JP2766473B2 - Peptide promoting the activation of protein C by thrombin - Google Patents

Peptide promoting the activation of protein C by thrombin

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JP2766473B2
JP2766473B2 JP8138588A JP13858896A JP2766473B2 JP 2766473 B2 JP2766473 B2 JP 2766473B2 JP 8138588 A JP8138588 A JP 8138588A JP 13858896 A JP13858896 A JP 13858896A JP 2766473 B2 JP2766473 B2 JP 2766473B2
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Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、トロンビンに結合
し、トロンビンのプロテインＣ活性化を促進する作用を
有する新規なペプチドに関する。更に詳しくは、本発明
は血栓溶解作用、抗血液凝固作用及び血小板凝集抑制作
用を有し、したがって、血液凝固を制御するための、ま
たは血小板凝集を制御するための医薬組成物として、循
環器系の疾患の治療に有用なペプチドに関する。本発明
は、また、その新規なペプチドをコードするデオキシリ
ボ核酸（以下“ＤＮＡ”と称する）、該ＤＮＡを含有す
る複製可能な組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質
転換された微生物または細胞及び組換えＤＮＡ技術によ
る該ペプチドの製造方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel peptide which binds to thrombin and has an action of promoting the activation of protein C of thrombin. More specifically, the present invention has a thrombolytic action, an anticoagulant action and a platelet aggregation inhibitory action, and therefore, as a pharmaceutical composition for controlling blood coagulation or for controlling platelet aggregation, a circulatory system The present invention relates to a peptide useful for the treatment of the above diseases. The present invention also relates to a deoxyribonucleic acid (hereinafter referred to as "DNA") encoding the novel peptide, a replicable recombinant DNA containing the DNA, a microorganism or a cell transformed with the recombinant DNA. And a method for producing the peptide by recombinant DNA technology.

【０００２】本明細書において、アミノ酸及びペプチド
は下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｃ
ＢＮ）で採用された略号を用いて表される。なお、アミ
ノ酸などに関し光学異性体があり得る場合は、特に明示
しなければＬ体を示すものとする。更に、特に明示しな
い限りペプチドのアミノ酸配列の左端及び右端はそれぞ
れＮ末端およびＣ末端である。[0002] In the present specification, amino acids and peptides are defined as IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Committee (C
BN). In addition, when there is an optical isomer for an amino acid or the like, the L-form is indicated unless otherwise specified. Further, unless otherwise specified, the left and right ends of the amino acid sequence of the peptide are the N-terminal and C-terminal, respectively.

【０００３】 Ｇｌｎ：グルタミン残基 Ａｓｐ：アスパラギン酸残基 Ｐｒｏ：プロリン残基 Ｔｙｒ：チロシン残基 Ｖａｌ：バリン残基 Ｌｙｓ：リジン残基 Ｇｌｕ：グルタミン酸残基 Ａｌａ：アラニン残基 Ａｓｎ：アスパラギン残基 Ｌｅｕ：ロイシン残基 Ｐｈｅ：フェニルアラニン残基 Ｇｌｙ：グリシン残基 Ｈｉｓ：ヒスチジン残基 Ｓｅｒ：セリン残基 Ｔｈｒ：スレオニン残基 Ｉｌｅ：イソロイシン残基 Ｔｒｐ：トリプトファン残基 Ａｒｇ：アルギニン残基 Ｍｅｔ：メチオニン残基 Ｃｙｓ：システイン残基 また、ポリデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴヌク
レオチドは下記の如き略号で表されるデオキシリボヌク
レオチドの配列により表記する。 Ａ：２′−デオキシアデニル酸残基 Ｃ：２′−デオキシシチジル酸残基 Ｇ：２′−デオキシグアニル酸残基 Ｔ：チミジル酸残基 特に明示しない限りデオキシリボヌクレオチド配列の左
端及び右端はそれぞれ５′末端及び３′末端である。Gln: glutamine residue Asp: aspartic acid residue Pro: proline residue Tyr: tyrosine residue Val: valine residue Lys: lysine residue Glu: glutamic acid residue Ala: alanine residue Asn: asparagine residue Leu : Leucine residue Phe: Phenylalanine residue Gly: Glycine residue His: Histidine residue Ser: Serine residue Thr: Threonine residue Ile: Isoleucine residue Trp: Tryptophan residue Arg: Arginine residue Met: Methionine residue Cys : Cysteine residue In addition, polydeoxyribonucleotides and oligonucleotides are represented by deoxyribonucleotide sequences represented by the following abbreviations. A: 2'-deoxyadenylic acid residue C: 2'-deoxycytidylic acid residue G: 2'-deoxyguanylic acid residue T: thymidylic acid residue Unless otherwise specified, the left and right ends of the deoxyribonucleotide sequence are respectively 5 'end and 3' end.

【０００４】[0004]

【従来の技術】現在、血栓溶解剤として用いられるもの
には、ストレプトキナーゼやウロキナーゼがある。ま
た、抗血液凝固剤としてはヘパリンやワーファリンが用
いられている。さらに、血小板凝集抑制剤としてはアス
ピリン、スルフィンピラゾン、ジピリダモール等が使わ
れている。これらの血栓溶解剤、抗血液凝固剤および血
小板凝集抑制剤は、それぞれ別個に、あるいは併用し
て、例えば、心筋梗塞、血栓症、塞栓症、末梢血管閉塞
症、閉塞性動脈硬化症、血管内血液凝固症候群（ＤＩ
Ｃ）、狭心症、一過性脳虚血発作、妊娠中毒症等の疾患
の治療及び予防に用いられている。しかしながら、これ
らの血栓溶解剤、抗血液凝固剤および血小板凝集抑制剤
は非常に複雑な機構から成り立つ血液の凝固線溶系の極
く一部に作用するにすぎない。そこで、血液の凝固線溶
系に広く作用し、優れた血液凝固抑制作用を示す薬剤が
要望されていた。2. Description of the Related Art Streptokinase and urokinase are currently used as thrombolytic agents. Heparin and warfarin are used as anticoagulants. Further, as a platelet aggregation inhibitor, aspirin, sulfinpyrazone, dipyridamole and the like are used. These thrombolytic agents, anticoagulants and platelet aggregation inhibitors can be used separately or in combination, for example, for myocardial infarction, thrombosis, embolism, peripheral vascular occlusion, atherosclerosis, intravascular Blood clotting syndrome (DI
C), for the treatment and prevention of diseases such as angina pectoris, transient ischemic attack, preeclampsia and the like. However, these thrombolytics, anticoagulants and platelet aggregation inhibitors only act on a very small part of the blood coagulation / fibrinolysis system, which consists of a very complex mechanism. Thus, there has been a demand for a drug that acts widely on the coagulation / fibrinolysis system of blood and has an excellent blood coagulation inhibitory action.

【０００５】ところで、血液凝固機構において重要な役
割を演じているビタミンＫ依存性の蛋白質としてプロテ
インＣが知られている。近年、そのプロテインＣの活性
化を促進し、トロンビンの作用による血小板の活性化と
フィブリン形成を抑制する物質が、ウサギの肺、ウシの
肺、ヒトの肺やヒト胎盤などに存在し、それが前述の薬
剤に比べて優れた血液凝固抑制作用を有することが報告
されている。[0005] By the way, protein C is known as a vitamin K-dependent protein that plays an important role in the blood coagulation mechanism. In recent years, substances that promote the activation of protein C and suppress platelet activation and fibrin formation due to the action of thrombin are present in rabbit lung, bovine lung, human lung and human placenta, etc. It has been reported that it has an excellent blood coagulation inhibitory effect as compared with the aforementioned drugs.

【０００６】ウサギの肺に存在する物質については、例
えば、シー ティー エスモン（Ｃ．Ｔ．Ｅｓｍｏｎ）
ら、プロシーディング オブ ナショナル アカデミー
オブ サイエンス ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、７８巻、２２４９頁
（１９８１年）；エヌ エル エスモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓ
ｍｏｎ）ら、ザ ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５７
巻、８５９頁（１９８２年）；シー ティー エスモン
（Ｃ．Ｔ．Ｅｓｍｏｎ）ら、ザ ジャーナル オブ バ
イオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）、２５７巻、７９４４頁（１９８２年）；エヌ
エル エスモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓｍｏｎ）ら、ザ ジャー
ナル オブバイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５８巻、１２２３８頁（１９８２
年）を参照することができる。[0006] Substances present in the lungs of rabbits are described, for example, by C.T. Esmon.
Proceding of National Academy of Science USA (Proc. Nat)
l. Acad. Sci. USA), 78, 2249 (1981); N. Esmon (NL Es)
mon) et al., The Journal of Biological
Chemistry (J. Biol. Chem.), 257
Vol. 859 (1982); CT Esmon et al., The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Che).
m. ), 257, 7944 (1982);
NL Esmon et al., The Journal of Biological Chemistry (J. Bio)
l. Chem. 258, 12238 (1982)
Year).

【０００７】ウシの肺に存在する物質については、例え
ば楠本ら、生化学、５６巻、８９０頁（１９８４年）を
参照することができる。また、ヒト胎盤に存在する物質
については、例えば特開昭６０−１９９８１９；黒沢
ら、日本血液学会誌、４７巻、６３２頁（１９８４
年）；エッチ エッチ サーレム（Ｈ．Ｈ．Ｓａｌｅ
ｍ）ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５９巻、１２２
４６頁（１９８４年）；エス．クロサワ（Ｓ．Ｋｕｒｏ
ｓａｗａ）ら、トロンボシス リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂ
ｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、３７巻、３５３頁（１
９８５年）を参照することができる。また、ヒトの肺に
存在する物質については、例えば楠本ら、生化学、５７
巻、１１０２頁（１９８５年）を参照することができ
る。[0007] With respect to substances present in bovine lungs, for example, reference can be made to Kusumoto et al., Biochemistry, 56, 890 (1984). Regarding substances present in the human placenta, for example, JP-A-60-199819; Kurosawa et al., Journal of the Japanese Society of Hematology, 47, 632 (1984).
Year); Etch Etch Salem (HH Sale)
m) et al., Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 259, 122
46 (1984); Kurosawa (S. Kuro)
sawa) et al., Thrombosis Research (Thromb)
ossis Research), 37, 353 (1
985). Regarding substances present in the human lung, for example, Kusumoto et al., Biochemistry, 57
Vol. 1102 (1985).

【０００８】上記の先行技術文献には上記物質の一般的
性質が記載されているが、その物質の構造、例えばアミ
ノ酸配列などは解明されておらず、未だにその物質は同
定されていない。従って、上記の先行技術文献に報告さ
れている物質が単一物質であるか否か、また、これらの
先行技術文献の記載にしたがって同一の物質が繰返し得
られるか否かについては全く不明である。さらにまた、
上記の先行技術文献に報告されている物質は、細胞膜上
に存在するものであり、界面活性剤の非存在下では不溶
性であって、循環器疾患の治療などの医薬組成物として
用いる場合にはそのままでは投与量を多くすることがで
きないものであり、そもそも生体由来であることから十
分な量が確保できず、その物質が本当に医薬として使用
できるものであるか否かの検討さえも出来ない状態であ
った。Although the above-mentioned prior art documents describe the general properties of the above substances, the structure of the substance, for example, the amino acid sequence, has not been elucidated, and the substance has not yet been identified. Therefore, it is completely unknown whether the substances reported in the above-mentioned prior art documents are single substances, and whether the same substances can be repeatedly obtained according to the descriptions of these prior art documents. . Furthermore,
The substances reported in the above-mentioned prior art documents are present on the cell membrane, are insoluble in the absence of a surfactant, and when used as a pharmaceutical composition for treatment of circulatory diseases, etc. The dose cannot be increased as it is, and it is not possible to secure a sufficient amount because it is originally derived from a living organism, and it is not possible to even determine whether the substance can be used as a drug. Met.

【０００９】注射剤とする場合に不溶物が存在すること
は、循環器疾患を有する患者において致命的であること
から、界面活性剤の添加を必須とするが、上記の問題を
有する患者にとって界面活性剤の添加は予想外の問題を
引き起こす可能性は否定できず、場合によっては好まし
いものではない。また、一部には細胞膜上に存在する以
外の形態、例えば血中や尿中の存在する旨の開示がある
が〔イシイら、ジャーナル オブ クリニカル インベ
スティゲーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、
７６巻、２１７８頁（１９８５年）〕、精製が十分にさ
れていないことが明らかであり、またその活性や作用、
物性やその由来等の解析や検討が不十分であり、まして
やアミノ酸配列等の構造についての解析は全くなく、そ
もそも医薬として使用できる効果と安全性を有し、しか
も医薬として常に安定的に供給し得るものとの位置づけ
をすることはできないものであった。即ち、従来、上記
物質においては、その物性や構造等についての十分な解
析がない状況であって、トロンビンに結合し、トロンビ
ンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有する
性質が得られ、且つ十分な可溶性を有するペプチドなど
望むべき状況では全くなかった。The presence of insolubles in the case of injections is fatal in patients with cardiovascular diseases, and thus requires the addition of surfactants. The addition of an activator cannot be ruled out to cause unexpected problems and in some cases is not preferred. In addition, there are some disclosures of forms other than those present on cell membranes, such as the presence in blood or urine [Ishii et al., Journal of Clinical Investigation (J. Clin. Invest.);
76, 2178 (1985)], it is clear that purification has not been sufficiently performed, and its activity and action,
The analysis and examination of physical properties and their origin are insufficient, and there is no analysis of the structure of amino acid sequence, etc., and it has the effect and safety that can be used as a medicament in the first place. It could not be positioned as a gain. That is, conventionally, in the above-mentioned substances, there is no sufficient analysis on the physical properties, structure, and the like, and a property of binding to thrombin and having an action of promoting the activation of protein C by thrombin is obtained, and There were no desirable situations, such as a peptide with sufficient solubility.

【００１０】[0010]

【発明が解決しようとする課題】従来より、血液凝固を
制御するための、または血小板凝集を制御するためのさ
らに有用なペプチドの提供が求められていた。Heretofore, there has been a demand for providing a more useful peptide for controlling blood coagulation or for controlling platelet aggregation.

【００１１】[0011]

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上述の技
術的背景にあって、血液の凝固線溶系の一因子であるプ
ロテインＣを活性化して血液凝固を抑制するだけでな
く、線溶作用を増進する物質を見出すべく鋭意研究を重
ねた結果、意外にも、後述するように本発明のペプチド
が、従来知られていない新規物質であって、トロンビン
に結合し、且つトロンビンによるプロテインＣ活性化を
促進して血液凝固を制御することができるだけでなく、
線溶を促進することができ、血液凝固を制御する薬剤、
即ち、血液凝固を制御するための、または血小板凝集を
制御するための医薬組成物として有用であることを見出
した。In the technical background described above, the present inventors have not only activated protein C, which is a factor in the coagulation / fibrinolysis system of blood, but also suppressed blood coagulation. As a result of intensive studies to find a substance that enhances the dissolution action, it was surprisingly found that the peptide of the present invention is a novel substance that has not been known until now and binds to thrombin, Not only can it promote C activation and control blood clotting,
Drugs that can promote fibrinolysis and control blood coagulation,
That is, they have found that they are useful as pharmaceutical compositions for controlling blood coagulation or for controlling platelet aggregation.

【００１２】また該ペプチドをコードするＤＮＡを単離
し、更にまた、そのペプチドが、組換えＤＮＡ技術によ
って、好ましくは他のヒト由来蛋白をまったく含まない
純粋な形態で、大量にかつ容易に製造でき、しかも該ペ
プチドが可溶性であって、医薬組成物自体やその製造に
おいて顕著に好ましい性質を有することを見出した。本
発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。It is also possible to isolate the DNA encoding the peptide and to produce the peptide in large quantities and easily by recombinant DNA technology, preferably in pure form without any other human-derived protein. In addition, they have found that the peptide is soluble and has remarkably favorable properties in the pharmaceutical composition itself and its production. The present invention has been completed based on these findings.

【００１３】即ち本発明によれば、配列番号７の１−５
７５のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列のアミノ酸
残基の置換、挿入または欠失を施すことにより得られる
アミノ酸配列を有し、且つ下記（ａ）、（ｂ）、（ｄ）
〜（ｆ）に規定される組換えペプチドであって、少なく
とも該組換えペプチド中に、ヒト由来の夾雑成分を実質
的に含有しないことを特徴とする実質的に精製された組
換えペプチド（但し、該ペプチドが配列番号３の１−４
９８のアミノ酸配列からなるペプチドである場合を除
く）。 （ａ）トロンビンに結合し、 （ｂ）トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進す
る作用を有する、 （ｄ）トロンビンによる凝固時間を延長する、 （ｅ）トロンビンによる血小板凝集を抑制する、 （ｆ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にて、銀染色
が可能である、が提供される。 本発明においては、以下特に断りのないかぎり配列番号
３の１−４９８のアミノ酸配列からなるペプチドである
場合を除くものである。本発明の組換えペプチドは、ヒ
ト由来の夾雑成分を実質的に含有しないものであって、
好ましいものである。この組換えペプチドは、配列番号
７の１−５７５のアミノ酸配列か、または該アミノ酸配
列のアミノ酸残基の置換、挿入または欠失を施すことに
よって得られるアミノ酸配列からなるペプチドであり、
これらは本発明の実施例により裏付けられている。また
上記組換えペプチドは、界面活性剤の非存在下で可溶性
であることが好ましい。That is, according to the present invention, 1-5 of SEQ ID NO: 7
Having the amino acid sequence of 75 or the amino acid sequence obtained by substituting, inserting or deleting an amino acid residue of the amino acid sequence, and having the following (a), (b) or (d)
(F) a substantially purified recombinant peptide characterized in that at least the recombinant peptide is substantially free of human-derived contaminants Wherein the peptide is 1-4 of SEQ ID NO: 3.
Excluding a peptide consisting of 98 amino acid sequences). (A) binds to thrombin, (b) has the effect of promoting the activation of protein C by thrombin, (d) prolongs the clotting time by thrombin, (e) inhibits thrombin-induced platelet aggregation, (f) Silver staining on SDS-polyacrylamide gel is provided. In the present invention, unless otherwise specified, a peptide consisting of the amino acid sequence of 1-498 of SEQ ID NO: 3 is excluded. The recombinant peptide of the present invention is substantially free of human-derived contaminant components,
It is preferred. This recombinant peptide is a peptide consisting of the amino acid sequence of 1 to 575 of SEQ ID NO: 7 or the amino acid sequence obtained by performing substitution, insertion or deletion of amino acid residues in the amino acid sequence,
These are supported by the embodiments of the present invention. Further, the above-mentioned recombinant peptide is preferably soluble in the absence of a surfactant.

【００１４】また、本発明によれば、下記（ａ）〜
（ｇ）に規定される実質的に精製された可溶性ペプチド
（但し、該ペプチドが配列番号３の１−４９８のアミノ
酸配列からなるペプチドである場合を除く）。 （ａ）トロンビンに結合し、 （ｂ）トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進す
る作用を有する、 （ｃ）少なくとも界面活性剤の非存在下で可溶である、 （ｄ）トロンビンによる凝固時間を延長する、 （ｅ）トロンビンによる血小板凝集を抑制する、 （ｆ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にて、銀染色
が可能である、 （ｇ）該可溶性ペプチドのアミノ酸配列の相同性が、該
アミノ酸配列の範囲において、下記の制限酵素地図According to the present invention, the following (a) to
A substantially purified soluble peptide as defined in (g), except that the peptide is a peptide consisting of the amino acid sequence of 1-498 of SEQ ID NO: 3. (A) binds to thrombin; (b) has the effect of promoting the activation of protein C by thrombin; (c) is soluble in the absence of at least a surfactant; (E) suppresses thrombin-induced platelet aggregation; (f) silver staining is possible on SDS-polyacrylamide gel; (g) homology of the amino acid sequence of the soluble peptide is In the range, the following restriction map

【化２】 に示された制限酵素サイトを有することにより特徴付け
られるヒト由来のＤＮＡがコードし得るトロンビンに結
合し、かつトロンビンによるプロテインＣの活性化を促
進する作用を有するペプチドのアミノ酸配列と完全に一
致する相同性を有する、が提供される。Embedded image (1) completely matches the amino acid sequence of a peptide which binds to thrombin which can be encoded by human-derived DNA characterized by having the restriction enzyme site shown in (1) and has an action of promoting the activation of protein C by thrombin. Having homology is provided.

【００１５】本発明のペプチドがトロンビンに結合する
ことは、例えば、本明細書実施例に記載されているよう
に、ＤＩＰ−トロンビン〔ジイソプロピルホスフォロト
ロンビン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏ
−ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、またはＤＩＰ−トロンビン−ア
ガロースに結合することにより確認される。また、トロ
ンビンによるプロテインＣの活性化を促進する活性を有
することも、本明細書実施例に記載されている通りであ
る。[0015] The binding of the peptide of the present invention to thrombin can be confirmed by, for example, as described in Examples herein, DIP-thrombin [diisopropylprophro- thrombin.
-Thrombin), or DIP-thrombin-agarose. In addition, it has the activity of promoting the activation of protein C by thrombin, as described in Examples in the present specification.

【００１６】本発明の可溶性ペプチドは、トロンビンに
よるプロテインＣの活性化を促進する活性物質として検
知され、回収される。通常本活性は、試料を０．１５Ｍ
食塩、２．５ｍＭ塩化カルシウム、１ｍｇ／ｍｌ血清ア
ルブミンを含有するｐＨ７．４の２０ｍＭトリス塩酸緩
衝液中にトロンビン及びプロテインＣの存在下添加し、
生成される活性化プロテインＣの量を定量し評価され
る。従って、本発明のペプチドは、上記緩衝液中に少な
くとも検知され得る濃度まで可溶性である。The soluble peptide of the present invention is detected and recovered as an active substance that promotes the activation of protein C by thrombin. Usually, the activity is 0.15 M
Sodium chloride, 2.5 mM calcium chloride, 1 mg / ml in 20 mM Tris-HCl buffer pH 7.4 containing 1 mg / ml serum albumin in the presence of thrombin and protein C;
The amount of activated protein C produced is quantified and evaluated. Thus, the peptides of the invention are soluble at least to a detectable concentration in the buffer.

【００１７】このように、ペプチドが可溶性であるこ
と、即ち、そのペプチドが界面活性剤の非存在下で調製
され得ることは、そのペプチドを医薬組成物として使用
するに際し、極めて有用なことであることについては、
既に述べた通りであるが、例えば、従来の物質において
は、界面活性剤の非存在下では不溶性であり、不溶物が
存在する注射剤としないために界面活性剤の添加を必須
とするが、種々の問題を有する循環器疾患の患者におい
て、この界面活性剤の添加は予想外の問題を引き起こす
可能性は否定できないし、また界面活性剤の添加量との
兼ね合いもあって、必ずしも十分に高い含有濃度の製剤
が調製できない可能性もあることが考えられる。As described above, the fact that the peptide is soluble, that is, the peptide can be prepared in the absence of a surfactant, is extremely useful when the peptide is used as a pharmaceutical composition. About that
As already described, for example, in a conventional substance, it is insoluble in the absence of a surfactant, and the addition of a surfactant is indispensable in order not to make an injectable in which insolubles are present, In patients with circulatory diseases having various problems, it cannot be denied that the addition of this surfactant may cause unexpected problems, and there is a balance with the amount of the surfactant added, so that it is not necessarily sufficiently high. It is conceivable that it may not be possible to prepare a formulation with a contained concentration.

【００１８】これに対し、本発明のペプチドは、可溶性
であるが故に、これらの問題はことごとく解決されるも
のである。また、医薬組成物を製造する場合において
も、本発明の可溶性であるペプチドが極めて有利である
ことは当然のことであって、例えば、精製が容易である
こと、製剤にするときに凍結乾燥等が容易であること等
が挙げられる。On the other hand, since the peptide of the present invention is soluble, all these problems can be solved. Also, in the case of producing a pharmaceutical composition, it is natural that the soluble peptide of the present invention is extremely advantageous. Is easy.

【００１９】本発明の可溶性ペプチドは、上記の作用と
可溶性を有すれば特に限定されなくともよいが、本発明
のペプチオドのアミノ酸配列の相同性は、図４０の制限
酵素地図に示された制限酵素サイトを有することにより
特徴付けられるヒト由来のＤＮＡのコードし得るトロン
ビンに結合し、トロンビンによるプロテインＣの活性化
を促進する作用を有するペプチドのアミノ酸配列と完全
に一致するものであり、このＤＮＡがコードし得るアミ
ノ酸配列は図４０の制限酵素地図の開始コドンの最初の
塩基から終止コドンの直前の塩基までの１７２５ｂｐの
塩基配列がコードし得るものであるが、このアミノ酸配
列の具体的例示としては、配列番号７の１−５７５のア
ミノ酸配列が好ましい例として挙げられる。尚、図４０
は図１１の一部分を示すものである。The soluble peptide of the present invention is not particularly limited as long as it has the above-mentioned action and solubility, but the homology of the amino acid sequence of the peptide of the present invention can be determined by the restriction enzyme shown in the restriction map shown in FIG. It is completely identical to the amino acid sequence of a peptide that binds to a thrombin that can be encoded by human-derived DNA characterized by having an enzyme site and has an effect of promoting the activation of protein C by thrombin. Can encode a 1725 bp nucleotide sequence from the first base of the start codon to the base immediately before the stop codon in the restriction enzyme map of FIG. 40. As a specific example of this amino acid sequence, Is preferably the amino acid sequence of 1 to 575 of SEQ ID NO: 7. Incidentally, FIG.
Shows a part of FIG.

【００２０】本発明の典型的なペプチドにおいては、ト
ロンビンに結合し、トロンビンによるプロテインＣの活
性化を促進する作用を有し、界面活性剤の非存在下で可
溶性であれば特に限定されないが、最も好ましい具体例
としては、配列番号１の１−１１８のアミノ酸配列、即
ち、下記式（Ｉ）： Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドが例示され
る。The typical peptide of the present invention is not particularly limited as long as it binds to thrombin, has an action of promoting the activation of protein C by thrombin, and is soluble in the absence of a surfactant. As a most preferred specific example, the amino acid sequence of 1-118 of SEQ ID NO: 1, that is, the following formula (I): Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu AsnGrThrNrThrNyS LeuCysValCysAlaGluGlyPheAlaProIleProHisGluProHisArgCysGlnMetPheCysAsnGlnThAlaCysProAlasPyAsAyPyAyApAyApAyPySyAyAyPyAyAgAyAyAyAyAyG Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Examples of the peptide include an amino acid sequence represented by Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys.

【００２１】勿論、式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列
は、最も好ましい例であって、上記の活性に程度の差が
あっても、上記の活性が認められる限り、特に式（Ｉ）
で表されるアミノ酸配列に拘泥する必要はない。またヒ
トにおいては、多型性と言われる変異があることは通常
十分に考えられることである。即ち、本発明のペプチド
は実質的に前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列から成
っていてもよいし、また、その作用と機能を阻害しない
限り若干の欠損、挿入、置換等があっても、その相同変
異体のアミノ酸配列であってもよく、式（Ｉ）で表され
るアミノ酸配列のＮ末端及び／またはＣ末端に結合した
少なくとも１種の他のペプチドのアミノ酸配列を更に含
有してもよい。Of course, the amino acid sequence represented by the formula (I) is the most preferred example.
It is not necessary to bind to the amino acid sequence represented by In humans, it is usually sufficiently possible to have a mutation referred to as polymorphism. That is, the peptide of the present invention may substantially consist of the amino acid sequence represented by the above formula (I), and may have some deletions, insertions, substitutions, etc. as long as the action and function are not inhibited. May also be the amino acid sequence of a homologous variant thereof, and further contain the amino acid sequence of at least one other peptide bound to the N-terminal and / or C-terminal of the amino acid sequence represented by Formula (I). You may.

【００２２】例えば、組換えペプチドが、配列番号の１
−４９８のアミノ酸配列のアミノ酸残基の置換、挿入ま
たは欠失を施すことにより得られるアミノ酸配列を有す
る組換えペプチドであることも好ましい。また、組換え
ペプチドが、（ｉ）配列番号８の１−２７２のアミノ酸
配列において、少なくとも該配列番号８の１１９−２３
６のアミノ酸配列を包含するように該配列番号８のＮ末
端及び／又はＣ末端の任意の個数のアミノ酸残基が削除
されていてもよいアミノ酸配列からなるトロンビンに結
合し、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進す
る作用を有する組換えペプチド、（ii) 前記（ｉ）に記
載の組換えペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸残基の置
換、挿入または欠失を施すことにより得られるアミノ酸
配列からなり、且つトロンビンに結合し、トロンビンに
よるプロテインＣの活性化を促進する作用を有する組換
えペプチド、のいずれかであることも好ましい。因み
に、これらの更に具体的なペプチドの例としては、
（１）上記式（Ｉ）のペプチドの他、下記のペプチドの
（２）〜（５）が挙げられる。（但し、配列番号３の１
−４９８のアミノ酸配列は参考のため例示する）。For example, when the recombinant peptide is
It is also preferred that the peptide is a recombinant peptide having an amino acid sequence obtained by substitution, insertion or deletion of the amino acid residue of the amino acid sequence of -498. In addition, the recombinant peptide has (i) at least 119-23 of SEQ ID NO: 8 in the amino acid sequence of 1-272 of SEQ ID NO: 8;
SEQ ID NO: 8 binds to thrombin consisting of an amino acid sequence in which an arbitrary number of amino acid residues at the N-terminal and / or C-terminal may be deleted so as to encompass the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, (Ii) an amino acid sequence obtained by performing substitution, insertion or deletion of amino acid residues in the amino acid sequence of the recombinant peptide according to (i), Further, it is also preferable that the peptide be any of recombinant peptides that bind to thrombin and have an action of promoting the activation of protein C by thrombin. Incidentally, examples of these more specific peptides include:
(1) In addition to the peptide of the above formula (I), the following peptides (2) to (5) may be mentioned. (However, 1 of SEQ ID NO: 3
The amino acid sequence of -498 is exemplified for reference).

【００２３】（２）式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端に下記のアミノ酸配列： Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ が結合してなるペプチド（即ち、配列番号６の１−２３
６のアミノ酸配列）。(2) The following amino acid sequence is added to the N-terminus of the amino acid sequence represented by the formula (I): Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Glyn Cy Lys Ny Gly Ala Ala Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu ro 1-23 of Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys is formed by bonding a peptide (i.e., SEQ ID NO: 6
6 amino acid sequence).

【００２４】（３）式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端及びＣ末端にそれぞれ下記のアミノ酸配列： Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ 及び Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ が結合してなるペプチド（即ち、配列番号８の１−２７
２のアミノ酸配列）。(3) The following amino acid sequences are provided at the N-terminal and C-terminal of the amino acid sequence represented by the formula (I): Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys I e Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys and Asp Ser Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser Pro Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu Val His Ser Gly peptide (namely, 1-27 of SEQ ID NO: 8)
2 amino acid sequence).

【００２５】（４）式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端及びＣ末端にそれぞれ下記のアミノ酸配列： Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ 及び Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ が結合してなるペプチド（即ち、配列番号３の１−４９
８のアミノ酸配列）。(4) The following amino acid sequences are provided at the N-terminal and the C-terminal of the amino acid sequence represented by the formula (I), respectively: Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly P o Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp P e Gln Ala Leu Pro Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro G y Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro bound to the Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys and Asp Ser Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu Val His Ser Gly Peptide (ie, 1-49 of column number 3
8 amino acid sequence).

【００２６】（５）配列番号１４の１−４６２のアミノ
酸配列からなるペプチド。 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys (5) A peptide consisting of the amino acid sequence of 1-462 of SEQ ID NO: 14. Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys

【００２７】本発明のペプチドはＮ末端アミノ酸残基と
してアミノ酸メチオニンを含有していてもよい。本発明
のペプチドはまた、Ｎ末端アミノ酸配列として例えば次
式：Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ ＡｌａＬｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａ
ｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏで表さ
れるアミノ酸配列を有するリーダー配列、またはその一
部を含有していてもよい。The peptide of the present invention may contain the amino acid methionine as the N-terminal amino acid residue. The peptide of the present invention may also have an N-terminal amino acid sequence of, for example, the following formula: Met Leu Gly Val Leu Val
Leu Gly AlaLeu Ala Leu A
It may contain a leader sequence having an amino acid sequence represented by la Gly Leu Gly Phe Pro, or a part thereof.

【００２８】自然の変異によりまたは人工の変異によ
り、ペプチドの活性および可溶性に重大な変化を与える
ことなく、ペプチドの構造の一部を変化させることが可
能である。本発明のペプチドは、トロンビンい結合し、
トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用
を有する限り、前記アミノ酸配列を有するペプチドの相
同変異体（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｖａｒｉａｎｔ）に
想到する構造を有するペプチドも包含する。置換、挿入
または欠失については、特に好ましくは１個もしくは数
個が例示されるが、特に限定されることはなく、本発明
の実施例に示される通りに解釈されるものである。本発
明のペプチドは少なくとも１個の糖残基を含有していて
もよいし、含有していなくてもよい。即ち、本発明では
少なくともアミノ酸配列として、本明細書に説明された
配列であることを示すものであって、特に糖残基により
限定されるものではない。It is possible to alter a part of the structure of a peptide by natural or artificial mutation without significantly altering the activity and solubility of the peptide. The peptide of the present invention binds to thrombin,
As long as it has an action of promoting the activation of protein C by thrombin, a peptide having a structure reminiscent of a homologous variant of the peptide having the amino acid sequence (Homologous variant) is also included. The substitution, insertion or deletion is particularly preferably one or several, but is not particularly limited, and should be interpreted as shown in the examples of the present invention. The peptide of the present invention may or may not contain at least one sugar residue. That is, in the present invention, it is shown that at least the amino acid sequence is a sequence described in the present specification, and is not particularly limited by a sugar residue.

【００２９】本発明のペプチドを製造するに当たって
は、例えば、以下の方法により遺伝子操作技術を用いる
ことが好ましい。この遺伝子操作技術に用いるヒト由来
の遺伝子としては、例えば本発明の図４０に示される制
限酵素地図のＤＮＡ等の遺伝子を出発原料として、本明
細書に開示されるトロンビンに結合し、トロンビンによ
るプロテインＣの活性化を促進する作用を有し、好まし
くは配列番号７の１−５７５のアミノ酸配列の部分配列
からなる、またさらに好ましくは界面活性剤の非存在下
で可溶性であるペプチドである、ペプチドをコードする
遺伝子へと、通常の遺伝子操作技術で変更すれば良いも
のであり、例えば、本明細書で開示された種々のペプチ
ドをコードする遺伝子を用いればよい。In producing the peptide of the present invention, for example, it is preferable to use a genetic engineering technique by the following method. As a human-derived gene used in this genetic engineering technique, for example, a gene such as DNA of a restriction enzyme map shown in FIG. A peptide having an activity of promoting C activation, preferably consisting of a partial sequence of the amino acid sequence of 1 to 575 of SEQ ID NO: 7, and more preferably a peptide which is soluble in the absence of a surfactant May be changed to a gene encoding the peptide by ordinary gene manipulation techniques. For example, genes encoding various peptides disclosed in the present specification may be used.

【００３０】本発明における好ましい遺伝子を例示すれ
ば、以下の例が挙げられる。例えば、次式（II）（即
ち、配列番号４の１−３５４の塩基配列）： ＧＴＧＧＡＧＣＣＣＧ ＴＧＧＡＣＣＣＧＴＧ ＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣ ＡＡＣＴＧＣＧＡＧＴ ＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡ ＧＣＣＣＣＴＧＡＡＣ ＣＡＡＡＣＴＡＧＣＴ ＡＣＣＴＣＴＧＣＧＴ ＣＴＧＣＧＣＣＧＡＧ ＧＧＣＴＴＣＧＣＧＣ ＣＣＡＴＴＣＣＣＣＡ ＣＧＡＧＣＣＧＣＡＣ ＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡ ＴＧＴＴＴＴＧＣＡＡ ＣＣＡＧＡＣＴＧＣＣ ＴＧＴＣＣＡＧＣＣＧ ＡＣＴＧＣＧＡＣＣＣ ＣＡＡＣＡＣＣＣＡＧ ＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧ ＡＧＴＧＣＣＣＴＧＡ ＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣ ＣＴＧＧＡＣＧＡＣＧ ＧＴＴＴＣＡＴＣＴＧ ＣＡＣＧＧＡＣＡＴＣ ＧＡＣＧＡＧＴＧＣＧ ＡＡＡＡＣＧＧＣＧＧ ＣＴＴＣＴＧＣＴＣＣ ＧＧＧＧＴＧＴＧＣＣ ＡＣＡＡＣＣＴＣＣＣ ＣＧＧＴＡＣＣＴＴＣ ＧＡＧＴＧＣＡＴＣＴ ＧＣＧＧＧＣＣＣＧＡ ＣＴＣＧＧＣＣＣＴＴ ＧＴＣＣＧＣＣＡＣＡ ＴＴＧＧＣＡＣＣＧＡ ＣＴＧＴ で表される塩基配列を含有するＤＮＡである。Examples of preferred genes in the present invention include the following. For example, the following formula (II) (i.e., the base sequence of 1-354 of SEQ ID NO 4): GTGGAGCCCG TGGACCCGTG CTTCAGAGCC AACTGCGAGT ACCAGTGCCA GCCCCTGAAC CAAACTAGCT ACCTCTGCGT CTGCGCCGAG GGCTTCGCGC CCATTCCCCA CGAGCCGCAC AGGTGCCAGA TGTTTTGCAA CCAGACTGCC TGTCCAGCCG ACTGCGACCC CAACACCCAG GCTAGCTGTG AGTGCCCTGA AGGCTACATC CTGGACGACG GTTTCATCTG CACGGACATC GACGAGTGCG AAAACGGCGG CTTCTGCTCC GGGGTGTGCC ACAACCTCCCCG A DNA containing the base sequence represented by TACCTTC GAGTGCATCT GCGGGCCCGA CTCGGCCCTT GTCCGCCACA TTGGCACCGA CTGT.

【００３１】遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産さ
れるポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくその
遺伝子の塩基配列の少なくとも１つの塩基を他の種類の
塩基に置換することができる。従って、本発明のＤＮＡ
はまた、遺伝略号の縮重に基づく置換によって変化され
た塩基配列を含有することも可能である。この場合、上
記置換により得られた塩基配列から演繹されるアミノ酸
配列は前に定義したアミノ酸配列と一致する。According to the degeneracy of the genetic code, at least one base in the base sequence of the gene can be replaced with another type of base without changing the amino acid sequence of the polypeptide produced from the gene. Therefore, the DNA of the present invention
Can also contain a nucleotide sequence altered by substitution based on the degeneracy of the genetic abbreviation. In this case, the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence obtained by the above substitution matches the amino acid sequence defined previously.

【００３２】本発明のＤＮＡは前記式（II）で表される
塩基配列と、その５′末端および／または３′末端に結
合した少なくとも１種の他の塩基配列とを含有していて
もよい。式（II）で表される塩基配列と少なくとも１種
の他の塩基配列とを含有するＤＮＡの例としては下記の
ＤＮＡ（１）〜（５）が挙げられる（但し、配列番号５
の１−１４９４の塩基配列は参考のため提示する）。The DNA of the present invention may contain the nucleotide sequence represented by the above formula (II) and at least one other nucleotide sequence bonded to its 5 'end and / or 3' end. . Examples of DNAs containing the base sequence represented by the formula (II) and at least one other base sequence include the following DNAs (1) to (5) (provided that SEQ ID NO: 5
The base sequence of 1-1494 is shown for reference).

【００３３】（１）上記式（II）で表されるＤＮＡ（即
ち、配列番号４の１−３５４の塩基配列）。 （２）式（II）で表される塩基配列とその５′末端に結
合した次式： ＴＧＣＡＧＣＧＴＧＧ ＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧ ＣＴＧＣＧＡＧＣＡＣ ＧＣＧＴＧＣＡＡＴＧ ＣＧＡＴＣＣＣＴＧＧ ＧＧＣＴＣＣＣＣＧＣ ＴＧＣＣＡＧＴＧＣＣ ＣＡＧＣＣＧＧＣＧＣ ＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧ ＧＣＡＧＡＣＧＧＧＣ ＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣ ＣＧＣＡＴＣＣＧＣＧ ＡＣＧＣＡＧＴＣＣＴ ＧＣＡＡＣＧＡＣＣＴ ＣＴＧＣＧＡＧＣＡＣ ＴＴＣＴＧＣＧＴＴＣ ＣＣＡＡＣＣＣＣＧＡ ＣＣＡＧＣＣＧＧＧＣ ＴＣＣＴＡＣＴＣＧＴ ＧＣＡＴＧＴＧＣＧＡ ＧＡＣＣＧＧＣＴＡＣ ＣＧＧＣＴＧＧＣＧＧ ＣＣＧＡＣＣＡＡＣＡ ＣＣＧＧＴＧＣＧＡＧ ＧＡＣＧＴＧＧＡＴＧ ＡＣＴＧＣＡＴＡＣＴ ＧＧＡＧＣＣＣＡＧＴ ＣＣＧＴＧＴＣＣＧＣ ＡＧＣＧＣＴＧＴＧＴ ＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧ ＧＧＴＧＧＣＴＴＣＧ ＡＧＴＧＣＣＡＣＴＧ ＣＴＡＣＣＣＴＡＡＣ ＴＡＣＧＡＣＣＴＧＧ ＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡ ＧＴＧＴ で表される塩基配列が結合してなるＤＮＡ（即ち、配列
番号９の１−７０８の塩基配列）。(1) DNA represented by the above formula (II) (namely, the nucleotide sequence of 1-354 of SEQ ID NO: 4). (2) formula (II) nucleotide sequence represented by the binding in its 5 'end the following formula: TGCAGCGTGG AGAACGGCGG CTGCGAGCAC GCGTGCAATG CGATCCCTGG GGCTCCCCGC TGCCAGTGCC CAGCCGGCGC CGCCCTGCAG GCAGACGGGC GCTCCTGCAC CGCATCCGCG ACGCAGTCCT GCAACGACCT CTGCGAGCAC TTCTGCGTTC CCAACCCCGA CCAGCCGGGC TCCTACTCGT GCATGTGCGA GACCGGCTAC CGGCTGGCGG CCGACCAACA CCGGTGCGAG GACGTGGATG ACTGCATACT GGAGCCCAGT CCGTGTCCGC AGCGCTGTGT CA CACACAG GGTGGCTTCG AGTGCCACTG CTACCCTAAC TACGACCTGG TGGACGGCGA GTGT with DNA base sequence is bonded represented (i.e., the base sequence of 1-708 of SEQ ID NO: 9).

【００３４】（３）式（II）で表される塩基配列の５′
末端および３′末端に夫々次式： ＴＧＣＡＧＣＧＴＧＧ ＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧ ＣＴＧＣＧＡＧＣＡＣ ＧＣＧＴＧＣＡＡＴＧ ＣＧＡＴＣＣＣＴＧＧ ＧＧＣＴＣＣＣＣＧＣ ＴＧＣＣＡＧＴＧＣＣ ＣＡＧＣＣＧＧＣＧＣ ＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧ ＧＣＡＧＡＣＧＧＧＣ ＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣ ＣＧＣＡＴＣＣＧＣＧ ＡＣＧＣＡＧＴＣＣＴ ＧＣＡＡＣＧＡＣＣＴ ＣＴＧＣＧＡＧＣＡＣ ＴＴＣＴＧＣＧＴＴＣ ＣＣＡＡＣＣＣＣＧＡ ＣＣＡＧＣＣＧＧＧＣ ＴＣＣＴＡＣＴＣＧＴ ＧＣＡＴＧＴＧＣＧＡ ＧＡＣＣＧＧＣＴＡＣ ＣＧＧＣＴＧＧＣＧＧ ＣＣＧＡＣＣＡＡＣＡ ＣＣＧＧＴＧＣＧＡＧ ＧＡＣＧＴＧＧＡＴＧ ＡＣＴＧＣＡＴＡＣＴ ＧＧＡＧＣＣＣＡＧＴ ＣＣＧＴＧＴＣＣＧＣ ＡＧＣＧＣＴＧＴＧＴ ＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧ ＧＧＴＧＧＣＴＴＣＧ ＡＧＴＧＣＣＡＣＴＧ ＣＴＡＣＣＣＴＡＡＣ ＴＡＣＧＡＣＣＴＧＧ ＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡ ＧＴＧＴ 及び ＧＡＣＴＣＣＧＧＣＡ ＡＧＧＴＧＧＡＣＧＧ ＴＧＧＣＧＡＣＡＧＣ ＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧ ＡＧＣＣＣＣＣＧＣＣ ＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧ ＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡ ＣＣＴＴＧＡＣＴＣＣ ＴＣＣＧＧＣＣＧＴＧ ＧＧＧＣＴＣＧＴＧＣ ＡＴＴＣＧＧＧＣ で表される塩基配列が結合してなるＤＮＡ（即ち、配列
番号１１の１−８１６の塩基配列）。(3) 5 'of the base sequence represented by the formula (II)
End and a 3 'husband terminus s following equation: TGCAGCGTGG AGAACGGCGG CTGCGAGCAC GCGTGCAATG CGATCCCTGG GGCTCCCCGC TGCCAGTGCC CAGCCGGCGC CGCCCTGCAG GCAGACGGGC GCTCCTGCAC CGCATCCGCG ACGCAGTCCT GCAACGACCT CTGCGAGCAC TTCTGCGTTC CCAACCCCGA CCAGCCGGGC TCCTACTCGT GCATGTGCGA GACCGGCTAC CGGCTGGCGG CCGACCAACA CCGGTGCGAG GACGTGGATG ACTGCATACT GGAGCCCAGT CCGTGTCCGC AGCGCTGTGT CAACACACAG GGTGGCTT CG AGTGCCACTG CTACCCTAAC TACGACCTGG TGGACGGCGA GTGT and GACTCCGGCA AGGTGGACGG TGGCGACAGC GGCTCTGGCG AGCCCCCGCC CAGCCCGACG CCCGGCTCCA CCTTGACTCC TCCGGCCGTG GGGCTCGTGC ATTCGGGC with DNA base sequence is bonded represented (i.e., the base sequence of 1-816 of SEQ ID NO: 11).

【００３５】（４）式（II）で表される塩基配列の５′
末端および３′末端に夫々次式： ＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧ ＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣ ＧＧＧＴＧＧＣＡＧＣ ＣＡＧＴＧＣＧＴＣＧ ＡＧＣＡＣＧＡＣＴＧ ＣＴＴＣＧＣＧＣＴＣ ＴＡＣＣＣＧＧＧＣＣ ＣＣＧＣＧＡＣＣＴＴ ＣＣＴＣＡＡＴＧＣＣ ＡＧＴＣＡＧＡＴＣＴ ＧＣＧＡＣＧＧＡＣＴ ＧＣＧＧＧＧＣＣＡＣ ＣＴＡＡＴＧＡＣＡＧ ＴＧＣＧＣＴＣＣＴＣ ＧＧＴＧＧＣＴＧＣＣ ＧＡＴＧＴＣＡＴＴＴ ＣＣＴＴＧＣＴＡＣＴ ＧＡＡＣＧＧＣＧＡＣ ＧＧＣＧＧＣＧＴＴＧ ＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧ ＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣ ＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣ ＴＧＣＣＡＣＣＣＧＧ ＣＴＧＣＧＧＣＧＡＣ ＣＣＣＡＡＧＣＧＣＣ ＴＣＧＧＧＣＣＣＣＴ ＧＣＧＣＧＧＣＴＴＣ ＣＡＧＴＧＧＧＴＴＡ ＣＧＧＧＡＧＡＣＡＡ ＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣ ＴＡＴＡＧＣＡＧＧＴ ＧＧＧＣＡＣＧＧＣＴ ＣＧＡＣＣＴＣＡＡＴ ＧＧＧＧＣＴＣＣＣＣ ＴＣＴＧＣＧＧＣＣＣ ＧＴＴＧＴＧＣＧＴＣ ＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧ ＣＴＧＣＴＧＡＧＧＣ ＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣ ＡＧＣＧＡＧＣＣＧＡ ＴＣＴＧＧＧＡＧＧＡ ＧＣＡＧＣＡＧＴＧＣ ＧＡＡＧＴＧＡＡＧＧ ＣＣＧＡＴＧＧＣＴＴ ＣＣＴＣＴＧＣＧＡＧ ＴＴＣＣＡＣＴＴＣＣ ＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧ ＣＡＧＧＣＣＡＣＴＧ ＧＣＴＧＴＧＧＡＧＣ ＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣ ＧＧＣＴＧＣＣＧＣＣ ＧＴＣＴＣＧＡＴＣＡ ＣＣＴＡＣＧＧＣＡＣ ＣＣＣＧＴＴＣＧＣＧ ＧＣＣＣＧＣＧＧＡＧ ＣＧＧＡＣＴＴＣＣＡ ＧＧＣＧＣＴＧＣＣＧ ＧＴＧＧＧＣＡＧＣＴ ＣＣＧＣＣＧＣＧＧＴ ＧＧＣＴＣＣＣＣＴＣ ＧＧＣＴＴＡＣＡＧＣ ＴＡＡＴＧＴＧＣＡＣ ＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣ ＧＧＡＧＣＧＧＴＣＣ ＡＧＧＧＧＣＡＣＴＧ ＧＧＣＣＡＧＧＧＡＧ ＧＣＧＣＣＧＧＧＣＧ ＣＴＴＧＧＧＡＣＴＧ ＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧ ＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴ ＧＣＧＡＧＣＡＣＧＣ ＧＴＧＣＡＡＴＧＣＧ ＡＴＣＣＣＴＧＧＧＧ ＣＴＣＣＣＣＧＣＴＧ ＣＣＡＧＴＧＣＣＣＡ ＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧ ＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣ ＡＧＡＣＧＧＧＣＧＣ ＴＣＣＴＧＣＡＣＣＧ ＣＡＴＣＣＧＣＧＡＣ ＧＣＡＧＴＣＣＴＧＣ ＡＡＣＧＡＣＣＴＣＴ ＧＣＧＡＧＣＡＣＴＴ ＣＴＧＣＧＴＴＣＣＣ ＡＡＣＣＣＣＧＡＣＣ ＡＧＣＣＧＧＧＣＴＣ ＣＴＡＣＴＣＧＴＧＣ ＡＴＧＴＧＣＧＡＧＡ ＣＣＧＧＣＴＡＣＣＧ ＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣ ＧＡＣＣＡＡＣＡＣＣ ＧＧＴＧＣＧＡＧＧＡ ＣＧＴＧＧＡＴＧＡＣ ＴＧＣＡＴＡＣＴＧＧ ＡＧＣＣＣＡＧＴＣＣ ＧＴＧＴＣＣＧＣＡＧ ＣＧＣＴＧＴＧＴＣＡ ＡＣＡＣＡＣＡＧＧＧ ＴＧＧＣＴＴＣＧＡＧ ＴＧＣＣＡＣＴＧＣＴ ＡＣＣＣＴＡＡＣＴＡ ＣＧＡＣＣＴＧＧＴＧ ＧＡＣＧＧＣＧＡＧＴ ＧＴ 及び ＧＡＣＴＣＣＧＧＣＡ ＡＧＧＴＧＧＡＣＧＧ ＴＧＧＣＧＡＣＡＧＣ ＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧ ＡＧＣＣＣＣＣＧＣＣ ＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧ ＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡ ＣＣＴＴＧＡＣＴＣＣ ＴＣＣＧＧＣＣＧＴＧ ＧＧＧＣＴＣＧＴＧＣ ＡＴＴＣＧＧＧＣ で表される塩基配列が結合してなるＤＮＡ（即ち、配列
番号５の１−１４９４の塩基配列）。(4) 5 'of the base sequence represented by the formula (II)
End and a 3 'husband terminus s following equation: GCACCCGCAG AGCCGCAGCC GGGTGGCAGC CAGTGCGTCG AGCACGACTG CTTCGCGCTC TACCCGGGCC CCGCGACCTT CCTCAATGCC AGTCAGATCT GCGACGGACT GCGGGGCCAC CTAATGACAG TGCGCTCCTC GGTGGCTGCC GATGTCATTT CCTTGCTACT GAACGGCGAC GGCGGCGTTG GCCGCCGGCG CCTCTGGATC GGCCTGCAGC TGCCACCCGG CTGCGGCGAC CCCAAGCGCC TCGGGCCCCT GCGCGGCTTC CAGTGGGTTA CGGGAGACAA CAACACCAGC TATAGCAG GT GGGCACGGCT CGACCTCAAT GGGGCTCCCC TCTGCGGCCC GTTGTGCGTC GCTGTCTCCG CTGCTGAGGC CACTGTGCCC AGCGAGCCGA TCTGGGAGGA GCAGCAGTGC GAAGTGAAGG CCGATGGCTT CCTCTGCGAG TTCCACTTCC CAGCCACCTG CAGGCCACTG GCTGTGGAGC CCGGCGCCGC GGCTGCCGCC GTCTCGATCA CCTACGGCAC CCCGTTCGCG GCCCGCGGAG CGGACTTCCA GGCGCTGCCG GTGGGCAGCT CCGCCGCGGT GGCTCCCCTC GGCTTACAGC TAATGTGCAC CGCGCCGCCC GAGCGGTCC AGGGGCACTG GGCCAGGGAG GCGCCGGGCG CTTGGGACTG CAGCGTGGAG AACGGCGGCT GCGAGCACGC GTGCAATGCG ATCCCTGGGG CTCCCCGCTG CCAGTGCCCA GCCGGCGCCG CCCTGCAGGC AGACGGGCGC TCCTGCACCG CATCCGCGAC GCAGTCCTGC AACGACCTCT GCGAGCACTT CTGCGTTCCC AACCCCGACC AGCCGGGCTC CTACTCGTGC ATGTGCGAGA CCGGCTACCG GCTGGCGGCC GACCAACACC GGTGCGAGGA CGTGGATGAC TGCATACTGG AGCCCAGTCC GTG TCCGCAG CGCTGTGTCA ACACACAGGG TGGCTTCGAG TGCCACTGCT ACCCTAACTA CGACCTGGTG GACGGCGAGT GT and GACTCCGGCA AGGTGGACGG TGGCGACAGC GGCTCTGGCG AGCCCCCGCC CAGCCCGACG CCCGGCTCCA CCTTGACTCC TCCGGCCGTG GGGCTCGTGC ATTCGGGC with DNA base sequence is bonded represented (i.e., the base sequence of 1-1494 of SEQ ID NO: 5).

【００３６】（５）配列番号１５の１−１３８６の塩基
配列からなるＤＮＡ。 GCACCCGCAG AGCCGCAGCC GGGTGGCAGC CAGTGCGTCG AGCACGACTG CTTCGCGCTC TACCCGGGCC CCGCGACCTT CCTCAATGCC AGTCAGATCT GCGACGGACT GCGGGGCCAC CTAATGACAG TGCGCTCCTC GGTGGCTGCC GATGTCATTT CCTTGCTACT GAACGGCGAC GGCGGCGTTG GCCGCCGGCG CCTCTGGATC GGCCTGCAGC TGCCACCCGG CTGCGGCGAC CCCAAGCGCC TCGGGCCCCT GCGCGGCTTC CAGTGGGTTA CGGGAGACAA CAACACCAGC TATAGCAGGT GGGCACGGCT CGACCTCAAT GGGGCTCCCC TCTGCGGCCC GTTGTGCGTC GCTGTCTCCG CTGCTGAGGC CACTGTGCCC AGCGAGCCGA TCTGGGAGGA GCAGCAGTGC GAAGTGAAGG CCGATGGCTT CCTCTGCGAG TTCCACTTCC CAGCCACCTG CAGGCCACTG GCTGTGGAGC CCGGCGCCGC GGCTGCCGCC GTCTCGATCA CCTACGGCAC CCCGTTCGCG GCCCGCGGAG CGGACTTCCA GGCGCTGCCG GTGGGCAGCT CCGCCGCGGT GGCTCCCCTC GGCTTACAGC TAATGTGCAC CGCGCCGCCC GGAGCGGTCC AGGGGCACTG GGCCAGGGAG GCGCCGGGCG CTTGGGACTG CAGCGTGGAG AACGGCGGCT GCGAGCACGC GTGCAATGCG ATCCCTGGGG CTCCCCGCTG CCAGTGCCCA GCCGGCGCCG CCCTGCAGGC AGACGGGCGC TCCTGCACCG CATCCGCGAC GCAGTCCTGC AACGACCTCT GCGAGCACTT CTGCGTTCCC AACCCCGACC AGCCGGGCTC CTACTCGTGC ATGTGCGAGA CCGGCTACCG GCTGGCGGCC GACCAACACC GGTGCGAGGA CGTGGATGAC TGCATACTGG AGCCCAGTCC GTGTCCGCAG CGCTGTGTCA ACACACAGGG TGGCTTCGAG TGCCACTGCT ACCCTAACTA CGACCTGGTG GACGGCGAGT GTGTGGAGCC CGTGGACCCG TGCTTCAGAG CCAACTGCGA GTACCAGTGC CAGCCCCTGA ACCAAACTAG CTACCTCTGC GTCTGCGCCG AGGGCTTCGC GCCCATTCCC CACGAGCCGC ACAGGTGCCA GATGTTTTGC AACCAGACTG CCTGTCCAGC CGACTGCGAC CCCAACACCC AGGCTAGCTG TGAGTGCCCT GAAGGCTACA TCCTGGACGA CGGTTTCATC TGCACGGACA TCGACGAGTG CGAAAACGGC GGCTTCTGCT CCGGGGTGTG CCACAACCTC CCCGGTACCT TCGAGTGCAT CTGCGGGCCC GACTCGGCCC TTGTCCGCCA CATTGGCACC GACTGT(5) DNA comprising the nucleotide sequence of 1-1386 of SEQ ID NO: 15. GCACCCGCAG AGCCGCAGCC GGGTGGCAGC CAGTGCGTCG AGCACGACTG CTTCGCGCTC TACCCGGGCC CCGCGACCTT CCTCAATGCC AGTCAGATCT GCGACGGACT GCGGGGCCAC CTAATGACAG TGCGCTCCTC GGTGGCTGCC GATGTCATTT CCTTGCTACT GAACGGCGAC GGCGGCGTTG GCCGCCGGCG CCTCTGGATC GGCCTGCAGC TGCCACCCGG CTGCGGCGAC CCCAAGCGCC TCGGGCCCCT GCGCGGCTTC CAGTGGGTTA CGGGAGACAA CAACACCAGC TATAGCAGGT GGGCACGGCT CGACCTCAAT GGGGCTCCCC TCTGCGGCCC GTTGTGCGTC GCTGTCTCCG CTGCTGAGGC CACTGTGCCC AGCGAGCCGA TCTGGGAGGA GCAGCAGTGC GAAGTGAAGG CCGATGGCTT CCTCTGCGAG TTCCACTTCC CAGCCACCTG CAGGCCACTG GCTGTGGAGC CCGGCGCCGC GGCTGCCGCC GTCTCGATCA CCTACGGCAC CCCGTTCGCG GCCCGCGGAG CGGACTTCCA GGCGCTGCCG GTGGGCAGCT CCGCCGCGGT GGCTCCCCTC GGCTTACAGC TAATGTGCAC CGCGCCGCCC GGAGCGGTCC AGGGGCACTG GGCCAGGGAG GCGCCGGGCG CTTGGGACTG CAGCGTGGAG AACGGCGGCT GCGAGCACGC GTGCAATGCG ATCCCTGGGG CTCCCCGCTG CCAGTGCCCA GCCGGCGCCG CCCTGCAGGC AGACGGGCGC TCCTGCACCG CATCCGCGAC GCAGTCCTGC AACGACCTCT GCGAGCACTT CTGCGTTCCC AACCCCGACC AGCCGGGCTC CTACTCGTGC ATGTGCGAGA CCGGCTACCG GCTGGCGGCC GACCAACACC GGTGCGAGGA CGTGGATGAC TGCATACTGG AGCCCAGTCC GTGTCCGCAG CGCTGTGTCA ACACACAGGG TGGCTTCGAG TGCCACTGCT ACCCTAACTA CGACCTGGTG GACGGCGAGT GTGTGGAGCC CGTGGACCCG TGCTTCAGAG CCAACTGCGA GTACCAGTGC CAGCCCCTGA ACCAAACTAG CTACCTCTGC GTCTGCGCCG AGGGCTTCGC GCCCATTCCC CACGAGCCGC ACAGGTGCCA GATGTTTTGC AACCAGACTG CCTGTCCAGC CGACTGCGAC CCCAACACCC AGGCTAGCTG TGAGTGCCCT GAAGGCTACA TCCTGGACGA CGGTTTCATC TGCACGGACA TCGACGAGTG CGAAAACGGC GGCTTCTGCT CCGGGGTGTG CCACAACCTC CCCGGTACCT TCGAGTGCAT CTGCGGGCCC GACTCGGCCC TTGTCCGCCA CATTGGCACC GACTGT

【００３７】本発明のＤＮＡは、例えば、以下のように
して得ることができる。 （１）トロンビンのプロテインＣ活性化を促進すること
のできるヒト肺由来のペプチドに特異的な、ウサギから
得られる抗体を用いて、ヒト肺から調製したｃＤＮＡラ
イブラリーからその抗体と結合するペプチドをコードす
るｃＤＮＡ断片を単離し、単離したｃＤＮＡ断片の塩基
配列を分析する。得られたｃＤＮＡ断片はトロンビンの
プロテインＣ活性化を促進することのできるヒト肺由来
のペプチドの一部分をコードしている。その部分はその
ペプチドのＣ末端を含むがＮ末端を含まない。The DNA of the present invention can be obtained, for example, as follows. (1) Using an antibody obtained from a rabbit, which is specific for a peptide derived from human lung and capable of promoting protein C activation of thrombin, a peptide that binds to the antibody is extracted from a cDNA library prepared from human lung. The encoding cDNA fragment is isolated, and the nucleotide sequence of the isolated cDNA fragment is analyzed. The resulting cDNA fragment encodes a portion of a human lung-derived peptide capable of promoting protein C activation of thrombin. That portion includes the C-terminus but not the N-terminus of the peptide.

【００３８】（２）上述のように、得られたｃＤＮＡ断
片はヒト肺由来のペプチドの全アミノ酸配列をコードし
ておらず、そのペプチドのＮ末端アミノ酸配列に対応す
る塩基配列を欠いているので、Ｎ末端アミノ酸配列をコ
ードするｃＤＮＡ断片を上記工程（１）で得られるｃＤ
ＮＡ断片を利用して通常の公知のプライマーエクステン
ション法により以下のようにして得る。 まず、上記工程（１）で得られたｃＤＮＡ断片のコード
するペプチドのＮ末端側のアミノ酸配列に対応するｃＤ
ＮＡ断片の一部分を有機化学合成する。次に、合成した
ＤＮＡをプライマーとして用いて通常の公知のプライマ
ーエクステンション法によりヒトさい帯内皮細胞より調
製したポリ（Ａ）+ ＲＮＡから上記工程（１）で得られ
るｃＤＮＡ断片の５′末端の上流の塩基配列を有するｃ
ＤＮＡ断片を得る。上記プライマーエクステンションを
繰り返すことによりヒト肺由来のペプチドのＮ末端アミ
ノ酸配列をコードするｃＤＮＡ断片を得る。(2) As described above, the obtained cDNA fragment does not encode the entire amino acid sequence of the peptide derived from human lung and lacks the nucleotide sequence corresponding to the N-terminal amino acid sequence of the peptide. , The cDNA fragment encoding the N-terminal amino acid sequence was obtained using the cD
It is obtained as follows by an ordinary known primer extension method using an NA fragment. First, the cD corresponding to the N-terminal amino acid sequence of the peptide encoded by the cDNA fragment obtained in the above step (1)
A portion of the NA fragment is chemically synthesized. Next, using the synthesized DNA as a primer, a 5′-end upstream of the 5 ′ end of the cDNA fragment obtained in the above step (1) from poly (A) + RNA prepared from human umbilical cord endothelial cells by a known primer extension method. C having a base sequence
Obtain a DNA fragment. By repeating the above primer extension, a cDNA fragment encoding the N-terminal amino acid sequence of the peptide derived from human lung is obtained.

【００３９】（３）次に、前記工程（１）及び（２）で
得られたｃＤＮＡ断片を適宜結合することにより、開始
コドンから始まる１７２５塩基対（以下“ｂｐ”と略す
る）のオープンリーディングフレームを含有するｃＤＮ
Ａ（以下“ｃＤＮＡ−Ａ”と略する）を得る。このオー
プンリーディングフレームの塩基配列は、配列番号１０
の１−１７２５の塩基配列である。またリーダー配列を
コードする塩基配列を除外し、ヒト肺由来のペプチドの
Ｎ末端アミノ酸配列からの塩基配列とすれば、配列番号
１２の１−１６７１の塩基配列となる。(3) Next, the cDNA fragments obtained in the above steps (1) and (2) are ligated appropriately to open-read 1725 base pairs (hereinafter abbreviated as “bp”) starting from the initiation codon. CDN containing frame
A (hereinafter abbreviated as "cDNA-A"). The nucleotide sequence of this open reading frame is SEQ ID NO: 10
1-1725. In addition, if the nucleotide sequence encoding the leader sequence is excluded and the nucleotide sequence is derived from the N-terminal amino acid sequence of the peptide derived from human lung, the nucleotide sequence is 1 to 1671 of SEQ ID NO: 12.

【００４０】このｃＤＮＡ−Ａから、前述のＤＮＡ
（１）〜（５）の塩基配列と実質的に同等の塩基配列を
有するｃＤＮＡは、以下の部分を位置特異的変異法で削
除することによって得らることができる。 （ｉ）ＤＮＡ（４）の塩基配列と実質的に同等の塩基配
列を含有するｃＤＮＡを調製するに当たっては、削除す
る部分としては、前記のオープンリーディングフレーム
における開始コドンの最初の塩基から数えて１５４９番
目から１７２５番目の塩基までの部分である。 （ii）ＤＮＡ（５）の塩基配列と実質的に同等の塩基配
列を含有するｃＤＮＡを調製するに当たっては、削除す
る部分としては、前記のオープンリーディングフレーム
における開始コドンの最初の塩基から数えて１４４１番
目から１７２５番目の塩基までの部分である。 (iii)ＤＮＡ（３）の塩基配列と実質的に同等の塩基配
列を含有するｃＤＮＡを調製するに当たっては、削除す
る部分としては、前記のオープンリーディングフレーム
における開始コドンの最初の塩基から数えて５５番目か
ら７３２番目および１５４９番目から１７２５番目の塩
基までの部分である。From this cDNA-A, the DNA
A cDNA having a nucleotide sequence substantially equivalent to the nucleotide sequence of (1) to (5) can be obtained by deleting the following portions by a site-directed mutagenesis method. (I) In preparing a cDNA having a nucleotide sequence substantially equivalent to the nucleotide sequence of DNA (4), the portion to be deleted was 1549 counted from the first base of the start codon in the open reading frame. The portion from the 1st to the 1725th base. (Ii) In preparing a cDNA having a nucleotide sequence substantially equivalent to the nucleotide sequence of DNA (5), the portion to be deleted is 1441 counted from the first nucleotide of the start codon in the open reading frame. The portion from the 1st to the 1725th base. (iii) In preparing a cDNA having a nucleotide sequence substantially equivalent to the nucleotide sequence of DNA (3), the portion to be deleted is 55% counted from the first base of the start codon in the open reading frame. The portion from the 732-th base and from the 1549-th base to the 1725-th base.

【００４１】(iv) ＤＮＡ（２）の塩基配列と実質的に
同等の塩基配列を含有するｃＤＮＡを調製するに当たっ
ては、削除する部分としては、前記のオープンリーディ
ングフレームにおける開始コドンの最初の塩基から数え
て５５番目から７３２番目および１４４１番目から１７
２５番目の塩基までの部分である。 (ｖ) ＤＮＡ（１）の塩基配列と実質的に同等の塩基配
列を含有するｃＤＮＡを調製するに当たっては、削除す
る部分としては、前記のオープンリーディングフレーム
における開始コドンの最初の塩基から数えて５５番目か
ら１０８６番目および１４４１番目から１７２５番目の
塩基までの部分である。 このようにして得られた各ｃＤＮＡの塩基配列は公知の
方法で分析して、ＤＮＡ（１）〜（５）の塩基配列とそ
れぞれ一致することを確認する。(Iv) In preparing a cDNA having a nucleotide sequence substantially equivalent to the nucleotide sequence of DNA (2), the portion to be deleted is as follows from the first nucleotide of the start codon in the open reading frame. Counting 55th to 732th and 1441th to 17th
It is the part up to the 25th base. (v) In preparing a cDNA containing a nucleotide sequence substantially equivalent to the nucleotide sequence of DNA (1), the portion to be deleted may be 55% counted from the first base of the start codon in the open reading frame. The portion from the 1086th base and the 1441th to the 1725th base. The nucleotide sequence of each cDNA thus obtained is analyzed by a known method, and it is confirmed that the nucleotide sequence matches each of the nucleotide sequences of DNAs (1) to (5).

【００４２】上記の本発明のＤＮＡは有機化学合成する
ことによっても得ることができる。また、本発明のＤＮ
Ａは前述のプライマーエクステンションを行うことな
く、前駆体ＤＮＡから調製することもできる。前駆体Ｄ
ＮＡは、前記工程（１）で得られるＤＮＡ断片またはそ
のＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて調製した合成ＤＮＡ
をプローブとして用いる通常のハイブリダイゼーション
法によってヒト染色体ＤＮＡライブラリーから得ること
ができる。The above-mentioned DNA of the present invention can also be obtained by organic chemical synthesis. In addition, the DN of the present invention
A can also be prepared from the precursor DNA without performing the above-mentioned primer extension. Precursor D
NA is a DNA fragment obtained in the step (1) or a synthetic DNA prepared based on the base sequence of the DNA fragment.
Can be obtained from a human chromosomal DNA library by an ordinary hybridization method using as a probe.

【００４３】前述の如く、式（II）の塩基配列を含有す
る本発明のＤＮＡは次式： Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏ で表されるようなリーダー配列をコードする塩基配列を
５′末端塩基配列として含有していてもよく、通常細胞
等での発現においてこのリーダー配列の全部又は一部は
削除され得る。本発明によれば、上記ＤＮＡと相補的な
ＤＮＡもまた提供される。本発明によれば、上記ＤＮＡ
とそれに相補的なＤＮＡが互いに相補的に結合して２重
鎖ＤＮＡを形成していてもよい。本発明のＤＮＡは前述
のすべてのペプチドの相同変異体に相当する構造を有す
るペプチドをコードする塩基配列を含有することも可能
である。As described above, the DNA of the present invention containing the nucleotide sequence of the formula (II) is a leader represented by the following formula: Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly Phe Pro A base sequence encoding the sequence may be contained as a 5 'terminal base sequence, and all or a part of the leader sequence can be deleted in normal expression in cells or the like. According to the present invention, a DNA complementary to the above DNA is also provided. According to the present invention, the DNA
And the DNA complementary thereto may complementarily bind to each other to form a double-stranded DNA. The DNA of the present invention can also contain a nucleotide sequence encoding a peptide having a structure corresponding to a homologous mutant of any of the aforementioned peptides.

【００４４】遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産さ
れるポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくその
遺伝子の塩基配列の少なくとも１つの塩基を他の種類の
塩基に置換することができる。従って、本発明のＤＮＡ
はまた、遺伝略号の縮重に基づく置換によって変化され
た塩基配列を含有することも可能である。この場合、上
記置換により得られた塩基配列から演繹されるアミノ酸
配列は前に定義したアミノ酸配列と一致する。すなわ
ち、本発明は前述の種々のペプチドのアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡまたはその相補的ＤＮＡである。According to the degeneracy of the genetic code, at least one base in the base sequence of the gene can be replaced with another type of base without changing the amino acid sequence of the polypeptide produced from the gene. Therefore, the DNA of the present invention
Can also contain a nucleotide sequence altered by substitution based on the degeneracy of the genetic abbreviation. In this case, the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence obtained by the above substitution matches the amino acid sequence defined previously. That is, the present invention relates to DNAs encoding the amino acid sequences of the aforementioned various peptides or DNAs complementary thereto.

【００４５】更にまた、本発明によれば、前記の本発明
のＤＮＡと複製可能な発現ベクターとからなる複製可能
な組換え体ＤＮＡが提供される。該組換え体ＤＮＡは、
それによって形質転換された微生物または細胞中で、本
発明のペプチドを発現することができる。適したベクタ
ーの例としては、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２
７、ＹＲｐ７、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１
４６）、ｐＢＰＶ−１（９−１）（ＡＴＣＣ ３７１１
１）などが挙げられる。尚、発現ベクターは宿主として
使用する微生物または細胞に適したものを選択する必要
がある。Further, according to the present invention, there is provided a replicable recombinant DNA comprising the above-mentioned DNA of the present invention and a replicable expression vector. The recombinant DNA comprises
The peptide of the present invention can be expressed in a microorganism or cell transformed thereby. Examples of suitable vectors include plasmids pBR322, pBR32
7, YRp7, pSV2-dhfr (ATCC 371
46), pBPV-1 (9-1) (ATCC 3711)
1) and the like. It is necessary to select an expression vector suitable for a microorganism or cell used as a host.

【００４６】更に本発明はまた、上述の複製可能な組換
え体ＤＮＡで形質転換された微生物または細胞に関す
る。微生物の例としては、エシェリヒア コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の菌株、例えばイー コ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ ３１４
４６）、イー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ、イー コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１５３
７）、イー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００およびイー
コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００ｈｆｌ並びにイー コ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（Ｆ−、λ−、プロトト
ロフィック、ＡＴＣＣ２７３７５）；バチラス サブチ
リス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の如きバ
チラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株；サルモネラ チ
フィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕ
ｒｉｕｍ）またはセラチア マーセサンス（Ｓｅｒｒａ
ｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓ）等の大腸菌以外の腸内
菌；シュードモーナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の
種々の菌株；およびサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などが
挙げられる。細胞の例としては、ＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ−８１）細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハム
スター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＷＩ３８、ＢＨＫ、ＣＯ
Ｓ−７およびＭＤＣＫ細胞株等の動物細胞が挙げられ
る。Further, the present invention also relates to a microorganism or a cell transformed with the above-described replicable recombinant DNA. Examples of microorganisms include Escherichia coli (Esc
strains such as E. coli K12 strain 294 (ATCC 314).
46), E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 3153)
7), E. coli C600 and E. coli C600hfl and E. coli W3110 (F-, λ-, prototrophy, ATCC 27375); A strain of the genus Bacillus; Salmonella typhimu;
rium) or Serratia Mercense (Serra)
intestinal bacteria other than Escherichia coli, such as Tia marcesan; various strains of the genus Pseudomonas; and Saccharomyces cerevisiae (Sac).
(Caromyces cerevisiae) and the like. Examples of cells include VERO (ATCC
CCL-81) cells, HeLa cells, Chinese hamster ovary (CHO) cell line, WI38, BHK, CO
Animal cells such as S-7 and MDCK cell lines.

【００４７】本発明のぺプチドは、前述の通り、０．１
５Ｍ食塩、２．５ｍＭ塩化カルシウム、１ｍｇ／ｍｌ血
清アルブミンを含有するｐＨ７．４の２０ｍＭトリス塩
酸緩衝液中に検知され得る濃度で可溶性であることは好
ましい。しかしながら、本発明の組換えペプチドにおい
ては、可溶性でないものも包含してもよい。ただし、可
溶性ペプチドが、ＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラ
ムに結合せしめたときに、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍＭ ベンズアミジン塩酸、０．５％
（ｖ／ｖ）ポリドカノール（Ｐｏｌｉｄｏｃａｎｏｌ；
商品名Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸ）を含む０．０２Ｍトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．５）により溶出できる性質、又は、
該可溶性ペプチドが、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ
ＣａＣｌ2 、０．５％（ｖ／ｖ）ポリドカノール（Ｐ
ｏｌｉｄｏｃａｎｏｌ；商品名Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸ）を
含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）により
平衡化したＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムに、
該緩衝液にて該可溶性ペプチドを溶解せしめた溶液を接
触せしめた場合に、該可溶性ペプチドが前記カラムに結
合せしめることができる性質を有することが好ましい。As described above, the peptide of the present invention has a content of 0.1%.
Preferably, it is soluble at a detectable concentration in a 20 mM Tris-HCl buffer at pH 7.4 containing 5 M saline, 2.5 mM calcium chloride, 1 mg / ml serum albumin. However, the recombinant peptides of the present invention may include those that are not soluble. However, when the soluble peptide was bound to a DIP-thrombin-agarose column, it was 1 M NaCl, 0.1 mM
EDTA, 1 mM benzamidine hydrochloride, 0.5%
(V / v) Polidocanol;
Properties that can be eluted with 0.02 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing Lubrol PX (trade name), or
The soluble peptide is 0.1 M NaCl, 0.5 mM
CaCl 2 , 0.5% (v / v) polidocanol (P
olipcanol; brand name Lubrol PX) and a DIP-thrombin-agarose column equilibrated with a 0.02 M Tris-HCl buffer (pH 7.5).
When the solution in which the soluble peptide is dissolved is brought into contact with the buffer, it is preferable that the soluble peptide has a property capable of binding to the column.

【００４８】例えば前述の配列番号７の１−５７５のア
ミノ酸配列をコードする遺伝子の場合を例にとると、生
体内では、血管内皮細胞膜上に次式の一次構造（即ち、
配列番号１３の１−５５７のアミノ酸配列）で発現され
る。 Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ ＬｅｕFor example, taking the case of a gene encoding the amino acid sequence of 1 to 575 of SEQ ID NO: 7 as an example, in vivo, the following primary structure on the vascular endothelial cell membrane (ie, the primary structure:
(Amino acid sequence of 1-557 of SEQ ID NO: 13) Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu Val His Ser Gly Leu Leu Ile Gly Ile Ser Ile Ala Ser Leu Cys Leu Val Val Ala Leu Leu Ala Leu Leu Cys His Leu Arg Lys Lys Gln Gly Ala Ala Arg Ala Lys Met Glu Tyr Lys Cys Ala Ala Pro Ser Lys Glu Val Val Leu Gln His Val Arg Thr Glu Arg Thr Pro Gln Arg Leu

【００４９】また上記遺伝子をＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞
またはＣ127 細胞で遺伝子工学的に発現させた場合も、
同様にそれら細胞膜上に発現・濃縮され、培養液中には
活性が検知されないので、トリトンＸ−１００等の界面
活性剤の存在下調製する。しかし、該ペプチドのアミノ
酸配列のＣ末端から５９番目以降の配列 Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ を除くことにより、分泌され得る形態で培養液中に可溶
物として検知・回収できる。[0049] The COS cells the gene, even if obtained by genetic engineering expressed in CHO cells or C 127 cells,
Similarly, since it is expressed and concentrated on those cell membranes and no activity is detected in the culture solution, it is prepared in the presence of a surfactant such as Triton X-100. However, the sequence from the C-terminus of the amino acid sequence of the peptide from the 59th position onwards Leu Leu Ile Gly Ile Ser Ile Ala Ser Leu Cys Leu Val Val Ala Leu Leu Al Ay Lau Leu Lys Leg Argy Glu Tyr Lys Cys Ala Ala Pro Ser Lys Glu Val Val Leu Gln His Val Arg Thr Glu Arg Thr Pro Gln Arg Leu A form that can be detected in a form that can be secreted in the form of a solution that can be secreted by removing the soluble liquid in the culture that can be detected.

【００５０】本発明のペプチドを製造する方法は、例え
ば以下の方法が好ましい例として挙げられるが、他の方
法によることも本発明が達成される限り特に限定されな
い。 （ａ）前述のペプチドをコードするＤＮＡと複製可能な
発現ベクターに連結して、該ＤＮＡと該複製可能な発現
ベクターとからなる複製可能な組換え体ＤＮＡを得、 （ｂ）該複製可能な組換え体ＤＮＡで微生物または細胞
を形質転換させて形質転換体を形成せしめ、 （ｃ）該形質転換体を該微生物または細胞の親細胞から
選別し、 （ｄ）該形質転換体を培養して、該形質転換体に該ＤＮ
Ａを発現させて該ペプチドを産生せしめ、そして （ｅ）該ペプチドを培養した形質転換体から単離するThe preferred method for producing the peptide of the present invention is, for example, the following method. However, other methods are not particularly limited as long as the present invention is achieved. (A) ligating to a DNA encoding the aforementioned peptide and a replicable expression vector to obtain a replicable recombinant DNA comprising the DNA and the replicable expression vector; Transforming a microorganism or cell with the recombinant DNA to form a transformant; (c) selecting the transformant from a parent cell of the microorganism or cell; and (d) culturing the transformant. , The transformant is
Expressing A to produce the peptide, and (e) isolating the peptide from the cultured transformants

【００５１】本発明の方法によれば、前述の本発明のＤ
ＮＡが正しく転写し、それによって得られるｍＲＮＡか
らの翻訳が正しく行われるように本発明のＤＮＡを複製
可能な発現ベクターのプロモーターなどのＤＮＡ領域の
下流に組入れて該ＤＮＡを有する複製可能な組換え体Ｄ
ＮＡを得、得られた該組換え体ＤＮＡで微生物または細
胞を形質転換させて該組換え体ＤＮＡを含有する形質転
換体を得る。得られた形質転換体は、該組み換え体ＤＮ
Ａに与えられた表現型によって微生物または培養細胞の
親細胞から単離される。得られた形質転換体を培養して
前記ＤＮＡの有する遺伝情報を発現させて本発明のペプ
チドを製造する。According to the method of the present invention, the aforementioned D of the present invention is used.
The DNA of the present invention is incorporated downstream of a DNA region such as a promoter of a replicable expression vector so that the NA is correctly transcribed and the translation from the resulting mRNA is correctly performed. Body D
NA is obtained, and a microorganism or cell is transformed with the obtained recombinant DNA to obtain a transformant containing the recombinant DNA. The resulting transformant is the recombinant DN
A is isolated from the parent cell of the microorganism or cultured cell according to the phenotype given to A. The resulting transformant is cultured to express the genetic information of the DNA to produce the peptide of the present invention.

【００５２】トロンビンに結合し、トロンビンによるプ
ロテインＣの活性化を促進する作用を有するペプチドに
関して、従来、アミノ酸配列等の解明が不可能であっ
て、遺伝子操作により製造されたことはなく、したがっ
て、ヒト由来の夾雑成分を含有しない実質的に精製され
た組換えペプチドとしては、天然型の１つの具体例であ
る配列番号１３の１−５５７のアミノ酸配列からなるペ
プチドも含めて従来知られていないものであって、本発
明の開示するところによって、初めて遺伝子操作により
製造された実質的に他のヒト由来の成分を含有しない精
製されたペプチドが取得し得たものである。本発明の開
示によって初めて医薬として安定的に大量に提供される
ことができるものとなったことが注目される。なお、天
然型のペプチド等の界面活性剤の非存在下で、可溶性で
ないペプチドを医薬組成物となす場合には適当量の界面
活性剤を存在させればよい。Regarding a peptide that binds to thrombin and has the effect of promoting the activation of protein C by thrombin, it has not been possible to elucidate the amino acid sequence, etc., and it has never been produced by genetic engineering. As a substantially purified recombinant peptide containing no human-derived contaminant component, a peptide having the amino acid sequence of 1-557 of SEQ ID NO: 13, which is one specific example of a natural type, has not been known so far. According to the disclosure of the present invention, for the first time, a purified peptide substantially free of other human-derived components produced by genetic engineering can be obtained. It is noted that the disclosure of the present invention has made it possible to be stably provided in large quantities as a medicine for the first time. When a non-soluble peptide is used as a pharmaceutical composition in the absence of a surfactant such as a natural peptide, an appropriate amount of a surfactant may be present.

【００５３】尚、本発明のＤＮＡ及び組換え体ＤＮＡを
構築するために必要なＤＮＡ配列、例えばプロモーター
や複製起源等をクローニングするためには原核細胞を宿
主として用いる宿主−ベクター系を使用するのが好まし
い。原核細胞の例としては、エシェリヒア コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の菌株、例えばイーコ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ ３１４
４６）、イー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ、イー コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１５３
７）、イー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００およびイー
コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００ｈｆｌ並びにイー コ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（Ｆ−、λ−、プロトト
ロフィック、ＡＴＣＣ ２７３７５）；バチラス サブ
チリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の如き
バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株；サルモネラ
チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｕｍ）またはセラチア マーセサンス（Ｓｅｒｒ
ａｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓ）等の大腸菌以外の腸内
細菌；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の
種々の菌株；およびサッカロミセス セレビシエ（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などが
挙げられる。In order to clone a DNA sequence required for constructing the DNA of the present invention and a recombinant DNA, for example, a promoter and an origin of replication, a host-vector system using a prokaryotic cell as a host is used. Is preferred. Examples of prokaryotic cells include Escherichia coli (Es
cherichia coli, for example, E. coli K12 strain 294 (ATCC 314).
46), E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 3153)
7), E. coli C600 and E. coli C600hfl and E. coli W3110 (F-, λ-, prototrophy, ATCC 27375); Bacillus subtilis Strains of the genus Bacillus such as Salmonella
Salmonella typhim
urium) or Serratia Mercense (Serr)
enterobacteria other than E. coli; various strains of the genus Pseudomonas; and Saccharomyces cerevisiae (Sa).
ccharomyces cerevisiae).

【００５４】これらの細菌のうちエシェリヒア コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株２９４が最も好ましい。上記
微生物を宿主として使用する場合、これら微生物に適し
たプラスミドベクターが組換え体ＤＮＡの複製可能な発
現ベクターとして一般に用いられる。例えば大腸菌を形
質転換するためのプラスミドベクターとしてはプラスミ
ドｐＢＲ３２２やｐＢＲ３２７などを用いることができ
る。プラスミドベクターは通常複製起源、プロモータ
ー、および組換え体ＤＮＡで形質転換した細胞を選別す
るのに有用な表現型を組換え体ＤＮＡに与えるマーカー
遺伝子等を含んでいる。Of these bacteria, E. coli K12 strain 294 is most preferred. When the above microorganisms are used as hosts, plasmid vectors suitable for these microorganisms are generally used as expression vectors capable of replicating recombinant DNA. For example, plasmids pBR322 and pBR327 can be used as plasmid vectors for transforming Escherichia coli. Plasmid vectors usually contain an origin of replication, a promoter, and a marker gene that provides the recombinant DNA with a phenotype useful for selecting cells transformed with the recombinant DNA.

【００５５】プロモーターの例としては、β−ラクタマ
ーゼ及びラクトースプロモーター、トリプトファンプロ
モーター等が挙げられる。マーカー遺伝子の例として
は、アンピシリン耐性遺伝子やテトラサイクリン耐性遺
伝子が挙げられる。一方、本発明のＤＮＡを発現して本
発明のペプチドを製造するためには上記の原核細胞を宿
主として用いる宿主−ベクター系および脊椎動物の細胞
などの真核生物の細胞を宿主細胞として用いる宿主−ベ
クター系を使用することができる。真核細胞の例として
は前述の動物の細胞株などの細胞が挙げられる。Examples of the promoter include β-lactamase and lactose promoter, tryptophan promoter and the like. Examples of the marker gene include an ampicillin resistance gene and a tetracycline resistance gene. On the other hand, in order to express the DNA of the present invention and produce the peptide of the present invention, a host-vector system using the above prokaryotic cells as a host and a host using eukaryotic cells such as vertebrate cells as host cells -Vector systems can be used. Examples of eukaryotic cells include cells such as the animal cell lines described above.

【００５６】本発明のＤＮＡを前述の真核細胞で発現さ
せるために、本発明の組換え体ＤＮＡは一般に遺伝子発
現を制御するための機能配列、例えば、複製起源、本発
明のＤＮＡの上流に位置すべきプロモーター、リボゾー
ム結合部位、ポリアデニル化部位や転写終止配列を含有
している。本発明のＤＮＡを真核細胞内で発現させるの
に用いることのできるそのような機能配列はウィルスや
ウィルス性物質から得ることができる。In order to express the DNA of the present invention in the aforementioned eukaryotic cells, the recombinant DNA of the present invention generally contains a functional sequence for controlling gene expression, for example, an origin of replication, upstream of the DNA of the present invention. It contains a promoter to be located, a ribosome binding site, a polyadenylation site, and a transcription termination sequence. Such functional sequences that can be used to express the DNA of the present invention in eukaryotic cells can be obtained from viruses and viral substances.

【００５７】例えば、本発明で用いることのできるプロ
モーターは、アデノウィルス２、ポリオーマウィルス、
シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）などから得ることが
できる。特に、アデノウィルス２の主後期プロモーター
やＳＶ４０の初期および後期プロモーターが好ましい。
また、トロンビンのプロテインＣ活性化を促進する作用
を有するヒト肺由来のペプチドをコードする遺伝子の上
流の位置に本来存在するプロモーターも、上述の宿主−
ベクター系で使用するのに適しているならば使用するこ
とができる。For example, promoters that can be used in the present invention include adenovirus 2, polyoma virus,
It can be obtained from Simian virus 40 (SV40) or the like. In particular, the main late promoter of adenovirus 2 and the early and late promoters of SV40 are preferred.
In addition, a promoter originally present at a position upstream of a gene encoding a peptide derived from human lung, which has an action to promote the activation of protein C of thrombin, is also used in the above-described host-
Any suitable for use in a vector system can be used.

【００５８】複製起源については、外来性の起源、例え
ば、アデノウィルス、ポリオーマ、ＳＶ４０、水疱性口
内炎ウィルス（ＶＳＶ）、ウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰ
Ｖ）等のウィルス由来の複製起源を用いることができ
る。また、発現ベクターとして宿主染色体に組み込まれ
るような性質を有するベクターを用いる場合、宿主染色
体の複製起源を利用することができる。With respect to the origin of replication, foreign sources such as adenovirus, polyoma, SV40, vesicular stomatitis virus (VSV), bovine papilloma virus (BP)
A replication origin derived from a virus such as V) can be used. When a vector having the property of being integrated into the host chromosome is used as the expression vector, the origin of replication of the host chromosome can be used.

【００５９】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡで形質
転換された微生物または細胞は、前述のとおり、組換え
体ＤＮＡに与えられた少なくとも１種の表現型によって
形質転換されずに残った親細胞から選別される。表現型
は少なくとも１種のマーカー遺伝子を組換え体ＤＮＡに
挿入することによって与えることができる。また複製可
能な発現ベクターが本来有しているマーカー遺伝子を利
用することもできる。The microorganism or cell transformed with the replicable recombinant DNA of the present invention is, as described above, a parent remaining untransformed by at least one phenotype given to the recombinant DNA. Sorted from cells. The phenotype can be conferred by inserting at least one marker gene into the recombinant DNA. Alternatively, a marker gene originally possessed by a replicable expression vector can be used.

【００６０】マーカー遺伝子の例としては、例えば、ネ
オマイシン耐性などの薬剤耐性遺伝子やジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ（以下“ＤＨＦＲ”と称する）をコードする
遺伝子などが挙げられる。これに関し、ＤＨＦＲ遺伝子
をマーカー遺伝子として用いる場合、ＤＨＦＲには様々
のタイプがあるため、その使用するマーカー遺伝子のコ
ードしているＤＨＦＲのタイプによって用いるべき宿主
を選択しなければならない。例えば、マーカー遺伝子と
して野生型ＤＨＦＲをコードする遺伝子を用いる場合、
宿主としてはＤＨＦＲ欠損株を用いるのが好ましい。Examples of marker genes include, for example, drug resistance genes such as neomycin resistance, and genes encoding dihydrofolate reductase (hereinafter referred to as "DHFR"). In this regard, when the DHFR gene is used as a marker gene, since there are various types of DHFR, a host to be used must be selected according to the type of DHFR encoded by the marker gene to be used. For example, when using a gene encoding wild-type DHFR as a marker gene,
It is preferable to use a DHFR-deficient strain as a host.

【００６１】ＤＨＦＲ欠損株はヒポキサンチン、グリシ
ン及びチミジンを要求するので、ヒポキサンチン、グリ
シン及びチミジンを含まない培地中では成育できない。
しかしながら、ＤＨＦＲ欠損株をＤＨＦＲ遺伝子を含有
する組換え体ＤＮＡで形質転換すると、その株はもはや
ヒポキサンチン、グリシン及びチミジンを要求しなくな
り、ヒポキサンチン、グリシン及びチミジンを含まない
培地中でも成育することができる。従って、形質転換細
胞は、ヒポキサンチン、グリシン及びチミジンについて
の栄養要求性を判断基準にして形質転換されないで残っ
た細胞から容易に選択することができる。Since the DHFR-deficient strain requires hypoxanthine, glycine and thymidine, it cannot grow in a medium free of hypoxanthine, glycine and thymidine.
However, when a DHFR-deficient strain is transformed with a recombinant DNA containing the DHFR gene, the strain no longer requires hypoxanthine, glycine and thymidine and can grow in a medium free of hypoxanthine, glycine and thymidine. it can. Therefore, the transformed cells can be easily selected from the cells which have not been transformed and are determined based on the auxotrophy for hypoxanthine, glycine and thymidine.

【００６２】一方、メトトレキセート（ＭＴＸ）に対す
る親和性の低い変異体ＤＨＦＲをコードする遺伝子（以
下“ＭＴＸ耐性ＤＨＦＲ遺伝子”と称する）をマーカー
遺伝子として用いる場合には、宿主細胞は正常なＤＨＦ
Ｒをコードする遺伝子を有していればよくＤＨＦＲを欠
損している必要はない。その理由は以下のとおりであ
る。正常ＤＨＦＲはＭＴＸによって阻害されるため、正
常ＤＨＦＲをコードする遺伝子を含有する宿主細胞はＭ
ＴＸの存在下ではヒポキサンチン、グリシン及びチミジ
ンを要求する。On the other hand, when a gene encoding a mutant DHFR having low affinity for methotrexate (MTX) (hereinafter referred to as “MTX-resistant DHFR gene”) is used as a marker gene, the host cell can be treated with normal DHF.
DHFR need not be deleted as long as it has a gene encoding R. The reason is as follows. Because normal DHFR is inhibited by MTX, host cells containing the gene encoding normal DHFR are
It requires hypoxanthine, glycine and thymidine in the presence of TX.

【００６３】しかしながら、その宿主細胞がＭＴＸ耐性
ＤＨＦＲ遺伝子を含有する組換え体ＤＮＡで形質転換す
ると形質転換細胞はＭＴＸ存在下においてももはやヒポ
キサンチン、グリシン及びチミジンを要求しない。従っ
て、形質転換細胞は、ＭＴＸ存在下におけるヒポキサン
チン、グリシン及びチミジンについての栄養要求性を判
断基準として用いて形質転換されていない細胞から選択
することができる。これに関し、真核細胞の大多数がＭ
ＴＸ感受性であるのでＭＴＸ耐性ＤＨＦＲ遺伝子はマー
カー遺伝子として用いるのに好都合である。However, when the host cell is transformed with the recombinant DNA containing the MTX resistant DHFR gene, the transformed cell no longer requires hypoxanthine, glycine and thymidine in the presence of MTX. Thus, transformed cells can be selected from untransformed cells using auxotrophy for hypoxanthine, glycine and thymidine in the presence of MTX as a criterion. In this regard, the majority of eukaryotic cells have M
Because it is TX sensitive, the MTX resistant DHFR gene is convenient to use as a marker gene.

【００６４】サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母
も本発明のＤＮＡを発現するための宿主として用いるこ
とができる。酵母で本発明のＤＮＡを発現するためには
複製可能な発現ベクターとして例えばプラスミドＹＲｐ
７を用いることができる。プラスミドＹＲｐ７はｔｒｐ
ｌ遺伝子を含有しており、このｔｒｐｌ遺伝子をマーカ
ー遺伝子として利用することができる。Saccharomyces cerevisiae (Sacch)
Yeast such as Aromyces cerevisiae) can also be used as a host for expressing the DNA of the present invention. In order to express the DNA of the present invention in yeast, for example, plasmid YRp
7 can be used. Plasmid YRp7 is trp
1 gene, and this trpl gene can be used as a marker gene.

【００６５】酵母細胞用の発現ベクターのプロモーター
の例としては、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは
エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボ
キシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６
−ホスフェートイソメラーゼ、グルコキナーゼ、などの
解糖系に関与する酵素類の遺伝子のプロモーターやアル
コールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性
ホスファターゼ、窒素代謝に関与する酵素、マルトース
及びラクトースの利用に関与する酵素類の遺伝子のプロ
モーターが挙げられる。Examples of promoters for expression vectors for yeast cells include 3-phosphoglycerate kinase or enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, and glucose-6.
-Promoters of genes of enzymes involved in glycolysis such as phosphate isomerase, glucokinase, alcohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, acid phosphatase, enzymes involved in nitrogen metabolism, enzymes involved in the use of maltose and lactose And the promoter of the gene.

【００６６】これらのうち、アルコールデヒドロゲナー
ゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素
代謝に関与する酵素類、グリセルアルデヒド−３−ホス
フェートデヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びラクト
ースの利用に関与する酵素類の遺伝子のプロモーター
は、これらのプロモーターによる転写を宿主の培養条件
を変えることによって制御することができるので有利で
ある。Among these, the promoters of the genes for alcohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, acid phosphatase, enzymes involved in nitrogen metabolism, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, and enzymes involved in the use of maltose and lactose Is advantageous because transcription by these promoters can be controlled by changing the culture conditions of the host.

【００６７】酵母細胞中における転写や翻訳を制御する
ための複製起源や終止コドンおよびその他のＤＮＡ配列
としては、酵母細胞に適している通常の公知のＤＮＡ配
列を用いることができる。形質転換した微生物または細
胞は通常の栄養培地を用いて通常の公知の方法で培養す
ることにより本発明のペプチドをコードするＤＮＡを発
現して本発明のペプチドを製造することができる。培養
後、本発明のペプチドは形質転換体の培養物から通常の
公知の方法、例えばカラムクロマトグラフィーなどを用
いて単離することができ、本明細書の記載に従って、本
発明の医薬組成物として使用できる程度に実質的に精製
されることが通常行われる。As the origin of replication, the termination codon, and other DNA sequences for controlling transcription and translation in yeast cells, ordinary known DNA sequences suitable for yeast cells can be used. The transformed microorganism or cell can be cultured in a conventional nutrient medium by a known method to express the DNA encoding the peptide of the present invention, thereby producing the peptide of the present invention. After culturing, the peptide of the present invention can be isolated from a culture of the transformant using a known method, for example, column chromatography, and used as a pharmaceutical composition of the present invention according to the description of the present specification. It is usual to be substantially purified to the extent that it can be used.

【００６８】このようにして得られたペプチドは、本発
明の作用と可溶性を有する限り、様々な種類と長さの糖
鎖を少なくとも１種含有していてもよいし、また複数の
アミノ酸配列からなるペプチドの混合物であってもよ
い。得られたペプチドが糖鎖を含有しているか否かは用
いる宿主細胞の種類によって異なる。また、ペプチドが
糖鎖を含有している場合の糖鎖の種類や長さも用いる宿
主細胞の種類によって異なる。The peptide thus obtained may contain at least one type of sugar chain of various types and lengths, as long as it has the action and solubility of the present invention, or may contain a plurality of amino acid sequences. May be a mixture of different peptides. Whether or not the obtained peptide contains a sugar chain depends on the type of host cell used. In addition, when the peptide contains a sugar chain, the type and length of the sugar chain also differ depending on the type of host cell used.

【００６９】一般に翻訳開始シグナルのＡＴＧから翻訳
されたペプチドは宿主細胞から分泌されるときにプロセ
ッシングを受けて成熟蛋白になることが知られている。
本発明のペプチドの場合もそのようなプロセッシングを
受けることがある。ペプチドがプロセッシングを受ける
部位は、宿主により、または培養条件により変化する場
合がある。例えば、本発明のペプチドが、式（Ｉ）で表
されるペプチドとＮ末端アミノ酸配列として前述の１８
個のアミノ酸からなるリーダー配列とを含むプロセッシ
ングを受けていない未成熟形で形質転換細胞中で産生さ
れる場合、その未成熟形ペプチドはプロセッシングを受
けてリーダー配列が削除されて成熟形となることがあ
る。しかしながら、前述のように未成熟形ペプチドのプ
ロセッシングを受ける位置は使用する宿主の種類や宿主
の培養条件により変化するので必ずしも上記のようなプ
ロセッシングが起きるとは限らない。It is generally known that a peptide translated from the translation initiation signal ATG undergoes processing when secreted from a host cell to become a mature protein.
The peptide of the present invention may be subjected to such processing. The site where the peptide undergoes processing may vary from host to host or from culture conditions. For example, the peptide of the present invention is obtained by combining the peptide represented by the formula (I) with the above-mentioned 18-terminal amino acid sequence.
When produced in a transformed cell in an unprocessed immature form containing a leader sequence consisting of 10 amino acids, the immature form peptide is processed to remove the leader sequence and become a mature form There is. However, as described above, the position at which the immature peptide is processed varies depending on the type of host used and the culture conditions of the host, so that the above-described processing does not always occur.

【００７０】前述のとおり、本発明のトロンビンによる
プロテインＣの活性化を促進する作用を有するペプチド
は組換えＤＮＡ技術を用いる方法により製造することが
できる。また、本発明のペプチドは通常の公知の方法に
より、例えば市販の自動ペプチド合成装置などを用いて
有機合成により製造することもできる。本発明のペプチ
ドはトロンビンによるプロテインＣ活性化を促進する作
用を有する。プロテインＣは血液凝固線溶機構において
重要な役割を演じているビタミンＫ依存性の蛋白質であ
り、トロンビンの作用により活性化される。As described above, the peptide of the present invention having the effect of promoting the activation of protein C by thrombin can be produced by a method using recombinant DNA technology. The peptide of the present invention can also be produced by an ordinary known method, for example, by organic synthesis using a commercially available automatic peptide synthesizer or the like. The peptide of the present invention has the effect of promoting protein C activation by thrombin. Protein C is a vitamin K-dependent protein that plays an important role in the blood coagulation / fibrinolysis mechanism and is activated by the action of thrombin.

【００７１】活性型プロテインＣは、生体内で血液凝固
系補酵素の活性型第Ｖ因子、および活性型第ＶＩＩ因子
を失活させ、また血栓溶解作用を有するプラスミノーゲ
ンアクチベーターの産生に関与していることが知られて
いる。〔鈴木宏治、医学の歩み、第１２５巻、９０１頁
（１９８３年）〕。本発明のペプチドは、このトロンビ
ンによるプロテインＣの活性化を促進して抗血液凝固作
用と血栓溶解作用を示す活性型プロテインＣを大量に産
生せしめるものである。従って、本発明のペプチドは生
体における抗血液凝固及び血栓溶解に大きく寄与するも
のである。Active protein C inactivates blood coagulation coenzyme active factor V and active factor VII in vivo and is involved in the production of plasminogen activator having a thrombolytic action. Is known to be. [Koji Suzuki, History of Medicine, Vol. 125, pp. 901 (1983)]. The peptide of the present invention promotes the activation of protein C by thrombin and produces a large amount of active protein C having an anticoagulant effect and a thrombolytic effect. Therefore, the peptide of the present invention greatly contributes to anticoagulation and thrombolysis in a living body.

【００７２】前述のように、本発明のペプチドは抗血液
凝固作用と血小板凝集抑制作用及び血栓溶解作用を有す
るので、血液凝固を制御するための、または血小板凝集
を制御するための医薬組成物として用いることが可能で
あり、具体的には、例えば、心筋梗塞、血栓症、塞栓
症、末梢血管閉塞症、閉塞性動脈硬化症、血管内血液凝
固症候群（ＤＩＣ）、狭心症、一過性脳虚血発作、妊娠
中毒症等の疾患の治療及び予防に用いることができる。As described above, since the peptide of the present invention has an anticoagulant effect, a platelet aggregation inhibitory effect and a thrombolytic effect, it can be used as a pharmaceutical composition for controlling blood coagulation or for controlling platelet aggregation. It can be used and specifically includes, for example, myocardial infarction, thrombosis, embolism, peripheral vascular occlusion, atherosclerosis obliterans, intravascular blood coagulation syndrome (DIC), angina pectoris, transient It can be used for treatment and prevention of diseases such as cerebral ischemic attack and toxemia of pregnancy.

【００７３】本発明の医薬組成物となすに際しては、本
発明のペプチドと、薬剤として使用可能な担体とを混合
すればよい。即ち、上記の疾患を治療または予防するの
に有効な量の本発明のペプチドを適当な量の担体と混ぜ
て、患者に効果的に投与するのに適した医薬組成物を調
製することができる。薬剤として使用可能な担体として
は、例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセル
ロースなどが例示される。また本発明の医薬組成物とし
ては、凍結乾燥された製剤となすことが好ましい。また
本発明の医薬組成物は注射用製剤として用いることが好
ましい。さらには、点滴静注用製剤とすることが好まし
い。In forming the pharmaceutical composition of the present invention, the peptide of the present invention may be mixed with a carrier that can be used as a drug. That is, a pharmaceutical composition suitable for effective administration to a patient can be prepared by mixing an effective amount of the peptide of the present invention for treating or preventing the above-mentioned diseases with an appropriate amount of a carrier. . Carriers that can be used as drugs include, for example, methylcellulose, carboxymethylcellulose and the like. It is preferable that the pharmaceutical composition of the present invention is a lyophilized preparation. Further, the pharmaceutical composition of the present invention is preferably used as an injection preparation. Further, it is preferable to use a preparation for intravenous drip infusion.

【００７４】注射剤として用いる場合に、上記の担体
は、薬剤として投与可能であり、且つ注射可能な溶液と
なり得る担体であることが好ましく、この担体として
は、ショ糖、精製ゼラチン、アルブミン、マンニトー
ル、ブドウ糖および塩化ナトリウムからなる群より選ば
れた１種以上が例示され、また各種無機塩のｐＨ調整剤
などを添加することも好ましい例として挙げられるが、
その場合には本発明の可溶性ペプチドとの組み合わせに
おいて、医薬組成物全体として可溶性であり、且つ綺麗
に凍結乾燥が可能であって、好ましい。また本発明にお
いては、上記担体が、グリセリンであることもまた好ま
しい。上記の担体は、製剤を調製する際に添加すること
が好ましいが、用時に溶解された際において添加される
ことも許されるものである。When used as an injection, the above-mentioned carrier is preferably a carrier that can be administered as a drug and can be made into an injectable solution, and includes sucrose, purified gelatin, albumin, mannitol , One or more selected from the group consisting of glucose and sodium chloride are exemplified, and addition of a pH adjuster for various inorganic salts is also a preferred example.
In that case, the combination with the soluble peptide of the present invention is preferable because it is soluble as a whole pharmaceutical composition and can be freeze-dried cleanly. In the present invention, it is also preferable that the carrier is glycerin. The above-mentioned carrier is preferably added at the time of preparing a preparation, but is also allowed to be added at the time of dissolving at the time of use.

【００７５】本発明によるペプチドの成人１回当たりの
投与量は年齢、性別、体重、症状等により異なるが、一
般に約０．１〜２００ｍｇであり、一日当たり一回また
は必要に応じて数回、例えば注射、好ましくは点滴静注
により投与する方法が例示される。本発明者らは、本発
明のペプチドが副作用の少ない極めて有用なものである
ことを確認しており、例えば、動物実験でラットｉｖ投
与において約３ｍｇ／ｋｇで全く死亡例や害を生ずるこ
とがなく、有効な作用も認められることから、ヒトの体
重を約６０〜７０ｋｇと考えて上記の投与量が妥当なも
のとして提示される。The dose of the peptide according to the present invention per adult dose varies depending on age, sex, body weight, symptoms and the like, but is generally about 0.1 to 200 mg, once or several times a day, if necessary. For example, a method of administering by injection, preferably intravenous drip is exemplified. The present inventors have confirmed that the peptide of the present invention is extremely useful with few side effects. For example, in animal experiments, administration of about 3 mg / kg of rat iv may cause no death or harm at all. In addition, since an effective effect is also recognized, the above-mentioned dose is presented as an appropriate one considering that the human body weight is about 60 to 70 kg.

【００７６】[0076]

【実施例】本発明をより詳細に記述するために参考例及
び実施例により説明するが、本発明の範囲はこれらの実
施例にのみ限定されるものではない。 参考例１ （プロテインＣ活性化を促進する作用の測定） 本発明のペプチドのプロテインＣ活性化の促進作用の測
定は、合成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒ
ｇ−ＭＣＡ（Ｂｏｃ及びＭＣＡはそれぞれｔ−ブトキシ
カルボニル基及び４−メチルクマリル−７−アミドの略
称である）を用いる公知のプロテインＣ測定法〔ワイ
オーノ（Ｙ．Ｏｈｎｏ）ら、ザ ジャーナル オブ バ
イオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）９０巻、１
３８７頁（１９８１年）〕に従って行なった。すなわ
ち、プロテインＣ（最終濃度０．５μＭ）およびトロン
ビン（最終濃度８０ｎＭ）を含有する水溶液５μｌに本
発明のペプチドを含む水溶液５μｌ（０〜０．０１ Ａ
280 ／ｍｌ）を加え、これにＮａＣｌ、ＣａＣｌ2 、血
清アルブミン及びトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）をそ
れぞれ最終濃度が０．１５Ｍ、２．５ｍＭ、１ｍｇ／ｍ
ｌ及び２０ｍＭになるように、そして全量が３０μｌと
なるように加えた。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to Examples and Examples to describe the present invention in more detail. However, the scope of the present invention is not limited only to these Examples. Reference Example 1 (Measurement of Action of Promoting Protein C Activation) The measurement of the action of the peptide of the present invention to promote protein C activation was performed using a synthetic substrate Boc-Leu-Ser-Thr-Ar.
A known method for measuring protein C using g-MCA (Boc and MCA are an abbreviation for t-butoxycarbonyl group and 4-methylcoumaryl-7-amide, respectively) [Y
Y. Ohno, et al., The Journal of Biochemistry, 90, 1
387 (1981)]. That is, 5 μl of an aqueous solution containing the peptide of the present invention (0 to 0.01 A) was added to 5 μl of an aqueous solution containing protein C (final concentration of 0.5 μM) and thrombin (final concentration of 80 nM).
280 / ml), and NaCl, CaCl 2 , serum albumin and Tris-HCl buffer (pH 7.4) were added thereto at final concentrations of 0.15 M, 2.5 mM and 1 mg / m 2 respectively.
1 and 20 mM, and the total volume was 30 μl.

【００７７】得られた混合物を３７℃で１５分間反応さ
せてプロテインＣを活性化した後に２μＭのアンチトロ
ンビンIII を１０μｌ及び１０単位／ｍｌのヘパリンを
含有する水溶液を１０μｌ加えて３７℃で１５分間加温
して反応を停止させた。得られた反応混合物に、前述の
合成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｍ
ＣＡ〔財団法人蛋白質研究奨励会ペプチド研究会（Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（日本）製〕２００
μＭを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）２
５０μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、２０
％酢酸０．５ｍｌを加えて反応を停止させ、遊離してき
たＡＭＣ（７−アミノ−７−メチル−クマリン）の濃度
を励起波長３８０ｎｍ、発光波長４４０ｎｍで蛍光分光
光度計ＲＦ−５４０型（島津製作所製、日本）により測
定した。The obtained mixture was reacted at 37 ° C. for 15 minutes to activate protein C. After adding 10 μl of 2 μM antithrombin III and 10 μl of an aqueous solution containing 10 units / ml of heparin, the mixture was added at 37 ° C. for 15 minutes. The reaction was stopped by heating. The obtained reaction mixture was added to the above-mentioned synthetic substrate Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-M.
CA [Protein Research Foundation Peptide Study Group (Pe
ptide Institute (Japan)] 200
20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing μM 2
After adding 50 μl and reacting at 37 ° C. for 10 minutes, 20 μl was added.
% Acetic acid was added to stop the reaction, and the concentration of the released AMC (7-amino-7-methyl-coumarin) was measured at an excitation wavelength of 380 nm and an emission wavelength of 440 nm using a fluorescence spectrophotometer RF-540 (Shimadzu Corporation). Manufactured in Japan).

【００７８】得られた蛍光強度を既知濃度のＡＭＣの蛍
光強度と比較して、遊離したＡＭＣ量を求めた。値は１
分間当りに生成するＡＭＣ量で表わす。このＡＭＣ量か
ら本発明のペプチドを含まない水溶液を加えたときのＡ
ＭＣ量を引いた値がサンプルのトロンビンによるプロテ
インＣ活性化を促進する強さを示す。The amount of released AMC was determined by comparing the obtained fluorescence intensity with the fluorescence intensity of AMC at a known concentration. Value is 1
Expressed as the amount of AMC generated per minute. From the AMC amount, A when an aqueous solution not containing the peptide of the present invention was added.
The value obtained by subtracting the amount of MC indicates the strength of the sample to promote protein C activation by thrombin.

【００７９】ここで、プロテインＣはヒト血漿から鈴木
らの方法〔鈴木（Ｓｕｚｕｋｉ）ら、ザ ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．）、２５８巻、１９１４頁（１９８３年
等）〕で精製した。また、ヒトトロンビンはランドブラ
ッド（Ｌｕｎｄｂｌａｄ）らの方法〔ランドブラッド
（Ｌｕｎｄｂｌａｄ）ら、バイオケミカル アンド バ
イオフィジカル リサーチ コミュニケーション（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ
ｎ．）６６巻、４８２頁（１９７５年）〕で精製した。Here, protein C was obtained from human plasma by the method of Suzuki et al. [Suzuki et al., The Journal.
Of biological chemistry (J. Biol.
Chem. , 258, 1914 (1983 etc.)]. Human thrombin was prepared by the method of Lundblad et al. [Lundblad et al., Biochemical and Biophysical Research Communication (Bi).
ochem. Biophys. Res. Commu
n. 66, 482 (1975)].

【００８０】参考例２ （１）：ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーの入手 ヒトの肺のポリ（Ａ）+ ＲＮＡより調製したバクテリオ
ファージλｇｔ11ｃＤＮＡライブラリーは、米国、クロ
ーンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ，Ｉｎｃ．、９２２ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，Ａ
ｖｅ．ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ９４３０３）より購入し
た（カタログ番号ＨＬ１００４）。[0080] Reference Example 2 (1): human lung cDNA library lung poly (A) + bacteriophage .lambda.gt 11 cDNA library prepared from RNA to obtain human USA, Clontech (Clontech LABORATOR
ies, Inc. , 922 Industrial, A
ve. Palo Alto, CA94303) (catalog number HL1004).

【００８１】（２）：トロンビンによるプロテインＣ活
性化を促進する作用のあるグリコペプチドの精製 プロテインＣ活性化を促進する作用のあるグリコペプチ
ドは、以下のようにしてヒト肺より抽出して得た。公立
病院より提供されたヒト肺標本約８００ｇを鋏で約１ｃ
ｍ四方程度の大きさに細切りした後、得られた組織片に
１ｍＭのＤＦＰ（Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｆｌｕｏｒ
ｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含む４℃に冷却した５００ｍ
ｌの生理食塩水を加え、ワーリングブレンダーとしてＡ
ｃｅ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ ＡＭ−１型（日本精器
会社製、日本）を用いて４℃で５分間、ホモジナイズし
た。ホモジナイズ後、混合物を氷中で５分間冷却した。(2): Purification of glycopeptide having an action of promoting protein C activation by thrombin Glycopeptide having an action of promoting protein C activation was obtained by extraction from human lung as follows. . Approximately 800g of human lung specimen provided by a public hospital with scissors
After shredding to a size of about m square, 1 mM DFP (Diisopropyl fluor) was added to the obtained tissue piece.
500 m cooled to 4 ° C.
l of saline and add A as a Waring blender
Using ce Homogenizer AM-1 (manufactured by Nippon Seiki Co., Ltd., Japan), homogenization was performed at 4 ° C. for 5 minutes. After homogenization, the mixture was cooled in ice for 5 minutes.

【００８２】次に混合物を更に４℃で５分間、ホモジナ
イズし氷中で５分間冷却した。上記のホモジナイズ及び
冷却操作を更に３回くり返した。得られたホモジェネー
トを１２，０００ｇで４℃において３０分間遠心分離に
かけて上澄液とペレットに分け、ペレットを集める。こ
れに０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、０．２５
Ｍ庶糖、１ｍＭベンズアミジン塩酸、０．５ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ2 を含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）１００ｍｌに懸濁し、ワーリングブレンダーを用い
て４℃で５分間、５回ホモジナイズして細胞抽出物を得
た。The mixture was then homogenized at 4 ° C. for 5 minutes and cooled in ice for 5 minutes. The above homogenization and cooling operations were repeated three more times. The obtained homogenate is centrifuged at 12,000 g at 4 ° C. for 30 minutes to separate the supernatant and the pellet, and the pellet is collected. 0.5% (v / v) Triton X-100, 0.25
M sucrose, 1 mM benzamidine hydrochloride, 0.5 mM Ca
0.02 M Tris-HCl buffer containing Cl 2 (pH 7.
5) The cells were suspended in 100 ml and homogenized 5 times at 4 ° C. for 5 minutes using a Waring blender to obtain a cell extract.

【００８３】得られた抽出物を３５，０００ｇ、１０℃
で６０分間遠心分離にかけて上澄液を集めた。エヌ エ
ル エスモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓｍｏｎ）ら〔ザ ジャーナ
ルオブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５７巻、８５９頁（１９８２
年）〕の方法に従って作成したＤＩＰ−トロンビン〔ジ
イソプロピルホスフォロトロンビン（ｄｉｉｓｏｐｒｏ
ｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏ−ｔｈｒｏｍｂｉｎ）を、ピ
ー クオトレカサス（Ｐ．Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ）の
方法〔（ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミ
ストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２４５巻、３
０５９頁（１９７０年）〕に従ってブロムシアン化した
アガロースに結合させて、ＤＩＰ−トロンビン−アガロ
ースを作成した。The obtained extract was weighed at 35,000 g and 10 ° C.
The supernatant was collected by centrifugation at for 60 minutes. NL Esmon et al. [The Journal of Biological Chemistry (J. Bio)
l. Chem. , 257, 859 (1982)
Year)) and DIP-thrombin [diisopropylphosphorothrombin (diisopro).
Pylphosphoro-thrombin was obtained by the method of P. Cuatrecasas [(The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 245, 3).
059 (1970)] to produce DIP-thrombin-agarose.

【００８４】次にＤＩＰ−トロンビン−アガロースを
２．５ｃｍφ×１０ｃｍの大きさのカラムに充填してＤ
ＩＰ−トロンビン−アガロースカラムを作成し、室温で
０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ2 、１ｍＭ
ベンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ
ＰＸ（半井科学薬品製、日本）を含む０．０２Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した。次
いで、上記の抽出上澄液をカラムに供した。カラムを
０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ2 、１ｍＭ
ベンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ
ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で洗浄した後、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、１ｍＭベンズアミジン塩酸０．５％（ｖ／ｖ）Ｌ
ｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で溶出して２．０ｍｌずつフラクシヨン
を集めた。溶出によって得られる各フラクションについ
て前記の方法でトロンビンのプロテインＣの活性化促進
能を測定した。同時に島津製作所（日本）製スペクトロ
フォトメーターＵＶ−２４０を用いて各フラクションの
波長２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ280 ）を測定した。Next, DIP-thrombin-agarose was packed into a column having a size of 2.5 cmφ × 10 cm, and
An IP-thrombin-agarose column was prepared and at room temperature 0.1 M NaCl, 0.5 mM CaCl 2 , 1 mM
Benzamidine hydrochloride, 0.5% (v / v) Lubrol
The column was equilibrated with a 0.02 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing PX (manufactured by Hanoi Chemicals, Japan). Next, the above-mentioned extracted supernatant was applied to a column. The column was filled with 0.3 M NaCl, 0.5 mM CaCl 2 , 1 mM
Benzamidine hydrochloride, 0.5% (v / v) Lubrol
0.02 M Tris-HCl buffer containing PX (pH 7.
After washing in 5), 1 M NaCl, 0.1 mM ED
TA, 1 mM benzamidine hydrochloride 0.5% (v / v) L
The fraction was eluted with a 0.02 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing ubrol PX, and 2.0 ml fractions were collected. For each fraction obtained by elution, the ability of thrombin to promote protein C activation was measured by the method described above. At the same time, the absorbance (A 280 ) of each fraction at a wavelength of 280 nm was measured using a spectrophotometer UV-240 manufactured by Shimadzu (Japan).

【００８５】プロテインＣ活性化能のある画分を回収
し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭＣａＣｌ2 、０．
０５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析した。得られた
透析液を２回目のＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラ
ムクロマトグラフィーに供した。即ち、透析液を１．５
ｃｍφ×１０ｃｍの大きさのＤＩＰ−トロンビン−アガ
ロースカラムに供し、０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ
ＣａＣｌ2 、０．１％（ｖ／ｖ）ＬｕｂｒｏｌＰＸを
含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄
後、さらに０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．
０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、次い
で１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％
（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。The fraction having the ability to activate protein C was collected, and 0.1 M NaCl, 0.5 mM CaCl 2 , 0.1 mM NaCl was added.
0.02M with 05% (v / v) Lubrol PX
It was dialyzed against Tris-HCl buffer (pH 7.5). The obtained dialysate was subjected to a second DIP-thrombin-agarose column chromatography. That is, the dialysis solution is 1.5 times
The sample was applied to a DIP-thrombin-agarose column having a size of cmφ × 10 cm, and 0.4 M NaCl, 0.5 mM
After washing with 0.02 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing CaCl 2 and 0.1% (v / v) LubrolPX, 0.4 M NaCl and 0.1 mM EDT were further added.
A, containing 0.1% (v / v) Lubrol PX.
Wash with 02 M Tris-HCl buffer (pH 7.5), then 1 M NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.1%
(V / v) Elution was performed with a 0.02 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing Lubrol PX.

【００８６】プロテインＣ活性化能のある画分を回収
し、さらに０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）
Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で透析した。得られた透析液を３回目の
ＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムクロマトグラフ
ィーに供した。カラムの大きさ、洗浄条件および溶出条
件は２回目のＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムク
ロマトグラフィーの条件と全く同じ条件で行なった。な
お、溶出して得られるフラクションは２ｍｌずつ集め
た。The fraction having the ability to activate protein C was collected and further added with 0.1 M NaCl and 0.05% (v / v).
It was dialyzed against 0.02 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing Lubrol PX. The obtained dialysate was subjected to a third DIP-thrombin-agarose column chromatography. The column size, washing conditions and elution conditions were exactly the same as those for the second DIP-thrombin-agarose column chromatography. The fractions obtained by elution were collected by 2 ml.

【００８７】次にプロテインＣ活性化能のある画分を回
収し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｌｕ
ｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）で透析した後、０．９ｃｍφ×８ｃｍの大き
さの４回目のＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムク
ロマトグラフィーに供した。０．３５Ｍ ＮａＣｌ、
０．５ｍＭ ＣａＣｌ2 、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒ
ｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で洗浄後、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭＥＤＴ
Ａ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．
０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。溶
出して得られたフラクションは１．９ｍｌずつ集めた。Next, a fraction capable of activating protein C was recovered, and 0.1 M NaCl, 0.05% (v / v) Lu was collected.
0.02 M Tris-HCl buffer containing brol PX (p
After dialysis with H7.5), it was subjected to a fourth DIP-thrombin-agarose column chromatography of 0.9 cmφ × 8 cm. 0.35 M NaCl,
0.5 mM CaCl 2 , 0.1% (v / v) Lubr
ol PX-containing 0.02 M Tris-HCl buffer (pH
After washing with 7.5), 1 M NaCl, 0.5 mM EDT
A, containing 0.1% (v / v) Lubrol PX.
Elution was performed with a 02M Tris-HCl buffer (pH 7.5). Fractions obtained by elution were collected in 1.9 ml portions.

【００８８】この第４回目のＤＩＰ−トロンビン−アガ
ロースカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを図１
に示す。フラクションナンバー４８番目から５６番目ま
でを回収した。このようにして精製されたフラクション
の吸光度から、得られた精製品の分子吸光係数を一般的
な蛋白質の分子吸光係数にならない１０．０（Ｅ1% 1cm
・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定してそれに基づき本精
製品の量を計算したところ約５００μｇであった。な
お、得られた精製画分をポリアクリルアミドゲル濃度５
〜１０％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を５０Ｖの電圧で２時間行ない、銀
染色によってバンドを観察したところ単一バンドのみ確
認された。FIG. 1 shows the elution pattern of the fourth DIP-thrombin-agarose column chromatography.
Shown in Fraction numbers 48 to 56 were collected. From the absorbance of the fraction purified in this manner, the molecular extinction coefficient of the obtained purified product was determined to be 10.0 (E 1% 1 cm
280 nm = 10.0), and the amount of the purified product was calculated based on the definition and found to be about 500 μg. The obtained purified fraction was subjected to polyacrylamide gel concentration 5
SDS-polyacrylamide gel electrophoresis using a gradient of 〜１０10% was performed at a voltage of 50 V for 2 hours, and only a single band was confirmed by observing the band by silver staining.

【００８９】また、この精製タンパク約１０μｇを２０
０ｍＭのＮａＣｌおよび０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏ
ｌ ＰＸを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で透析後、同じ緩衝液で平衡化したＣｏｎＡセファ
ロース（ファルマシア社製、カタログ番号１７−０４４
０）のカラム（樹脂量約１ｍｌ）に供し、同じ緩衝液で
充分洗浄したところ、このタンパクはＣｏｎＡセファロ
ースに吸着して洗浄液中には溶出されなかった。次いで
０．５Ｍのメチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（Ｍｅｔ
ｈｙｌ−α−Ｄ−ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）
（米国Ｓｉｇｍａ社製、カタログ番号Ｍ−６８８２）を
含む以外は上記と同じ緩衝液を通したところ、このタン
パク質は溶出した。従って、このタンパク質は糖を含む
いわゆるグリコペプチドであることがわかった。Further, about 10 μg of this purified protein was added to 20
0 mM NaCl and 0.1% (v / v) Lubro
50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.
After dialysis in 5), ConA Sepharose (Pharmacia, Cat. No. 17-044) equilibrated with the same buffer
When the sample was applied to the column (0) (resin amount: about 1 ml) and washed sufficiently with the same buffer, this protein was adsorbed on ConA Sepharose and was not eluted in the washing solution. Then 0.5M methyl-α-D-mannopyranoside (Met
hyl-α-D-mannopyranoside)
The protein was eluted by passing through the same buffer as described above except that it contained (manufactured by Sigma, USA, catalog number M-6882). Therefore, this protein was found to be a so-called glycopeptide containing sugar.

【００９０】（３）：トロンビンのプロテインＣ活性化
を促進するグリコペプチドのアミノ酸配列分析 このグリコペプチドのアミノ酸配列は以下の様にして分
析した。精製したグリコペプチドを０．１％（ｖ／ｖ）
ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液で室温で１６
時間透析してアミノ酸配列分析用試料とする。アプライ
ドバイオシステムズ社（米国）製アミノ酸シークエンシ
ングアナライザー（モデル４７０Ａ）を用い、アール
エム ヘウイック（Ｒ．Ｍ．Ｈｅｗｉｃｋ）らの方法
〔ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５６巻、７９９０頁
（１９８１年）〕に準じて、Ｎ末端側より順次エドマン
分析を行なった。(3): Analysis of Amino Acid Sequence of Glycopeptide Promoting Protein C Activation of Thrombin The amino acid sequence of this glycopeptide was analyzed as follows. 0.1% (v / v) of purified glycopeptide
16% aqueous solution of sodium lauryl sulfate (SDS) at room temperature
The sample is dialyzed for a time to prepare a sample for amino acid sequence analysis. Using an amino acid sequencing analyzer (Model 470A) manufactured by Applied Biosystems (USA),
According to the method of RM Hewick et al. [The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.) 256, 7990 (1981)], Edman analysis was performed sequentially from the N-terminal side. Was.

【００９１】遊離してくるフェニルチオヒダントイン
アミノ酸を、スペクトロフイジクス社（米国）製高速液
体クロマトグラフィー用装置（ＳＰ８１００）および米
国デュポン社製ゾルバックスＯＤＳカラムを用いて分析
を行ない、アミノ酸配列を決定した。その結果、アミノ
酸配列の一部が明らかになり、Ｎ末端より１１個目まで
は下記アミノ酸配列を有するものであることがわかっ
た。 Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ− Ｓｅｒ−ＧｌｎFree phenylthiohydantoin
Amino acids were analyzed using a high performance liquid chromatography apparatus (SP8100) manufactured by Spectrophysics (USA) and a Zorbax ODS column manufactured by DuPont (USA) to determine the amino acid sequence. As a result, a part of the amino acid sequence was clarified, and it was found that up to the eleventh from the N-terminal had the following amino acid sequence. Ala-Pro-Ala-Glu-Pro-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-Gln

【００９２】（４）：Ｎ末端アミノ酸配列をコードする
ＤＮＡプローブの作成 トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進するグリコ
ペプチドのＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡプロ
ーブは、前述のＮ末端アミノ酸配列より、ヒト由来遺伝
子においてアミノ酸をコードする塩基配列の塩基の使用
頻度を考慮して〔ニュークリック アシド リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．）、９巻、Ｒ４
３頁（１９８１年）〕、Ｎ末端からのアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列として、５′ＣＴＧＧＧ ＡＧＣＣＧ
ＣＣＧＧＧ ＣＴＧＧＧ ＧＣＴＣＧ ＧＣＧＧＧＧ
ＧＣ３′の３３ｍｅｒを、また大塚ら〔イー オーツカ
エト アール（Ｅ．Ｏｈｔｓｕｋａ，ｅｔ ａｌ．）、
ザ ジャーナル オブバイオロジカル ケミストリー
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）第２６０巻、２６０５頁
（１９８５年）〕に従って、デオキシイノシン（“Ｉ”
で示す）をチミジル酸の代りに用いてＮ末端からのアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列として、 （１）５′ＧＣＩＣＣ ＩＧＣＩＧ ＡＡＣＣＩ ＣＡＧＣＣ ＩＧＧ３′ （２）５′ＧＣＩＣＣ ＩＧＣＩＧ ＡＧＣＣＩ ＣＡＡＣＣ ＩＧＧ３′ （３）５′ＧＣＩＣＣ ＩＧＣＩＧ ＡＧＣＣＩ ＣＡＧＣＣ ＩＧＧ３′ （４）５′ＧＣＩＣＣ ＩＧＣＩＧ ＡＡＣＣＩ ＣＡＡＣＣ ＩＧＧ３′ の４種類の２３ｍｅｒを米国アプライド バイオシステ
ムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製の３
８０Ａ型ＤＮＡ合成機で合成し、メーカーマニュアルに
従って精製し、実験書〔イー エフ マニアティスら
（Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｅ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ）、モレキ
ュラークローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ）、１２２頁（１９８２年）の記載にしたがって、Ｔ
4 ＤＮＡキナーゼ、およびγ−32Ｐ−ＡＴＰを用いてラ
ベル化した。(4): Preparation of DNA Probe Encoding N-Terminal Amino Acid Sequence A DNA probe encoding the N-terminal amino acid sequence of a glycopeptide that promotes activation of protein C by thrombin can be obtained from the aforementioned N-terminal amino acid sequence by using human In consideration of the frequency of use of the nucleotides in the nucleotide sequence encoding the amino acid in the derived gene [Nucleic Acid Res., Vol. 9, R4
3 (1981)] as a base sequence encoding an amino acid sequence from the N-terminus, 5'CTGGGG AGCCG
CCGGGG CTGGG GCTCG GCGGGG
The 33mer of GC3 'was also described by Otsuka et al. [E. Ohtsuka, et al.,
Deoxyinosine ("I") according to The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.) 260, 2605 (1985)].
Is used in place of thymidylic acid) as a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence from the N-terminus: (1) 5 ′ GCIC IGCIG AACCI CAGCC IGG3 ′ (2) 5 ′ GCICC IGCIG AGCCI CAACC IGG3 ′ (3) 5 'GCICC IGCIG AGCCI CAGCC IGG3' (4) 5 'GCIC IGCIG AACCI CAACC IGG3' 4 types of 23mer were manufactured by Applied Biosystems, USA.
It was synthesized with a type 80A DNA synthesizer, purified according to the manufacturer's manual, and described in an experimental manual [Maniatis EF, et al., Molecular Cloning (Molecular Cloning)].
g), p. 122 (1982).
4 Labeled with DNA kinase and γ- 32 P-ATP.

【００９３】（５）：トロンビンによるプロテインＣ活
性化を促進する作用のあるグリコペプチドの抗体 トロンビンのプロテインＣ活性化を促進する作用のある
グリコペプチドに対するウサギ抗体は、前述のようにし
て精製したトロンビンによるプロテインＣ活性化を促進
する作用のあるヒト肺由来のグリコペプチドを用いて、
成書〔エル ハドソンら（Ｌ．ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．）、プラクティカル イムノロジー（Ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、９頁（１９７６
年）、ブラックウェル サイエンティフィック パブリ
ケーションズ（ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）〕に従って作製した。(5): Antibody of glycopeptide having an action of promoting the activation of protein C by thrombin A rabbit antibody against a glycopeptide having an action of promoting the activation of protein C of thrombin can be obtained by purifying thrombin as described above. Using a glycopeptide derived from human lung that has the effect of promoting protein C activation by
Book [El Hudson et al. (L. hudson et a
l. ), Practical Immunology (Practi)
cal Immunology), page 9 (1976).
Year), Blackwell Scientific Publications (Blackwell Scientific)
c Publications)].

【００９４】この抗体がトロンビンによるプロテインＣ
活性化を促進する作用のあるヒト肺由来のグリコペプチ
ドと反応することを以下の様にして確認した。すなわ
ち、参考例２−（２）に記載の方法で得た精製タンパク
の約１０ｎｇをニトロセルロースのフィルターにスポッ
トする。よく風乾した後、この抗体を一次抗体としてニ
トロセルロースフィルター上のタンパクと反応させ、次
いでヤギで調製したビオチン化抗ウサギＩｇＧ（ザイメ
ット ラボラトリー社製、米国、カタログ番号６２−１
８４０）を二次抗体として反応させた後、アビジン・ビ
オチン化した西洋ワサビ由来パーオキシダーゼ（アマシ
ャムジャパン社製、日本、カタログ番号ＲＰＮ．１０５
１）を作用させる方法で発色させると黒褐色のスポット
を与えた。This antibody was used for protein C by thrombin.
It was confirmed as follows that it reacts with a glycopeptide derived from human lung which has an activity of promoting activation. That is, about 10 ng of the purified protein obtained by the method described in Reference Example 2- (2) is spotted on a nitrocellulose filter. After air-drying well, this antibody was reacted as a primary antibody with a protein on a nitrocellulose filter, and then a biotinylated anti-rabbit IgG prepared by a goat (Zymet Laboratory, USA, Catalog No. 62-1)
840) as a secondary antibody, and then avidin / biotinylated horseradish peroxidase (manufactured by Amersham Japan, Japan, catalog number RPN.105).
When the color was developed by the method of 1), a black-brown spot was obtained.

【００９５】（６）：ヒトさい帯内皮細胞の採集及び培
養 ヒトさい帯内皮細胞はディスパーゼＩＩ（合同酒精製、
日本）を用いるマノらの方法〔ワイ マノら（Ｙ．Ｍａ
ｎｏ，ｅｔ ａｌ．）、エクスペリンエンシア（Ｅｘｐ
ｅｒｉｅｎｔｉａ）、第３９巻、第１１４４頁（１９８
３年）〕にしたがって、私立病院より提供された新鮮な
ヒトさい帯から得た静脈より採集し培養した。(6): Collection and culture of human umbilical vein endothelial cells
Using the method of Mano et al. [Japan]
no, et al. ), Experin Encia (Exp)
erientia), Vol. 39, p. 1144 (198
3 years)] and collected from a vein obtained from a fresh human umbilical cord provided by a private hospital.

【００９６】参考例３ （組換え体ＤＮＡの取得） （１）：ポリ（Ａ）+ ＲＮＡの調製 ヒト内皮細胞よりチャーギンらの方法〔ジェイ エム
チャーギン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａ
ｌ．）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）、第１８巻、５２９４頁（１９７９年）〕に従って
ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを調製した。Reference Example 3 (Acquisition of Recombinant DNA) (1): Preparation of poly (A) + RNA The method of Chargin et al.
Chargin (Chirgwin, JM et a)
l. ), Biochemistry (Biochemistry)
y), Vol. 18, p. 5294 (1979)], to prepare poly (A) + RNA.

【００９７】（２）：ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーより
のスクリーニング ヒト肺のポリ（Ａ）+ ＲＮＡより調製したｃＤＮＡをバ
クテリオファージλｇｔ１１に組み込んだｃＤＮＡライ
ブラリー（クローンテック社製、米国）をそのマニュア
ルに従ってイー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｙ１０９０（ク
ローンテック社製、米国）に感染させたものをＬＢ培地
プレート上に１５ｃｍ径プレート１枚当り約１０万プラ
ーク程度になる様に移植した。４２℃で３．５時間培養
後、あらかじめ１０ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙ
ｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉ
ｄｅ）に浸してから乾燥させたニトロセルロースフィル
ター（ＢＡ８５メンブランフィルター、シュライヒャー
アンド シェル社製、独国）をプレートの上に載せ、
３７℃で３．５時間インキュベートして、ペプチドをＩ
ＰＴＧで誘導発現させてニトロセルロースフィルター上
にうつしとる。(2) Screening from Human Lung cDNA Library A cDNA library (Clontech, USA) obtained by incorporating cDNA prepared from human lung poly (A) + RNA into bacteriophage λgt11 was prepared according to the manual. E. coli Y1090 (produced by Clonetech, USA) was transplanted onto an LB medium plate so as to have about 100,000 plaques per 15 cm diameter plate. After culturing at 42 ° C for 3.5 hours, 10 mM IPTG (isopropy
l-β-D-thiogalactopyranosi
de) and placed on a plate with a nitrocellulose filter (BA85 membrane filter, manufactured by Schleicher and Shell GmbH, Germany) dried.
Incubate at 37 ° C for 3.5 hours to convert the peptide to I
Induced expression with PTG and transfer on nitrocellulose filter.

【００９８】このニトロセルロースフィルターに、マニ
ュアルに従って、ウサギで調製したトロンビンのプロテ
インＣ活性化を促進する作用を有する参考例２−（５）
で得られたグリコペプチドに対する抗体を一次抗体とし
て反応させ、次いでヤギで調製したビオチン化抗ウサギ
ＩｇＧ（ザイメッド ラボラトリー社製、米国 カタロ
グ番号６２−１８４０）を二次抗体として反応させた
後、アビジン・ビオチン化した西洋ワサビ由来パーオキ
シダーゼ（アマーシャム ジャパン社製、日本、カタロ
グ番号ＲＰＮ．１０５１）で発色させて、陽性のクロー
ンを単離した。この陽性クローンの保有する組換え体ｃ
ＤＮＡ／λｇｔ１１に含まれるｃＤＮＡ断片をＴＭ１３
と称した。Reference Example 2- (5) in which this nitrocellulose filter was used to promote the activation of protein C of thrombin prepared in rabbits according to the manual.
After reacting the antibody against the glycopeptide obtained in the above as a primary antibody, and then reacting a biotinylated anti-rabbit IgG (manufactured by Zymed Laboratories, US Cat. No. 62-1840) prepared with goat as a secondary antibody, Color was developed with biotinylated horseradish-derived peroxidase (Amersham Japan, Japan, catalog number RPN.1051), and positive clones were isolated. Recombinant c possessed by this positive clone
The cDNA fragment contained in DNA / λgt11 was converted to TM13
It was called.

【００９９】（３）：Ｎ末端アミノ酸配列をコードする
ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション 参考例３−（２）で得られたＤＮＡ断片ＴＭＩ３が参考
例２−（４）で調製したＮ末端アミノ酸配列をコードす
るＤＮＡプローブとハイブリダイズするか否かを実験書
〔シルハービイ（Ｓｉｌｈａｖｙ）ら、エクスペリメン
ツ ウイズ ジーン フュージョンズ（Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ）、１
９１頁（１９８４年）コールド スプリングハーバー
ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従って実施した。ＤＮＡ
断片ＴＭ１３はいずれのＮ末端アミノ酸配列をコードす
るＤＮＡプローブともハイブリダイズしないことがわか
った。(3): Hybridization with DNA probe coding for N-terminal amino acid sequence The DNA fragment TMI3 obtained in Reference Example 3- (2) is obtained by combining the N-terminal amino acid sequence prepared in Reference Example 2- (4). An experimental report [Silhavy et al., Experiments with Gene Fusions] determined whether to hybridize with the DNA probe to be encoded.
ents With Gene Fusions), 1
Page 91 (1984) Cold Spring Harbor
Laboratory (Cold Spring Harbor)
Laboratory). DNA
It was found that fragment TM13 did not hybridize with any of the DNA probes encoding the N-terminal amino acid sequence.

【０１００】（４）：ＴＭ１３の塩基配列 参考例３−（２）で得られるクローンが含有するＤＮＡ
断片ＴＭ１３の塩基配列をサンガーらの方法（サンガー
エフ ら（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ，ｅｔ ａｌ．）、プロ
シーディング オブ ナショナル アカデミー オブ
サイエンス ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、７４巻、５４６３頁（１９７
７年）にしたがって決定した。結果を図２〜図３に示
す。(4): Base sequence of TM13 DNA contained in the clone obtained in Reference Example 3- (2)
The nucleotide sequence of fragment TM13 was determined by the method of Sanger et al. (Sanger, F., et al., Proceeding of National Academy of
Science USA (Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA), 74, 5463 (197)
7 years). The results are shown in FIGS.

【０１０１】（５）：ＤＮＡ断片ＴＭ１３をプローブと
したヒト肺ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング ＤＮＡ断片ＴＭ１３を制限酵素ＫｐｎＩおよびＰｖｕII
で消化して約４４０塩基対のＤＮＡ断片を得、これをニ
ックトランスレーション法で32Ｐで標識した。このＤＮ
Ａ断片をプローブとしてヒト肺ｃＤＮＡライブラリーよ
りプラークハイブリダイゼーションを行なって陽性のク
ローンをスクリーニングした。すなわち、常法に従って
クローンＴＭ１３のＤＮＡをＫｐｎＩおよびＰｖｕIIで
消化してポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、抽
出、精製して約４４０ｂｐの精製断片約５００ｎｇを得
た。このＤＮＡをアマーシャム ジャパン（日本）社製
のニックトランスレーション キット（カタログ番号
Ｎ．５０００）を用い、それに添付のユーザー マニュ
アルに従ってα−32Ｐ−ｄＣＴＰを用いて標識した。(5): Screening of human lung cDNA library using DNA fragment TM13 as a probe DNA fragment TM13 was used as a restriction enzyme KpnI and PvuII.
To obtain a DNA fragment of about 440 base pairs, which was labeled with 32 P by the nick translation method. This DN
Plasmid hybridization was performed from a human lung cDNA library using the A fragment as a probe to screen for positive clones. That is, the DNA of clone TM13 was digested with KpnI and PvuII, separated by polyacrylamide gel electrophoresis, extracted and purified according to a conventional method to obtain about 500 ng of a purified fragment of about 440 bp. This DNA was labeled with α- 32 P-dCTP using a nick translation kit (catalog number N.5000) manufactured by Amersham Japan (Japan) according to the attached user manual.

【０１０２】この32Ｐで標識したＤＮＡ断片をプローブ
として実験書〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、
モレキユラー クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）、３２０頁、１９８２年、コールド ス
プリング ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従
ってヒト肺ｃＤＮＡライブラリーのプラークハィブリダ
イゼーションを行なった。陽性のクローンを単離し、そ
のクローンが含有する組換え体を各種制限酵素で解析し
たところ、得られた組換え体にはＴＭ１３よりも前記ペ
プチドのＮ末端側の塩基配列をコードしていると思われ
る約２４００ｂｐのＤＮＡ断片が組み込まれていること
がわかった。このＤＮＡ断片をＴＭ１３７と称した。The DNA fragment labeled with 32 P was used as a probe in an experimental book [Maniatis et al.,
Molecular cloning (Molecular C
ling, p. 320, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory.
ing Harbor Laboratory)] to perform plaque hybridization of the human lung cDNA library. Positive clones were isolated and the recombinants contained in the clones were analyzed with various restriction enzymes. It was found that a likely DNA fragment of about 2400 bp was incorporated. This DNA fragment was designated as TM137.

【０１０３】（６）：ＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配列 前記（５）で得られたＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配列
を参考例３−（４）に記載の方法と同様に決定した。結
果を図４〜図７に示す。この結果より、ＤＮＡ断片ＴＭ
１３７は、参考例２−（３）に記載したＮ末端アミノ酸
配列をコードする塩基配列を含まないことがわかった。(6): Base sequence of DNA fragment TM137 The base sequence of DNA fragment TM137 obtained in (5) was determined in the same manner as in the method described in Reference Example 3- (4). The results are shown in FIGS. From these results, it can be seen that the DNA fragment TM
137 did not contain the nucleotide sequence encoding the N-terminal amino acid sequence described in Reference Example 2- (3).

【０１０４】（７）：プライマー エクステンション 参考例３−（４）で得られたＤＮＡ断片の塩基配列のう
ち、ＤＮＡ断片ＴＭ１３のＮ末端側の配列を基に３種類
の合成ＤＮＡを参考例２−（４）に記載と同様にして作
成し、ＨＴＭ１３１、ＨＴＭ１３２、ＨＴＭ１３３と命
名した。なお、合成ＤＮＡの設計に当っては、ヒトさい
帯内皮細胞より調製したｍＲＮＡとハイブリダイズする
側の塩基配列を利用した。各合成ＤＮＡの塩基配列は以
下のとおりであり、それらの合成ＤＮＡが対応するＤＮ
Ａ断片ＴＭ１３での位置を図２に、またＴＭ１３７での
位置を図４に示す。(7): Primer extension In the base sequence of the DNA fragment obtained in Reference Example 3- (4), three types of synthetic DNAs were obtained based on the N-terminal sequence of DNA fragment TM13. It was created in the same manner as described in (4), and was named HTM131, HTM132, and HTM133. In designing the synthetic DNA, the base sequence that hybridizes with mRNA prepared from human umbilical cord endothelial cells was used. The base sequence of each synthetic DNA is as follows, and the corresponding DNA
The position in A fragment TM13 is shown in FIG. 2, and the position in TM137 is shown in FIG.

【０１０５】 ＨＴＭ１３１： ５′ＧＡＣＧＣＡＧＡＧＧＴＡＧＣＴＡＧＴＴＴ ３′（２０ｍｅｒ） ＨＴＭ１３２： ５′ＡＡＣＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴＧ ３′ （１５ｍｅｒ） ＨＴＭ１３３： ５′ＧＡＣＡＧＧＣＡＧＴＣＴＧＧＴＴＧＣＡＡ ３′（２０ｍｅｒ）HTM131: 5'GACGCAGAGGTAGCTAGTTTT 3 '(20mer) HTM132: 5'AACATCTGGCCACCTG 3' (15mer) HTM133: 5'GACAGGCAGTCTGGTTGCAA 3 '(20mer)

【０１０６】次にこのＨＴＭ１３３をプライマーとして
参考例３−（１）に記載した方法で得たヒトさい帯内皮
細胞より調製したポリ（Ａ）+ ＲＮＡを用いて、いわゆ
るプライマー エクステンション（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘ
ｔｅｎｓｉｏｎ）法を行なって、ＤＮＡ断片ＴＭ１３７
のさらに５′上流部分を合成した。すなわち、約１μｇ
／μｌのポリ（Ａ）+ ＲＮＡ５μｌに約２７ｎｇ／μｌ
のＨＴＭ１３３溶液２０μｌを加え６５℃で２０分間加
熱後、室温にまで約１時間かけて冷却した。それ以降
は、ｃＤＮＡ合成システム（アマシャム ジャパン社、
日本、カタログ番号ＲＰＮ１２５６）を用いて、そのマ
ニュアルに従ってｃＤＮＡを合成した。但し、ｃＤＮＡ
合成システムに入っているオリゴ（ｄＴ）プライマーの
かわりにＨＴＭ１３３を用いて実施した。Next, using this HTM133 as a primer and poly (A) + RNA prepared from human umbilical cord endothelial cells obtained by the method described in Reference Example 3- (1), a primer extension (Primer Ex) was used.
The DNA fragment TM137
A further 5 'upstream portion of was synthesized. That is, about 1 μg
Ng / μl per 5 μl of poly (A) + RNA / μl
Was added and heated at 65 ° C. for 20 minutes, and then cooled to room temperature over about 1 hour. Since then, cDNA synthesis systems (Amersham Japan,
CDNA was synthesized according to the manual using Japan, catalog number RPN1256). However, cDNA
HTM133 was used instead of the oligo (dT) primer included in the synthesis system.

【０１０７】合成されたｃＤＮＡは実験書〔マニアティ
ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、２４１
頁、１９８２年、コールド スプリング ハーバー ラ
ボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従って両末端にＣテールを
つけ、両末端にＧテールをつけたｐＢＲ３２２（ＡＴＣ
Ｃ３７０１７）と混合し、６５℃、５分間加熱後５７
℃、２時間加熱した後、ゆっくりと室温に戻した後大腸
菌Ｋ１２ＭＣ１０６１（ベックマン シティ オブ ホ
ープ メディカルインスティテュート、米国より入手）
を形質転換した。The synthesized cDNA was prepared according to the manual (Maniatis et al., Molecular Cloning, 241).
Page, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory.
Laboratory)], pBR322 (ATC) with a C tail at both ends and a G tail at both ends.
C37017), and after heating at 65 ° C. for 5 minutes, 57
C. After heating for 2 hours at room temperature and slowly returning to room temperature, E. coli K12MC1061 (obtained from Beckman City of Hope Medical Institute, USA)
Was transformed.

【０１０８】詳しくは、大腸菌Ｋ１２ＭＣ１０６１株の
コロニーをＬＢ培地を用いて、５５０ｎｍにおける吸光
度が０．３になるまで培養した。該培養物５０ｍｌを集
め、２５ｍｌの１０ｍＭ ＲｂＣｌを含む１０ｍＭ ３
−（Ｎーモルホリノ）プロパン−スルホン酸（ＭＯＰ
Ｓ）（ｐＨ７．０）溶液で洗浄し、次いで、５０ｍＭＣ
ａＣｌ2、１０ｍＭ ＲｂＣｌを含む２５ｍｌの０．１
Ｍ ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５）に再び懸濁した。得られた
懸濁液を３０分間氷冷し、遠心後、上澄を除去し、３０
μｌのＤＭＳＯおよび５０ｍＭ ＣａＣｌ2と１０ｍＭ
ＲｂＣｌを含む２．０ｍｌの０．１Ｍ ＭＯＰＳ（ｐ
Ｈ６．５）の混合液中に懸濁させた。懸濁液を２００μ
ｌずつ分注し、前述のプラスミドＤＮＡ溶液１０μｌを
それぞれに加えた。Specifically, a colony of Escherichia coli K12MC1061 strain was cultured in an LB medium until the absorbance at 550 nm became 0.3. 50 ml of the culture is collected and 10 mM 3 containing 25 ml of 10 mM RbCl.
-(N-morpholino) propane-sulfonic acid (MOP
S) (pH 7.0) solution, then wash with 50 mM C
aCl 2 , 25 ml 0.1% containing 10 mM RbCl
Re-suspended in M MOPS (pH 6.5). The resulting suspension was cooled on ice for 30 minutes, centrifuged, and the supernatant was removed.
μl DMSO and 50 mM CaCl 2 and 10 mM
2.0 ml of 0.1 M MOPS containing RbCl (p
H6.5). 200μ suspension
The above-mentioned plasmid DNA solution (10 μl) was added to each.

【０１０９】該混合液を３０分間氷冷した後、４４℃で
６０秒ヒートショックを与え、ただちに、あらかじめ３
７℃に温めておいた５ｍｌのＬＢ培地を加えた。この溶
液を３７℃で１時間培養した後、それぞれの溶液を遠心
し、上澄を除去し、細胞ペレットを得た。該細胞ペレッ
トにＬＢ培地を加え、撹拌した後、懸濁液とした。該懸
濁液を５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天
プレートにまき３７℃で１夜培養を行なった。このよう
にして得られるｃＤＮＡバンクより、参考例２−（４）
に記載した方法に従って５′末端を32Ｐで標識したＨＴ
Ｍ１３１及びＨＴＭ１３２をそれぞれプローブとして、
コロニーハイブリダイゼーションを参考例３−（３）と
同様の方法で実施した。After the mixture was ice-cooled for 30 minutes, a heat shock was applied at 44 ° C. for 60 seconds.
5 ml of LB medium warmed to 7 ° C. was added. After culturing this solution at 37 ° C. for 1 hour, each solution was centrifuged and the supernatant was removed to obtain a cell pellet. An LB medium was added to the cell pellet, and stirred to form a suspension. The suspension was spread on an LB agar plate containing 5 μg / ml of tetracycline and cultured at 37 ° C. overnight. From the cDNA bank thus obtained, Reference Example 2- (4)
HT labeled at its 5 'end with 32 P according to the method described in
Using M131 and HTM132 as probes, respectively.
Colony hybridization was performed in the same manner as in Reference Example 3- (3).

【０１１０】コロニハイブリダイゼーションで約７０，
０００個の形質転換体をスクリーニングしてＨＴＭ１３
１及びＨＴＭ１３２の両者のプローブと反応するコロニ
ーが６クローン得られた。この６クローンから、実験書
〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー
クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）、３６６頁、１９８２年、コールド スプリング
ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従ってプラス
ミドＤＮＡ（これを“ｐＴＭＰ５”と称する）を調製
し、各種の制限酵素を用いて切断し、電気泳動で解析し
たところ、６クローンから得られたプラスミドＤＮＡは
全て同一であり、約９００ｂｐの大きさのＤＮＡ断片と
ベクターからなることがわかった。このＤＮＡ断片をＴ
ＭＰ５と命名した。Approximately 70, by colony hybridization
000 transformants were screened for HTM13
Six clones were obtained which reacted with both the 1 and HTM132 probes. From these 6 clones, an experimental book [Maniatis et al., Molecular Cloning (Molecular Clonin)] was used.
g) p. 366, 1982, Cold Spring
Harbor Laboratory (Cold Spring H
plasmid DNA (hereinafter referred to as "pTMP5") was prepared, cleaved with various restriction enzymes, and analyzed by electrophoresis. As a result, the plasmid DNAs obtained from the six clones were all the same. And a DNA fragment of about 900 bp in size and a vector. This DNA fragment is
It was named MP5.

【０１１１】（８）：ＤＮＡ断片ＴＭＰ５とＮ末端アミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイ
ゼーション 参考例３−（３）に記載の方法と同様にして、ＤＮＡ断
片ＴＭＰ５がＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡプ
ローブとハイブリダイズするか否かを調べた。ＤＮＡ断
片ＴＭＰ５はいずれのＮ末端ＤＮＡプローブともハイブ
リダイズしない、つまりＮ末端アミノ酸配列部分をコー
ドしていないことが分かった。(8): Hybridization of DNA fragment TMP5 with a DNA probe encoding an N-terminal amino acid sequence In the same manner as described in Reference Example 3- (3), DNA fragment TMP5 encodes an N-terminal amino acid sequence. It was examined whether the DNA hybridized with the DNA probe to be hybridized. It was found that the DNA fragment TMP5 did not hybridize with any of the N-terminal DNA probes, that is, did not encode the N-terminal amino acid sequence portion.

【０１１２】（９）：ＤＮＡ断片ＴＭＰ５の塩基配列 参考例３−（４）に記載の方法と同様にして、ＤＮＡ断
片ＴＭＰ５の塩基配列を決定した。結果を図８〜図９に
示す。(9): Base sequence of DNA fragment TMP5 The base sequence of DNA fragment TMP5 was determined in the same manner as in the method described in Reference Example 3- (4). The results are shown in FIGS.

【０１１３】（１０）：第２回目のプライマー エクス
テンション 参考例３−（７）に記載の方法と同様にして、ＤＮＡ断
片ＴＭＰ５の塩基配列を基にしてＨＴＭ１３４、ＨＴＭ
１３５、ＨＴＭ１３６の３本の２０ｍｅｒの合成ＤＮＡ
を作成する。これらの合成ＤＮＡと対応するＤＮＡ断片
ＴＭＰ５における位置を図８に示す。参考例３−（７）
に記載の方法と同様にしてプライマー エクステンショ
ンをＨＴＭ１３６をプライマーとし、ＨＴＭ１３４、及
びＨＴＭ１３５をプローブとして実施した。約５０，０
００個の形質転換体から、ＨＴＭ１３４、及びＨＴＭ１
３５とハイブリダイズする形質転換体が一種類得られ
た。この形質転換体が保有する組換え体に含まれている
ＤＮＡ断片をＴＭＰ２６と命名した。(10) Second Primer Extension HTM134, HTM based on the nucleotide sequence of DNA fragment TMP5 in the same manner as described in Reference Example 3- (7).
135, three 20mer synthetic DNAs of HTM136
Create FIG. 8 shows the positions in the DNA fragment TMP5 corresponding to these synthetic DNAs. Reference Example 3- (7)
The primer extension was performed using HTM136 as a primer and HTM134 and HTM135 as probes in the same manner as described in the above section. About 50,0
From the 00 transformants, HTM134 and HTM1
One transformant hybridizing with 35 was obtained. The DNA fragment contained in the recombinant carried by this transformant was named TMP26.

【０１１４】（１１）：ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６とＮ末端
アミノ酸配列をコードするＤＮＡプローブとのハイブリ
ダイゼーシヨン 参考例３−（３）に記載の方法と同様にしてＤＮＡ断片
ＴＭＰ２６がＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡプ
ローブとハイブリダイズするか否かを調べた。その結
果、ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６は参考例２−（４）で合成し
た３３ｍｅｒのＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡ
プローブ及び４種の２５ｍｅｒのプローブのミックスプ
ローブとハイブリダイズした。つまり、ＤＮＡ断片ＴＭ
Ｐ２６はＮ末端アミノ酸配列部分をコードしていること
が分かった。(11): Hybridization of DNA fragment TMP26 with a DNA probe encoding an N-terminal amino acid sequence In the same manner as described in Reference Example 3- (3), DNA fragment TMP26 It was examined whether it hybridized with the DNA probe to be coded. As a result, the DNA fragment TMP26 was a DNA encoding the 33-mer N-terminal amino acid sequence synthesized in Reference Example 2- (4).
Hybridized with the probe and a mixed probe of four 25-mer probes. That is, the DNA fragment TM
P26 was found to encode the N-terminal amino acid sequence portion.

【０１１５】（１２）：ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６の塩基配
列 参考例３−（４）に記載の方法と同様にして、ＤＮＡ断
片ＴＭＰ２６の塩基配列を決定した。ＤＮＡ断片ＴＭＰ
２６のカルボキシル末端からの約５４０塩基の塩基配列
を図１０に示す。(12): Base sequence of DNA fragment TMP26 The base sequence of DNA fragment TMP26 was determined in the same manner as in the method described in Reference Example 3- (4). DNA fragment TMP
FIG. 10 shows the nucleotide sequence of about 540 bases from the 26 carboxyl terminus.

【０１１６】（１３）：ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６、ＴＭＰ
５及びＴＭＰ１３７の接合 参考例３−（１）〜（１２）で得られ、塩基配列を決定
した４本のＤＮＡ断片（ＴＭ１３、ＴＭ１３７、ＴＭＰ
５及びＴＭＰ２６）のその塩基配列における対応関係お
よび簡単な制限酵素地図を図１１に示した。図１１に示
すようにＤＮＡ断片ＴＭＰ２６に含まれるＮ末端アミノ
酸配列をコードする塩基配列の上流にある最初のＡＴＧ
よりオープンリーディングフレームを組むとＤＮＡ断片
ＴＭＰ２６、ＴＭＰ５を通過してＴＭ１３７の途中まで
続く１７２５ｂｐからなることが分かった。この各ＤＮ
Ａ断片にわたるオープンリーディングフレームをコード
するＤＮＡ断片を得るためにＤＮＡ断片ＴＭＰ２６、Ｔ
ＭＰ５及びＴＭ１３７を次のようにして常法に従って継
ぎあわせた。(13): DNA fragments TMP26, TMP
5 and TMP137 conjugation Four DNA fragments (TM13, TM137, TMP) obtained in Reference Examples 3- (1) to (12) and determined in base sequence
5 and TMP26) in their base sequences and a simple restriction map are shown in FIG. As shown in FIG. 11, the first ATG upstream of the nucleotide sequence encoding the N-terminal amino acid sequence contained in the DNA fragment TMP26
When the open reading frame was assembled, it was found that the open reading frame consisted of 1725 bp that passed through DNA fragments TMP26 and TMP5 and continued halfway through TM137. Each DN
To obtain a DNA fragment encoding an open reading frame spanning the A fragment,
MP5 and TM137 were spliced together in the usual manner as follows.

【０１１７】（１３−１）：ＤＮＡ断片ＴＭ１３７とＴ
ＭＰ５の継ぎあわせ まず、λｇｔ１１のＥｃｏＲＩサイトに挿入されている
ＤＮＡ断片ＴＭ１３７を単離し、プラスミドｐＵＣ１８
（ファルマシア社製、スウェーデン、カタログ番号２７
−４９４９−０１）のＥｃｏＲＩサイトに挿入してプラ
スミドｐＵＣ１８ＴＭ１３７を得た。次にプラスミドｐ
ＵＣ１８ＴＭ１３７を制限酵素ＨｉｎｃII、ＥｃｏＲＩ
で消化して４％（ｖ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で分離し、電気泳動抽出装置（日本、アート社製、
ＭＡＸ−ＹＩＥＬＤＲ）を用いて約２，３００ｂｐのＤ
ＮＡ断片を回収し、エタノール沈殿を行なって精製し
た。(13-1): DNA fragment TM137 and T
Splicing of MP5 First, a DNA fragment TM137 inserted into the EcoRI site of λgt11 was isolated, and the plasmid pUC18 was isolated.
(Pharmacia, Sweden, Catalog No. 27
-4949-01) to obtain plasmid pUC18TM137. Next, the plasmid p
UC18TM137 is replaced with restriction enzymes HincII and EcoRI.
And separated by 4% (v / v) polyacrylamide gel electrophoresis.
MAX-YIELDR) using about 2,300 bp of D
The NA fragment was recovered and purified by ethanol precipitation.

【０１１８】一方、参考例３−（７）で得られたＴＭＰ
５をプラスミドｐＢＲ３２２に組み込んだプラスミドｐ
ＴＭＰ５をＤｄｅＩで完全に消化した後、切断末端を
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ Ｐ
ｏｌＩ断片）を用いて平滑末端にして約８００ｂｐのＤ
ＮＡ断片を回収し、このＤＮＡ断片をｐＵＣ１８のＳｍ
ａＩサイトに挿入してプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＰ５を
得た。次にこのプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＰ５を制限酵
素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｃIIで完全消化して約６００
ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｃII断片を得た。On the other hand, the TMP obtained in Reference Example 3- (7)
5 into plasmid pBR322
After complete digestion of TMP5 with DdeI, the cut ends were placed in E. coli. coli DNA polymerase (Klenow P
ol fragment) and made about 800 bp of D
The NA fragment was recovered, and this DNA fragment was replaced with the Sm of pUC18.
The plasmid was inserted into the aI site to obtain a plasmid pUC18TMP5. Next, this plasmid pUC18TMP5 was completely digested with restriction enzymes BamHI and HincII to obtain about 600
A bp BamHI-HincII fragment was obtained.

【０１１９】以上の様にしてプラスミドｐＵＣ１８ＴＭ
１３７より調製した約２，３００ｂｐのＤＮＡの断片及
びプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＰ５より調製した約６００
ｂｐのＤＮＡ断片プラスミドｐＵＣ１８のＢａｍＨＩお
よびＥｃｏＲＩで消化して調製したベクターに挿入して
プラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ１を得た。この工程を図１
２に示した。As described above, plasmid pUC18TM
Approximately 2,300 bp DNA fragment prepared from 137 and about 600 prepared from plasmid pUC18TMP5.
The bp DNA fragment was inserted into a vector prepared by digesting plasmid pUC18 with BamHI and EcoRI to obtain plasmid pUC18TMJ1. This process is shown in FIG.
2 is shown.

【０１２０】（１３−２）：ＤＮＡ断片ＴＭＪ１とＴＭ
Ｐ２６の継ぎあわせ プラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ１を制限酵素ＤｄｅＩ、Ｋ
ｐｎＩ及びＢａｍＨＩで完全消化し、約９５０ｂｐ及び
約１５００ｂｐの断片を回収した。一方、ＤＮＡ断片Ｔ
ＭＰ２６をプラスミドｐＵＣ１３（ファルマシア社製、
スウェーデン、カタログ番号２７−４９５４−０１）の
制限酵素ＰｓｔＩサイトに挿入してプラスミドｐＵＣ１
３ＴＭＰ２６を得た。これをＢｂｅＩで完全消化した
後、切断末端をＴ4ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末
端にし、さらに制限酵素Ｂｇ1 IIで完全消化して約１７
０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。さらに別に、プラスミドｐ
ＵＣ１３ＴＭＰ２６をＢｇ1 II及びＤｄｅＩで完全消化
して約２８０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。(13-2): DNA fragments TMJ1 and TM
Splicing of P26 Plasmid pUC18TMJ1 was replaced with restriction enzymes DdeI and K
After digestion with pnI and BamHI, fragments of about 950 bp and about 1500 bp were recovered. On the other hand, DNA fragment T
MP26 was converted to plasmid pUC13 (Pharmacia,
Swedish, catalog number 27-4954-01) inserted into the PstI site of the restriction enzyme
3TMP26 was obtained. This was digested to completion with BbeI, the cut ends were blunted using T 4 DNA polymerase, about it was completely digested further with the restriction enzyme Bg1 II 17
A 0 bp DNA fragment was obtained. Furthermore, plasmid p
UC13TMP26 was completely digested with BglII and DdeI to obtain a DNA fragment of about 280 bp.

【０１２１】次に上記の約１７０ｂｐ、約２８０ｂｐ、
約９５０ｂｐのＤＮＡ断片をＴ4 ＤＮＡリガーゼを用い
て継ぎあわせ、制限酵素ＫｐｎＩで消化した後、５０Ｖ
の電圧で４℃で２時間、１．３％低融点アガロースゲル
電気泳動にかけて精製単離し、約１４００ｂｐのＤＮＡ
断片を得た。また別途、プラスミドｐＵＣ１８をＳｐｈ
Ｉで完全に消化した後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラ
ーゼで切断末端を平滑末端にした後、ＢａｍＨＩで完全
消化してベクターを調製した。このベクターに上述の約
１，４００ｂｐ及び約１，５００ｂｐのＤＮＡ断片をＴ
4 ＤＮＡリガーゼを用いて挿入して、プラスミドｐＵＣ
１８ＴＭＪ２を得た。この工程を図１３に示す。Next, about 170 bp, about 280 bp,
Approximately 950 bp DNA fragment was spliced together using T 4 DNA ligase and digested with the restriction enzyme KpnI.
Purified and isolated by 1.3% low melting point agarose gel electrophoresis at 4 ° C. for 2 hours at a voltage of about 1400 bp of DNA.
A fragment was obtained. Separately, plasmid pUC18 is replaced with Sph
After complete digestion with I.I. After cutting the blunt end with E. coli DNA polymerase, the vector was prepared by complete digestion with BamHI. The above-mentioned DNA fragments of about 1,400 bp and about 1,500 bp were
4 Insert with DNA ligase and insert plasmid pUC
18TMJ2 was obtained. This step is shown in FIG.

【０１２２】参考例４ （ヒト染色体からの目的遺伝子のスクリーニング） ヒト染色体ライブラリーからの目的遺伝子のスクリーニ
ングは以下のようにして実施した。λファージのベクタ
ーＥＭＢＬ−３に入ったヒト染色体ライブラリーは米国
クローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．９２２Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ａｖ
ｅ．Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ９４３０３）より購入し
た（カタログ番号ＨＬ１００６）。このライブラリーよ
り参考例３−（２）で得られたＤＮＡ断片ＴＭ１３をプ
ローブとして用いて参考例３−（５）と同様の方法でス
クリーニングを行なったところ、約２万ｂｐインサート
を含有する染色体クローンが１種類得られた。Reference Example 4 (Screening of Target Gene from Human Chromosome) Screening of a target gene from a human chromosome library was carried out as follows. The human chromosome library contained in the vector EMBL-3 of phage λ was obtained from Clontech Laborat, USA.
ries, Inc. 922 Industrial Av
e. Palo Alto, CA94303) (catalog number HL1006). Screening was carried out from this library using the DNA fragment TM13 obtained in Reference Example 3- (2) as a probe in the same manner as in Reference Example 3- (5). One clone was obtained.

【０１２３】この染色体クローンを制限酵素ＢａｍＨＩ
で完全消化して１．０％アガロースゲル電気泳動を行な
い、実験書〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モ
レキュラー クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ）、３８２頁、１９８２年、コールド スプ
リング ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従っ
てサザン ブロットハイブリダイゼーションを同じプー
ロブを用いて実施した。This chromosomal clone was cloned into the restriction enzyme BamHI.
After completion of the digestion with 1.0% agarose gel, electrophoresis was performed.
oning), p. 382, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory.
ng Harbor Laboratory)]. Southern blot hybridizations were performed using the same probe.

【０１２４】その結果、約４，０００ｂｐのＤＮＡ断片
に強い陽性のバンドを得たのでその断片を常法に従って
単離し、プラスミドｐＵＣ１８のＢａｍＨＩサイトにサ
ブクローニングした。この約４，０００ｂｐのＤＮＡの
塩基配列を決定したところ、参考例３−（１３−２）で
作製したプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ２に挿入されてい
るＤＮＡ断片の塩基配列と完全に一致することが分かっ
た。As a result, a strong positive band was obtained for a DNA fragment of about 4,000 bp. The fragment was isolated by a conventional method and subcloned into the BamHI site of plasmid pUC18. When the nucleotide sequence of this approximately 4,000 bp DNA was determined, it was found that the nucleotide sequence completely matched the nucleotide sequence of the DNA fragment inserted into the plasmid pUC18TMJ2 prepared in Reference Example 3- (13-2).

【０１２５】実施例１ プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２、ｐＳＶ２ＴＭＤ１、ｐＳ
Ｖ２ＴＭＤ２、ｐＳＶ２ＴＭＤ４及び、ｐＳＶ２ＴＭＤ
５の作製 （１）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２の構築 プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）
をＨｉｎｄIII 及びＢｇl IIで完全消化してＳＶ４０の
初期転写プロモーター及びＳＶ４０の転写ターミネータ
を有するベクターを得た。次に参考例２−（１３−２）
で作成したプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ２をＨｉｎｄII
I で部分消化した後ＢａｍＨＩで完全消化して約２，９
００ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片をＴ
ＭＪ２と称した。この２，９００ｂｐのＤＮＡ断片と上
記の如く調製したベクターとをＴ4ＤＮＡリガーゼを用
いて継ぎ合わせ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を得た。
プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を構築する工程を図１４に
示す。得られたプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２については
ブダペスト条約の規定に基き、アメリカン タイプ カ
ルチャー コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託番号第６７
２８３号として寄託されている。Example 1 Plasmids pSV2TMJ2, pSV2TMD1, pS
V2TMD2, pSV2TMD4 and pSV2TMD
Preparation of plasmid 5 (1) Construction of plasmid pSV2TMJ2 Plasmid pSV2-dhfr (ATCC37146)
Was completely digested with HindIII and BglII to obtain a vector having an SV40 early transcription promoter and an SV40 transcription terminator. Next, Reference Example 2- (13-2)
Plasmid pUC18TMJ2 prepared in
After partial digestion with I and complete digestion with BamHI, about 2,9
A 00 bp DNA fragment was isolated. This DNA fragment is
MJ2. The 2,900 bp DNA fragment and the vector prepared as described above were spliced together using T 4 DNA ligase to obtain a plasmid pSV2TMJ2.
The steps for constructing plasmid pSV2TMJ2 are shown in FIG. The obtained plasmid pSV2TMJ2 was deposited at the American Type Culture Collection (ATCC) under the deposit number 67 under the provisions of the Budapest Treaty.
No. 283.

【０１２６】（２）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１の構築 （ａ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ１の作製 前記工程（１）で得られたプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２
をＮｃｏＩで完全消化した後、切断末端をＥ．ｃｏｌｉ
ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にした。次いで
ＨｉｎｄIII で完全消化して約１９００ｂｐのＤＮＡ断
片を得た。得られたＤＮＡ断片をＴＭＪ３と称した。一
方、ファージＭ−１３ｍｐ１９（宝酒造社製、日本、カ
タログ番号３１１９）をＨｉｎｄIII 及びＨｉｎｃIIで
消化してベクターを調製した。このベクターにＤＮＡ断
片ＴＭＤ３を挿入して組換え体プラスミドＭ−１３ｍｐ
１９ＴＭＪ３を得た。(2) Construction of plasmid pSV2TMD1 (a) Preparation of DNA fragment TMD1 Plasmid pSV2TMJ2 obtained in the above step (1)
Was completely digested with NcoI, and the cut end was replaced with E. coli. coli
The ends were made blunt using DNA polymerase. Then, it was completely digested with HindIII to obtain a DNA fragment of about 1900 bp. The obtained DNA fragment was designated as TMJ3. On the other hand, a vector was prepared by digesting phage M-13mp19 (manufactured by Takara Shuzo, Japan, catalog number 3119) with HindIII and HincII. The DNA fragment TMD3 was inserted into this vector and the recombinant plasmid M-13mp was inserted.
19TMJ3 was obtained.

【０１２７】また別途、下記の塩基配列を有する削除用
ＤＮＡプローブ〔以下“ディリーター（ｄｅｌｅｔｅ
ｒ）”と称する〕を有機合成した： ５′−ＧＧＡＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＣＣＣＧＡＡＴＧＣＡＣＧ−３′(25 mer)。 合成ディリーターをＴＭＤと称した。このようにして作
成したディリーターＴＭＤを用い、メソッド イン エ
ンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ）、第１００巻、４６８頁、（１９８３年）、ア
カデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）に
記載の方法に従って部位特異的変異の手法で前記の如く
得られた組換え体プラスミドＭ−１３ｍｐ１９ＴＭＪ１
３の１７７塩基からなる部分の削除を行った。Separately, a DNA probe for deletion having the following base sequence [hereinafter referred to as "deleter"
r) "was synthesized organically: 5'-GGAGGCGCTCAGCCCGAATGCACG-3 '(25 mer). The synthetic deleter was designated as TMD. Enzymol
100, p. 468 (1983), and a recombinant plasmid M-13mp19TMJ1 obtained as described above by site-directed mutagenesis according to the method described in Academic Press.
The portion consisting of 3 177 bases was deleted.

【０１２８】即ち、２５ｐｍｏｌのディリーターＴＭＤ
および１０ｐｍｏｌのＭ１３プライマーＭ３（ユニバー
サルプライマー、宝酒造社製、日本、カタログ番号３８
３１）の５′末端をＴ4 キナーゼを用いてリン酸化した
後、０．５ｐｍｏｌの組換え体プラスミドＭ１３ｍｐ１
９ＴＭＪ３のシングルストランドＤＮＡを加え、９５℃
で５分間加熱後、室温にまで冷却した。次いで５単位の
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ１（Ｋｌｅｎｏｗ
Ｆｒａｇｍｅｎｔ）、及び１０単位のＴ4 ＤＮＡリガー
ゼを混合物に加えて３７℃で３０分間インキュベートし
て混合物中に組換え体プラスミドを生成させた。That is, 25 pmol of the deleter TMD
And 10 pmol of M13 primer M3 (Universal Primer, manufactured by Takara Shuzo, Japan, Catalog No. 38
After the 5 'end of the 31) were phosphorylated using of T 4 kinase, recombinant plasmid of 0.5 pmol M13mp1
Add 9TMJ3 single-strand DNA and add
And then cooled to room temperature. Then 5 units of E.C. coli DNA polymerase 1 (Klenow
Fragment) and 10 units of T 4 DNA ligase were added to the mixture and incubated at 37 ° C. for 30 minutes to generate a recombinant plasmid in the mixture.

【０１２９】得られた混合物をイー コリ（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０５（ファルマシア社製、スウェーデン、カ
タログ番号２７−１５５０）に加えた。それによって、
このイー コリを組換え体プラスミドでトランスフェク
ションした。３７℃で一夜培養して生じた寒天培地上の
プラークをニトロセルロースフィルターに移しとり、８
０℃で２時間加熱後、プレハイブリダイゼーションを行
った。プレハイブリダイゼーションは６×ＳＥＴ〔０．
９Ｍ ＮａＣｌ、１８０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．
０）、６ｍＭ ＥＤＴＡ〕、５×Ｄｅｎｈａｒｔｓ’
〔０．１％（ｗ／ｖ）フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、
０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、０．１％
（ｗ／ｖ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）〕、０．１
％ＳＤＳ，１００μｇ／ｍｌ変性サケ***ＤＮＡを含む
溶液中で５５℃、２時間加温することにより実施した。The obtained mixture was used for E. coli.
i) Added to JM105 (Pharmacia, Sweden, Catalog No. 27-1550). Thereby,
This E. coli was transfected with the recombinant plasmid. The plaque on the agar medium formed by culturing overnight at 37 ° C. was transferred to a nitrocellulose filter,
After heating at 0 ° C. for 2 hours, prehybridization was performed. Prehybridization was performed at 6 × SET [0.
9 M NaCl, 180 mM Tris buffer (pH 8.
0), 6 mM EDTA], 5 × Denhards'
[0.1% (w / v) Ficoll,
0.1% (w / v) polyvinylpyrrolidone, 0.1%
(W / v), bovine serum albumin (BSA)], 0.1
This was carried out by heating at 55 ° C. for 2 hours in a solution containing% SDS and 100 μg / ml denatured salmon sperm DNA.

【０１３０】次いで上記の溶液中の変性サケ***ＤＮＡ
のかわりに32ＰでラベルしたＴＭＤを加えた溶液を用い
てハイブリダイゼーション反応を５５℃、２時間実施し
た。次いで６×ＳＳＣ（０．９Ｍ食塩、０．０９Ｍクエ
ン酸三ナトリウムの水溶液）を用いてニトロセルロース
フィルターを洗浄した。洗浄は室温で、５分間、２回洗
った後、５５℃、６５℃、７５℃、と段階的に温度を上
げていって、それぞれ５分間２回ずつ洗った。Ｘ線フィ
ルムＸＡＲ−５（イーストマン コダック社製、米国）
を得られたニトロセルロースフィルターに密着させて−
８０℃、一夜露出させたところ、Ｘ線フイルム上に強く
露光した黒いスポットが数１０個検出された。Next, denatured salmon sperm DNA in the above solution
The hybridization reaction was carried out at 55 ° C. for 2 hours using a solution to which TMD labeled with 32 P was added instead. Next, the nitrocellulose filter was washed with 6 × SSC (0.9 M salt, 0.09 M aqueous solution of trisodium citrate). After washing twice at room temperature for 5 minutes, the temperature was gradually increased to 55 ° C., 65 ° C., and 75 ° C., and washed twice for 5 minutes each. X-ray film XAR-5 (Eastman Kodak, USA)
The nitrocellulose filter obtained was adhered to-
After exposure at 80 ° C. overnight, several tens of darkly exposed black spots were detected on the X-ray film.

【０１３１】各スポットは組換え体プラスミドで感染し
たクローンに対応するものである。そのうち、６クロー
ンを選択し、各クローンの組換え体プラスミドを単離し
て制限酵素解析、及び塩基配列の解析を行ったところ、
これらのクローンの保有する組換え体プラスミドは制限
部位と塩基配列がそれぞれ同一であることがわかった。
得られた組換え体プラスミドをＭ１３−ＴＭＤ１と称し
た。さらにこの組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ１
は、開始コドン（ＡＴＧ）と、その下流に４９８個のア
ミノ酸からなる本発明のペプチドをコードする塩基配列
を含む塩基配列を含有するＤＮＡ断片を有することがわ
かった。この組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ１に含
まれるＤＮＡ断片をＴＭＤ１と称した。図１５に組換え
体プラスミドＭ−１３ｍｐ１９ＴＭＪ３とディリータ−
ＴＭＤとがハイブリダイズし、ＤＮＡ断片ＴＭＪ３に対
応するＤＮＡ領域の一部が削除されるところを示す。Each spot corresponds to a clone infected with the recombinant plasmid. Among them, 6 clones were selected, and the recombinant plasmid of each clone was isolated and subjected to restriction enzyme analysis and nucleotide sequence analysis.
It was found that the recombinant plasmids of these clones had the same restriction site and the same nucleotide sequence.
The resulting recombinant plasmid was designated as M13-TMD1. Further, the recombinant plasmid M13-TMD1
Was found to have a DNA fragment containing a start codon (ATG) and a base sequence downstream of the base sequence including the base sequence encoding the peptide of the present invention consisting of 498 amino acids. The DNA fragment contained in the recombinant plasmid M13-TMD1 was called TMD1. FIG. 15 shows that the recombinant plasmid M-13mp19TMJ3 and the deleter
This shows that TMD hybridizes and a part of the DNA region corresponding to the DNA fragment TMJ3 is deleted.

【０１３２】（ｂ）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１の構築 実施例１−（２）−（ａ）で作製した組換え体プラスミ
ドＭ１３−ＴＭＤ１をＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで
完全消化してＴＭＤ１の約１９００ｂｐ ＤＮＡ断片を
単離した。一方、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴ
ＣＣ ３７１４６）をＨｉｎｄIII 及びＢｇl IIで完全
消化してベクターを得た。このベクターとＤＮＡ断片Ｔ
ＭＤ１とをＴ4 ＤＮＡリガーゼを用いて継ぎあわせ、プ
ラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１を得た。(B) Construction of plasmid pSV2TMD1 The recombinant plasmid M13-TMD1 prepared in Example 1- (2)-(a) was completely digested with HindIII and BamHI to isolate a DNA fragment of about 1900 bp of TMD1. . On the other hand, plasmid pSV2-dhfr (AT
CC 37146) was completely digested with HindIII and BglII to obtain a vector. This vector and DNA fragment T
Seaming the MD1 using T 4 DNA ligase to obtain a plasmid PSV2TMD1.

【０１３３】（３）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２の構築 （ａ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ２の作製 下記の塩基配列： ５′−ＣＴＣＣＡＣＧＣＴＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＣＣＣ
ＡＧＧ−３′（２５ｍｅｒ）を有するディリーターＴＭ
ｄ2 をディリーターＴＭＤの代わりに削除用ＤＮＡプロ
ーブとして用いる以外は、実施例１−（２）−（ａ）と
実質的に同様の方法を繰り返して、ＴＭＤ２と称するＤ
ＮＡ断片を含む組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ２を
得た。ＤＮＡ断片ＴＭＤ２は実施例１−（２）−（ａ）
で得られたＤＮＡ断片ＴＭＤ１の５′末端から６７８ｂ
ｐのＤＮＡが削除された構造を有する。このＤＮＡ断片
ＴＭＤ２は開始コドン（ＡＴＧ）と、その下流に２７２
個のアミノ酸からなる本発明のペプチドをコードする塩
基配列を含む塩基配列を有していた。図１６に組換え体
プラスミドＭ１３−ＴＭＤ１とディリーターＴＭｄ2と
がハイブリダイズし、ＤＮＡ断片ＴＭＤ１に対応するＤ
ＮＡ領域の一部が削除されるところを示す。(3) Construction of plasmid pSV2TMD2 (a) Preparation of DNA fragment TMD2 The following nucleotide sequence: 5'-CTCCACGCTGCAGGGGGAACCCC
Deliter TM having AGG-3 '(25mer)
except using d 2 as deletion DNA probes instead of deleter over the TMD, Example 1- (2) - repeat substantially the same manner as in (a), D called TMD2
A recombinant plasmid M13-TMD2 containing the NA fragment was obtained. The DNA fragment TMD2 was prepared in Example 1- (2)-(a).
678 b from the 5 'end of the DNA fragment TMD1 obtained in
It has a structure in which p DNA is deleted. This DNA fragment TMD2 has an initiation codon (ATG) and 272 downstream thereof.
It had a nucleotide sequence including the nucleotide sequence encoding the peptide of the present invention consisting of amino acids. D of Figure 16 two pairs recombinant plasmid M13-TMD1 and a deleter over TMd 2 is hybridized, corresponding to the DNA fragment TMD1
This shows that a part of the NA area is deleted.

【０１３４】（ｂ）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２の構築 実施例１−（３）−（ａ）で作製した組換え体プラスミ
ドＭ１３−ＴＭＤ２をＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで
完全消化してＴＭＤ２の約１２００ｂｐＤＮＡ断片を単
離した。一方、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣ
Ｃ ３７１４６）をＨｉｎｄIII 及びＢｇl IIで完全消
化してベクターを得た。このベクターとＤＮＡ断片ＴＭ
Ｄ２とをＴ4 ＤＮＡリガーゼを用いて継ぎあわせ、プラ
スミドｐＳＶ２ＴＭＤ２を得た。(B) Construction of plasmid pSV2TMD2 The recombinant plasmid M13-TMD2 prepared in Example 1- (3)-(a) was completely digested with HindIII and BamHI to isolate an approximately 1200 bp DNA fragment of TMD2. On the other hand, plasmid pSV2-dhfr (ATC
C 37146) was completely digested with HindIII and BglII to obtain a vector. This vector and DNA fragment TM
Seaming and D2 using T 4 DNA ligase to obtain a plasmid PSV2TMD2.

【０１３５】（４）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４の作製 （ａ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ３の作製 前記工程（１）で得られたプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２
をＮｃｏＩで完全消化した後、切断末端をＥ．ｃｏｌｉ
ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にした。次いで
ＨｉｎｄIII で完全消化して約１，９００ｂｐのＤＮＡ
断片を得た。得られたＤＮＡ断片をＴＭＪ３と称した。
一方、ファージＭ−１３ｍｐ１９（宝酒造社製、日本、
カタログ番号３１１９）のＨｉｎｄIII 及びＨｉｎｃII
で消化してベクターを調製した。このベクターにＤＮＡ
断片ＴＭＪ３を挿入して組換え体プラスミドＭ−１３ｍ
ｐ１９ＴＭＪ３を得た。(4) Preparation of plasmid pSV2TMD4 (a) Preparation of DNA fragment TMD3 Plasmid pSV2TMJ2 obtained in the above step (1)
Was completely digested with NcoI, and the cut end was replaced with E. coli. coli
The ends were made blunt using DNA polymerase. Then, the DNA was digested completely with HindIII to obtain about 1,900 bp of DNA.
A fragment was obtained. The obtained DNA fragment was designated as TMJ3.
On the other hand, phage M-13mp19 (Takara Shuzo, Japan,
Catalog No. 3119) HindIII and HincII
To prepare a vector. This vector contains DNA
Insert the fragment TMJ3 and insert the recombinant plasmid M-13m
p19TMJ3 was obtained.

【０１３６】また別途、下記の塩基配列を有するディリ
ーターを有機合成した： ５′−ＧＧＡＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＣＡＧＴＣＧＧＴＧＣＣＡ−３′(25 mer)。 合成ディリーターをＴＭｄ3と称した。このようにして
作製したディリーターをＴＭｄ3 用い、メソッド イン
エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ）、第１００巻、４６８頁、（１９８３
年）、アカデミック プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ）に記載の方法にしたがって部位特異的変異の手
法で前記の如く得られた組換え体プラスミドＭ−１３ｍ
ｐ１９ＴＭＪ３の２８５ｂｐからなる部分の削除を行っ
た。Separately, a deleter having the following base sequence was organically synthesized: 5'-GGAGGCCGCTCAACAGTCGGTGCCCA-3 '(25 mer). Synthesis deleter chromatography was designated TMd 3. In this way, the TMd 3 using the deleter over prepared, methods in Enzymology (Method in Enzym
100), p. 468, (1983).
Year), Academic Press (Academic Pr)
ess), the recombinant plasmid M-13m obtained as described above by site-directed mutagenesis according to the method described in ess).
The part consisting of 285 bp of p19TMJ3 was deleted.

【０１３７】即ち、２５ｐｍｏｌのディリーターＴＭｄ
3 及び１０ｐｍｏｌのＭ１３プライマーＭ３（ユニバー
サルプライマー、宝酒造社製、日本、カタログ番号３８
３１）の５′末端をＴ4 キナーゼを用いてリン酸化した
後、０．５ｐｍｏｌの組換えプラスミドＭ１３ｍｐ１９
ＴＭＪ３のシングルストランドＤＮＡを加え、９５℃で
５分間加熱後、室温にまで冷却した。次いで５単位の
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ１（Ｋｌｅｎｏｗ
Ｆｒａｇｍｅｎｔ）、及び１０単位のＴ4 ＤＮＡリガー
ゼを混合物に加えて３７℃で３０分間インキュベートし
て混合物中に組換え体プラスミドを生成させた。That is, 25 pmol of the releaser TMd
3 and 10 pmol of M13 primer M3 (Universal primer, manufactured by Takara Shuzo, Japan, Catalog No. 38
After the 5 'end of the 31) were phosphorylated using of T 4 kinase, 0.5 pmol recombinant plasmid M13mp19
A single-strand DNA of TMJ3 was added, heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then cooled to room temperature. Then 5 units of E.C. coli DNA polymerase 1 (Klenow
Fragment) and 10 units of T 4 DNA ligase were added to the mixture and incubated at 37 ° C. for 30 minutes to generate a recombinant plasmid in the mixture.

【０１３８】得られた混合物をイー コリ（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０５（ファルマシア社製、スウェーデン、カ
タログ番号２７−１５５０）に加えた。それによりイー
コリを組換え体プラスミドでトランスフェクションし
た。３７℃で一夜培養して生じた寒天培地上のプラーク
をニトロセルロースフィルターに移しとり、８０℃で２
時間加熱後、プレハイブリダイゼーションを行った。プ
レハイブリダイゼーションは、６×ＳＥＴ〔０．９Ｍ
ＮａＣｌ、１８０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、６
ｍＭ ＥＤＴＡ〕、５×Ｄｅｎｈａｒｔｓ’〔０．１％
（ｗ／ｖ）フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、０．１％（ｗ
／ｖ）ポリビニルピロリドン、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）〕、０．１％ＳＤＳ，１００
μｇ／ｍｌ変性サケ***ＤＮＡを含む溶液中で５５℃、
２時間加温することにより実施した。The obtained mixture was used for E. coli (E. col).
i) Added to JM105 (Pharmacia, Sweden, Catalog No. 27-1550). Thereby, E. coli was transfected with the recombinant plasmid. The plaque formed on the agar medium obtained by culturing overnight at 37 ° C. was transferred to a nitrocellulose filter, and the plaque was incubated at 80 ° C. for 2 hours.
After heating for an hour, prehybridization was performed. Prehybridization was performed using 6 × SET [0.9M
NaCl, 180 mM Tris buffer (pH 8.0), 6
mM EDTA], 5 × Denhards' [0.1%
(W / v) Ficoll, 0.1% (w
/ V) polyvinylpyrrolidone, 0.1% (w / v) bovine serum albumin (BSA)], 0.1% SDS, 100
55 ° C. in a solution containing μg / ml denatured salmon sperm DNA,
This was performed by heating for 2 hours.

【０１３９】次いで、上記の溶液中の変性サケ***ＤＮ
Ａのかわりに32ＰでラベルしたＴＭｄ3 を加えた溶液を
用いてハイブリダイゼーション反応を５５℃、２時間実
施した。次いで６×ＳＳＣ（０．９Ｍ食塩、０．０９Ｍ
クエン酸三ナトリウムの水溶液）を用いてニトロセルロ
ースフィルターを洗浄した。洗浄は室温で、５分間、２
回洗った後、５５℃、６５℃、７５℃、と段階的に温度
を上げていって、それぞれ５分間２回ずつ洗った。Ｘ線
フィルムＸＡＲ−５（イーストマン コダック社製、米
国）を得られたニトロセルロースフィルターに密着させ
て−８０℃、一夜露出させたところ、Ｘ線フィルム上に
強く露光した黒いスポットが数１０個検出された。Next, denatured salmon sperm DN in the above solution
The hybridization reaction was carried out at 55 ° C. for 2 hours using a solution containing TMd 3 labeled with 32 P instead of A. Then 6 × SSC (0.9M salt, 0.09M
The nitrocellulose filter was washed using an aqueous solution of trisodium citrate). Wash at room temperature for 5 minutes, 2
After washing twice, the temperature was gradually increased to 55 ° C, 65 ° C, and 75 ° C, and each was washed twice for 5 minutes. When X-ray film XAR-5 (manufactured by Eastman Kodak Company, USA) was brought into close contact with the obtained nitrocellulose filter and exposed at -80 ° C overnight, several tens of black spots were strongly exposed on the X-ray film. was detected.

【０１４０】各スポットは組換え体プラスミドで感染し
たクローンに対応するものである。そのうち、６クロー
ンを選択し、各クローンの組換え体プラスミドを単離し
て制御酵素解析、及び塩基配列の解析を行ったところ、
これらのクローンの保有する組換え体プラスミドは制限
部位と塩基配列がそれぞれ同一であることがわかった。
得られた組換え体プラスミドをＭ１３−ＴＭＤ３と称し
た。更にこの組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３は、
開始コドン（ＡＴＧ）と、その下流に４６２個のアミノ
酸からなるペプチドをコードする塩基配列（配列番号１
５の１−１３８６の塩基配列）を含有するＤＮＡ断片を
有することがわかった。この組換え体プラスミドＭ１３
−ＴＭＤ３に含まれるＤＮＡ断片をＴＭＤ３と称した。
図１７に組換え体プラスミドＭ−１３ｍｐ１９ＴＭＪ３
とディリーターＴＭｄ3 とがハイブリダイズし、ＤＮＡ
断片ＴＭＪ３に対応するＤＮＡ領域の一部が削除される
ところを示す。Each spot corresponds to a clone infected with the recombinant plasmid. Among them, 6 clones were selected, the recombinant plasmid of each clone was isolated, and the control enzyme analysis and nucleotide sequence analysis were performed.
It was found that the recombinant plasmids of these clones had the same restriction site and the same nucleotide sequence.
The resulting recombinant plasmid was designated as M13-TMD3. Furthermore, this recombinant plasmid M13-TMD3
A nucleotide sequence encoding a peptide consisting of 462 amino acids downstream of the initiation codon (ATG) (SEQ ID NO: 1)
5 1-1386). This recombinant plasmid M13
-The DNA fragment contained in TMD3 was called TMD3.
FIG. 17 shows the recombinant plasmid M-13mp19TMJ3.
And the releaser TMd 3 hybridize and DNA
This shows that a part of the DNA region corresponding to the fragment TMJ3 is deleted.

【０１４１】（ｂ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ４の作製 部位特異的変異の手法を用いてディリーターＴＭｄ3 の
代わりに実施例１−（３）−（ａ）で得られたディリー
ターＴＭｄ2 を用いる以外は、実施例１−（４）−
（ａ）と実質的に同様の方法で、上述の如く得られた組
換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３の一部を削除して、
ＴＭＤ４と称するＤＮＡ断片を含む組換え体プラスミド
Ｍ１３−ＴＭＤ４を得た。ＤＮＡ断片ＴＭＤ４は実施例
１−（４）−（ａ）で得られたＤＮＡ断片ＴＭＤ３の
５′末端から６７８ｂｐのＤＮＡが削除された構造を有
する。このＤＮＡ断片ＴＭＤ４は開始コドン（ＡＴＧ）
と、その下流に２３６個のアミノ酸からなる本発明のペ
プチドをコードする塩基配列を含む塩基配列を有してい
た。図１８に組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３とデ
ィリーターＴＭｄ2 とがハイブリダイスし、ＤＮＡ断片
ＴＭＤ３に対応するＤＮＡ領域の一部が削除されるとと
ころを示す。[0141] (b) Example 1- (3) in place of the deleter over TMd 3 using techniques produce site-specific mutations in DNA fragments TMD4 - but using deleter over TMd 2 obtained in (a) is carried out Example 1- (4)-
In a substantially similar manner to (a), a part of the recombinant plasmid M13-TMD3 obtained as described above is deleted,
A recombinant plasmid M13-TMD4 containing a DNA fragment called TMD4 was obtained. The DNA fragment TMD4 has a structure in which 678 bp of DNA has been deleted from the 5 'end of the DNA fragment TMD3 obtained in Example 1- (4)-(a). This DNA fragment TMD4 has an initiation codon (ATG)
And a base sequence including a base sequence encoding the peptide of the present invention consisting of 236 amino acids downstream thereof. Figure 18 two sets recombinant plasmid M13-TMD3 with the deleter over TMd 2 is hybridize, indicating the place and part of the DNA region corresponding to the DNA fragment TMD3 is deleted.

【０１４２】（ｃ）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４の構築 実施例１−（４）−（ｂ）で作製した組換え体プラスミ
ドＭ１３−ＴＭＤ４をＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで完
全消化してＴＭＤ４の約１１００ｂｐＤＮＡ断片を単離
した。一方、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ
３７１４６）をＨｉｎｄIII 及びＢｇl IIで完全消化
してベクターを得た。このベクターとＤＮＡ断片ＴＭＤ
４とをＴ4 ＤＮＡリガーゼを用いて継ぎあわせ、プラス
ミドｐＳＶ２ＴＭＤ４を得た。(C) Construction of plasmid pSV2TMD4 The recombinant plasmid M13-TMD4 prepared in Example 1- (4)-(b) was completely digested with HindIII and BamHI to isolate an about 1100 bp DNA fragment of TMD4. On the other hand, plasmid pSV2-dhfr (ATCC
37146) was completely digested with HindIII and BglII to obtain a vector. This vector and DNA fragment TMD
4 were ligated together using T 4 DNA ligase to obtain plasmid pSV2TMD4.

【０１４３】（５）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５の構築 （ａ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ５の作製 下記の塩基配列： ５′−ＣＡＣＧＧＧＣＴＣＣＡＣＧＧＧＧＡＡＣＣＣＣ
ＡＧＧ−３′（２５ｍｅｒ）を有するディリーターＴＭ
ｄ4 をディリーターＴＭｄ2 の代わりに削除用ＤＮＡプ
ローブとして用いる以外は、実施例１−（４）−（ｂ）
と実質的に同様の方法を繰り返して、ＴＭＤ５と称する
ＤＮＡ断片を含む組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ５
を得た。ＤＮＡ断片ＴＭＤ５を実施例１−（４）−
（ａ）で得られたＤＮＡ断片ＴＭＤ３の５′末端から１
０３２ｂｐのＤＮＡが削除された構造を有する。このＤ
ＮＡ断片ＴＭＤ５は開始コドン（ＡＴＧ）と、その下流
に１１８個のアミノ酸からなる本発明のペプチドをコー
ドする塩基配列を含む塩基配列を有していた。図１９に
組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３とディリーターＴ
Ｍｄ4 とがハイブリダイズし、ＤＮＡ断片ＴＭＤ３に対
応するＤＮＡ領域の一部が削除されるところを示す。(5) Construction of plasmid pSV2TMD5 (a) Preparation of DNA fragment TMD5 The following base sequence: 5'-CACGGGCTCCACGGGGGAACCCC
Deliter TM having AGG-3 '(25mer)
except using d 4 as deletion DNA probes instead of deleter over TMd 2 is Example 1- (4) - (b)
And a recombinant plasmid M13-TMD5 containing a DNA fragment called TMD5.
I got The DNA fragment TMD5 was prepared in Example 1- (4)-
1 from the 5 'end of the DNA fragment TMD3 obtained in (a).
It has a structure in which 032 bp DNA is deleted. This D
The NA fragment TMD5 had a start codon (ATG) and a base sequence downstream thereof including a base sequence encoding the peptide of the present invention consisting of 118 amino acids. FIG. 19 shows the recombinant plasmid M13-TMD3 and the releaser T
Md 4 and is hybridized, showing the place where a part of the DNA region corresponding to the DNA fragment TMD3 is deleted.

【０１４４】（ｂ）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５の構築 実施例１−（５）−（ａ）で作製した組換え体プラスミ
ドＭ１３−ＴＭＤ５をＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで完
全消化してＴＭＤ５の約７４０ｂｐ ＤＮＡ断片を単離
した。一方、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ
３７１４６）をＨｉｎｄIII 及びＢｇl IIで完全消化
してベクターを得た。このベクターとＤＮＡ断片ＴＭＤ
５とをＴ4 ＤＮＡリガーゼを用いて継ぎあわせ、プラス
ミドｐＳＶ２ＴＭＤ５を得た。(B) Construction of plasmid pSV2TMD5 The recombinant plasmid M13-TMD5 prepared in Example 1- (5)-(a) was completely digested with HindIII and BamHI to isolate a DNA fragment of about 740 bp of TMD5. . On the other hand, plasmid pSV2-dhfr (ATCC
37146) was completely digested with HindIII and BglII to obtain a vector. This vector and DNA fragment TMD
5 was joined using T 4 DNA ligase to obtain a plasmid pSV2TMD5.

【０１４５】実施例２ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換） ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）を培養器
中に入れた１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（以下“Ｆ
ＣＳ”と略する）を加えたダルベッコの最小必須培地
（以下“ＭＥＭ”と略する）〔フローラボラトリ（Ｆｌ
ｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製、米国、カタロ
グ番号１０−３３１）〕を用いて、３７℃で５％炭酸ガ
スインキューベーター中で対数増殖期になるまで培養
し、０．１％トリプシン及び０．０２％ＥＤＴＡを用い
て培養器に付着増殖した細胞を培養器よりはがして、ハ
ンクス平衡塩類溶液〔フローラボラトリー（Ｆｌｏｗ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製、米国、カタログ番号
１７−１０１−２２〕に約１×１０7 個／ｍｌの濃度に
なるように懸濁した。Example 2 (Transformation of COS-1 cells with plasmid pSV2TMD5) 10% (v / v) fetal bovine serum (hereinafter referred to as "F") was obtained by placing COS-1 cells (ATCC CRL1650) in an incubator.
CS ") and Dulbecco's minimum essential medium (hereinafter abbreviated as" MEM ") [Flow Laboratory (Fl
ow Laboratories), USA, Catalog No. 10-331)] at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator until the logarithmic growth phase was reached, and 0.1% trypsin and 0.02% The cells adhered and grown on the incubator using EDTA were separated from the incubator, and the Hanks balanced salt solution [Flow Laboratory (Flow Laboratory)
Laboratories), USA, Catalog No. 17-101-22] to a concentration of about 1 × 10 7 cells / ml.

【０１４６】実施例１−（５）で得られたプラスミドｐ
ＳＶ２ＴＭＤ５を約２μｇ／μｌになるように１ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。約１０μｇ
のプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５を含む得られたプラスミ
ド懸濁液５μｌを１．５ｍｌ容量のエッペンドルフ型試
験管に入れ、次いでこの試験管に上述の如く得られたＣ
ＯＳ−１細胞の細胞懸濁液２００μｌを入れて、０℃で
１０分間放置した。試験管内の懸濁液を米国Ｄ．Ｅ．
Ｐ．ＳＹＳＴＥＭ社製細胞融合装置ＦＰＨ１００１型の
キュベットに移し、１．２ｋＶで４０μ秒の条件で２回
電気パルスを与えた。その後懸濁液を再び元のエッペン
ドルフ型試験管に移し、０℃で５分間放置した後、１０
％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを加えたダルベッコのＭＥＭ１０ｍ
ｌを以下のように用いて直径１０ｃｍの組織培養用プレ
ートに移した。即ち、少量の１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを
含むダルベッコのＭＥＭを懸濁液に加えてその混合物を
組織培養用プレートに移した。次いで、試験管を残りの
ダルベッコのＭＥＭで数回洗浄して洗浄液を同じプレー
トに加えた。その後、プレートは５％ＣＯ2 存在下３７
℃で２４時間培養した。The plasmid p obtained in Example 1- (5)
SV2TMD5 was suspended in 1 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) to a concentration of about 2 μg / μl. About 10μg
5 μl of the resulting plasmid suspension containing the plasmid pSV2TMD5 was placed in a 1.5 ml Eppendorf tube and the C.I.
200 μl of a cell suspension of OS-1 cells was added and left at 0 ° C. for 10 minutes. The suspension in the test tube was prepared according to U.S.A. E. FIG.
P. The cell was transferred to a cuvette of a cell fusion device FPH1001 manufactured by SYSTEM, and an electric pulse was applied twice at 40 ksec at 1.2 kV. Thereafter, the suspension was transferred again to the original Eppendorf type test tube, left at 0 ° C. for 5 minutes,
Dulbecco's MEM with 10% (v / v) FCS
was transferred to a 10 cm diameter tissue culture plate as follows. That is, Dulbecco's MEM containing a small amount of 10% (v / v) FCS was added to the suspension, and the mixture was transferred to a tissue culture plate. The tubes were then washed several times with the remaining Dulbecco's MEM and the wash was added to the same plate. Thereafter, the plate was incubated at 37% in the presence of 5% CO 2.
C. for 24 hours.

【０１４７】（トロンビンによるプロテインＣ活性化を
促進する作用の確認） 培養終了後、プレートの培地をＦＣＳを含まないダルベ
ッコのＭＥＭに交換し、４８時間培養した。培養上澄液
を５μｌ採取し、これを試料として参考例１に記載した
方法で、プロテインＣ活性化の促進作用を測定した。更
に、直径１０ｃｍの組織培養用プレート１枚分の細胞を
米国コースター（Ｃｏａｓｔｅｒ）社製セルスクレイパ
ー（Ｃｅｌｌ Ｓｃｒａｐｅｒ）（カタログ番号３０１
０）を用いて掻き取って集め、８００ｒｐｍ、１０分間
の条件で遠心分離して集める。このペレットを試料とし
て用いて参考例１に記載した方法でプロテインＣの活性
化を促進する作用を測定した。またコントロールとして
はプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒでトランスフォームし
たＣＯＳ−１細胞の培養上澄液及び細胞ペレットを試料
として用いた。結果を表１に示した。表中に示す吸光度
の数値は試料の吸光度を組織培養用プレート１枚分に換
算したものである。(Confirmation of Action to Promote Activation of Protein C by Thrombin) After completion of the culture, the medium of the plate was replaced with Dulbecco's MEM containing no FCS, and the plate was cultured for 48 hours. 5 μl of the culture supernatant was collected, and this was used as a sample to measure the effect of promoting protein C activation by the method described in Reference Example 1. Further, cells of one tissue culture plate having a diameter of 10 cm were combined with Cell Scraper (Coaster, USA) (catalog number 301).
Collect by scraping using 0) and centrifuging at 800 rpm for 10 minutes. Using this pellet as a sample, the effect of promoting the activation of protein C was measured by the method described in Reference Example 1. As a control, a culture supernatant and cell pellet of COS-1 cells transformed with the plasmid pSV2-dhfr were used as samples. The results are shown in Table 1. The values of the absorbance shown in the table are obtained by converting the absorbance of the sample into the value of one tissue culture plate.

【０１４８】[0148]

【表１】 ┌─────────────────────────────────┐ │ プラスミド 試料 吸光度 │ ├─────────────────────────────────┤ │ ｐＳＶ２ＴＭＤ５ 培養上澄液 ４３００ │ │ （本発明） 細胞ペレット ６．９ │ │ ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ 細胞上澄液 検出されず │ │ （コントロール） 細胞ペレット 検出されず │ └─────────────────────────────────┘[Table 1] ┌─────────────────────────────────┐ │ Plasmid sample absorbance │ ├───── │ │ pSV2TMD5 Culture supernatant 4300 │ │ (the present invention) cell pellet 6.9 │ │ pSV2 -Dhfr Cell supernatant Not detected │ │ (Control) Cell pellet Not detected │ └───────────────────────────── ────┘

【０１４９】実施例３ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロ
ンビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４を用いる以外は実施例２と
同様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４によっ
て形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用を測定した。その
結果を表２に示した。表中に示す吸光度の数値は試料の
吸光度を組織培養用プレート１枚分に換算したものであ
る。Example 3 (Transformation of COS-1 Cells with Plasmid pSV2TMD4 and Measurement of Promoting Effect of Thrombin on Protein C Activation of Peptide Produced by the Transformed Cells) Same as Example 2 except that plasmid pSV2TMD4 was used. The operation was performed to measure the promoting effect of thrombin on the activation of protein C by the peptide produced by the cells transformed with the plasmid pSV2TMD4. The results are shown in Table 2. The values of the absorbance shown in the table are obtained by converting the absorbance of the sample into the value of one tissue culture plate.

【０１５０】[0150]

【表２】 ┌─────────────────────────────────┐ │ プラスミド 試料 吸光度 │ ├─────────────────────────────────┤ │ ｐＳＶ２ＴＭＤ４ 培養上澄液 ４２００ │ │ （本発明） 細胞ペレット ６．８ │ │ ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ 培養上澄液 検出されず │ │ （コントロール） 細胞ペレット 検出されず │ └─────────────────────────────────┘[Table 2] ┌─────────────────────────────────┐ │ Plasmid sample absorbance │ ├───── │ │ pSV2TMD4 culture supernatant 4200 │ │ (invention) cell pellet 6.8 │ │ pSV2 -Dhfr Culture supernatant Not detected │ │ (Control) Cell pellet Not detected │ └───────────────────────────── ────┘

【０１５１】実施例４ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロ
ンビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２を用いる以外は実施例２と
同様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２によっ
て形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用を測定した。その
結果を表３に示した。表中に示す吸光度の数値は試料の
吸光度を組織培養用プレート１枚分に換算したものであ
る。Example 4 (Transformation of COS-1 Cells with Plasmid pSV2TMD2 and Measurement of Promoting Effect of Peptide Produced by Transformed Cells on Protein C Activation by Thrombin) The same procedure as in Example 2 was carried out except that plasmid pSV2TMD2 was used. The operation was performed to measure the promoting effect of thrombin on the activation of protein C by the peptide produced by the cells transformed with the plasmid pSV2TMD2. Table 3 shows the results. The values of the absorbance shown in the table are obtained by converting the absorbance of the sample into the value of one tissue culture plate.

【０１５２】[0152]

【表３】 ┌─────────────────────────────────┐ │ プラスミド 試料 吸光度 │ ├─────────────────────────────────┤ │ ｐＳＶ２ＴＭＤ２ 培養上澄液 ４０００ │ │ （本発明） 細胞ペレット ７．０ │ │ ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ 細胞上澄液 検出されず │ │ （コントロール） 細胞ペレット 検出されず │ └─────────────────────────────────┘[Table 3] │ │ Plasmid sample absorbance │ ├───── │ │ pSV2TMD2 culture supernatant 4000 │ │ (the present invention) cell pellet 7.0 │ │ pSV2 -Dhfr Cell supernatant Not detected │ │ (Control) Cell pellet Not detected │ └───────────────────────────── ────┘

【０１５３】実施例５ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロ
ンビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１を用いる以外は実施例２と
同様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１によっ
て形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用を測定した。その
結果を表４に示した。表中に示す吸光度の数値は試料の
吸光度を組織培養用プレート１枚分に換算したものであ
る。Example 5 (Transformation of COS-1 Cells with Plasmid pSV2TMD1 and Measurement of Promoting Effect of Peptide Produced by Transformed Cells on Protein C Activation by Thrombin) The same procedure as in Example 2 was carried out except that plasmid pSV2TMD1 was used. The operation was performed to measure the effect of the peptide produced by the cells transformed with the plasmid pSV2TMD1 on the activation of protein C by thrombin. Table 4 shows the results. The values of the absorbance shown in the table are obtained by converting the absorbance of the sample into the value of one tissue culture plate.

【０１５４】[0154]

【表４】 ┌─────────────────────────────────┐ │ プラスミド 試料 吸光度 │ ├─────────────────────────────────┤ │ ｐＳＶ２ＴＭＤ１ 培養上澄液 （ＦＣＳ＋） ６００ │ │ （本発明） （ＦＣＳ−） １２００ │ │ 細胞ペレット（ＦＣＳ＋） １．８ │ │ （ＦＣＳ−） ３．６ │ │ ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ 培養上澄液 （ＦＣＳ＋） 検出されず │ │ （コントロール） （ＦＣＳ−） 検出されず │ │ 細胞ペレット（ＦＣＳ＋） 検出されず │ │ （ＦＣＳ−） 検出されず │ └─────────────────────────────────┘[Table 4] │ │ Plasmid sample absorbance │ ├───── ────────────────────────────┤ │ pSV2TMD1 culture supernatant (FCS +) 600 │ │ (invention) (FCS-) 1200 │ │ Cell pellet (FCS +) 1.8 │ │ (FCS-) 3.6 │ │ pSV2-dhfr Culture supernatant (FCS +) Not detected │ │ (Control) (FCS-) Not detected │ │ Cell pellet (FCS +) Not detected │ │ (FCS-) Not detected │ └───────────────────────────────── ┘

【０１５５】実施例６ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロ
ンビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を用いる以外は、実施例２
と同様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によ
って形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビ
ンによるプロテインＣ活性化の促進作用を測定した。そ
の結果、細胞ペレットの試料が強いプロテインＣ活性化
促進作用を示し、生成したプロテインＣの量は約３００
ｎｇであった。一方、コントロールとして用いたプラス
ミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒでトランスフォームした細胞で
はこの活性は検出されなかった。Example 6 (Transformation of COS-1 Cells with Plasmid pSV2TMJ2 and Measurement of Promoting Effect of Peptide Produced by the Transformed Cells on Protein C Activation by Thrombin) Example 2 was repeated except that plasmid pSV2TMJ2 was used.
The same operation as described above was carried out, and the action of the peptide produced by the cells transformed with the plasmid pSV2TMJ2 to promote the activation of protein C by thrombin was measured. As a result, the cell pellet sample exhibited a strong protein C activation promoting action, and the amount of generated protein C was about 300
ng. On the other hand, this activity was not detected in cells transformed with the plasmid pSV2-dhfr used as a control.

【０１５６】実施例７ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５によるＣＨＯ細胞の形質
転換と形質転換細胞における発現） 約４μｇのプラスミドｐＳＶ−２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ
３７１５０）、及び約２０μｇの実施例１−（５）で作
成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５を混合してエタノー
ル沈殿した。沈殿物を風乾後、４５０μｌのＴＥ（ｐＨ
７．９、１ｍＭトリス塩酸緩衝液、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）に溶解し、５００μｌの２×ＨＢＳ（５０ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ2
ＨＰＯ4、ｐＨ７．１２）を加えた。次いで５０μｌの
２．５Ｍ ＣａＣｌ2 を滴下し室温に１０分間放置し
た。Example 7 (Transformation of CHO cells with plasmid pSV2TMD5 and expression in transformed cells) About 4 μg of plasmid pSV-2-neo (ATCC
37150) and about 20 μg of the plasmid pSV2TMD5 prepared in Example 1- (5) were mixed and precipitated with ethanol. After air-drying the precipitate, 450 μl of TE (pH
7.9, 1 mM Tris-HCl buffer, 0.1 mM EDT
A) and dissolved in 500 μl of 2 × HBS (50 mM H
EPES, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na 2
HPO 4 , pH 7.12) was added. Then, 50 μl of 2.5 M CaCl 2 was added dropwise and left at room temperature for 10 minutes.

【０１５７】一方、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ及び１ｖ／
ｖ％ペニシリン−ストレプトマイシン（フローラボラト
リー社製、米国、カタログ番号１６−７００−４９）を
含有するＨａｍ’ｓＦ−１２培地（フローラボラトリー
社製、米国、カタログ番号１０−４２１−２０）を用い
て直径６ｃｍの組織培養用プレートにプレート１枚当た
り細胞数約５×１０2 程度播種したＣＨＯ−ＫＩ株（Ａ
ＴＣＣ ＣＣＬＤ ６１）を１夜培養し、培地を新鮮な
培地に交換し、更に３時間培養した。このＣＨＯ−ＫＩ
に前述のＣａＣｌ2 を滴下したプラスミドＤＮＡ溶液を
重層し、３７℃で約８時間培養した。５ｍｌのＰＢＳ
（−）（フローラボラトリー社製、米国、カタログ番号
２８−１０３−０５）を用いて２回洗浄し、さらに、５
ｍｌの前述の培地で洗浄後、新鮮な培地を加えて約１６
時間さらに培養した。プレートに付着した細胞を０．２
５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ溶液を用いてはが
し、直径１０ｃｍの組織培養プレート４枚に広げて培養
した。２４時間後、培地を選択培地に交換した。On the other hand, 10% (v / v) FCS and 1 v / v
Diameter using Ham's F-12 medium (manufactured by Flow Laboratories, USA, catalog number 10-421-20) containing v% penicillin-streptomycin (manufactured by Flow Laboratories, USA, catalog number 16-700-49) A CHO-KI strain (A) in which about 5 × 10 2 cells were seeded per plate on a 6 cm tissue culture plate.
TCC CCLD 61) was cultured overnight, the medium was replaced with fresh medium, and the cells were further cultured for 3 hours. This CHO-KI
Was overlaid with the above-described plasmid DNA solution to which CaCl 2 was added dropwise, and cultured at 37 ° C. for about 8 hours. 5 ml of PBS
Washed twice using (−) (manufactured by Flow Laboratories, USA, Catalog No. 28-103-05), and further washed with 5
After washing with ml of the above-mentioned medium, fresh medium was added to the medium for about 16 minutes.
The cells were further cultured for hours. 0.2 cells attached to plate
The cells were peeled off using a 5% trypsin, 0.02% EDTA solution, spread on four tissue culture plates having a diameter of 10 cm, and cultured. After 24 hours, the medium was changed to a selective medium.

【０１５８】選択培地の組成は前述の培地に４００μｇ
／ｍｌになる様にジェネティシンＣ−４１８（ＧＩＢＣ
Ｏ社製、米国、カタログ番号８６０−１８１１）を添加
したものである。３〜４日おきに培地交換を行いながら
約２週間培養して、トランスフォームした細胞をクロー
ニングした。この操作で得られた細胞のクローンをそれ
ぞれ直径１０ｃｍの組織培養プレートでコンフルエント
になるまで生育させた。途中、培地のＦＣＳ濃度を１０
％から１％に減らした培地に切り換えて培養した。この
ＦＣＳ含有選択培地で培養した培養液５０μｌをとり、
これを用いて参考例１に記載した方法でプロテインＣ活
性化を促進する作用を測定したところ、強いプロテイン
Ｃ活性化促進作用が認められた。一方、コントロールと
して用いたプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏだけでトランス
フォームした細胞では本活性は検出されなかった。The composition of the selective medium was 400 μg in the aforementioned medium.
Geneticin C-418 (GIBC
O, USA, catalog number 860-1811). The cells were cultured for about 2 weeks while changing the medium every 3 to 4 days, and the transformed cells were cloned. The clones of the cells obtained by this operation were grown on tissue culture plates each having a diameter of 10 cm until they became confluent. On the way, the FCS concentration of the medium was increased to 10
The culture was switched to a medium reduced from 1% to 1%. Take 50 μl of the culture solution cultured in this FCS-containing selection medium,
When the effect of promoting protein C activation was measured by the method described in Reference Example 1 using this, a strong activity of promoting protein C activation was observed. On the other hand, this activity was not detected in cells transformed only with the plasmid pSV2-neo used as a control.

【０１５９】実施例８ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４によるＣＨＯ細胞の形質
転換及び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４を用いる以外は実施例７と
同様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４によっ
て形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用を測定したところ
強いプロテインＣ活性化促進作用が認められた。一方、
コントロールとして用いたプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏ
だけでトランスフォームした細胞では、本活性は検出さ
れなかった。Example 8 (Transformation of CHO Cells by Plasmid pSV2TMD4 and Measurement of Promoting Effect of Peptide Produced by Transformed Cells on Protein C Activation by Thrombin) The same operation as in Example 7 was carried out except that plasmid pSV2TMD4 was used. Then, the action of the peptide produced by the cells transformed with the plasmid pSV2TMD4 to promote protein C activation by thrombin was measured. As a result, a strong protein C activation promoting action was observed. on the other hand,
Plasmid pSV2-neo used as control
This activity was not detected in cells transformed alone.

【０１６０】実施例９ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２によるＣＨＯ細胞の形質
転換及び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２を用いる以外は、実施例７
と同様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２によ
って形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビ
ンによるプロテインＣ活性化の促進作用を測定したとこ
ろ強いプロテインＣ活性化促進作用が認められた。一
方、コントロールとして用いたプラスミドｐＳＶ２−ｎ
ｅｏだけでトランスフォームした細胞では、本活性は検
出されなかった。Example 9 (Transformation of CHO cells with plasmid pSV2TMD2 and measurement of the promoting effect of peptide produced by the transformed cells on protein C activation by thrombin) Example 7 was carried out except that plasmid pSV2TMD2 was used.
The same operation as described above was carried out, and the action of promoting the protein C activation by thrombin of the peptide produced by the cell transformed with the plasmid pSV2TMD2 was measured. As a result, a strong action of promoting protein C activation was observed. On the other hand, plasmid pSV2-n used as a control
This activity was not detected in cells transformed with eo alone.

【０１６１】実施例１０ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１によるＣＨＯ細胞の形質
転換及び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１を用いる以外は、実施例７
と同様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１によ
って形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビ
ンによるプロテインＣ活性化の促進作用を測定したとこ
ろ強いプロテインＣ活性化促進作用が認められた。一
方、コントロールとして用いたプラスミドｐＳＶ２−ｎ
ｅｏだけでトランスフォームした細胞では、本活性は検
出されなかった。Example 10 (Transformation of CHO cells with plasmid pSV2TMD1 and measurement of the promoting effect of peptide produced by the transformed cells on protein C activation by thrombin) Example 7 was repeated except that plasmid pSV2TMD1 was used.
By performing the same operation as described above, the action of promoting the protein C activation by thrombin of the peptide produced by the cells transformed with the plasmid pSV2TMD1 was measured, and a strong action of promoting protein C activation was observed. On the other hand, plasmid pSV2-n used as a control
This activity was not detected in cells transformed with eo alone.

【０１６２】実施例１１ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によるＣＨＯ細胞の形質
転換及び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） 約４μｇのプラスミドｐＳＶ−２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ
３７１５０）、及び約２０μｇの実施例１で作成したプ
ラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を混合してエタノール沈殿し
た。沈殿物を風乾後、４５０μｌのＴＥ（ｐＨ７．９、
１ｍＭトリス塩酸緩衝液、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶
解し、５００μｌの２×ＨＢＳ（５０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ
４、ｐＨ７．１２）を加えた。次いで５０μｌの２．５
Ｍ ＣａＣｌ2 を滴下し室温に１０分間放置した。Example 11 (Transformation of CHO Cells by Plasmid pSV2TMJ2 and Measurement of Promoting Effect of Thrombin on Protein C Activation of Peptide Produced by Transformed Cells) About 4 μg of plasmid pSV-2-neo (ATCC
37150) and about 20 μg of the plasmid pSV2TMJ2 prepared in Example 1 were mixed and precipitated with ethanol. After air-drying the precipitate, 450 μl of TE (pH 7.9,
Dissolve in 1 mM Tris-HCl buffer, 0.1 mM EDTA, and add 500 μl of 2 × HBS (50 mM HEPE).
S, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO
4, pH 7.12). Then 50 μl of 2.5
M CaCl 2 was added dropwise and left at room temperature for 10 minutes.

【０１６３】一方、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ及び１ｖ／
ｖ％ペニシリン−ストレプトマイシン（フローラボラト
リー社製、米国、カタログ番号１６−７００−４９）を
含有するＨａｍ’ｓＦ−１２培地（フローラボラトリー
社製、米国、カタログ番号１０−４２１−２０）を用い
て直径６ｃｍの組織培養用プレートにプレート１枚当た
り細胞数約５×１０2 程度播種したＣＨＯ−ＫＩ株（Ａ
ＴＣＣ ＣＣＬＤ ６１）を１夜培養し、培地を新鮮な
培地に交換し、更に３時間培養した。このＣＨＯ−ＫＩ
に前述のＣａＣｌ2 を滴下したプラスミドＤＮＡ溶液を
重層し、３７℃で約８時間培養した。５ｍｌのＰＢＳ
（−）（フローラボラトリー社製、米国、カタログ番号
２８−１０３−０５）を用いて２回洗浄し、さらに、５
ｍｌの前述の培地で洗浄後、新鮮な培地を加えて約１６
時間さらに培養した。On the other hand, 10% (v / v) FCS and 1 v / v
Diameter using Ham's F-12 medium (manufactured by Flow Laboratories, USA, catalog number 10-421-20) containing v% penicillin-streptomycin (manufactured by Flow Laboratories, USA, catalog number 16-700-49) A CHO-KI strain (A) in which about 5 × 10 2 cells were seeded per plate on a 6 cm tissue culture plate.
TCC CCLD 61) was cultured overnight, the medium was replaced with fresh medium, and the cells were further cultured for 3 hours. This CHO-KI
Was overlaid with the above-described plasmid DNA solution to which CaCl 2 was added dropwise, and cultured at 37 ° C. for about 8 hours. 5 ml of PBS
Washed twice using (−) (manufactured by Flow Laboratories, USA, Catalog No. 28-103-05), and further washed with 5
After washing with ml of the above-mentioned medium, fresh medium was added to the medium for about 16 minutes.
The cells were further cultured for hours.

【０１６４】プレートに付着した細胞を０．２５％トリ
プシン、０．０２％ＥＤＴＡ溶液を用いてはがし、直径
１０ｃｍの組織培養プレート４枚に広げて培養した。２
４時間後、培地を選択培地に交換した。選択培地の組成
は前述の培地に４００μｇ／ｍｌになる様にジェネティ
シンＣ−４１８（米国ＧＩＢＣＯ社製、カタログ番号８
６０−１８１１）を添加したものである。３〜４日おき
に培地交換を行いながら約２週間培養して、トランスフ
ォームした細胞をクローニングした。この操作で得られ
た細胞のクローンをそれぞれ直径１０ｃｍの組織培養プ
レートでコンフルエントになるまで生育させた。途中、
培地のＦＣＳ濃度を１０％から１％に減らした培地に切
り換えて培養した。The cells adhered to the plate were peeled off using a 0.25% trypsin, 0.02% EDTA solution, spread on four tissue culture plates having a diameter of 10 cm, and cultured. 2
After 4 hours, the medium was changed to a selective medium. The composition of the selection medium is such that Geneticin C-418 (manufactured by GIBCO, USA, catalog number 8) is added to the above-mentioned medium so as to have a concentration of 400 μg / ml.
60-1811). The cells were cultured for about 2 weeks while changing the medium every 3 to 4 days, and the transformed cells were cloned. The clones of the cells obtained by this operation were grown on tissue culture plates each having a diameter of 10 cm until they became confluent. On the way,
The culture was switched to a medium in which the FCS concentration of the medium was reduced from 10% to 1%.

【０１６５】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によって形質
転換された細胞の産生するペプチドのトロンビンによる
プロテインＣ活性化の促進作用を細胞ペレットを試料と
して用いて測定したところ強いプロテインＣ活性化促進
作用が認められた。一方、コントロールとして用いたプ
ラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏだけで形質転換した細胞及び
その培養上澄液では本活性は検出されなかった。[0165] The action of the peptide produced by the cells transformed with the plasmid pSV2TMJ2 to promote protein C activation by thrombin was measured using a cell pellet as a sample, and a strong action of protein C activation was observed. On the other hand, this activity was not detected in the cells transformed with only the plasmid pSV2-neo used as a control and in the culture supernatant thereof.

【０１６６】実施例１２ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５によるＣ127 Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（５）で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ
５をＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ4 ＤＮＡリガー
ゼを作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５のＨｉｎｄ
III サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５−１
を得た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５−１を
ＰｖｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約１７００ｂｐ
のＤＮＡ断片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８のＨ
ｉｎｃII及びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿入
してプラスミドｐＵＣＴＭＤ５−１を得た。Example 12 (Transformation of C 127 I cells with plasmid pSV2TMD5 and measurement of the effect of thrombin on the activation of protein C by peptides produced by the transformed cells) Measurement of plasmid pSV2TMD prepared in Example 1- (5)
5 was completely digested with HindIII.
The end was made blunt using polymerase, T 4 DNA ligase was allowed to act, and Hind of plasmid pSV2TMD5 was
Plasmid pSV2TMD5-1 lacking the III site
I got Next, this plasmid pSV2TMD5-1 was completely digested with PvuII and BamHI to obtain about 1700 bp.
Was obtained. This is called H of plasmid pUC18.
Plasmid pUCTMD5-1 was obtained by insertion into a vector completely digested with incII and BamHI.

【０１６７】一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コ
バスルビアス（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ ａ
ｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）にしたがってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。
得られたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩ及びＨｉ
ｎｄIII で消化して得た約２９６０ｂｐのＤＮＡ断片
に、プラスミドｐＵＣＴＭＤ５−１をＢａｍＨＩ及びＨ
ｉｎｄIII で完全消化して得た約２６００ｂｐのＤＮＡ
断片を挿入してプラスミドｐＢＲＴＭＤ５−１を得た。
このプラスミドｐＢＲＴＭＤ５−１をＨｉｎｄIII で完
全消化したものとプラスミドｐＢＰＶ−１（９−１）
（ＡＴＣＣ ３７１１１）をＨｉｎｄIII で完全消化し
て得た断片とをＴ4ＤＮＡリガーゼを用いて継いで、Ｃ
127細胞発現用のプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ５−１を
得た。以上の工程を図２０〜図２１に示す。On the other hand, plasmid pBR322 (ATCC
37017) to the method of Kobasrubias et al. [L. Covasrubias et al.
l), Gene, 13, 25, (1981)
Year), plasmid pBR327 was prepared.
The resulting plasmid pBR327 was transformed into BamHI and Hi.
The plasmid pUCTMD5-1 was added to a DNA fragment of about 2960 bp obtained by digestion with
About 2600 bp DNA obtained by complete digestion with indIII
The fragment was inserted to obtain plasmid pBRTMD5-1.
This plasmid pBRTMD5-1 was completely digested with HindIII, and plasmid pBPV-1 (9-1)
(ATCC 37111) and a fragment obtained by complete digestion with HindIII were joined using T 4 DNA ligase to give C
The plasmid pdBPVTMD5-1 for expression of 127 cells was obtained. The above steps are shown in FIGS.

【０１６８】次に、実施例７に記載の方法に準じてｐｄ
ＢＰＶＴＭＤ５−１でＣ127Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ及び
１ｖ／ｖ％ペニシリン−ストレプトマイシン（フローラ
ボラトリー社製、米国、カタログ番号１６−７００−４
９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培養したとこ
ろ、フォーカスを形成する細胞が、６個得られたのでそ
れぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径１０ｃ
ｍの組織培養用プレートでコンフルエントになるまで生
育させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培地に置換
して培養した。この培地で１日培養した培養液５０μｌ
をとり、これを用いて参考例１に記載した方法でプロテ
インＣ活性化の促進作用を測定したところ、強い活性が
認められた。一方、コントロールとして用いたプラスミ
ドｐＢＶ−１（９−１）だけでトランスフォームした細
胞では本活性は検出されなかった。Next, according to the method described in Example 7, pd
C 127 I cell with BPVTMD5-1 (ATCC CRL
1616). 10% FCS and 1 v / v% penicillin-streptomycin (Flow Laboratories, USA, catalog number 16-700-4
When the cells were cultured in Dulbecco's MEM containing about 9 weeks for about 3 weeks, 6 cells that formed foci were obtained.
m of tissue culture plates until confluent. Thereafter, the medium was replaced with a medium not containing FCS and cultured. 50 μl of culture solution cultured for 1 day in this medium
The activity of promoting protein C activation was measured by the method described in Reference Example 1 and found to be strong. On the other hand, this activity was not detected in cells transformed only with the plasmid pBV-1 (9-1) used as a control.

【０１６９】実施例１３ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４によるＣ127Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（４）で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ
４をＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ4 ＤＮＡリガー
ゼを作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４のＨｉｎｄ
III サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４−１
を得た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４−１を
ＰｖｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約２１００ｂｐ
の断片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８のＨｉｎｃ
II及びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿入してプ
ラスミドｐＵＣＴＭＤ４−１を得た。Example 13 (Transformation of C 127 I cells with plasmid pSV2TMD4 and measurement of the promoting effect of peptide produced by the transformed cells on protein C activation by thrombin) Plasmid pSV2TMD prepared in Example 1- (4)
4 was completely digested with HindIII.
The ends were made blunt using polymerase, T 4 DNA ligase was allowed to act, and Hind of plasmid pSV2TMD4 was
Plasmid pSV2TMD4-1 lacking the III site
I got Next, this plasmid pSV2TMD4-1 was completely digested with PvuII and BamHI to obtain about 2100 bp.
Fragment was obtained. This was transformed into Hinc of plasmid pUC18.
Plasmid pUCTMD4-1 was obtained by insertion into a vector completely digested with II and BamHI.

【０１７０】一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コ
バスルビアスら（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ
ａｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）にしたがってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。
得られたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩ及びＨｉ
ｎｄIII で消化して得た約２９６０ｂｐのＤＮＡ断片
に、プラスミドｐＵＣＴＭＤ４−１をＢａｍＨＩ及びＨ
ｉｎｄIII で完全消化して得た約３，０００ｂｐのＤＮ
Ａ断片を挿入してプラスミドｐＢＲＴＭＤ４−１を得
た。このプラスミドｐＢＲＴＭＤ４−１をＨｉｎｄIII
で完全消化したものとプラスミドｐＢＰＶ−１（９−
１）（ＡＴＣＣ ３７１１１）をＨｉｎｄIII で完全消
化して得た断片とをＴ4 ＤＮＡリガーゼを用いて継い
で、Ｃ127細胞発現用のプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ４
−１を得た。以上の工程を図２２〜図２３に示す。On the other hand, plasmid pBR322 (ATCC
37017) to the method of Kobasrubias et al. [L. Covasrubias et al.
al), Gene, 13, 25, (1981)
Year), plasmid pBR327 was prepared.
The resulting plasmid pBR327 was transformed into BamHI and Hi.
The plasmid pUCTMD4-1 was ligated to the DNA fragment of about 2960 bp obtained by digestion with
About 3,000 bp of DN obtained by complete digestion with indIII
The A fragment was inserted to obtain plasmid pBRTMD4-1. This plasmid pBRTMD4-1 was inserted into HindIII.
Digested with plasmid pBPV-1 (9-
1) The fragment obtained by completely digesting (ATCC 37111) with HindIII was ligated with T 4 DNA ligase to obtain a plasmid pdBPVTMD4 for C 127 cell expression.
-1 was obtained. The above steps are shown in FIGS.

【０１７１】次に、ｐｄＢＰＶＴＭＤ４−１で実施例７
に記載の方法に準じてＣ127Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ及
び１ｖ／ｖ％ペニシリン−ストレプトマイシン（フロー
ラボラトリー社製、米国、カタログ番号１６−７００−
４９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培養したと
ころ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたのでそ
れぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径１０ｃ
ｍの組織培養用プレートでコンフルエントになるまで生
育させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培地に置換
して培養した。この培地で１日培養した培養液５０μｌ
をとり、これを用いて参考例１に記載した方法でプロテ
インＣ活性化の促進作用を測定したところ、強い活性が
認められた。一方、コントロールとして用いたプラスミ
ドｐＢＰＶ−（９−１）だけでトランスフォームした細
胞では本活性は検出されなかった。Next, Example 7 was performed using pdBPVTMD4-1.
C 127 I cells (ATCC CRL) according to the method described in
1616). 10% FCS and 1 v / v% penicillin-streptomycin (manufactured by Flow Laboratories, USA, catalog number 16-700-
When the cells were cultured in Dulbecco's MEM containing about 49 weeks for about 3 weeks, 6 cells forming a focus were obtained.
m of tissue culture plates until confluent. Thereafter, the medium was replaced with a medium not containing FCS and cultured. 50 μl of culture solution cultured for 1 day in this medium
The activity of promoting protein C activation was measured by the method described in Reference Example 1 and found to be strong. On the other hand, this activity was not detected in cells transformed only with the plasmid pBPV- (9-1) used as a control.

【０１７２】実施例１４ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２によるＣ127Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（３）で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ
２をＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ4 ＤＮＡリガー
ゼを作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２のＨｉｎｄ
III サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２−１
を得た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２−１を
ＰｖｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約２, ２００ｂ
ｐのＤＮＡ断片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８の
ＨｉｎｃII及びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿
入してプラスミドｐＵＣＴＭＤ２−１を得た。Example 14 (Transformation of C 127 I cells by plasmid pSV2TMD2 and measurement of the effect of thrombin on the activation of protein C by a peptide produced by the transformed cells) Plasmid pSV2TMD prepared in Example 1- (3)
2 was completely digested with HindIII.
The end was made blunt using polymerase, T 4 DNA ligase was allowed to act, and Hind of plasmid pSV2TMD2 was
Plasmid pSV2TMD2-1 lacking the III site
I got Next, this plasmid pSV2TMD2-1 was completely digested with PvuII and BamHI to obtain about 2,200 b
p DNA fragment was obtained. This was inserted into a vector obtained by completely digesting plasmid pUC18 with HincII and BamHI to obtain plasmid pUCTMD2-1.

【０１７３】一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コ
バスルビアスら（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ
ａｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）に従ってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。得ら
れたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩおよびＨｉｎ
ｄIII で消化して得た約２９６０ｂｐのＤＮＡ断片に、
プラスミドｐＵＣＴＭＤ２−１をＢａｍＨＩ及びＨｉｎ
ｄIII で完全消化して得た約３，０７０ｂｐのＤＮＡ断
片を挿入して、プラスミドｐＢＲＴＭＤ２−１を得た。
このプラスミドｐＢＲＴＭＤ２−１をＨｉｎｄIII で完
全消化したものとプラスミドｐＢＰＶ−１（９−１）
（ＡＴＣＣ ３７１１１）をＨｉｎｄIII で完全消化し
て得た断片とＴ4 ＤＮＡリガーゼを用いて、Ｃ127細胞
発現用のプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ２−１を得た。以
上の工程を図２４〜図２５に示す。On the other hand, plasmid pBR322 (ATCC
37017) to the method of Kobasrubias et al. [L. Covasrubias et al.
al), Gene, 13, 25, (1981)
Year), plasmid pBR327 was prepared. The resulting plasmid pBR327 was transformed with BamHI and Hin.
The DNA fragment of about 2960 bp obtained by digestion with dIII
Plasmid pUCTMD2-1 was replaced with BamHI and Hind.
A DNA fragment of about 3,070 bp obtained by complete digestion with dIII was inserted to obtain a plasmid pBRTMD2-1.
This plasmid pBRTMD2-1 was completely digested with HindIII and plasmid pBPV-1 (9-1).
(ATCC 37111) and using a fragment T 4 DNA ligase obtained by complete digestion with HindIII, and obtain a plasmid pdBPVTMD2-1 for C 127 cell expression. The above steps are shown in FIGS.

【０１７４】次にｐｄＢＰＶＴＭＤ２−１で実施例７に
記載の方法に準じてＣ127Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１
６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ及び１
ｖ／ｖ％ペニシリン−ストレプトマインシ（米国、フロ
ーラボラトリー社製、カタログ番号１６−７００−４
９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培養したとこ
ろ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたのでそれ
ぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径１０ｃｍ
の組織培養用プレートでコンフルエントになるまで生育
させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培地に置換し
て培養した。この培地で１日培養した培養液５０μｌを
とり、これを用いて参考例１に記載した方法でプロテイ
ンＣ活性化の促進作用を測定したところ、強い活性が認
められた。一方、コントロールとして用いたプラスミド
ｐＢＰＶ−１（９−１）だけでトランスフォームした細
胞では本活性は検出されなかった。Next, C 127 I cells (ATCC CRL1) were treated with pdBPVTMD2-1 according to the method described in Example 7.
616) was transformed. 10% FCS and 1
v / v% penicillin-streptomycin (manufactured by Flow Laboratories, USA, catalog number 16-700-4)
When the cells were cultured in Dulbecco's MEM containing about 9 weeks for about 3 weeks, 6 cells forming foci were obtained. Each cell was cloned and each was 10 cm in diameter.
Were grown until confluent on a tissue culture plate. Thereafter, the medium was replaced with a medium not containing FCS and cultured. When 50 μl of a culture solution cultured for 1 day in this medium was taken and the promoting activity of protein C activation was measured by the method described in Reference Example 1, strong activity was observed. On the other hand, this activity was not detected in cells transformed only with the plasmid pBPV-1 (9-1) used as a control.

【０１７５】実施例１５ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１によるＣ127Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（２）で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ
１をＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ4 ＤＮＡリガー
ゼを作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１のＨｉｎｄ
III サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１−１
を得た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１−１を
ＰｖｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約３, １００ｂ
ｐのＤＮＡ断片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８の
ＨｉｎｃII及びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿
入してプラスミドｐＵＣＴＭＤ１−１を得た。Example 15 (Transformation of C 127 I cells with plasmid pSV2TMD1 and measurement of the promoting effect of peptide produced by the transformed cells on protein C activation by thrombin) Plasmid pSV2TMD prepared in Example 1- (2)
1 was completely digested with HindIII.
The end was made blunt using polymerase, T 4 DNA ligase was allowed to act, and Hind of plasmid pSV2TMD1 was
Plasmid pSV2TMD1-1 lacking the III site
I got Next, this plasmid pSV2TMD1-1 was completely digested with PvuII and BamHI to obtain about 3,100 b
p DNA fragment was obtained. This was inserted into a vector which was completely digested with HincII and BamHI of plasmid pUC18 to obtain plasmid pUCTMD1-1.

【０１７６】一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コ
バスルビアスら（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ
ａｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）に従ってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。得ら
れたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
III で消化して得た約２, ９６０ｂｐのＤＮＡ断片に、
プラスミドｐＵＣＴＭＤ１−１をＢａｍＨＩ及びＨｉｎ
ｄIII で完全消化して得たＤＮＡ断片を挿入してプラス
ミドｐＢＲＴＭＤ１−１を得た。このプラスミドｐＢＲ
ＴＭＤ１−１をＨｉｎｄIII で完全消化したものとプラ
スミドｐＢＰＶ−１（９−１）（ＡＴＣＣ ３７１１
１）をＨｉｎｄIII で完全消化して得た断片とをＴ4 Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて継いで、Ｃ127細胞発現用のプラ
スミドｐｄＢＰＶＴＭＤ１−１を得た。以上の工程を図
２６〜図２７に示す。On the other hand, plasmid pBR322 (ATCC
37017) to the method of Kobasrubias et al. [L. Covasrubias et al.
al), Gene, 13, 25, (1981)
Year), plasmid pBR327 was prepared. The resulting plasmid pBR327 was transformed with BamHI and Hind.
The DNA fragment of about 2,960 bp obtained by digestion with III
Plasmid pUCTMD1-1 was replaced with BamHI and Hind.
The DNA fragment obtained by complete digestion with dIII was inserted to obtain plasmid pBRTMD1-1. This plasmid pBR
TMD1-1 was completely digested with HindIII and plasmid pBPV-1 (9-1) (ATCC 3711).
The fragment obtained by digesting 1) completely with HindIII was combined with T 4 D
By using NA ligase, plasmid pdBPVTMD1-1 for expression of C 127 cells was obtained. The above steps are shown in FIGS.

【０１７７】次に、ｐｄＢＰＶＴＭＤ１−１で実施例７
に記載の方法に準じてＣ127Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ及
び１ｖ／ｖ％ペニシリン−ストレプトマイシン（フロー
ラボラトリー社製、米国、カタログ番号１６−７００−
４９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培養したと
ころ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたのでそ
れぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径１０ｃ
ｍの組織細胞用プレートでコンフルエントになるまで生
育させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培地に置換
して培養した。この培地で１日培養した培養液５０μｌ
をとり、これを用いて参考例１に記載した方法でプロテ
インＣ活性化の促進作用を測定したところ、強い活性が
認められた。一方、コントロールとして用いたプラスミ
ドｐＢＰＶ−１（９−１）だけでトランスフォームした
細胞では本活性は検出されなかった。Next, pBPTVTMD1-1 was used in Example 7
C 127 I cells (ATCC CRL) according to the method described in
1616). 10% FCS and 1 v / v% penicillin-streptomycin (manufactured by Flow Laboratories, USA, catalog number 16-700-
When the cells were cultured in Dulbecco's MEM containing about 49 weeks for about 3 weeks, 6 cells forming a focus were obtained.
The cells were grown to confluence on a m tissue plate. Thereafter, the medium was replaced with a medium not containing FCS and cultured. 50 μl of culture solution cultured for 1 day in this medium
The activity of promoting protein C activation was measured by the method described in Reference Example 1 and found to be strong. On the other hand, this activity was not detected in cells transformed only with the plasmid pBPV-1 (9-1) used as a control.

【０１７８】実施例１６ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によるＣ127 Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（１）で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ
２をＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ4 ＤＮＡリガー
ゼを作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２のＨｉｎｄ
III サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２−１
を得た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２−１を
ＰｖｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約４, １００ｂ
ｐのＤＮＡ断片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８の
ＨｉｎｃII及びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿
入してプラスミドｐＵＣＴＭＪ２−１を得た。Example 16 (Transformation of C 127 I cells with plasmid pSV2TMJ2 and measurement of the promoting effect of peptide produced by the transformed cells on protein C activation by thrombin) Plasmid pSV2TMJ prepared in Example 1- (1)
2 was completely digested with HindIII.
Blunt ended with polymerase, by the action of T 4 DNA ligase, the plasmid pSV2TMJ2 Hind
Plasmid pSV2TMJ2-1 lacking the III site
I got Then, this plasmid pSV2TMJ2-1 was completely digested with PvuII and BamHI to obtain about 4,100 b
p DNA fragment was obtained. This was inserted into a vector obtained by completely digesting plasmid pUC18 with HincII and BamHI to obtain plasmid pUCTMJ2-1.

【０１７９】一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コ
バスルビアス（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ ａ
ｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）に従ってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。得ら
れたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
III で消化して得た約２９６０ｂｐのＤＮＡ断片に、プ
ラスミドｐＵＣＴＭＪ２−１をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
III で完全消化して得たＤＮＡ断片を挿入してプラスミ
ドｐＢＲＴＭＪ２−１を得た。このプラスミドｐＢＲＴ
ＭＪ２−１をＨｉｎｄIII で完全消化したものとプラス
ミドｐＢＰＶ−１（９−１）（ＡＴＣＣ３７１１１）を
ＨｉｎｄIII で完全消化して得た断片とをＴ4 ＤＮＡリ
ガーゼを用いて継いで、Ｃ127細胞発現用のプラスミド
ｐｄＢＰＶＴＭＪ２−１を得る。以上の工程を図２８〜
図２９に示す。On the other hand, plasmid pBR322 (ATCC
37017) to the method of Kobasrubias et al. [L. Covasrubias et al.
l), Gene, 13, 25, (1981)
Year), plasmid pBR327 was prepared. The resulting plasmid pBR327 was transformed with BamHI and Hind.
The plasmid pUCTMJ2-1 was added to a DNA fragment of about 2960 bp obtained by digestion with BamHI and Hind.
The DNA fragment obtained by complete digestion with III was inserted to obtain plasmid pBRTMJ2-1. This plasmid pBRT
MJ2-1 completely digested one with the plasmid pBPV-1 with HindIII (9-1) in the footsteps (ATCC37111) and fragment obtained by complete digestion with HindIII using T 4 DNA ligase, C 127 for cell expression To obtain plasmid pdBPVTMJ2-1. The above steps are performed as shown in FIGS.
As shown in FIG.

【０１８０】次にｐｄＢＰＶＴＭＪ２−１で実施例７に
記載の方法に準じてＣ127Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ及び
１（ｖ／ｖ％）ペニシリン−ストレプトマイシン（フロ
ーラボラトリー社製、米国、カタログ番号１６−７００
−４９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培養した
ところ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたので
それぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径１０
ｃｍの組織細胞用プレートでコノフルエントになるまで
生育させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培地に置
換して培養した。この培地で１日培養した後、培養した
細胞のペレットをかきとり、これを用いて参考例１に記
載した方法でプロテインＣ活性化の促進作用を測定した
ところ、強い活性が認められた。一方、コントロールと
して用いたプラスミドｐＢＰＶ−１（９−１）だけでト
ランスフォームした細胞では本活性は検出されなかっ
た。Next, C 127 I cells (ATCC CRL) were obtained using pdBPVTMJ2-1 according to the method described in Example 7.
1616). 10% FCS and 1 (v / v%) penicillin-streptomycin (Flow Laboratories, USA, catalog number 16-700)
When the cells were cultured for about 3 weeks in Dulbecco's MEM containing -49), six cells forming foci were obtained.
The cells were grown to conofluent on a cm cell plate. Thereafter, the medium was replaced with a medium not containing FCS and cultured. After culturing for 1 day in this medium, the pellet of the cultured cells was scraped and used to measure the promoting effect of protein C activation by the method described in Reference Example 1. As a result, a strong activity was observed. On the other hand, this activity was not detected in cells transformed only with the plasmid pBPV-1 (9-1) used as a control.

【０１８１】実施例１７ （本発明の培養液からのトロンビンによるプロテインＣ
の活性化を促進する作用を有するペプチドの精製） 実施例７に記載した方法で培養したプラスミドｐＳＶ２
−ｎｅｏ及びプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５でトランスフ
ォームしたＣＨＯ細胞を直径１０ｃｍの組織培養用プレ
ート２５枚で培養した。培地は１日おきに４回新鮮な培
地と交換した。この培養液をすべて集め（約１００ｍ
ｌ）、ｐＨ７．５に調製した後ＤＩＰ−トロンビン−ア
ガロースのカラムクロマトグラフィーにかけて調製し
た。すなわち、エヌ エル エスモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓｍ
ｏｎ）ら〔ザ ジャーナルオブ バイオロジカル ケミ
ストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）、２５７巻、８５
９頁、（１９８２年）〕の方法にしたがって作製したＤ
ＩＰ−トロンビン〔ジイソプロピルホスホロトロンビン
（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｒｏ
ｍｂｉｎ）〕を、ピー クオトレカサス（Ｐ．Ｃｕａｔ
ｒｅｃａｓａｓ）の方法〔ザ ジャーナル オブ バイ
オロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ）、２４５巻、３５９頁（１９７０年）〕に準じてブ
ロムシアン化したアガロースに結合させてＤＩＰ−トロ
ンビン−アガロースを作製した。Example 17 (Protein C by thrombin from the culture solution of the present invention)
Purification of Peptide Having Action to Promote Activation of Plasmid pSV2 Cultured by the Method described in Example 7
CHO cells transformed with -neo and plasmid pSV2TMD5 were cultured on 25 tissue culture plates having a diameter of 10 cm. The medium was replaced with fresh medium four times every other day. Collect all of this culture (about 100m
1) The pH was adjusted to 7.5, followed by DIP-thrombin-agarose column chromatography. That is, N.L.Esm.
on) et al. [The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem), 257, 85]
9 (1982)].
IP-thrombin [diisopropylphosphorothrombin
mbin)], peak treacles (P. Cuat)
[The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Che)
m), 245, p. 359 (1970)] to prepare DIP-thrombin-agarose.

【０１８２】次にＤＩＰ−トロンビン−アガロースを
２．５ｃｍφ×１０ｃｍの大きさのカラムに充填してＤ
ＩＰ−トロンビン−アガロースカラムを作製して室温で
０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ2 、１ｍＭ
ベンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ
ＰＸ（半井化学薬品製、日本）を含む０．０２Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した。次
いで、上記の上澄液をカラムに供した。カラムを０．３
Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ2 、１ｍＭベンズ
アミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸ
を含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗
浄した後、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍ
Ｍベンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏ
ｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で溶出して２．０ｍｌずつフラクションを集めた。
溶出によって得られる各フラクションについて前記の方
法でプロテインＣ活性化の促進作用を測定した。同時に
島津製作所（日本）製スペクトロフォトメーターＵＶ−
２４０を用いて、各フラクションの波長２８０ｎｍにお
ける吸光度（Ａ280 ）を測定した。活性のある画分を回
収し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ2 、
０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸ（半井化学薬品
製、日本）を含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で透析した。得られた透析液を２回目のＤＩＰ
−トロンビン−アガロースカラムクロマトグラフィーに
供した。Next, DIP-thrombin-agarose was packed in a column having a size of 2.5 cmφ × 10 cm, and
Prepare an IP-thrombin-agarose column and add 0.1 M NaCl, 0.5 mM CaCl 2 , 1 mM at room temperature
Benzamidine hydrochloride, 0.5% (v / v) Lubrol
The column was equilibrated with 0.02 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing PX (manufactured by Hanoi Chemicals, Japan). Next, the above supernatant was applied to a column. 0.3 column
M NaCl, 0.5 mM CaCl 2 , 1 mM benzamidine hydrochloride, 0.5% (v / v) Lubrol PX
After washing with 0.02 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 1 M NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 m
M benzamidine hydrochloride, 0.5% (v / v) Lubro
0.02 M Tris-HCl buffer (pH 7.
Elution was performed in 5), and 2.0 ml fractions were collected.
For each fraction obtained by the elution, the promoting effect of protein C activation was measured by the method described above. At the same time, Shimadzu (Japan) spectrophotometer UV-
Using 240, the absorbance (A 280 ) of each fraction at a wavelength of 280 nm was measured. The active fractions were collected and 0.1 M NaCl, 0.5 mM CaCl 2 ,
0.02 M Tris-HCl buffer containing 0.5% (v / v) Lubrol PX (Hansui Chemicals, Japan) (pH
Dialysis was performed at 7.5). The obtained dialysate is used for the second DIP
-Thrombin-agarose column chromatography.

【０１８３】即ち、透析液を１．５ｃｍφ×１０ｃｍの
大きさのＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムに通
し、０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ2 、
０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、さらに
０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％
（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス
緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、次いで１Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂ
ｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で溶出した。活性画分を回収し、精製品を−８
０℃で凍結保存した。この精製品の分子吸光係数を一般
的な蛋白質の分子吸光係数にならない１０．０（Ｅ1%
1cm ・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定して、それに基づ
き精製品の量を計算したところ約４．７μｇであった。
尚、この精製品をポリアクリルアミドゲル濃度５−１０
％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行い、銀染色によってバンドを観察した
ところ単一のバンドのみ確認された。That is, the dialysate was passed through a DIP-thrombin-agarose column having a size of 1.5 cmφ × 10 cm to obtain 0.4 M NaCl, 0.5 mM CaCl 2 ,
0.02 with 0.1% (v / v) Lubrol PX
After washing with M Tris-HCl buffer (pH 7.5), the solution was further washed with 0.4 M NaCl, 0.1 mM EDTA, 0.1%
(V / v) Wash with 0.02 M Tris buffer (pH 7.5) containing Lubrol PX, then 1 M NaC
1, 0.5 mM EDTA, 0.1% (v / v) Lub
PX with 0.02 M Tris-HCl buffer (pH
Eluted at 7.5). The active fraction was collected and the purified product was -8
Stored frozen at 0 ° C. The molecular extinction coefficient of this purified product is adjusted to 10.0 (E 1%
(1 cm · 280 nm = 10.0), and the amount of the purified product was calculated based on the definition. The result was about 4.7 μg.
In addition, this purified product was subjected to polyacrylamide gel concentration 5-10.
% By SDS-polyacrylamide gel electrophoresis using a gradient and observing the band by silver staining, only a single band was confirmed.

【０１８４】実施例１８ プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４を用いる以外は実施例１７
と同様の操作を行い本発明のペプチドの精製品を得、波
長２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。この精製品の
分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子吸光係数にならい
１０．０（Ｅ1% 1cm ・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定し
て、それに基づき精製品の量を計算したところ約４．５
μｇであった。尚、この精製品をポリアクリルアミドゲ
ル濃度５−１０％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を行い、銀染色によってバ
ンドを観察したところ単一のバンドのみ確認された。Example 18 Example 17 except that the plasmid pSV2TMD4 was used.
A purified product of the peptide of the present invention was obtained in the same manner as described above, and the absorbance at a wavelength of 280 nm was measured. The molecular extinction coefficient of this purified product was defined as 10.0 (E 1% 1 cm · 280 nm = 10.0) in accordance with the molecular extinction coefficient of general proteins, and the amount of purified product was calculated to be about 4 .5
μg. The purified product was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis using a gradient having a polyacrylamide gel concentration of 5 to 10%, and the band was observed by silver staining. Only a single band was confirmed.

【０１８５】実施例１９ プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２を用いる以外は実施例１７
と同様の操作を行い本発明のペプチドの精製品を得、波
長２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。この精製品の
分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子吸光係数にならい
１０．０（Ｅ1% 1cm ・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定し
て、それに基づき精製品の量を計算したところ約４μｇ
であった。尚、この精製品をポリアクリルアミドゲル濃
度５−１０％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を行い、銀染色によってバンド
を観察したところ単一のバンドのみ確認された。Example 19 Example 17 except that the plasmid pSV2TMD2 was used.
A purified product of the peptide of the present invention was obtained in the same manner as described above, and the absorbance at a wavelength of 280 nm was measured. The molecular extinction coefficient of this purified product was defined as 10.0 (E 1% 1 cm / 280 nm = 10.0) in accordance with the molecular extinction coefficient of general protein, and the amount of the purified product was calculated based on the definition.
Met. The purified product was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis using a gradient having a polyacrylamide gel concentration of 5 to 10%, and the band was observed by silver staining. Only a single band was confirmed.

【０１８６】実施例２０ プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１を用いる以外は実施例１７
と同様の操作を行い本発明のペプチドの精製品を得、波
長２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。この精製品の
分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子吸光係数にならい
１０．０（Ｅ1% 1cm ・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定し
て、それに基づき精製品の量を計算したところ約３μｇ
であった。尚、この精製品をポリアクリルアミド濃度５
−１０％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行い、銀染色によってバンドを観
察したところ単一のバンドのみ確認された。Example 20 Example 17 except that the plasmid pSV2TMD1 was used.
A purified product of the peptide of the present invention was obtained in the same manner as described above, and the absorbance at a wavelength of 280 nm was measured. The molecular extinction coefficient of this purified product was defined as 10.0 (E 1% 1 cm · 280 nm = 10.0) in accordance with the molecular extinction coefficient of general protein, and the amount of the purified product was calculated based on the definition.
Met. In addition, this refined product was polyacrylamide concentration 5
SDS-polyacrylamide gel electrophoresis using a -10% gradient was performed, and the band was observed by silver staining. As a result, only a single band was confirmed.

【０１８７】実施例２１ 実施例１１に記載した方法で、プラスミドｐＳＶ２ＴＭ
Ｊ２及びプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏで形質転換したＣ
ＨＯ細胞を直径１０ｃｍの組織培養用プレート２５枚を
用いて培養した。培養後、培養上澄液を８００ｒｐｍで
１０分間遠心分離にかけて細胞を集めた。得られた細胞
ペレットに、０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、
０．２５Ｍ庶糖、１ｍＭベンズアミジン塩酸、０．５ｍ
Ｍ ＣａＣｌ2 を含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）１００ｍｌに懸濁し、ワーリングブレンダー
を用いて４℃で５分間、５回ホモジナイズして細胞抽出
物を得た。得られた抽出物を３５，０００ｇ、１０℃で
６０分間遠心分離にかけて上澄液を集めた。この上澄液
から、実施例１７と同様の操作により本発明のペプチド
の精製品を得、波長２８０ｎｍにおける吸光度を測定し
た。この精製品の分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子
吸光係数にならない１０．０（Ｅ1% 1cm ・２８０ｎｍ＝
１０．０）と規定して、それに基づき精製品の量を計算
したところ約３μｇであった。尚、この精製品をポリア
クリルアミド濃度５−１０％のグラジェントを用いるＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、銀染色
によってバンドを観察したところ単一のバンドのみ確認
された。Example 21 In the same manner as described in Example 11, the plasmid pSV2TM
C2 transformed with J2 and plasmid pSV2-neo
HO cells were cultured using 25 tissue culture plates having a diameter of 10 cm. After the culture, the culture supernatant was centrifuged at 800 rpm for 10 minutes to collect the cells. 0.5% (v / v) Triton X-100 was added to the obtained cell pellet.
0.25M sucrose, 1mM benzamidine hydrochloride, 0.5m
0.02 M Tris-HCl buffer containing M CaCl 2 (p
H7.5) was suspended in 100 ml and homogenized 5 times at 4 ° C. for 5 minutes using a Waring blender to obtain a cell extract. The obtained extract was centrifuged at 35,000 g at 10 ° C. for 60 minutes, and the supernatant was collected. From the supernatant, a purified product of the peptide of the present invention was obtained in the same manner as in Example 17, and the absorbance at a wavelength of 280 nm was measured. The molecular extinction coefficient of this purified product is determined to be 10.0 (E 1% 1 cm · 280 nm =
10.0), and the amount of purified product was calculated based on the result, and it was about 3 μg. In addition, this purified product was prepared by using S with a gradient of polyacrylamide concentration of 5-10%.
When DS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed and the band was observed by silver staining, only a single band was confirmed.

【０１８８】実施例２２ （トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進する作用
の確認）精製した本発明のペプチドのプロテインＣ活性
化の促進作用を次の方法にて評価した。即ち、０．１Ｍ
ＮａＣｌ、３．６ｍＭ ＣａＣｌ2 、１０ｍｇ／ｍｌ
ウシ血清アルブミンを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）に５０μｇ／ｍｌのプロテインＣ、５ｎ
Ｍのトロンビン及び５ｎＭの精製した本発明のペプチド
を加えて３７℃で反応させた。反応物に３００μｇ／ｍ
ｌのアンチトロンビンIII （米国シグマ社製）および５
ｍＭ ＥＤＴＡを加えて反応を停止して、生成した活性
型プロテインＣの量を前述の合成基質を用いる方法で測
定した。結果を図３０図〜図３４に示すが、本発明のペ
プチドを無添加の場合（Ｂ）では活性化プロテインＣの
生成は認められなかった（点線）が、本発明のペプチド
を添加した場合（Ａ）には、反応時間と共に生成した活
性化プロテインＣの量が増加した（実線）。Example 22 (Confirmation of Action to Promote Protein C Activation by Thrombin) The action of the purified peptide of the present invention to promote protein C activation was evaluated by the following method. That is, 0.1M
NaCl, 3.6 mM CaCl 2 , 10 mg / ml
50 μg / ml of protein C, 5 n in 0.02 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing bovine serum albumin
M thrombin and 5 nM of the purified peptide of the present invention were added and reacted at 37 ° C. 300 μg / m for reaction
1 antithrombin III (manufactured by Sigma, USA) and 5
The reaction was stopped by adding mM EDTA, and the amount of activated protein C generated was measured by the method using the above-mentioned synthetic substrate. The results are shown in FIG. 30 to FIG. 34. In the case where the peptide of the present invention was not added (B), the generation of activated protein C was not observed (dotted line). In A), the amount of activated protein C produced increased with the reaction time (solid line).

【０１８９】実施例２３ （抗血液凝固作用の確認） 本発明のペプチドがトロンビンによるフィブリノーゲン
のフィブリンへの変換を阻害し、血液凝固を実質的に阻
害することはハインリッヒ アメルング社（独国）製の
コアギュロメーターＫＣ−１０を用いて血液凝固時間を
測定することによって調べた。即ち、５ｍＭ ＣａＣｌ
2 、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．５）に３．０μｇのフィブリノーゲン
（米国シグマ社製、フラクションＩ）を加え、これに０
−５０ｎＭの精製した本発明のペプチドを加え、次い
で、全量が０．４ｍｌになるように１０ｎＭのトロンビ
ンを加えて凝固時間を測定した。結果を図３５〜図３９
図に示す。トロンビンにくらべ、添加した精製ペプチド
の量が多くなるにしたがって、血液凝固時間が延長され
ることが確認された。Example 23 (Confirmation of anticoagulant action) The peptide of the present invention inhibits the conversion of fibrinogen into fibrin by thrombin and substantially inhibits blood coagulation. The peptide was produced by Heinrich Amelung (Germany). It was determined by measuring the blood clotting time using a coagulometer KC-10. That is, 5 mM CaCl
2. 3.0 μg of fibrinogen (fraction I, manufactured by Sigma, USA) was added to 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 0.1 M NaCl, and 0
Clotting time was measured by adding −50 nM of the purified peptide of the present invention, and then adding 10 nM thrombin to a total volume of 0.4 ml. The results are shown in FIGS.
Shown in the figure. It was confirmed that the blood coagulation time was prolonged as the amount of the purified peptide added increased as compared with thrombin.

【０１９０】実施例２４ （血小板凝集抑制作用の確認） 本発明のペプチドがトロンビンの血小板凝集作用を実質
的に阻害することはＳＩＥＮＣＯ社（米国）製のプレー
トレットアグリゴメーターを用いて評価した。即ち、３
０万ｃｅｌｌｓ／μｌの血小板液（Ｐｌａｔｅｌｅｔ
Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ、Ｐ．Ｒ．Ｐ．）２５０μｌに
１単位のトロンビン（約０．４μｇ）を加えると血小板
が凝集するが、トロンビンを加える前にその加えるトロ
ンビンと等モル以上の精製した本発明のペプチドを加え
ておくと血小板の凝集が起きなかった。Example 24 (Confirmation of Platelet Aggregation Inhibiting Effect) The fact that the peptide of the present invention substantially inhibits the platelet aggregation effect of thrombin was evaluated using a platelet aggregometer manufactured by SIENCO (USA). That is, 3
10,000 cells / μl platelet fluid (Platelet
Rich Plasma, P.M. R. P. If 1 unit of thrombin (about 0.4 μg) is added to 250 μl, platelets will aggregate, but if thrombin is added before the addition of thrombin in an equimolar amount or more to the purified peptide of the present invention, platelet aggregation will occur. Did not get up.

【０１９１】[0191]

【適用例】以下に上記の各実施例で得られた種々の可溶
性のペプチドの適用例を応用例をもって説明するが、本
発明はそれら応用例により何ら限定されるものではな
い。 応用例１ 精製した本発明のペプチド １０ ｍｇ 精製ゼラチン ２０ ｍｇ マンニトール １００ ｍｇ 塩化ナトリウム ７．８ｍｇ リン酸（１及び２）ナトリウム １５．４ｍｇ 上記成分を注射用蒸留水２ｍｌに溶解し、通常の製剤条
件により中性付近の注射用製剤を調製した。即ち、前記
溶解液を、無菌バイアルに入れ、−３５℃で２時間予備
凍結し、−３５℃で真空度０．０７５Ｔｏｒｒで３５時
間一次乾燥し、次いで３０℃、真空度０．０３Ｔｏｒｒ
で５時間二次乾燥して、注射用バイアルを製造した。得
られた組成物は、投与直前に生理食塩水もしくはブドウ
糖注射液５００ｍｌに溶解され、その溶解液は、点滴静
注するのに用いられる。APPLICATION EXAMPLES Hereinafter, application examples of various soluble peptides obtained in each of the above Examples will be described with application examples, but the present invention is not limited by these application examples. Application Example 1 Purified peptide of the present invention 10 mg Purified gelatin 20 mg Mannitol 100 mg Sodium chloride 7.8 mg Sodium phosphate (1 and 2) 15.4 mg The above components were dissolved in 2 ml of distilled water for injection, and the usual formulation conditions were used. To prepare a near neutral formulation for injection. That is, the lysate was placed in a sterile vial, pre-frozen at −35 ° C. for 2 hours, dried at −35 ° C. at a vacuum of 0.075 Torr for 35 hours, and then dried at 30 ° C. and a vacuum of 0.03 Torr.
For 5 hours to produce injection vials. The obtained composition is dissolved in physiological saline or 500 ml of glucose injection solution immediately before administration, and the solution is used for intravenous drip infusion.

【０１９２】 応用例２ 精製した本発明のペプチド ２．５ ｍｇ アルブミン ５ ｍｇ マンニトール ２５ ｍｇ 塩化ナトリウム １．９５ｍｇ リン酸（１及び２）ナトリウム ３．８５ｍｇ 上記成分を注射用蒸留水２ｍｌに溶解し、通常の製剤条
件により中性付近の注射用製剤を調製した。即ち、前記
溶解液を、無菌バイアルに入れ、−３５℃で２時間予備
凍結し、−３５℃で真空度０．０７５Ｔｏｒｒで３５時
間一次乾燥し、次いで３０℃、真空度０．０３Ｔｏｒｒ
で５時間二次乾燥して、注射用バイアルを製造した。得
られた組成物は、投与直前に生理食塩水もしくはブドウ
糖注射液５００ｍｌに溶解され、その溶解液は、点滴静
注するのに用いられる。Application Example 2 Purified peptide of the present invention 2.5 mg Albumin 5 mg Mannitol 25 mg Sodium chloride 1.95 mg Sodium phosphate (1 and 2) 3.85 mg The above components were dissolved in 2 ml of distilled water for injection, A near neutral injection formulation was prepared under normal formulation conditions. That is, the lysate was placed in a sterile vial, pre-frozen at −35 ° C. for 2 hours, dried at −35 ° C. at a vacuum of 0.075 Torr for 35 hours, and then dried at 30 ° C. and a vacuum of 0.03 Torr.
For 5 hours to produce injection vials. The obtained composition is dissolved in physiological saline or 500 ml of glucose injection solution immediately before administration, and the solution is used for intravenous drip infusion.

【０１９３】[0193]

【発明の効果】本発明のペプチドは、抗血液凝固作用、
血小板凝集抑制作用、血栓溶解作用を併せ持ち副作用の
少ない循環器系疾患などの治療用薬として極めて有用な
物質である。また、本発明のペプチドは、このような医
薬用途以外に、たとえば、人工血管、人工臓器、カテー
テルなどの医用人工材料に結合させて、血栓の形成を防
止する薬剤として用いることができる。The peptide of the present invention has an anticoagulant effect,
It is a very useful substance as a therapeutic drug for circulatory diseases, etc., which has both a platelet aggregation inhibitory action and a thrombolytic action and has few side effects. Further, the peptide of the present invention can be used as an agent for preventing thrombus formation by binding to a medical artificial material such as an artificial blood vessel, an artificial organ, or a catheter, for example, in addition to such medical uses.

【０１９４】[0194]

【配列表】[Sequence list]

配列番号：１ 配列の長さ：１１８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys 1 5 10 15 Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe 20 25 30 Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln 35 40 45 Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu 50 55 60 Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile 65 70 75 80 Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu 85 90 95 Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg 100 105 110 His Ile Gly Thr Asp Cys 115 SEQ ID NO: 1 Sequence length: 118 Sequence type: Amino acid Sequence type: Protein sequence Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys 1 5 10 15 Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe 20 25 30 Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln 35 40 45 Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu 50 55 60 Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile 65 70 75 80 Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu 85 90 95 Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg 100 105 110 His Ile Gly Thr Asp Cys 115

【０１９５】 配列番号：２ 配列の長さ：５９ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Leu Leu Ile Gly Ile Ser Ile Ala Ser Leu Cys Leu Val Val Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Leu Cys His Leu Arg Lys Lys Gln Gly Ala Ala Arg Ala 20 25 30 Lys Met Glu Tyr Lys Cys Ala Ala Pro Ser Lys Glu Val Val Leu Gln 35 40 45 His Val Arg Thr Glu Arg Thr Pro Gln Arg Leu 50 55SEQ ID NO: 2 Sequence length: 59 Sequence type: amino acid Sequence type: Protein sequence Leu Leu Ile Gly Ile Ser Ile Ala Ser Leu Cys Leu Val Val Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Leu Cys His Leu Arg Lys Lys Gln Gly Ala Ala Arg Ala 20 25 30 Lys Met Glu Tyr Lys Cys Ala Ala Pro Ser Lys Glu Val Val Leu Gln 35 40 45 His Val Arg Thr Glu Arg Thr Pro Gln Arg Leu 50 55

【０１９６】 配列番号：３ 配列の長さ：４９８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp 1 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln 20 25 30 Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly 50 55 60 Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp 65 70 75 80 Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110 Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr 115 120 125 Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala 130 135 140 Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly 165 170 175 Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205 Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220 Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln 245 250 255 Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp 260 265 270 Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr 275 280 285 Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg 290 295 300 Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln 305 310 315 320 Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335 Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350 Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr 355 360 365 Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His 370 375 380 Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp 385 390 395 400 Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp 405 410 415 Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430 Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys 435 440 445 Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser 450 455 460 Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser 465 470 475 480 Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu Val His 485 490 495 Ser GlySEQ ID NO: 3 Sequence length: 498 Sequence type: amino acid Sequence type: Protein sequence Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp 1 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln 20 25 30 Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly 50 55 60 Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp 65 70 75 80 Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110 Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr 115 120 125 Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala 130 135 140 Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly 165 170 175 Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln A la Leu Pro Val Gly 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205 Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220 Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln 245 250 255 Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp 260 265 270 Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr 275 280 285 Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg 290 295 300 Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln 305 310 315 320 Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335 Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350 Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr 355 360 365 Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His 370 375 380 Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro A la Asp Cys Asp 385 390 395 400 400 Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp 405 410 415 Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430 Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys 435 440 445 Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser 450 455 460 Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser 465 470 475 480 Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu Val His 485 490 495 Ser Gly

【０１９７】 配列番号：４ 配列の長さ：３５４ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC 48 CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC 96 GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG 144 ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG 192 TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC 240 GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC 288 CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC 336 CAC ATT GGC ACC GAC TGT 354SEQ ID NO: 4 Sequence length: 354 Sequence type: nucleotide sequence Sequence type: DNA sequence GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC 48 CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC 96 GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG 144 ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG 192 TGC CCT GAA GGC TAC ATC C GAC GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC 240 GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC 288 CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC 336 CAC ATT GGC ACC GAC 354

【０１９８】 配列番号：５ 配列の長さ：１４９４ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GCA CCC GCA GAG CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC GTC GAG CAC GAC 48 TGC TTC GCG CTC TAC CCG GGC CCC GCG ACC TTC CTC AAT GCC AGT CAG 96 ATC TGC GAC GGA CTG CGG GGC CAC CTA ATG ACA GTG CGC TCC TCG GTG 144 GCT GCC GAT GTC ATT TCC TTG CTA CTG AAC GGC GAC GGC GGC GTT GGC 192 CGC CGG CGC CTC TGG ATC GGC CTG CAG CTG CCA CCC GGC TGC GGC GAC 240 CCC AAG CGC CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG GTT ACG GGA GAC 288 AAC AAC ACC AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC CTC AAT GGG GCT 336 CCC CTC TGC GGC CCG TTG TGC GTC GCT GTC TCC GCT GCT GAG GCC ACT 384 GTG CCC AGC GAG CCG ATC TGG GAG GAG CAG CAG TGC GAA GTG AAG GCC 432 GAT GGC TTC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC TGC AGG CCA CTG 480 GCT GTG GAG CCC GGC GCC GCG GCT GCC GCC GTC TCG ATC ACC TAC GGC 528 ACC CCG TTC GCG GCC CGC GGA GCG GAC TTC CAG GCG CTG CCG GTG GGC 576 AGC TCC GCC GCG GTG GCT CCC CTC GGC TTA CAG CTA ATG TGC ACC GCG 624 CCG CCC GGA GCG GTC CAG GGG CAC TGG GCC AGG GAG GCG CCG GGC GCT 672 TGG GAC TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG 720 ATC CCT GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC CTG CAG 768 GCA GAC GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC 816 CTC TGC GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC 864 TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA CAC CGG 912 TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG 960 CGC TGT GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC 1008 TAC GAC CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC 1056 AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC 1104 CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC 1152 AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC 1200 CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC 1248 GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC 1296 TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC 1344 GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT GAC TCC 1392 GGC AAG GTG GAC GGT GGC GAC AGC GGC TCT GGC GAG CCC CCG CCC AGC 1440 CCG ACG CCC GGC TCC ACC TTG ACT CCT CCG GCC GTG GGG CTC GTG CAT 1488 TCG GGC 1494SEQ ID NO: 5 Sequence length: 1494 Sequence type: base sequence Sequence type: DNA sequence GCA CCC GCA GAG CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC GTC GAG CAC GAC 48 TGC TTC GCG CTC TAC CCG GGC CCC GCG ACC TTC CTC AAT GCC AGT CAG 96 ATC TGC GAC GGA CTG CGG GGC CAC CTA ATG ACA GTG CGC TCC TCG GTG 144 GCT GCC GAT GTC ATT TCC TTG CTA CTG AAC GGC GAC GGC GGC GTT GGC 192 CGC CGG CGC CTC TGG AGC CTG CAG CTG CCA CCC GGC TGC GGC GAC 240 CCC AAG CGC CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG GTT ACG GGA GAC 288 AAC AAC ACC AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC CTC AAT GGG GCT 336 CCC CTC TGC GGC CC TGC GTC GCT GTC TCC GCT GCT GAG GCC ACT 384 GTG CCC AGC GAG CCG ATC TGG GAG GAG CAG CAG TGC GAA GTG AAG GCC 432 GAT GGC TTC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC TGC AGG CCA CTG 480 GCT GTG GAG CCC GCC GCG GCT GCC GCC GTC TCG ATC ACC TAC GGC 528 ACC CCG TTC GCG GCC CGC GGA GCG GAC TTC CAG GCG CTG CCG GTG GGC 576 AGC TCC GCC GCG GTG GCT CCC CTC GGC TTA CAG CTA ATG TG C ACC GCG 624 CCG CCC GGA GCG GTC CAG GGG CAC TGG GCC AGG GAG GCG CCG GGC GCT 672 TGG GAC TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG 720 ATC CCT GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GGC GCC GCC CTG CAG 768 GCA GAC GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC 816 CTC TGC GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC 864 TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CTG CTG GCC GAC CAA CAC CGG 912 TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG 960 CGC TGT GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC 1008 TAC GAC CTG GTG GAC GGC GAG TGT CCC GTG GAC CCG TGC TTC 1056 AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC 1104 CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC 1152 AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC 1200 CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC 1248 GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC 1296 TGC TCC GGG GTG TGC CAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC 1344 GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT GAC TCC 1392 GGC AAG GTG GAC GGT GGC GAC AGC GGC TCT GGC GAG CCC CCG CCC AGC 1440 CCG ACG CCC GCC TTG ACT CCT CCG GCC GTG GGG CTC GTG CAT 1488 TCG GGC 1494

【０１９９】 配列番号：６ 配列の長さ：２３６ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro 1 5 10 15 Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ala Asp 20 25 30 Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu Cys 35 40 45 Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys 50 55 60 Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg Cys Glu 65 70 75 80 Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys 85 90 95 Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp 100 105 110 Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala 115 120 125 Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys 130 135 140 Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys 145 150 155 160 Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn 165 170 175 Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly 180 185 190 Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser 195 200 205 Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro 210 215 220 Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 225 230 235SEQ ID NO: 6 Sequence length: 236 Sequence type: amino acid Sequence type: Protein sequence Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro 1 5 10 15 Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ala Asp 20 25 30 Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu Cys 35 40 45 Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys 50 55 60 Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg Cys Glu 65 70 75 80 Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys 85 90 95 Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp 100 105 110 Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala 115 120 125 Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys 130 135 140 Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys 145 150 155 160 Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn 165 170 175 Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr I le Leu Asp Asp Gly 180 185 190 Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser 195 200 205 Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro 210 215 220 Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 225 230 235

【０２００】 配列番号：７ 配列の長さ：５７５ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15 Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu 20 25 30 His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala 35 40 45 Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser 50 55 60 Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly 65 70 75 80 Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys 85 90 95 Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr 100 105 110 Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn 115 120 125 Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu 130 135 140 Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val 145 150 155 160 Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg 165 170 175 Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr 180 185 190 Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro 195 200 205 Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys 210 215 220 Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro 225 230 235 240 Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys 245 250 255 Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala 260 265 270 Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys 275 280 285 Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly 290 295 300 Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln 305 310 315 320 His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys 325 330 335 Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr 340 345 350 Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro 355 360 365 Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr 370 375 380 Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu 385 390 395 400 Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp 405 410 415 Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile 420 425 430 Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly 435 440 445 Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys 450 455 460 Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 465 470 475 480 Asp Ser Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro 485 490 495 Pro Ser Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu 500 505 510 Val His Ser Gly Leu Leu Ile Gly Ile Ser Ile Ala Ser Leu Cys Leu 515 520 525 Val Val Ala Leu Leu Ala Leu Leu Cys His Leu Arg Lys Lys Gln Gly 530 535 540 Ala Ala Arg Ala Lys Met Glu Tyr Lys Cys Ala Ala Pro Ser Lys Glu 545 550 555 560 Val Val Leu Gln His Val Arg Thr Glu Arg Thr Pro Gln Arg Leu 565 570 575 SEQ ID NO: 7 Sequence length: 575 Sequence type: amino acid Sequence type: Protein sequence Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15 Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu 20 25 30 His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala 35 40 45 Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser 50 55 60 Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly 65 70 75 80 Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys 85 90 95 Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr 100 105 110 Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn 115 120 125 Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu 130 135 140 Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val 145 150 155 160 Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg 165 170 175 Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala A la Val Ser Ile Thr 180 185 190 Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro 195 200 205 Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys 210 215 220 Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro 225 230 235 240 Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys 245 250 255 Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala 260 265 270 Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys 275 280 285 Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly 290 295 300 Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln 305 310 315 320 His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys 325 330 335 Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr 340 345 350 Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro 355 360 365 Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr 370 375 380 Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala ProIle Pro His Glu 385 390 395 400 400 Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp 405 410 415 Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile 420 425 430 Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly 435 440 445 Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys 450 455 460 Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 465 470 475 480 Asp Ser Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro 485 490 495 Pro Ser Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu 500 505 510 Val His Ser Gly Leu Leu Ile Gly Ile Ser Ile Ala Ser Leu Cys Leu 515 520 525 Val Val Ala Leu Leu Ala Leu Leu Cys His Leu Arg Lys Lys Gln Gly 530 535 540 540 Ala Ala Arg Ala Lys Met Glu Tyr Lys Cys Ala Ala Pro Ser Lys Glu 545 550 550 555 560 Val Val Leu Gln His Val Arg Thr Glu Arg Thr Pro Gln Arg Leu 565 570 575

【０２０１】 配列番号：８ 配列の長さ：２７２ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro 1 5 10 15 Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ala Asp 20 25 30 Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu Cys 35 40 45 Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys 50 55 60 Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg Cys Glu 65 70 75 80 Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys 85 90 95 Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp 100 105 110 Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala 115 120 125 Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys 130 135 140 Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys 145 150 155 160 Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn 165 170 175 Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly 180 185 190 Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser 195 200 205 Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro 210 215 220 Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser Gly Lys 225 230 235 240 Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser Pro Thr 245 250 255 Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu Val His Ser Gly 260 265 270SEQ ID NO: 8 Sequence length: 272 Sequence type: amino acid Sequence type: Protein sequence Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro 1 5 10 15 Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ala Asp 20 25 30 Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu Cys 35 40 45 Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys 50 55 60 Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg Cys Glu 65 70 75 80 Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys 85 90 95 Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp 100 105 110 Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala 115 120 125 Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys 130 135 140 Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys 145 150 155 160 Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn 165 170 175 Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr I le Leu Asp Asp Gly 180 185 190 Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser 195 200 205 Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro 210 215 220 Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser Gly Lys 225 230 235 240 Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser Pro Thr 245 250 255 Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu Val His Ser Gly 260 265 270

【０２０２】 配列番号：９ 配列の長さ：７０８ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG ATC CCT 48 GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC CTG CAG GCA GAC 96 GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC CTC TGC 144 GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC TCG TGC 192 ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA CAC CGG TGC GAG 240 GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG CGC TGT 288 GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC TAC GAC 336 CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC AGA GCC 384 AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC CTC TGC 432 GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC AGG TGC 480 CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC CCC AAC 528 ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC GAC GGT 576 TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC TGC TCC 624 GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC GGG CCC 672 GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT 708SEQ ID NO: 9 Sequence length: 708 Sequence type: base sequence Sequence type: DNA sequence TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG ATC CCT 48 GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC CTG CAG GCA GAC 96 GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC CTC TGC 144 GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC TCG TGC 192 ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA CAC CGG TGC GAG 240 GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG CGC TGT 288 GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC TAC GAC 336 CTG GTG GAC GGC TGC GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC AGA GCC 384 AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC CTC TGC 432 GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC AGG TGC 480 CAG ATG TTT CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC CCC AAC 528 ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC GAC GGT 576 TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC T GC TCC 624 GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC GGG CCC 672 GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT 708

【０２０３】 配列番号：１０ 配列の長さ：１７２５ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ATG CTT GGG GTC CTG GTC CTT GGC GCG CTG GCC CTG GCC GGC CTG GGG 48 TTC CCC GCA CCC GCA GAG CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC GTC GAG 96 CAC GAC TGC TTC GCG CTC TAC CCG GGC CCC GCG ACC TTC CTC AAT GCC 144 AGT CAG ATC TGC GAC GGA CTG CGG GGC CAC CTA ATG ACA GTG CGC TCC 192 TCG GTG GCT GCC GAT GTC ATT TCC TTG CTA CTG AAC GGC GAC GGC GGC 240 GTT GGC CGC CGG CGC CTC TGG ATC GGC CTG CAG CTG CCA CCC GGC TGC 288 GGC GAC CCC AAG CGC CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG GTT ACG 336 GGA GAC AAC AAC ACC AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC CTC AAT 384 GGG GCT CCC CTC TGC GGC CCG TTG TGC GTC GCT GTC TCC GCT GCT GAG 432 GCC ACT GTG CCC AGC GAG CCG ATC TGG GAG GAG CAG CAG TGC GAA GTG 480 AAG GCC GAT GGC TTC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC TGC AGG 528 CCA CTG GCT GTG GAG CCC GGC GCC GCG GCT GCC GCC GTC TCG ATC ACC 576 TAC GGC ACC CCG TTC GCG GCC CGC GGA GCG GAC TTC CAG GCG CTG CCG 624 GTG GGC AGC TCC GCC GCG GTG GCT CCC CTC GGC TTA CAG CTA ATG TGC 672 ACC GCG CCG CCC GGA GCG GTC CAG GGG CAC TGG GCC AGG GAG GCG CCG 720 GGC GCT TGG GAC TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC 768 AAT GCG ATC CCT GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC 816 CTG CAG GCA GAC GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC 864 AAC GAC CTC TGC GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC 912 TCC TAC TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA 960 CAC CGG TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT 1008 CCG CAG CGC TGT GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC 1056 CCT AAC TAC GAC CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG 1104 TGC TTC AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT 1152 AGC TAC CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG 1200 CCG CAC AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC 1248 TGC GAC CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC 1296 CTG GAC GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC 1344 GGC TTC TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC 1392 ATC TGC GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT 1440 GAC TCC GGC AAG GTG GAC GGT GGC GAC AGC GGC TCT GGC GAG CCC CCG 1488 CCC AGC CCG ACG CCC GGC TCC ACC TTG ACT CCT CCG GCC GTG GGG CTC 1536 GTG CAT TCG GGC TTG CTC ATA GGC ATC TCC ATC GCG AGC CTG TGC CTG 1584 GTG GTG GCG CTT TTG GCG CTC CTC TGC CAC CTG CGC AAG AAG CAG GGC 1632 GCC GCC AGG GCC AAG ATG GAG TAC AAG TGC GCG GCC CCT TCC AAG GAG 1680 GTA GTG CTG CAG CAC GTG CGG ACC GAG CGG ACG CCG CAG AGA CTC 1725SEQ ID NO: 10 Sequence length: 1725 Sequence type: Base sequence Sequence type: DNA sequence ATG CTT GGG GTC CTG GTC CTT GGC GCG CTG GCC CTG GCC GGC CTG GGG 48 TTC CCC GCA CCC GCA GAG CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC GTC GAG 96 CAC GAC TGC TTC GCG CTC TAC CCG GGC CCC GCG ACC TTC CTC AAT GCC 144 AGT CAG ATC TGC GAC GGA CTG CGG GGC CAC CTA ATG ACA GTG CGC TCC 192 TCG GTG GCT GCC GAT GTC ATT TCC TTG CTA CTG AAC GGC GAC GGC GGC 240 GTT GGC CGC CGG CGC CTC TGG ATC GGC CTG CAG CTG CCA CCC GGC TGC 288 GGC GAC CCC AAG CGC CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG GTT ACG 336 GGA GAC AGC ACC AGC ACC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC CTC AAT 384 GGG GCT CCC CTC TGC GGC CCG TTG TGC GTC GCT GTC TCC GCT GCT GAG 432 GCC ACT GTG CCC AGC GAG CCG ATC TGG GAG GAG CAG CAG TGC GAA GTG 480 AAG GTC GAT GGC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC TGC AGG 528 CCA CTG GCT GTG GAG CCC GGC GCC GCG GCT GCC GCC GTC TCG ATC ACC 576 TAC GGC ACC CCG TTC GCG GCC CGC GGA GCG GAC TTC CAG GCG CTG CCG 624 GTG GGC AGC TCC GCC GCG GTG GCT CCC CTC GGC TTA CAG CTA ATG TGC 672 ACC GCG CCG CCC GGA GCG GTC CAG GGG CAC TGG GCC AGG GAG GCG CCG 720 GGC GCT TGG GAC TGC AGC GTG GAG AGC GGC GGC GAG CAC GCG TGC 768 AAT GCG ATC CCT GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC 816 CTG CAG GCA GAC GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC 864 AAC GAC CTC TGC GAG CAC TTC TGC GTT CTC CCC GAC CAG CCG GGC 912 TCC TAC TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA 960 CAC CGG TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT 1008 CCG CAG CGC TGT GTC AAC AGC GGT TTC GAG TGC CAC TGC TAC 1056 CCT AAC TAC GAC CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG 1104 TGC TTC AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT 1152 AGC TAC CTC TGC GTC GGC GCC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG 1200 CCG CAC AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC 1248 TGC GAC CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC 1296 CTG GAC GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC 1344 GGC TTC TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC 1392 ATC TGC GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT 1440 GAC TCC GGC AGC GAC GGT GGC GAC AGC GGC TCT GGC GAG CCC CCG 1488 CCC AGC CCG ACG CCC GGC TCC ACC TTG ACT CCT CCG GCC GTG GGG CTC 1536 GTG CAT TCG GGC TTG CTC ATA GGC ATC TCC ATC GCG AGC CTG TGC CTG 1584 GTG GTG GCG TTG GCG CTC CTC TGC CAC CTG CGC AAG AAG CAG GGC 1632 GCC GCC AGG GCC AAG ATG GAG TAC AAG TGC GCG GCC CCT TCC AAG GAG 1680 GTA GTG CTG CAG CAC GTG CGG ACC GAG CGG ACG CCG CAG AGA CTC 1725

【０２０４】 配列番号：１１ 配列の長さ：８１６ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG ATC CCT 48 GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC CTG CAG GCA GAC 96 GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC CTC TGC 144 GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC TCG TGC 192 ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA CAC CGG TGC GAG 240 GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG CGC TGT 288 GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC TAC GAC 336 CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC AGA GCC 384 AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC CTC TGC 432 GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC AGG TGC 480 CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC CCC AAC 528 ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC GAC GGT 576 TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC TGC TCC 624 GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC GGG CCC 672 GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT GAC TCC GGC AAG 720 GTG GAC GGT GGC GAC AGC GGC TCT GGC GAG CCC CCG CCC AGC CCG ACG 768 CCC GGC TCC ACC TTG ACT CCT CCG GCC GTG GGG CTC GTG CAT TCG GGC 816SEQ ID NO: 11 Sequence length: 816 Sequence type: base sequence Sequence type: DNA sequence TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG ATC CCT 48 GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC CTG CAG GCA GAC 96 GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC CTC TGC 144 GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC TCG TGC 192 ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA CAC CGG TGC GAG 240 GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG CGC TGT 288 GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC TAC GAC 336 CTG GTG GAC GGC TGC GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC AGA GCC 384 AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC CTC TGC 432 GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC AGG TGC 480 CAG ATG TTT CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC CCC AAC 528 ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC GAC GGT 576 TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TT C TGC TCC 624 GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC GGG CCC 672 GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT GAC TCC GGC AAG 720 GTG GAC GGT GGC GAC AGC GGC TCT GGC GAG CCC CC CCC AGC CCG ACG 768 CCC GGC TCC ACC TTG ACT CCT CCG GCC GTG GGG CTC GTG CAT TCG GGC 816

【０２０５】 配列番号：１２ 配列の長さ：１６７１ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GCA CCC GCA GAG CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC GTC GAG CAC GAC 48 TGC TTC GCG CTC TAC CCG GGC CCC GCG ACC TTC CTC AAT GCC AGT CAG 96 ATC TGC GAC GGA CTG CGG GGC CAC CTA ATG ACA GTG CGC TCC TCG GTG 144 GCT GCC GAT GTC ATT TCC TTG CTA CTG AAC GGC GAC GGC GGC GTT GGC 192 CGC CGG CGC CTC TGG ATC GGC CTG CAG CTG CCA CCC GGC TGC GGC GAC 240 CCC AAG CGC CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG GTT ACG GGA GAC 288 AAC AAC ACC AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC CTC AAT GGG GCT 336 CCC CTC TGC GGC CCG TTG TGC GTC GCT GTC TCC GCT GCT GAG GCC ACT 384 GTG CCC AGC GAG CCG ATC TGG GAG GAG CAG CAG TGC GAA GTG AAG GCC 432 GAT GGC TTC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC TGC AGG CCA CTG 480 GCT GTG GAG CCC GGC GCC GCG GCT GCC GCC GTC TCG ATC ACC TAC GGC 528 ACC CCG TTC GCG GCC CGC GGA GCG GAC TTC CAG GCG CTG CCG GTG GGC 576 AGC TCC GCC GCG GTG GCT CCC CTC GGC TTA CAG CTA ATG TGC ACC GCG 624 CCG CCC GGA GCG GTC CAG GGG CAC TGG GCC AGG GAG GCG CCG GGC GCT 672 TGG GAC TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG 720 ATC CCT GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC CTG CAG 768 GCA GAC GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC 816 CTC TGC GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC 864 TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA CAC CGG 912 TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG 960 CGC TGT GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC 1008 TAC GAC CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC 1056 AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC 1104 CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC 1152 AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC 1200 CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC 1248 GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC 1296 TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC 1344 GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT GAC TCC 1392 GGC AAG GTG GAC GGT GGC GAC AGC GGC TCT GGC GAG CCC CCG CCC AGC 1440 CCG ACG CCC GGC TCC ACC TTG ACT CCT CCG GCC GTG GGG CTC GTG CAT 1488 TCG GGC TTG CTC ATA GGC ATC TCC ATC GCG AGC CTG TGC CTG GTG GTG 1536 GCG CTT TTG GCG CTC CTC TGC CAC CTG CGC AAG AAG CAG GGC GCC GCC 1584 AGG GCC AAG ATG GAG TAC AAG TGC GCG GCC CCT TCC AAG GAG GTA GTG 1632 CTG CAG CAC GTG CGG ACC GAG CGG ACG CCG CAG AGA CTC 1671SEQ ID NO: 12 Sequence length: 1671 Sequence type: Base sequence Sequence type: DNA sequence GCA CCC GCA GAG CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC GTC GAG CAC GAC 48 TGC TTC GCG CTC TAC CCG GGC CCC GCG ACC TTC CTC AAT GCC AGT CAG 96 ATC TGC GAC GGA CTG CGG GGC CAC CTA ATG ACA GTG CGC TCC TCG GTG 144 GCT GCC GAT GTC ATT TCC TTG CTA CTG AAC GGC GAC GGC GGC GTT GGC 192 CGC CGG CGC CTC TGG AGC CTG CAG CTG CCA CCC GGC TGC GGC GAC 240 CCC AAG CGC CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG GTT ACG GGA GAC 288 AAC AAC ACC AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC CTC AAT GGG GCT 336 CCC CTC TGC GGC CC TGC GTC GCT GTC TCC GCT GCT GAG GCC ACT 384 GTG CCC AGC GAG CCG ATC TGG GAG GAG CAG CAG TGC GAA GTG AAG GCC 432 GAT GGC TTC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC TGC AGG CCA CTG 480 GCT GTG GAG CCC GCC GCG GCT GCC GCC GTC TCG ATC ACC TAC GGC 528 ACC CCG TTC GCG GCC CGC GGA GCG GAC TTC CAG GCG CTG CCG GTG GGC 576 AGC TCC GCC GCG GTG GCT CCC CTC GGC TTA CAG CTA ATG TGC ACC GCG 624 CCG CCC GGA GCG GTC CAG GGG CAC TGG GCC AGG GAG GCG CCG GGC GCT 672 TGG GAC TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG 720 ATC CCT GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GCC GCC CTG CAG 768 GCA GAC GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC 816 CTC TGC GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC 864 TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CTG CTG GCC GAC CAA CAC CGG 912 TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG 960 CGC TGT GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC 1008 TAC GAC CTG GTG GAC GGC GAG TGT CCC GTG GAC CCG TGC TTC 1056 AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC 1104 CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC 1152 AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC 1200 CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC 1248 GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC 1296 TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC 1344 GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT GAC TCC 1392 GGC AAG GTG GAC GGT GGC GAC AGC GGC TCT GGC GAG CCC CCG CCC AGC 1440 CCG ACC GCC GCC ACC TTG ACT CCT CCG GCC GTG GGG CTC GTG CAT 1488 TCG GGC TTG CTC ATA GGC ATC TCC ATC GCG AGC CTG TGC CTG GTG GTG 1536 GCG CTT TTG GCG CTC CTC TGC CAC CTG CGC AAG AAG CAG GGC GCC GCC A584 AGG AGCAG GAG TAC AAG TGC GCG GCC CCT TCC AAG GAG GTA GTG 1632 CTG CAG CAC GTG CGG ACC GAG CGG ACG CCG CAG AGA CTC 1671

【０２０６】 配列番号：１３ 配列の長さ：５５７ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp 1 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln 20 25 30 Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly 50 55 60 Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp 65 70 75 80 Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110 Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr 115 120 125 Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala 130 135 140 Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly 165 170 175 Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205 Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220 Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln 245 250 255 Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp 260 265 270 Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr 275 280 285 Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg 290 295 300 Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln 305 310 315 320 Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335 Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350 Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr 355 360 365 Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His 370 375 380 Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp 385 390 395 400 Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp 405 410 415 Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430 Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys 435 440 445 Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser 450 455 460 Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser 465 470 475 480 Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu Val His 485 490 495 Ser Gly Leu Leu Ile Gly Ile Ser Ile Ala Ser Leu Cys Leu Val Val 500 505 510 Ala Leu Leu Ala Leu Leu Cys His Leu Arg Lys Lys Gln Gly Ala Ala 515 520 525 Arg Ala Lys Met Glu Tyr Lys Cys Ala Ala Pro Ser Lys Glu Val Val 530 535 540 Leu Gln His Val Arg Thr Glu Arg Thr Pro Gln Arg Leu 545 550 555SEQ ID NO: 13 Sequence length: 557 Sequence type: Amino acid Sequence type: Protein sequence Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp 1 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln 20 25 30 Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly 50 55 60 Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp 65 70 75 80 Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110 Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr 115 120 125 Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala 130 135 140 Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly 165 170 175 Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gl n Ala Leu Pro Val Gly 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205 Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220 Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln 245 250 255 Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp 260 265 270 Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr 275 280 285 Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg 290 295 300 Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln 305 310 315 320 Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335 Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350 Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr 355 360 365 Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His 370 375 380 Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pr o Ala Asp Cys Asp 385 390 395 400 Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp 405 410 415 Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430 Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys 435 440 445 Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser 450 455 460 Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser 465 470 475 480 Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu Val His 485 490 495 Ser Gly Leu Leu Ile Gly Ile Ser Ile Ala Ser Leu Cys Leu Val Val 500 505 510 Ala Leu Leu Cys His Leu Arg Lys Lys Gln Gly Ala Ala 515 520 525 Arg Ala Lys Met Glu Tyr Lys Cys Ala Ala Pro Ser Lys Glu Val Val 530 535 540 Leu Gln His Val Arg Thr Glu Arg Thr Pro Gln Arg Leu 545 550 555

【０２０７】 配列番号：１４ 配列の長さ：４６２ 配列の型：アミノ酸 配列 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp 1 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln 20 25 30 Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly 50 55 60 Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp 65 70 75 80 Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110 Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr 115 120 125 Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala 130 135 140 Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly 165 170 175 Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205 Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220 Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln 245 250 255 Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp 260 265 270 Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr 275 280 285 Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg 290 295 300 Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln 305 310 315 320 Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335 Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350 Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr 355 360 365 Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His 370 375 380 Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp 385 390 395 400 Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp 405 410 415 Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430 Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys 435 440 445 Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 450 455 460SEQ ID NO: 14 Sequence length: 462 Sequence type: Amino acid sequence Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp 1 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln 20 25 30 Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly 50 55 60 Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp 65 70 75 80 Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110 Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr 115 120 125 Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala 130 135 140 Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly 165 170 175 Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly 180 18 5 190 Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205 Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220 Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln 245 250 255 Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp 260 265 270 Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr 275 280 285 Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg 290 295 300 Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln 305 310 315 320 Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335 Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350 Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr 355 360 365 Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His 370 375 380 Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp 385 390 39 5 400 Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp 405 410 415 Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430 Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys 435 440 445 Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 450 455 460

【０２０８】 配列番号：１５ 配列の長さ：１３８６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列 GCACCCGCAG AGCCGCAGCC GGGTGGCAGC CAGTGCGTCG AGCACGACTG CTTCGCGCTC 60 TACCCGGGCC CCGCGACCTT CCTCAATGCC AGTCAGATCT GCGACGGACT GCGGGGCCAC 120 CTAATGACAG TGCGCTCCTC GGTGGCTGCC GATGTCATTT CCTTGCTACT GAACGGCGAC 180 GGCGGCGTTG GCCGCCGGCG CCTCTGGATC GGCCTGCAGC TGCCACCCGG CTGCGGCGAC 240 CCCAAGCGCC TCGGGCCCCT GCGCGGCTTC CAGTGGGTTA CGGGAGACAA CAACACCAGC 300 TATAGCAGGT GGGCACGGCT CGACCTCAAT GGGGCTCCCC TCTGCGGCCC GTTGTGCGTC 360 GCTGTCTCCG CTGCTGAGGC CACTGTGCCC AGCGAGCCGA TCTGGGAGGA GCAGCAGTGC 420 GAAGTGAAGG CCGATGGCTT CCTCTGCGAG TTCCACTTCC CAGCCACCTG CAGGCCACTG 480 GCTGTGGAGC CCGGCGCCGC GGCTGCCGCC GTCTCGATCA CCTACGGCAC CCCGTTCGCG 540 GCCCGCGGAG CGGACTTCCA GGCGCTGCCG GTGGGCAGCT CCGCCGCGGT GGCTCCCCTC 600 GGCTTACAGC TAATGTGCAC CGCGCCGCCC GGAGCGGTCC AGGGGCACTG GGCCAGGGAG 660 GCGCCGGGCG CTTGGGACTG CAGCGTGGAG AACGGCGGCT GCGAGCACGC GTGCAATGCG 720 ATCCCTGGGG CTCCCCGCTG CCAGTGCCCA GCCGGCGCCG CCCTGCAGGC AGACGGGCGC 780 TCCTGCACCG CATCCGCGAC GCAGTCCTGC AACGACCTCT GCGAGCACTT CTGCGTTCCC 840 AACCCCGACC AGCCGGGCTC CTACTCGTGC ATGTGCGAGA CCGGCTACCG GCTGGCGGCC 900 GACCAACACC GGTGCGAGGA CGTGGATGAC TGCATACTGG AGCCCAGTCC GTGTCCGCAG 960 CGCTGTGTCA ACACACAGGG TGGCTTCGAG TGCCACTGCT ACCCTAACTA CGACCTGGTG 1020 GACGGCGAGT GTGTGGAGCC CGTGGACCCG TGCTTCAGAG CCAACTGCGA GTACCAGTGC 1080 CAGCCCCTGA ACCAAACTAG CTACCTCTGC GTCTGCGCCG AGGGCTTCGC GCCCATTCCC 1140 CACGAGCCGC ACAGGTGCCA GATGTTTTGC AACCAGACTG CCTGTCCAGC CGACTGCGAC 1200 CCCAACACCC AGGCTAGCTG TGAGTGCCCT GAAGGCTACA TCCTGGACGA CGGTTTCATC 1260 TGCACGGACA TCGACGAGTG CGAAAACGGC GGCTTCTGCT CCGGGGTGTG CCACAACCTC 1320 CCCGGTACCT TCGAGTGCAT CTGCGGGCCC GACTCGGCCC TTGTCCGCCA CATTGGCACC 1380 GACTGT 1386SEQ ID NO: 15 Sequence length: 1386 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double-stranded sequence GCACCCGCAG AGCCGCAGCC GGGTGGCAGC CAGTGCGTCG AGCACGACTG CTTCGCGCGCTC 60 TACCCGGGCC CCGCGACCTT CCTCAATGCC AGTCAGCGTCCGTCGATGCTGCGACGCTCGTCGATGCTGCGATGACGCTGCTGCGATGCT GGCCTGCAGC TGCCACCCGG CTGCGGCGAC 240 CCCAAGCGCC TCGGGCCCCT GCGCGGCTTC CAGTGGGTTA CGGGAGACAA CAACACCAGC 300 TATAGCAGGT GGGCACGGCT CGACCTCAAT GGGGCTCCCC TCTGCGGCCC GTTGTGCGTC 360 GCTGTCTCCG CTGCTGAGGC CACTGTGCCC AGCGAGCCGA TCTGGGAGGA GCAGCAGTGC 420 GAAGTGAAGG CCGATGGCTT CCTCTGCGAG TTCCACTTCC CAGCCACCTG CAGGCCACTG 480 GCTGTGGAGC CCGGCGCCGC GGCTGCCGCC GTCTCGATCA CCTACGGCAC CCCGTTCGCG 540 GCCCGCGGAG CGGACTTCCA GGCGCTGCCG GTGGGCAGCT CCGCCGCGGT GGCTCCCCTC 600 GGCTTACAGC TAATGTGCAC CGCGCCGCCC GGAGCGGTCC AGGGGCACTG GGCCAGGGAG 660 GCGCCGGGCG CTTGGGACTG CAGCGTGGAG AACGGCGGCT GCGAGCACGC GTGCAATGCG 720 ATCCCTGGGG CTCCCCGCTG CCAGTGCCCA GCCGG CGCCG CCCTGCAGGC AGACGGGCGC 780 TCCTGCACCG CATCCGCGAC GCAGTCCTGC AACGACCTCT GCGAGCACTT CTGCGTTCCC 840 AACCCCGACC AGCCGGGCTC CTACTCGTGC ATGTGCGAGA CCGGCTACCG GCTGGCGGCC 900 GACCAACACC GGTGCGAGGA CGTGGATGAC TGCATACTGG AGCCCAGTCC GTGTCCGCAG 960 CGCTGTGTCA ACACACAGGG TGGCTTCGAG TGCCACTGCT ACCCTAACTA CGACCTGGTG 1020 GACGGCGAGT GTGTGGAGCC CGTGGACCCG TGCTTCAGAG CCAACTGCGA GTACCAGTGC 1080 CAGCCCCTGA ACCAAACTAG CTACCTCTGC GTCTGCGCCG AGGGCTTCGC GCCCATTCCC 1140 CACGAGCCGC ACAGGTGCCA GATGTTTTGC AACCAGACTG CCTGTCCAGC CGACTGCGAC 1200 CCCAACACCC AGGCTAGCTG TGAGTGCCCT GAAGGCTACA TCCTGGACGA CGGTTTCATC 1260 TGCACGGACA TCGACGAGTGTG CGAAAACGGC GGCTTCTGCT CCGGGGTGTG CCACAACCTC 1320 CCCGGTACCT TCGAGGCCT GCGCGCGCGTGCCTGCGCGCGCACT

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】ヒト肺から精製して得られる、トロンビンによ
るプロテインＣ活性化を促進する作用を有するペプチド
を参考例２において４回目のＤＩＰ−トロンビン−アガ
ロ−スカラムクロマトグラフィーに供した結果を示すグ
ラフである。FIG. 1 shows the results of subjecting a peptide obtained by purifying from human lung, which has the effect of promoting protein C activation by thrombin, to a fourth DIP-thrombin-agarose column chromatography in Reference Example 2. It is a graph.

【図２】参考例３−（２）で得られる、ＤＮＡ断片ＴＭ
１３の塩基配列を示すものである。FIG. 2 shows a DNA fragment TM obtained in Reference Example 3- (2).
13 shows the base sequence of No. 13.

【図３】図２に続くＤＮＡ断片ＴＭ１３の塩基配列を示
すものである。FIG. 3 shows the nucleotide sequence of DNA fragment TM13 following FIG. 2.

【図４】参考例３−（５）で得られる、ＤＮＡ断片ＴＭ
１３７の塩基配列を示すものである。FIG. 4 shows a DNA fragment TM obtained in Reference Example 3- (5).
137 shows the base sequence of 137.

【図５】図４に続くＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配列を
示すものである。FIG. 5 shows the nucleotide sequence of DNA fragment TM137 following FIG. 4;

【図６】図５に続くＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配列を
示すものである。FIG. 6 shows the nucleotide sequence of DNA fragment TM137 following FIG. 5;

【図７】図６に続くＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配列を
示すものである。FIG. 7 shows the nucleotide sequence of DNA fragment TM137 following FIG. 6;

【図８】参考例３−（７）で得られる、ＤＮＡ断片ＴＭ
Ｐ５の塩基配列を示すものである。FIG. 8 shows a DNA fragment TM obtained in Reference Example 3- (7).
It shows the nucleotide sequence of P5.

【図９】図８に続くＤＮＡ断片ＴＰＭ５の塩基配列を示
すものである。FIG. 9 shows the nucleotide sequence of DNA fragment TPM5 following FIG.

【図１０】参考例３−（１０）で得られる、ＤＮＡ断片
ＴＭＰ２６の塩基配列を示すものである。FIG. 10 shows the nucleotide sequence of DNA fragment TMP26 obtained in Reference Example 3- (10).

【図１１】ＤＮＡ断片ＴＭＰ１３、ＴＭ１３７、ＴＭＰ
５およびＴＭＰ２６と参考例３−（１３−１）及び３−
（１３−２）で得られるＤＮＡ断片ＴＭＪ１とＴＭＪ２
の各制限酵素地図と、これらのＤＮＡ断片の有する塩基
配列における対応関係を示すものであり、縦方向にみて
各ＤＮＡ断片の互いに重なる部分は共通の塩基配列を有
することを示す。図中ＤＮＡ断片ＴＭＪ２の制限酵素地
図の斜線部分は斜交線部分とを含む部分は考えられるオ
ープンリーディングフレームであり、斜交線部分に本発
明の塩基配列が存在するものである。FIG. 11 shows DNA fragments TMP13, TM137 and TMP.
5 and TMP26 and Reference Examples 3- (13-1) and 3-
DNA fragments TMJ1 and TMJ2 obtained in (13-2)
1 shows the corresponding relationship between the restriction enzyme maps and the base sequences of these DNA fragments, and shows that the overlapping portions of the DNA fragments in the vertical direction have a common base sequence. In the figure, the hatched portion of the restriction enzyme map of the DNA fragment TMJ2 includes the open reading frame which can be considered as an open reading frame, and the base sequence of the present invention is present in the hatched portion.

【図１２】ＴＭＪ１とそれに結合したＴＭＰ５を含有す
るプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ１の構築を示すフローチ
ャートである。FIG. 12 is a flow chart showing the construction of plasmid pUC18TMJ1 containing TMJ1 and TMP5 bound thereto.

【図１３】ＴＭＪ１とそれに結合したＴＭＰ２６を含有
するプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ２の構築を示すフロー
チャートである。FIG. 13 is a flow chart showing construction of plasmid pUC18TMJ2 containing TMJ1 and TMP26 bound thereto.

【図１４】ＴＭＪ２を動物細胞宿主用発現ベクターに挿
入することによりプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２の構築を
示すフローチャートである。FIG. 14 is a flowchart showing the construction of plasmid pSV2TMJ2 by inserting TMJ2 into an expression vector for an animal cell host.

【図１５】実施例１−（２）−（ａ）で得られた組換え
体プラスミドＭ−１３ｍｐ１９ＴＭＪ３にディリーター
ＴＭＤが相補的にハイブリダイズしたところを示すもの
であり、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズし
ている部分の周辺の塩基配列とそれによってコードされ
ているアミノ酸配列を示すものである。FIG. 15 shows that the releaser TMD hybridized complementarily to the recombinant plasmid M-13mp19TMJ3 obtained in Example 1- (2)-(a), in which the releaser hybridized to the plasmid. This shows the base sequence around the portion and the amino acid sequence encoded thereby.

【図１６】実施例１−（２）−（ｂ）で得られた組換え
体プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１にディリーターＴＭｄ2
が相補的にハイブリダイズしたところを示すものであ
り、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズしてい
る部分の周辺の塩基配列とそれによってコードされてい
るアミノ酸配列を示すものである。FIG. 16 shows that the recombinant plasmid pSV2TMD1 obtained in Example 1- (2)-(b) was replaced with the releaser TMd 2.
Shows the base sequence hybridizing complementarily, and the nucleotide sequence around the portion where the releaser hybridizes to the plasmid and the amino acid sequence encoded thereby.

【図１７】実施例１−（２）−（ａ）で得られた組換え
体プラスミドＭ−１３ｍｐ１９ＴＭＪ３にディリーター
ＴＭｄ3が相補的にハイブリダイズしたところを示すも
のであり、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズ
している部分の周辺の塩基配列とそれによってコードさ
れているアミノ酸配列を示すものである。[17] Example 1- (2) - deleter over TMd 3 in the recombinant plasmid M-13mp19TMJ3 obtained in (a) is intended to indicate a place where hybridized complementary, hybridized deleter over within plasmid This shows the base sequence around the part shown in the figure and the amino acid sequence encoded thereby.

【図１８】実施例１−（４）−（ａ）で得られた組換え
体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３にディリーターＴＭｄ2
が相補的にハイブリダイズしたところを示すものであ
り、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズしてい
る部分の周辺の塩基配列とそれによってコードされてい
るアミノ酸配列を示すものである。FIG. 18 shows that the recombinant plasmid M13-TMD3 obtained in Example 1- (4)-(a) has a deleter TMd 2
Shows the base sequence hybridizing complementarily, and the nucleotide sequence around the portion where the releaser hybridizes to the plasmid and the amino acid sequence encoded thereby.

【図１９】実施例１−（４）−（ａ）で得られた組換え
体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３にディリーターＴＭｄ4
が相補的にハイブリダイズしたところを示すものであ
り、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズしてい
る部分の周辺の塩基配列とそれによってコードされてい
るアミノ酸配列を示すものである。FIG. 19 shows that the recombinant plasmid M13-TMD3 obtained in Example 1- (4)-(a) has a deleter TMd 4
Shows the base sequence hybridizing complementarily, and the nucleotide sequence around the portion where the releaser hybridizes to the plasmid and the amino acid sequence encoded thereby.

【図２０】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡであるプ
ラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ５−１の構築を示すフローチ
ャートである。FIG. 20 is a flowchart showing the construction of plasmid pdBPVTMD5-1, which is a replicable recombinant DNA of the present invention.

【図２１】図２０に続く複製可能可能な組換え体ＤＮＡ
であるプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ５−１の構築を示す
フローチャートである。FIG. 21 shows a replicable recombinant DNA following FIG. 20.
It is a flowchart which shows the construction of plasmid pdBPVTMD5-1.

【図２２】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡであるプ
ラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ４−１の構築を示すフローチ
ャートである。FIG. 22 is a flow chart showing the construction of plasmid pdBPVTMD4-1, which is a replicable recombinant DNA of the present invention.

【図２３】図２２に続く複製可能な組換え体ＤＮＡであ
るプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ４−１の構築を示すフロ
ーチャートである。FIG. 23 is a flowchart showing the construction of plasmid pdBPVTMD4-1, which is a replicable recombinant DNA, following FIG. 22.

【図２４】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡであるプ
ラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ２−１の構築を示すフローチ
ャートである。FIG. 24 is a flowchart showing the construction of a plasmid pdBPVTMD2-1 which is a replicable recombinant DNA of the present invention.

【図２５】図２４に続く複製可能な組換え体ＤＮＡであ
るプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ２−１の構築を示すフロ
ーチャートである。FIG. 25 is a flow chart showing the construction of plasmid pdBPVTMD2-1 which is a replicable recombinant DNA following FIG. 24.

【図２６】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡであるプ
ラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ１−１の構築を示すフローチ
ャートである。FIG. 26 is a flow chart showing the construction of plasmid pdBPVTMD1-1, which is a replicable recombinant DNA of the present invention.

【図２７】図２６に続く複製可能な組換え体ＤＮＡであ
るプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ１−１の構築を示すフロ
ーチャートである。FIG. 27 is a flowchart showing the construction of plasmid pdBPVTMD1-1, which is a replicable recombinant DNA, following FIG. 26.

【図２８】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡであるプ
ラスミドｐｄＢＰＶＴＭＪ２−１の構築を示すフローチ
ャートである。FIG. 28 is a flowchart showing the construction of plasmid pdBPVTMJ2-1, which is a replicable recombinant DNA of the present invention.

【図２９】図２８に続く複製可能な組換え体ＤＮＡであ
るプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＪ２−１の構築を示すフロ
ーチャートである。FIG. 29 is a flowchart showing the construction of plasmid pdBPVTMJ2-1, which is a replicable recombinant DNA, following FIG. 28.

【図３０】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。FIG. 30 shows that the cells transformed with plasmid pSV2TMD5 were cultured and purified, and the amount and reaction time of activated protein C generated by the reaction of protein C with thrombin in the presence and absence of the obtained peptide. 6 is a graph showing the relationship of.

【図３１】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。FIG. 31 shows the results of culturing and purifying cells transformed with the plasmid pSV2TMD4, the amount of activated protein C generated by the reaction of protein C with thrombin, and the reaction time in the presence and absence of the obtained peptide. 6 is a graph showing the relationship of.

【図３２】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。FIG. 32 shows the results of culturing and purifying cells transformed with the plasmid pSV2TMD2, the amount of activated protein C produced by the reaction of protein C with thrombin, and the reaction time in the presence and absence of the obtained peptide. 6 is a graph showing the relationship of.

【図３３】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。FIG. 33 shows the results of culturing and purifying cells transformed with plasmid pSV2TMD1, the amount of activated protein C produced by the reaction of protein C with thrombin, and the reaction time in the presence and absence of the obtained peptide. 6 is a graph showing the relationship of.

【図３４】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。FIG. 34 shows that the cells transformed with plasmid pSV2TMJ2 were cultured and purified, and the amount and reaction time of activated protein C generated by the reaction of protein C with thrombin in the presence and absence of the obtained peptide. 6 is a graph showing the relationship of.

【図３５】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。FIG. 35 is a graph showing the relationship between the clotting time of blood obtained by culturing and purifying cells transformed with plasmid pSV2TMD5 and the obtained peptide and the amount of the purified peptide of the present invention added.

【図３６】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。FIG. 36 is a graph showing the relationship between the coagulation time of blood obtained by culturing and purifying cells transformed with the plasmid pSV2TMD4 and adding the obtained peptide, and the amount of the purified peptide of the present invention added.

【図３７】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。FIG. 37 is a graph showing the relationship between the clotting time of blood obtained by culturing and purifying cells transformed with plasmid pSV2TMD2 and the obtained peptide and the amount of the purified peptide of the present invention added.

【図３８】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。FIG. 38 is a graph showing the relationship between the clotting time of blood obtained by culturing and purifying cells transformed with the plasmid pSV2TMD1 and adding the obtained peptide and the amount of the purified peptide of the present invention added.

【図３９】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。FIG. 39 is a graph showing the relationship between the clotting time of blood obtained by culturing and purifying cells transformed with plasmid pSV2TMJ2 and the obtained peptide and the amount of the purified peptide of the present invention added.

【図４０】ＤＮＡ断片ＴＭＪ２の制限酵素地図である。
図中、斜線部分と斜交線部分とを含む部分は考えられる
オープンリーディングフレームであり、斜交線部分に本
発明のペプチドをコードする塩基配列が存在するもので
ある。FIG. 40 is a restriction map of a DNA fragment TMJ2.
In the figure, the portion containing the hatched portion and the oblique line portion is a possible open reading frame, in which the nucleotide sequence encoding the peptide of the present invention exists in the oblique line portion.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 特願昭62−305876 (32)優先日 昭62(1987)12月４日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願昭62−305877 (32)優先日 昭62(1987)12月４日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願昭62−305878 (32)優先日 昭62(1987)12月４日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (56)参考文献 特開 昭62−169728（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−503757（ＪＰ，Ａ) Ｊ．ＣＬＩＮ．ＩＮＶＥＳＴ．ＶＯ Ｌ．76，（1985）ＰＰ．2178−2181 ＴＨＥ ＥＭＢＯ ＪＯＵＲＮＡ Ｌ．，ＶＯＬ．６，ＮＯ．７（1987）Ｐ Ｐ．1891−1897──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification symbol FI C12P 21/02 C12N 5/00 B // (C12N 5/10 C12R 1:91) (C12P 21/02 C12R 1:91) ( 31) Priority claim number Japanese Patent Application No. 62-305876 (32) Priority date December 4, 1987 (1987) (33) Country claiming priority Japan (JP) (31) Priority claim number Japanese Patent Application No. 62-305877 (32) Priority date December 4, 1987 (1987) (33) Priority country Japan (JP) (31) Priority claim number Japanese Patent Application No. 62-305878 (32) Priority date December 1987 (1987) 4th (33) Priority Country Japan (JP) (56) References JP-A-62-169728 (JP, A) JP-A-3-5033757 (JP, A) CLIN. INVEST. VOL. 76, (1985) PP. 2178-2181 THE EMBO JOURNA L. , VOL. 6, NO. 7 (1987) P.P. 1891-1897

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 配列番号７の１−５７５のアミノ酸配
列、または該アミノ酸配列のアミノ酸残基の置換、挿入
または欠失を施すことにより得られるアミノ酸配列を有
し、且つ下記（ａ）、（ｂ）、（ｄ）〜（ｆ）に規定さ
れる組換えペプチドであって、少なくとも該組換えペプ
チド中に、ヒト由来の夾雑成分を実質的に含有しないこ
とを特徴とする実質的に精製された組換えペプチド（但
し、該ペプチドが配列番号３の１−４９８のアミノ酸配
列からなるペプチドである場合を除く）。 （ａ）トロンビンに結合し、 （ｂ）トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進す
る作用を有する、 （ｄ）トロンビンによる凝固時間を延長する、 （ｅ）トロンビンによる血小板凝集を抑制する、 （ｆ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にて、銀染色
が可能である。(1) an amino acid sequence from 1 to 575 of SEQ ID NO: 7;
Substitution or insertion of amino acid residues in the sequence or the amino acid sequence
Or has an amino acid sequence obtained by making a deletion.
And defined in the following (a), (b), (d) to (f).
At least the recombinant peptide
Pride should be substantially free of human-derived contaminants.
A substantially purified recombinant peptide, characterized in that
And the peptide is an amino acid sequence of 1-498 of SEQ ID NO: 3.
Except for peptides consisting of columns) . (A ) binds to thrombin ; ( b) promotes protein C activation by thrombin
Has the effect that, (d) extending the coagulation time by thrombin, inhibiting platelet aggregation by (e) thrombin at the (f) SDS-polyacrylamide gels, silver staining
Is possible . 【請求項２】 該組換えペプチドが、（ｃ）少なくとも
界面活性剤の非存在下で可溶性である可溶性ペプチドで
あることを特徴とする請求項１に記載の組換えペプチ
ド。2. The recombinant peptide according to claim 1 , wherein (c) at least
A soluble peptide that is soluble in the absence of a surfactant
The recombinant peptide according to claim 1, wherein
De . 【請求項３】 該組換えペプチドが、配列番号３の１−
４９８のアミノ酸配列のアミノ酸残基の置換、挿入また
は欠失を施すことにより得られるアミノ酸配列を有する
ことを特徴とする請求項１または２に記載の組換えペプ
チド。3. The recombinant peptide according to claim 1, wherein
Substitution, insertion or substitution of amino acid residues in the amino acid sequence of 498
Has an amino acid sequence obtained by making a deletion
The recombinant peptide according to claim 1 or 2, wherein
Chid . 【請求項４】 該組換えペプチドが、 （ｉ）配列番号８の１−２７２のアミノ酸配列におい
て、少なくとも該配列番号８の１１９−２３６のアミノ
酸配列を包含するように該配列番号８のＮ末端及び／又
はＣ末端の任意の個数のアミノ酸残基が削除されていて
もよいアミノ酸配列からなるトロンビンに結合し、トロ
ンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有
する組換えペプチド、 （ii) 前記（ｉ）に記載の組換えペプチドのアミノ酸配
列のアミノ酸残基の置換、挿入または欠失を施すことに
より得られるアミノ酸配列からなり、且つトロン ビンに
結合し、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進
する作用を有する組換えペプチド、のいずれかであるこ
とを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の組換え
ペプチド。4. The recombinant peptide according to claim 1, wherein ( i) the amino acid sequence of 1-272 of SEQ ID NO: 8
At least the amino acids 119-236 of SEQ ID NO: 8
The N-terminus of SEQ ID NO: 8 and / or to include an acid sequence
Has any number of C-terminal amino acid residues deleted
Binds to thrombin consisting of a good amino acid sequence,
Has the effect of promoting the activation of protein C by
Recombinant peptides, (ii) amino acid distribution of the recombinant peptide according to the (i)
Substituting, inserting or deleting amino acid residues in a sequence
It consists of more the resulting amino acid sequence, and to thrombin
Binds and promotes protein C activation by thrombin
Recombinant peptide that has the action of
The recombination according to any one of claims 1 to 3, wherein
Peptide . 【請求項５】 下記（ａ）〜（ｇ）に規定される実質的
に精製された可溶性ペプチド（但し、該ペプチドが配列
番号３の１−４９８のアミノ酸配列からなるペプチドで
ある場合を除く）。 （ａ）トロンビンに結合し、 （ｂ）トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進す
る作用を有する、 （ｃ）少なくとも界面活性剤の非存在下で可溶性であ
る、 （ｄ）トロンビンによる凝固時間を延長する、 （ｅ）トロンビンによる血小板凝集を抑制する、 （ｆ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にて、銀染色
が可能である、 （ｇ）該可溶性ペプチドのアミノ酸配列の相同性が、該
アミノ酸配列の範囲において、下記の制限酵素地図 【化１】 に示された制限酵素サイトを有することにより特徴付け
られるヒト由来のＤＮＡがコードし得るトロンビンに結
合し、かつトロンビンによるプロテインＣの活性化を促
進する作用を有するペプチドのアミノ酸配列と完全に一
致する相同性を有する。5. Substantially defined in the following (a) to (g)
Purified peptide (provided that the peptide has the sequence
A peptide consisting of the amino acid sequence of 1-498 of No. 3
Unless there is) . (A ) binds to thrombin ; ( b) promotes protein C activation by thrombin
It has the effect that, soluble der absence of at least a surfactant (c)
That, (d) extending the coagulation time by thrombin, inhibiting platelet aggregation by (e) thrombin at the (f) SDS-polyacrylamide gels, silver staining
Is possible, (g) the amino acid sequence homology of the soluble peptide, the
In the range of amino acid sequence, the following restriction map is shown. Characterized by having the restriction enzyme site shown in
DNA that can be encoded by human
And promotes activation of protein C by thrombin
Completely identical to the amino acid sequence of the peptide
Has matching homology . 【請求項６】 該可溶性ペプチドがＤＩＰ−トロンビン
−アガロースカラムに結合せしめたときに、１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ベンズアミジン
塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）ポリドカノールを含む０．０
２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）により溶出できる
性質、又は、該可溶性ペプチドが、０ ．１Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ 2 、０．５％（ｖ／ｖ）ポリ
ドカノールを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）により平衡化したＤＩＰ−トロンビン−アガロ
ースカラムに、該緩衝液にて該可溶性ペプチドを溶解せ
しめた溶液を接触せしめた場合に、該可溶性ペプチドが
前記カラムに結合せしめることができる性質を有するこ
とを特徴とする請求項５に記載の可溶性ペプチド。6. The method according to claim 6, wherein the soluble peptide is DIP-thrombin.
-1 M Na when bound to an agarose column
Cl, 0.1 mM EDTA, 1 mM benzamidine
Hydrochloric acid, 0.0 containing 0.5% (v / v) polidocanol
Can be eluted with 2M Tris-HCl buffer (pH 7.5)
The nature or the soluble peptide is 0 . 1M NaC
1, 0.5 mM CaCl 2 , 0.5% (v / v) poly
0.02 M Tris-HCl buffer containing docanol (pH
DIP-Thrombin-Agaro equilibrated according to 7.5)
Dissolve the soluble peptide in the buffer
When the solution thus obtained is brought into contact with the solution,
It must have the property of being able to bind to the column.
The soluble peptide according to claim 5, characterized in that: 【請求項７】 該ペプチドが、糖鎖が付いた、又は糖鎖
が付いていないことを特徴とする請求項１〜６のいずれ
かに記載のペプチド。7. The peptide has a sugar chain attached thereto or a sugar chain.
7. Any one of claims 1 to 6, wherein
Or the peptide of
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