JP2776634B2 - グリコプロテイン ▲ＩＩ▼ｂ／▲ＩＩＩ▼ａに対するヒト型モノクローナル抗体 - Google Patents
グリコプロテイン ▲ＩＩ▼ｂ／▲ＩＩＩ▼ａに対するヒト型モノクローナル抗体Info
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、ヒトグリコプロテイン（Glycoprotein） I
I b/III a（GP II b/III a）に対するヒト型モノクロー
ナル抗体（以下MCAと略す）とそれを産生するハイブリ
ドーマに関する。
I b/III a（GP II b/III a）に対するヒト型モノクロー
ナル抗体（以下MCAと略す）とそれを産生するハイブリ
ドーマに関する。
背景技術 血栓症の発現と進展に血小板が重要な役割を果たして
いることが明らかになり、抗血小板薬療法が抗血栓療法
の１つとして注目されてきた。血栓は、血管の内皮細胞
が何らかの原因で剥離すると、von Willebrand因子（vW
Fと略す）に対するレセプターをもっている血小板が内
皮下に粘着し、活性化され、放出反応と凝集を起こし、
血小板血栓が形成される。この血小板血栓の形成におい
て、粘着におけるvWFに対する血小板上のレセプターはG
lycoprotein I b（GP I b）であり、血小板凝集は、血
小板膜上のGlycoprotein II b/III a（GP II b/III
a）同士がフィブリノーゲン（Fibrinogen）（Fbg）また
はvWFを介して結合することにより起きることがわかっ
ており、そのそれぞれの結合部位についても研究されて
いる。
いることが明らかになり、抗血小板薬療法が抗血栓療法
の１つとして注目されてきた。血栓は、血管の内皮細胞
が何らかの原因で剥離すると、von Willebrand因子（vW
Fと略す）に対するレセプターをもっている血小板が内
皮下に粘着し、活性化され、放出反応と凝集を起こし、
血小板血栓が形成される。この血小板血栓の形成におい
て、粘着におけるvWFに対する血小板上のレセプターはG
lycoprotein I b（GP I b）であり、血小板凝集は、血
小板膜上のGlycoprotein II b/III a（GP II b/III
a）同士がフィブリノーゲン（Fibrinogen）（Fbg）また
はvWFを介して結合することにより起きることがわかっ
ており、そのそれぞれの結合部位についても研究されて
いる。
現在までに、血小板の粘着・凝集・放出などの血小板
機能や実験的血栓形成を抑制する多数の抗血小板剤が開
発されてきた。しかし、これらの多くはその薬剤の作用
の一面として血小板凝集抑制能を有するものであり、特
異性が低く、副作用の点で問題がある。例えば、鎮痛解
熱剤としても有名なアスピリンは、消化管出血、血小板
のトロンボキサンA2と血管内皮でのプロスタサイクリン
合成阻害という副作用がある。また、チクロピジンの場
合は、胃腸症状、肝障害、白血球減少などの副作用が観
察されている。
機能や実験的血栓形成を抑制する多数の抗血小板剤が開
発されてきた。しかし、これらの多くはその薬剤の作用
の一面として血小板凝集抑制能を有するものであり、特
異性が低く、副作用の点で問題がある。例えば、鎮痛解
熱剤としても有名なアスピリンは、消化管出血、血小板
のトロンボキサンA2と血管内皮でのプロスタサイクリン
合成阻害という副作用がある。また、チクロピジンの場
合は、胃腸症状、肝障害、白血球減少などの副作用が観
察されている。
また、近年、マウス型MCAの作製技術の確立にともな
い、抗血小板マウス型MCAを抗血小板剤として使用する
試みが行われている。その１例としては、H.K.Goldらの
行ったもので〔H.K.Gold,et.al.,J.Clin.Invest.,86 65
1−659（1990）〕、ヒトGP II b/III aに特異的でかつ
血小板凝集を抑制するマウス型MCAを作製し、臨床治療
を行っている。しかし、マウス型であるため、ヒトでの
治療では、血小板凝集の抑制効果はあるものの、半減期
・抗原性の点で問題があり、治療・予防としては、完全
なものとは思われない。
い、抗血小板マウス型MCAを抗血小板剤として使用する
試みが行われている。その１例としては、H.K.Goldらの
行ったもので〔H.K.Gold,et.al.,J.Clin.Invest.,86 65
1−659（1990）〕、ヒトGP II b/III aに特異的でかつ
血小板凝集を抑制するマウス型MCAを作製し、臨床治療
を行っている。しかし、マウス型であるため、ヒトでの
治療では、血小板凝集の抑制効果はあるものの、半減期
・抗原性の点で問題があり、治療・予防としては、完全
なものとは思われない。
そこで、ヒトに投与し安全でかつ血栓症の予防及び治
療に役立てるには、マウス由来でなく、ヒト由来のMCA
が不可欠となる。一般にヒト由来のMCAは、GP II b/III
a特異的でかつ血小板凝集阻害活性を有する抗体産生能
力を持つヒトＢリンパ球と、ミエローマ細胞等のリンパ
系樹立細胞との融合によって得られるハイブリドーマか
ら産生されるか、または上記ヒトＢリンパ球をEBウイル
スによって形質転換することによって得られるリンパ芽
球様細胞から産生される。
療に役立てるには、マウス由来でなく、ヒト由来のMCA
が不可欠となる。一般にヒト由来のMCAは、GP II b/III
a特異的でかつ血小板凝集阻害活性を有する抗体産生能
力を持つヒトＢリンパ球と、ミエローマ細胞等のリンパ
系樹立細胞との融合によって得られるハイブリドーマか
ら産生されるか、または上記ヒトＢリンパ球をEBウイル
スによって形質転換することによって得られるリンパ芽
球様細胞から産生される。
1980年頃から現在に至るまで、多くのヒト型MCA作製
研究が行われてきたが、上記の両方法ともにそれぞれ固
有の問題をかかえており、マウス型MCAのように確立し
た技術となっていない。しかし、もし効率よくヒトＢリ
ンパ球を免疫感作でき、かつヒトGP II b/III aに特異
的で血小板凝集阻害能を有するヒト型MCA産生能のある
ハイブリドーマが得られるならば、これから得られるMC
Aは生産性が高く、かつ、医薬品としての安全性上も望
ましいものとなる。
研究が行われてきたが、上記の両方法ともにそれぞれ固
有の問題をかかえており、マウス型MCAのように確立し
た技術となっていない。しかし、もし効率よくヒトＢリ
ンパ球を免疫感作でき、かつヒトGP II b/III aに特異
的で血小板凝集阻害能を有するヒト型MCA産生能のある
ハイブリドーマが得られるならば、これから得られるMC
Aは生産性が高く、かつ、医薬品としての安全性上も望
ましいものとなる。
GP II b/III aに特異的に結合し、ヒトの血小板凝集
を抑制するマウス型モノクローナル抗体は1985年以来、
多くの論文に発表されている（例えば、B.S.Collerら、
Blood,Vol.86,No.3,1986,783−786頁）。
を抑制するマウス型モノクローナル抗体は1985年以来、
多くの論文に発表されている（例えば、B.S.Collerら、
Blood,Vol.86,No.3,1986,783−786頁）。
また、GP II b/III aに特異的に結合するヒト型モノ
クローナル抗体が、D.J.Nugentら、Blood,Vol.70,No.1,
1987,16−22頁；及びPCT/US89/05418に記載されてい
る。
クローナル抗体が、D.J.Nugentら、Blood,Vol.70,No.1,
1987,16−22頁；及びPCT/US89/05418に記載されてい
る。
しかしながら、GP II b/III aに特異的に結合し、且
つヒト血小板凝集を抑制する能力を有するヒト型モノク
ローナル抗体は知られていない。
つヒト血小板凝集を抑制する能力を有するヒト型モノク
ローナル抗体は知られていない。
発明の開示 従って、本発明は、ヒト血小板のGP II b/III aに結
合し且つヒト血小板凝集を抑制する能力を有するヒト型
モノクローナル抗体を、提供するものである。
合し且つヒト血小板凝集を抑制する能力を有するヒト型
モノクローナル抗体を、提供するものである。
本発明はまた、ヒト・リンパ球とマウス・ミエローマ
細胞とを融合することによって形成される、前記のモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマ又はその子孫
に関する。
細胞とを融合することによって形成される、前記のモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマ又はその子孫
に関する。
本発明はまた、前記ハイブリドーマを培養することを
特徴とする、前記モノクローナル抗体の製造方法に関す
る。
特徴とする、前記モノクローナル抗体の製造方法に関す
る。
本発明はまた、前記モノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマを選択することを特徴とする、ハイブリド
ーマの製造方法に関する。
イブリドーマを選択することを特徴とする、ハイブリド
ーマの製造方法に関する。
図面の簡単な説明 図１は、Ca++の存在下、または非存在下におけるGP I
I b/III aに対する本発明のヒト型MCAの結合を示すグラ
フである。（ａ）はICF2C8の結合を、（ｂ）はIAD2−１
の結合を示す。
I b/III aに対する本発明のヒト型MCAの結合を示すグラ
フである。（ａ）はICF2C8の結合を、（ｂ）はIAD2−１
の結合を示す。
図２は、FbgとGP II b/III aの結合に対する本発明の
ヒト型MCAの影響を示すグラフである。
ヒト型MCAの影響を示すグラフである。
図３は、vWFとGP II b/III aの結合に対する本発明の
ヒト型MCAの影響を示すグラフである。
ヒト型MCAの影響を示すグラフである。
図４は、ICF2C8の血小板表面のGP II b/III aへの結
合能を示すflow cytometryのチャートである。（ａ）
は抗体を全く反応させなかった場合、（ｂ）は抗GP II
b/III aヒト型MCAを反応させず、FITC標識化抗ヒトIgM
ヤギ抗体のみを血小板と反応させた場合、（ｃ）はICF2
C8を反応後、FITC標識化抗ヒトIgMヤギ抗体を反応させ
た場合を示す。
合能を示すflow cytometryのチャートである。（ａ）
は抗体を全く反応させなかった場合、（ｂ）は抗GP II
b/III aヒト型MCAを反応させず、FITC標識化抗ヒトIgM
ヤギ抗体のみを血小板と反応させた場合、（ｃ）はICF2
C8を反応後、FITC標識化抗ヒトIgMヤギ抗体を反応させ
た場合を示す。
図５は、ICF2C8の血小板凝集抑制活性を示す図であ
る。
る。
発明を実施するための最良の形態 本発明において用いられるヒト・リンパ球は、特発性
血小板減少症（以下ITPという）患者の脾臓、リンパ
節、末梢血、骨髄、扁桃、アデノイド等の中に含まれて
いる。本発明の目的のためには、いかなる材料のリンパ
球でも用いることができるが、望ましくはITP患者由来
のリンパ節、脾臓、扁桃である。
血小板減少症（以下ITPという）患者の脾臓、リンパ
節、末梢血、骨髄、扁桃、アデノイド等の中に含まれて
いる。本発明の目的のためには、いかなる材料のリンパ
球でも用いることができるが、望ましくはITP患者由来
のリンパ節、脾臓、扁桃である。
マウスのミエローマ細胞としては、８−アザグアニン
耐性株を用いるのが有利であり、公知のものとしては、
BALB/CマウスのP3×65Ag8株、P3−NS1/1−Ag4−１株、P
3×63AgU1株、SP2/OAg14株、P3×63Ag8.6.5.3株、MPC11
−45.6.TG1.7株、SP−１株等がある。
耐性株を用いるのが有利であり、公知のものとしては、
BALB/CマウスのP3×65Ag8株、P3−NS1/1−Ag4−１株、P
3×63AgU1株、SP2/OAg14株、P3×63Ag8.6.5.3株、MPC11
−45.6.TG1.7株、SP−１株等がある。
本発明においては、ヒトリンパ球とマウスミエローマ
細胞融合に先立って、ヒトリンパ球を補体とヒトリンパ
球に対するマウスMCA〔例えば、オルト・ダイアグノス
ティク社（Ortho Diagnostic社）のOKT3〕とで処理し、
あるいはAETで処理した羊赤血球とFicollとで処理し、
Ｔリンパ球を除去しておくことが望ましい。
細胞融合に先立って、ヒトリンパ球を補体とヒトリンパ
球に対するマウスMCA〔例えば、オルト・ダイアグノス
ティク社（Ortho Diagnostic社）のOKT3〕とで処理し、
あるいはAETで処理した羊赤血球とFicollとで処理し、
Ｔリンパ球を除去しておくことが望ましい。
本発明のヒト型MCAを作成するに際しては、例えばヒ
ト固型リンパ組織をITP患者から手術によって摘出し、
摘出組織をハサミとメスによっておだやかにほぐし、細
胞分散液を得る。細胞分散液からＴリンパ球を除去する
ために次の２つの方法を用いる。
ト固型リンパ組織をITP患者から手術によって摘出し、
摘出組織をハサミとメスによっておだやかにほぐし、細
胞分散液を得る。細胞分散液からＴリンパ球を除去する
ために次の２つの方法を用いる。
（１）細胞分散液をFicoll−Paque層に重層し、遠心す
ることによってリンパ球を分離する。さらに、補体1/2
容と抗ヒトＴリンパ球・マウスMCAで処理し、あらかじ
めＴリンパ球を破壊し、残ったＢリンパ球を遠心分離す
る。
ることによってリンパ球を分離する。さらに、補体1/2
容と抗ヒトＴリンパ球・マウスMCAで処理し、あらかじ
めＴリンパ球を破壊し、残ったＢリンパ球を遠心分離す
る。
（２）細胞分散液を、AET処理した羊赤血球と混合し、F
icoll−Paque遠心法によりＢ細胞を分離する。これらの
方法を用いると、未処理のリンパ球を用いる場合よりも
ハイブリドーマの生成率が上昇する。
icoll−Paque遠心法によりＢ細胞を分離する。これらの
方法を用いると、未処理のリンパ球を用いる場合よりも
ハイブリドーマの生成率が上昇する。
かくして得られたヒトリンパ球とマウス・ミエローマ
細胞とを融合する。例えばヒトリンパ球とミエローマ細
胞を10:1〜1:100、好ましくは1:1〜1:10の比率で混合
し、適当な細胞融合溶液、例えば約35％ポリエチレング
リコール（分子量1,000〜6,000程度）および約7.5％ジ
メチルスルホキシドを含むRPMI1640を加えて、室温〜37
℃で１〜数分間撹拌し、その後10％ウシ胎児血清（FC
S）添加RPMI1640で徐々に希釈し、洗浄の後、HAT（ヒポ
キサンチン−アミノプテリン−チミジン）選択培養液に
て細胞濃度が１〜５×105個/mlとなるように調整する。
細胞とを融合する。例えばヒトリンパ球とミエローマ細
胞を10:1〜1:100、好ましくは1:1〜1:10の比率で混合
し、適当な細胞融合溶液、例えば約35％ポリエチレング
リコール（分子量1,000〜6,000程度）および約7.5％ジ
メチルスルホキシドを含むRPMI1640を加えて、室温〜37
℃で１〜数分間撹拌し、その後10％ウシ胎児血清（FC
S）添加RPMI1640で徐々に希釈し、洗浄の後、HAT（ヒポ
キサンチン−アミノプテリン−チミジン）選択培養液に
て細胞濃度が１〜５×105個/mlとなるように調整する。
これを0.2mlずつ、例えば96穴プレートに分柱し、５
％CO2を含む空気中で35〜38℃で２〜３週間培養する。9
6穴プレートにはフィーダー相としてマウス腹腔滲出細
胞を入れて置き、融合した細胞を入れる直前にその培養
液を除去する。HAT培養液中ではハイブリドーマのみが
生存し、８−アサグアニン耐性のミエローマ細胞及びミ
エローマ同士の融合細胞は生存し得ない（未融合の抗体
産生細胞は数日で死滅する）。
％CO2を含む空気中で35〜38℃で２〜３週間培養する。9
6穴プレートにはフィーダー相としてマウス腹腔滲出細
胞を入れて置き、融合した細胞を入れる直前にその培養
液を除去する。HAT培養液中ではハイブリドーマのみが
生存し、８−アサグアニン耐性のミエローマ細胞及びミ
エローマ同士の融合細胞は生存し得ない（未融合の抗体
産生細胞は数日で死滅する）。
培養後、培養液中に産生された抗体のGP II b/III a
への結合活性とFbg・GP II b/III aの結合阻害活性をチ
ェックし、目的とする抗体を産生しているハイブリドー
マのみを選び出す。そして、そのハイブリドーマを取り
出し、限界希釈法によってクローニングし、MCAを安定
に産生するサブクローンを樹立する。
への結合活性とFbg・GP II b/III aの結合阻害活性をチ
ェックし、目的とする抗体を産生しているハイブリドー
マのみを選び出す。そして、そのハイブリドーマを取り
出し、限界希釈法によってクローニングし、MCAを安定
に産生するサブクローンを樹立する。
このようにして得られた本発明の抗GP II b/III a・
ヒトMCAを産生するマウス−ヒトハイブリドーマは、凍
結して保存することができる。かかるハイブリドーマの
セルライン（細胞株）及び／又はそれに由来する細胞株
を適当な方法で大量に培養すると、培養上清から本発明
の目的とするヒト型MCAを得ることができる。また、こ
のハイブリドーマを動物に移植して腫瘍化し、その腹水
や血清からヒト型MCAを得ることもできる。
ヒトMCAを産生するマウス−ヒトハイブリドーマは、凍
結して保存することができる。かかるハイブリドーマの
セルライン（細胞株）及び／又はそれに由来する細胞株
を適当な方法で大量に培養すると、培養上清から本発明
の目的とするヒト型MCAを得ることができる。また、こ
のハイブリドーマを動物に移植して腫瘍化し、その腹水
や血清からヒト型MCAを得ることもできる。
以上の如くして得られた本発明の抗GP II b/III a・
ヒト型MCAのうち、ICF2C8は次の様な特性を有してい
た。
ヒト型MCAのうち、ICF2C8は次の様な特性を有してい
た。
（１）ヒト血小板より得られたGP II b/III aを固定化
したELISAで結合陽性を示した。
したELISAで結合陽性を示した。
（２）in vitroでFbgとGP II b/III aの結合を阻害し
た。
た。
（３）in vitroでvWFとGP II b/III aの結合を阻害し
た。
た。
（４）aggregometerを使った測定系でヒト血小板のADP
またはコラーゲンによる凝集を阻害した。
またはコラーゲンによる凝集を阻害した。
（５）本発明のヒト型MCAであるICF2C8は、サブクラス
がIgMであり、その軽鎖がλであった。
がIgMであり、その軽鎖がλであった。
GP II b/III aに特異的に結合し、且つ赤小板凝集を
抑制する本発明のヒト型モノクローナル抗体は、例えば
血栓症の予防又は治療のための血小板凝集抑制剤の活性
成分として期待される。しかしながら、この用途のため
には、生来の（native）モノクローナル抗体のみなら
ず、その特異的結合能を有する活性断片、例えばFab,F
（ab′）２等も使用することができる。従って、本発明
は、この様なモノクローナル抗体の活性断片も包含す
る。これらの断片は、例えば新生化学実験講座第12巻18
5〜195頁、東京化学同人発行に記載されている様な常法
に従って製造することができる。
抑制する本発明のヒト型モノクローナル抗体は、例えば
血栓症の予防又は治療のための血小板凝集抑制剤の活性
成分として期待される。しかしながら、この用途のため
には、生来の（native）モノクローナル抗体のみなら
ず、その特異的結合能を有する活性断片、例えばFab,F
（ab′）２等も使用することができる。従って、本発明
は、この様なモノクローナル抗体の活性断片も包含す
る。これらの断片は、例えば新生化学実験講座第12巻18
5〜195頁、東京化学同人発行に記載されている様な常法
に従って製造することができる。
実施例 以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１ （１）細胞融合 （ａ）リンパ球の調製 ITP患者から手術によって摘出された脾臓をハサミと
メスによって細かくほぐし、培地Ａ〔RPMI1640−10％ウ
シ胎児血清（FCS）−2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナ
トリウム−20μg/ml L−セリン−0.05u/mlヒトインシュ
リン−80μg/mlゲンタマイシン硫酸塩）に細胞を懸濁し
た。このcell細胞懸濁液をFicoll−Paque液に重層し、
1,500rpmで20分間遠心した。Ficoll−Paqueの上に集積
した細胞を取り出し、リン酸緩衝液（PBS）で１回、PRM
I1640で２回遠心洗浄し、最終的にRPMI1640中に１×107
cells/mlに懸濁させてリンパ球を得た。
メスによって細かくほぐし、培地Ａ〔RPMI1640−10％ウ
シ胎児血清（FCS）−2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナ
トリウム−20μg/ml L−セリン−0.05u/mlヒトインシュ
リン−80μg/mlゲンタマイシン硫酸塩）に細胞を懸濁し
た。このcell細胞懸濁液をFicoll−Paque液に重層し、
1,500rpmで20分間遠心した。Ficoll−Paqueの上に集積
した細胞を取り出し、リン酸緩衝液（PBS）で１回、PRM
I1640で２回遠心洗浄し、最終的にRPMI1640中に１×107
cells/mlに懸濁させてリンパ球を得た。
（ｂ）細胞融合 リンパ球を10％human B cell grouth factorまたは１
％Pokeweed Mitogenの入った10％FCS−RPMI1640培地で
３〜４日培養した。そのリンパ球３×107細胞とマウス
・ミエローマP3U1cells（３×107細胞）とをRPMI1640培
地で混合し、細胞を遠心沈澱（1,600rpm,5分間）させ
た。上清を除去し、その細胞ペレットをタッピングによ
ってほぐし、1mlのポリエチレングリコール溶液（35％V
/Vポリエチレングリコール＃1000−7.5％V/Vジメチルス
ルホキシド−RPMI1640中）をゆっくり加え、室温で１分
間放置した。
％Pokeweed Mitogenの入った10％FCS−RPMI1640培地で
３〜４日培養した。そのリンパ球３×107細胞とマウス
・ミエローマP3U1cells（３×107細胞）とをRPMI1640培
地で混合し、細胞を遠心沈澱（1,600rpm,5分間）させ
た。上清を除去し、その細胞ペレットをタッピングによ
ってほぐし、1mlのポリエチレングリコール溶液（35％V
/Vポリエチレングリコール＃1000−7.5％V/Vジメチルス
ルホキシド−RPMI1640中）をゆっくり加え、室温で１分
間放置した。
次に、これに2mlのRPMI1640を加えて、１分間放置
し、さらに2mlのRPMI1640を加えて、２分間放置し、次
に4mlのHAT培地（培地Ａ中95μＭヒポキサンチン−0.4
μＭアミノプテリン−16μＭチミジン）を加えて２分間
放置し、次いで8mlのHAT培地を加えて２分間放置し、そ
して24mlのHAT培地を加えて、37℃で30分間放置した。
最終的にHAT培地で75ないし150mlとした。
し、さらに2mlのRPMI1640を加えて、２分間放置し、次
に4mlのHAT培地（培地Ａ中95μＭヒポキサンチン−0.4
μＭアミノプテリン−16μＭチミジン）を加えて２分間
放置し、次いで8mlのHAT培地を加えて２分間放置し、そ
して24mlのHAT培地を加えて、37℃で30分間放置した。
最終的にHAT培地で75ないし150mlとした。
これを約200μずつ96ウエルの平らな培養プレード
に接種した。なお、この培養プレードには、前もってIC
Rマウス（雄性）の腹腔滲出細胞を２×104細胞／ウエル
ずつ接種し融合した細胞を接種する直前に培養液を除去
し、融合細胞を入れた。この培養プレートを37℃でCO2
−インキュベーター中で培養した。培地は１週間毎に、
半量ずつHT培地（HATからアミノプテリンを省いたも
の）で置換して、ハイブリドーマ・クローンが出現する
まで培養を続けた。
に接種した。なお、この培養プレードには、前もってIC
Rマウス（雄性）の腹腔滲出細胞を２×104細胞／ウエル
ずつ接種し融合した細胞を接種する直前に培養液を除去
し、融合細胞を入れた。この培養プレートを37℃でCO2
−インキュベーター中で培養した。培地は１週間毎に、
半量ずつHT培地（HATからアミノプテリンを省いたも
の）で置換して、ハイブリドーマ・クローンが出現する
まで培養を続けた。
（２）スクリーニング ハイブリドーマコロニーが出現した時点において、ヒ
トGP II b/III aに対する結合活性とFbg・GP II b/III
a結合阻害活性を、ウエル毎に下記（ａ）（ｂ）の方法
で測定し、陽性を示したコロニーのハイブリドーマをク
ローニングした。
トGP II b/III aに対する結合活性とFbg・GP II b/III
a結合阻害活性を、ウエル毎に下記（ａ）（ｂ）の方法
で測定し、陽性を示したコロニーのハイブリドーマをク
ローニングした。
（ａ）ヒトGP II b/III aに対する結合活性 ヒトGP II b/III aをＡバッファー〔127mM Ca++/90mM
Mg++/PBS（pH7.2）〕で２μg/mlに希釈し、96ウエルEL
ISAプレートに50μ/wellで入れ、４℃で一晩静置し
た。その後GP II b/III a溶液をすて、10％FCS/Aバッフ
ァーを200μ/wellで入れ、37℃,120分置いた。0.002
％ヒビデン（登録商標）（ICI社）で３回洗浄後、ハイ
ブリドーマの培養上清を50μ/wellで入れ、37℃,60分
反応させた。
Mg++/PBS（pH7.2）〕で２μg/mlに希釈し、96ウエルEL
ISAプレートに50μ/wellで入れ、４℃で一晩静置し
た。その後GP II b/III a溶液をすて、10％FCS/Aバッフ
ァーを200μ/wellで入れ、37℃,120分置いた。0.002
％ヒビデン（登録商標）（ICI社）で３回洗浄後、ハイ
ブリドーマの培養上清を50μ/wellで入れ、37℃,60分
反応させた。
0.002％ヒビデンで３回洗浄した後、GP II b/III aに
結合したヒト型MCAを検出するため、10％FCS/Aバッファ
ーで104倍に希釈したアルカリホスファターゼ標識化抗
ヒトIgGを50μ/wellで入れ、37℃,60分反応させた。
0.002％ヒビデンで５回洗浄後、ｐ−ニトロリン酸２ナ
トリウムを0.25mM MgCl2/1Mジエタノールアミン（pH9.
8）に10mg/mlになるように溶解し、100μ/wellで入
れ、室温で適度に発色させた。その後、405nmの吸光度
を測定して、GP II b/III aに対する結合活性を調べ
た。
結合したヒト型MCAを検出するため、10％FCS/Aバッファ
ーで104倍に希釈したアルカリホスファターゼ標識化抗
ヒトIgGを50μ/wellで入れ、37℃,60分反応させた。
0.002％ヒビデンで５回洗浄後、ｐ−ニトロリン酸２ナ
トリウムを0.25mM MgCl2/1Mジエタノールアミン（pH9.
8）に10mg/mlになるように溶解し、100μ/wellで入
れ、室温で適度に発色させた。その後、405nmの吸光度
を測定して、GP II b/III aに対する結合活性を調べ
た。
（ｂ）Fbg・GP II b/III a結合阻害活性 ヒトフィブリノーゲン（Fbg）をＡバッファーで10μg
/mlに希釈し、96ウエルELISAプレートに100μ/wellで
入れ、37℃,60分静置した。その後、１％BSA/1％FCS/ハ
ンクス液でウエルを洗浄した。10％FCS/0.1％NaN3/Aバ
ッファーを200μ/wellで入れ、37℃,60分静置した
後、0.002％ヒビデンで３回洗浄した。10％FCS/Aバッフ
ァーで希釈した0.25μg/mlヒトGP II b/III aとハイブ
リドーマの培養上清を等量で混合し、37℃,60分反応さ
せたものを、50μ/wellで入れ、37℃,60分結合させ
た。
/mlに希釈し、96ウエルELISAプレートに100μ/wellで
入れ、37℃,60分静置した。その後、１％BSA/1％FCS/ハ
ンクス液でウエルを洗浄した。10％FCS/0.1％NaN3/Aバ
ッファーを200μ/wellで入れ、37℃,60分静置した
後、0.002％ヒビデンで３回洗浄した。10％FCS/Aバッフ
ァーで希釈した0.25μg/mlヒトGP II b/III aとハイブ
リドーマの培養上清を等量で混合し、37℃,60分反応さ
せたものを、50μ/wellで入れ、37℃,60分結合させ
た。
0.002％ヒビデンで３回洗浄した後、結合したGP II b
/III a量を測定するため、10％FCS/Aバッファーで500ng
/mlに希釈した抗GP II b/III aマウス型MCA（Serotec社
製、MCA468）を50μ/wellで入れ、37℃,60分反応させ
た。0.002％ヒビデンで３回洗浄した後、10％FCS/Aバッ
ファーで104倍希釈したペルオキシターゼ標識化抗マウ
スIgG抗体（TAGO社）を50μ/wellで入れ、37℃,60分
反応させた。
/III a量を測定するため、10％FCS/Aバッファーで500ng
/mlに希釈した抗GP II b/III aマウス型MCA（Serotec社
製、MCA468）を50μ/wellで入れ、37℃,60分反応させ
た。0.002％ヒビデンで３回洗浄した後、10％FCS/Aバッ
ファーで104倍希釈したペルオキシターゼ標識化抗マウ
スIgG抗体（TAGO社）を50μ/wellで入れ、37℃,60分
反応させた。
その後、0.002％ヒビデンで５回洗浄した。0.45mg/ml
TMBZ−HCL（pH2.0）と0.017％H2O2/50mM NaHPO4/41mM
クエン酸（pH4.3）を等量で混合し、100μ/wellで入
れ、室温で適度に発色させた。1MH2SO4を100μ/well
で入れて発色を止め、450nmの吸光度を測定してFbgに結
合したGP II b/III a量を測り、Fbg・GP II b/III a結
合阻害活性を調べた。
TMBZ−HCL（pH2.0）と0.017％H2O2/50mM NaHPO4/41mM
クエン酸（pH4.3）を等量で混合し、100μ/wellで入
れ、室温で適度に発色させた。1MH2SO4を100μ/well
で入れて発色を止め、450nmの吸光度を測定してFbgに結
合したGP II b/III a量を測り、Fbg・GP II b/III a結
合阻害活性を調べた。
（３）クローニング （２）のスクリーニングで陽性を示したハイブリドー
マを次のようにクローニングした。まず、96ウエル平プ
レートに、マウス膜腔滲出細胞２×104細胞／ウエルだ
けを接種しておいた。そして、１時間〜１日後に培地を
除去し、ハイブリドーマを、10細胞／ウエルで96ウエル
に接種した。第一クローニングにはHT培地を用い、第二
クローニングには培地Ａを用いた。培養２〜３週間後に
抗体活性を測定し、陽性クローンを拾った。
マを次のようにクローニングした。まず、96ウエル平プ
レートに、マウス膜腔滲出細胞２×104細胞／ウエルだ
けを接種しておいた。そして、１時間〜１日後に培地を
除去し、ハイブリドーマを、10細胞／ウエルで96ウエル
に接種した。第一クローニングにはHT培地を用い、第二
クローニングには培地Ａを用いた。培養２〜３週間後に
抗体活性を測定し、陽性クローンを拾った。
（４）実験結果 ITP患者の脾臓等より得られたリンパ球（約10種類）
を使って80回に及ぶ細胞融合とスクリーニングを行っ
た。上記（２）のスクリーニング系（ａ）のGP II b/II
I aに対する結合活性陽性を示すハイブリドーマは全体
の約10％であったが、その中でスクリーニング系（ｂ）
のFbg・GP II b/III aの結合阻害活性を有していたハイ
ブリドーマは１種しか存在しなかった。
を使って80回に及ぶ細胞融合とスクリーニングを行っ
た。上記（２）のスクリーニング系（ａ）のGP II b/II
I aに対する結合活性陽性を示すハイブリドーマは全体
の約10％であったが、その中でスクリーニング系（ｂ）
のFbg・GP II b/III aの結合阻害活性を有していたハイ
ブリドーマは１種しか存在しなかった。
この両スクリーニング系に陽性を示したハイブリドー
マ１種をクローニングすることによって、上記の性質を
有するMCAを安定に産生するハイブリドーマICF2C8を樹
立することに成功した（表１）。また、Fbg・GP II b/I
II aの結合阻害活性は示さないが、GP II b/III aに対
して結合する７種のハイブリドーマについても、クロー
ニングによりMCAを安定に産生するハイブリドーマとし
て樹立した（表１）。
マ１種をクローニングすることによって、上記の性質を
有するMCAを安定に産生するハイブリドーマICF2C8を樹
立することに成功した（表１）。また、Fbg・GP II b/I
II aの結合阻害活性は示さないが、GP II b/III aに対
して結合する７種のハイブリドーマについても、クロー
ニングによりMCAを安定に産生するハイブリドーマとし
て樹立した（表１）。
こうして得られたハイブリドーマセルラインICF2C8
は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号工業技術院
微生物工業技術研究所に、ブダペスト条約に基き、1991
年10月８日に微工研条寄第3596号（FERM BP−3596）と
して寄託されている。
は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号工業技術院
微生物工業技術研究所に、ブダペスト条約に基き、1991
年10月８日に微工研条寄第3596号（FERM BP−3596）と
して寄託されている。
実施例2,ICF2C8の精製 ハイブリドーマICF2C8をITES/PVP培地で培養した培養
液（3L）を出発材料として用いた。この培養液をアミコ
ン（YM30メンブレン）で約500mlに濃縮した後、ポリエ
チレングリコールを終濃度10％になるように加え、４℃
で120分置いた。そして、沈澱物を遠心により集め、1M
NaCl/20mMリン酸バッファー（pH7.2）に溶解した後、同
バッファーで平衡化したCon A Sepharoseにかけた。こ
のCon A Sepharoseを1M NaCl/20mM NaPi（pH7.2）、1M
NaCl/50mM AcNa（pH4.0）で順に洗浄した後、MCAを0.5M
α−メチルマンノース/0.5M Nacl/20mN NaPi（pH7.2）
で溶出した。
液（3L）を出発材料として用いた。この培養液をアミコ
ン（YM30メンブレン）で約500mlに濃縮した後、ポリエ
チレングリコールを終濃度10％になるように加え、４℃
で120分置いた。そして、沈澱物を遠心により集め、1M
NaCl/20mMリン酸バッファー（pH7.2）に溶解した後、同
バッファーで平衡化したCon A Sepharoseにかけた。こ
のCon A Sepharoseを1M NaCl/20mM NaPi（pH7.2）、1M
NaCl/50mM AcNa（pH4.0）で順に洗浄した後、MCAを0.5M
α−メチルマンノース/0.5M Nacl/20mN NaPi（pH7.2）
で溶出した。
この溶出分画をアミコン（YM10メンブレン）で濃縮後
PBSで平衡化したSepharose CL−6Bにかけ、IgMを含む分
画をICF2C8として回収した（5mg）。この方法で得られ
たICF2C8はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（SDS−PAGE）で90％以上純粋なIgMであ
ることが確認された。
PBSで平衡化したSepharose CL−6Bにかけ、IgMを含む分
画をICF2C8として回収した（5mg）。この方法で得られ
たICF2C8はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（SDS−PAGE）で90％以上純粋なIgMであ
ることが確認された。
実施例3,Ca++存在下・非存在下でのGP II b/III aに対
するヒト型MCAの結合 （１）Ca++存在下でのGP II b/III aに対するヒト型MCA
の結合 精製GP II b/III aをＡバッファー〔127mM Ca++/90mM
Mg++/PBS（pH7.2）〕で１μg/mlに希釈し、96ウエルEL
ISAプレートに100μ/wellで入れ、４℃で一晩静置し
た。GP II b/III a溶液をすて、２％BSA/Aバッファーを
175μ/wellで入れ、37℃で120分静置してＡバッファ
ーで３回洗浄した後、0.2％BSA/Aバッファーで０〜５μ
g/mlに希釈した抗GP II b/III aヒト型MCA（ICF2C8また
はIAD2−１）を100μ/wellで入れ、37℃,60分反応さ
せた。
するヒト型MCAの結合 （１）Ca++存在下でのGP II b/III aに対するヒト型MCA
の結合 精製GP II b/III aをＡバッファー〔127mM Ca++/90mM
Mg++/PBS（pH7.2）〕で１μg/mlに希釈し、96ウエルEL
ISAプレートに100μ/wellで入れ、４℃で一晩静置し
た。GP II b/III a溶液をすて、２％BSA/Aバッファーを
175μ/wellで入れ、37℃で120分静置してＡバッファ
ーで３回洗浄した後、0.2％BSA/Aバッファーで０〜５μ
g/mlに希釈した抗GP II b/III aヒト型MCA（ICF2C8また
はIAD2−１）を100μ/wellで入れ、37℃,60分反応さ
せた。
Ａバッファーで３回洗浄後、GP II b/III aに結合し
たヒト型MCA量を測定するため、アルカリフォスファタ
ーゼ標識化抗ヒトIgM（または抗ヒトIgG）抗体を0.2％B
SA/Aバッファーで104倍希釈して100μ/wellで入れ、3
7℃,60分反応させた。Ａバッファーで４回洗浄後、Ｐ−
ニトロリン酸２ナトリウムを0.25mM MgCl2/1Mジエタノ
ールアミン（pH9.8））に10mg/mlで溶解し、100μ/we
llで入れ、室温で適度に発色させた。その後、405nmの
吸光度を測定し、吸光度よりGP II b/III aに対するヒ
ト型MCAの結合能を調べた。図１にその結果を示す。
たヒト型MCA量を測定するため、アルカリフォスファタ
ーゼ標識化抗ヒトIgM（または抗ヒトIgG）抗体を0.2％B
SA/Aバッファーで104倍希釈して100μ/wellで入れ、3
7℃,60分反応させた。Ａバッファーで４回洗浄後、Ｐ−
ニトロリン酸２ナトリウムを0.25mM MgCl2/1Mジエタノ
ールアミン（pH9.8））に10mg/mlで溶解し、100μ/we
llで入れ、室温で適度に発色させた。その後、405nmの
吸光度を測定し、吸光度よりGP II b/III aに対するヒ
ト型MCAの結合能を調べた。図１にその結果を示す。
（２）Ca++非存在下でのGP II b/III aに対するヒト型M
CAの結合 精製GP II b/III aをＡバッファーで１μg/mlに希釈
し、96ウエルELISAプレートに100μ/wellで入れ、４
℃で一晩静置した。GP II b/III a溶液をすて、２％BSA
/Bバッファー〔10mM EDTA/PBS（pH7.2）〕を175μ/we
llで入れ、37℃,120分静置して、Ｂバッファーで３回洗
浄した後、0.2％BSA/Bバッファーで０〜５μg/mlに希釈
した抗GP II b/III aヒト型MCA（ICF2C8またはIAD2−
１）を100μ/wellで入れ、37℃で60分反応させた。
CAの結合 精製GP II b/III aをＡバッファーで１μg/mlに希釈
し、96ウエルELISAプレートに100μ/wellで入れ、４
℃で一晩静置した。GP II b/III a溶液をすて、２％BSA
/Bバッファー〔10mM EDTA/PBS（pH7.2）〕を175μ/we
llで入れ、37℃,120分静置して、Ｂバッファーで３回洗
浄した後、0.2％BSA/Bバッファーで０〜５μg/mlに希釈
した抗GP II b/III aヒト型MCA（ICF2C8またはIAD2−
１）を100μ/wellで入れ、37℃で60分反応させた。
Ａバッファーで３回洗浄後、GP II b/III aに結合し
たヒト型MCA量を測定するため、アルカリフォスファタ
ーゼ標識化抗ヒトIgM（または抗ヒトIgG）抗体を0.2％B
SA/Aバッファーで104倍希釈して100μ/wellで入れ、3
7℃で60分反応させた。Ａバッファーで４回洗浄後、Ca
++存在下と同じ発色操作を行ってGP II b/III aに対す
るMCAの結合能を調べた。その結果を図１に示す。
たヒト型MCA量を測定するため、アルカリフォスファタ
ーゼ標識化抗ヒトIgM（または抗ヒトIgG）抗体を0.2％B
SA/Aバッファーで104倍希釈して100μ/wellで入れ、3
7℃で60分反応させた。Ａバッファーで４回洗浄後、Ca
++存在下と同じ発色操作を行ってGP II b/III aに対す
るMCAの結合能を調べた。その結果を図１に示す。
図１の（ａ）より、ICF2C8はCa++存在下でのみ濃度依
存的に吸光度が増しており、Ca++非存在下では全く吸光
度が増していない。これより、ICF2C8は、Ca++存在下で
のみGP II b/III aと結合しCa++非存在下では結合しな
いことがわかった。
存的に吸光度が増しており、Ca++非存在下では全く吸光
度が増していない。これより、ICF2C8は、Ca++存在下で
のみGP II b/III aと結合しCa++非存在下では結合しな
いことがわかった。
また、図１（ｂ）より、IAD2−１はCa++存在・非存在
に関係なくGP II b/III aと結合することがわかった。
に関係なくGP II b/III aと結合することがわかった。
実施例4,FbgとGP II b/III aの結合に対するヒト型MCA
の影響 ヒトフィブリノーゲン（Fbg）をＡバッファーで10μg
/mlに希釈し、96ウエルELISAプレートに100μ/wellで
入れ、37℃,60分静置した。その後、１％BSA/1％FCS/ハ
ンクス液でウエルを洗浄した。10％FCS/0.1％NaN3/Aバ
ッファーを200μ/wellで入れ、37℃,60分静置した
後、0.002％ヒビデンで３回洗浄した。10％FCS/Aバッフ
ァーで希釈した0.25μg/mlヒトGP II b/III aと各濃度
の抗ヒトGP II b/III aヒト型MCA（ICF2C8またはIAD2−
１）を等量で混合し、37℃,60分反応させたものを、50
μ/wellで入れ、37℃,60分結合させた。
の影響 ヒトフィブリノーゲン（Fbg）をＡバッファーで10μg
/mlに希釈し、96ウエルELISAプレートに100μ/wellで
入れ、37℃,60分静置した。その後、１％BSA/1％FCS/ハ
ンクス液でウエルを洗浄した。10％FCS/0.1％NaN3/Aバ
ッファーを200μ/wellで入れ、37℃,60分静置した
後、0.002％ヒビデンで３回洗浄した。10％FCS/Aバッフ
ァーで希釈した0.25μg/mlヒトGP II b/III aと各濃度
の抗ヒトGP II b/III aヒト型MCA（ICF2C8またはIAD2−
１）を等量で混合し、37℃,60分反応させたものを、50
μ/wellで入れ、37℃,60分結合させた。
0.002％ヒビデンで３回洗浄した後、結合したGP II b
/III a量を測定するため、10％FCS/Aバッファーで500ng
/mlに希釈した抗GP II b/III aマウス型MCA（Serotec社
製、MCA468）を50μ/wellで入れ、37℃で60分反応さ
せた。0.002％ヒビデンで３回洗浄した後、10％FCS/Aバ
ッファーで104倍希釈したペルオキシダーゼ標識化抗マ
ウスIgG抗体（TAGO社）を50μ/wellで入れ、37℃で60
分反応させた。その後、0.002％ヒビデンで５回洗浄し
た。
/III a量を測定するため、10％FCS/Aバッファーで500ng
/mlに希釈した抗GP II b/III aマウス型MCA（Serotec社
製、MCA468）を50μ/wellで入れ、37℃で60分反応さ
せた。0.002％ヒビデンで３回洗浄した後、10％FCS/Aバ
ッファーで104倍希釈したペルオキシダーゼ標識化抗マ
ウスIgG抗体（TAGO社）を50μ/wellで入れ、37℃で60
分反応させた。その後、0.002％ヒビデンで５回洗浄し
た。
0.45mg/ml TMBZ−HCl（pH2.0）と0.017％H2O2/59mM N
a2HPO4/41mMクエン酸（pH4.3）を等量で混合し、100μ
/wellで入れ、室温で適度に発色させた。1M H2SO4を1
00μ/wellで入れて発色を止め、450nmの吸光度を測定
してFbgに結合したGP II b/III a量を測った。結果を図
２に示す。
a2HPO4/41mMクエン酸（pH4.3）を等量で混合し、100μ
/wellで入れ、室温で適度に発色させた。1M H2SO4を1
00μ/wellで入れて発色を止め、450nmの吸光度を測定
してFbgに結合したGP II b/III a量を測った。結果を図
２に示す。
図２よりICF2C8の濃度依存的に吸光度が減少している
ことがわかる。つまり、FbgとGP II b/III aの結合は、
加えたICF2C8により濃度依存的に阻害され、ICF2C8の終
濃度2.5μg/mlのときにはその70％が阻害された。しか
し、同じ抗GP II b/III aヒト型MCAであるIAD2−１によ
っては、FbgとGP II b/III aの結合は阻害されなかっ
た。
ことがわかる。つまり、FbgとGP II b/III aの結合は、
加えたICF2C8により濃度依存的に阻害され、ICF2C8の終
濃度2.5μg/mlのときにはその70％が阻害された。しか
し、同じ抗GP II b/III aヒト型MCAであるIAD2−１によ
っては、FbgとGP II b/III aの結合は阻害されなかっ
た。
実施例5,vWFとGP II b/III aの結合に対するICF2C8の影
響 96ウエルELISAプレートにＡバッファーで21.6μg/ml
に希釈した抗vWFポリクローナル抗体を100μ/wellで
入れ、４℃に一晩静置した。抗体溶液をすて、２％BSA/
Aバッファーを175μ/wellで入れ、37℃に120分静置し
た。Ａバッファーでウエルを３回洗浄した後、von Wil
lebrand病治療薬ヘマーテ（登録商標）Ｐ〔ヘキスト
ジャパン（株）〕を0.2％BSA/Aバッファーで0.625unit/
mlに希釈し、100μ/wellで入れ、37℃,120分反応さ
せ、vWFを結合させた。
響 96ウエルELISAプレートにＡバッファーで21.6μg/ml
に希釈した抗vWFポリクローナル抗体を100μ/wellで
入れ、４℃に一晩静置した。抗体溶液をすて、２％BSA/
Aバッファーを175μ/wellで入れ、37℃に120分静置し
た。Ａバッファーでウエルを３回洗浄した後、von Wil
lebrand病治療薬ヘマーテ（登録商標）Ｐ〔ヘキスト
ジャパン（株）〕を0.2％BSA/Aバッファーで0.625unit/
mlに希釈し、100μ/wellで入れ、37℃,120分反応さ
せ、vWFを結合させた。
Ａバッファーでウエルを３回洗浄後、0.2％BSA/Aバッ
ファーで希釈したGP II b/III a（２μg/ml）と抗GP II
b/III aヒト型MCA（０〜10μg/ml）を等量で混合し、3
7℃で90分反応させたものを、100μ/wellで入れ、37
℃で90分反応させ、vWFとGP II b/III aを結合させた。
Ａバッファーでウエルを３回洗浄後、vWFに結合したGP
II b/III aを測定するため、0.2％BSA/Aバッファーで50
0ng/mlに希釈した抗GP II b/III aマウス型MCA（Serote
c社製、MCA468）を100μ/wellで入れ、37℃,60分反応
させた。
ファーで希釈したGP II b/III a（２μg/ml）と抗GP II
b/III aヒト型MCA（０〜10μg/ml）を等量で混合し、3
7℃で90分反応させたものを、100μ/wellで入れ、37
℃で90分反応させ、vWFとGP II b/III aを結合させた。
Ａバッファーでウエルを３回洗浄後、vWFに結合したGP
II b/III aを測定するため、0.2％BSA/Aバッファーで50
0ng/mlに希釈した抗GP II b/III aマウス型MCA（Serote
c社製、MCA468）を100μ/wellで入れ、37℃,60分反応
させた。
Ａバッファーで３回洗浄後、0.2％BSA/Aバッファーで
104倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識化抗マウ
スIgG抗体（TAGO Inc.,Cat Nr.6550）を100μ/well
で入れ、37℃,60分反応させた。Ａバッファーで４回洗
浄後、ｐ−ニトロリン酸２ナトリウムを0.25mM MgCl2/1
Mジエタノールアミン（pH9.8）に10mg/mlになるように
溶解し、100μ/wellで入れ、室温で60分発色させた。
その後、405nmの吸光度を測定した。この吸光度より、v
WFとGP II b/III aと結合量を調べた。加えた抗GP II b
/III aヒト型MCA濃度と上記の方法で得られた405nmの吸
光度の関係を図３に示す。
104倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識化抗マウ
スIgG抗体（TAGO Inc.,Cat Nr.6550）を100μ/well
で入れ、37℃,60分反応させた。Ａバッファーで４回洗
浄後、ｐ−ニトロリン酸２ナトリウムを0.25mM MgCl2/1
Mジエタノールアミン（pH9.8）に10mg/mlになるように
溶解し、100μ/wellで入れ、室温で60分発色させた。
その後、405nmの吸光度を測定した。この吸光度より、v
WFとGP II b/III aと結合量を調べた。加えた抗GP II b
/III aヒト型MCA濃度と上記の方法で得られた405nmの吸
光度の関係を図３に示す。
図３より、抗GP II b/III aヒト型MCAICF2C8は濃度依
存的に吸光度を減少させ、10μg/mlで11％まで吸光度を
減少させた。つまり、ICF2C8は、10μg/mlの抗体濃度で
vWFとGP II b/III aの結合を89％阻害したことになる。
抗GP II b/III aヒト型MCAIAD2−１はvWFとGP II b/III
aの結合を阻害しなかった。
存的に吸光度を減少させ、10μg/mlで11％まで吸光度を
減少させた。つまり、ICF2C8は、10μg/mlの抗体濃度で
vWFとGP II b/III aの結合を89％阻害したことになる。
抗GP II b/III aヒト型MCAIAD2−１はvWFとGP II b/III
aの結合を阻害しなかった。
実施例6,ICF2C8の血小板表面への結合能 ヒト新鮮血と3.8％クエン酸ナトリウムを9:1で混ぜた
後、1000rpmで10分間遠心してplatelet rich plasma
を得た。このplatelet rich plasmaと終濃度５μg/ml
になるように抗GP II b/III aヒト型モノクローナル抗
体（ICF2C8）を混合し、室温で30分反応させた。この反
応物を遠心（2500rpm,10分間）した後、沈澱した血小板
をバッファーＣ〔15mM Tris・HCl/150mM NaCl（pH7.
4）〕で１回洗浄した。
後、1000rpmで10分間遠心してplatelet rich plasma
を得た。このplatelet rich plasmaと終濃度５μg/ml
になるように抗GP II b/III aヒト型モノクローナル抗
体（ICF2C8）を混合し、室温で30分反応させた。この反
応物を遠心（2500rpm,10分間）した後、沈澱した血小板
をバッファーＣ〔15mM Tris・HCl/150mM NaCl（pH7.
4）〕で１回洗浄した。
この血小板をバッファーＣにけん濁後、FITC標識化抗
ヒトIgMヤギ抗体を室温で30分間反応させた。この反応
物を遠心（2500rpm,10分間）した後、沈澱した血小板を
バッファーＡで１回洗浄した。この血小板を再度バッフ
ァーＡにけん濁し、flow cytometryにかけた。結果を
図４に示す。
ヒトIgMヤギ抗体を室温で30分間反応させた。この反応
物を遠心（2500rpm,10分間）した後、沈澱した血小板を
バッファーＡで１回洗浄した。この血小板を再度バッフ
ァーＡにけん濁し、flow cytometryにかけた。結果を
図４に示す。
図４の（ａ）は抗体を全く反応させなかった場合、
（ｂ）は抗GP II b/III aヒト型モノクローナル抗体を
反応させず、FITC標識化抗ヒトIgMヤギ抗体のみを血小
板と反応させた場合、（ｃ）はICF2C8を反応後、FITC標
識化抗ヒトIgMヤギ抗体を反応させた場合のflow cytom
etryのチャートである。
（ｂ）は抗GP II b/III aヒト型モノクローナル抗体を
反応させず、FITC標識化抗ヒトIgMヤギ抗体のみを血小
板と反応させた場合、（ｃ）はICF2C8を反応後、FITC標
識化抗ヒトIgMヤギ抗体を反応させた場合のflow cytom
etryのチャートである。
図４から、（ａ）と（ｂ）のピークの位置は変化がな
いのでFITC標識化抗ヒトIgMヤギ抗体は今回の条件下で
は血小板表面に結合しないことがわかる。ICF2C8を血小
板に反応させた場合の（ｃ）のピーク位置は、（ａ），
（ｂ）に比べて右に移動していた。このことより、ICF2
C8は、精製GP II b/III aだけでなく、ヒト血小板表面
上のGP II b/III aにも結合することがわかった。
いのでFITC標識化抗ヒトIgMヤギ抗体は今回の条件下で
は血小板表面に結合しないことがわかる。ICF2C8を血小
板に反応させた場合の（ｃ）のピーク位置は、（ａ），
（ｂ）に比べて右に移動していた。このことより、ICF2
C8は、精製GP II b/III aだけでなく、ヒト血小板表面
上のGP II b/III aにも結合することがわかった。
実施例7,ICF2C8の血小板凝集抑制活性 ヒト新鮮血と3.8％クエン酸ナトリウムを9:1で混ぜた
後、1000rpmで10分間遠心してplatelet rich plasma
（RPR）を得た。このRPR450μと各濃度のICF2C8の45
μを37℃で１分間反応させた後、ADPを終濃度4.8μＭ
になるように加え、血小板凝集を起こし、アグリコメー
ターにて血小板凝集を37℃で５分間観察した。結果を図
５に示す。
後、1000rpmで10分間遠心してplatelet rich plasma
（RPR）を得た。このRPR450μと各濃度のICF2C8の45
μを37℃で１分間反応させた後、ADPを終濃度4.8μＭ
になるように加え、血小板凝集を起こし、アグリコメー
ターにて血小板凝集を37℃で５分間観察した。結果を図
５に示す。
図６より、ICF2C8は濃度依存的に血小板凝集を抑制
し、終濃度100μg/mlで凝集を約70％抑制した。
し、終濃度100μg/mlで凝集を約70％抑制した。
産業上の利用可能性 本発明のモノクローナル抗体及びその活性断片は、血
栓症の予防又は治療のための血小板凝集抑制剤の活性成
分としての使用が期待される。
栓症の予防又は治療のための血小板凝集抑制剤の活性成
分としての使用が期待される。
規則第1392の寄託された微生物への言及 寄託機関 工業技術院微生物工業技術研究所 茨城県つくば市東１丁目１番３号 ICF2C8 微工研条寄第3596号 （FERM BP−1596） 寄託日1991年10月８日
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 村上 敏信 東京都日野市多摩平３−18−４ 帝人ア パート142号 (72)発明者 佐々木 聡 東京都八王子市打越町1224 パラティノ 打越302 (72)発明者 木村 剛 アメリカ合衆国，アリゾナ，タクソン 930，リバーロード アパートメント １イー (72)発明者 佐川 智子 東京都日野市旭が丘２−26−９ 帝人旭 が丘寮209号 (56)参考文献 特表 平７−503450（ＪＰ，Ａ) 国際公開90／6134（ＷＯ，Ａ１) Ｔｈｒｏｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ，38［５］ （1985） Ｐ．547−559 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
Claims (5)
- 【請求項１】ヒトGlycoprotein II b/III aに特異的に
結合し、ヒト血小板凝集を抑制し、且つフィブリノーゲ
ンのヒトGlycoprotein II b/III aへの結合を阻害する
能力を有するヒト型モノクローナル抗体、又は該抗体の
断片であって、ヒトGlycoprotein II b/III aに特異的
に結合し、ヒト血小板凝集を抑制し、且つフィブリノー
ゲンのヒトGlycoprotein II b/III aへの結合を阻害す
る能力を有する断片。 - 【請求項２】ヒトGlycoprotein II b/III aに特異的に
結合し、ヒト血小板凝集を抑制し、且つフィブリノーゲ
ンのヒトGlycoprotein II b/III aへの結合を阻害する
能力を有するヒト型モノクローナル抗体を産生する、ヒ
ト・リンパ球とマウス・ミエローマ細胞との融合によっ
て得られるハイブリドーマ又はその子孫。 - 【請求項３】請求項２に記載のハイブリドーマを培養す
ることを特徴とする、ヒトGlycoprotein II b/III aに
特異的に結合し、ヒト血小板凝集を抑制し、且つフィブ
リノーゲンのヒトGlycoprotein II b/III aへの結合を
阻害する能力を有するヒト型モノクローナル抗体の製造
方法。 - 【請求項４】ヒト・リンパ球とマウス・ミエローマ細胞
とを融合せしめ、そしてヒトGlycoprotein II b/III a
に特異的に結合し、ヒト血小板凝集を抑制し、且つフィ
ブリノーゲンのヒトGlycoprotein II b/III aへの結合
を阻害する能力を有するヒト型モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマを選択することを特徴とする、該
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの製造方
法。 - 【請求項５】ヒトGlycoprotein II b/III aに特異的に
結合し、ヒト血小板凝集を抑制し、且つフィブリノーゲ
ンのヒトGlycoprotein II b/III aへの結合を阻害する
能力を有するヒト型モノクローナル抗体、又は該抗体の
断片であって、ヒトGlycoprotein II b/III aに特異的
に結合し、ヒト血小板凝集を抑制し、且つフィブリノー
ゲンのヒトGlycoprotein II b/III aへの結合を阻害す
る能力を有する断片を含んで成る血小板凝集抑制剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26264091 | 1991-09-17 | ||
| JP3-262640 | 1991-09-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP5505954A Expired - Fee Related JP2776634B2 (ja) | 1991-09-17 | 1992-09-16 | グリコプロテイン ▲ＩＩ▼ｂ／▲ＩＩＩ▼ａに対するヒト型モノクローナル抗体 |
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|---|---|
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| JP (1) | JP2776634B2 (ja) |
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| US5672585A (en) * | 1990-04-06 | 1997-09-30 | La Jolla Cancer Research Foundation | Method and composition for treating thrombosis |
| US6521594B1 (en) | 1990-04-06 | 2003-02-18 | La Jolla Cancer Research Foundation | Method and composition for treating thrombosis |
| US5780303A (en) * | 1990-04-06 | 1998-07-14 | La Jolla Cancer Research Foundation | Method and composition for treating thrombosis |
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| US8455627B2 (en) | 2001-10-05 | 2013-06-04 | Affimed Therapeutics, Ag | Human antibody specific for activated state of platelet integrin receptor GPIIb/IIIa |
| ES2288900T3 (es) * | 2001-10-05 | 2008-02-01 | Affimed Therapeutics Ag | Anticuerpo de origen humano para inhibir la agregacion de trombocitos. |
| CN1230447C (zh) | 2002-07-17 | 2005-12-07 | 阮长耿 | 识别血小板膜糖蛋白的单克隆抗体及其在抗血栓治疗中的应用 |
| WO2011112549A2 (en) * | 2010-03-10 | 2011-09-15 | Emory University | Temperature sensitive conjugate compositions, and uses related thereto |
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|---|---|---|---|---|
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-
1992
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- 1992-09-16 AU AU25834/92A patent/AU659873B2/en not_active Ceased
- 1992-09-16 EP EP92920009A patent/EP0557535B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-16 DE DE69223606T patent/DE69223606T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-09-16 JP JP5505954A patent/JP2776634B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｔｈｒｏｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８［５］ （１９８５） Ｐ．５４７−５５９ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0557535B1 (en) | 1997-12-17 |
| DE69223606T2 (de) | 1998-07-16 |
| WO1993006232A1 (en) | 1993-04-01 |
| EP0557535A1 (en) | 1993-09-01 |
| DE69223606D1 (de) | 1998-01-29 |
| AU2583492A (en) | 1993-04-27 |
| EP0557535A4 (ja) | 1994-02-16 |
| AU659873B2 (en) | 1995-06-01 |
| KR930702536A (ko) | 1993-09-09 |
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