JP2746964B2 - ＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法 - Google Patents
ＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法Info
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- JP2746964B2 JP2746964B2 JP63320327A JP32032788A JP2746964B2 JP 2746964 B2 JP2746964 B2 JP 2746964B2 JP 63320327 A JP63320327 A JP 63320327A JP 32032788 A JP32032788 A JP 32032788A JP 2746964 B2 JP2746964 B2 JP 2746964B2
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- dna
- restriction endonuclease
- xba
- restriction
- endonuclease
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
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Description
【発明の詳細な説明】 発明のバックグラウンド 本発明は、制限エンドヌクレアーゼXba Iおよびその
修飾メチラーゼのクローンならびに該クローンからこれ
らの酵素を製造する方法に係る。
修飾メチラーゼのクローンならびに該クローンからこれ
らの酵素を製造する方法に係る。
制限エンドヌクレアーゼは天然の細菌中にみられる酵
素の一群である。制限エンドヌクレアーゼは、夾雑する
他の細菌成分から精製すると、実験室でDNA分子を切断
して各々相応する正確な断片を形成するのに使用するこ
とができる。この性質の故に、DNA分子はひとつずつ独
自に同定することができ、またその構成遺伝子別に分画
することができる。制限エンドヌクレアーゼは現代の遺
伝子研究における不可欠の手段であることが立証されて
いる。これらの酵素は、遺伝子の工学および解析を達成
するのに使用される生化学的な「ハサミ」である。
素の一群である。制限エンドヌクレアーゼは、夾雑する
他の細菌成分から精製すると、実験室でDNA分子を切断
して各々相応する正確な断片を形成するのに使用するこ
とができる。この性質の故に、DNA分子はひとつずつ独
自に同定することができ、またその構成遺伝子別に分画
することができる。制限エンドヌクレアーゼは現代の遺
伝子研究における不可欠の手段であることが立証されて
いる。これらの酵素は、遺伝子の工学および解析を達成
するのに使用される生化学的な「ハサミ」である。
制限エンドヌクレアーゼは、DNA分子上の特定のヌク
レオチド配列（いわゆる「認識配列」）を認識してこれ
に結合多することによって作用する。これらの酵素はDN
A分子に結合すると、認識配列の内部または一端でその
分子を開裂する。異なる制限エンドヌクレアーゼはそれ
ぞれ異なる認識配列に対して親和力をもっている。今日
までに調べられた幾百種もの細菌で百を越える数の異な
る制限エンドヌクレアーゼが同定されている。
レオチド配列（いわゆる「認識配列」）を認識してこれ
に結合多することによって作用する。これらの酵素はDN
A分子に結合すると、認識配列の内部または一端でその
分子を開裂する。異なる制限エンドヌクレアーゼはそれ
ぞれ異なる認識配列に対して親和力をもっている。今日
までに調べられた幾百種もの細菌で百を越える数の異な
る制限エンドヌクレアーゼが同定されている。
通常細菌は、その種毎に、小数の制限エンドヌクレア
ーゼをもつのみである。これらのエンドヌクレアーゼは
それの由来となった細菌に因んで命名される。たとえ
ば、Haemophilus aegyptiusはHae I、Hae IIおよびHae
IIIと呼ばれる３つの異なる制限エンドヌクレアーゼを
合成する。これらの酵素は、それぞれ（AT）GGCC（A
T）、PuGCGCPyおよびGGCCという配列を認識して開裂す
る。一方、大腸菌Escherichia coli RY13は唯１種類の
酵素EcoR Iを合成するだけであり、この酵素はGAATTCと
いう配列を認識する。
ーゼをもつのみである。これらのエンドヌクレアーゼは
それの由来となった細菌に因んで命名される。たとえ
ば、Haemophilus aegyptiusはHae I、Hae IIおよびHae
IIIと呼ばれる３つの異なる制限エンドヌクレアーゼを
合成する。これらの酵素は、それぞれ（AT）GGCC（A
T）、PuGCGCPyおよびGGCCという配列を認識して開裂す
る。一方、大腸菌Escherichia coli RY13は唯１種類の
酵素EcoR Iを合成するだけであり、この酵素はGAATTCと
いう配列を認識する。
理論にとらわれるつもりはないが、制限エンドヌクレ
アーゼは自然界で細菌細胞の繁殖に関して防衛的な役割
を果たしていると考えられる。これらの酵素のおかげ
で、細菌は、もしこれらの酵素がなければこれらの細菌
を殺したりまたはこれらに寄生したりすることになるウ
ィルスやプラスミドのような外来DNA分子による感染に
対して抵抗することが可能になる。制限エンドヌクレア
ーゼは、侵入して来るDNA分子に結合し、それぞれの認
識配列に出合う度毎にそれらのDNA分子を開裂すること
によって、細菌に抵抗性を付与する。こうして生起する
破壊作用の結果、侵入する感染性の遺伝子の多くは不活
化され、そのDNAはエキソヌクレアーゼによってさらに
細かく分解されることになる。
アーゼは自然界で細菌細胞の繁殖に関して防衛的な役割
を果たしていると考えられる。これらの酵素のおかげ
で、細菌は、もしこれらの酵素がなければこれらの細菌
を殺したりまたはこれらに寄生したりすることになるウ
ィルスやプラスミドのような外来DNA分子による感染に
対して抵抗することが可能になる。制限エンドヌクレア
ーゼは、侵入して来るDNA分子に結合し、それぞれの認
識配列に出合う度毎にそれらのDNA分子を開裂すること
によって、細菌に抵抗性を付与する。こうして生起する
破壊作用の結果、侵入する感染性の遺伝子の多くは不活
化され、そのDNAはエキソヌクレアーゼによってさらに
細かく分解されることになる。
細菌の防御系の第二の要素は修飾メチラーゼである。
これらの酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的であ
り、これらが提供する手段によって、細菌は外来の感染
性DNAから自身のDNAを区別し防御できるようになる。修
飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ
ヌクレオチド認識配列を認識してそれに結合するが、こ
のDNAを破断する代わりに、メチル基を付加することに
よってその認識配列内のヌクレオチドのいずれかを化学
的に修飾する。このメチル化が起こると、制限エンドヌ
クレアーゼがその認識配列に結合することはなくなり、
また、その配列が制限エンドヌクレアーゼによって開裂
されることもなくなる。細菌細胞のDNAはその修飾メチ
ラーゼの活性のおかげでいつも充分に修飾されており、
したがって内因性の制限エンドヌクレアーゼの存在に対
する感受性を全くもたない。制限エンドヌクレアーゼの
認識と攻撃に対して感受性のあるのは未修飾のDNA、し
たがって外来のものであることが確認できるDNAだけで
ある。
これらの酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的であ
り、これらが提供する手段によって、細菌は外来の感染
性DNAから自身のDNAを区別し防御できるようになる。修
飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ
ヌクレオチド認識配列を認識してそれに結合するが、こ
のDNAを破断する代わりに、メチル基を付加することに
よってその認識配列内のヌクレオチドのいずれかを化学
的に修飾する。このメチル化が起こると、制限エンドヌ
クレアーゼがその認識配列に結合することはなくなり、
また、その配列が制限エンドヌクレアーゼによって開裂
されることもなくなる。細菌細胞のDNAはその修飾メチ
ラーゼの活性のおかげでいつも充分に修飾されており、
したがって内因性の制限エンドヌクレアーゼの存在に対
する感受性を全くもたない。制限エンドヌクレアーゼの
認識と攻撃に対して感受性のあるのは未修飾のDNA、し
たがって外来のものであることが確認できるDNAだけで
ある。
遺伝子工学技術の出現によって、今では、遺伝子をク
ローニングし、その遺伝子がコードしているタンパク質
や酵素を従来の精製技術で取得可能な量より大量に生産
することが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
のクローンを単離する際の鍵は、そのようなクローンの
出現頻度が10-3〜10-4程度に低い場合、複雑な「ライブ
ラリー」、すなわち「ショットガン」法で得られるクロ
ーンの集団の中で目的とするクローンを同定するための
簡単で信頼のおける方法を開発することである。好まし
くは、この方法は、目的としない大多数のクローンは死
滅するが珍にある望ましいクローンは生き残れるよう
に、選択的なものとするべきである。
ローニングし、その遺伝子がコードしているタンパク質
や酵素を従来の精製技術で取得可能な量より大量に生産
することが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
のクローンを単離する際の鍵は、そのようなクローンの
出現頻度が10-3〜10-4程度に低い場合、複雑な「ライブ
ラリー」、すなわち「ショットガン」法で得られるクロ
ーンの集団の中で目的とするクローンを同定するための
簡単で信頼のおける方法を開発することである。好まし
くは、この方法は、目的としない大多数のクローンは死
滅するが珍にある望ましいクローンは生き残れるよう
に、選択的なものとするべきである。
II型の制限−修飾系は今もクローニングされており、
その数は次第に増加している。最初にクローニングされ
た系では、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定また
は選択する手段としてバクテリオファージによる感染が
使用された［Hha II:Mann et al.,Gene,3:97−112（197
8）;EcoR II:Kosykh et al.,Molec.gen.Genet.,178:717
−719（1980）;Pst I:Walder et al.,Proc.Nat.Acad.Sc
i.USA,78,1503−1507（1981）］。細菌中に制限−修飾
系が存在すると細菌はバクテリオファージによる感染に
対して抵抗できるので、クローニングされた制限−修飾
遺伝子を担持する細胞は、原則として、ファージに暴露
されたライブラリーから生えて来る（生き残る）株とし
て選択的に単離することができる。しかしこの方法は限
られた価値しかないことが判明した。すなわち、クロー
ニングされた制限−修飾遺伝子は、選択的な生き残りを
可能にする程に充分なファージ耐性を常に発現するとは
限らないことが判明したのである。
その数は次第に増加している。最初にクローニングされ
た系では、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定また
は選択する手段としてバクテリオファージによる感染が
使用された［Hha II:Mann et al.,Gene,3:97−112（197
8）;EcoR II:Kosykh et al.,Molec.gen.Genet.,178:717
−719（1980）;Pst I:Walder et al.,Proc.Nat.Acad.Sc
i.USA,78,1503−1507（1981）］。細菌中に制限−修飾
系が存在すると細菌はバクテリオファージによる感染に
対して抵抗できるので、クローニングされた制限−修飾
遺伝子を担持する細胞は、原則として、ファージに暴露
されたライブラリーから生えて来る（生き残る）株とし
て選択的に単離することができる。しかしこの方法は限
られた価値しかないことが判明した。すなわち、クロー
ニングされた制限−修飾遺伝子は、選択的な生き残りを
可能にする程に充分なファージ耐性を常に発現するとは
限らないことが判明したのである。
もうひとつ別のクローニング法では、最初プラスミド
由来とされていた系をＥ．coliクローニングプラスミド
中に組み込んでいる［EcoR V:Bougueleret et al.,Nucl
eic Acids Res.,12:3659−3676（1984）;PaeR7:Gingera
s and Brooks,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:402−406（1
983）;Theriault and Roy,Gene,19:355−359（1982）;P
vu II:Blementhal et al.,J.Bacteriol.,164:501−509
（1985）］。
由来とされていた系をＥ．coliクローニングプラスミド
中に組み込んでいる［EcoR V:Bougueleret et al.,Nucl
eic Acids Res.,12:3659−3676（1984）;PaeR7:Gingera
s and Brooks,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:402−406（1
983）;Theriault and Roy,Gene,19:355−359（1982）;P
vu II:Blementhal et al.,J.Bacteriol.,164:501−509
（1985）］。
第三の方法としてますます多くの系のクローニングに
使用されている方法では、本発明者らの特許出願第7070
79号に関連する活性なメチラーゼ遺伝子について選択す
る［BsuR I:Kiss et al.,Nucleic Acids Res.,13:6403
−6421（1985）］。制限遺伝子と修飾遺伝子とは近接し
て存在する傾向がるので、両方の遺伝子を含有するクロ
ーンは一方の遺伝子について選択するだけで単離できる
ことが多い。しかし、メチル化活性による選択では完全
な制限−修飾系が必ず得られるというわけではなく、逆
に、メチラーゼ遺伝子のみが得られることもある［BspR
I:Szomolanyi et al.,Gene,10:219−225（1980）;Bcn
I:Janulaitis et al.,Gene,20:197−204（1982）;BsuR
I:Kiss and Baldauf,Gene,21:111−119（1983）；およ
びMsp I:Walder et al.,J.Biol.Chem.,258:1235−1241
（1983）］。
使用されている方法では、本発明者らの特許出願第7070
79号に関連する活性なメチラーゼ遺伝子について選択す
る［BsuR I:Kiss et al.,Nucleic Acids Res.,13:6403
−6421（1985）］。制限遺伝子と修飾遺伝子とは近接し
て存在する傾向がるので、両方の遺伝子を含有するクロ
ーンは一方の遺伝子について選択するだけで単離できる
ことが多い。しかし、メチル化活性による選択では完全
な制限−修飾系が必ず得られるというわけではなく、逆
に、メチラーゼ遺伝子のみが得られることもある［BspR
I:Szomolanyi et al.,Gene,10:219−225（1980）;Bcn
I:Janulaitis et al.,Gene,20:197−204（1982）;BsuR
I:Kiss and Baldauf,Gene,21:111−119（1983）；およ
びMsp I:Walder et al.,J.Biol.Chem.,258:1235−1241
（1983）］。
制限−修飾遺伝子のクローニングに対する基本的な障
害は、修飾によって保護されていない宿主中にエンドヌ
クレアーゼ遺伝子を導入しようとすることにある。メチ
ラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを一緒に単
一のクローンとして導入すると、エンドヌクレアーゼが
宿主DNAを開裂する機会を得る前にメチラーゼがそのDNA
を修飾して保護するはずである。したがって、場合によ
っては、これらの遺伝子は順番（すなわち、最初にメチ
ラーゼ、次にエンドヌクレアーゼの順）にのみクローニ
ングが可能となるかもしれない。制限−修飾系をクロー
ニングする際のもうひとつ別の障害は、ある種のE.coli
株がシトシン修飾に対して逆の反応をするという発見に
ある。すなわち、そのような株は、メチル化シトシンを
含有するDNAを破壊する系をもっているのである［Ralei
gh and Wilson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:9070−9074
（1986）］。これらの株では、シトシン特異的メチラー
ゼ遺伝子を、単独でも、あるいはその対応するエンドヌ
クレアーゼ遺伝子と共にでも、容易にクローニングする
ことはできない。この問題を避けるためには、これらの
系を欠損しているＥ．coli変異株（McrA-およびMcrB-）
を使用する必要がある。
害は、修飾によって保護されていない宿主中にエンドヌ
クレアーゼ遺伝子を導入しようとすることにある。メチ
ラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを一緒に単
一のクローンとして導入すると、エンドヌクレアーゼが
宿主DNAを開裂する機会を得る前にメチラーゼがそのDNA
を修飾して保護するはずである。したがって、場合によ
っては、これらの遺伝子は順番（すなわち、最初にメチ
ラーゼ、次にエンドヌクレアーゼの順）にのみクローニ
ングが可能となるかもしれない。制限−修飾系をクロー
ニングする際のもうひとつ別の障害は、ある種のE.coli
株がシトシン修飾に対して逆の反応をするという発見に
ある。すなわち、そのような株は、メチル化シトシンを
含有するDNAを破壊する系をもっているのである［Ralei
gh and Wilson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:9070−9074
（1986）］。これらの株では、シトシン特異的メチラー
ゼ遺伝子を、単独でも、あるいはその対応するエンドヌ
クレアーゼ遺伝子と共にでも、容易にクローニングする
ことはできない。この問題を避けるためには、これらの
系を欠損しているＥ．coli変異株（McrA-およびMcrB-）
を使用する必要がある。
精製した制限エンドヌクレアーゼ、および重要性はそ
れより落ちるが修飾メチラーゼは、実験室でDNAの特性
決定と再配列をするのに有用な道具であるから、これら
の酵素を大量に合成する細菌株を組換えDNA技術によっ
て得ることは商業上大いに魅力がある。そのような株が
得られれば、商業的に有用な量で生産するための手段が
提供されるばかりでなく精製の作業も簡単になると思わ
れるので、これらの株は極めて有用なものとなろう。
れより落ちるが修飾メチラーゼは、実験室でDNAの特性
決定と再配列をするのに有用な道具であるから、これら
の酵素を大量に合成する細菌株を組換えDNA技術によっ
て得ることは商業上大いに魅力がある。そのような株が
得られれば、商業的に有用な量で生産するための手段が
提供されるばかりでなく精製の作業も簡単になると思わ
れるので、これらの株は極めて有用なものとなろう。
発明の概要 本発明によって、Xanthomonas badrii（ATCC11672）
に由来するXba I制限エンドヌクレアーゼおよび修飾メ
チラーゼの遺伝子を含有するクローン、ならびにこれら
の酵素の生産方法が提供される。より特定すると、本発
明は、TCTAGAというDNA配列を認識してＴとＣの間で開
裂する酵素である制限エンドヌクレアーゼXba Iを発現
するクローンに係る。Zain and Roberts,J.Mol.Biol.,1
15:249−255（1977）参照（その開示内容は、ここで引
用したことによって本明細書中に含まれるものとす
る）。本発明に従って生産されるXba I制限エンドヌク
レアーゼはXanthomonas badriiから作成したXba I調製
物中にみられる夾雑物を含んでいない。
に由来するXba I制限エンドヌクレアーゼおよび修飾メ
チラーゼの遺伝子を含有するクローン、ならびにこれら
の酵素の生産方法が提供される。より特定すると、本発
明は、TCTAGAというDNA配列を認識してＴとＣの間で開
裂する酵素である制限エンドヌクレアーゼXba Iを発現
するクローンに係る。Zain and Roberts,J.Mol.Biol.,1
15:249−255（1977）参照（その開示内容は、ここで引
用したことによって本明細書中に含まれるものとす
る）。本発明に従って生産されるXba I制限エンドヌク
レアーゼはXanthomonas badriiから作成したXba I調製
物中にみられる夾雑物を含んでいない。
この酵素をクローニングする好ましい方法は、X.badr
iiに由来するDNaを含有するライブラリーを形成し、Xba
I修飾メチラーゼ遺伝子を含有するクローンを単離し、
これらをスクリーニングして、Xba I制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子も共に含有しているクローンを同定するこ
とからなる。
iiに由来するDNaを含有するライブラリーを形成し、Xba
I修飾メチラーゼ遺伝子を含有するクローンを単離し、
これらをスクリーニングして、Xba I制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子も共に含有しているクローンを同定するこ
とからなる。
発明の詳細な説明 本発明は、Xba I制限および修飾遺伝子のクローン、
ならびにそのようなクローンによって生産される制限エ
ンドヌクレアーゼXba Iに係る。これらのXba I遺伝子
は、Xba I修飾遺伝子を含有し発現することに基づいて
選択したある種のクローンが同時にXba I制限遺伝子も
含有しているという事実を利用する方法によってクロー
ニングされる。そのようなクローンのDNAはXba I制限エ
ンドヌクレアーゼによる消化に対して耐性を示す。この
消化に対する耐性によって、Xba Iメチラーゼおよびエ
ンドヌクレアーゼをコードしているクローンを選択的に
単離するための手段が得られる。
ならびにそのようなクローンによって生産される制限エ
ンドヌクレアーゼXba Iに係る。これらのXba I遺伝子
は、Xba I修飾遺伝子を含有し発現することに基づいて
選択したある種のクローンが同時にXba I制限遺伝子も
含有しているという事実を利用する方法によってクロー
ニングされる。そのようなクローンのDNAはXba I制限エ
ンドヌクレアーゼによる消化に対して耐性を示す。この
消化に対する耐性によって、Xba Iメチラーゼおよびエ
ンドヌクレアーゼをコードしているクローンを選択的に
単離するための手段が得られる。
Xba I制限遺伝子およびメチラーゼ遺伝子をクローニ
ングして発現させるための本発明の好ましい方法を第１
図に示すが、これには以下のステップが含まれる。
ングして発現させるための本発明の好ましい方法を第１
図に示すが、これには以下のステップが含まれる。
（１） Xanthomonas badriiのDNAを精製する。X.badri
iはZain et al.,supraに記載されており、この細菌のサ
ンプルはthe American Type Culture Collectionからカ
タログNo.ATCC 11672として入手可能である。
iはZain et al.,supraに記載されており、この細菌のサ
ンプルはthe American Type Culture Collectionからカ
タログNo.ATCC 11672として入手可能である。
（２） このDNAをHind IIIのような制限エンドヌクレ
アーゼで部分消化する。
アーゼで部分消化する。
（３） 浄化したDNAを、１個以上のXba I部位を含有す
るpUC19（ATCC 37254）のようなクローニングベクター
に連結する。連結したDNAをEscherichia coli RR1株
（ATCC 31343）のような適当な宿主に形質転換する。
るpUC19（ATCC 37254）のようなクローニングベクター
に連結する。連結したDNAをEscherichia coli RR1株
（ATCC 31343）のような適当な宿主に形質転換する。
（４） 形質転換した混合物を、形質転換細胞を選択す
るための抗生物質アンピシリンのような薬剤を存在させ
て30℃で増殖させる。培養後形質転換コロニーを集めて
セルライブラリーとする。
るための抗生物質アンピシリンのような薬剤を存在させ
て30℃で増殖させる。培養後形質転換コロニーを集めて
セルライブラリーとする。
（５） このセルライブラリーから組換えプラスミドを
そっくり全部精製してプラスミドライブラリーを作成す
る。
そっくり全部精製してプラスミドライブラリーを作成す
る。
（６） このプラスミドライブラリーをX.badriiから調
製したXba I制限エンドヌクレアーゼで完全に消化す
る。Xba I消化により未修飾のクローンが特異的に破壊
され、Xba Iメチラーゼクローンの相対頻度が増大す
る。
製したXba I制限エンドヌクレアーゼで完全に消化す
る。Xba I消化により未修飾のクローンが特異的に破壊
され、Xba Iメチラーゼクローンの相対頻度が増大す
る。
（７） 消化したプラスミドライブラリーをＥ．coli R
R1のような適当な宿主に再度形質転換し、選択培地に接
種して形質転換体を回収する。これらのコロニーを採取
し、そのDNAをXba I修飾遺伝子の存在について分析す
る。すなわち、コロニーが担持するプラスミドDNAを精
製し、Xba I制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベ
ートして消化に対して抵抗性か否かを決定する。また、
全細胞DNA（染色体およびプラスミド）も精製してXba I
制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベートする。Xb
a I修飾遺伝子を担持するクローンのDNAは充分に修飾さ
れているはずであり、プラスミドDNAと全DNAは両方とも
消化に対して実質的に抵抗性であるはずである。
R1のような適当な宿主に再度形質転換し、選択培地に接
種して形質転換体を回収する。これらのコロニーを採取
し、そのDNAをXba I修飾遺伝子の存在について分析す
る。すなわち、コロニーが担持するプラスミドDNAを精
製し、Xba I制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベ
ートして消化に対して抵抗性か否かを決定する。また、
全細胞DNA（染色体およびプラスミド）も精製してXba I
制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベートする。Xb
a I修飾遺伝子を担持するクローンのDNAは充分に修飾さ
れているはずであり、プラスミドDNAと全DNAは両方とも
消化に対して実質的に抵抗性であるはずである。
（８） ステップ（７）で同定したXba Iメチラーゼク
ローンの細胞抽出物を調製し、この抽出物のXba I制限
エンドヌクレアーゼ活性を検定することによって、Xba
I制限エンドヌクレアーゼを担持するクローンを同定す
る。
ローンの細胞抽出物を調製し、この抽出物のXba I制限
エンドヌクレアーゼ活性を検定することによって、Xba
I制限エンドヌクレアーゼを担持するクローンを同定す
る。
（９） Xba I制限および修飾遺伝子を担持しているク
ローンを醗酵槽内のアンピシリン含有富化培地中で増殖
させることによって、Xba I制限エンドヌクレアーゼを
生産することができる。細胞を延伸して回収し、音波処
理で破砕すると、Xba I制限エンドヌクレアーゼ活性を
含有する粗細胞抽出物が生成する。
ローンを醗酵槽内のアンピシリン含有富化培地中で増殖
させることによって、Xba I制限エンドヌクレアーゼを
生産することができる。細胞を延伸して回収し、音波処
理で破砕すると、Xba I制限エンドヌクレアーゼ活性を
含有する粗細胞抽出物が生成する。
（10） Xba I制限エンドヌクレアーゼ活性を含有する
粗細胞抽出物を、アフィニティークロマトグラフィーや
イオン交換クロマトグラフィーのように標準的タンパク
質精製技術によって精製する。
粗細胞抽出物を、アフィニティークロマトグラフィーや
イオン交換クロマトグラフィーのように標準的タンパク
質精製技術によって精製する。
上に概略を記載した手順は本発明の好ましい実施態様
であるが、上記の手順を業界で公知の技術によって変え
ることができるということは当業者には明らかであろ
う。
であるが、上記の手順を業界で公知の技術によって変え
ることができるということは当業者には明らかであろ
う。
以下に現状で好ましい具体例を挙げて本発明を例示す
るが、これらの実施例は単なる例示であって特許請求の
範囲で指摘されない限り本発明がこれらの実施例に限定
されることはないものと考えられたい。
るが、これらの実施例は単なる例示であって特許請求の
範囲で指摘されない限り本発明がこれらの実施例に限定
されることはないものと考えられたい。
実施例 Xba I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング （１） DNAの精製： Xanthomonas badrii（ATCC 11672）の凍結した細胞5g
を氷上で１時間解凍した後20mlの25％スクロース,50mM
Tris pH8.0中に再懸濁させた。10mlの0.25M EDTA pH8.0
および6mlの10mg/mlリゾチーム（0.25M Tris pH8.0中）
を加えた。この懸濁液を２時間氷上に保った後、24mlの
１％Triton X−100,50mM Tris pH8.0,67mM EDTAおよび5
mlの10％SDSを加えて溶菌させた。得られた溶液を、
（前もって0.5M Tris,pH8.0で平衡化した）フェノール7
0mlおよびクロロホルム60mlで抽出した。得られた乳濁
液を10Krpmで30分遠心して相を分離した。粘稠な上相を
新しいびんに移し、フェノールおよびクロロホルムでも
う一度抽出した。得られた乳濁液を再度遠心した後、上
相をDNA緩衝液（10mM Tris pH8.0,1mM EDTA）に対しこ
の液を四回交換して透析した。次に、透析した溶液を最
終濃度200μg/mlのRNaseにより37℃で１時間消化した。
次に、DNAを沈澱させるために、5M NaClを最終濃度0.4M
まで加え、0.55倍容量のイソプロピルアルコールを重層
した。沈澱したDNAをガラス棒に巻き付けて取り出し、
空気乾燥した後DNA緩衝液に溶解させて４℃で貯蔵し
た。
を氷上で１時間解凍した後20mlの25％スクロース,50mM
Tris pH8.0中に再懸濁させた。10mlの0.25M EDTA pH8.0
および6mlの10mg/mlリゾチーム（0.25M Tris pH8.0中）
を加えた。この懸濁液を２時間氷上に保った後、24mlの
１％Triton X−100,50mM Tris pH8.0,67mM EDTAおよび5
mlの10％SDSを加えて溶菌させた。得られた溶液を、
（前もって0.5M Tris,pH8.0で平衡化した）フェノール7
0mlおよびクロロホルム60mlで抽出した。得られた乳濁
液を10Krpmで30分遠心して相を分離した。粘稠な上相を
新しいびんに移し、フェノールおよびクロロホルムでも
う一度抽出した。得られた乳濁液を再度遠心した後、上
相をDNA緩衝液（10mM Tris pH8.0,1mM EDTA）に対しこ
の液を四回交換して透析した。次に、透析した溶液を最
終濃度200μg/mlのRNaseにより37℃で１時間消化した。
次に、DNAを沈澱させるために、5M NaClを最終濃度0.4M
まで加え、0.55倍容量のイソプロピルアルコールを重層
した。沈澱したDNAをガラス棒に巻き付けて取り出し、
空気乾燥した後DNA緩衝液に溶解させて４℃で貯蔵し
た。
（２） DNAの部分消化： 60μｇのX.badriiDNAを600μのHind III制限エンド
ヌクレアーゼ消化用緩衝液（10mM Tris pH7.9,10mM MgC
l2,10mMメルカプトエタノール,50mM NaCl）中に希釈し
た。得られた溶液を１つは200μ、他の４つは100μ
として５つに分けた。最初の200μに1unitのHind III
制限エンドヌクレアーゼを加えてDNA 1μｇ当たりHind
IIIを0.05unitとした。これから100μを取り出して第
２のチューブへ入れて混合して0.02unit/μｇとした。
残りのチューブも同様に100μずつ移してやって、0.0
1unit/μｇ、0.006unit/μｇおよび0.003unit/とした。
これらの溶液を１時間37℃にインキュベートした後、10
分間72℃に加熱して消化を停止した。５つの溶液をひと
つに合わせた。
ヌクレアーゼ消化用緩衝液（10mM Tris pH7.9,10mM MgC
l2,10mMメルカプトエタノール,50mM NaCl）中に希釈し
た。得られた溶液を１つは200μ、他の４つは100μ
として５つに分けた。最初の200μに1unitのHind III
制限エンドヌクレアーゼを加えてDNA 1μｇ当たりHind
IIIを0.05unitとした。これから100μを取り出して第
２のチューブへ入れて混合して0.02unit/μｇとした。
残りのチューブも同様に100μずつ移してやって、0.0
1unit/μｇ、0.006unit/μｇおよび0.003unit/とした。
これらの溶液を１時間37℃にインキュベートした後、10
分間72℃に加熱して消化を停止した。５つの溶液をひと
つに合わせた。
（３） 連結および形質転換： Hind IIIで部分消化したX.badriiDNA 6μｇ（60μ
）を、Hind IIIで開裂し脱リン酸化したpUC19（ATCC3
7254）３μｇ（30μ）と混合した。20μの10X連結
用緩衝液（500mM Tris pH7.5,100mM MgCl2,100mM DTT,5
mM ATP）および90μの滅菌蒸溜水を加えて容積を200
μとした。T4DNAリガーゼを7.5μ加え、得られた溶
液を４時間16℃にインキュベートした。この溶液をクロ
ロホルム20μで抽出して滅菌した後、15秒間軽く遠心
（microcentrifugation）して清澄化した。連結溶液62.
5μを、500μのSSC/CaCl2（50mM NaCl,5mMクエン酸
Na3,67mM CaCl2）と混合し、氷冷したＥ．coli RR1（AT
CC31343）コンピテント細胞を1ml加えた。得られた溶液
を５分間42℃にインキュベートした後、7mlのLuria−ブ
ロス（Ｌ−broth）を添加して30℃で４時間インキュベ
ーションを続行した。
）を、Hind IIIで開裂し脱リン酸化したpUC19（ATCC3
7254）３μｇ（30μ）と混合した。20μの10X連結
用緩衝液（500mM Tris pH7.5,100mM MgCl2,100mM DTT,5
mM ATP）および90μの滅菌蒸溜水を加えて容積を200
μとした。T4DNAリガーゼを7.5μ加え、得られた溶
液を４時間16℃にインキュベートした。この溶液をクロ
ロホルム20μで抽出して滅菌した後、15秒間軽く遠心
（microcentrifugation）して清澄化した。連結溶液62.
5μを、500μのSSC/CaCl2（50mM NaCl,5mMクエン酸
Na3,67mM CaCl2）と混合し、氷冷したＥ．coli RR1（AT
CC31343）コンピテント細胞を1ml加えた。得られた溶液
を５分間42℃にインキュベートした後、7mlのLuria−ブ
ロス（Ｌ−broth）を添加して30℃で４時間インキュベ
ーションを続行した。
（４） セルライブラリー： 形質転換した培養液を穏やかに遠心した後、上清を捨
て、細胞を1mlのＬ−brothに再懸濁させた。再懸濁した
細胞のうちの200μを、アンピシリンを100μg/ml含有
するLuria−寒天（Ｌ−agar）プレート上に接種した。
プレートを一晩30℃にインキュベートした。プレートの
表面に生えて来た形質転換細胞を回収するために、各プ
レートに2.5mlの10mM Tris pH7.5,10mM MgCl2を満た
し、コロニーを全部掻き集めて、得られた懸濁液を１本
のチューブにプールした。
て、細胞を1mlのＬ−brothに再懸濁させた。再懸濁した
細胞のうちの200μを、アンピシリンを100μg/ml含有
するLuria−寒天（Ｌ−agar）プレート上に接種した。
プレートを一晩30℃にインキュベートした。プレートの
表面に生えて来た形質転換細胞を回収するために、各プ
レートに2.5mlの10mM Tris pH7.5,10mM MgCl2を満た
し、コロニーを全部掻き集めて、得られた懸濁液を１本
のチューブにプールした。
（５） プラスミドライブラリー： 2.5mlのセルライブラリーを、アンピシリンを100μg/
ml含有するＬ−broth 500ml中に接種した。30℃で一晩
振盪培養した後、4k rpmで５分遠心した。上清を捨て、
細胞ペレットを10mlの25％スクロース,50mM Tris pH8.0
に室温で再懸濁させた。0.25M EDTA,pH8.0を5ml、およ
び10mg/mlリゾチーム（0.25M Tris,pH8.0中）を3ml加え
た。得られた溶液を氷上に１時間放置した後、12mlの１
％Triton X−100,50mM Tris pH8.0,67mM EDTAを添加
し、得られた懸濁液を穏やかにかき回して細胞の溶解を
起こさせた。
ml含有するＬ−broth 500ml中に接種した。30℃で一晩
振盪培養した後、4k rpmで５分遠心した。上清を捨て、
細胞ペレットを10mlの25％スクロース,50mM Tris pH8.0
に室温で再懸濁させた。0.25M EDTA,pH8.0を5ml、およ
び10mg/mlリゾチーム（0.25M Tris,pH8.0中）を3ml加え
た。得られた溶液を氷上に１時間放置した後、12mlの１
％Triton X−100,50mM Tris pH8.0,67mM EDTAを添加
し、得られた懸濁液を穏やかにかき回して細胞の溶解を
起こさせた。
溶菌した混合物を50mlのチューブに移して17Krpm,4℃
で45分間遠心した。ピペットで上清を取り出した。固体
のCsClを20.0g秤量して50mlのプラスチック製ネジブタ
付きチューブに入れ、このチューブ中に上清22.0gをピ
ペットで入れて混合した。5mg/mlのエチジウムブロミド
（10mM Tris pH8.0,100mM NaCl,1mM EDTA中）を1.0ml加
えた。この溶液を、5/8 in×3 inの遠心管２本に移し、
Beckman Ti 70ローター中44K rpm,17℃で42時間回転さ
せた。プラスミドを集めるために、これらのチューブを
開き、紫外光を照射して２本のケイ光バンドの下側の方
を注射器で集めた。各チューブから得た下側のバンドを
合わせ、等容量の、水で飽和した氷冷ｎ−ブタノールで
四回抽出することによってエチジウムブロミドを除去し
た。
で45分間遠心した。ピペットで上清を取り出した。固体
のCsClを20.0g秤量して50mlのプラスチック製ネジブタ
付きチューブに入れ、このチューブ中に上清22.0gをピ
ペットで入れて混合した。5mg/mlのエチジウムブロミド
（10mM Tris pH8.0,100mM NaCl,1mM EDTA中）を1.0ml加
えた。この溶液を、5/8 in×3 inの遠心管２本に移し、
Beckman Ti 70ローター中44K rpm,17℃で42時間回転さ
せた。プラスミドを集めるために、これらのチューブを
開き、紫外光を照射して２本のケイ光バンドの下側の方
を注射器で集めた。各チューブから得た下側のバンドを
合わせ、等容量の、水で飽和した氷冷ｎ−ブタノールで
四回抽出することによってエチジウムブロミドを除去し
た。
抽出された溶液を、DNA緩衝液を四回交換しながらこ
の液に対して透析した後、２倍容量のイソプロパノール
と最終濃度が0.4Mとなるのに充分な5M NaClを添加して
核酸を沈澱させた。得られた溶液を一晩−20℃で保存し
た後15K rpm,0℃で15分遠心した。上清を捨て、ペレッ
トを15分間風乾した後、750μの10mM Tris pH7.5,1mM
EDTAに溶かして−20℃で貯蔵した。プラスミドDNAの濃
度は約200μg/mlであった。
の液に対して透析した後、２倍容量のイソプロパノール
と最終濃度が0.4Mとなるのに充分な5M NaClを添加して
核酸を沈澱させた。得られた溶液を一晩−20℃で保存し
た後15K rpm,0℃で15分遠心した。上清を捨て、ペレッ
トを15分間風乾した後、750μの10mM Tris pH7.5,1mM
EDTAに溶かして−20℃で貯蔵した。プラスミドDNAの濃
度は約200μg/mlであった。
（６） プラスミドライブラリーの消化： 10μｇ（50μ）のプラスミドライブラリーを450μ
のXba I制限エンドヌクレアーゼ消化用緩衝液（6mM T
ris pH8.0,6mM MgCl2,50mM NaCl）中に希釈した。60uni
t（３μ）のXba I制限エンドヌクレアーゼを加え、チ
ューブを２時間45分37℃にインキュベートした。12分間
72℃に加熱することによって反応を停止させた。この溶
液中に0.15unit（３μ）の細菌アルカリ性ホスファタ
ーゼを混入し、100μのパラフィン油を頂部に重層し
た。この溶液をさらに２時間68℃にインキュベートした
後、40μのクロロホルムで抽出して滅菌した。
のXba I制限エンドヌクレアーゼ消化用緩衝液（6mM T
ris pH8.0,6mM MgCl2,50mM NaCl）中に希釈した。60uni
t（３μ）のXba I制限エンドヌクレアーゼを加え、チ
ューブを２時間45分37℃にインキュベートした。12分間
72℃に加熱することによって反応を停止させた。この溶
液中に0.15unit（３μ）の細菌アルカリ性ホスファタ
ーゼを混入し、100μのパラフィン油を頂部に重層し
た。この溶液をさらに２時間68℃にインキュベートした
後、40μのクロロホルムで抽出して滅菌した。
（７） 形質転換： 12.5μ（0.25μｇ）の消化し脱リン酸化したライブ
リーを100μのSSC/CaCl2（上記第３項）および200μ
の氷冷したコンピテントE.coli RR1と混合した。得ら
れた混合物を２分間42℃に暖めた後、アンピシリンを10
0μg/ml含有するＬ−agarプレートに接種した。このプ
レートを一晩30℃にインキュベートした。Xba I消化お
よび脱リン酸化によって、未消化のプラスミドによる形
質転換の場合と比較して、形質転換体の数は約1/103に
減少した。この生き残ったもののうちから28個のコロニ
ーを採り、それぞれ、10mlのアンピシリン含有Ｌ−brot
h中に接種してミニカルチャー（小培養物）を調製し、
アンピシンを含有するＬ−agarプレートに画線してマス
ターストックを調製した。
リーを100μのSSC/CaCl2（上記第３項）および200μ
の氷冷したコンピテントE.coli RR1と混合した。得ら
れた混合物を２分間42℃に暖めた後、アンピシリンを10
0μg/ml含有するＬ−agarプレートに接種した。このプ
レートを一晩30℃にインキュベートした。Xba I消化お
よび脱リン酸化によって、未消化のプラスミドによる形
質転換の場合と比較して、形質転換体の数は約1/103に
減少した。この生き残ったもののうちから28個のコロニ
ーを採り、それぞれ、10mlのアンピシリン含有Ｌ−brot
h中に接種してミニカルチャー（小培養物）を調製し、
アンピシンを含有するＬ−agarプレートに画線してマス
ターストックを調製した。
（８） 生き残った個体の解析： 上記第７項に記載した28個の生き残りのコロニーを10
mlになるまで増殖させ、これらが担持するプラスミドを
Birnboin and Doly,Nucleic Acids Res.,7:1513（197
9）の方法を応用した以下のminiprep精製法によって調
製した。
mlになるまで増殖させ、これらが担持するプラスミドを
Birnboin and Doly,Nucleic Acids Res.,7:1513（197
9）の方法を応用した以下のminiprep精製法によって調
製した。
miniprep法： 各培養物を8K rpmで５分間遠心し、上清を捨てて得ら
れた細胞ペレットを、1mg/mlリゾチームを含有する1.0m
lの25mM Tris,10mM EDTA,50mMグルコース,pH8.0中に再
懸濁させた。５分間室温に置いた後、各チューブに2.0m
lの0.2M NaOH,1％SDSを加え、チューブを振盪して細胞
を溶解し、次いで氷上に置いた。溶液が透明になってか
ら各々3M酢酸ナトリウム（pH4.8）を1.5mlずつ加えて振
盪した。生じた沈澱を15K rpm,4℃で10分間遠心して沈
ませた。得られた上清を各々、イソプロパノールを3ml
含有する遠心管に流し入れて混合した。室温で10分経っ
た後遠心管を15K rpmで10分間遠心して沈澱した核酸を
ペレット化した。上清を捨て、ペレットを室温で30分風
乾した。乾燥した後ペレットを850μの10mM Tris,1mM
1mM EDTA,pH8.0に再懸濁させた。5M NaClを75μずつ
加え、得られた溶液を、575μのイソプロパノールを
含有するEppendorfチューブに移し、室温で10分かけて
再度沈澱させた。次に、チューブをmicrofuge中で45秒
間回転し、上清を捨ててペレットを風乾した。このペレ
ットを、次いで、RNaseを100μg/ml含有する500μの1
0mM Tris,1mM EDTA,pH8.0に溶解し、１時間37℃にイン
キュベートしてRNAを消化した。50μの5M NaCl、次い
で350μのイソプロパノールを添加してDNAをもう一度
沈澱させた。室温で10分後、45秒間遠心してDNAを沈ま
せ、上清を捨て、得られたペレットを150μの10mM Tr
is,1mM EDTA,pH8.0に再溶解した。次いで、プラスミドm
iniprep（小調製物）をHind IIIとXba Iで消化して解析
した。
れた細胞ペレットを、1mg/mlリゾチームを含有する1.0m
lの25mM Tris,10mM EDTA,50mMグルコース,pH8.0中に再
懸濁させた。５分間室温に置いた後、各チューブに2.0m
lの0.2M NaOH,1％SDSを加え、チューブを振盪して細胞
を溶解し、次いで氷上に置いた。溶液が透明になってか
ら各々3M酢酸ナトリウム（pH4.8）を1.5mlずつ加えて振
盪した。生じた沈澱を15K rpm,4℃で10分間遠心して沈
ませた。得られた上清を各々、イソプロパノールを3ml
含有する遠心管に流し入れて混合した。室温で10分経っ
た後遠心管を15K rpmで10分間遠心して沈澱した核酸を
ペレット化した。上清を捨て、ペレットを室温で30分風
乾した。乾燥した後ペレットを850μの10mM Tris,1mM
1mM EDTA,pH8.0に再懸濁させた。5M NaClを75μずつ
加え、得られた溶液を、575μのイソプロパノールを
含有するEppendorfチューブに移し、室温で10分かけて
再度沈澱させた。次に、チューブをmicrofuge中で45秒
間回転し、上清を捨ててペレットを風乾した。このペレ
ットを、次いで、RNaseを100μg/ml含有する500μの1
0mM Tris,1mM EDTA,pH8.0に溶解し、１時間37℃にイン
キュベートしてRNAを消化した。50μの5M NaCl、次い
で350μのイソプロパノールを添加してDNAをもう一度
沈澱させた。室温で10分後、45秒間遠心してDNAを沈ま
せ、上清を捨て、得られたペレットを150μの10mM Tr
is,1mM EDTA,pH8.0に再溶解した。次いで、プラスミドm
iniprep（小調製物）をHind IIIとXba Iで消化して解析
した。
（９） Xba Iメチラーゼ遺伝子クローン： 解析した28個のうち11個のクローンがさまざまな構造
を有していることが判明した。これらのプラスミドはに
せものであるので捨てた。残りの17個のプラスミドは、
Xba I消化に対して耐性であり、1.3Kbと1.1Kbの少なく
とも２種のHind III断片を担持していることが判明し
た。これらの断片はXba Iメチラーゼをコードしている
ことが示された。これらのプラスミドのほとんどは、1.
3Kb断片と1.1Kb断片に加えて他のHind III断片も担持し
ていた。これら追加の断片は長さが3Kb、0.35Kbおよび
0.25Kbであった。５種の断片を全て担持しているプラス
ミドのうちのひとつpEC145RM 102−４は、Xba Iエンド
ヌクレアーゼをコードしているばかりでなく、Xba Iメ
チラーゼもコードしていることが示された。
を有していることが判明した。これらのプラスミドはに
せものであるので捨てた。残りの17個のプラスミドは、
Xba I消化に対して耐性であり、1.3Kbと1.1Kbの少なく
とも２種のHind III断片を担持していることが判明し
た。これらの断片はXba Iメチラーゼをコードしている
ことが示された。これらのプラスミドのほとんどは、1.
3Kb断片と1.1Kb断片に加えて他のHind III断片も担持し
ていた。これら追加の断片は長さが3Kb、0.35Kbおよび
0.25Kbであった。５種の断片を全て担持しているプラス
ミドのうちのひとつpEC145RM 102−４は、Xba Iエンド
ヌクレアーゼをコードしているばかりでなく、Xba Iメ
チラーゼもコードしていることが示された。
（10） Xba I制限エンドヌクレアーゼクローン： pEC145RM 102−４は、このプラスミドを担持している
E.coli RR1の抽出物を検定することによって、Xba I制
限エンドヌクレアーゼをコードしており、発現すること
が判明した。
E.coli RR1の抽出物を検定することによって、Xba I制
限エンドヌクレアーゼをコードしており、発現すること
が判明した。
エンドヌクレアーゼアッセイ： pEC145RM 102−４を担持しているE.coli RR1の培養物
50mlを、100μg/mlアンピシリンを含有するＬ−broth中
30℃で一晩増殖させた。培養物を4Krpmで５分間遠心
し、得られた細胞ペレットを3mlの溶菌用緩衝液（20mM
KPO4 pH7.6,10mMメルカプトエタノール,0.1mM EDTA）中
に再懸濁させた。同じ緩衝液中に10mg/mlのリゾチーム
を含有する液を0.5ml加え、得られた懸濁液を３時間氷
上に放置した。この懸濁液を一晩−20℃に凍結した後氷
上で１時間かけて解凍した。この懸濁液2mlを、0.005％
Triton X−100を含有する溶菌用緩衝液を５分間軽く遠
心して細胞の破片を除去した。得られた上清のエンドヌ
クレアーゼ活性を以下のようにして検定した。
50mlを、100μg/mlアンピシリンを含有するＬ−broth中
30℃で一晩増殖させた。培養物を4Krpmで５分間遠心
し、得られた細胞ペレットを3mlの溶菌用緩衝液（20mM
KPO4 pH7.6,10mMメルカプトエタノール,0.1mM EDTA）中
に再懸濁させた。同じ緩衝液中に10mg/mlのリゾチーム
を含有する液を0.5ml加え、得られた懸濁液を３時間氷
上に放置した。この懸濁液を一晩−20℃に凍結した後氷
上で１時間かけて解凍した。この懸濁液2mlを、0.005％
Triton X−100を含有する溶菌用緩衝液を５分間軽く遠
心して細胞の破片を除去した。得られた上清のエンドヌ
クレアーゼ活性を以下のようにして検定した。
Hind IIIで消化したメチル化されてないλファージDN
A17.5μｇ（35μ）を、350μのXba I制限エンドヌ
クレアーゼ消化用緩衝液（上記第６項）中に希釈した。
この溶液を６本のチューブに、最初の１本は75μ、残
りの５本は50μずつ分注した。最初のチューブに抽出
物3.75μを入れてDNA1μｇ当たり抽出物１μとし
た。次に、最初のチューブから25μを取り出して第二
のチューブに移して0.3μ／μｇとした。続けてチュ
ーブ３、４、５にも順次50μずつ移して、チューブ３
（0.1μ／μｇ）、チューブ４（0.03μ／μｇ）お
よび５（0.01μ／μｇ）とした。６本目のチューブに
は抽出物を入れないで負のコントロールとして使用し
た。これらのチューブを１時間37℃にインキュベートし
た後、各チューブのサンプル15μをゲル電気泳動によ
って分析した。これらの抽出物は、1mlに付き約103unit
のXba I制限エンドヌクレアーゼを含有していることが
判明した。これは、細胞1g当たり約104unitに相当す
る。
A17.5μｇ（35μ）を、350μのXba I制限エンドヌ
クレアーゼ消化用緩衝液（上記第６項）中に希釈した。
この溶液を６本のチューブに、最初の１本は75μ、残
りの５本は50μずつ分注した。最初のチューブに抽出
物3.75μを入れてDNA1μｇ当たり抽出物１μとし
た。次に、最初のチューブから25μを取り出して第二
のチューブに移して0.3μ／μｇとした。続けてチュ
ーブ３、４、５にも順次50μずつ移して、チューブ３
（0.1μ／μｇ）、チューブ４（0.03μ／μｇ）お
よび５（0.01μ／μｇ）とした。６本目のチューブに
は抽出物を入れないで負のコントロールとして使用し
た。これらのチューブを１時間37℃にインキュベートし
た後、各チューブのサンプル15μをゲル電気泳動によ
って分析した。これらの抽出物は、1mlに付き約103unit
のXba I制限エンドヌクレアーゼを含有していることが
判明した。これは、細胞1g当たり約104unitに相当す
る。
（11） 単離された14個のプラスミドのうちの２番目の
プラスミドpEC145RM 102−18を詳細に分析して、このプ
ラスミドが担持しているどの断片がエンドヌクレアーゼ
の合成に必須であるかということと、どれが外因性であ
るかということを決定した。pEC145RM 102−18は3.0、
1.3、1.1、0.35および0.25Kbの５種のHind III断片を担
持しており、pEC145RM 102−４と同じであるように思わ
れた。
プラスミドpEC145RM 102−18を詳細に分析して、このプ
ラスミドが担持しているどの断片がエンドヌクレアーゼ
の合成に必須であるかということと、どれが外因性であ
るかということを決定した。pEC145RM 102−18は3.0、
1.3、1.1、0.35および0.25Kbの５種のHind III断片を担
持しており、pEC145RM 102−４と同じであるように思わ
れた。
CsClで精製した（上記第５項）pEC145RM 102−18 DNA
10μｇを、200μのHind III制限エンドヌクレアーゼ
消化用緩衝液（上記第２項）に希釈した。20unitのHind
III制限エンドヌクレアーゼを加え、得られた溶液を１
時間37℃にインキュベートした。10分間72℃に加熱する
ことによって反応を停止させた。消化物16μ（0.8μ
ｇ）を２μの10X連結用緩衝液（上記第３項）と混合
し、T4DNAリガーゼを２μ添加した。連結物を４時間1
6℃にインキュベートした後、クロロホルム３μで滅
菌した。連結したDNA 7μを100μのSSC/CaCl2（上
記第３項）と混合し、200μの氷冷したコンピテント
なE.coli RR1中に形質転換した。得られた混合物を、ア
ンピシリンを含有するＬ−agarプレートに接種し、30℃
にインキュベートした。コロニーを採取し、それらが担
持しているプラスミドをminiprep法（上記第８項）によ
って調製して分析した。
10μｇを、200μのHind III制限エンドヌクレアーゼ
消化用緩衝液（上記第２項）に希釈した。20unitのHind
III制限エンドヌクレアーゼを加え、得られた溶液を１
時間37℃にインキュベートした。10分間72℃に加熱する
ことによって反応を停止させた。消化物16μ（0.8μ
ｇ）を２μの10X連結用緩衝液（上記第３項）と混合
し、T4DNAリガーゼを２μ添加した。連結物を４時間1
6℃にインキュベートした後、クロロホルム３μで滅
菌した。連結したDNA 7μを100μのSSC/CaCl2（上
記第３項）と混合し、200μの氷冷したコンピテント
なE.coli RR1中に形質転換した。得られた混合物を、ア
ンピシリンを含有するＬ−agarプレートに接種し、30℃
にインキュベートした。コロニーを採取し、それらが担
持しているプラスミドをminiprep法（上記第８項）によ
って調製して分析した。
3.0Kbの断片が外因性であることが判明したが他の４
種の断片はメチラーゼとエンドヌクレアーゼの合成に必
要であることが判明した（第２図）。４つの小断片だけ
を担持するひとつのプラスミドpEC145RM 102−18/39のX
ba Iエンドヌクレアーゼ活性を検定した。このプラスミ
ドを担持するE.coli RR1の抽出物は1mlにつき約１×10
5unitのXba Iエンドヌクレアーゼを含有することが判明
した。これは細胞1g当たり１×106unitに相当する。
種の断片はメチラーゼとエンドヌクレアーゼの合成に必
要であることが判明した（第２図）。４つの小断片だけ
を担持するひとつのプラスミドpEC145RM 102−18/39のX
ba Iエンドヌクレアーゼ活性を検定した。このプラスミ
ドを担持するE.coli RR1の抽出物は1mlにつき約１×10
5unitのXba Iエンドヌクレアーゼを含有することが判明
した。これは細胞1g当たり１×106unitに相当する。
pEC145RM 102−18/39を担持しているE.coli RR1は、X
ba I制限エンドヌクレアーゼを精製する際に使用するこ
とができる好ましい株である。この株を醗酵槽内のアン
ピシリン含有Ｌ−broth中30℃で定常期まで増殖させ
る。次いで遠心して細胞を集め、即ぐに破砕して抽出物
を調製するかまたは使用時まで−70℃に凍結貯蔵する。
ba I制限エンドヌクレアーゼを精製する際に使用するこ
とができる好ましい株である。この株を醗酵槽内のアン
ピシリン含有Ｌ−broth中30℃で定常期まで増殖させ
る。次いで遠心して細胞を集め、即ぐに破砕して抽出物
を調製するかまたは使用時まで−70℃に凍結貯蔵する。
第１図は、Xba I制限エンドヌクレアーゼをクローニン
グおよび生産する方法の概略を示す。 第２図は、Xba I制限エンドヌクレアーゼおよび修飾メ
チラーゼをコードしているX.badriiDNAの3Kb Hind III
マルチフラグメント（大断片）の制限地図であり、この
マルチフラグメントを別の3Kb単一フラグメントと共にp
UC19（ATCC 37254）のHind III部位にクローニングして
pEC145RM 102−４およびpEC145RM 102−18を創作した。
次いで、このマルチフラグメントを別にサブクローニン
グしてpEC145RM 102−18/39を創作した。 第３図は、pEC145RM 102−18/39を担持するE.coli RR1
（ATCC 31343）の細胞抽出物中のXba I制限エンドヌク
レアーゼ活性を示すアガロースゲルのＸ線写真である。
グおよび生産する方法の概略を示す。 第２図は、Xba I制限エンドヌクレアーゼおよび修飾メ
チラーゼをコードしているX.badriiDNAの3Kb Hind III
マルチフラグメント（大断片）の制限地図であり、この
マルチフラグメントを別の3Kb単一フラグメントと共にp
UC19（ATCC 37254）のHind III部位にクローニングして
pEC145RM 102−４およびpEC145RM 102−18を創作した。
次いで、このマルチフラグメントを別にサブクローニン
グしてpEC145RM 102−18/39を創作した。 第３図は、pEC145RM 102−18/39を担持するE.coli RR1
（ATCC 31343）の細胞抽出物中のXba I制限エンドヌク
レアーゼ活性を示すアガロースゲルのＸ線写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (4)
- 【請求項１】キサントモナス・バドリー（Xanthomonas
badrii）由来のDNA配列TCTAGAを認識してＴとＣの間で
開裂するXba I制限エンドヌクレアーゼをコードし、以
下に示すような制限部位を有する、DNAセグメント。 - 【請求項２】請求項１に記載のDNAセグメントが挿入さ
れている組換えDNAベクター。 - 【請求項３】請求項２に記載のベクターにより形質転換
された原核生物宿主細胞。 - 【請求項４】請求項２に記載のベクターにより形質転換
された原核生物宿主細胞を下記エンドヌクレアーゼを発
現する条件下で培養することを特徴とする、キサントモ
ナス・バドリー（Xanthomonas badrii）由来のDNA配列T
CTAGAを認識してＴとＣの間で開裂するXba I制限エンド
ヌクレアーゼの製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US136,093 | 1987-12-21 | ||
| US07/136,093 US4983542A (en) | 1987-12-21 | 1987-12-21 | Method for producing the XbaI restriction endonuclease and methylase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0216979A JPH0216979A (ja) | 1990-01-19 |
| JP2746964B2 true JP2746964B2 (ja) | 1998-05-06 |
Family
ID=22471256
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63320327A Expired - Lifetime JP2746964B2 (ja) | 1987-12-21 | 1988-12-19 | ＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4983542A (ja) |
| EP (1) | EP0323081B1 (ja) |
| JP (1) | JP2746964B2 (ja) |
| AT (1) | ATE118817T1 (ja) |
| DE (2) | DE323081T1 (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5298404A (en) * | 1989-10-13 | 1994-03-29 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the Hpa I restriction endonuclease and methylase |
| US5278060A (en) * | 1990-08-30 | 1994-01-11 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the Nla III restriction endonuclease and methylase |
| US5288696A (en) * | 1990-09-07 | 1994-02-22 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing and cloning SacII restriction endonuclease and methylase |
| US5202248A (en) * | 1990-11-02 | 1993-04-13 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and producing the nco i restriction endonuclease and methylase |
| US5192676A (en) * | 1991-02-05 | 1993-03-09 | New England Biolabs, Inc. | Type ii restriction endonuclease, asci, obtainable from arthrobacter species and a process for producing the same |
| US5200337A (en) * | 1991-10-25 | 1993-04-06 | New England Biolabs, Inc. | Type ii restriction endonuclease, apo i, obtainable from arthrobacter protophormiae and a process for producing the same |
| US5231021A (en) * | 1992-04-10 | 1993-07-27 | Life Technologies, Inc. | Cloning and expressing restriction endonucleases and modification methylases from xanthomonas |
| US5248605A (en) * | 1992-12-07 | 1993-09-28 | Life Technologies, Inc. | Cloning and expressing restriction endonucleases from haemophilus |
| US5312746A (en) * | 1993-01-08 | 1994-05-17 | Life Technologies, Inc. | Cloning and expressing restriction endonucleases and modification methylases from caryophanon |
| US5334526A (en) * | 1993-05-28 | 1994-08-02 | Life Technologies, Inc. | Cloning and expression of AluI restriction endonuclease |
| US8227231B2 (en) | 2005-08-04 | 2012-07-24 | New England Biolabs, Inc. | Restriction endonucleases, DNA encoding these endonucleases and methods for identifying new endonucleases with the same or varied specificity |
| CN109880841A (zh) * | 2018-12-31 | 2019-06-14 | 吴江近岸蛋白质科技有限公司 | 一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IN166864B (ja) * | 1985-03-01 | 1990-07-28 | New England Biolabs Inc | |
| DE3751923T2 (de) * | 1986-06-06 | 1997-04-03 | New England Biolabs Inc | Verfahren zur Klonierung von Restriktions-Modifikationssystemen |
-
1987
- 1987-12-21 US US07/136,093 patent/US4983542A/en not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-12-16 EP EP88311916A patent/EP0323081B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-16 DE DE88311916T patent/DE323081T1/de active Pending
- 1988-12-16 AT AT88311916T patent/ATE118817T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-12-16 DE DE3853145T patent/DE3853145T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-19 JP JP63320327A patent/JP2746964B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0216979A (ja) | 1990-01-19 |
| DE3853145T2 (de) | 1995-08-31 |
| EP0323081A3 (en) | 1990-03-07 |
| US4983542A (en) | 1991-01-08 |
| ATE118817T1 (de) | 1995-03-15 |
| DE323081T1 (de) | 1994-02-24 |
| EP0323081B1 (en) | 1995-02-22 |
| DE3853145D1 (de) | 1995-03-30 |
| EP0323081A2 (en) | 1989-07-05 |
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| ENDONUCLEASE | Looney et al.[45] Date of Patent: Mar. 12, 1991 | |
| ENDONUCLEASE | Barsomian et al. | |
| ENDONUCLEASE | Lumnen et al. |
Legal Events
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