考慮してきた。
しかしそれらはこれらの異なるDNAのクローン化フラ
グメント、特に遺伝子E1あるいはL1及び遺伝子E6
−E7によって置き換ることもできる。 【0065】in vitroにおけるHPV−DNA
検知の基本的原理は当然、厳格(ストリクト)あるいは
弱厳格条件で行なわれるハイブリダイゼーションを含
む。 【0066】操作は例えば下記のように行なわれるが、
記載する診断方法は当然、本発明のプローブ及びプロー
ブの混合物の使用条件を制限するものではないと解され
るものである。 【0067】クローン化HPVのDNA混合物より得た
プローブを使用する試験の目的は、バイオプシー中、病
変部から採取して得た細胞中、あるいはカルノイ(Carno
y)混合液(エタノール、クロロホルム、酢酸、6:3:
1)により固定されパラフィン中に含まれるバイオプシ
ー部分中のHPVの存在を明らかにし、HPVのタイプ
を同定することである。試験は、原理は公知の方法によ
る試料からのDNAの予抽出を必要とし、HPV−DN
A混合物から調製した放射性プローブ(32pあるいは35
sで標識されている)を使用した厳格あるいは弱厳格条
件下での分子ハイブリダイゼーションによるこのDNA
の分析を含む。一般には、各試験はいくつかのプローブ
混合物を必要とする。 【0068】いくつかのハイブリダイゼーション方法が
使用し得る。例えばスポットハイブリダイゼーション法
が使用できる。本方法はDNAの変性の後、DNAアリ
コートをメンブラン(ニトロセルロースあるいはジーン
スクリーンプラス〔Genescreeuplus〕上に沈積させ、各
メンブランを通常の条件下でプローブ混合物とハイブリ
ダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーションさせたメ
ンブランを放射線写真フィルム上に接触露光させること
により放射性ハイブリッドの検知を行なうことから成
る。またレプリカに対するハイブリダイゼーション法を
使用することもできる。本方法は、制限酵素でのDNA
処理により得られたDNAフラグメントのアガロースゲ
ル電気泳動による分離、アルカリ変性後の該フラグメン
トのメンブラン(ニトロセルロースあるいはジーンスク
リーンプラス)上への転写、及び通常の条件下での異な
るプローブ混合物とのそれらのハイブリダイゼーション
から成る。放射性ハイブリッドの形成はやはり、メンブ
ランの放射性写真フィルム上への接触露光によって検知
する。 【0069】放射性プローブは、ニックトランスレーシ
ョン法により標識されたHPV−DNA、あるいは例え
ばSP6型のようなベクター中にインサートされたウイ
ルスDNAの転写により調製されたRNAにより構成さ
れる。放射性プローブを使用すると格別な好感度という
利点が得られるが、例えばビオチン化されており、それ
自体標識された抗体あるいは酵素的、蛍光的あるいはそ
の他の標識を有する抗体により認識可能な抗体によって
認識され得るような非放射性プローブの使用を除外する
ものではない。 【0070】プローブの選択は標本の性質に依る。例え
ばEVを有している可能性がある患者の場合、混合物
1,2,3,4,5,6及び7が使用される。混合物1
及び2はEV及び皮膚イボの異なる診断を可能とする。
プローブ3はEVに関連するHPVの3つのグループの
それぞれの最もよく検知されるものを含んでおり、プロ
ーブ7はEVのガンに関連するHPVのDNAを含んで
おり、大多数のEVの場合の診断を可能にするものであ
り、特にガンに発展し易いHPVのタイプに感染した患
者の同定の診断を可能にするものである。混合物4,5
及び6の使用により、同一の患者に感染したHPVの一
つ以上のタイプを区別することができる。 【0071】従って本発明はさらに、上記したプローブ
のいくつかを含むセットあるいはキットにも係り、特に ──上記した19のHPV−DNAのタイプあるいはサ
ブタイプのそれぞれの代表的なもの、あるいは ──プローブの混合物、好ましくは前記に規定したプロ
ーブの種々のグループあるいは混合物を含むものであ
る。これらのキットは、患者から得たウイルス調製物と
種々のグループあるいは混合物との間のハイブリダイゼ
ーションによるinvitroでの診断試験を目的とす
るものである。 【0072】言うまでもなく今まで記載したことから、
本発明は特異的に想定されるその実施態様あるいは適用
に限定されるものではなく、それどころか全ての変形例
を包含するものであり、特定番号を付され図面中に制限
地図を示したHPV−DNAの特許請求の範囲における
記載は、特許請求の範囲が前記した定義に従って同じタ
イプに分類されるこのHPV−DNAに共通なHPV−
DNAを全て包含することを示すものであり、特に同じ
サブタイプに属するHPV−DNAにおいてはなおさら
そうである。 【0073】さらに図面に示したHPV−32から得ら
れたDNAに関して、それが以下の酵素、AvaI,B
alI,BamHI,ClaI,EcoRI,Hind
III,NdeI,NruI,PvuI,PvuII,Sa
cI,SalI,SmaI,TthIIIあるいはXma
Iのいずれによっても切断されないことが特に指摘され
る。 【0074】また、下記の組換えDNAは1984年1
1月30日に下記の受託番号でC.N.C.M(ナショ
ナルコレクション・オブ・カルチュア・オブ・マイクロ
オーガニズム・オブ・インスティテュート・バスツー
ル、パリ)に寄託されていることも特記しておく。 【0075】 pBR322/HPV2d ………… No.I−379 pBR322/HPV10bA ………… No.I−380 pBR322/HPV10bB ………… No.I−381 pBR322/HPV14a ………… No.I−382 pBR322/HPV14b ………… No.I−383 pBR322/HPV15 ………… No.I−384 pBR322/HPV17a ………… No.I−385 pHPV5 HindIII B/HPV17b … No.I−386 pBR322/HPV19 ………… No.I−387 pBR322/HPV20 ………… No.I−388 pBR322/HPV21 ………… No.I−389 pHPV5 HindIII B/HPV22 …… No.I−390 pBR322/HPV23 ………… No.I−391 pBR322/HPV24a ………… No.I−392 pBR322/HPV24b ………… No.I−393 pBR322/HPV28 ………… No.I−394 pBR322/HPV29 ………… No.I−395 pBR322/HPV31 ………… No.I−396 pSP64/HPV32 ………… No.I−397 pLI55/IP2 ………… No.I−450 pSP65/IP4 ………… No.I−449 本発明はさらに、前に言及した異なる乳頭腫ウイルスか
ら得た遺伝子E6及びE7の発現の産物にも特に係る。
それ等は有効量で投与すれば乳頭腫ウイルスに関連する
腫瘍の進行に対する抵抗性を宿主に生起することができ
るワクチンの活性主成分として使用することができる。 【0076】本発明はまた、哺乳動物の免疫化により得
られる血清にも係る。該血清は患者に有効量で特に非経
口的に投与可能な血清調製物とし得、それは対応する乳
頭腫ウイルスのタイプあるいはサブタイプにより生起さ
れた感染を退行させ得る。 【0077】問題の種類の発現のポリペプチド生成物を
得ること、特に適当なプロモータのコントロール下にベ
クターにE6及び/又はE7配列を結合すること、乳頭
腫ウイルスが問題のプロモーターを認識し易く、それに
関する配列を発現し易い細胞宿主の形質転換から成る遺
伝子工学の技術によるものは、同業の通常の能力を有す
る者に対して強調する必要はない。 【0078】このように本発明は、問題の種類の主成分
(発現生成物あるいは対応抗体)を生理的に許容可能な
薬理学的担体と共に含む、薬理学的使用を目的とする組
成物にも係る。特に問題の種類の組成物が非経口的に投
与される場合は、担体は注射可能な飽和溶液により構成
される。 【0079】最後に、参照した文献の書誌目録を以下に
記した。これは読者が本テキストを十分に理解するため
に有用であると考えられる範囲において、先行技術水準
の記載の要件を満すものである。この理由から、これら
の文献の内容は記載の一部と考えられるべきものであ
る。 【0080】参 考 文 献 (1)エム・ダースト(M.Durst) 他、プロク・ナトル・
アカド・スシ(Proc.Nafl.Acad.Sci)、U.S.A,8
0:3812−3815。 【0081】(2)ジエイ・アール・コギン・ジュニア
(Coggin, j.r.,Jr) 他、1979、カンサー・レス(Can
cer Res.) ,39:545−546。 【0082】(3)エル・ギスマン(Gissmann,L.) 他、
1982、ジエイ・ヴイロル(J.Virol.)44:393−
400。 【0083】(4)エム・グリーン(Green,M.)他、19
82、プロク・ナトル・アカド・スシ、U.S.A.,
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C.A.)他、1980、ヴイロル(Virol.)36:395:
407。 【0085】(6)エス・ジヤブロンスカ(Jablonska,
S.)他、1972、カンサー・レス、32:583−5
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2、スプリンガー・セミン・イムノ・パソール(Springa
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4:967−969。
【図面の簡単な説明】
【図1】HPV1a,HPV2dおよびHPV4aの制
限地図を示す。 【図2】HPV3a,HPV10a,HPV10b,H
PV28およびHPV29の制限地図を示す。 【図3】HPV−5a,HPV−17aおよびHPV−
24の制限地図を示す。 【図4a】HPV−5a,HPV−8,HPV−12,
HPV−14aおよびHPV−14bの制限地図を示
す。 【図4b】HPV−19,HPV−20,HPV−2
1,HPV−22およびHPV−23の制限地図を示
す。 【図5】HPV−9,HPV−15,HPV−17aお
よびHPV−17bの制限地図を示す。 【図6】HPV−24の制限地図を示す。 【図7】HPV−5a,HPV−8,HPV−14bお
よびHPV−32の制限地図を示す。 【図8】HPV−13およびHPV−31の制限地図を
示す。 【図9】HPV−IP2およびHPV−IP4の制限地
図を示す。
限地図を示す。 【図2】HPV3a,HPV10a,HPV10b,H
PV28およびHPV29の制限地図を示す。 【図3】HPV−5a,HPV−17aおよびHPV−
24の制限地図を示す。 【図4a】HPV−5a,HPV−8,HPV−12,
HPV−14aおよびHPV−14bの制限地図を示
す。 【図4b】HPV−19,HPV−20,HPV−2
1,HPV−22およびHPV−23の制限地図を示
す。 【図5】HPV−9,HPV−15,HPV−17aお
よびHPV−17bの制限地図を示す。 【図6】HPV−24の制限地図を示す。 【図7】HPV−5a,HPV−8,HPV−14bお
よびHPV−32の制限地図を示す。 【図8】HPV−13およびHPV−31の制限地図を
示す。 【図9】HPV−IP2およびHPV−IP4の制限地
図を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
C12R 1:92)
(C12Q 1/68
C12R 1:92)
(72)発明者 ミツシエル・フアーヴル
フランス国、75015・パリ、リユ・ギル
ー、7
(72)発明者 デイナ・クレムスドルフ
フランス国、75013・パリ、リユ・エス
キロル、35
(72)発明者 オデール・クロワツサン
フランス国、75013・パリ、リユ・オー
ギユスト・ランソン、19
(72)発明者 ジエラール・ペオ−アルノーデ
フランス国、93100・モントロイユ、ア
ヴニユ・ポール・シニヤツク、25
(72)発明者 シルヴイ・ボードウノン
フランス国、77450・エズブリ、モント
リ、アヴニユ・フオツシユ、108
(56)参考文献 J.INVEST.DERMATO
L.VOL.80 (1983) P.436−
440
J.VIROL.,VOL.43
(1982) P.436−447
J.VIROL.,VOL.48
(1983) P.340−351
PROC.NATL,ACAD.SC
I.U.S.A.,VOL.80
(1983) P.3812−3815
(58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名)
C12Q 1/68
G01N 33/574
G01N 33/577
C12N 15/37
BIOSIS(DIALOG)
WPI(DIALOG)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 1.(i)HPV−14a,HPV−14b,HPV−
15,HPV−17a,HPV−17b,HPV−1
9,HPV−20,HPV−21,HPV−22,HP
V−23,HPV−24,HPV−28,HPV−2
9,HPV−31,HPV−32,HPV−IP2,お
よびHPV−IP4からなる群から選択される乳頭腫ウ
イルスから得られる約7,000〜約8,000塩基対
からなり、明細書記載の図1〜9の制限地図の一つを有
するヒト乳頭腫ウイルス(HPV)の精製されたDN
A、又は該乳頭腫ウイルスの1つに特異的であり、スト
リンジェント条件下で該乳頭腫ウイルスと安定なハイブ
リダイゼーションをすることができる前記精製DNAの
フラグメント、および(ii)前記(i)に記載のHPV
DNA又はDNAフラグメントとは異なる少なくとも
一つの別のHPV DNA、を含有する、ヒト乳頭腫ウ
イルス感染の検出のための組成物。
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