JP2749730B2

JP2749730B2 - インターロイキン５レセプター

Info

Publication number: JP2749730B2
Application number: JP3232072A
Authority: JP
Inventors: 聖志高津; 明富永; 智高木; 芳幸村田
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-09-11
Filing date: 1991-09-11
Publication date: 1998-05-13
Anticipated expiration: 2013-05-13
Also published as: DE69132306T2; ES2149156T3; JPH0654690A; DK0475746T3; EP0475746B1; ATE194652T1; US5760204A; GR3034525T3; DE69132306D1; US5453491A; US5807991A; EP0475746A1; US5916767A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はマウス及びヒトのインタ
ーロイキン５レセプターをコードするＤＮＡ、インター
ロイキン５レセプター自体、及び当該インターロイキン
５レセプターの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】インターロイキン５ (以下「ＩL-５」と
記す) は好酸球とＢ細胞の増殖分化因子であり (Immuno
l. Rev. 102, 29; ibid, 102, 107, (1988))。特に結核
菌や寄生虫で感作されたＴ細胞やアロ抗原で感作された
Ｔ細胞がよく産生することが知られている (J. Immuno
l. 140, 1175, (1988), Nature 324, 70, (1986)) 。ま
た、ＩL-５は特に抗ＤＮＡ抗体を含むＩｇＭクラス免疫
グロブリン産生を誘導することが知られており、自己免
疫病への関与も疑われている。また自己抗体と筋膜炎を
伴う好酸球増多症などに関与している可能性が高いこと
が報告されている(Eosinophils, Oxford University Pr
ess, 1988)。一方、このＩL-５と結合するインターロイ
キン５レセプター (以下ＩL-５R と記す) には膜型と分
泌型の２種類があり、分泌型のマウスＩL-５R は、ヒト
ＩL-５と結合可能であることからＩL-５が関与している
と思われる前記疾病等の治療薬として期待されている。

【０００３】このマウスＩL-５R の解析のために、本発
明者はマウス骨髄細胞をＩL-５の存在下で培養すること
により、ＩL-５と反応性を有する初期Ｂ細胞株Ｔ88、Ｔ
88−Ｍ等を得ており (Growth Factors １, 135, (198
9))、これらの細胞株を使ったＩL-５の結合実験や架橋
実験により、ＩL-５R は少なくとも分子量約46,500の分
子と分子量約 114,000の分子の２つの構成要素からなる
こと、及びＩL-５R には解離定数27 nMの低親和性受容
体と解離定数150 pMの高親和性受容体があり、このうち
低親和性受容体は前記分子量46,500の分子に相当し、こ
れに対して高親和性受容体は、前記分子量 114,000の分
子と前記分子量46,500の分子とからなることを予想した
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 2311, (1989)) 。

【０００４】そして、本発明者らは、Ｔ88−Ｍ細胞の膜
分画をラットに免疫することにより、ＩL-５のＩL-５R
への結合を阻害する２種のモノクローナル抗体Ｈ７とＴ
21を得 (Int. Immunol. ２, 181, (1990), J. Immunol.
144, 4218, (1990)) 、これらＨ７, Ｔ21抗体を使った
免疫沈降法により、これらの抗ＩL-５R 抗体は分子量約
６万の糖タンパク質を認識することが判明した。前記報
告の分子量46,500の分子は糖鎖を持たないＩL-５を用い
た架橋実験の結果、分子量は約55,000であったことが判
り、この分子量約６万の分子が単独で低親和性受容体を
形成していることを明らかにした(Int. Immunol. ２, 1
81, (1990))。さらに、本発明者らは、ヒトにおいても
正常好酸球上にＩL-５R が存在することを見出した。か
かるヒトＩL-５R は解離定数170〜330 pMの親和性を有
し、架橋実験を行なった結果、分子量は、55000〜60000
であることが判明した。

【０００５】このＩL-５R 分子は、前記したマウスの低
親和性ＩL-５R に対応するものと考えられる (Cellular
Immunology 133, 484, (1991))。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、マウス
・ヒトを問わず現在までにこの低親和性ＩL-５R をコー
ドするＤＮＡを単離した例はない。しかして、本発明
は、かかるマウス及びヒトの低親和性ＩL-５R をコード
するＤＮＡを取得して構造を解析すること及びこのＤＮ
Ａを主に哺乳動物細胞で発現させて対応するＩL-５R を
提供しようとするものである。

【０００７】特にマウスにおいて存在する細胞膜上にあ
るＩL-５R とは異なる分泌型のＩL-５R をコードする
ＤＮＡを得て純粋な分泌型ＩL-５R を提供することを目
的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決すべく鋭意検討した結果、以下 (１) から (24)
を構成要件とする本発明を完成させるに至った。 (１) マウス骨髄細胞ｍＲＮＡ由来のインターロイキン
５レセプターをコードするＤＮＡ。

【０００９】(２) 配列番号１の塩基配列を有する (１)
記載のＤＮＡ。 (３) 配列番号２の塩基配列を有する (１) 記載のＤＮ
Ａ。 (４) マウス骨髄細胞ｍＲＮＡ由来でありかつ分泌型の
インターロイキン５レセプターをコードするＤＮＡ。 (５) 配列番号３の塩基配列を有する (４) 記載のＤＮ
Ａ。

【００１０】(６) 配列番号４の塩基配列を有する (４)
記載のＤＮＡ。 (７) 配列番号５のアミノ酸配列を有するインターロイ
キン５レセプター。 (８) 配列番号６のアミノ酸配列を有するインターロイ
キン５レセプター。 (９) 配列番号７のアミノ酸配列を有する分泌型インタ
ーロイキン５レセプター。

【００１１】(10) 配列番号８のアミノ酸配列を有する
分泌型インターロイキン５レセプター。 (11) 培養培地中でインターロイキン５レセプターを発
現できる細胞を培養し、該培養細胞又は培養上清から抗
インターロイキン５レセプター抗体を用いてインターロ
イキン５レセプターを単離することを特徴とするインタ
ーロイキン５レセプターの製造方法。

【００１２】(12) 請求項１〜６いずれか記載のＤＮＡ
を有する発現ベクターにより形質転換されたサルCOS7細
胞 (ATCC CRL 1651)。 (13) ヒト末梢血好酸球ｍＲＮＡ由来のインターロイキ
ン５レセプターをコードするＤＮＡ。 (14) 配列番号９の塩基配列を有する (14) 記載のＤＮ
Ａ。

【００１３】(15) 配列番号10の塩基配列を有する (14)
記載のＤＮＡ。 (16) 配列番号11の塩基配列を有する (14) 記載のＤＮ
Ａ。 (17) 配列番号12の塩基配列を有する (14) 記載のＤＮ
Ａ。 (18) 配列番号13のアミノ酸配列を有するインターロイ
キン５レセプター。 (19) 配列番号14のアミノ酸配列を有するインターロイ
キン５レセプター。

【００１４】(20) 配列番号13に示されるアミノ酸残基
１〜333の配列の全部又は一部をコードする (13) 記載
のＤＮＡ。 (21) ヒトインターロイキン５レセプターの細胞質ドメ
イン及びトランスメンブレン領域を欠失した可溶性ヒト
インターロイキン５レセプター。 (22) (13) 〜 (17) 及び (20) のいずれかに記載され
たＤＮＡ配列を含む組み換え発現ベクター。

【００１５】(23) (22) 記載のベクターを含む適当な
宿主細胞を発現促進条件下で培養することを特徴とする
インターロイキン５レセプター又はその生産方法。以下、本発明のＩL-５R をコードするＤＮＡ、ＩL-５R
及びその製造方法について各製造工程を順次説明しなが
ら詳述する。ＩL-５R を持つ細胞からのＲＮＡの調製 (１) マウスの骨髄細胞ｍＲＮＡの調製本発明のマウスＩL-５R はマウスの骨髄細胞ｍＲＮＡ由
来であり、このマウスＩL-５R をコードするＤＮＡを調
製するためにまず、ＩL-５R を有するマウス骨髄細胞か
らｍＲＮＡを採取する。

【００１６】ＲＮＡの供給源となるマウス骨髄細胞は、
マウスＩL-５を用いた長期骨髄細胞培養により (Growth
Factor １, 135, (1989))得ることができる。これらの
うち好適なものとしては、例えばBALB/cマウスの骨髄長
期細胞培養株Ｙ16が挙げられる。このＹ16は初期Ｂ細胞
株でありＩL-５に強い反応性を示す (１pg／mlのＩL-５
にまで反応する) 。この細胞より Okayama等の方法(Met
hod inEnzymol., 154, 3, (1987))に従ってＲＮＡを調
製する。全ＲＮＡをオリゴ(dT)−セルロースカラムを用
いたアフィニティクロマトグラフィーにより Poly(A)⁺
ＲＮＡ分画を得る。

【００１７】(２) ヒト末梢血好酸球細胞ｍＲＮＡの調
製本発明のヒトＩL-５R は、ヒト末梢血好酸球ｍＲＮＡ由
来であり、このヒトＩL-５R をコードするＤＮＡを調製
するためにまず、ＩL-５R を有するヒト好酸球からｍ−
ＲＮＡを採取する。ＲＮＡの供給源となるヒト好酸球
は、健康な成人及び好酸球増多症の患者の末梢血より、
密度差等を用いて分離する (Cellular Immunology 133,
484, (1991))。これらの細胞から Okayamaらの方法に
従ってＲＮＡを調製する。この全ＲＮＡをオリゴ(dT)−
セファロースカラムを用いたアフィニティクロマトグラ
フィーにより Poly(A)⁺ＲＮＡ分画を得る。ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーの調製 (１) マウスのｃＤＮＡライブラリーの調製ランダムプライマーと逆転写酵素により Poly(A)⁺ＲＮ
ＡをｃＤＮＡに逆転写する (Gene 25, 263, (1983))。
このｃＤＮＡを Seed らの開発した方法 (Proc.Natl. A
cad. Sci. USA. 84, 8573, (1987)) に従ってサイトメ
ガロウイルスのプロモーターをもつCDM8ベクターのBstX
Ｉ部位に挿入する (図２Ａ) 。その際、1.０kb以上のｃ
ＤＮＡを選別し、挿入する。このようにして得られたプ
ラスミドＤＮＡで大腸菌をトランスフォームして哺乳動
物での発現型ライブラリーとする。

【００１８】(２) ヒトのｃＤＮＡライブラリーの調製ヒトｃＤＮＡライブラリーは、上記マウスｃＤＮＡと同
様にして、ランダムプライマーと逆転写酵素を用いる方
法で得たｃＤＮＡを用いて調製する。例えば、かかるｃ
ＤＮＡを Seed らの方法を用いて pAGS-３ベクター (Ge
ne79, 269, (1989))のBstX１部位に挿入することによっ
て調製できる。

【００１９】又、EcoR１リンカーを用いてλgt10のEcoR
１部位に挿入することもできる。いずれの場合も１.0kb
以上のｃＤＮＡを選別して用いるのが好ましい。このよ
うにして得られたプラスミドＤＮＡ等で大腸菌をトラン
スフォームあるいはトランスフェクトして所望のｃＤＮ
Ａライブラリーを得ることができる。ＩL-５R 遺伝子のクローニング (１) マウスＩL-５R 遺伝子のクローニング Seed らの開発したベクターCDM8を使ったｃＤＮＡライ
ブラリーをサルのCOS7細胞で発現させ、目的の遺伝子産
物 (この場合はＩL-５R ) に対する抗体、Ｈ７, Ｔ21を
用いてｃＤＮＡをスクリーニングする。方法は Seed ら
の報告 (Nature329, 840, (1988))に従う。

【００２０】まずCOS7細胞に上記ｃＤＮＡライブラリー
をDEAEデキストラン法及びプロトプラストフュージョン
法を用いてトランスフェクトする。目的のＩL-５R ｃＤ
ＮＡを発現可能な形でもつクローンはCOS7細胞上にその
遺伝子産物 (ＩL-５R ) を発現させるから、このCOS7細
胞をＨ７とＴ21抗体でインキュベートし、抗ラットＩｇ
Ｇ抗体でコートしたペトリディッシュに結合させる (Ｈ
７とＴ21は共にラットＩｇＧ抗体である) 。このペトリ
ディッシュに結合したCOS7細胞からプラスミドＤＮＡを
回収しさらにこのCOS7細胞での発現、抗体を用いた選別
を数回くり返す。最終的には個々のｃＤＮＡクローンを
COS7細胞に発現させＨ７とＴ21抗体を用いた蛍光染色を
おこない、フローサイトメトリーでＩL-５R のｃＤＮＡ
をコードするクローンを同定する。

【００２１】(２) ヒトＩL-５R 遺伝子のクローニングマウスＩL-５R ｃＤＮＡクローンである pＩL-５R.8 の
HindIII-PstＩ断片とハイブリダイズしたクローンを前
記マウスと同様の方法でヒト好酸球pAGS-3ライブラリー
より単離する。このクローンがヒトＩL-５R 遺伝子の全
長をコードしていない場合には、さらにこのクローン自
体をプローブとして他のライブラリー例えばλgt10ライ
ブラリーより全長を含むクローンを単離することができ
る。ＩL-５の結合実験 (１) マウスのＩL-５の結合実験抗ＩL-５R 抗体Ｈ７とＴ21を用いて単離されたｃＤＮＡ
クローンがＩL-５と特異的に結合するタンパク質をコー
ドしているかどうかをＩL-５結合実験を行なって検定す
る。³⁵Ｓ−メチオニンと³⁵Ｓ−システインを用いて放射
標識したＩL-５(J. Immunol. 140, 1175, (1988), J. E
xp. Med. 168, 863, (1988))をＩL-５RｃＤＮＡクロー
ンの候補を発現させたCOS7細胞に結合させ、この結合が
１00倍量の非標識ＩL-５によって特異的に阻害されるこ
とを確認する。

【００２２】(２) ヒトのＩL-５の結合実験ヒトのＩL-５の結合実験は、前述のマウスＩL-５の結合
実験と同様の方法で行うことができる。かかる結合実験
において、マーカーとなるＩL-５として、³⁵Ｓで放射標
識したマウスＩL-５；baculovirus の発現ベクターにヒ
トＩL-５ｃＤＮＡ遺伝子を組み込みこれを導入したSp
odoptera frugiperda の細胞であるSf21の培養上清から
抗ＩL-５抗体を用いて精製したヒトＩL-５；¹²⁵Ｉで放
射標識したヒトＩL-５等を用いることができる。ＩL-５の架橋実験と免疫沈降 (１) マウスＩL-５の架橋実験と免疫沈降ＩL-５R ｃＤＮＡの候補が現在までに報告されているＩ
L-５反応性初期Ｂ細胞株Ｔ88−Ｍと同じ分子をコードし
ているかどうかを³⁵Ｓ−放射標識ＩL-５を用いた架橋実
験により検討する (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86,
2311, (1989))。特に還元条件下の電気泳動においてＩL
-５の単量体に相当する分子量 (約22,000) が減少する
ことを確認する。ＩL-５R ｃＤＮＡの候補クローンをCO
S7細胞に発現させて細胞表面タンパク質をヨード化し抗
ＩL-５R 抗体、Ｈ７とＴ21を用いて免疫沈降を行ない
(Int. Immunol. ２, 181 (1990)) 、上記のように分子
量約６万の分子であることを確認する。

【００２３】(２) ヒトＩL-５の架橋実験と免疫沈降ヒトＩL-５R ｃＤＮＡの候補が、現在までに報告されて
いるヒト好酸球上のＩL-５Rをコードしているか否か
を、³⁵Ｓで標識したマウスＩL-５あるいは¹²⁵Ｉで放射
標識したヒトＩL-５を用いた架橋実験により検討する。
方法はマウスの場合に準ずる。ＩL-５R 遺伝子の全構造と膜離脱型ＩL-５R 遺伝子の単
離図１に単離したＩL-５R ｃＤＮＡの簡単な制限酵素地図
を示す。 pＩL-５R.8が最初にCDM8ライブラリーより単
離されたｃＤＮＡクローンである。このライブラリーか
ら pＩL-５R.8の HindIII-PstＩ断片をプローブとして
用いたコロニーハイブリゼーション法によりもう一つの
クローン pＩL-５R.2 を得る。これら２つのｃＤＮＡク
ローンの全塩基配列をSangerらの方法(Proc. Natl. Aca
d. Sci.USA. 74, 5463, (1977)) により決定する。

【００２４】pＩL-５R.8 の全塩基配列は配列番号２
に；その構造遺伝子部分に対応する塩基配列は配列番号
１に；構造遺伝子部分に対応するアミノ酸配列は配列番
号５に；そして pＩL-５R.8 の全塩基配列とその構造遺
伝子部分に対応するアミノ酸配列を同時に図11に記載す
る。ヌクレオチドは開始メチオニンコドンＡＴＧのＡを
１番として番号付けしてあり、またアミノ酸も同じメチ
オニンを一番としてある。 pＩL-５R.8 クローンの全長
は1808ヌクレオチドであり 415個のアミノ酸をコードす
る。またハイドロパシープロット (hydropathy plot:OF
URFS and ORFS,Rusell F. Doolittle, University Sci
ence Books, 1987)によるとこのタンパク質は４つの部
分よりなることがわかる。つまり、シグナルペプチド
(配列番号５においてNo.1〜No.17 アミノ酸部分；図11
において下線部分) 、細胞外部分、膜貫通部分、細胞内
部分である。なお、配列番号５において、32・128・213
・241・392・412 Asn から始まる３個のアミノ酸から成
る部分；及び図11において、二重のアンダーラインで示
されている部分は、Ｎ型糖鎖が結合していると考えられ
る部位を示す。配列番号６に pＩL-５R.8 の構造遺伝子
部分に対応するアミノ酸配列より、上記シグナルペプチ
ド部分と考えられる配列を除いたアミノ酸配列を記載す
る。クローン pＩL-５R.2 は膜貫通部分を欠いており
(図１) 、これにより発現されるＩL-５R は分泌型であ
る。これは配列番号５において、ＩL-５Rの膜貫通部分
と考えられるNo.340アミノ酸〜No.361アミノ酸を含むN
o.299アミノ酸からＣ末端に相当する部分；図11におい
ては、白い逆三角形で示された部分、がpIL-５R.2 にお
いて欠落していることからも裏付けられる。なお、図11
において星印はシステイン残基の存在を示す。pIL-５R.
2 の全塩基配列は配列番号４に；その構造遺伝子部分に
対応する塩基配列は配列番号３に；構造遺伝子部分に対
応するアミノ酸配列は配列番号７に；そして、 pＩL-５
R.2 の全塩基配列とその構造遺伝子部分に対応するアミ
ノ酸配列を同時に図12に記載する。図12において、白い
逆三角形で示された部分が欠失のある場所を示す他はす
べて記号は図11に準ずる。さらに配列番号８に pＩL-５
R.2 の構造遺伝子部分に対応するアミノ酸配列より、上
記シグナルペプチド部分と考えられる配列を除いたアミ
ノ酸配列を記載する。

【００２５】(２) ヒトＩL-５R 遺伝子の全構造図６に単離したヒトＩL-５R ｃＤＮＡの簡単な制限酵素
地図を示す。HSIL5RとHSIL5R2 の２つのクローンが得ら
れた。そしてこれらのクローンの全塩基配列は上記マウ
スと同様にしてSangerらの方法によって決定した。HSIL
5R及びHSIL5R2 の全塩基配列はそれぞれ配列番号10及び
配列番号12に；構造遺伝子部分に対応する塩基配列はそ
れぞれ配列番号9及び配列番号11に；そして全塩基配列
とその構造遺伝子部分に対応するアミノ酸配列を同時に
それぞれ図13及び図14に記載する。その結果、HSIL5Rは
420個の、HSIL5R2 は 396個のアミノ酸をコードしてい
ることが明らかになった。共にシグナルペプチド、細胞
外部分、膜貫通部分及び細胞内部分よりなるが、両者は
396番目のアミノ酸から塩基配列が異なっており、HSIL
-5R2はその下流に１個のアミノ酸をコードするだけで終
止コドンと連なっており、細胞内ドメインに相当する部
分が短かいことが明らかとなった。図13及び図14におい
て、下線で示した最初の20個のアミノ酸残基はシグナル
配列を示す。膜貫通部分はボックスで、Ｎ型糖鎖結合部
分は二重のアンダーラインを示す。また、星印はシステ
イン残基を、黒い逆三角形はHSIL5RとHSIL5R2 との相違
点のはじまりを示す。ノーザンブロットによるｍＲＮＡサイズとその発現細胞
の種類 (１) マウスＩL-５のｍＲＮＡサイズ及びその発現細胞
の種類 Poly(A)⁺ＲＮＡをＩL-５反応性初期Ｂ細胞株Ｙ16、慢性
Ｂ白血病細胞株BCL₁-B20, マウスミエローマ細胞株、 M
OPC104E, X5563, Ｌ細胞, ＩL-３反応性マウス骨髄細胞
長期培養株及びＩL-２反応性マウスＴ細胞株より調製し
てその２μgを用いてＩL-５R ｍＲＮＡの発現を検討す
る。プローブはpＩL-５R.8のHindIII-PstＩ断片を用
い、ノーザンブロットを行なう(Biochemistry 16, 4743
(1977))。Ｙ16, BCL₁-B20, MOPC104EというＩL-５反応
性の細胞に５ないし5.８kbのｍＲＮＡの発現が認められ
る。

【００２６】(２) ヒトＩL-５のｍＲＮＡサイズ及びそ
の発現細胞の種類 Poly(A)⁺ＲＮＡをヒト好酸球、ヒト幼若赤芽球様細胞株
TF-1、ヒト好酸球様白血病細胞株EoL-３、成人Ｔ白血病
細胞株ATL-２、バーキットリンパ腫細胞株Raji、ヒトマ
クロファージ様細胞Ｕ-937から調製して、その６μg を
用いてＩL-５R ｍＲＮＡの発現を検討する。プローブと
してHSIL-5R ｃＤＮＡ全長を用いた。その結果、ヒト好
酸球とTF-1に５.3kbと１.4kbのｍＲＮＡの存在が認めら
れる。ＩL-５R 遺伝子の発現 (１) マウスＩL-５R 遺伝子の発現本発明におけるＩL-５R 遺伝子の発現ベクターとしては
以下の２種のベクターが使用可能である (図２参照) 。

【００２７】CDM8ベクター；このベクターは、哺乳動物
細胞での強い発現ベクターであり、BstXＩ切断部位の間
にｃＤＮＡをBstXＩリンカーを結合させ挿入して使用す
る。pCAGGSベクター；このベクターはCDM8より強い発現
能力をもつpAGS-3 (Gene,79, 269, (1989))のプロモー
ター部位の上流に CMVエンハンサーをもつ。ｃＤＮＡの
挿入部位はラビットβ−グロビンのエクソン内のEcoRＩ
部位を XhoＩに変えた位置であり、pAGS-3よりさらに強
い発現が得られる。

【００２８】本発明の実施例におけるＩL-５R の発現実
験においてはこのうちpCAGGSベクターを用いて行った。
その手段は既に記述したＩL-５結合実験・架橋実験、及
びＨ７、Ｔ21抗体を用いた免疫沈降である。特に分泌型
と思われる pＩL-５R.2 に関してはこのベクターのEcoR
Ｉ部位に組み込んでサルのCOS7 (ATCC CRL 1651)細胞に
発現させその上清の産物のアミノ酸配列を決定した。そ
のＮ端20個のアミノ酸配列はＩL-５R ｃＤＮＡの塩基配
列から予想されるものと一致した。 pＩL-５R.2 をトラ
ンスフェクトしたCOS7の培養上清はＩL-５の受容体への
結合を阻害した。

【００２９】(２) ヒトＩL-5R遺伝子の発現ヒトＩL-５R ｃＤＮＡもマウスの場合と同様に、発現遺
伝子であるpCAGGSベクターのEcoRＩ部位にヒトＩL-５R
ＤＮＡを組み込んだ。λgt10からEcoRＩを用いて切り出
したヒトＩL-５R cＤＮＡを組み込んで、これをCOS7細
胞で発現させた。分泌型ヒトインターロイキン５レセプターの生産 HSIL5R cＤＮＡをBluescript SK(-)のEcoRＩ部位に挿入
する。これを制限酵素SalＩと KpnＩで消化し、その産
物をエキソヌクレアーゼIII でヒトＩL-５R の膜貫通部
分と細胞質内部分をコードしている塩基配列とを除くよ
うに消化する。この産物をマングビーンエクソヌクレア
ーゼで処理した後クレノウ断片で平滑端として再結合さ
せる (Gene 33: 103, 1985) 。この処理で配列番号10に
示したHSIL5R cＤＮＡの3'末端から 995番目の塩基まで
を欠失したクローンをひろう。この 995番目のアミノ酸
は分泌型マウスＩL-５R ｃＤＮＡにおける欠失の始まる
部分に相当する。かかる欠失突然変異部分を、制限酵素
EcoRＩとBssHIIで切り出し終止コドンを含むリンカーと
結合させ種々のベクターの適当な制限酵素部位に挿入す
る。あるいは、HSIL-5R ｃＤＮＡの欠失を3'末端から 9
96番目とすれば、この欠失によりフレームシフトがおこ
り構築物はBluescript SK(-)ベクター内に存在する２つ
の終止コドンを結果として持つことになる。

【００３０】このようにして膜貫通部分と細胞質部分を
欠失した 333個のアミノ酸がコードされた分泌型ヒトＩ
L-５R を発現させるＤＮＡが構築される。以上のように
して構築された発現ベクターは宿主に導入することが可
能で、発現ベクターにより形質転換された宿主は可溶性
ヒトインターロイキン５レセプターを生産する。発現ベ
クターの選択は宿主に依存して決定されるが、宿主とし
ては原核細胞、酵母または高等真核細胞が含まれる。原
核細胞にはグラム陰性菌またはグラム陽性菌が含まれ、
例えばE.coliまたはバシラス属の細菌である。高等真核
細胞には昆虫並びに哺乳動物由来の樹立された細胞系列
が含まれる。

【００３１】

【発明の効果】本発明によりはじめてマウス及びヒトの
ＩL-５レセプターをコードするＤＮＡが提供され、これ
により純粋なＩL-５レセプターを得ることが可能となっ
た。特にヒトＩL-５レセプターをコードするＤＮＡと相
同な分泌型マウスＩL-５レセプターをコードするＤＮＡ
をも得ることによって、当該分泌型ＩL-５レセプターＤ
ＮＡ又は人工的に作成したヒトＩL-５レセプターをコー
ドするｃＤＮＡを発現させることが可能となった。この
発現されたＩL-５レセプターは、ヒトＩL-５が関与する
可能性が強い自己免疫病及び好酸球増多を伴う疾病の治
療薬としての応用が期待され、医療あるいは医薬品工業
等において多大な貢献をすると考えられる。

【００３２】

【実施例】以下、実施例を挙げ本発明を具体的に説明す
る。実施例１. マウスＩL-５R の Poly(A) ⁺ ＲＮＡの調製２×10⁷個のＹ16細胞を４％ FCS・RPMI1640培地 (５×1
0^-5M ２−メルカプトエタノール、100U／mlペニシリ
ン、１00μg ／mlのストレプトマイシンを含む)でＩL-
５ (３00 pg／ml) の存在下に密栓して３Ｌのスピナー
カルチュアボトルで培養した。１週間後に約５×10⁹個
のＹ16細胞を得た。このうち１×10⁹個のＹ16細胞を Ok
ayamaらの方法により (前述の文献) 5.５M グアニジウ
ムチオシアネイト溶液 (25mM クエン酸ナトリウム、0.5
％ラウリルサルコシンナトリウム、0.２M ２−メルカプ
トエタノール、pH７.0) 50mlに溶解しセシウムトリフル
オロ酢酸溶液 (密度１.5ｇ／ml, 0.1M EDTA pH７.0) の
上に重層して15℃で125,000gにて24時間遠心分離した。
ＲＮＡはこの遠心分離でペレットとなり、これを10mM T
ris-HCl pH７.5と１mM EDTA を含む蒸留水に溶解してＲ
ＮＡ溶液とした。これをオリゴ(dT)−セルロースに通し
てその結合分画を Poly(A)⁺ＲＮＡとした(Molecular Cl
oning, Chapter 7, page 26, Cold Spring Harbor Labo
ratory Press (1989))。この操作を２回くり返して30μ
g の Poly(A)⁺ＲＮＡを得た。実施例２. マウスＩL-５R のｃＤＮＡライブラリーの作
製上述の30μgの Poly(A)⁺ＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し
(ＢＲＬ社, Bethesda,MDのｃＤＮＡ合成キットを使用)
Seedらの方法 (既に述べた) に従ってCDM8ベクターを使
ったｃＤＮＡライブラリーを作成した。図２ＡのCDM8ベ
クターをBstXＩにて消化し、生じた約4100塩基対の断片
を酢酸カリウム密度勾配遠心法により精製した。合成し
たｃＤＮＡにBstXＩリンカーを結合させ、酢酸カリウム
密度勾配遠心法により、約1000塩基対以上の長さを持つ
ｃＤＮＡを選別しこれを前述のBstXＩ消化後、精製した
CDM8ベクターをリゲーションさせた。さらにこれを大腸
菌MC1061／P3に移入し独立した約２00万個の形質転換体
を得、ｃＤＮＡライブラリーとした。実施例３. マウスＩL-５R のｃＤＮＡライブラリーのス
クリーニング Seedらの方法 (前述) に従って目的の遺伝子産物に対す
る抗体を使ってのパニング法を用いた。まず上述の約２
00万個のｃＤＮＡライブラリーより精製したプラスミド
ＤＮＡをCOS7細胞にDEAE−デキストラン法を用いて移入
した。５×10⁵／６cmディッシュの細胞濃度で前日まき
なおしたCOS7細胞ディッシュ１枚あたり２μg のプラス
ミドＤＮＡを使用した。ディッシュ１00枚分のCOS7細胞
をトランスフェクトした。２日後にCOS7細胞をはがして
Ｈ７とＴ21抗体とインキュベートし、これらの抗体の結
合したCOS7細胞をヤギ抗ラットＩｇＧ抗体を結合させた
ディッシュ上で選択した (パニング法) 。このようにし
てＨ７とＴ21抗原陽性の細胞からプラスミドＤＮＡを回
収し、MC1061／P3をもう一度形質転換して大腸菌のコロ
ニーを得た。この大腸菌をプロトプラストフュージョン
法によりCOS7細胞に融合して再度上記のパニングを行な
った。このサイクルを３回くり返した後、さらに２回ヤ
ギ抗ラットＩgＧ抗体のＦ(ab')₂ フラグメントを用いた
上記スクリーニングをくり返した。この操作はＦｃレセ
プター遺伝子の混入を防ぐためのものである。以上６回
のパニングの後、50個の独立したコロニーより精製した
プラスミドＤＮＡをCOS7細胞に発現させ解析したとこ
ろ、１個がＨ７とＴ21抗原を発現していた。これを pＩ
L-５R.8と名づけた。この pＩL-５R.8のｃＤＮＡインサ
ートをプローブとして用いたコロニーハイブリゼーショ
ン法(Molecular Cloning,Capterl, pege 90 Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press (1989))により、Ｙ16細胞
より作成した前述のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングした。プローブとしては pＩL-５R.8 の HindIII-P
stＩ断片を精製し、ランダムプライマー法により、α³²
P-dCTPで放射標識としたものを用いた。ＬＢアガロース
寒天培地に約１0000コロニー／10cmディッシュの濃度で
前述のライブラリーを接種し、一晩培養して発育したコ
ロニーのＤＮＡをニトロセルロース膜に移し、前述のプ
ローブとハイブリダイズさせ、オートラジオグラフィを
行った。これより単離した１つのクローンを pＩL-５R.
2 と名づけた。実施例４. スクリーニングしたマウスＩL-5R cＤＮＡの
塩基配列の解析 pＩL-５R.8 のｃＤＮＡ部分を XbaＩで切り出しＭ13mp1
9ベクターに挿入した。BamHＩと KpnＩで切断してエキ
ソヌクレアーゼIII にて消化し、10分間まで１分間ごと
に反応を止めた。その後マングビーンヌクレアーゼによ
り末端を平滑化し、クレノウフラグメントで末端を修復
した後リゲーションをおこなった (Gene33, 103 (198
5))。これらの反応物で大腸菌JM109を形質導入して種々
の長さの欠失突然変異体を得た。これらから１本鎖ＤＮ
Ａを調製し(Methods in Enzymology101, 58 (1983))配
列番号15の配列を有するＭ13プライマーを用いてSangar
法にて塩基配列を決定した。ｃＤＮＡの挿入が逆向きの
Ｍ13でも同じ方法で欠失突然変異体を作成し、両方向の
塩基配列の相補性を確認した。 pＩL-５R.8 の全塩基配
列等は配列番号２及び図11に示してある。最初の17個の
アミノ酸は理論的にシグナルペプチドであり(Nucleic.
Acids. Res. 14, 4683 (1986))、またNo.340アミノ酸〜
No.361アミノ酸部分はハイドロパシープロット(hydropa
thy plot)により細胞膜貫通部分であると考えられた。
２本線のアンダーラインはＮ型糖鎖が結合していると思
われる部位を示している。理論的分子量45,284と実際に
COS7細胞で産生されるリコンビナントＩL-５R の分子量
約60,000との差はＮ型糖鎖によって説明できる。配列番
号５におけるNo.299アミノ酸からＣ末端にかけての部分
はpＩL-５R.2 において欠失している塩基配列を示して
いる。 pＩL-５R.2 の塩基配列 (配列番号４) は、 pＩ
L-５R.8 の塩基配列を基にして17塩基より成るプライマ
ーを幾つか合成し、これらと配列番号16に示した配列を
有するＴ７プライマー及び配列番号17に示した配列を有
するCDM8の3'側プライマーを用いてSanger法により決定
した。 pＩL-５R.2 では、フレームシフトが起きる結
果、欠失後は４つのアミノ酸で翻訳が終止する。このＤ
ＮＡから翻訳されるべきペプチドはＢ細胞や好酸球の分
化過程で分泌型として働く可能性が考えられた。実施例５. マウスＩL-５R ｃＤＮＡの発現・結合実験 pＩL-５R.8 (CDM8ベクター) からｃＤＮＡを XhoＩで切
り出し図２ＢのpCAGGSベクターの XhoＩ部位に挿入した
(pCAGGSのEcoRＩ部位は XhoＩリンカーを結合すること
により、 XhoＩ部位に変換してある) 。生じたプラスミ
ドをpCAGGS.5R.8 と名付けた。このプラスミドpCAGGS.5
R.8 はこれを大腸菌を導入し、E.coli, 5R.8とし、工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託した。この寄託番号
は微工研条寄第3085号 (FERM BP 3085) である。

【００３３】pＩL-５R.8 及びpCAGGS.5R.8 をトランス
フェクトしたCOS7細胞を２日間培養後に回収し、その一
部 (２〜10×10⁴個の細胞) と種々の濃度の³⁵Ｓ−放射
標識ＩL-５ (２.5×10⁸cpm／μg ) とを１00倍過剰量の
非標識ＩL-５の存在下および非存在下にて、37℃10分間
加温し、細胞に結合したＩL-５数およびその解離定数(K
d) を求めた。図３内右上に直接結合実験のデータを図
はそれをスキャッチャード (Scatchard)解析(Ann N. Y.
Acad. Sci. 51, 660 (1949)) したものを示す(図３)
。図３ＡはCDM8ベクターを使った pＩL-５R.8 でトラ
ンスフェクトしたCOS7細胞を使用したときの結果であ
り、kd値は２nM、結合部位数は12,000／cellであった。
図３ＢはpCAGGS.5R.8 をCOS7細胞にトランスフェクトし
た時の結果である。この場合得られたKd値は９.6nM、結
合部位数は８.8×10⁵／cellであった。また図３ＣはＩL
-５ cＤＮＡを単離したＹ16株を用いた結合実験の結果
である。Ｙ16株は解離定数 (Kd)20pM 、結合部位数 1,2
00／cellの高親和性受容体とKd5.１nM、結合部位数22,0
00／cellの低親和性受容体をもつ。これらの実験から今
回単離されたＩL-５結合遺伝子は低親和性受容体の遺伝
子であることが示された。実施例６. cＤＮＡ由来のＩL-５R を用いての架橋実験 pCAGGS.5R.8 の方が pＩL-５R.8 よりも発現率が高いの
で以後この cＤＮＡクローンを用いて実験を試みた。

【００３４】pCAGGS.5R.8(レーン３−６) またはベクタ
ーのみ (レーン１, ２) を遺伝子移入したCOS7細胞 (１
×10⁵個) を４nMの³⁵Ｓ−放射標識ＩL-５と100倍過剰量
の非標識ＩL-５の存在下 (図４レーン２, ４, ６) およ
び非存在下 (図４レーン１,３, ５) にて37℃10分間加
温した。その後、細胞をよく洗浄後disuccinimidyl tar
tarate(DST) (PIECE. Chemical社 Rockford, IL)を添加
し４℃30分間加温、続いて細胞を１％ TritonX-100にて
破砕した。細胞破砕液を７.5％ SDS−ポリアクリルアミ
ドゲル内で、非還元下 (図４レーン１〜４) または還元
下 (図４レーン５, ６) で電気泳動しBio-Analyzer 100
(フジフィルム社) で解析した (図４)。Mitaらの報告
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 2311, (1989)) で
低親和性受容体に相当すると思われる90〜100Kd のバン
ドが認められた。この分子は還元条件下での泳動では分
子量が約75Kdに低下した (図４レーン５) 。これはＩL-
５のモノマーの分子量 (22,000) の低下を示しており低
親和性ＩL-５R の性質を示すものである。実施例７. cＤＮＡ由来のマウスＩL-５R を用いての免
疫沈降 pCAGGS.5R.8トランスフェクトCOS7細胞 (５×10⁶個) の
細胞表面をヨードビーズ (Pierce Chemical社, Rockfor
d, IL) を用いて¹²⁵Ｉ−放射標識し、それらの細胞破壊
液をＨ７抗体と反応させた。その後プロテインG-Sephar
ose (Pharmacia社、Piscat away, NJ)と４℃12時間反応
させ、プロテインＧ−Sepharose に吸着したタンパク質
をSDS-PAGEにて還元条件下に電気泳動しBio-Analyzer 1
00で解析した。分子量約60kdのバンドがpCAGGS.5R.8 を
トランスフェクトしたCOS7の場合にのみ見られた (図
５) 。実施例８. 分泌型マウスＩL-５R の精製とアミノ酸配列
の決定 pＩL-５R.2 ｃＤＮＡのXhoＩ断片を pＩL-５R.8の場合
と同様にpCAGGSベクターに挿入し、プラスミドpCAGGS.5
R.2 を得た。このプラスミドpCAGGS.5R.2 は、これを大
腸菌に導入し、E.coli 5R.2 として、工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託した。この寄託番号は微工研条寄
第3084号 (FERM BP 3084) である。このクローンpCAGG
S.5R.2 ＤＮＡをCOS7細胞にDEAE dextran法にてトラン
スフェクトし無血清培地 (イスコフのDMEM) で２日間培
養した。その培養上清を濃縮してSDS-PAGEにかけるとpC
AGGS.5R.2 をトランスフェクトしたCOS7の培養上清には
ベクターＤＮＡを移入したものに比して分子量約５万の
バンドが特異的に発現されていることが判明した。また
pCAGGS.5R.2 をトランスフェクトしたCOS7の培養上清を
Ｈ７を結合したグリコシルハードゲル (生化学工業、To
kyo)に吸着させ０.1％CHAPSを含む２mM HEPES溶液で洗
浄し、350mMの酢酸で結合分画を溶出した。このサンプ
ルを凍結乾燥し、SDS-PAGE用のサンプルバッファーに可
溶化させLaemmliの方法(Nature 227, 680 (1970)) で電
気泳動をし、polyvinylidene difluoridemembrane (Mil
lipore, Bedford, MA) に Electro blotting 法にて移
し、分子量約５万の分子のバンドを切断して気相シーク
エンサー477A (HPLCシステム付属、Applied Biosystem
Co.)で分析した。その結果、ＩL-５R の分泌型タンパク
質のＮ末端は配列番号18に示した通りであり膜型ＩL-５
R ｃＤＮＡクローン pＩL-５R.8 のＤＮＡ塩基配列から
予想される18番目から37番目のアミノ酸配列に一致し
た。１−17番目まではシグナルペプチドであると予想さ
れた。15番目のXaa はｃＤＮＡからの予想ではAsn であ
りＮ型糖鎖が結合していると考えられた。実施例９. ヒトＩL-５R Poly(A) ⁺ ＲＮＡの調製 28Ｌの健康な成人の末梢血および50mlの好酸球増多症患
者の末梢血より赤血球を除いた後、 Percoll (ファルマ
シア社製) を用いた密度勾配遠心により1.09ｇ／mlに相
当する分画を集めた。

【００３５】この結果、健常人の末梢血より細胞数２.8
×10⁹個の好酸球50％分画を、好酸球増多症患者の末梢
血より細胞数２×10⁹個の好酸球50％分画を得た。これ
らの細胞より実施例１のマウスの場合と同様にして Pol
y(A)⁺ＲＮＡを各々５μg 調製した。実施例10. ヒトＩL-５R ｃＤＮＡライブラリーの作製上記 Poly(A)⁺ＲＮＡ５μg より、実施例２のマウスの
場合と同様にしてｃＤＮＡを合成し、pAGS-3ベクターと
λgt10ベクターにそれぞれ挿入した。健康成人の血液か
らの好酸球由来ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡにBstX１
リンカーを結合したのち約1000塩基対以上の長さを持つ
ｃＤＮＡを選別し、これをBstX１消化したpAGS-3ベクタ
ーに挿入した。さらにこれを大腸菌MC1061に移入し、独
立した約１00万個の形質転換体を得て、これをｃＤＮＡ
ライブラリーとした。

【００３６】また、上記好酸球増多症患者由来のｍＲＮ
Ａ５μg から合成したｃＤＮＡはEcoRＩリンカーを結合
して1000塩基以上を選別し、これをλgt10ベクターに挿
入して大腸菌C600 Hflに感染させ約160万個の独立のプ
ラークを得た。実施例11. クロスハイブリダイゼーション法によるヒト
ＩL-５R ｃＤＮＡクローンの単離マウスＩL-５R ｃＤＮＡクローン pＩL-５R.8 ｃＤＮＡ
の³²Ｐ−放射標識したHindIII-PstＩ 1.2kb断片を用い
てpAGS-3 cＤＮＡライブラリーより緩やかな条件でコロ
ニーハイブリダイゼーションをすることによりクローン
ph５R.1 を得た。

【００３７】すなわち、約１00万個のpAGS-3 cＤＮＡク
ローンの大腸菌コロニーを直径８cmのニトロセルロース
膜約１00枚に移し、10×Denhart's 溶液６×SSC (0.9M
NaCl, 0.09M クエン酸ナトリウム塩) と１00μg ／mlの
熱変性サケ***ＤＮＡの溶液中で上記プローブと65℃で
24時間ハイブリダイズさせた。このニトロセルロース膜
を45℃で１×SSC と０.1％ SDSの存在下で洗浄後、前記
したマウスの方法に準じてオートラジオグラフィーにて
コロニーを固定し、唯一単離された cＤＮＡクローンを
ph５R.1 と名付けた。

【００３８】しかしながら、このph５R.1 は１.0kbの c
ＤＮＡしか含まず、ヒトＩL-５R ＤＮＡの全長を含むと
は考えられなかった。そこで、かかる１.0kbの cＤＮＡ
の全長である XhoＩ断片をプローブとしてさらにλgt10
の cＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。約１00
万個のλgt10 cＤＮＡライブラリーを直径13cmのナイロ
ンメンブレン(Colony／plaque screen, Du Pont-NEN, B
oston, MA) に移し、上記プローブを用いて、Colony／p
laque screen のプロトコールに従ってハイブリダイゼ
ーションを行なった。なお、このハイブリダイゼーショ
ンに用いた溶液は、１％ SDS,１M NaCl、10％デキスト
ラン硫酸、１00μg ／mlの熱変性サケ***ＤＮＡで；こ
れを上記プローブと共に65℃、24時間のインキュベーシ
ョンを行なった。また洗浄は、65℃下、２×SSC １％ S
DSで１時間行なった。

【００３９】この操作により、約２kbの cＤＮＡを有す
る２つのクローンを単離し、それぞれ、HSIL5RとHSIL5R
2と名付けた。この２つのクローンで E.coli を形質転
換し、HSIL5RとHSIL5R2 のそれぞれについて形質転換株
を得た。HSIL5Rに対応する形質転換株をE.coli HSIL5R
とHSIL5R2に対する形質転換株をE.coli HSIL5R2と命名
し、それぞれを工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
した。前者の寄託番号は、微工研条寄第3542号(FERM BP
3542)であり、後者の寄託番号は、微工研条寄第3543号
(FERM BP 3543)である。実施例12. スクリーニングしたヒトＩL-５R ｃＤＮＡ塩
基配列の解析 HSIL5RとHSIL5R2 のｃＤＮＡ部分をEcoRＩで切り出し、
EcoRＩで消化したBluescript KS(-)ベクター (stratage
ne, La JoNa, CA)に導入した。塩基配列はマウスの場合
と同様Sanger法にて決定した。塩基配列はｃＤＮＡの両
方向から決定した。すなわち、はじめにSanger法による
塩基配列の決定に用いるプライマーとして、5'側のｃＤ
ＮＡ上流部分に位置するＩL-５R ｃＤＮＡ断片 (Ｔ３プ
ライマー：配列番号17参照）と3'側のｃＤＮＡ上流部分
に位置するＩL-５R ｃＤＮＡ断片(Ｔ７プライマー：配
列番号16参照) を用い、それぞれ逆方向に (前者は下流
に向けて、後者は上流に向けて) 読み取った塩基配列を
合成して新たなプライマーとして用い、順次これを繰り
返すことによって２方向から塩基配列を決定して相補性
を確認した。

【００４０】HSIL5Rの全塩基配列は配列番号10及び図13
に示した。実施例４に示したマウスの場合と同様にして
アミノ酸No.1〜No.20 に相当するアミノ酸配列は理論的
にシグナルペプチドでありまた、アミノ酸No.345〜No.3
65に相当するアミノ酸配列はハイドロパシープロット
(hydropathy plot)(Nucleic. Acids. Res. 14, 4683 (1
986))により細胞膜貫通部分であると考えられた。35, 1
31, 137, 142, 216, 244 Asn から始まる３個のアミノ
酸からなる部分は、Ｎ型糖鎖が結合していると思われる
部位を示している。このＮ型糖鎖の存在により、理論分
子量 45556と実際にCOS7細胞で産生されるリコンビナン
トＩL-５R の分子量約60,000との差を説明することがで
きる。HSIL5RとHSIL5R2 との配列の相違はアミノ酸No.3
95から始まることが判明した。

【００４１】HSIL5R2 の全塩基配列は配列番号12及び図
14に示した通りである。 395番目のアミノ酸がグリシン
で、 396番目のアミノ酸がイソロイシンであり、これが
最終アミノ酸であった。従って、HSIL5RとHSIL5R2は、
395番目のアミノ酸まで129番目を除き同じで、HSIL5R2
は396番目のイソロイシンで終結しているが、HSIL5Rは3
96番目のセリン以降さらに24個のアミノ酸が付加されて
いた。HSIL5Rの 129番目のアミノ酸はバリンであった
が、 HSIL5R2の129番目のアミノ酸はイソロイシンであ
った。実施例13. ヒトＩL-５R ｃＤＮＡの発現・結合実験 HSIL5Rと HSIL5R2を共にEcoRＩで消化して切り出してpC
AGGSベクターのEcoRＩ部位に挿入した。生じたプラスミ
ドをそれぞれpCAGGS. HSIL5R及びpCAGGS. HSIL5R2と名
付けた。

【００４２】この２種類のプラスミドをCOS7細胞に導入
し、発現させて、³⁵Ｓで標識したマウスＩL-５又は ¹²⁵
Ｉで標識したヒトＩL-５ (２×10⁶cpm／μg ) を用いて
結合試験を行なった。図７Ａ, 図７ＢはヒトＩL-５を使
った場合の、図８Ｃ, 図８ＤはマウスＩL-５を使った場
合のスキャッチャード (Scatchard)解析の結果である。
図７及び図８の挿入図は上記結合試験の結果を示す。す
なわち図７Ａ, 図８Ｃは発現プラスミドとしてpCAGGS.H
SIL5Rを用いた場合の¹²⁵Ｉ−放射標識ヒトＩL-５、³⁵Ｓ
−放射標識マウスＩL-５それぞれに対する結果を示し、
図８Ｃ，図８Ｄは、発現プラスミドとしてpCAGGS.HSIL5
R2を用いた場合の¹²⁵Ｉ−放射標識ヒトＩL-５、³⁵Ｓ−
放射標識マウスＩL-５に対する結果を示す。

【００４３】¹²⁵Ｉ−放射標識したＩL-５を使用した場
合には、その放射活性が低いことから結合定数 (Kd) が
１00pM以下である高親和性の誘導体を検出することは困
難であった。そこで、高い放射比活性を有しかつ変性し
ていない³⁵Ｓ−放射標識したＩL-５を用いてKd値を求め
た。すなわち、pCAGGS.HSIL5R でトランスフェクトした
COS7細胞を用いた場合、 ¹²⁵Ｉ−放射標識ヒトＩL-５に
対してはKdは約590pMで³⁵Ｓ−放射標識マウスＩL-５に
対してKdは約250pMであった。

【００４４】pCAGGS.HSIL5R2でトランスフェクトしたCO
S7細胞を用いた場合には、¹²⁵Ｉ−放射標識ヒトＩL-５
に対してはKdは約410pM で³⁵Ｓ−放射標識マウスＩL-５
に対してKdは約355pMであった。上記のKd値は、本発明
者が、³⁵Ｓ−放射標識マウスＩL-５を用いた結合試験を
行ないスキャッチャード (Scatchard)解析より得た健康
な成人の末梢血由来の好酸球に対するＩL-５のKd値であ
る170〜330pMにほぼ相当した。

【００４５】かかるＩL-５に対するＩL-５R のKd値は、
マウスの低親和性受容体に対するＩL-５のKd値よりも高
くかつ前記の通り健康な成人の末梢血由来の好酸球に対
するＩL-５のKd値とほぼ一致することから、今回本発明
者らが単離したヒトＩL-５レセプター遺伝子はヒトＩL-
５結合に関して非常に重要な役割を果している分子をコ
ードしていることを示している。

【００４６】図９は、HSIL5RがコードするヒトＩL-5Rの
リガンド結合特異性を示したものである。pCAGGS.HSIL5
Rを導入したCOS7細胞 (４×10⁵／１00μl) に５00pMの
¹²⁵Ｉ−放射標識ヒトＩL-５を加え、同時に¹²⁵Ｉ−放射
標識ヒトＩL-５と競合させるべき種々のサイトカインを
加えた。この結果、単離したヒトＩL-５レセプターはヒ
ト及びマウスのＩL-５と特異的に結合し、ＩL-２、ＩL-
３、ＩL-４、ＩL-６、GM-CSF、G-CSF とは結合しないこ
とが明らかになった。実施例14. ｃＤＮＡ由来のヒトＩL-５R を用いての架橋
実験 pCAGGS.HSIL5R又はpCAGGS.HSIL5R2を導入した１×10⁵個
のCOS7細胞を５.5nMの³⁵Ｓ−放射標識マウスＩL-５又
は、１nMの ¹²⁵Ｉ−放射標識ヒトＩL-５と共に４℃で１
時間インキュベート後、１mMの bis (sulfosuccinimidy
l) suberate (Pierce Chemical Co., Rockford, IL)を
これに加えた。そして、さらに４℃で30分間インキュベ
ートした。このインキュベーションの後、実施例６のマ
ウスの場合と同様に解析した。

【００４７】図10は、pCAGGSを導入したCOS7細胞の系を
対照として (レーン１, ４) 、pCAGGS.HSIL5Rを導入し
たCOS7細胞と³⁵Ｓ−放射標識マウスＩL-５ (レーン１,
２,３) 又は ¹²⁵Ｉ−放射標識ヒトＩL-５ (レーン４,
５, ６) とを架橋させて得られた電気泳動図である。pC
AGGS.HSIL-5Rを導入したCOS7細胞を³⁵Ｓ−放射標識マウ
スＩL-５と過剰量の放射標識をしていないＩL-５の存在
下 (レーン３) 又は非存在下 (レーン２) で反応させ
た。さらに ¹²⁵Ｉ−放射標識ヒトＩL-５と過剰量の放射
標識をしていないＩL-５の存在下 (レーン６) 又は非存
在下 (レーン５)で反応させた。

【００４８】この結果、過剰量のＩL-５の非存在下にお
いては、レーン２において約105kd;レーン５において約
86kdのバンドが認められ、マウスのＩL-５を45kd、ヒト
のＩL-５を31kdとして計算した結果、それぞれ約60kdと
55kdの分子がＩL-５と結合していることが予想された。
これは前述の健康な成人の末梢血由来の好酸球で本発明
者が見出した分子とほぼ同じ分子量であった (Cellular
Immunology, 133；484-469)。

【００４９】なお、いずれのバンドも非標識のＩL-５の
存在下では消失した。

【００５０】

【配列表】配列番号：1 配列の長さ：1245 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源：BALB/c マウス早期Ｂ細胞株 Y16 （骨髄由来）直接の起源：ＣＤＭ８ライブラリー配列の特徴特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：1..51 特徴を決定した方法：E 配列の特徴特徴を表す記号：N 型糖鎖binding-site 存在位置：94..102, 382..390, 637..645, 721..729, 1174..1182, 1234..124 2 特徴を決定した方法：S 配列の特徴特徴を表す記号：膜貫通部分存在位置：1018..1083 特徴を決定した方法：S 配列の特徴特徴を表す記号：pIL-5R.2欠失部分存在位置：986..1164 特徴を決定した方法：E 配列 ATGGTGCCTG TGTTACTAAT TCTTGTGGGA GCTTTGGCAA CACTGCAAGC TGACTTACTT 60 AATCACAAAA AGTTTTTACT TCTACCACCT GTCAATTTTA CCATTAAAGC CACTGGATTA 120 GCTCAAGTTC TTTTACACTG GGACCCAAAT CCTGACCAAG AGCAAAGGCA TGTTGATCTA 180 GAGTATCACG TGAAAATAAA TGCCCCACAA GAAGACGAAT ATGATACCAG AAAGACTGAA 240 AGCAAATGTG TGACCCCCCT TCATGAAGGC TTTGCAGCTA GCGTGAGGAC CATTCTGAAG 300 AGCAGCCATA CAACTCTGGC CAGCAGTTGG GTTTCTGCTG AACTCAAAGC TCCACCAGGA 360 TCTCCTGGAA CCTCGGTTAC GAATTTAACT TGTACCACAC ACACTGTTGT AAGTAGCCAC 420 ACCCACTTAA GGCCATACCA AGTGTCCCTT CGTTGCACCT GGCTTGTTGG GAAGGATGCC 480 CCTGAGGACA CACAGTATTT CCTATACTAC AGGTTTGGTG TTTTGACTGA AAAATGCCAA 540 GAATACAGCA GAGATGCACT GAACAGAAAT ACTGCATGCT GGTTTCCCAG GACATTTATC 600 AACAGCAAAG GGTTTGAACA GCTTGCTGTG CACATTAATG GCTCAAGCAA GCGTGCTGCA 660 ATCAAGCCCT TTGATCAGCT GTTCAGTCCA CTTGCCATTG ACCAAGTGAA TCCTCCAAGG 720 AATGTCACAG TGGAAATTGA AAGCAATTCT CTCTATATAC AGTGGGAGAA ACCACTTTCT 780 GCCTTTCCAG ATCATTGCTT TAACTATGAG CTGAAAATTT ACAACACAAA AAATGGTCAC 840 ATTCAGAAGG AAAAACTGAT CGCCAATAAG TTCATCTCAA AAATTGATGA TGTTTCTACA 900 TATTCCATTC AAGTGAGAGC AGCTGTGAGC TCACCTTGCA GAATGCCAGG AAGGTGGGGC 960 GAGTGGAGTC AACCTATTTA TGTGGGAAAG GAAAGGAAGT CCTTGGTAGA ATGGCATCTC 1020 ATTGTGCTCC CAACAGCTGC CTGCTTCGTC TTGTTAATCT TCTCACTCAT CTGCAGAGTG 1080 TGTCATTTAT GGACCAGGTT GTTTCCACCG GTTCCGGCCC CAAAGAGTAA CATCAAAGAT 1140 CTCCCTGTGG TTACTGAATA TGAGAAACCT TCGAATGAAA CCAAAATTGA AGTTGTACAT 1200 TGTGTGGAAG AGGTTGGATT TGAAGTCATG GGAAATTCCA CGTTT 1245

【００５１】配列番号：2 配列の長さ：1808 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源：BALB/c マウス早期Ｂ細胞株 Y16 （骨髄由来）直接の起源：ＣＤＭ８ライブラリー配列の特徴特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：303..353 特徴を決定した方法：E 配列の特徴特徴を表す記号：N 型糖鎖binding-site 存在位置：396..404, 684..692, 939..947, 1023..1031, 1476..1484, 1536.. 1544 特徴を決定した方法：S 配列の特徴特徴を表す記号：膜貫通部分存在位置：1320..1385 特徴を決定した方法：S 配列の特徴特徴を表す記号：pIL-5R.2欠失部分存在位置：1288..1466 特徴を決定した方法：E 配列 GAAATAATTG GTAAACACAG AAAATGTTTC AATAGAAAAA AGAGGAAACA GAACACTGTG 60 TAGCCCTGTT ATCAGCAGAG ACAGAGCTAA CGCTGGGGAT ACCAAACTAG AAGAAGCTCA 120 CTGGACAGGT CCCGGTATGC AGTTCTATTT TTGTTGATGG CTCTGTATCT AATGTGTTCA 180 TTTGTACCAA GGATCTAACC AGGGTCTTCC AGAGTCTGAG CAAGCTTCTC CCACTGAGCT 240 ACATCACAGC CCCCTGTTTA TTGGAAGAAG AAATACTTAC ACCTTTCCAG TATTCGGCTA 300 CCATGGTGCC TGTGTTACTA ATTCTTGTGG GAGCTTTGGC AACACTGCAA GCTGACTTAC 360 TTAATCACAA AAAGTTTTTA CTTCTACCAC CTGTCAATTT TACCATTAAA GCCACTGGAT 420 TAGCTCAAGT TCTTTTACAC TGGGACCCAA ATCCTGACCA AGAGCAAAGG CATGTTGATC 480 TAGAGTATCA CGTGAAAATA AATGCCCCAC AAGAAGACGA ATATGATACC AGAAAGACTG 540 AAAGCAAATG TGTGACCCCC CTTCATGAAG GCTTTGCAGC TAGCGTGAGG ACCATTCTGA 600 AGAGCAGCCA TACAACTCTG GCCAGCAGTT GGGTTTCTGC TGAACTCAAA GCTCCACCAG 660 GATCTCCTGG AACCTCGGTT ACGAATTTAA CTTGTACCAC ACACACTGTT GTAAGTAGCC 720 ACACCCACTT AAGGCCATAC CAAGTGTCCC TTCGTTGCAC CTGGCTTGTT GGGAAGGATG 780 CCCCTGAGGA CACACAGTAT TTCCTATACT ACAGGTTTGG TGTTTTGACT GAAAAATGCC 840 AAGAATACAG CAGAGATGCA CTGAACAGAA ATACTGCATG CTGGTTTCCC AGGACATTTA 900 TCAACAGCAA AGGGTTTGAA CAGCTTGCTG TGCACATTAA TGGCTCAAGC AAGCGTGCTG 960 CAATCAAGCC CTTTGATCAG CTGTTCAGTC CACTTGCCAT TGACCAAGTG AATCCTCCAA 1020 GGAATGTCAC AGTGGAAATT GAAAGCAATT CTCTCTATAT ACAGTGGGAG AAACCACTTT 1080 CTGCCTTTCC AGATCATTGC TTTAACTATG AGCTGAAAAT TTACAACACA AAAAATGGTC 1140 ACATTCAGAA GGAAAAACTG ATCGCCAATA AGTTCATCTC AAAAATTGAT GATGTTTCTA 1200 CATATTCCAT TCAAGTGAGA GCAGCTGTGA GCTCACCTTG CAGAATGCCA GGAAGGTGGG 1260 GCGAGTGGAG TCAACCTATT TATGTGGGAA AGGAAAGGAA GTCCTTGGTA GAATGGCATC 1320 TCATTGTGCT CCCAACAGCT GCCTGCTTCG TCTTGTTAAT CTTCTCACTC ATCTGCAGAG 1380 TGTGTCATTT ATGGACCAGG TTGTTTCCAC CGGTTCCGGC CCCAAAGAGT AACATCAAAG 1440 ATCTCCCTGT GGTTACTGAA TATGAGAAAC CTTCGAATGA AACCAAAATT GAAGTTGTAC 1500 ATTGTGTGGA AGAGGTTGGA TTTGAAGTCA TGGGAAATTC CACGTTTTGA TGGCATTTTG 1560 CCATTCTGAA ATGAACTCAT ACAGGACTCC GTGATAAGAG CAAGGACTGC TATTTCTTGG 1620 CAAGGAGGTA TTTCAAATGA ACACTCAGAG CCAGGCGGTG GTAGAGCTCG CCTTTAATAC 1680 CAGCACCTGG GATGCACAGA CGGGAGGATT TCTGAGTTCG AGGCCAGCTT GGTCTATAAA 1740 GTGAGTTCCA GGACAGCCAG AGCTACACAG AGAAACCCTG TCTCGAAAAA ACAAACAAAC 1800 AAACAAAC 1808

【００５２】配列番号：3 配列の長さ：996 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源：BALB/c マウス早期Ｂ細胞株 Y16 （骨髄由来）直接の起源：ＣＤＭ８ライブラリー配列の特徴特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：1..51 特徴を決定した方法：E 配列の特徴特徴を表す記号：N 型糖鎖binding-site 存在位置：94..102, 382..390, 637..645, 721..729 特徴を決定した方法：S 配列 ATGGTGCCTG TGTTACTAAT TCTTGTGGGA GCTTTGGCAA CACTGCAAGC TGACTTACTT 60 AATCACAAAA AGTTTTTACT TCTACCACCT GTCAATTTTA CCATTAAAGC CACTGGATTA 120 GCTCAAGTTC TTTTACACTG GGACCCAAAT CCTGACCAAG AGCAAAGGCA TGTTGATCTA 180 GAGTATCACG TGAAAATAAA TGCCCCACAA GAAGACGAAT ATGATACCAG AAAGACTGAA 240 AGCAAATGTG TGACCCCCCT TCATGAAGGC TTTGCAGCTA GCGTGAGGAC CATTCTGAAG 300 AGCAGCCATA CAACTCTGGC CAGCAGTTGG GTTTCTGCTG AACTCAAAGC TCCACCAGGA 360 TCTCCTGGAA CCTCGGTTAC GAATTTAACT TGTACCACAC ACACTGTTGT AAGTAGCCAC 420 ACCCACTTAA GGCCATACCA AGTGTCCCTT CGTTGCACCT GGCTTGTTGG GAAGGATGCC 480 CCTGAGGACA CACAGTATTT CCTATACTAC AGGTTTGGTG TTTTGACTGA AAAATGCCAA 540 GAATACAGCA GAGATGCACT GAACAGAAAT ACTGCATGCT GGTTTCCCAG GACATTTATC 600 AACAGCAAAG GGTTTGAACA GCTTGCTGTG CACATTAATG GCTCAAGCAA GCGTGCTGCA 660 ATCAAGCCCT TTGATCAGCT GTTCAGTCCA CTTGCCATTG ACCAAGTGAA TCCTCCAAGG 720 AATGTCACAG TGGAAATTGA AAGCAATTCT CTCTATATAC AGTGGGAGAA ACCACTTTCT 780 GCCTTTCCAG ATCATTGCTT TAACTATGAG CTGAAAATTT ACAACACAAA AAATGGTCAC 840 ATTCAGAAGG AAAAACTGAT CGCCAATAAG TTCATCTCAA AAATTGATGA TGTTTCTACA 900 TATTCCATTC AAGTGAGAGC AGCTGTGAGC TCACCTTGCA GAATGCCAGG AAGGTGGGGC 960 GAGTGGAGTC AACCTATTTA TGTGGAAACC TTCGAA 996

【００５３】配列番号：4 配列の長さ：1355 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源：BALB/c マウス早期Ｂ細胞株 Y16 （骨髄由来）直接の起源：ＣＤＭ８ライブラリー配列の特徴特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：13..63 特徴を決定した方法：E 配列の特徴特徴を表す記号：N 型糖鎖binding-site 存在位置：106..114, 394..402, 649..657, 733..741 特徴を決定した方法：S 配列 TATTCGGCTA CCATGGTGCC TGTGTTACTA ATTCTTGTGG GAGCTTTGGC AACACTGCAA 60 GCTGACTTAC TTAATCACAA AAAGTTTTTA CTTCTACCAC CTGTCAATTT TACCATTAAA 120 GCCACTGGAT TAGCTCAAGT TCTTTTACAC TGGGACCCAA ATCCTGACCA AGAGCAAAGG 180 CATGTTGATC TAGAGTATCA CGTGAAAATA AATGCCCCAC AAGAAGACGA ATATGATACC 240 AGAAAGACTG AAAGCAAATG TGTGACCCCC CTTCATGAAG GCTTTGCAGC TAGCGTGAGG 300 ACCATTCTGA AGAGCAGCCA TACAACTCTG GCCAGCAGTT GGGTTTCTGC TGAACTCAAA 360 GCTCCACCAG GATCTCCTGG AACCTCGGTT ACGAATTTAA CTTGTACCAC ACACACTGTT 420 GTAAGTAGCC ACACCCACTT AAGGCCATAC CAAGTGTCCC TTCGTTGCAC CTGGCTTGTT 480 GGGAAGGATG CCCCTGAGGA CACACAGTAT TTCCTATACT ACAGGTTTGG TGTTTTGACT 540 GAAAAATGCC AAGAATACAG CAGAGATGCA CTGAACAGAA ATACTGCATG CTGGTTTCCC 600 AGGACATTTA TCAACAGCAA AGGGTTTGAA CAGCTTGCTG TGCACATTAA TGGCTCAAGC 660 AAGCGTGCTG CAATCAAGCC CTTTGATCAG CTGTTCAGTC CACTTGCCAT TGACCAAGTG 720 AATCCTCCAA GGAATGTCAC AGTGGAAATT GAAAGCAATT CTCTCTATAT ACAGTGGGAG 780 AAACCACTTT CTGCCTTTCC AGATCATTGC TTTAACTATG AGCTGAAAAT TTACAACACA 840 AAAAATGGTC ACATTCAGAA GGAAAAACTG ATCGCCAATA AGTTCATCTC AAAAATTGAT 900 GATGTTTCTA CATATTCCAT TCAAGTGAGA GCAGCTGTGA GCTCACCTTG CAGAATGCCA 960 GGAAGGTGGG GCGAGTGGAG TCAACCTATT TATGTGGAAA CCTTCGAATG AAACCAAAAT 1020 TGAAGTTGTA CATTGTGTGG AAGAGGTTGG ATTTGAAGTC ATGGGAAATT CCACGTTTTG 1080 ATGGCATTTT GCCATTCTGA AATGAACTCA TACAGGACTC CGTGATAAGA GCAAGGACTG 1140 CTATTTCTTG GCAAGGAGGT ATTTCAAATG AACACTCAGA GCCAGGCGGT GGTAGAGCTC 1200 GCCTTTAATA CCAGCACCTG GGATGCACAG ACGGGAGGAT TTCTGAGTTC GAGGCCAGCT 1260 TGGTCTATAA AGTGAGTTCC AGGACAGCCA GAGCTACACA GAGAAACCCT GTCTCGAAAA 1320 AACAAACAAA CAAACAAACA AACAAAAATG AACAC 1355

【００５４】配列番号：5 配列の長さ：415 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源：BALB/c マウス早期Ｂ細胞株 Y16 （骨髄由来）直接の起源：ＣＤＭ８ライブラリー配列の特徴特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：1..17 特徴を決定した方法：E 配列の特徴特徴を表す記号：N 型糖鎖binding-site 存在位置：32..34, 128..130, 213..215, 241..243, 392..394, 412..414 特徴を決定した方法：S 配列の特徴特徴を表す記号：膜貫通部分存在位置：340..361 特徴を決定した方法：S 配列 Met Val Pro Val Leu Leu Ile Leu Val Gly Ala Leu Ala Thr Leu Gln 1 5 10 15 Ala Asp Leu Leu Asn His Lys Lys Phe Leu Leu Leu Pro Pro Val Asn 20 25 30 Phe Thr Ile Lys Ala Thr Gly Leu Ala Gln Val Leu Leu His Trp Asp 35 40 45 Pro Asn Pro Asp Gln Glu Gln Arg His Val Asp Leu Glu Tyr His Val 50 55 60 Lys Ile Asn Ala Pro Gln Glu Asp Glu Tyr Asp Thr Arg Lys Thr Glu 65 70 75 80 Ser Lys Cys Val Thr Pro Leu His Glu Gly Phe Ala Ala Ser Val Arg 85 90 95 Thr Ile Leu Lys Ser Ser His Thr Thr Leu Ala Ser Ser Trp Val Ser 100 105 110 Ala Glu Leu Lys Ala Pro Pro Gly Ser Pro Gly Thr Ser Val Thr Asn 115 120 125 Leu Thr Cys Thr Thr His Thr Val Val Ser Ser His Thr His Leu Arg 130 135 140 Pro Tyr Gln Val Ser Leu Arg Cys Thr Trp Leu Val Gly Lys Asp Ala 145 150 155 160 Pro Glu Asp Thr Gln Tyr Phe Leu Tyr Tyr Arg Phe Gly Val Leu Thr 165 170 175 Glu Lys Cys Gln Glu Tyr Ser Arg Asp Ala Leu Asn Arg Asn Thr Ala 180 185 190 Cys Trp Phe Pro Arg Thr Phe Ile Asn Ser Lys Gly Phe Glu Gln Leu 195 200 205 Ala Val His Ile Asn Gly Ser Ser Lys Arg Ala Ala Ile Lys Pro Phe 210 215 220 Asp Gln Leu Phe Ser Pro Leu Ala Ile Asp Gln Val Asn Pro Pro Arg 225 230 235 240 Asn Val Thr Val Glu Ile Glu Ser Asn Ser Leu Tyr Ile Gln Trp Glu 245 250 255 Lys Pro Leu Ser Ala Phe Pro Asp His Cys Phe Asn Tyr Glu Leu Lys 260 265 270 Ile Tyr Asn Thr Lys Asn Gly His Ile Gln Lys Glu Lys Leu Ile Ala 275 280 285 Asn Lys Phe Ile Ser Lys Ile Asp Asp Val Ser Thr Tyr Ser Ile Gln 290 295 300 Val Arg Ala Ala Val Ser Ser Pro Cys Arg Met Pro Gly Arg Trp Gly 305 310 315 320 Glu Trp Ser Gln Pro Ile Tyr Val Gly Lys Glu Arg Lys Ser Leu Val 325 330 335 Glu Trp His Leu Ile Val Leu Pro Thr Ala Ala Cys Phe Val Leu Leu 340 345 350 Ile Phe Ser Leu Ile Cys Arg Val Cys His Leu Trp Thr Arg Leu Phe 355 360 365 Pro Pro Val Pro Ala Pro Lys Ser Asn Ile Lys Asp Leu Pro Val Val 370 375 380 Thr Glu Tyr Glu Lys Pro Ser Asn Glu Thr Lys Ile Glu Val Val His 385 390 395 400 Cys Val Glu Glu Val Gly Phe Glu Val Met Gly Asn Ser Thr Phe 405 410 415

【００５５】配列番号：6 配列の長さ：398 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源：BALB/c マウス早期Ｂ細胞株 Y16 （骨髄由来）直接の起源：ＣＤＭ８ライブラリー配列の特徴特徴を表す記号：N 型糖鎖binding-site 存在位置：15..17, 111..113, 196..198, 224..226, 375..377, 395..397 特徴を決定した方法：S 配列の特徴特徴を表す記号：膜貫通部分存在位置：323..344 特徴を決定した方法：S 配列 Asp Leu Leu Asn His Lys Lys Phe Leu Leu Leu Pro Pro Val Asn Phe 1 5 10 15 Thr Ile Lys Ala Thr Gly Leu Ala Gln Val Leu Leu His Trp Asp Pro 20 25 30 Asn Pro Asp Gln Glu Gln Arg His Val Asp Leu Glu Tyr His Val Lys 35 40 45 Ile Asn Ala Pro Gln Glu Asp Glu Tyr Asp Thr Arg Lys Thr Glu Ser 50 55 60 Lys Cys Val Thr Pro Leu His Glu Gly Phe Ala Ala Ser Val Arg Thr 65 70 75 80 Ile Leu Lys Ser Ser His Thr Thr Leu Ala Ser Ser Trp Val Ser Ala 85 90 95 Glu Leu Lys Ala Pro Pro Gly Ser Pro Gly Thr Ser Val Thr Asn Leu 100 105 110 Thr Cys Thr Thr His Thr Val Val Ser Ser His Thr His Leu Arg Pro 115 120 125 Tyr Gln Val Ser Leu Arg Cys Thr Trp Leu Val Gly Lys Asp Ala Pro 130 135 140 Glu Asp Thr Gln Tyr Phe Leu Tyr Tyr Arg Phe Gly Val Leu Thr Glu 145 150 155 160 Lys Cys Gln Glu Tyr Ser Arg Asp Ala Leu Asn Arg Asn Thr Ala Cys 165 170 175 Trp Phe Pro Arg Thr Phe Ile Asn Ser Lys Gly Phe Glu Gln Leu Ala 180 185 190 Val His Ile Asn Gly Ser Ser Lys Arg Ala Ala Ile Lys Pro Phe Asp 195 200 205 Gln Leu Phe Ser Pro Leu Ala Ile Asp Gln Val Asn Pro Pro Arg Asn 210 215 220 Val Thr Val Glu Ile Glu Ser Asn Ser Leu Tyr Ile Gln Trp Glu Lys 225 230 235 240 Pro Leu Ser Ala Phe Pro Asp His Cys Phe Asn Tyr Glu Leu Lys Ile 245 250 255 Tyr Asn Thr Lys Asn Gly His Ile Gln Lys Glu Lys Leu Ile Ala Asn 260 265 270 Lys Phe Ile Ser Lys Ile Asp Asp Val Ser Thr Tyr Ser Ile Gln Val 275 280 285 Arg Ala Ala Val Ser Ser Pro Cys Arg Met Pro Gly Arg Trp Gly Glu 290 295 300 Trp Ser Gln Pro Ile Tyr Val Gly Lys Glu Arg Lys Ser Leu Val Glu 305 310 315 320 Trp His Leu Ile Val Leu Pro Thr Ala Ala Cys Phe Val Leu Leu Ile 325 330 335 Phe Ser Leu Ile Cys Arg Val Cys His Leu Trp Thr Arg Leu Phe Pro 340 345 350 Pro Val Pro Ala Pro Lys Ser Asn Ile Lys Asp Leu Pro Val Val Thr 355 360 365 Glu Tyr Glu Lys Pro Ser Asn Glu Thr Lys Ile Glu Val Val His Cys 370 375 380 Val Glu Glu Val Gly Phe Glu Val Met Gly Asn Ser Thr Phe 385 390 395

【００５６】配列番号：7 配列の長さ：332 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源：BALB/c マウス早期Ｂ細胞株 Y16 （骨髄由来）直接の起源：ＣＤＭ８ライブラリー配列の特徴特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：1..17 特徴を決定した方法：E 配列の特徴特徴を表す記号：N 型糖鎖binding-site 存在位置：32..34, 128..130, 213..215, 241..243 特徴を決定した方法：S 配列 Met Val Pro Val Leu Leu Ile Leu Val Gly Ala Leu Ala Thr Leu Gln 1 5 10 15 Ala Asp Leu Leu Asn His Lys Lys Phe Leu Leu Leu Pro Pro Val Asn 20 25 30 Phe Thr Ile Lys Ala Thr Gly Leu Ala Gln Val Leu Leu His Trp Asp 35 40 45 Pro Asn Pro Asp Gln Glu Gln Arg His Val Asp Leu Glu Tyr His Val 50 55 60 Lys Ile Asn Ala Pro Gln Glu Asp Glu Tyr Asp Thr Arg Lys Thr Glu 65 70 75 80 Ser Lys Cys Val Thr Pro Leu His Glu Gly Phe Ala Ala Ser Val Arg 85 90 95 Thr Ile Leu Lys Ser Ser His Thr Thr Leu Ala Ser Ser Trp Val Ser 100 105 110 Ala Glu Leu Lys Ala Pro Pro Gly Ser Pro Gly Thr Ser Val Thr Asn 115 120 125 Leu Thr Cys Thr Thr His Thr Val Val Ser Ser His Thr His Leu Arg 130 135 140 Pro Tyr Gln Val Ser Leu Arg Cys Thr Trp Leu Val Gly Lys Asp Ala 145 150 155 160 Pro Glu Asp Thr Gln Tyr Phe Leu Tyr Tyr Arg Phe Gly Val Leu Thr 165 170 175 Glu Lys Cys Gln Glu Tyr Ser Arg Asp Ala Leu Asn Arg Asn Thr Ala 180 185 190 Cys Trp Phe Pro Arg Thr Phe Ile Asn Ser Lys Gly Phe Glu Gln Leu 195 200 205 Ala Val His Ile Asn Gly Ser Ser Lys Arg Ala Ala Ile Lys Pro Phe 210 215 220 Asp Gln Leu Phe Ser Pro Leu Ala Ile Asp Gln Val Asn Pro Pro Arg 225 230 235 240 Asn Val Thr Val Glu Ile Glu Ser Asn Ser Leu Tyr Ile Gln Trp Glu 245 250 255 Lys Pro Leu Ser Ala Phe Pro Asp His Cys Phe Asn Tyr Glu Leu Lys 260 265 270 Ile Tyr Asn Thr Lys Asn Gly His Ile Gln Lys Glu Lys Leu Ile Ala 275 280 285 Asn Lys Phe Ile Ser Lys Ile Asp Asp Val Ser Thr Tyr Ser Ile Gln 290 295 300 Val Arg Ala Ala Val Ser Ser Pro Cys Arg Met Pro Gly Arg Trp Gly 305 310 315 320 Glu Trp Ser Gln Pro Ile Tyr Val Glu Thr Phe Glu 325 330

【００５７】配列番号：8 配列の長さ：315 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源：BALB/c マウス早期Ｂ細胞株 Y16 （骨髄由来）直接の起源：ＣＤＭ８ライブラリー配列の特徴特徴を表す記号：N 型糖鎖binding-site 存在位置：15..17, 111..113, 196..198, 224..226 特徴を決定した方法：S 配列 Asp Leu Leu Asn His Lys Lys Phe Leu Leu Leu Pro Pro Val Asn Phe 1 5 10 15 Thr Ile Lys Ala Thr Gly Leu Ala Gln Val Leu Leu His Trp Asp Pro 20 25 30 Asn Pro Asp Gln Glu Gln Arg His Val Asp Leu Glu Tyr His Val Lys 35 40 45 Ile Asn Ala Pro Gln Glu Asp Glu Tyr Asp Thr Arg Lys Thr Glu Ser 50 55 60 Lys Cys Val Thr Pro Leu His Glu Gly Phe Ala Ala Ser Val Arg Thr 65 70 75 80 Ile Leu Lys Ser Ser His Thr Thr Leu Ala Ser Ser Trp Val Ser Ala 85 90 95 Glu Leu Lys Ala Pro Pro Gly Ser Pro Gly Thr Ser Val Thr Asn Leu 100 105 110 Thr Cys Thr Thr His Thr Val Val Ser Ser His Thr His Leu Arg Pro 115 120 125 Tyr Gln Val Ser Leu Arg Cys Thr Trp Leu Val Gly Lys Asp Ala Pro 130 135 140 Glu Asp Thr Gln Tyr Phe Leu Tyr Tyr Arg Phe Gly Val Leu Thr Glu 145 150 155 160 Lys Cys Gln Glu Tyr Ser Arg Asp Ala Leu Asn Arg Asn Thr Ala Cys 165 170 175 Trp Phe Pro Arg Thr Phe Ile Asn Ser Lys Gly Phe Glu Gln Leu Ala 180 185 190 Val His Ile Asn Gly Ser Ser Lys Arg Ala Ala Ile Lys Pro Phe Asp 195 200 205 Gln Leu Phe Ser Pro Leu Ala Ile Asp Gln Val Asn Pro Pro Arg Asn 210 215 220 Val Thr Val Glu Ile Glu Ser Asn Ser Leu Tyr Ile Gln Trp Glu Lys 225 230 235 240 Pro Leu Ser Ala Phe Pro Asp His Cys Phe Asn Tyr Glu Leu Lys Ile 245 250 255 Tyr Asn Thr Lys Asn Gly His Ile Gln Lys Glu Lys Leu Ile Ala Asn 260 265 270 Lys Phe Ile Ser Lys Ile Asp Asp Val Ser Thr Tyr Ser Ile Gln Val 275 280 285 Arg Ala Ala Val Ser Ser Pro Cys Arg Met Pro Gly Arg Trp Gly Glu 290 295 300 Trp Ser Gln Pro Ile Tyr Val Glu Thr Phe Glu 305 310 315

【００５８】配列番号：9 配列の長さ：1260 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源：ヒト末梢血好酸球直接の起源：λｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリー配列の特徴特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：1..60 特徴を決定した方法：E 配列の特徴特徴を表す記号：N 型糖鎖binding-site 存在位置：103..111, 391..399, 409..417, 424..432, 646..654, 730..738 特徴を決定した方法：S 配列の特徴特徴を表す記号：膜貫通部分存在位置：1033..1095 特徴を決定した方法：S 配列 ATGATCATCG TGGCGCATGT ATTACTCATC CTTTTGGGGG CCACTGAGAT ACTGCAAGCT 60 GACTTACTTC CTGATGAAAA GATTTCACTT CTCCCACCTG TCAATTTCAC CATTAAAGTT 120 ACTGGTTTGG CTCAAGTTCT TTTACAATGG AAACCAAATC CTGATCAAGA GCAAAGGAAT 180 GTTAATCTAG AATATCAAGT GAAAATAAAC GCTCCAAAAG AAGATGACTA TGAAACCAGA 240 ATCACTGAAA GCAAATGTGT AACCATCCTC CACAAAGGCT TTTCAGCAAG TGTGCGGACC 300 ATCCTGCAGA ACGACCACTC ACTACTGGCC AGCAGCTGGG CTTCTGCTGA ACTTCATGCC 360 CCACCAGGGT CTCCTGGAAC CTCAGTTGTG AATTTAACTT GCACCACAAA CACTACAGAA 420 GACAATTATT CACGTTTAAG GTCATACCAA GTTTCCCTTC ACTGCACCTG GCTTGTTGGC 480 ACAGATGCCC CTGAGGACAC GCAGTATTTT CTCTACTATA GGTATGGCTC TTGGACTGAA 540 GAATGCCAAG AATACAGCAA AGACACACTG GGGAGAAATA TCGCATGCTG GTTTCCCAGG 600 ACTTTTATCC TCAGCAAAGG GCGTGACTGG CTTGCGGTGC TTGTTAACGG CTCCAGCAAG 660 CACTCTGCTA TCAGGCCCTT TGATCAGCTG TTTGCCCTTC ACGCCATTGA TCAAATAAAT 720 CCTCCACTGA ATGTCACAGC AGAGATTGAA GGAACTCGTC TCTCTATCCA ATGGGAGAAA 780 CCAGTGTCTG CTTTTCCAAT CCATTGCTTT GATTATGAAG TAAAAATACA CAATACAAGG 840 AATGGATATT TGCAGATAGA AAAATTGATG ACCAATGCAT TCATCTCAAT AATTGATGAT 900 CTTTCTAAGT ACGATGTTCA AGTGAGAGCA GCAGTGAGCT CCATGTGCAG AGAGGCAGGG 960 CTCTGGAGTG AGTGGAGCCA ACCTATTTAT GTGGGAAATG ATGAACACAA GCCCTTGAGA 1020 GAGTGGTTTG TCATTGTGAT TATGGCAACC ATCTGCTTCA TCTTGTTAAT TCTCTCGCTT 1080 ATCTGTAAAA TATGTCATTT ATGGATCAAG TTGTTTCCAC CAATTCCAGC ACCAAAAAGT 1140 AATATCAAAG ATCTCTTTGT AACCACTAAC TATGAGAAAG CTGGGTCCAG TGAGACGGAA 1200 ATTGAAGTCA TCTGTTATAT AGAGAAGCCT GGAGTTGAGA CCCTGGAGGA TTCTGTGTTT 1260

【００５９】配列番号：10 配列の長さ：2006 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源：ヒト末梢血好酸球直接の起源：λｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリー配列の特徴特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：62..121 特徴を決定した方法：E 配列の特徴特徴を表す記号：N 型糖鎖binding-site 存在位置：164..172, 452..460, 470..478, 485..493, 707..715, 791..799 特徴を決定した方法：S 配列の特徴特徴を表す記号：膜貫通部分存在位置：1094..1156 特徴を決定した方法：S 配列 CGGTCCTCGC CATCTTCTGT TGAGTACTGG TCGGAACAAG AGGATCGTCT GTAGACAGGA 60 TATGATCATC GTGGCGCATG TATTACTCAT CCTTTTGGGG GCCACTGAGA TACTGCAAGC 120 TGACTTACTT CCTGATGAAA AGATTTCACT TCTCCCACCT GTCAATTTCA CCATTAAAGT 180 TACTGGTTTG GCTCAAGTTC TTTTACAATG GAAACCAAAT CCTGATCAAG AGCAAAGGAA 240 TGTTAATCTA GAATATCAAG TGAAAATAAA CGCTCCAAAA GAAGATGACT ATGAAACCAG 300 AATCACTGAA AGCAAATGTG TAACCATCCT CCACAAAGGC TTTTCAGCAA GTGTGCGGAC 360 CATCCTGCAG AACGACCACT CACTACTGGC CAGCAGCTGG GCTTCTGCTG AACTTCATGC 420 CCCACCAGGG TCTCCTGGAA CCTCAGTTGT GAATTTAACT TGCACCACAA ACACTACAGA 480 AGACAATTAT TCACGTTTAA GGTCATACCA AGTTTCCCTT CACTGCACCT GGCTTGTTGG 540 CACAGATGCC CCTGAGGACA CGCAGTATTT TCTCTACTAT AGGTATGGCT CTTGGACTGA 600 AGAATGCCAA GAATACAGCA AAGACACACT GGGGAGAAAT ATCGCATGCT GGTTTCCCAG 660 GACTTTTATC CTCAGCAAAG GGCGTGACTG GCTTGCGGTG CTTGTTAACG GCTCCAGCAA 720 GCACTCTGCT ATCAGGCCCT TTGATCAGCT GTTTGCCCTT CACGCCATTG ATCAAATAAA 780 TCCTCCACTG AATGTCACAG CAGAGATTGA AGGAACTCGT CTCTCTATCC AATGGGAGAA 840 ACCAGTGTCT GCTTTTCCAA TCCATTGCTT TGATTATGAA GTAAAAATAC ACAATACAAG 900 GAATGGATAT TTGCAGATAG AAAAATTGAT GACCAATGCA TTCATCTCAA TAATTGATGA 960 TCTTTCTAAG TACGATGTTC AAGTGAGAGC AGCAGTGAGC TCCATGTGCA GAGAGGCAGG 1020 GCTCTGGAGT GAGTGGAGCC AACCTATTTA TGTGGGAAAT GATGAACACA AGCCCTTGAG 1080 AGAGTGGTTT GTCATTGTGA TTATGGCAAC CATCTGCTTC ATCTTGTTAA TTCTCTCGCT 1140 TATCTGTAAA ATATGTCATT TATGGATCAA GTTGTTTCCA CCAATTCCAG CACCAAAAAG 1200 TAATATCAAA GATCTCTTTG TAACCACTAA CTATGAGAAA GCTGGGTCCA GTGAGACGGA 1260 AATTGAAGTC ATCTGTTATA TAGAGAAGCC TGGAGTTGAG ACCCTGGAGG ATTCTGTGTT 1320 TTGACTGTCA CTTTGGCATC CTCTGATGAA CTCACACATG CCTCAGTGCC TCAGTGAAAA 1380 GAACAGGGAT GCTGGCTCTT GGCTAAGAGG TGTTCAGAAT TTAGGCAACA CTCAATTTAC 1440 CTGCGAAGCA ATACACCCAG ACACACCAGT CTTGTATCTC TTAAAAGTAT GGATGCTTCA 1500 TCCAAATCGC CTCACCTACA GCAGGGAAGT TGACTCATCC AAGCATTTTG CCATGTTTTT 1560 TCTCCCCATG CCGTACAGGG TAGCACCTCC TCACCTGCCA ATCTTTGCAA TTTGCTTGAC 1620 TCACCTCAGA CTTTTCATTC ACAACAGACA GCTTTTAAGG CTAACGTCCA GCTGTATTTA 1680 CTTCTGGCTG TGCCCGTTTG GCTGTTTAAG CTGCCAATTG TAGCACTCAG CTACCATCTG 1740 AGGAAGAAAG CATTTTGCAT CAGCCTGGAG TGAATCATGA ACTTGGATTC AAGACTGTCT 1800 TTTCTATAGC AAGTGAGAGC CACAAATTCC TCACCCCCCT ACATTCTAGA ATGATCTTTT 1860 TCTAGGTAGA TTGTGTATGT GTGTGTATGA GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA 1920 GAGAAATTAT CTCAAGCTCC AGAGGCCTGA TCCAGGATAC ATCATTTGAA ACCAACTAAT 1980 TTAAAAGCAT AATAGAGCTA ATATAT 2006

【００６０】配列番号：11 配列の長さ：1188 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源：ヒト末梢血好酸球直接の起源：λｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリー配列の特徴特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：1..60 特徴を決定した方法：E 配列の特徴特徴を表す記号：N 型糖鎖binding-site 存在位置：103..111, 391..399, 409..417, 424..432, 646..654, 730..738 特徴を決定した方法：S 配列の特徴特徴を表す記号：膜貫通部分存在位置：1033..1095 特徴を決定した方法：S 配列 ATGATCATCG TGGCGCATGT ATTACTCATC CTTTTGGGGG CCACTGAGAT ACTGCAAGCT 60 GACTTACTTC CTGATGAAAA GATTTCACTT CTCCCACCTG TCAATTTCAC CATTAAAGTT 120 ACTGGTTTGG CTCAAGTTCT TTTACAATGG AAACCAAATC CTGATCAAGA GCAAAGGAAT 180 GTTAATCTAG AATATCAAGT GAAAATAAAC GCTCCAAAAG AAGATGACTA TGAAACCAGA 240 ATCACTGAAA GCAAATGTGT AACCATCCTC CACAAAGGCT TTTCAGCAAG TGTGCGGACC 300 ATCCTGCAGA ACGACCACTC ACTACTGGCC AGCAGCTGGG CTTCTGCTGA ACTTCATGCC 360 CCACCAGGGT CTCCTGGAAC CTCAATTGTG AATTTAACTT GCACCACAAA CACTACAGAA 420 GACAATTATT CACGTTTAAG GTCATACCAA GTTTCCCTTC ACTGCACCTG GCTTGTTGGC 480 ACAGATGCCC CTGAGGACAC GCAGTATTTT CTCTACTATA GGTATGGCTC TTGGACTGAA 540 GAATGCCAAG AATACAGCAA AGACACACTG GGGAGAAATA TCGCATGCTG GTTTCCCAGG 600 ACTTTTATCC TCAGCAAAGG GCGTGACTGG CTTGCGGTGC TTGTTAACGG CTCCAGCAAG 660 CACTCTGCTA TCAGGCCCTT TGATCAGCTG TTTGCCCTTC ACGCCATTGA TCAAATAAAT 720 CCTCCACTGA ATGTCACAGC AGAGATTGAA GGAACTCGTC TCTCTATCCA ATGGGAGAAA 780 CCAGTGTCTG CTTTTCCAAT CCATTGCTTT GATTATGAAG TAAAAATACA CAATACAAGG 840 AATGGATATT TGCAGATAGA AAAATTGATG ACCAATGCAT TCATCTCAAT AATTGATGAT 900 CTTTCTAAGT ACGATGTTCA AGTGAGAGCA GCAGTGAGCT CCATGTGCAG AGAGGCAGGG 960 CTCTGGAGTG AGTGGAGCCA ACCTATTTAT GTGGGAAATG ATGAACACAA GCCCTTGAGA 1020 GAGTGGTTTG TCATTGTGAT TATGGCAACC ATCTGCTTCA TCTTGTTAAT TCTCTCGCTT 1080 ATCTGTAAAA TATGTCATTT ATGGATCAAG TTGTTTCCAC CAATTCCAGC ACCAAAAAGT 1140 AATATCAAAG ATCTCTTTGT AACCACTAAC TATGAGAAAG CTGGAATT 1188

【００６１】配列番号：12 配列の長さ：2024 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源：ヒト末梢血好酸球直接の起源：λｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリー配列の特徴特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：104..163 特徴を決定した方法：E 配列の特徴特徴を表す記号：N 型糖鎖binding-site 存在位置：206..214, 494..502, 512..520, 527..535, 749..757, 833..841 特徴を決定した方法：S 配列の特徴特徴を表す記号：膜貫通部分存在位置：1136..1198 特徴を決定した方法：S 配列 TAGATGCTGG GGTTGCAGCC ACGAGCATAG ACACGACAGA CACGGTCCTC GCCATCTTCT 60 GTTGAGTACT GGTCGGAACA AGAGGATCGT CTGTAGACAG GATATGATCA TCGTGGCGCA 120 TGTATTACTC ATCCTTTTGG GGGCCACTGA GATACTGCAA GCTGACTTAC TTCCTGATGA 180 AAAGATTTCA CTTCTCCCAC CTGTCAATTT CACCATTAAA GTTACTGGTT TGGCTCAAGT 240 TCTTTTACAA TGGAAACCAA ATCCTGATCA AGAGCAAAGG AATGTTAATC TAGAATATCA 300 AGTGAAAATA AACGCTCCAA AAGAAGATGA CTATGAAACC AGAATCACTG AAAGCAAATG 360 TGTAACCATC CTCCACAAAG GCTTTTCAGC AAGTGTGCGG ACCATCCTGC AGAACGACCA 420 CTCACTACTG GCCAGCAGCT GGGCTTCTGC TGAACTTCAT GCCCCACCAG GGTCTCCTGG 480 AACCTCAATT GTGAATTTAA CTTGCACCAC AAACACTACA GAAGACAATT ATTCACGTTT 540 AAGGTCATAC CAAGTTTCCC TTCACTGCAC CTGGCTTGTT GGCACAGATG CCCCTGAGGA 600 CACGCAGTAT TTTCTCTACT ATAGGTATGG CTCTTGGACT GAAGAATGCC AAGAATACAG 660 CAAAGACACA CTGGGGAGAA ATATCGCATG CTGGTTTCCC AGGACTTTTA TCCTCAGCAA 720 AGGGCGTGAC TGGCTTGCGG TGCTTGTTAA CGGCTCCAGC AAGCACTCTG CTATCAGGCC 780 CTTTGATCAG CTGTTTGCCC TTCACGCCAT TGATCAAATA AATCCTCCAC TGAATGTCAC 840 AGCAGAGATT GAAGGAACTC GTCTCTCTAT CCAATGGGAG AAACCAGTGT CTGCTTTTCC 900 AATCCATTGC TTTGATTATG AAGTAAAAAT ACACAATACA AGGAATGGAT ATTTGCAGAT 960 AGAAAAATTG ATGACCAATG CATTCATCTC AATAATTGAT GATCTTTCTA AGTACGATGT 1020 TCAAGTGAGA GCAGCAGTGA GCTCCATGTG CAGAGAGGCA GGGCTCTGGA GTGAGTGGAG 1080 CCAACCTATT TATGTGGGAA ATGATGAACA CAAGCCCTTG AGAGAGTGGT TTGTCATTGT 1140 GATTATGGCA ACCATCTGCT TCATCTTGTT AATTCTCTCG CTTATCTGTA AAATATGTCA 1200 TTTATGGATC AAGTTGTTTC CACCAATTCC AGCACCAAAA AGTAATATCA AAGATCTCTT 1260 TGTAACCACT AACTATGAGA AAGCTGGAAT TTAAATTCAA GCATGTTTTA ACTTTTGGTT 1320 TAAGGTACTT GGGTGTACCT GGCAGTGTTG TAAGCTCTTT ACATTAATTA ATTAACTCTC 1380 TAGGTACTGT TATCTTCATT TTATAAACAA GGCAGCTGAA GTTGAGAGAA ATAAGTAACC 1440 TGTCCTAGGT CACACAATTA GGAAATGACA GATCTGGCAG TCTATTTCCA GGCAGTCTAT 1500 TTCCACGAGG TCATGAGTGC GAAAGAGGGA CTAGGGGAAG AATGATTAAC TCCAGGGAGC 1560 TGACTTTTCT AGTGTGCTTA CCTGTTTTGC ATCTCTCAAG GATGTGCCAT GAAGCTGTAG 1620 CCAGGTGGAA TTGTACCACA GCCCTGACAT GAACACCTGA TGGCAGCTGC TGGGTTGGAG 1680 CCTAGACAAA AACATGAAGA ACCATGGCTG CTGCCTGAGC CCATCGTGCT GTAATTATAG 1740 AAAACCTTCT AAGGGAAGAA TATGCTGATA TTTTTCAGAT AAGTACCCCT TTTATAAAAA 1800 TCCTCCAAGT TAGCCCTCGA TTTTCCATGT AAGGAAACAG AGGCTTTGAG ATAATGTCTG 1860 TCTCCTAAGG GACAAAGCCA GGACTTGATC CTGTCTTAAA AATGCAAAAT GTAGTACTTC 1920 TTCCATCAAA GGTAGACATG CACTAAGGGA CAGGTTTTGG CTTGGTATCA GAATACATTT 1980 TTAAAAGCTG TGTAAGAATT GAACGGGCTG TACTAGGGGG TATA 2024

【００６２】配列番号：13 配列の長さ：420 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源：ヒト末梢血好酸球直接の起源：λｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリー配列の特徴特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 配列の特徴特徴を表す記号：N 型糖鎖binding-site 存在位置：131..133, 137..139, 142..144, 216..218, 244..246 特徴を決定した方法：S 配列の特徴特徴を表す記号：膜貫通部分存在位置：345..365 特徴を決定した方法：S 配列 Met Ile Ile Val Ala His Val Leu Leu Ile Leu Leu Gly Ala Thr Glu 1 5 10 15 Ile Leu Gln Ala Asp Leu Leu Pro Asp Glu Lys Ile Ser Leu Leu Pro 20 25 30 Pro Val Asn Phe Thr Ile Lys Val Thr Gly Leu Ala Gln Val Leu Leu 35 40 45 Gln Trp Lys Pro Asn Pro Asp Gln Glu Gln Arg Asn Val Asn Leu Glu 50 55 60 Tyr Gln Val Lys Ile Asn Ala Pro Lys Glu Asp Asp Tyr Glu Thr Arg 65 70 75 80 Ile Thr Glu Ser Lys Cys Val Thr Ile Leu His Lys Gly Phe Ser Ala 85 90 95 Ser Val Arg Thr Ile Leu Gln Asn Asp His Ser Leu Leu Ala Ser Ser 100 105 110 Trp Ala Ser Ala Glu Leu His Ala Pro Pro Gly Ser Pro Gly Thr Ser 115 120 125 Val Val Asn Leu Thr Cys Thr Thr Asn Thr Thr Glu Asp Asn Tyr Ser 130 135 140 Arg Leu Arg Ser Tyr Gln Val Ser Leu His Cys Thr Trp Leu Val Gly 145 150 155 160 Thr Asp Ala Pro Glu Asp Thr Gln Tyr Phe Leu Tyr Tyr Arg Tyr Gly 165 170 175 Ser Trp Thr Glu Glu Cys Gln Glu Tyr Ser Lys Asp Thr Leu Gly Arg 180 185 190 Asn Ile Ala Cys Trp Phe Pro Arg Thr Phe Ile Leu Ser Lys Gly Arg 195 200 205 Asp Trp Leu Ala Val Leu Val Asn Gly Ser Ser Lys His Ser Ala Ile 210 215 220 Arg Pro Phe Asp Gln Leu Phe Ala Leu His Ala Ile Asp Gln Ile Asn 225 230 235 240 Pro Pro Leu Asn Val Thr Ala Glu Ile Glu Gly Thr Arg Leu Ser Ile 245 250 255 Gln Trp Glu Lys Pro Val Ser Ala Phe Pro Ile His Cys Phe Asp Tyr 260 265 270 Glu Val Lys Ile His Asn Thr Arg Asn Gly Tyr Leu Gln Ile Glu Lys 275 280 285 Leu Met Thr Asn Ala Phe Ile Ser Ile Ile Asp Asp Leu Ser Lys Tyr 290 295 300 Asp Val Gln Val Arg Ala Ala Val Ser Ser Met Cys Arg Glu Ala Gly 305 310 315 320 Leu Trp Ser Glu Trp Ser Gln Pro Ile Tyr Val Gly Asn Asp Glu His 325 330 335 Lys Pro Leu Arg Glu Trp Phe Val Ile Val Ile Met Ala Thr Ile Cys 340 345 350 Phe Ile Leu Leu Ile Leu Ser Leu Ile Cys Lys Ile Cys His Leu Trp 355 360 365 Ile Lys Leu Phe Pro Pro Ile Pro Ala Pro Lys Ser Asn Ile Lys Asp 370 375 380 Leu Phe Val Thr Thr Asn Tyr Glu Lys Ala Gly Ser Ser Glu Thr Glu 385 390 395 400 Ile Glu Val Ile Cys Tyr Ile Glu Lys Pro Gly Val Glu Thr Leu Glu 405 410 415 Asp Ser Val Phe 420

【００６３】配列番号：14 配列の長さ：396 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源：ヒト末梢血好酸球直接の起源：λｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリー配列の特徴特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 配列の特徴特徴を表す記号：N 型糖鎖binding-site 存在位置：131..133, 137..139, 142..144, 216..218, 244..246 特徴を決定した方法：S 配列の特徴特徴を表す記号：膜貫通部分存在位置：345..365 特徴を決定した方法：S 配列 Met Ile Ile Val Ala His Val Leu Leu Ile Leu Leu Gly Ala Thr Glu 1 5 10 15 Ile Leu Gln Ala Asp Leu Leu Pro Asp Glu Lys Ile Ser Leu Leu Pro 20 25 30 Pro Val Asn Phe Thr Ile Lys Val Thr Gly Leu Ala Gln Val Leu Leu 35 40 45 Gln Trp Lys Pro Asn Pro Asp Gln Glu Gln Arg Asn Val Asn Leu Glu 50 55 60 Tyr Gln Val Lys Ile Asn Ala Pro Lys Glu Asp Asp Tyr Glu Thr Arg 65 70 75 80 Ile Thr Glu Ser Lys Cys Val Thr Ile Leu His Lys Gly Phe Ser Ala 85 90 95 Ser Val Arg Thr Ile Leu Gln Asn Asp His Ser Leu Leu Ala Ser Ser 100 105 110 Trp Ala Ser Ala Glu Leu His Ala Pro Pro Gly Ser Pro Gly Thr Ser 115 120 125 Ile Val Asn Leu Thr Cys Thr Thr Asn Thr Thr Glu Asp Asn Tyr Ser 130 135 140 Arg Leu Arg Ser Tyr Gln Val Ser Leu His Cys Thr Trp Leu Val Gly 145 150 155 160 Thr Asp Ala Pro Glu Asp Thr Gln Tyr Phe Leu Tyr Tyr Arg Tyr Gly 165 170 175 Ser Trp Thr Glu Glu Cys Gln Glu Tyr Ser Lys Asp Thr Leu Gly Arg 180 185 190 Asn Ile Ala Cys Trp Phe Pro Arg Thr Phe Ile Leu Ser Lys Gly Arg 195 200 205 Asp Trp Leu Ala Val Leu Val Asn Gly Ser Ser Lys His Ser Ala Ile 210 215 220 Arg Pro Phe Asp Gln Leu Phe Ala Leu His Ala Ile Asp Gln Ile Asn 225 230 235 240 Pro Pro Leu Asn Val Thr Ala Glu Ile Glu Gly Thr Arg Leu Ser Ile 245 250 255 Gln Trp Glu Lys Pro Val Ser Ala Phe Pro Ile His Cys Phe Asp Tyr 260 265 270 Glu Val Lys Ile His Asn Thr Arg Asn Gly Tyr Leu Gln Ile Glu Lys 275 280 285 Leu Met Thr Asn Ala Phe Ile Ser Ile Ile Asp Asp Leu Ser Lys Tyr 290 295 300 Asp Val Gln Val Arg Ala Ala Val Ser Ser Met Cys Arg Glu Ala Gly 305 310 315 320 Leu Trp Ser Glu Trp Ser Gln Pro Ile Tyr Val Gly Asn Asp Glu His 325 330 335 Lys Pro Leu Arg Glu Trp Phe Val Ile Val Ile Met Ala Thr Ile Cys 340 345 350 Phe Ile Leu Leu Ile Leu Ser Leu Ile Cys Lys Ile Cys His Leu Trp 355 360 365 Ile Lys Leu Phe Pro Pro Ile Pro Ala Pro Lys Ser Asn Ile Lys Asp 370 375 380 Leu Phe Val Thr Thr Asn Tyr Glu Lys Ala Gly Ile 385 390 395

【００６４】配列番号：15 配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：Ｍ１３ファージ配列 GTTTTCCCAG TCACGAC 17

【００６５】配列番号：16 配列の長さ：15 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：Ｔ７ファージ配列 ATGGAAATTA ATACG 15

【００６６】配列番号：17 配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：Ｔ３ファージ配列 ATTAACCCTC ACTAAAG 17

【００６７】配列番号：18 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源：BALB/c マウス早期Ｂ細胞株 Y16 （骨髄由来）直接の起源：ＣＤＭ８ライブラリー配列の特徴特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：E 配列 Asp Leu Leu Asn His Lys Lys Phe Leu Leu Leu Pro Pro Val Xaa Phe 1 5 10 15 Thr Ile Lys Ala 20

【図面の簡単な説明】

【図１】単離したマウスＩL-５R ｃＤＮＡの制限酵素地
図。

【図２】使用したベクター及びｃＤＮＡをベクターに挿
入する部位を示す図。

【図３】³⁵Ｓ−放射標識ＩL-５を用いたマウスＩL-５R
における結合試験及びスキャッチャード解析を示す図。

【図４】³⁵Ｓ−放射標識ＩL-５を用いたマウスＩL-５R
の架橋実験の結果を示す図。

【図５】リコンビナントマウスＩL-５R の免疫沈降実験
の結果を示す図。

【図６】単離したヒトＩL-５R ｃＤＮＡの制限酵素地
図。

【図７】³⁵Ｓ又は¹²⁵Ｉで放射標識したＩL-５を用いた
ヒトＩL-５R の結合試験及びスキャッチャード解析の結
果を示す図。

【図８】^３５Ｓ又は^１２５Ｉで放射標識したＩＬ−５を
用いたヒトＩＬ−５Ｒの結合試験及びスキャッチャード
解析の結果を示す図。

【図９】ヒトＩＬ−５Ｒと種々のサイトカインとの結合
特異性を検討した図。

【図１０】^３５Ｓ又は^１２５Ｉで放射標識したＩＬ−５
を用いたヒトＩＬ−５Ｒにおける架橋実験の結果を示す
図。

【図１１】ｐＩＬ−５Ｒ．８の全塩基配列と推定アミノ
酸配列を示す図。

【図１２】ｐＩＬ−５Ｒ．２の全塩基配列及び推定アミ
ノ酸配列を示す図。

【図１３】ＨＳＩＬ５Ｒの全塩基配列と推定アミノ酸配
列を示す図。

【図１４】ＨＳＩＬ５Ｒ２の全塩基配列及び推定アミノ
酸配列を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，144，（1990. ６月），Ｐ．4218−4225 Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ．，172，（1990. ９月１日発行），Ｐ．683−691 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/12 C12P 21/02 C07K 14/715 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（ＧＥＮＥＴＹＸ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１の塩基配列を有し、かつマウ
ス骨髄細胞ｍＲＮＡ由来のインターロイキン５レセプタ
ーをコードするＤＮＡ。
【請求項２】配列番号２の塩基配列を有し、かつマウ
ス骨髄細胞ｍＲＮＡ由来のインターロイキン５レセプタ
ーをコードするＤＮＡ。
【請求項３】配列番号３の塩基配列を有し、かつマウ
ス骨髄細胞ｍＲＮＡ由来の分泌型インターロイキン５レ
セプターをコードするＤＮＡ。
【請求項４】配列番号４の塩基配列を有し、かつマウ
ス骨髄由来ｍＲＮＡ由来の分泌型インターロイキン５レ
セプターをコードするＤＮＡ。
【請求項５】請求項１〜４のいずれか記載のＤＮＡと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつマ
ウス由来のインターロイキン５と結合親和性を有するタ
ンパク質をコードする哺乳動物由来のＤＮＡ。
【請求項６】配列番号５のアミノ酸配列を有するイン
ターロイキン５レセプター。
【請求項７】配列番号６のアミノ酸配列を有するイン
ターロイキン５レセプター。
【請求項８】配列番号７のアミノ酸配列を有する分泌
型インターロイキン５レセプター。
【請求項９】配列番号８のアミノ酸配列を有する分泌
型インターロイキン５レセプター。
【請求項１０】請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮ
Ａを有する発現ベクターにより形質転換されたサルＣＯ
Ｓ７細胞(ATCC CRL 1651)。
【請求項１１】配列番号９の塩基配列を有し、かつヒ
ト末梢血好酸球ｍＲＮＡ由来のインターロイキン５レセ
プターをコードするＤＮＡ。
【請求項１２】配列番号10の塩基配列を有し、かつヒ
ト末梢血好酸球ｍＲＮＡ由来のインターロイキン５レセ
プターをコードするＤＮＡ。
【請求項１３】配列番号11の塩基配列を有し、かつヒ
ト末梢血好酸球ｍＲＮＡ由来のインターロイキン５レセ
プターをコードするＤＮＡ。
【請求項１４】配列番号12の塩基配列を有し、かつヒ
ト末梢血好酸球ｍＲＮＡ由来のインターロイキン５レセ
プターをコードするＤＮＡ。
【請求項１５】配列番号13のアミノ酸配列を有するイ
ンターロイキン5レセプター。
【請求項１６】配列番号14のアミノ酸配列を有するイ
ンターロイキン5レセプター。
【請求項１７】請求項１〜５及び請求項11〜14のいず
れかに記載されたＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクタ
ー。
【請求項１８】請求項17記載のベクターを含む宿主細
胞を発現促進条件下で培養することを特徴とするインタ
ーロイキン5レセプター又はその類縁体の生産方法。