CZ29397A3 - Chemokiny pocházející z makrofágů a jejich analogy, polynukleotidy, které je kódují, použití těchto chemokinů a farmaceutické prostředky na jejich bázi - Google Patents

Description

nukleotidy, které je kódují, použití těchto chemokinů a farmaceutické prostředky na jejich bázi

Oblast techniky

Vynález se obecně týká chemokinů. Konkrétněji se vynález týká purifikovaných a izolovaných polynukleotidů kódujících nový lidský chemokin C-C, purifikovaného a izolovaného chemokinového proteinu kódovaného těmito polynukleotidy a látek a způsobů vhodných pro rekombinantní produkci tohoto nového chemokinového proteinu.

Dosavadní stav techniky

Chemokiny, které jsou také známy pod označením interkriny a cytokiny SIS představují třídu malých sekretovaných proteinů (skládajících se například ze 70 až 100 aminokyselin a majících molekulu o velikosti 8 až 10 kDa, které přitahují a aktivují leukocyty a tím napomáhají stimulaci a regulaci imunitního systému. Označení chemokin je odvozeno od sousloví chemotaktický cytokin a vyjadřuje schopnost těchto proteinů stimulovat chemotaxi leukocytů. Chemokiny mohou opravdu zahrnovat hlavní atraktanty pro zánětlivé buňky do patologických tkání [obecný souhrn viz Baggiolini et al., Advances in Immunology, 55: 97 až 179 (1994)]. Bohatým zdrojem chemokinů jsou leukocyty ale několik chemokinů je exprimováno ve velkém množství tkání (viz výše uvedená citace, tabulka II).

Dříve identifikované chemokiny obecně vykazují 20 až 70% vzájemnou aminokyselinovou shodu (identitu) a obsahují 4 vysoce konzervované cysteinové zbytky. Na

• ·

• · « · základě relativní polohy prvních dvou z těchto cysteinových zbytků jsou chemokiny dále roztříděny do dvou podtříd.

V podtřídě C-X-C, neboli podtřídě a, která je kódována geny umístěnými v lidském chromosomu 4, jsou první dva cysteiny od sebe odděleny jednou aminokyselinou. V podtřídě C-C, neboli podtřídě β, která je kódována geny umístěnými v lidském chromosomu 17, spolu první dva cysteiny sousedí. Rentgenová krystalografie a studie NMR několika chemokinů ukázaly, že v každé třídě vytváří první a třetí cystein první disulfidový můstek a druhý a čtvrtý cystein druhý disulfidový můstek. Tyto struktury silné ovlivňují nativní konformaci těchto proteinů. U samotného člověka bylo v každé podtřídě chemokinů popsáno téměř 10 rozdílných sekvencí. Chemokiny z obou podtříd obsahují charakteristické vedoucí sekvence o délce 22 až 25 aminokyselin.

Chemokiny C-X-C, které zahrnují 11-8, Gro alfa/beta/gamma, základní protein krevních destiček, faktor 4 krevních destiček (PF4), IP-10 a jiné, vykazují přibližně 25% až 60% shodu při porovnání kterýchkoli v dvou aminokyselinových sekvencí, s výjimkou členů Gro alfa/beta/gamma, které vzájemně vykazují shodu 84 až 88%. Většina chemokinů C-X-C (s výjimkou IP-10 a faktoru 4 krevních destiček) sdílí společný tripeptidový motiv E-L-R před (vhledem ke směru exprese) prvními dvěma cysteinovými zbytky a tyto chemokiny jsou silnými stimulátory neutrofilů, které vyvolávají rychlou změnu tvaru, chemotaxi, respirační ruptury a degranulaci. Tyto účinky jsou zprostředkovány receptory spojenými s proteinem G, které se podobají rhodopsinu a vykazují sedmitransmembránovou doménu (seven-transmembrane-domain rhodopsin-like G protein-coupled receptors). Receptory specifické pro 11-8 byly klonovány Holmesem et al. (Science 253: 1278 až 1280, 1991), přičemž podobný receptor (77% shoda), který rozpoznává 11-8, Gro a NAP2 byl také klonován (Murphy a Tiffany, Science, 253: 1280 až 1283, 1991).

·· ····

Postupné zkracování N-terminální aminokyselinové sekvence určitých chemokinů C-X-C, včetně 11-8 je spojeno s významným zvýšením jejich účinnosti.

Chemokiny C-C, které zahrnují makrofágové zánětlivé proteiny (Macrophage Inflammatory Proteins) ΜΙΡ-Ια a ΜΙΡ-1β, monocytové chemoatraktantové proteiny 1, 2 a 3 (MCP-1/2/3), RANTES, 1-309 a jiné, vykazují 25% až 75% vzájemnou aminokyselinovou shodu. Všechny z dříve identifikovaných chemokinů C-C aktivují monocyty, vyvolávají vápníkový tok a chemotaxi. Selektivnější účinky jsou pozorovány v případě lymfocytů, například T-lymfocytů, které nejlépe odpovídají na RANTES. Receptory spojené s proteinem G, které vykazují sedmitransmembránovou doménu (seven-transmembrane-domain G protein-coupled receptors) pro chemokiny Č-C již byly klonovány, včetně C-C chemokinového receptoru-1 (CCR1), který rozpoznává ΜΙΡ-Ια a RANTES (Neote et al., Cell, 72:

415 až 425, 1993) a receptoru CCR2, který rozpoznává MCP-1 (Charo et al., Proč. Nat. Acad. Sci. 91: 2752 až 2756,

1994) , CCR3, který rozpoznává eotaxin (Combadiere, J. Biol. Chem., 270: 16491, 1995), CCR4, který rozpoznává ΜΙΡ-Ια, RANTES a MCP-1 (Power et al., J. Biol. Chem. 270: 19495,

1995) a CCR5, který rozpoznává ΜΙΡ-Ια, MIP-Ιβ a RANTES (Samson et al., Biochemistry, 35: 3362, 1996).

Úloha řady chemokinů, zejména 11-8, při různých patologických stavech již byla dobře dokumentována (obecný přehled lze nalézt ve výše citované publikaci Baggiolini et al., viz zejména tabulka VII). S nadprodukcí 11-8 je například spojována lupénka a podle několika studií byla pozorována vysoká hladina 11-8 v synoviální tekutině zanícených kloubů pacientů postižených rheumatickými chorobami, osteoarthritis a dnou.

Také úloha chemokinů C-C při patologických stavech • ·· · • ··· · * · je dobře dokumentována, přestože méně podrobně než úloha 11-8. Tak například koncentrace MCP-1 v synoviální tekutině je u pacientů postižených rheumatoidní arthritis vyšší než u pacientů postižených jinými arthritickými chorobami. MCP-1dependentní influx jednojaderných fagocytů může být důležitý při vývoji idiopatické plicní fibrosy. Úloha chemokinů C-C při verbování monocytů do atherosklerotických oblastí je v současné době předmětem intenzivního zájmu; exprese MCP-l byla detegována v arteriálních stěnách bohatých na makrofágy, ale nikoliv v normální arteriální tkáni. Bylo ukázáno, že exprese MCP-1 v maligních buňkách potlačuje schopnost těchto buněk vytvářet nádory in vivo (viz US patent č. 5 179 078; tato citace je zde uváděna náhradou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu). Existuje proto potřeba identifikovat a charakterizovat další chemokiny C-C, aby se dále objasnila úloha této důležité třídy molekul při patologických stavech a aby bylo možno vyvinout zlepšené způsoby léčení takových stavů za použití produktů odvozených od chemokinů.

Bylo též ukázáno, že chemokiny z podtřídy C-C jsou použitelné při zobrazování v oboru lékařství, například při zobrazování míst infekce, zánětu a jiných míst, v nichž se vyskytují receptorové molekuly pro chemokiny C-C (viz například Kulkel et al., US patent č. 5 413 778; tato citace je zde uváděna náhradou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu). Při těchto metodách se chemicky připojí značící činidlo (například radioaktivní izotop) k chemokinů C-C za použití technik známých v tomto oboru (viz například US patenty č. 4 965 392 a 5 037 630; tyto citace jsou zde uváděny náhradou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu), značený chemokin ve farmaceuticky vhodném nosiči se podá subjektu, potom se nechá značený chemokin akumulovat v cílovém místě a nakonec se ·· ···· ·· ····

··· v cílovém místě značený chemokin in vivo zobrazí. V tomto oboru existuje potřeba vyvinout další nové chemokiny C-C pro rozšíření arzenálu zobrazovacích prostředků v lékařství.

Bylo již také ukázáno, že chemokiny z podřídy C-C, RANTES, MIP-a a MIP-Ιβ jsou hlavními mediátory potlačovacího účinku lidských T-buněk proti viru imunitní nedostatečnosti HIV, což je činidlo zodpovědné za vyvolání syndromu získané imunitní nedostatečnosti (AIDS). Tyto chemokiny vykazují schopnost inhibovat v rozsahu, který je závislý na dávce schopnost specifických kmenů HIV infikovat kultivované linie T-buněk (Cocchi et al., Science, 270: 1811, 1995). Všechny zkoušené kmeny tohoto viru však nejsou stejně susceptibilní vůči této inhibici a existuje proto potřeba nalézt další chemokiny C-C pro použití jako inhibitory kmenů HIV.

S ohledem na důležitost chemokinů jako mediátorů chemotaxe a zánětu existuje také potřeba identifikovat a izolovat nové členy třídy chemokinů, aby bylo možno usnadňovat modulaci zánětlivých a imunitních odpovědí.

Tak například látky, které povzbuzují zánět mohou povzbuzovat hojení ran nebo rychlost zotavování z takových chorob jako je zánět plic, kde je zánět důležitý pro vykořenění infekce. Modulace zánětu je podobně důležitá při patologických stavech, které se projevují zánětem. Jedním takovým patologickým stavem je Crohnova choroba, která se projevuje chronickým zánětem všech vrstev střeva, bolestí a diarrheou. Stupeň selhání terapie za použití léčiv je při Crohnově chorobě poměrně vysoký a choroba se často vrací i u pacientů podrobených chirurgickému zásahu. Identifikace, izolace a charakterizace nových chemokinů usnadňuje modulaci zánětu.

·· ····

Podobně také látky, které indukují imunitní odpověď, mohou mít značný vliv na dosažení úlevy nebo hojení řady patologických stavů. Díky důležité roli leukocytů (například neutrofilů a monocytů) při imunitních odpovědích zprostředkovaných buňkami a díky zavedené roli chemokinů při chemotaxi leukocytů existuje potřeba identifikovat a izolovat nové chemokiny pro usnadnění modulace imunitních odpovědí .

Kromě toho, zjištěná korelace mezi expresí chemokinu a zánětlivými stavy a chorobami představuje potenciál pro diagnostické a prognostické indikace použití chemokinů, jakož i protilátek, které jsou s chemokiny specificky imunoreaktivní. I proto existuje potřeba identifikovat a izolovat nové chemokiny pro usnadnění takových diagnostických a prognostických indikací.

Některé chemokiny, jako například 11-8, kromě své schopnosti přitahovat a aktivovat leukocyty, jsou také schopny ovlivňovat proliferaci jiných buněk než leukocytů (viz Tuschil, J. Invest. Dermatol. 99, 294 až 298, 1992). Existuje proto potřeba identifikovat a izolovat nové chemokiny pro usnadnění modulace takové proliferace buněk.

Ze všech výše uvedených důvodů existuje proto potřeba vyvinout rekombinantní způsoby produkce nově objevených chemokinů. Tyto rekombinantní způsoby potom dále usnadní klinické aplikace chemokinů a jejich inhibitorů.

Podstata vynálezu

Vynález je zaměřen na nové purifikované a izolované polynukleotidy a polypeptidy, které splňují jednu nebo více výše uvedených potřeb.

·· ····

Jedním aspektem tohoto vynálezu jsou purifikované a izolované polynukleotidy (tj. DNA a RNA, a to jak kódující, tak nekódující řetězce), které kódují nový lidský chemokin z podtřídy C-C, který je v tomto textu označován názvem chemokin pocházející z makrofágů (Macrophage Derived Chemokine), zkráceně MDC. Přednostní sekvence DNA podle vynálezu zahrnují sekvence genomové DNA a cDNA a chemicky syntetizované sekvence DNA.

Nukleotidová sekvence cDNA označená názvem MDC cDNA, která kóduje tento chemokin, je znázorněna v SEQ ID NO: 1. Tato sekvence zahrnuje 5' a 3' nekódující sekvence. Přednostní DNA podle vynálezu zahrnuje nukleotidy 20 až 298 ze SEQ ID NO: 1, kteréžto nukleotidy zahrnují kódující sekvenci MDC.

Protein MDC obsahuje putativní 24-aminokyselinovou signální sekvenci u svého aminokonce. Přednostní DNA podle vynálezu obsahuje nukleotidy 92 až 298 ze sekvence SEQ ID NO: 1, kteréžto nukleotidy zahrnují putativní kódující sekvenci maturovaného (sekretovaného) proteinu MDC bez signální sekvence.

Aminokyselinová sekvence chemokinů MDC je uvedena na SEQ ID NO: 2. Přednostní polynukleotidy podle tohoto vynálezu zahrnují kromě polynukleotidů popsaných výše také polynukleotidy, které kódují aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 a které se liší od polynukleotidů popsaných v předchozích odstavcích pouze dobře známou degenerací svého genetického kódu.

Podobně, jelikož 24 aminokyselin (polohy -24 až

-1) SEQ ID NO: 2 zahrnuje putativní signální peptid, který se odštěpuje za vzniku maturovaného chemokinů MDC, zahrnují přednostní polynukleotidy podle vynálezu také polynukleoti4 4 4 4 • · 4

dy, které kódují aminokyseliny 1 až 69 ze SEQ ID NO: 2. Přednostním polynukleotidem je tedy purifikovaný polynukleotid kódující polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, která zahrnuje aminokyseliny 1 až 69 ze sekvence SEQ ID NO: 2.

Z použití polynukleotidů podle tohoto vynálezu je možno uvést použití jako hybridizační próby pro identifikaci a izolaci genomové DNA kódující humánní MDC. Takový gen bude mít pravděpodobně strukturu zahrnující tři exony a dva introny, kterážto struktura je charakteristická pro geny chemokinů C-C (viz Baggiolini et al., výše uvedená citace); identifikaci a izolaci DNA majících sekvence kódující jiné než lidské proteiny homologické vzhledem k MDC; a identifikaci buněk, které exprimují MDC, jakož i vymezení podmínek, za jakých je tento protein exprimován.

Hybridizačních prób podle vynálezu je také možno použít v diagnostice, například při hledání zánětů v lidské tkáni, například ve tkáni tlustého střeva. Hybridizační studie za použití MDC polynukleotidové hybridizační próby jsou schopny odlišit tkáň tlustého střeva pacientů s Crohnovou chorobou (v tom případě je MDC hybridizace detegována v epitheliu, lamina propria, Payerových ložiscích a hladkém svalstvu) od tkáně tlustého střeva normálního člověka (v tomto případě není hybridizace vyšší než pozadí).

Obecně lze říci, že jako hybridizační próba podle vynálezu je užitečná souvislá část MDC cDNA podle vynálezu obsahující alespoň asi 14 nukleotidů a přednostně asi 18 nukleotidů. Jedním aspektem tohoto vynálezu je tedy DNA zahrnující souvislou část nukleotidové sekvence SEQ ID NO: 1 nebo nekódujícího řetězce, který je k této sekvenci komplementární, kterážto souvislá část obsahuje alespoň 18 nukleotidů, přičemž tato DNA je schopna hybridizovat za strin- 9 »· *··· ·· **·· » · · » · · • · · β gentních podmínek ke kódujícímu nebo nekódujícími řetězci lidského MDC genu. Pokud se má hybridizačních prób podle vynálezu použít pro diagnostické účely, vykazují přednostně hybridizačni specificitu vůči sekvencím genu MDC. V přednostním provedení tedy DNA podle vynálezu, které tvoří hybridizační próby, nehybridizují za stringentních podmínek k jiným genům chemokinů člověka, například genům MCP-1, genům MCP-2, genům RANTES, genům ΜΙΡ-Ια, genům MIP-Ιβ, genům 1-309 atd.

Podle dalšího aspektu je předmětem vynálezu purifikovaný polynukleotid, který za stringentních podmínek hybridizuje k nekódujícímu řetězci DNA se sekvencí SEQ ID NO. 1. Podobně je předmětem vynálezu také purifikovaný polynukleotid, který by, kdyby nebylo redundance genetického kódu, hybridizoval za stringentních podmínek k nekódujícímu řetězci DNA se sekvencí SEQ ID NO: 1. Jako příklad stringentních hybridizačních podmínek je možno uvést tyto podmínky: hybridizace při 42C v 5X SSC, 20mM fosforečnanu sodném o pH 6,8, 50% formamidu a promývání při 42°C za použití 0,2X SSC. Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že je žádoucí měnit tyto podmínky empiricky s ohledem na délku a obsah nukleotidové báze GC v sekvencích, které mají být hybridizovány a že existují vzorce pro určení takových variací (viz například Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Mannual, 2. vydání, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Dalším aspektem tohoto vynálezu jsou plasmidové a virové DNA vektory obsahující DNA podle vynálezu, které byly popsány výše, včetně jakýchkoliv DNA uvedených kdekoliv v tomto popisu. Přednostní vektory zahrnují expresní vektory, v nichž je zavedená cDNA, která kóduje MDC operativně připojena k endogenní nebo heterologní sekvenci řídící expresi. Takové expresní vektory mohou dále zahrnovat • 9 9999 ··

9· *999 • · » ···

9» sekvence DNA kódující polypeptid, které jsou operabilně připojeny k sekvencím DNA kódujícím MDC. Tyto vektory je možno exprimovat a získá se přitom fúzovaný protein obsahující MDC polypeptid, který je předmětem zájmu.

Dalším aspektem tohoto vynálezu jsou prokaryontní nebo eukaryontní hostitelské buňky, které jsou stabilně transfekovány nebo transformovány DNA nebo vektorem podle tohoto vynálezu. V přednostních hostitelských buňkách se exprimuje maturovaný MDC polypeptid kódovaný DNA nebo vektorem podle tohoto vynálezu. DNA, vektory a hostitelské buňky podle tohoto vynálezu jsou užitečné například při způsobech rekombinantní produkce velkých množství polypeptidů MDC podle tohoto vynálezu. I samotné tyto způsoby spadají do rozsahu tohoto vynálezu. Předmětem vynálezu je tedy například také způsob produkce MDC, při němž se hostitelská buňka podle vynálezu pěstuje ve vhodném živném médiu a z buněk nebo z média se izoluje MDC protein.

Ještě dalším aspektem tohoto vynálezu jsou purifikované a izolované MDC polypeptidy. Přednostním peptidem je purifikovaný chemokinový polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci zahrnující aminokyseliny 1 až 69 ze sekvence SEQ ID NO: 2. Polypeptidy podle vynálezu je možno purifikovat z přírodních zdrojů, ale přednostně se produkují rekombinantními postupy za použití různých DNA, vektorů a/nebo hostitelských buněk podle vynálezu. Připravit je možno je i chemickou syntézou. Purifikované polypeptidy podle vynálezu mohou být glykosylovány nebo neglykosylovány, mohou být ve vodě rozpustné nebo nerozpustné, mohou být oxidovány nebo redukovány atd. v závislosti na zvolené hostitelské buňce, metodě rekombinantní produkce, izolační metodě, zpracování, pufru zvoleném pro uskladnění apod.

• Λ ·

Předmětem vynálezu jsou také polypeptidové analogy MDC, v nichž je u MDC polypeptidu podle tohoto vynálezu jeden nebo více aminokyselinových zbytků přidáno, vypuštěno nebo nahrazeno, za předpokladu, že si takové analogy zachovávají jednu nebo více biologických účinností, jež jsou charakteristické pro chemokiny C-C. Malá velikost MDC umožňuje chemickou syntézu takových polypeptidových analogů. Připravené analogy je možno podrobit screeningu na biologické aktivity MDC (například schopnost indukovat makrofágovou chemotaxi nebo inhibovat monocytovou chemotaxi) za použití celé řady stanovení aktivity, která je charakterizována v tomto popisu. Alternativně lze takové polypeptidové analogy produkovat rekombinantní cestou za použití dobře známých postupů, jako je místně orientovaná mutagenese DNA kódující MDC podle tohoto vynálezu.

Podobným aspektem tohoto vynálezu jsou polypeptidové analogy, v nichž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků přidáno, vypuštěno nebo nahrazeno vzhledem k MDC polypeptidům podle tohoto vynálezu, přičemž takové analogy sice nevykazují biologické aktivity chemokinů C-C nebo MDC, ale jsou schopny kompetitivní nebo nekompetitivní inhibice vazby MDC polypeptidů k receptorů chemokinů C-C. Takové polypeptidy jsou například užitečné pro modulaci biologické aktivity endogenního MDC v hostiteli a jsou také užitečné pro zobrazovací postupy v lékařství, jež byly zmíněny výše.

U určitých specifických analogů MDC se předpokládá modulace struktury, intermolekulárních vazebných charakteristik a biologických účinností MDC. Tak například, změna struktury a funkce MDC se specificky předpokládá u analogů vzniklých deleci u aminokonce a karboxylového konce (N-terminální ch a C-terminálních zkrácených analogů).

···· • · · · •·· ··· ·· e

Do rozsahu vynálezu spadají dále následující specifické alterace jednotlivých aminokyselin (jednočetné nebo kombinované):

1) nahrazení zbytku bázické argininové a/nebo lysinové aminokyseliny v poloze 24 a 27 sekvence SEQ ID NO:

zbytkem nebázické aminokyseliny;

2) nahrazení tyrosinového zbytku v poloze 30 sekvence SEQ ID NO: 2, tryptofanového zbytku v poloze 59 sekvence SEQ ID NO: 2 a/nebo valinového zbytku v poloze 60 sekvence SEQ ID NO: 2 zbytkem nabité nebo polární aminokyseliny (například šeřinu, lysinu, argininu, histidinu, aspartátu, glutamátu, asparaginu, glutaminu nebo cysteinu); a

3) nahrazení zbytku glutamové kyseliny v poloze 50 sekvence SEQ ID NO: 2 zbytkem bázické nebo malé nenabité aminokyseliny (například lysinu, argininu, histidinu, glycinu nebo alaninu).

Specifické analogy zahrnující tyto alterace aminokyselin spadají do rozsahu sekvence SEQ ID NO. 25, která je znázorněna dále.

Met

Ala

Arg

Leu

Gin

Thr

Ala

Leu

Leu Val

Val

Leu

Val

Leu

Leu

Ala

-24

-20

-15

-10

Val

Ala

Leu

Gin

Ala

Thr

Glu

Ala

Gly Pro

Tyr

Gly

Ala

Asn

Met

Glu

-5

1

5

Asp

Ser

Val

Cys

Cys

Arg

Asp

Tyr

Val Arg

Tyr

Arg

Leu

Pro

Leu

Xaa

10

15

20

Val

Val

Xaa

His

Phe

Xaa

Trp

Thr

Ser Asp

Ser

Cys

Pro

Arg

Pro

Gly

25

30

35

40

Val Val Leu Leu Thr Phe Arg Asp Lys Xaa Ile Cys Ala Asp Pro Arg 45 50 55

I

• · ··· ·

Val Pro Xaa Xaa Lys Met Xle Leu Aen Lye Leu Ser Cln kde aminokyselina v poloze 24 je zvolena ze souboru zahrnujícího arginin, glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, serin, threonin, fenylalanin, tyrosin, tryptofan, aspartát, glutamát, asparagin, glutamin, cystein a methionin;

aminokyselina v poloze 27 je nezávisle zvolena ze souboru zahrnujícího lysin, glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, serin, threonin, fenylalanin, tyrosin, tryptofan, aspartát, glutamát, asparagin, glutamin, cystein a methionin;

aminokyselina v poloze 30 je nezávisle zvolena ze souboru zahrnujícího tyrosin, serin, lysin, arginin, histidin, aspartát, glutamát, asparagin, glutamin a cystein;

aminokyselina v poloze 50 je nezávisle zvolena ze souboru zahrnujícího kyselinu glutamovou, lysin, arginin, histitin, glycin a alanin;

aminokyselina v poloze 59 je nezávisle zvolena ze souboru zahrnujícího tryptofan, serin, lysin, arginin, histidin, aspartát, glutamát, asparagin, glutamin a cystein; a aminokyselina v poloze 60 je nezávisle zvolena ze souboru zahrnujícího valin, serin, lysin, arginin, histidin, aspartát, glutamát, asparagin, glutamin a cystein.

U takových polypeptidových analogů MDC se předpokládá schopnost specifické modulace vazebných charakteristik MDC k receptorům chemokinu a/nebo jiným molekulám (například heparinu, glykosaminoglykanům, erythrocytovým receptorům ·· ···· • · · • · · • · · · • · chemokinů), které jsou považovány za důležité při prezentaci MDC k jeho receptoru. V jednom přednostním provedení zahrnují analogy polypeptidu MDC podle vynálezu aminokyseliny 1 až 69 ze sekvence SEQ ID NO: 25.

Také byly syntetizovány následující další analogy, které rovněž spadají do rozsahu tohoto vynálezu:

a) polypeptid obsahující sekvenci aminokyselin identifikovanou polohami 1 až 70 ze SEQ ID NO: 30;

b) polypeptid obsahující sekvenci aminokyselin identifikovanou polohami 9 až 69 ze SEQ ID NO: 2;

c) polypeptid obsahující sekvenci aminokyselin identifikovanou polohami 1 až 69 ze SEQ ID NO: 31; a

d) polypeptid obsahující sekvenci aminokyselin identifikovanou polohami 1 až 69 ze SEQ ID NO: 32.

Do rozsahu tohoto vynálezu také spadají purifikované a izolované polynukleotidy kódující tyto analogy polypeptidu MDC. Tyto polynukleotidy jsou užitečné například pro rekombinantní produkci polynukleotidů MDC. Podobně spadají do rozsahu tohoto vynálezu také prokaryontní a eukaryontní hostitelské buňky, které jsou stabilně transformovány takovými DNA nebo vektory.

Dalším aspektem tohoto vynálezu jsou protilátky (například monoklonální a polyklonální protilátky, jednořetězcové protilátky, chimérické a humanizované protilátky apod.), jež jsou imunoreaktivní s polypeptidy MDC a jejich analogy podle tohoto vynálezu. Tyto protilátky jsou užitečné například při purifikaci polypeptidů podle vynálezu, pro kvantitativní měření endogenního MDC v hostiteli, například

I za použití dobře známých technik ELISA a pro modulaci vazby MDC k jeho receptoru či receptorům. Do rozsahu vynálezu dále spadají také hybridomální buněčné linie produkující protilátky podle tohoto vynálezu.

Rekombinantních polypeptidu MDC a jejich polypeptidových analogů podle tohoto vynálezu se může používat podobným způsobem jako protilátek při vazebných reakcích pro identifikaci buněk exprimujících receptor nebo receptory MDC a při standardních expresních klonovacích technikách za účelem izolace polynukleotidů kódujících takový receptor nebo receptory. Takové polypeptidy MDC, analogy polypeptidů MDC a MDC receptorové polypeptidy jsou užitečné pro modulaci MDC chemokinové účinnosti a pro identifikaci polypeptidu a chemického činidla (například malé molekuly), který je agonistou či antagonistou MDC.

Další aspekty tohoto vynálezu se vztahují k farmaceutickému využití polypeptidů MDC a analogů polypeptidů MDC podle tohoto vynálezu. Tak například bylo ukázáno, že MDC moduluje chemotaxi leukocytů. Zejména bylo ukázáno, že MDC indukuje chemotaxi makrofágů a inhibuje chemotaxi monocytů. Jedním aspektem tohoto vynálezu je tedy způsob modulace (například regulace směrem nahoru nebo dolů) chemotaxe leukocytů v savčím hostiteli, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje stupeň podání MDC polypeptidu nebo polypeptidového analogu MDC podle vynálezu, přičemž tento polypeptid MDC nebo polypeptidový analog MDC moduluje chemotaxi leukocytů v hostiteli. V přednostních provedeních jsou leukocyty tvořeny monocyty a/nebo makrofágy. Tak například se podává empiricky stanovené množství MDC (například ve farmaceuticky vhodném nosiči) za účelem indukce chemotaxe makrofágů nebo inhibice chemotaxe monocytů. Inhibičních analogů MDC polypeptidů se používá pro dosažení opačného účinku.

I

Dalším aspektem tohoto vynálezu je způsob paliativního ošetření zánětlivého stavu pacienta, kterýžto stav je charakterizován alespoň i) chemotaxi monocytů směrem k místu zánětu v organismu pacienta a/nebo ii) proliferací fibroblastových buněk, jehož podstata spočívá v tom, že se pacientovi podá terapeuticky účinné množství MDC. Podle jednoho provedení se za terapeuticky účinné množství MDC považuje množství této látky, které je schopno inhibovat chemotaxi monocytů. V jiném provedení se za terapeuticky účinné množství MDC považuje množství této látky, které je schopno inhibovat proliferací fibroblastových buněk. Taková terapeuticky účinná množství se stanoví empiricky za použití dobře známých stanovení závislosti vyvolané odpovědi na podané dávce.

Dalším aspektem tohoto vynálezu jsou farmaceutické prostředky obsahující polypeptidy MDC nebo jejich analogy podle tohoto vynálezu ve farmaceuticky vhodném nosiči. Podobně je předmětem vynálezu i použití prostředků podle vynálezu pro léčení chorobných stavů, například zánětlivých chorob. Podle jednoho provedení je zánětlivý chorobný stav charakterizován chemotaxi monocytů směrem k místu zánětu v těle pacienta postiženého tímto chorobným stavem. Podle jiného provedení je zánětlivých chorobný stav charakterizován proliferací fibroblastových buněk v těle pacienta postiženého tímto chorobným stavem.

Výše uvedené aspekty a četné další aspekty tohoto vynálezu budou zřejmé z připojených výkresů a podrobného popisu, který následuje.

Přehled obr, na výkresech

Na obr. 1 je uvedeno srovnání aminokyselinové sekvence humánního MDC (SEQ ID NO: 2) s aminokyselinovými ·· ·»·· ·· «··· sekvencemi jiných, dříve charakterizovaných lidských chemokinů C-C: MCP-3 [Van Damme et al., J. Exp. Med., 176:

(1992)] (SEQ ID NO: 18); MCP-1 [Matsushima et al., J.

Exp. Med., 169: 1485 (1989)] (SEQ ID NO: 19); MCP-2 (maturovaná forma) [Van Damme, výše uvedená citace; Chang et al., Int. Immunol., 1:388 (1989)] (SEQ ID NO 20); RANTES [Schall et al., J. Immunol., 141: 1018 (1988)] (SEQ ID NO: 21); MIP-Ιβ [Brown et al., J. Immunol., 142:679 (1989)] (SEQ ID NO: 22); ΜΙΡ-Ια [Nakao et al., Mol. Cell Biol., 10:3646 (1990)] (SEQ ID NO: 23); a 1-309 [Miller et al., J.

Immunol., 143:2907 (1989] (SEQ ID NO: 24). Lomítko ”/ označuje místo, v němž se odštěpují putativní signální peptidy, pomlčky jsou vloženy pro optimalizaci zákrytu sekvencí.

Na obr. 2 je znázorněn graf popisující chemotaktický účinek (měřený v jednotkách fluorescence) zvyšujících se koncentrací MDC na migraci lidských jednojaderných buněk při stanovení chemotaxe. Plné kroužky ukazují odpověď lidských jednojaderných buněk pocházejících z buněčné linie THP-1. Prázdné kosočtverce ukazují odpověď na pozitivní kontrolu, sérum aktivované zymosanem (ZAS).

Na obr. 3 je znázorněn graf popisující chemotaktický účinek (měřený v jednotkách fluorescence) zvyšujících se koncentrací MDC na migraci lidských polymorfonukleárních pmn leukocytů. Plné kroužky ukazují odpověď na MDC a prázdné kosočtverce ukazují odpověď na pozitivní kontrolu, 11-8.

Na obr. 4 je znázorněn graf popisující chemotaktický účinek (měřený v jednotkách fluorescence) zvyšujících se koncentrací MDC na migraci makrofágů a monocytů. Plné kroužky ukazují odpověď na MDC u makrofágů pocházejících z buněčné linie THP-1 a prázdné kosočtverce ukazují •9 9999 • 9 · • · 9

9 9 9

- ie - :

odpověď na MDC u monocytů pocházejících z buněčné linie THP-1.

Na obr. 5 je znázorněn graf popisující chemotaktický účinek (měřený v jednotkách fluorescence) zvyšujících se koncentrací MDC na migraci peritoneálních makrofágů morčete. Plné kroužky ukazují odpověď na MDC u makrofágů. Prázdný trojúhelníček ukazuje odpověď v případě pozitivního kontrolního pokusu, při němž se použije séra aktivovaného zymosanem (ZAS).

Na obr. 6 je znázorněn graf popisující inhibiční účinek na chemotaxi (měřený v jednotkách fluorescence) zvyšujících se koncentrací MDC na migraci monocytů THP-1 indukovanou MCP-1. Plné kroužky označují inhibiční účinky MDC na chemotaxi indukovanou MCP-1. Prázdné kroužky popisují inhibiční účinky MDC na chemotaxi při kontrolním pokusu, při kterém se použije základního média (RPMX s 0,2% BSA, tj. RBSA, ale bez MCP-1). Nulový bod na ose x odpovídá odpovědi buněk na MCP-1 a RBSA za nepřítomnosti MDC.

Na obr. 7 je znázorněn graf popisující účinek (měřený v cpm, tj. rozpadech za minutu) zvyšujících se koncentrací MDC na proliferaci fibroblastů. Plné kroužky ukazují proliferativní odpověď s purifikovaným MDC, který byl rekombinantně produkován v buňkách CHO (příklad 10F). Prázdné kroužky ukazují odpověď na chemicky syntetizovaný MDC (příklad 11).

Na obr. 8 je schematicky znázorněna konstrukce savčího expresního vektoru pDCl.

- 19 Příklady provedení vynálezu

Vynález je ilustrován v následujících příkladech, které se vztahují k lidské cDNA označené zkratkou MDC cDNA, jež kóduje nový C-chemokin označený zkratkou MDC (Macrophage Derived Chemokine, tj. chemokin pocházející z makrofágů). Příklad 1 konkrétně popisuje izolaci části MDC cDNA z cDNA knihovny lidského makrofágů. Příklad 2 popisuje izolaci přídavných cDNA z cDNA knihovny za použití cDNA z příkladu 1, jako próby. Jedna z těchto přídavných cDNA obsahuje úplnou MDC kódující sekvenci. V příkladu 2 je navíc uvedena složená MDC cDNA nukleotidová sekvence a je zde charakterizována dedukovaná aminokyselinová sekvence chemokinu (MDC), který je touto nukleotidovou sekvencí kódován. V příkladu 3 jsou popsány experimenty ukazující hladinu exprese MDC genu v různých lidských tkáních. Největší exprese MDC genu byla pozorována v tkáni brzlíku, mnohem slabší exprese byla zjištěna v tkáních sleziny a plic. Příklad 4 popisuje expresi genu MDC během maturace monocytů na makrofágy a během indukce diferenciace buněk HL60 na buněčný typ podobající se makrofágů.

Jelikož byla exprese genu MDC detegována v thymu a slezině (viz příklad 3), byly provedeny in šitu hybridizační studie za účelem další lokalizace exprese genu MDC v těchto tkáních. In šitu hybridizace ukázala korelaci mezi zvýšenou expresí genu MDC v střevní tkáni a Crohnovou chorobou. Tyto in šitu hybridizační pokusy jsou popsány v příkladu 5.

I

Příklad 6 popisuje rekombinantní produkci MDC, jakožto fúzovaného proteinu GST-MDC v prokaryontních buňkách, jakož i štěpení tohoto fúzovaného proteinu a purifikaci rekombinantního MDC. Příklad 7 popisuje konstrukci alternativního DNA konstruktu, který je užitečný pro expresi rekombinantního proteinu MDC a popisuje ·· ····

- 20 *· ·*·

produkci MDC v bakteriálním hostiteli, který byl transformován tímto konstruktem.

V příkladu 8 jsou uvedeny experimentální protokoly purifikace rekombinantního MDC produkovaného způsobem popsaným v příkladu 7. Příklady 9 a 10 obsahují experimentální protokoly pro rekombinantní produkci MDC v kvasinkách a savčích buňkách. Příklad 10 obsahuje protokoly purifikace rekombinantního MDC. Příklad 11 popisuje produkci MDC a MDC polypeptidových analogů peptidovou syntézou.

Příklady 12 až 17 obsahují protokoly pro stanovení biologických aktivit MDC. Tak například příklad 12 obsahuje popis stanovení účinků MDC na basofily, žírné buňky a eosinofily. Příklad 13 popisuje stanovení vlastností MDC, jakožto chemoatraktantu a vlastnosti MDC při aktivaci buněk. Při posledně uvedených stanoveních se používá monocytů/ makrofágů, neutrofilů a granulocytů.

Příklady 14 až 17 obsahují protokoly stanovení biologických účinností MDC in vivo. V příkladu 14 je popsáno stanovení inhibičních vlastností MDC na růst nádorů. V příkladech 15 až 16 jsou uvedeny protokoly pro stanovení účinnosti MDC při intraperitoneálním a subkutánním injekčním podání. V příkladu 17 jsou uvedeny protokoly pro stanovení myelosupresivní aktivity MDC.

Příklad 18 obsahuje protokol pro vytváření monoklonálních protilátek, které jsou specificky imunoreaktivní s MDC.

Ostatní příklady obsahují přídavná stanovení účinnosti MDC. Tak například příklad 19 obsahuje popis stanovení vápníkového toku za účelem zjištění schopnosti MDC indukovat aktivaci buněk. Příklad 20 obsahuje popis stanovení účinnosti MDC proti HIV a antiproliferativní účinnosti MDC. V příkladu 21 jsou ukázány aktiproliferativní účinky MDC na fibroblasty. Příklad 22 obsahuje popis in vitro zkoušek pro zjištění účinků MDC na proliferaci dalších typů buněk. Příklad 23 obsahuje popis in vivo zkoušky prováděné za účelem stanovení antiproliferativních účinků MDC na fibroblasty. Příklad 24 obsahuje popis stanovení zaměřených na identifikaci MDC modulátorů.

Příklad 1

Izolace části cDNA C-C chemokinů

Částečná cDNA nového C-C chemokinů byla izolována dále uvedeným způsobem. Z makrofágů pocházejících z monocytů periferní krve se sklidí póly A* RNA. Za použití soupravy Invitrogen Copy Kit (San Diego, Kalifornie, USA) se vytvoří dvouřetězcová cDNA s tupými konci, k této cDNA se ligují adaptéry BstXI a potom se provede inserce do savčího expresního vektoru, pRc/CMV (Invitrogen) [viz Tjoelker et al. , Nátuře, 374: 549 až 552 (1955)]. Bakterie E. coli, XLl-Blue (Stratagene, La Jolla, Kalifornie, USA) se transformuje elektroporací cDNA knihovnou tohoto plasmidu a poté se navzorkuje na 986 misek obsahujících 100 μg/ml karbenicilinu (přibližně 3000 transformantů na misku). Bakterie se nechají růst přes noc při 37C a potom se nárůst seškrábne z každé misky, čímž se získá 986 bakteriálních vzorků. Z každého z těchto 986 bakteriálních vzorků se izoluje plasmidová DNA za použití systému Magie Miniprep DNA Purification System (Promega, Madison, Wisconsin, USA), přičemž se pracuje podle instrukcí výrobce.

Purifikovaných vzorků plasmidové DNA bylo potom použito pro izolaci individuálních cDNA klonů, které sloužily pro další charakterizaci. Při tom bylo postupováno •9 9999

9999 takto: Plasmidové DNA z jednotlivých vzorků se použije pro transformaci buněk E. coli XLl-Blue. Buňky se nanesou na misky a nechají růst přes noc za podmínek uvedených výše. Náhodným způsobem se vyberou jednotlivé transformanty, které se nechají růst přes noc ve 3 ml média LB doplněného karbenicilinem za účelem purifikace plasmidů. Použije se systému Wizard Miniprep Purification System (Promega) s následujícími obměnami: k vazebné pryskyřici pro DNA dodávané výrobcem se přidá 250 mg křemeliny (Sigma Chem.

Co., St. Louis, MO, USA). Purifikovaná plasmidová DNA se sekvenuje na automatizovaném sekvenačním zařízení Automated Sequencer Model 373 (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornie, USA) za použití primerů JHS P6:

5' GACACTATAGAATAGGGC 3' (SEQ ID NO: 3).

Tento primer hybridizuje k plasmidovému vektoru pRc/CMV přiléhajícímu k místu klonování.

Nukleotidová sekvence a dedukovaná aminokyselinová sekvence jednotlivých cDNA se porovná s databázemi nukleotidových a peptidových sekvencí za účelem stanovení, které z klonů kódují proteiny vykazující podobnost se známými mediátory zánětu. Porovnávání sekvencí bylo provedeno 14. prosince 1994 na pracovišti BLAST Network Service of the National Center for Biotechnology Information (E-mail: [email protected]) za použití přiřazovacího algoritmu popsaného v Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 až 410 (1990). Analýza sekvence ukazuje, že část jednoho z izolovaných klonů makrofágové cDNA, který je označen zkratkou pMP390, obsahuje sekvenci genu vykazující přibližně 60 až 70% shodu (totožnost) s dříve identifikovanými geny chemokinů, včetně genu MCT3 člověka a genu MIP-Ιβ krysy.

·· ·*·· ·· ····

2,85kb insert cDNA z pMP390 se subklonuje do vektoru pBlueScript SK“ (Stratagene, La Jolla, Kalifornie, USA) pro usnadnění úplného sekvencování. Štěpením za použití systému Promega's Erase-a-Base System (Madison, Wisconsin, USA) se vytvoří hnízdové delece, počínaje ocasem poly-A. Plasmidy s deleci se znovu recirkularizují a klonují do E. coli, načež se provede purifikace a sekvenace za použití primerů M13, T3.1 a T7.1 (SEQ ID NO: 4)

M13: 5’GTAAAACGACGGCCAGT 3’ (SEQ ID NO: 5)

T3.1: 5’ AATTAACCCTCACTAAAGGG 3’ (SEQ ID NO: 6)

T7.1: 5’ GTAATACGACTCACTATAGGGC 3’

Úplná sekvence této pMP390 cDNA odpovídá nukleotidům 73 až 2923 ze SEQ ID NO: 1 (a dedukovaným aminokyselinám -6 až 69 ze SEQ ID NO: 2). Sekvence, která byla původně porovnávána se sekvencemi v databázích, odpovídá nukleotidům 73 až 610 ze sekvence SEQ ID NO: 1.

Příklad 2

Izolace přídavných cDNA klonů obsahujících úplnou sekvenci kódující MDC

Za použití klonu pMP390 cDNA izolovaného způsobem popsaným v příkladu 1 se izolují další cDNA klony ze stejné makrofágové cDNA knihovny člověka. Tyto přídavné cDNA obsahují přídavnou 5' sekvenci a kódují úplnou aminokyselinovou sekvenci chemokinů pocházejícího z makrofágů.

···· ·· ····

Nejprve se podrobí screeningu pomocí PCR 40 z 986 vzorků plasmidové DNA z cDNA knihovny makrofágů (viz příklad 1) za účelem identifikace vzorků obsahujících přídavné cDNA klony, které jsou předmětem zájmu. Z pMP390 cDNA sekvence získané podle příkladu 1 se zkonstruuje syntetický oligonukleotidový PCR primer 390-1F (uložený pod označením SEQ ID NO: 7) a 390-2R (uložený pod označením SEQ ID NO: 8) za účelem amplifikace 211bp sekvence pMP390 zčásti kódovaný genem chemokinu.

390-1F: 5’TCTATCTAGAGGCCCCTACGGCGCCAACATGGAAG

390-2R: 5’ CACCGGATCCTCATTGGCTCAGCTTATTGAGAA 3’

Primer 390-1F odpovídá nukleotidům 91 až 116 ze sekvence SEQ ID NO: 1. Předchází mu rozpoznávací místo pro restrikční endonukleasu Xbal a čtyři přídavné báze pro usnadnění štěpení enzymem. Primer 390-2R je komplementární k nukleotidům 301 až 279 ze sekvence SEQ ID NO: 1, přičemž je fúzován k rozpoznávacímu místu pro enzym BamHI, které je lemováno čtyřmi přídavnými bázemi. Místa Xbal a BamHI jsou přidána pro usnadnění klonování výsledného fragmentu.

μΐ PCR reakční směsi pro každý zvolený plasmidový vzorek obsahuje 0,2 μg plasmidové DNA; l,5mM chlorid hořečnatý; 50mM chlorid draselný; lOmM Tris, pH 8,4; 0,2mM každého z dNTP; 10 μg/ml každého z primerů a 0,5 μΐ Taq polymerasy (5 jednotek/μΐ) (Boehringer Mannheim, Biochemicals (BMB), Indianapolis, IN, USA). Reakční směsi se inkubují po dobu 4 minut při 94’C a potom se provede 30 cyklů denaturace (15 sekund při 94’C), teplotní hybridizace (15 sekund při 60’C) a prodlužování (30 sekund při 72’C).

·· ···· ·· ···· · • * · · · · • · · · • · · * · o _c · · · · · · · — ·· * ♦ ·· ··· «· ·

Produkty PCR reakce se podrobí elektroforéze na 2% agarosovém gelu (Life Technologies, lne., Gaithersburg, MD, USA) v 0,5X TBE pufru (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, 2. vydání, Cold Spring Harbon, New York, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)) a vizualizace se provede pomocí ethidiumbromidu. Ze 40 plasmidových vzorků, které byly podrobeny zkoušení se u 6 zjistí intenzivní pás odpovídající očekávanému 230bp PCR fragmentu (který zahrnuje 211 bp sekvenci chemokinového genu lemovanou restrikčními místy Xbal a BamHI), což ukazuje na přítomnost jednoho nebo více plasmidů obsahujících genové sekvence mající vztah k pMP390.

Pro izolaci těchto příbuzných klonů se alikvotní vzorky ze tří z těchto šesti pozitivních plasmidových vzorků zavedou elektroporací do buněk E. coli XLl-Blue. Buňky se nanesou na misky a pěstují přes noc způsobem popsaným v příkladu 1. Kolonie se přenesou na nitrocelulosové membrány a ty se upraví podle standardních protokolů (Sambrook et al., výše uvedená citace) pro hybridizaci.

MDC próba značená radioizotopem pro screening filtrů se připraví dále uvedeným způsobem: 2,85kb fragment DNA obsahující MDC cDNA se vyštěpí z pMP390 štěpením restrikčním enzymem, purifikuje se elektroforézou na agarosovém gelu v pufru TAE (Sambrook et al., výše uvedená citace), podrobí elektroeluci, extrakci fenolem a chloroformem a srážení ethanolem. Purifikovaný fragment (250 ng) se označí za použití soupravy Random Primed DNA Labelling Kit (BMB) podle doporučení výrobce. Značená próba se purifikuje průchodem přes sloupec G-50 Quick Spin Column (BMB).

Filtry se inkubují 16 hodin při 42 °C za použití próby (5 x 10⁷ rozpadú/min) ve 40 až 50 ml roztoku obsahujícího 50% formamid, 5X Denhardtův roztok, 5X SSC (IX SSC = ···· · · ······ • · ·· ·· · · ·

0,15M chlorid sodný a 15mM citran sodný), 50mM fosforečnan sodný, pH 6,5 a 0,1 mg/ml DNA z lososího spermatu (sheared salmon sperm DNA) (Sigma, St. Louis, MO, jedn.SA). Po hybridi zaci se filtry 3 x promyjí v 0,2X SSC a 0,2% SDS při 55°C (promývání trvá 30 minut). Pro vizualizaci hybridizace se promyté filtry exponují přes noc při -80 °C na autoradiografický film XAR-5 Kodak (Rochester, NY, USA) za použití intenzifikačních filtrů Lightning Plus (DuPont, DE, USA).

PCR se použije pro screening 50 hybridizujících bakteriálních kolonií. Výše uvedeným způsobem se uspořádá 50 reakcí PCR za použití primerů 390-1F a 390-2R a bakterií z 50 kolonií místo templátové DNA. Na počátku se reakční směsi 8 minut denaturují při 94°C. Potom se provede 35 amplifikačních cyklů za výše popsaných podmínek. Jedna kolonie produkuje očekávaný 230bp produkt. Plasmid obsažený v tomto klonu se označí zkratkou pMP390-12.

Přídavné MDC cDNA, které jsou předmětem zájmu, se identifikují koloniovou hybridizací za použití próby specifické pro 5' konec insertu pMP390. Tato próba se připraví následujícím způsobem: Pomocí PCR se způsobem popsaným výše připraví fragment DNA obsahující 211 bází z kódující oblasti pMP390 cDNA (nukleotidy 91 až 298 ze sekvence SEQ ID NO: 1) a 163 bází sousední 3' nekódující oblasti. Při tom se jako templátu použije 60 ng klonu pMP390 cDNA a jako primerů se použije syntetických oligonukleotidů 390-1F (SEQ ID NO:

7) a 390-4R (SEQ ID NO: 9).

390-4R: 5' AATGGATCCACAGCACGGAGGTGACCAAG 3'

Primer 390-4R obsahuje restrikční místo BamHI, po němž následuje sekvence, jež je komplementární k nukleotidům

461 až 442 ze sekvence SEQ ID NO: 1.

·· ···· • · 9 ·· · • · 9 β • · · 9 9

9 9 9

9 9999 • · 9 9 ·9

PCR produkt se purifikuje výše popsanou elektroforézou a 50 ng purifikováného fragmentu se označí pomocí soupravy Random Primed DNA Labelling Kit (BMB) a purifikuje průchodem přes sloupec G-50 Quick Spin Column (BMB). Filtry se podrobí screeningu za použití tohoto fragmentu, jako próby, způsobem popsaným výše, promyjí se třikrát 0,4X SSC a 0,2% SDS při 48°C (30 minut). Autoradiografie se provede způsobem popsaným výše. Deteguje se 5 hybridizujících kolonií, které se označí zkratkami: MP390A, MP390B, MP390C, MP390D a MP390E.

Těchto 5 kolonií a kolonie transformovaná pMP390-l2 se izoluje a nechá růst za účelem purifikace plasmidů za použití systému Wizard Miniprep Purification System (Promega, Madison, WI, USA) s přídavkem křemeliny, jak je to uvedeno v příkladu 1. Plasmidová DNA se sekvenuje na automatickém sekvenačním zařízení Applied Biosystems Model 373 za použití syntetického primerů 390-3R (SEQ ID NO: 10):

390-3R: 5’ AGTCAAGCTTAGGGCACTCTGGGATCGGCAC 3*.

Primer 390-3R je komplementární k bázím 266 až 246 ze sekvence SEQ ID NO: 1 a u svého 5' konce obsahuje místo pro restrikční endonukleasu HindlII a 4 přídavné bázové páry. Tento primer byl zkonstruován pro teplotní hybridizaci před (vhledem ke směru exprese) a za (vhledem ke směru exprese) nukleotidem 216 ze sekvence SEQ ID NO: 1, tj. místem, v němž je předvídán intron v genomové DNA kódující chemokin podle tohoto vynálezu (viz Danoff et al., J. Iramunology, 152: 1182 až 1189 (1994)).

Z těchto šesti klonů obsahují největší přídavnou 5' kódující sekvenci klony pMP390-12 a pMP-390-B. Každá z těchto přídavných sekvencí obsahuje 72 přídavných nukleotidů předcházejících (vhledem ke směru exprese) sekvenci, která byla ·· >··· ·· ···· dříve získána z klonu pMP390 cDNA. Kompozitní DNA sekvence, která je zde označena zkratkou MDC cDNA, se získá přiřazením sekvencí pMP390 a pMP390-12 cDNA. Tato 2923bp kompozitní cDNA sekvence je uvedena v tomto textu jako SEQ ID NO: 1. Příslušná dedukovaná aminokyselinová sekvence chemokinů MDC je v tomto textu uvedena jako SEQ ID NO: 2.

Manuální porovnání dedukované aminokyselinové sekvence MDC se sekvencemi známých chemokinů ukazuje, že sekvence MDC cDNA kóduje nový C-C chemokin o délce 93 aminokyselin. Tento chemokin vykazuje 28 až 34% shodu (identitu) v aminokyselinách s jinými C-C chemokiny (viz obr. 1 a tabulka 1).

···· ·· ···· ··

Tabulka 1

Shoda aminokyselinových sekvencí mezi MDC a dříve identifi kovanými C-C chemokiny (%)

	MDC	MCP-1	MCP-2	MCP-3	RANTES	ΜΙΡ-Ια	MIP-10	1-309
MDC		29%	28%	33%	34%	29%	33%	32%
MCP-1	29%		62%	72%	34%	38%	34%	33%
MCP-2	28%	62%		59%	30%	36%	33%	34%
MCP-3	33%	72%	59%		34%	35%	35%	37%
RANTES	34%	34%	30%	34%		50%	44%	22%
ΜΙΡ-Ια	29%	38%	36%	35%	50%		55%	35%
MIP-1/3	33%	34%	33%	35%	44%	55%		31%
1-309	32%	33%	34%	37%	22%	35%	31%

·· · ·· · • · · • · ·

- 30 - :::

·· ·

Důležité je, že jsou 4 cysteinové zbytky, které jsou charakteristické pro chemokiny v MDC konzervovány. V 8 sekvencích znázorněných na obr. 1 je úplně konzervováno 5 dalších zbytků.

Prvních 24 aminokyselin z 93 aminokyselinové sekvence MDC je převážně hydrofóbních, což je konsistentní s Heijne-ovými pravidly (Nucleic Acid Res. 14: 4683 až 4690 (1986)), které řídí odštěpování signálu. Tyto znaky a porovnání polypeptidů znázorněné na obr. 1 dohromady ukazují, že MDC cDNA kóduje 24 aminokyselinový signální peptid, který se odštěpuje za vzniku maturované formy MDC počínající glycinovým zbytkem v poloze 1 sekvence SEQ ID NO: 2. Tento předpoklad byl potvrzen přímým sekvenováním proteinu MDC produkovaného rekombinantní cestou v savčích buňkách, jak je to popsáno dále v příkladu 10. Kompozitní cDNA sekvence pro MDC znázorněná v SEQ ID NO: 1 zahrnuje 19 nukleotidů předcházejících (vhledem ke směru exprese) předvídaný iniciační methioninový kodon a obsahuje 2,6 kb fragment za terminačním kodonem.

Příklad 3

Stanovení exprese genu MDC v lidských tkáních

Pro stanovení tkání, v nichž je exprimován gen MDC se provedou analýzy Northern blot.

5' fragmentu pMP390 označeného radioizotopem, popsaného v příkladu 2 (který odpovídá oblasti MDC cDNA kódující putativní maturovanou formu MDC plus 163 bází sousední 3' nekódující oblasti) se použije jako próby pro bloty Multiple Tissue Northern Blots (Clontech, Palo Alto, Kalifornie, USA) obsahující RNA z různých normálních lidských tkání. Před použitím se próba denaturuje varem a ···· • · · • · » • · · <5 * hybridizace se provádějí podle protokolu popsaného výrobcem. Autoradiografie se exponují 5 dnů při -80°C se dvěma intenzifikačními stínítky.

Největší exprese genu MDC je pozorována v tkáni brzlíku a mnohem menší exprese je detegována v slezinné a plicní tkáni. Exprese MDC v tkáni tenkého střeva je ještě na nižší úrovni a žádná exprese není pozorována v mozku, tlustém střevě, srdci, ledvinách, játrech, vaječnících, slinivce břišní, placentě, prostatě, v kosterním svalstvu, varlatech, ani leukocytech periferní krve.

Příklad 4

Exprese MDC genu během maturace makrofágů

S ohledem na skutečnost, že cDNA kódující MDC byly izolovány z humánní makrofágové cDNA knihovny, byla zkoumána exprese MDC genu během diferenciace monocytů na makrofágy za použití následujícího postupu:

A.

Humánní monocyty od jediného dárce se kultivují v sérii misek pro tkáňové kultury a buňky z jedné misky se sklidí vždy po 0, 2, 4 nebo 6 dnech (obecný postup je uveden v publikaci Elstad et al., J. Immunol. 140, 1618 až 1624 a Tjoelker et al., výše uvedená citace). Za těchto podmínek dojde k diferenciaci monocytů na makrofágy do 4. až 6. dne (Stafforini et al., J. Biol. Chem. 265, 9682 až 9687 (1990)).

Z RNA (10 μg/pás) buněk sklizených v každém časovém okamžiku se připraví Northern blot, a ten se podrobí zkoušení za použití próby obsahující radioizotopem značený e· ··· ·

· • · *

fragment pMP390 charakterizovaný výše. V RNA pocházející z čerstvě izolovaných monocytů není detegovatelný žádný signál, zatímco buňky, u nichž proběhla diferenciace na makrofágy po 6 dnech v kultuře, poskytovaly velmi silný signál. Buňky kultivované po dobu 4 dnů poskytovaly mnohem slabší signál, zatímco signál pocházející z buněk kultivovaných po dobu 2 dnů mohl být pozorován pouze při prodloužené expozici filtru.

B.

Pro potvrzení exprese MDC v diferenciovaných humánních makrofázích se supernatanty kultury analyzují metodou Western blot pomocí anti-MDC monoklonálních protilátek produkovaných způsobem popsaným dále, v příkladu 18. Několik misek s lidskými makrofágy se diferencuje růstem na plastu po dobu 8 dnů za přítomnosti faktoru stimulujícího makrofágové kolonie (0,5 ng/ml, R&D Systems Minneapolis, Minnesota, USA).

Médium z diferenciovaných makrofágových buněčných kultur se odstraní a nahradí podobným médiem nebo médiem obsahujícím nízkohustotní lipoprotein (LDL, Sigma), oxidovaný LDL (oxidovaný inkubací v 5μΜ pentahydrátu síranu měďnatého způsobem popsaným v Malden et al., J. Biol. Chem. 266: 13901 (1991) nebo dexamethazon (6nM, Sigma Chemical Company). Po 3 dnech od každého ošetření se kultivační médium odstraní, jeho hodnota pH se upraví na 6,8 přídavkem chlorovodíku a médium se nechá projít přes sloupec HeparinSepharose CL-6B (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA). Sloupec se promyje 0,2M chloridem sodným v 20mM pufru Tris o pH 8 a eluuje 0,6M chloridem sodným ve 20mM pufru Tris o pH 8. Eluovaná látka se frakcionuje na 18% akrylamidovém gelu SDS-PAGE (Novex) a elektroblotuje na membránu PVDF (Millipore, Betford, MA, USA). Filtr se blokuje, promyje a · · ·· · «-· ····

C« 9 · • · ·· · nechá reagovat s monoklonálními protilátkami proti MDC za použití standardních technik (Sambrook et al., výše uvedená citace). V každém z analyzovaných kultivačních médií byl MDC protein detegován v koncentraci přibližně 0,5μg/ml, což potvrzuje, že dochází k expresi MDC v diferenciovaných humánních makrofázích.

Exprese MDC byla také analyzována v humánních epithelových buněčných liniích. Linie epithelových buněk tlustého střeva T84 (ATCC #CCL-248) byly pěstovány v médiu DMEM/F12 (Gibco, Gaithersburg, MD, USA) a buněčná linie plicních epithelových buněk A549 (ATCC #CCL-185) byla pěstována v médiu F12. Screening na přítomnost MDC mRNA v buňkách a MDC proteinu v kultivačním médiu byl proveden stejným způsobem jako v případě makrofágů, viz výše. Žádná známka exprese MDC nebyla detegovatelná v těchto buněčných liniích, at již se použilo jakékoliv metody.

Kromě toho byly vzorky buněčné linie T84 jeden den zpracovávány TNFa (5 ng/ml, PeproTech, Rocky Hill, New Jersey, USA), TGF-β (1 ng/ml, R&D Systems) nebo interferonem-gamma (200 jednotek/ml, PeproTech), vždy buď bez nebo za přidání rekombinantního MDC v koncentraci 100 ng/ml (pocházejícího z transfektantů buněk CHO, viz příklad 10). Vzorky buněčné linie A549 byly zpracovány PMA (50 ng/ml, Sigma Chemical Company) po dobu 0, 1, 3, 5 nebo 7 dnů. Žádné z těchto zpracování nemělo za následek detegovatelnou expresi MDC mRNA v buňkách T84 nebo A549 při screeningu metodou Northern blot, jak to bylo popsáno výše.

C.

Další zkoušení exprese MDC genu v makrofázích bylo provedeno zpracováním humánní buněčné linie HL60 buď 1% dimethylsulfoxidem (Sigma Chemical Company) nebo PMA (50

»· β · · * · · ♦ • * · · · « • t · • · · <· ♦ ·· ···· ng/ml, Sigma). Zpracování DMSO indukuje diferenciaci buněk HL60 na buňky granulocytového typu, zatímco PMA indukuje diferenciaci na makrofágy (Perussia et al., Blood, 58, 836 až 843 (1981)). RNA byla izolována z neošetřených buněk a z buněk zpracovaných po dobu 1 až 3 dnů buď DMSO nebo PMA, potom byla podrobena elektroforéze (10 μg/pás) a blotována. Northern blot získané RNA byl podroben zkoušení za použití próby obsahující radioizotopem značený 5' fragment pMP390 (viz příklad 3).

Po 3 dnech od zpracování PMA buňky HL60 jasně exprimují MDC mRNA, přestože úroveň exprese je zřetelně nižší než úroveň, které se dosahuje u makrofágů po 6 dnech v kultuře (viz výše). Žádná exprese nebyla pozorována po 1 dnu zpracování nebo u neošetřených buněk. Žádná detegovatelná exprese MDC také nebyla indukována zpracováním dimethylsulfoxidem po dobu 1 nebo 3 dnů.

Příklad 5

In šitu hybridizace

Jelikož byla exprese genu MDC detegována v brzlíku a slezině, byla provedena in šitu hybridizace pro lokalizaci zdroje této informace v těchto tkáních. In šitu hybridizace bylo dále také použito pro korelaci exprese MDC genu se zánětem střevní tkáně spojeným s Crohnovou chorobou.

Pro vytvoření radioizotopem značených in šitu hybridizačních prób se DNA fragment (nukleotidy 91 až 301 ze sekvence SEQ ID NO: 1) obsahující kódovací oblast MDC subklonují do vektoru pBluescript SK“. Pro zavedení ³⁵S-UTP do RNA transkriptů komplementárních ke každému řetězci genu se použije T3 a T7 RNA polymeras (BMB) podle instrukcí výrobce.

I» ···

- 35 • · «····· • · · · · · · • * · · ♦ • · 9 · · · « • · · · ··· ··· «« «

Vzorky normální lidské tkáně sleziny, brzlíku a tlustého střeva, jakož i vzorky tkáně tlustého střeva od pacientů s Crohnovou chorobou byly získány od National Disease Research Interchange (Philadelphia, PA, USA). Tkáně pocházely od těchto dárců: normální tkáň brzlíku pochází od 19-tiletého Kavkazana, který zemřel při havárii motorového vozidla, tkáň byla odebrána při pitvě; normální tkáň sleziny pochází od 51-tiletého černocha, který zemřel v důsledku mozkového krvácení, tkáň byla odebrána při pitvě; normální tkáň tlustého střeva pochází od černošky, tkáň byla odebrány při chirurgickém ošetření; tkáň tlustého střeva postiženého Crohnovou chorobou č. 1 pochází od 46-leté pacientky neznámé rasy trpící vředovou kolitidou, tkáň byla odebrána při chirurgickém zásahu; tkáň tlustého střeva postiženého Crohnovou chorobou č. 2 pochází od 18-letého pacienta neznámé rasy trpícího Crohnovou chorobou, tkáň byla odebrána při chirurgickém zásahu.

Kromě výše uvedených analýz byla také zkoušení podrobena tkáň krčních mandlí, které byly pacientovi odňaty při tonsilektomii. Při zkoušení bylo použito nekódující části MDC cDNA odpovídající nukleotidům 677 až 1042 ze SEQ ID NO: 1. Tato část byla vytvořena PCR amplifikací klonu MDC cDNA za použití primerů 390-7F (SEQ ID NO: 26) a 390-8R (SEQ ID NO: 27)

390-7F: 5’- TAT TGG ATC CGT TCT AGC TCC CTG TTC TCC 3’

390-8R: 5’- CCA AGA ATT CCT GCA GCC ACT TTC TGG GCT C 3’

Tento fragment byl klonován do vektoru pBluescript SK“ za účelem vytvoření RNA prób popsaných výše.

Vzorky tkáně popsané v předchozích odstavcích byly připraveny pro in šitu hybridizaci následujícím způsobem:

·> *··· » · ♦ ·· · • * * · · · · ♦ ’ * · . · · · ♦

Vzorek tkáně se uloží do kompozice OCT (Miles lne., Elkhart, IN, USA) a nařeže na tlouštku 6 μιη v kryostatu 2800E (Leica). Tkáňové řezy se přilepí ke klíčkům potaženým Vectabondem (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), fixují 20 minut ve 4% paraformaldehydu při 4°C, dehydratují ethanolem a denaturují při 70°C 70% formamidem a 2X SSC.

Hybridizace se provádějí tak, že se preparáty 16 hodin inkubují při 55 °C s kódujícím a nekódujícím řetězcem příslušné próby, který je označen radioizotopem, ve vodném hybridizačním roztoku obsahujícím 50% formamid, 0,3M chlorid sodný, 20mM pufr Tris o pH 7,5, 10% dextransulfát, IX Denhardtův roztok, lOOnM dithiothreitol a 5mM EDTA. Po hybridizaci se preparáty 1 hodinu inkubují při teplotě místnosti v 4X SSC a lOmM DTT. Preparáty se promyjí při teplotě místnosti 2X SSC, při 60C v IX SSC a nakonec při teplotě místnosti v 0,lX SSC. Vzorky se dehydratují v ethanolu a potom potáhnou fotografickou emulzí Kodak NTB2, 2 hodiny suší na vzduchu, 11 dnů exponují při 4°C, vyvolají a barví hematoxylinem/eosinem.

Pozorovaná hybridizace kódujícího řetězce (obou prób) ukazuje, že MDC gen je exprimován v buňkách v kortexu normálního lidského brzlíku, přičemž slabý signál je ve folikulech. Exprese MDC brzlíku může ukazovat na úlohu MDC při vývoji T-lymfocytů. Exprese v normální lidské slezině byla lokalizována v buňkách červené dřeně, zatímco v buňkách bílé dřeně byl pozorován jen slabý signál. Vysoká hladina exprese v zanícených krčních mandlích byla lokalizována v epithelové oblasti, přestože se zdálo, že zanícené buňky infiltrovaly do celého vzorku tkáně.

Vzorky tkáně tlustého střeva od pacientů s Crohnovou chorobou vykazovaly hybridizaci v buňkách epithelu, lamina propria, Payerových ložiscích a hladkém

svalstvu. Naproti tomu normální tkáň tlustého střeva nevykazovala hybridizaci vyšší, než odpovídá pozadí. Pozorovaný profil exprese MDC v tlustém střevu pacientů s Crohnovou chorobou úzce koreluje s expresí genu specifického vzhledem k makrofágům, PAF-AH (Plateled Activating Factor Acetylhydrolase) [Tjoelker et al., výše uvedená citace]. Tento výsledek spolu s daty uvedenými v příkladu 4 ukazuje, že makrofágy exprimují MDC cDNA in vivo během patogenního zánětu. Kromě toho identifikace MDC ve vzorcích tkáně tlustého střeva postiženého Crohnovou chorobou naznačuje diagnostickou relevanci hladiny MDC (například v krvi, stolici a/nebo v intestinálních lézích pacienta) pro chorobný stav nebo klinickou prognózu pacienta.

Příklad 6

Produkce rekombinantního MDC

Pro produkci rekombinantního MDC proteinu se sekvence kódující putativní maturovanou formu proteinu amplifikuje pomocí PCR a klonuje do vektoru pGEX-3X (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA). Vektor pGEX se zkonstruuje pro produkci fúzovaného proteinu obsahujícího glutathionS-transferasu (GST) kódovanou tímto vektorem a protein kódovaný fragmentem DNA se vloží do klonovacího místa vektoru.

I zde se používá standardních PCR podmínek popsaných v příkladu 2 pro amplifikaci fragmentu MDC cDNA za použití primerů 390-2R a 390-FX2 (SEQ ID NO: 11):

' TATCGGATCCTGGTTCCGCGTGGCCCCTACGGCGCCAACATCGAA 3 ' .

Primer 390-FX2 obsahuje restrikční místo BamHI následované sekvencí kódující thrombinové štěpící místo ·· ···· ·· *·· · (Chang et al., Eur. J. Biochem. 151: 217 (1985)), jež je opět následováno bázemi 92 až 115 ze sekvence SEQ ID NO: 1. Thrombinové štěpící místo má strukturu leucin-valin-prolinarginin-glycin-prolin, kde glycin a prolin představují první dva zbytky maturované formy MDC. Předpokládá se, že při působení thrombinu na tento rekombinantní fúzovaný protein dojde k rozštěpení vazby arginin-glycin v tomto fúzovaném proteinu, přičemž se z GST fúzovaného produktu uvolní maturovaný chemokin.

PCR produkt se purifikuje elektroforézou na agarosovém gelu, štěpí endonukleasou BamHI a klonuje do místa BamHI plasmidu pGEX-3X. Konstrukt pGEX-3X/MDC se transformuje do buněk E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, Kalifornie, USA) a jednotlivé transformanty se izolují a nechají růst. Plasmidová DNA z jednotlivých transformantů se purifikuje a zčásti sekvenuje za použití automatického sekvenačního zařízení a primerů GEX-5 (SEQ ID NO: 12), který hybridizuje k vektoru pGEX-3X v blízkosti klonovacího místa BamHI.

GEX-5: 5' GAAATCCAGCAAGTATATAGCA 3'

Sekvence získaná s tímto primerem potvrzuje přítomnost požadovaného insertu MDC ve správné orientaci.

Indukce fúzovaného proteinu GST MDC se provede tak, že se kultura transformovaných buněk XL-l Blue nechá růst v médiu LB (doplněném karben ici línem) při 31 °C až do optické density při vlnové délce 600 nm 0,4, načež se provede čtyřhodinová inkubace za přítomnosti 0,25 až l,0mM isopropylβ-D-thiogalaktopyranosidu (Sigma Chemical Company, St.

Louis, MO, USA).

4« 4444

4444

Tento fúzovaný protein, který je produkován v podobě nerozpustného inkluzního tělesa v bakterii, se purif iku je takto: buňky se sklidí centrifugací, promyjí 0,15M chloridem sodným, lOmM pufrem Tris o pH 8 a lmM EDTA a zpracují lysozymem (0,1 mg/ml, Sigma Chemical Company) po dobu 15 minut při teplotě místnosti. Lysát se vyčeří zpracováním ultrazvukem a rozbité buňky se peletizují lOminutovou centrifugací při 12 000 x g. Peleta obsahující fúzovaný protein se resuspenduje v 50mM Tris o pH 8 a lOmM EDTA, suspenze se převrství 50% glycerolem a 30 minut centrifuguje při 6 000 x g. Získaná peleta se resuspenduje ve standardním roztoku chloridu sodného pufrovaném fosforečnanem (PBS), který neobsahuje hořečnaté a vápenaté ionty. Fúzovaný protein, který zůstává nerozpustný, tvoří přibližně 80 až 90 % hmotnosti proteinu a migruje v denaturačních SDS-polyakrylamidových gelech při relativní molekulové hmotnosti 33 kDa. Výtěžek proteinu odhadnutý barvením barvivém Coomassie činí přibližně 100 mg/litr kultury E. coli.

Fúzovaný protein se podrobí štěpení thrombinem za účelem odštěpení GST od maturovaného MDC proteinu. Štěpící reakční směs (20 až 40 μg fúzovaného proteinu, 20 až 30 jednotek lidského thrombinu (4 000 jednotek/mg, Sigma) v 0,5 ml PBS) se 16 až 48 hodin inkubuje při teplotě místnosti a potom nanese na denaturační gel SDS-PAGE, na němž se provede frakcionace reakčních produktů. Gel se máčí v 0,4M roztoku chloridu draselného, aby se vizualizoval pás GST a MDC proteinu. GST migruje jako fragment o relativní molekulové hmotnosti asi 26 kDa a MDC protein jako fragment o relativní molekulové hmotnosti asi 7 kDa.

Totožnost 7kDa fragmentu z SDS page se potvrdí částečnou analýzou aminokyselinové sekvence. Nejprve se protein vyřízne z gelu, provede se elektroeluce ve 25mM Tris bázi a 25mM glycinu a potom se protein shromáždí na membráně • 9 9999 • 9 9999

♦ 9 99 »9 9 ♦ · * 9 9 • ·»·«·· « · 9 9 • •9 999 99 9

PVDF ve sloupci ProSpin (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornie, USA). Když se vzorek podrobí automatickému sekvenování za použití zařízení od firmy Applied Biosystems Model 473A, získá se 15 zbytků poskytujících informace o sekvenci, které přesně odpovídají očekávanému N-konci předvídané maturované formy MDC (viz SEQ ID NO: 2, aminokyselinové zbytky 1 až 15).

Příklad 7

Konstrukce bakteriálního MDC expresního vektoru

Část MDC cDNA kódující předvídaný maturovaný MDC protein se klonuje do plasmidů obsahujícího arabinosový promotor a vedoucí sekvenci pelB (viz Better et al.,

Science, 240: 1041 až 1043 (1988)).

MDC cDNA se konkrétně amplifikuje PCR způsobem popsaným v příkladu 2 za použití přibližně 0,1 gg pMP390-12, jako templátu, a syntetických oligonukleotidových primerů 390-2R a 390-Pel (SEQ ID NO: 13)

390-Pel: 5' ATTGCCATGGCCGGCCCCTACGGCGCCAACATGGAA 3’

Primer 390-Pel obsahuje restrikční místo Ncol následované dvěma cytosinovými zbytky a potom bázemi 92 až 115 ze sekvence SEQ ID NO: 1.

Očekávaný 232bp PCR produkt se purifikuje elektroforézou na agarosovém gelu, rozštěpí se Ncol a BamHI a klonuje spolu s části arabinosového operonu a vedoucí sekvencí pelB (Better et al., výše uvedená citace) do vektoru pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA, USA). Výsledný konstrukt, který je označen zkratkou P2-390, kóduje fúzi vedoucí sekvence pelB (kódované vektorem) k maturo•9 9999 •9 9999 vánému MDC proteinu. Sekvence tohoto konstruktu se potvrdí automatickým sekvenováním za použití primerů Aral (SEQ ID NO: 28) a Ara2 (SEQ ID NO: 29), které se teplotně hybridizují k vektoru v sousedství klonovacího místa.

Aral: 5’ GCG ACT CTC TAC TGT TTC TC3’ Ara2: 5’-CAC AGG AAA CAG CTA TGA CC3’

Plasmid P2-390 se transformuje do kmene E. coli MC1061 za použití standardních procedur a ampicilin resistentní klon se zvolí pro produkci MDC. Tento klon se nechá růst ve třílitrovém fermentoru (Applikon, Foster City, Kalifornie, USA) a přídavkem 50% arabinosy do konečné koncentrace 0,1% se indukuje produkce MDC. Po 1 dni inkubace za přítomnosti arabinosy se buňky sklidí. Analýza Western Blotting ukazuje, že MDC je přítomen v buňkách v koncentraci přibližně 4 μg/g buněčné pasty a je vylučován do kultivačního média při koncentraci přibližně l μg/ml.

Příklad 8

Purifikace rekombinantního MDC z bakterií a kultivačního média

Následuje experimentální protokol použitý pro purifikaci rekombinantního MDC produkovaného způsobem popsaným v příkladu 7.

Vyloučený rekombinantní MDC protein se purifikuje z média bakteriální kultury, například pomocí přizpůsobených metod, které byly popsány dříve pro purifikaci rekombinantně produkovaného chemokinů RANTES (Kuna et al., J. Immunol., ·# ···· ♦ · · · · » « ·· * ··· *·· «» ·

- 42 149: 636 až 642 (1992)), chemokinu MGSA (Horuk et al., J. Biol. Chem. 268: 541 až 546 (1993)) a chemokinu IP-10 (exprimovaného v hmyzích buňkách) (Sarris et al., J. Exp. Med. 178: 1127 až 1132 (1993)).

Příklad 9

Rekombinantní produkce MDC v kvasinkách

Následují protokoly použití pro rekombinantní expresi MDC v kvasinkách a purifikaci rekombinantního MDC.

Kódující oblast MDC cDNA se pomocí PCR amplifikuje z pMP390-12 za použití syntetických oligonukleotidů obsahujících sekvence MDC cDNA, jakožto primerů, tj. primerů 390-lF a 390-2R. DNA kódující kvasinkovou pre-pro-alfa vedoucí sekvenci se amplifikuje z kvansinkové genomové DNA PCR reakcí za použití jednoho primerů obsahujícího báze 1 až 20 genu pérovacího faktoru alfa (alpha mating factor gene) a dalšího primerů, který je komplementární k bázím 255 až 235 tohoto genu (Kurjan a Herskowitz, Cell, 30: 933 až 943 (1982)). Fragment vedoucí sekvence pre-pro-alfa a fragment sekvence kódující MDC se liguje do plasmidu obsahujícího kvasinkový alkohol dehydrogenasový promotor (ADH2) tak, že tento promotor řídí expresi fúzovaného proteinu skládajícího se z faktoru pre-prop-alfa fúzovaného k maturovanému MDC polypeptidů. Jak ukázali Rose a Broach, Meth. Enz. 185: 234 až 279, D. Goeddel ed., Academie Press lne., San Diego, Kalifornie, USA (1990), tento vektor dále obsahuje ADH2 transkripční terminátor za (vhledem ke směru exprese) klonovacím místem, kvasinkový 2-mikronový počátek replikace, kvasinkový gen leu-2d, kvasinkové geny REP1 a REP2, beta laktamasový gen z E. coli a počátek replikace z E. coli. β-laktamasový gen a gen leu-2d také zajišťují zvýšení počtu kopií plasmidu v kvasinkách pro zvýšení úrovně ·· ···· · · ·· ···.

• ♦ · ·· ·· · « · ί · · · · ··· ··· · · ·♦··»» ·· ί .ί. .ί. .»* :

- 43 exprese. Geny REP1 a REP2 kódují proteiny, které se podílejí na regulaci počtu kopií plasmidu.

Konstrukt DNA popsaný v předchozím odstavci se transformuje do kvasinkových buněk známým způsobem, například zpracováním s octanem lithným (Stearns et al., Meth. Enz., výše uvedená citace, str. 280 až 297). Promotor ADH2 je indukován vyčerpáním glukosy v růstovém médiu (Price et al., Gene, 55: 287 (1987). Sekvence pre-pro-alfa zajišťuje sekreci fúzovaného proteinu z buněk. Současně kvasinkový protein KEX2 odštěpuje sekvenci pre-pro od maturovaného chemokinů MDC (Bitter et al., Proč. Nati. Acad.

Sci. USA 81: 5330 až 5334 (1984)).

Alternativně se MDC rekombinantně exprimuje v kvasinkách za použití obchodně dostupného expresního systému, například Pichia Expression System (Invitrogen, San Diego, Kalifornie, USA) podle instrukcí výrobce. Tento systém se při řízení sekrece také spoléhá na sekvenci pre-pro-alfa, ale transkripce insertu je poháněna alkoholoxidasovým promotorem (A0X1) po indukci methanolem.

Vyloučený MDC se purifikuje z kvasinkového růstového média, například způsoby použitými pro purifikaci MDC ze supernatantů bakteriálních a savších buněk (viz příklady 8 a 10).

Příklad 10

Rekombinantní produkce MDC v savčích buňkách

MDC byl rekombinantně produkován v savčích buňkách za použití následujících postupů:

·· ···· ·· ··«»

• ·· ·· » * · • · · · · · • · · · · ··· » • · · · · • ♦·· ··· ·· ·

A. Syntéza expresního vektoru 390HXE

Zkrácená verze MDC cDNA se syntetizuje PCR způsobem popsaným v příkladu 2 za použití pMP390-12, jakožto templátu a syntetických oligonukleotidů 390RcH a 390RcX, jako primerů.

(SEQ ID NO: 14)

390RcH: 5’GACCAAGCTTGAGACATACAGGACAGAGCA (SEQ. ID NO: 15) . 390RcX: 5’TGGATCTAGAAGTTGGCACAGGCTTCTGG

Primer 390RcH obsahuje restrikční místo HindlII, které je následováno bázemi 1 až 20 ze sekvence SEQ ID NO: 1 a primer 390RcX obsahuje restrikční místo Xbal, které je následováno sekvencí, jež je komplementární k bázím 403 až 385 ze sekvence SEQ ID NO: 1.

Očekávaný 423bp PCR produkt se purifikuje elektroforézou na agarosovém gelu a klonuje do pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, Kalifornie, USA) štěpeného HindlII/Xbal, což je vektor, který umožňuje přímou expresi v savčích buňkách. Výsledný plasmid, který se označí zkratkou 390HXE, obsahuje báze 1 až 403 ze sekvence SEQ ID NO: 1. Sekvence tohoto insertu se potvrdí automatizovaným sekvenováním za použití primerů DC03 (SEQ ID NO: 16) a JHSP6

DC03: 5' CGA AAT TAA TAC GAC TCA CT 3 '

Primer DC03 se teplotně hybridizuje k sekvenci pRc/CMV vektoru v místě, které sousedí s klonovacím místem.

·· ···· • · • · · • · · ·« ♦ • · · • · · * ·#· · • · ·· «

B. Syntéza expresního vektoru 390HmX

Reakcí PCR se zhotoví další MDC cDNA konstrukt za použití pMP390-12, jakožto templátu, a primerů 390RcH a 390mycRX (SEQ ID NO: 17)

390mycRX: 5’TGGATCTAGATCAATTCAAGTCCTCCTCGCT

GATCAGCTTCTGCTCTTGGCTCAGCTTATTGAGAAT 3’

Primer 390mycRX obsahuje restrikční místo Xbal, sekvenci, jež je komplementární k sekvenci kódující epitop myc [Fowlkes et al., BioTechniques, 13: 422 až 427 (1992)] a sekvenci, jež je komplementární k bázím 298 až 278 ze sekvence SEQ ID NO: 1. Touto reakcí se amplifikuje očekávaný 354bp fragment obsahující báze 1 až 298 ze sekvence SEQ ID NO: 1, který je fúzován k epitopu myc u karboxylového konce MDC. Tohoto epitopu se může použít pro usnadnění imunoprecipitace, afinitní purifikace a detekce fúzovaného proteinu MDC-myc pomocí metody Western blotting. Získaný fragment se klonuje do pRc/CMV, a tak se získá plasmid 390HmX. Sekvence tohoto insertu se potvrdí automatizovaným sekvenováním za použití primerů DC03.

C. Exprese MDC v buňkách 293T a NSO

Pro expresi dvou konstruktů MDC cDNA, které jsou popsány výše v odstavcích A. a B., se použije dvou transfekčních protokolů: transientní transfekce do buněčné linie embryonálních lidských ledvin 293T a stabilní transfekce do myší myelomatické buněčné linie NSO (ECACC 85110503).

Transientní transfekce buněk 293T se provede za použití protokolu s precipitací fosforečnanem vápenatým,

9 9

- 46 který popsali Chen a Okayama v BioTechniques 6: 632 až 638 (1988) a Mol. Cel. Biol. 87: 2745 až 2752 (1987). Buňky a supernatanty se sklízí 4 dny po transfekci. Z 4 úplné RNA z každého buněčného lysátu se zhotoví Northern blot, který se podrobí zkoušení za použití radioizotopem značeného fragmentu MDC připraveného PCR, jako próby. Jako templátu pro značící reakci se použije PCR fragmentu předběžně připraveného amplifikaci pMP390 za použití primerů 390-1F a 390-4R (viz příklad 2). Při PCR reakci se použije přibližně 30 ng tohoto fragmentu. Réakční směs pro PCR obsahuje chlorid horečnatý (l,5mM), chlorid draselný (50mM), Tris pufr o pH 8,4 (lOmM), dATP (0,2mM), dTTP (0,2mM), dGTP (0,2mM), dCTP (ΙμΜ), a³²P-dCTP (50 μ^) (DuPont/New England Nuclear, Boston, MA, USA), Taq polymerasu (2,5 jednotky) a primery 390-1F a 390-2R (vždy 10 μg/ml). Réakční směs se denaturuje čtyřminutovým zahříváním na 94°C a potom se provede 15 amplifikačních cyklů popsaných v příkladu 2.

Próba se purifikuje průchodem přes sloupec G-25 Quick Spin (BMB). Hybridizační podmínky jsou popsány v příkladu 2. Filtry se následně promyjí 0,5X SSC a 0,2% SDS při teplotě 42°C (30 minut). Autoradiografie se provádí při -80°C za použití jednoho intenzifikačního stínítka (16 hodin). Konstrukty MDC DNA jsou v transfekovaných buňkách vysoce exprimovány, zatímco v netransfekováných buňkách je nelze detegovat.

Při stabilních transfekcích se buňky NSO nechají růst až do 80% konfluence v D-MEM (Gibco), sklidí se centrifugací a promyjí PBS. Plasmidová DNA (20 μg) se linearizuje pomocí restrikční endonukleasy Seal (BMB), která se přidá k buňkám. Inkubace se provádí na ledu po dobu 15 minut v 0,4cm štěrbinové kyvetě (BioRad, Hercules, California, USA). Elektroporace buněk se provádí dvěma pulsy o kapacitě 3 μΡ a napětí 1,5 kV. Buňky se zředí suspendováním ve 20 ml D-MEM, inkubují se při 37’C po dobu 24 hodin ·· ·444 • · · · 4 ·

- 47 v atmosféře obsahující 5 % oxidu uhličitého. Za účelem selekce se buňky při různém zředění v D-MEM s obsahem geneticinu (800 gg/ml) navzorkují na 96-jamkové plotny, jamky obsahující pouze jednu kolonii resistentní vůči léčivu se expandují v selekčním médiu. Úplná RNA se analyzuje metodou Northern Blotting, jak je to popsáno v předchozím odstavci. MDC je pozorován pouze v transfekovaných buněčných liniích.

MDC se purifikuje ze supernatantů kultur savčích buněk například za použití přizpůsobených metod purifikace rekombinantního chemokinů TCA3 (Wilson et al., J. Immunol., 145: 2745 až 2750 (1990)) nebo způsobem popsaným dále v části F.

D. Exprese MDC v buňkách CHO

Pro amplifikací bází 1 až 403 klonu MDC cDNA se použije PCR za použití primerů 390RcH a 390RcX (SEQ ID NO:

a 15), které jsou popsány výše, v části A. Vzniklý fragment se klonuje do míst HindlII a Xbal expresního vektoru pDCl, což je derivát vektoru pUC19, který obsahuje cytomegalovirový promotor (CMV) pro pohánění exprese tohoto insertu. Konkrétně lze uvést, že vektor pDCl, který je znázorněn na obr. 8, byl získán z pRc/CMV a pSV2-dhfr (ATCC vektor č. 37146). Vektor pDCl se podobá savčímu expresnímu vektoru pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, Kalifornie, USA), pouze s tím rozdílem, že pDCl nese myší dihydrofolát reduktasový (dhfr) gen, jakožto selekční markér místo neomycin fosfotransferašového genu. Transkripce cílového genu v pDCl je pod kontrolou silného CMV promotoru (viz Stenbert et al., J. Virology, 49: 190 až 199, 1984). Kromě toho je na 3’ straně cílového genu obsažena polyadenylační sekvence z genu hovězího růstového hormonu (Goodwin a Rottman, J. Biol. Chem. 267: 16330 až 16334 (1992)).

• · · 99 99 • · 9 9 9

9 9 9 9 9 9 • » · 9 9 _ 4 8 —· · ······

9· «999

9 9 • 9 9

9 9

9

9 9

Expresní kazeta dhfr (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1: 854 až 864 (1981)) umožňuje selekci na pDCl v buňkách postrádajících funkční gen dhfr.

Za použití standardních technik inkubace s chloridem vápenatým a tepelného šoku (Sambrook et al., výše uvedená citace) se bakterie XL-1 Blue (Stratagene) transformují plasmidem pDCl/MDC. Transformanty se nechají růst v médiu LB, které obsahuje karbenicilin (100 μg/ml).

Plasmidová DNA z jednotlivých transformovaných klonů se izoluje za použití systému Promega Wizzard Maxiprep (Madison, WI, USA) a jeho sekvence potvrdí automatickým sekvenováním za použití primerů 390-IF a 390-2R. Tento plasmid se linearizuje štěpením restrikční endonukleasou Pvul (Boehringer Mannheim), který sekvenci vektoru jednou rozštěpí.

Jako buněčné linie vaječníků čínského křečka (CHO) pro produkci MDC se použije linie DG-44 získané delecí genu dhfr (viz Urlaub et al., Cell 33: 405 (1983)). Pro elektroporaci se 10⁷ těchto buněk CHO promyje v PBS, resuspenduje v 1 ml PBS, suspenze se smíchá s 25 μg linearizovaného plasmidů a přenese do 0,4cm kyvety. Suspenze se podrobí elektroporaci za použití zařízení BioRad Gene Pulser (Richmond, Kalifornie, USA) při 290 V a 960 μΓ. Transfektanty se podrobí selekci růstem na a“ médiu (katalogové číslo 12000 Gibco, Geithersburg, MD, USA) s obsahem 10 % dialyzovaného fetálního hovězího séra (FBS) (Hyclone, Logan, UT, USA), které neobsahuje hypoxanthin a thymidin. Buňky z několika set transfekováných kolonií se spojí a znovu navzorkují na misky s a“ médiem s obsahem methotrexátu (20nM) (Sigma, St. Louis, M0, USA). Kolonie, které přežijí toto selekční kolo se izolují a expandují v a“ médiu s obsahem methotrexátu (20nM).

·· ····

·* * • · ··· • ··· · • · • ·· ·

E. Purifikace MDC pro sekvenaci proteinu

Transfekované klony CHO se pěstují v plastových miskách pro tkáňové kultury s a“ médiem do přibližně 90% konfluence a poté se a“ médium nahradí médiem P5, které obsahuje FBS (0,2 až 1,0 %). Médium P5 se skládá ze složek uvedených v tabulce 2. Použité médium bylo zhotoveno ze zakoupeného předmíseného prášku od firmy Hyclone, Logan, UT, USA) doplněním následujících přídavných složek:

1. hydrogenuhličitan sodný, 3 g/litr (Sigma, St. Louis, MO, USA)

2. seleničitan sodný, 2 μg/litr (Sigma)

3. 1% hydrolyzát sojových bobů (Quest International, Naarden, Nizozemsko)

4. IX roztok síranu železnatého/EDTA (Sigma)

5. roztok EX-CYTE VLE, 1,45 ml/litr (Bayer, Kankakee, IL, USA)

6. rekombinantní inzulín, 10 μg/ml (Nucellin, Eli Lilly, Indianapollis, IN, USA)

7. Pluronic F-68, 0,1 % (Sigma)

8. glycin, 30 μg/ml (Sigma)

9. ethanolamin, 50μΜ (Sigma) a

10. pyrohroznan sodný, lmM (Sigma).

·· ···♦ ·· é

Tabulka 2

Složka prášek 5 g/1

chlorid sodný	4,0
A	chlorid draselný	0,4
N	fosforečnan sodný
0	dibázický, bezvodý	0,07102
R	fosforečnan sodný
G	monobázický.H20	0,0625
A	síran hořečnatý, bezvodý	0,1
N	pentahydrát síranu
I	měďnatého	0,00000125
c	heptahydrát síranu
K	železnatého	0,000417
É	heptahydrát síranu zinečnatého	0,0004315
S	nonahydrát dusičnanu
0	železitého	0,00005
L	chlorid vápenatý,
I	bezvodý chlorid hořečnatý,	0,11661
	bezvodý	0

«· ·«· ·

L-alanin	0 0,15 0,075
	L-arginin.HCl L-arparagin.H20
A	L-aspartová kyselina	0,04
M	L-cystein.HCl.H20	0,12
I	L-glutamová kyselina	0,02
N	L-glutamin	0,5846
0	glycin	0,02
K	L-histidin.HCl.H20	0,04
Y	L-isoleucin	0,15
s	L-leucin	0,15
E	L-lysin.HCl	o,i
L	L-methionin	0,05
I	L-prolin	0,05
N	L-fenylalanin	0,05
Y	L-serin	0,075
	L-threonin	0,075
	L-tryptofan dvojsodná sůl	0,02
	L-tyrosinu.2H2O	0,075
	L-valin	0,125
	biotin	0,001
V	D-kalciumpantothenát	0,0025
I	cholinchlorid	0,015
T	kyselina listová	0,005
A	i-inositol	0,175
M	nikotinamid	0,005
I	pyridoxal.HCl	0,005
N	pyridoxin.HCl	0,005
Y	riboflavin	0,001
	thiamin.HCl	0,005
	kyanokobalamin	0,001

<· · ·· ·

- 52 - ’··· ί

	D-glukosa sodná sůl hypoxanthinu	1,0 0,005
J	thymidin	0,005
I	putrescin.2HC1	0,000081
N	pyrohroznan sodný	0,11004
É	kyselina linolová	0,0001
	DL-alfa-lipoová kyselina	0,0002
	fenolová červeň, sodná sůl	0,0086022

Po dalších 2 dnech v kultuře se alikvot každého supernatantu smíchá se stejným objemem acetonu. Vysrážené proteiny se peletizují centrifugací, frakcionUjí na 18% gelu Tris Glycine (Novex) a blotují na membránu PVDF (Millipore, Bedford, MA, USA).

MDC vázaný k membráně se deteguje pomocí monoklonální protilátky (příprava viz příklad 18). Buňky z klonu vylučujícího nejvyšší hladinu MDC proteinu (přibližně 1 μg/ml) se z misek sejmou roztokem 0,5 % trypsinu v 5,3mM EDTA (Gibco) a použije se jich pro zaočkování suspenzní kultury v a” médiu s přísadou 10 % fetálního hovězího séra (FBS). V průběhu 8 dnů se ke kultuře přidá 5 objemů média P5. Proteiny se vysrážejí v supernatantu kultury přídavkem polyethylenglykolu (o molekulové hmotnosti 8 000, výrobek firmy Union Carbide, Danbury, CT, USA) do koncentrace 200 g/litr a potom frakcionují na 18% Tris glycinovém gelu a poté elektroblotují na membránu PVDF (Millipore Bedford, MA, USA) v pufru CABS (3-[cyklohexylamino]-l-propansulfonová kyselina, pH 10,4) (Sigma, St. Louis, MO, USA). Oddělí se proužek filtračního papíru pro detekci MDC analýzou Western Blot za použití supernatantu hybridomální buněčné linie produkující anti-MDC monoklonální protilátky (viz příklad 18). Reakční pás, který migruje při relativní molekulární

• 4

44··

4 4 4 ·

4

44 4 hmotnosti 6,4 kDa se vystřihne ze zbývající části filtračního papíru.

Za použití automatického sekvenačního zařízení (Applied Biosystems Model 473A, Foster City, Kalifornie, USA) se zjistí, že sekvence u N-konce proteinu je GPYGANMEDS. Tato sekvence je identická se sekvencí prvních 10 zbytků SEQ ID NO: 2 a odpovídá N-konci předvídané maturované formy MDC.

F. Purifikace MDC pro biologická stanovení

Pro pěstování ve větších kulturách se buňky CHO exprimující MDC nechají narůst do 80% konfluence v miskách pro tkáňové kultury naplněných a“ médiem. Buňky se z misek odstraní zpracováním trypsinem a EDTA a resuspendují se při hustotě 3 x 10⁵ buněk/ml v médiu P5 doplněném 1 % FBS v rotačních baňkách při 37°C. Podle potřeby se přidává další médium P5 s 1 % FBS tak, aby se hustota buněk udržela v rozmezí od 1 x 10⁶ do 3 x 10⁶.

Po 11 dnech v kultuře se buňky z média odfiltrují. Hodnota pH kultivačního média se nastaví na 6,8 a médium se nechá projít přes sloupec heparin-Sepharose CL-6B (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA). Sloupec se nejprve promyje 0,2M roztokem chloridu sodného v pufru na bázi fosforečnanu draselného o pH 7 a potom se provede eluce lineárním gradientem od 0,2 do 0,7M roztoku chloridu sodného. Frakce se analyzují na SDS-PAGE a barvením pomocí barviva Coomasie se stanoví, která frakce obsahuje MDC. MDC se eluuje ze sloupce přibližně 0,6M roztokem chloridu sodného.

Frakce obsahující MDC se spojí a zkoncentrují ultrafiltrací v komoře s míchanou kyvetou (Amicon, Beverley,

MA, USA) za použití filtru s vylučovací mezí molekulové •9 9999

9999

hmotnosti 3 kDa. Ke koncentrovanému MDC se přidá oktylglukosid (až do konečné koncentrace lOmM) (Boehringer Mannheim Biochemicals) a výsledná směs se nechá projít sloupcem Sephacryl HR-100 (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA). Frakce se analyzují na přítomnost MDC za použití SDS page. Konečný výtěžek MDC proteinu činí přibližně 0,1 mg/litr supernatantu kultury a jeho čistota je podle barvení Coomasie vyšší než 95 %.

Příklad 11

Výroba MDC a analogů MDC peptidovou syntézou

Polypeptid MDC a jeho analogy byly připraveny chemickou syntézou peptidů za použití technologií, kterých již bylo úspěšně použito při výrobě jiných chemokinů, jako je 11-8 [Clark-Lewis et al., J. Biol. Chem., 266: 23128 až 23134 (1991)] a MCP-l. Tyto metody jsou výhodné, poněvadž jsou rychlé, spolehlivé, v případě krátkých sekvencí, jako jsou chemokiny, a umožňují selektivní zavádění nových nepřirozených aminokyselin a jiné chemické modifikace.

Tak například byly MDC a jeho analogy chemicky syntetizovány za použití optimalizovaných stupňovitých postupů v tuhé fázi (Schnolzer et al., Int. J. Pept. Protein Res. 40: 180, 1992) založenými na terč.butyloxykarbonylové (Boc) chemii podle Merrifielda (J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 až 2154, 1963) za použití syntetizátoru peptidů Applied Biosystems 430A Peptide Synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornie, USA). Proteiny byly purifikovány pomocí HPLC s reversní fází a charakterizovány standardními metodami, jako je elektrosprejová hmotnostní spektrometrie a nukleární magnetická resonance.

·· ···· • · φ φ» Φ· φ · · • · · * · φ · · • φ φ φ · φ · φ · · φ γ- Γ- Φ Φ Φ Φ · Φ φ ” DD * φφ · φφφ φφφ φ· «

Chemicky syntetizovaný MDC, který byl získán, odpovídá maturované formě rekombinantního MDC, která se skládá ze zbytků 1 až 69 ze sekvence SEQ ID NO: 2. Pro porovnání chemicky syntetizovaného MDC s rekombinantním MDC produkovaným transfektanty buněk CHO (viz příklad 10) bylo použito několika metod. Migrace na denaturovaném gelu SDS-PAGE (18% Tris glycinový gel NOVEX) chemicky syntetizovaného MDC je identická s migrací rekombinantního MDC. Kromě toho oba proteiny reagují podobně při analýze Western blot za použití monoklonálních a polyklonálních protilátek vypěstovaných proti MDC produkovanému v bakteriích (viz dále, příklad 18). Chemicky syntetizovaný MDC se také chová stejným způsobem jako rekombinantní MDC při imunoprecipitačních stanoveních za použití anti-MDC monoklonálních protilátek. Tyto studie ukazují, že denaturované a nedenaturované struktury chemicky syntetizovaného MDC se podobají strukturám rekombinantního MDC.

Chemickou cestou byly také syntetizovány následující analogy MDC

1) MDC (n+1) (SEQ ID NO: 30) skládající se ze zbytku leucinu následovaného zbytky 1 až 69 ze sekvence SEQ ID NO: 2

2) MDC (9-69) skládající se ze zbytků 9 až 69 ze sekvence

SEQ ID NO: 2

3) MDC-yl (SEQ ID NO: 31) skládající se ze zbytků 1 až 69 ze sekvence SEQ ID NO: 2 s následujícími substitucemi: zbytky 59 až 60 (Trp-Val) jsou nahrazeny sekvencí Tyr-Leu

4) MDC-eyfy (SEQ ID NO: 32) skládající se ze zbytků 1 až 69 ze sekvence SEQ ID NO: 2 s následujícími substitucemi: zbytky 28 až 31 (His-Phe-Tyr-Trp)jsou nahrazeny sekvencí Glu-Tyr-Phe-Tyr pocházející z aminokyselinové sekvence

chemokinu RANTES (zbytky 26 až 29 ze sekvence SEQ ID NO:

21)

U analogů MDC (n+1), MDC (9 až 69) a MDC-yl se očekává antagonistická účinnost vzhledem k účinnosti MDC, tj. účinnost spočívající v inhibici účinnosti MDC díky kompetitivní vazbě ke stejnému receptorů, který rozpoznává MDC. Tyto látky mohou alternativně vyvolávat inhibici díky tvorbě heterodimerů s nativním MDC. Z možných účinnosti analogu MDC-eyfy je možno uvést inhibici MDC popsanou u dřívějších analogů. Na rozdíl od nich se však může MDC-eyfy chovat podobně jako nativní MDC. Jiné účinnosti tohoto analogu mohou zahrnovat funkce, které jsou typické pro chemokin RANTES, jako je chemotaxe T-lymfocytů, monocytů nebo eosinofilů.

Kromě toho spadají do rozsahu vynálezu také následující specifické alterace jednotlivých aminokyselin (samotné nebo v kombinaci):

1) nahrazení bázické aminokyseliny, argininu v poloze 24 a/nebo lysinu v poloze 27 v sekvenci SEQ ID NO: 2 nebázickými aminokyselinami;

2) nahrazení tyrosinového zbytku v poloze 30 sekvence SEQ ID NO: 2, tryptofanového zbytku v poloze 59 sekvence SEQ ID NO: 2 a/nebo valinového zbytku v poloze 60 sekvence SEQ ID NO: 2 zbytkem nabité nebo polární aminokyseliny (například šeřinu, lysinu, argininu, histidinu, aspartátu, glutamátu, asparaginu, glutaminu nebo cysteinu); a

3) nahrazení zbytku glutamové kyseliny v poloze sekvence SEQ ID NO: 2 zbytkem bázické nebo malé nenabité •9 ···· • · ··· · aminokyseliny (například lysinu, argininu, histidinu, glycinu nebo alaninu).

Specifické analogy vykazující tyto alterace aminokyselin spadají do rozsahu následujícího vzorce (SEQ ID NO: 25)

Met

Ala

Arg

Leu

Gin

Thr

Ala

Leu

Leu Val

Val

Leu Val Leu

Leu

Ala

-24

-20

-15

-10

Val

Ala

Leu

Gin

Ala

Thr

Glu

Ala

Gly Pro

Tyr

Gly Ala Asn

Met

Glu

-5

1

5

Asp

Ser

Val

Cys

Cys

Arg

Asp

Tyr

Val Arg

Tyr

Arg Leu Pro

Leu

Xaa

10

15

20

Val

Val

Xaa

His

Phe

Xaa

Trp

Thr

Ser Asp

Ser

Cys Pro Arg

Pro

Gly

25

30

35

40

Val

Val

Leu

Leu

Thr

Phe

Arg

Asp

Lys Xaa

Ile

Cys Ala Asp

Pro

Arg

45

50

55

Val

Pro

Xaa

Xaa

Lys

Met

Ile

Leu

Asn Lys

Leu

Ser Gin

65 kde aminokyselina v poloze 24 je zvolena ze souboru zahrnujícího arginin, glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, serin, threonin, fenylalanin, tyrosin, tryptofan, aspartát, glutamát, asparagin, glutamin, cystein a methionin; kde aminokyselina v poloze 27 je nezávisle zvolena ze souboru zahrnujícího lysin, glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, serin, threonin, fenylalanin, tyrosin, tryptofan, aspartát, glutamát, asparagin, glutamin, cystein a methionin; kde aminokyselina v poloze 30 je nezávisle zvolena ze souboru zahrnujícího tyrosin, serin, lysin, arginin, histidin, aspartát, glutamát, asparagin, glutamin a cystein; kde aminokyselina v poloze 50 je nezávisle zvolena ze souboru zahrnujícího glutamovou kyselinu, lysin, arginin, histidin, glycin a alanin; kde aminokyselina v poloze 59 je nezávisle zvolena

- 58 ze souboru zahrnujícího tryptofan, serin, lysin, arginin, histidin, aspartát, glutamát, asparagin, glutamin a cystein; a kde aminokyselina v poloze 60 je nezávisle zvolena ze souboru zahrnujícího valin, serin, lysin, arginin, histidin, aspartát, glutamát, asparagin, glutamin a cystein. U těchto analogů polypeptidů MDC se specificky očekává modulace vazebných vlastností MDC k chemokinovým receptorům a/nebo jiným molekulám (například heparinu, glykosaminoglykanům, receptorům erythrocytového chemokinu), které jsou považovány za důležité při prezentaci MDC k jeho receptoru.

Rekombinantních technik, jako jsou techniky popsané v předchozích příkladech, se také může použít pro přípravu analogů polypeptidů MDC. Při tom se polynukleotidy kódující MDC modifikují tak, aby kódovaly polypeptidové analogy, které jsou předmětem zájmu, za použití dobře známých technik, jako je místně orientovaná mutagenese a řetězová reakce iniciovaná polymerasou (obecný přehled viz Sambrook et al., výše uvedená citace, kapitola 15). Tyto modifikované polynukleotidy se exprimují rekombinantní cestou a rekombinantní analogy polypeptidů MDC se purifikují způsobem popsaným v předchozích příkladech.

Vlastnosti MDC a analogů polypeptidů MDC, jakožto chemoatraktantu a/nebo vlastnosti při aktivaci jednoho nebo více typů buněk, které se podílejí na zánětlivých procesech (například T-lymfocytů, monocytů, makrofágů, basofilů, eosinofilů, neutrofilů, žírných buněk, endotheliálních buněk, epitheliálních buněk, fibroblastů aj.) se zkoušejí způsoby dobře známými v tomto oboru, kterých bylo použito u řady jiných chemokinů. Účinnost nativního polypeptidů MDC, rekombinantního polypeptidů MDC nebo rekombinantních analogů polypeptidů MDC, jakož i syntetického polypeptidů MDC a syntetických analogů polypeptidů MDC, které byly purifikovány a izolovány způsobem popsaným v jednom nebo ·· ···· • · · ♦ « >

··· ♦ • · « · A ·* #··· * ♦ · * * · « • · » · • · · ·• » · « ·» · «·· ·

- 59 více předchozích příkladů, se stanovuje způsobem popsaným v následujících příkladech, v nichž se pro ilustraci používá polypeptidu MDC.

Příklad 12

Zkoušení účinků MDC na basofily, žírné buňky a eosinofily

Zkoušení účinků MDC na basofily, žírné buňky a eosinofily se provádí například způsoby popsanými v publikaci Weber et al., J. Immunol. 154: 4166 až 4172 (1995) pro stanovení účinnosti MCP-1/2/3. Při těchto způsobech se měří změny volného cytosolického vápníku a uvolňování proinflamatorních mediátorů (jako je histamin a leukotrien). Blokování aktivace těchto buněk zprostředkované chemokinem vykazuje implikace při léčeních alergických reakcí v pozdní fázi, při nichž má významnou úlohu sekrece pro-inflamatorních mediátorů (Weber et al., výše uvedená citace).

Příklad 13

Zkoušení účinností MDC, jako chemoatraktantu a účinností na aktivace buněk, kterými jsou lidské monocyty/makrofágy a lidské neutrofily

Účinky MDC na lidské monocyty/makrofágy nebo lidské neutrofily se hodnotí například způsoby popsanými v publikaci Devi et al., J. Immunol., 153: 5376 až 5383 (1995) pro hodnocení aktivace neutrofilů a makrofágů indukované myším TCA3. Indexy aktivace měřené při těchto studiích zahrnují zvýšenou adhezi k fibrinogenu, k níž dochází díky aktivaci integrinů, chemotaxi, indukci reaktivních dusíkových meziproduktů, respirační ruptury (produkce superoxidu a peroxidu vodíku) a exocytóze lysozymu a elastasy za přítomnosti cytochalasinu B. Jak uvádějí Devi et

•9 9999

9 9 • 9 99 9

9 9 * - 9 «· 9 al., jsou tyto účinnosti korelovány s několika stádii odpovědi leukocytů na zánět. Tato odpovědí leukocytů (přehled viz: Springer, Cell. 76: 301 až 314 (1994)) zahrnuje adherenci leukocytů k endotheliálním buňkám cév, migraci přes endotheliální vrstvu, chemotaxi směrem ke zdroji chemokinů a místně specifické uvolňování mediátorů zánětu. Podíl MDC na kterémkoliv z těchto stádií poskytuje důležitý cíl pro klinickou intervenci zaměřenou na modulaci zánětlivé odpovědi.

Při jednom stanovení chemotaxe, které je známo v tomto oboru, modifikovaném stanovení s Boydenovýrai komorami (Boyden chamber assay), se leukocyty, které mají být zkoušeny fluorescentně označí kalceinem 20minutovou inkubací s touto látkou při teplotě místnosti. Označené buňky se dvakrát promyjí séraprostým médiem RPMI, resuspendují v RPMI s obsahem BSA (2 mg/ml) a potom kvantitativně přidají do horních jamek komor, které jsou odděleny od spodních jamek polykarbonátovým filtrem (Neuroprobe lne., Cabin John, MD, USA). MDC, který je zředěn stejným médiem jako leukocyty, se v různé koncentraci přidá do spodních jamek. Komory se inkubují 2 hodiny při 37°C. Na konci této zkoušky se buňky, které nemigrovaly membránou, odstraní opláchnutím filtru pomocí PBS a seškrábnutím gumovým stíračím nožem. Buňky, které migrovaly přes filtr, se kvantifikují změřením fluorescence v jednotlivých jamkách pomocí deskového měřiče fluorescence (Fluorescent Plate Reader, Cytofluor, Millipore lne., Boston, MA, USA).

Také se provede série experimentů pro stanovení chemotaktických vlastností MDC. Při těchto experimentech se používá o sobě známých postupů. Nejprve se stanoví odpověď lidských jednojaderných buněk na MDC. Také se stanoví účinek MDC na chemotaktickou odpověď polymorfonukleárních leukocytů (granulocytů).

999·

• 9 • 99 9

9 «

9

9 ♦

»«· *

Zjistilo se, že MCP-1, který je C-C chemokinem vyvolává jak verbování, tak aktivaci monocytů, ale zdá se, že má omezenou schopnost indukovat migraci makrofágů. Neschopnost MCP-1 přitahovat makrofágy zřejmě koreluje s procesem diferenciace: při diferenciaci monocytových buněk dochází k postupnému snižování odpovědi buněk na MCP-1 (Denholm a Stankus, Cytokine, 7: 436 až 440 (1995)). Zdá se, že biologické účinnosti MCP-1 korelují s expresí tohoto chemokiny s ohledem na to, že se v monocytech vyskytuje MCP-1 mRNA, ale její množství v těchto buňkách během diferenciace buněk klesá.

Profil exprese MDC se zdá být obrácený ve srovnání s popsaným profilem exprese MCP-1? množství mRNA pro MDC totiž stoupá při diferenciaci monocytů na makrofágy. Za účelem zjištění, zda tento profil exprese koreluje s biologickou odpovědí na MDC, byly porovnávány s účinky MDC na migraci monocytů a makrofágů.

Při zkouškách chemotaxe a inhibice chemotaxe byla analyzována řada typů různých leukocytových buněk: lidské jednojaderné a polymorfonukleární leukocyty se izolují z periferní krve za použití způsobů známých v tomto oboru (Denholm et al., Amer. J. Pathol. 135: 571 až 580 (1989)). Dále se použije buněčná linie lidských monocytů, THP-1 (získaná ze sbírky ATCC, Rockville, MD, USA a uchovávaná v kultuře v RPMI s 10% FBS a s přísadou penicilinu a streptomycinu). Buňky THP-1 se mohou kultitovat jako monocyty nebo se u nichž může indukovat diferenciace na makrofágy působením forbolmyristátacetátu (PMA) (Denholm a Stankus, Cytokine, 7: 436 až 440 (1995)). V některých pokusech se použije monocytických buněk THP-1 a v jiných se použije monocytických buněk THP-1, u nichž byla indukována diferenciace na makrofágy působením forbolmyristátacetátu (PMA). Dále se připraví peritoneální makrofágy morčete

9999

9 9 •99 •9 9999 » 9 »91 99 9 9

9

9 9 způsobem popsaným v Yoshimura, J. Immunol. 150: 5025 až 5032 (1993). V krátkosti lze tuto přípravu popsat takto: 2 dny před odběrem buněk se zvířatům intraperitoneální injekcí podá 3% sterilní thioglykolát (Difco). Makrofágy se získají z peritoneální dutiny vypláchnutím roztokem chloridu sodného pufrovaným fosforečnanem (PBS) s obsahem EDTA (lmM) a glukosy (0,1%). Buňky se jednou promyjí na odstředivce a potom se jich použije při zkouškách chemotaxe způsobem popsaným dále.

Zkoušky chemotaktické účinnosti se provádějí za použití buněčných přípravků připravených výše popsaným způsobem. Vlastní zkoušení se provádí způsobem popsaným v Denholm a Stankus, Cytometry 19: 366 až 369 (1995) za použití 96-jamkových komor (Neuroprobe lne., Cabin John, MD, USA). Buňky se označí fluorescentním barvivém, kalceinem (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Polykarbonátové filtry použité při tomto stanovení neobsahují PVP (Neuroprobe lne.). Pro různé typy buněk se použije filtrů s následující velikostí pórů: monocyty a buňky THP-1 - 5 μπι; polymorfonukleární leukocyty - 3 μη; makrofágy morčete - 8 μπι.

Buňky označené kalceinem (50 000 buněk) se resuspendují v médiu RPMI s obsahem BSA (5 mg/ml) a umístí do horních jamek. MDC nebo jiné zkoušené látky se zředí RPMI s obsahem BSA (konečná koncentrace MDC je například 25, 50, 100, 250 ng/ml) a umístí do spodních jamek. Po dvouhodinové inkubaci při 37'C se buňky, které nemigrovaly filtrem a zůstaly na jeho horní straně, odstraní setřením a filtr se usuší na vzduchu. Pro kontrolu se při těchto stanoveních použije RPMI s BSA (negativní kontrola) a MCP-1 o koncentraci 50 ng/ml, jakož i séra aktivovaného 1 % zymosanu (Saz, příprava viz Denholm a Lewis, Amer. J. Pathol. 126:

464 až 474 (1987)) (pozitivní kontroly). Migrace buněk se kvantitativně vyhodnotí v zařízení Fluorescent Plate Reader,

4444 •4 4444 · 4 • 44

4 4

4 4

4

4 4

444

4

4

4

44 4

Cytofluor, Millipore lne., Boston, MA, USA. Počet buněk, které migrovaly, se vyjádří v jednotkách fluorescence.

Při zkouškách inhibiční účinnosti se buňky v horních jamkách komor suspendují v MDC při různé koncentraci (0,005, 0,05, 0,5, 5,0 a 50 ng/ml). Spodní jamky komor se naplní buď samotným médiem nebo chemotaktickými faktory, tj. MCP-1 nebo sérem aktivovaným zymosanem (Zas). Inhibice se zjišťuje porovnáním počtu buněk, které migrovaly do MCP-1 nebo Zas za nepřítomnosti MDC s počtem buněk, které migrovaly při zvyšujících se koncentracích MDC. Příprava buněk a kvantitativní vyjádření výsledků se provádějí přesně tak, jak to bylo popsáno výše v souvislosti se zkouškami chemotaxe. Počet buněk, které migrovaly, se vyjádří v jednotkách fluorescence.

Jak ukazuje obr. 2, MDC neindukuje migraci jednojaderných buněk pocházejících z THP-1, nýbrž spíše takovou migraci inhibuje v koncentraci v rozmezí od 10 do 100 ng/ml. Jiné C-C chemokiny, jako je MCP-l a RANTES, v tomto koncentračním rozmezí obvykle indukují maximální chemotaxi monocytů.

Jak ukazuje obr. 3, MDC nemá v koncentraci rozmezí od 0,001 do 100 ng/ml žádný výsledný účinek na migraci granulocytů. Pokud se týče nepřítomnosti účinku na chemotaxi granulocytů, je MDC podobný jiným dříve popsaným C-C chemokinům.

Odpověď makrofágů a monocytových buněk THP-1 na MDC je znázorněna na obr. 4. Makrofágy (plné kroužky) migrují k MDC v rozsahu závislém na dávce, přičemž optimální aktivity se dosahuje při koncentraci 50 ng/ml. Pokles chemotaktické odpovědi makrofágů na MDC při vyšších koncentracích (100 ng/ml) odráží desensitizaci buněk, která je typická pro

- 64 ♦ · · · • · f • · · * ♦ · · ·· · · • · · ···· ·♦ · ♦ · • · · ♦ • · ··· · • ♦ · ··· ·· · většinu chemotaktických faktorů při vyšších koncentracích (Falk a Leonard, Infect. Immunol. 32: 464 až 468 (1981)). Monocytické buňky THP-1 (prázdné kroužky) však k MDC nemigruj í.

Chemotaktická účinnost MDC na makrofágy se dále ověří v experimentech při kterých se používá izolovaných peritoneálních makrofágů morčete. MDC indukuje migraci makrofágů morčete, v rozsahu závislém na dávce (viz obr. 5) v koncentraci v rozmezí od 100 do 500 ng/ral. Koncentrace, které ze zapotřebí pro indukci migrace makrofágů morčete, je přibližně desetinásobkem koncentrace potřebné v případě lidských buněk (viz obr. 4). Podobné koncentrační rozdíly v maximální biologické účinnosti lidských chemokinů u jiných druhů byly oznámeny i u MCP-1 (viz Yoshimura, J. Immunol. 150: 5025 až 5032 (1993)).

Výsledky těchto experimentů ukazují, že biologické účinnosti MDC jsou spojeny s diferenciací monocytů na makrofágy. Naproti tomu, MCP-1 (Yoshimura , J. Immunol. 150:

5025 až 5032 (1993)) indukuje chemotaxi makrofágů, ale nikoliv monocytů.

Schopnost MDC přitahovat makrofágy ukazuje, že tento chemokin by mohl vyvolávat indukci fokální akumulace tkáňových makrofágů. Akumulace tkáňových makrofágů ve specifických oblastech je důležitá při tvorbě granulomů, při níž plicní makrofágy obklopují a uzavírají cizí částice nebo relativně nerozložitelné bakteriální patogeny, jako je Mycobacterium sp. (Adams, Am. J. Pathol., 84: 164 až 191 (1976)).

Při některých chorobách, jako je arthritis, je akumulace makrofágů považována za škodlivou a destruktivní. Schopnost MDC zvyšovat chemotaxi makrofágů ukazuje na ·· ···· ·· ···· terapeutickou použitelnost inhibitorů MDC podle tohoto vynálezu pro prevenci, snížení nebo eliminaci akumulace makrofágů v tkáních.

Výsledky zkoušení chemotaxe za použití jednojaderných lidských buněk, které jsou shrnuty na obr. 2, naznačují, že by MDC mohl inhibovat migraci buněk. Za nepřítomnosti MDC migrují monocytové buňky THP-1 k MCP-1 (viz obr. 6; koncentrace MDC 0 ng/ml). Když jsou však buňky vystaveny působení MDC, chemotaktická odpověď na MCP-1 (plné kroužky) se sníží. MDC v koncentraci v rozmezí od 0,005 do 0,5 ng/ml inhibuje chemotaktickou odpověď monocytů na MCP-1. Přestože MDC inhibuje chemotaktickou odpověď monocytů na MCP-1, neexistuje žádný významný účinek MDC na chemokinesi nebo náhodnou migraci, jak to ukazují počty buněk, které migrovaly do samotného média (prázdné kroužky; RPMI s BSA) buď za přítomnosti, nebo za nepřítomnosti MDC.

Inhibiční účinnost MDC na chemotaxi monocytů ukazuje na terapeutickou užitečnost MDC při léčení několika chronických zánětlivých stavů, jako je atherosklerosa, arthritis a pulmonární fibrosa, při nichž chemotaxe monocytů zřejmě hraje důležitou patogenní úlohu. Zvýšení účinnosti MDC při takových chorobách by mohlo mít za následek sníženou migraci monocytů do tkání, a tedy zeslabení prudkosti symptomů choroby.

Příklad 14

Zkouška inhibice růstu nádoru in vivo za použití MDC

Inhibiční vlastnosti MDC na růst národu se zkoušejí například za použití modifikovaného protokolu, který popsali

Laning et al., J. Immunol. 153: 4625 až 4635 (1994) pro stanovení inhibičních vlatností myšího TCA3 na růst nádorů.

··· «

cDNA kódující MDC se transfekuje elektroporací do myelomární buněčné linie J558 (sbírka American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA). Transfektanty se podrobí screeningu na produkci MDC za použití standardních technik, jako je ELISA (Enzyme-Linked Immunoadsorbent Assay) za použití monoklonální protilátky vyvinuté proti MDC, jak je to popsáno v příkladu 18. Bolus 10⁶ buněk klonu produkujícího MDC se subkutánní injekcí podá do spodního pravého kvadrantu myší BALB/C. Pro srovnání se kontrolním myším injekčně podá 10⁶ netransfekovaných buněk. Pro porovnání účinnosti MDC při inhibici růstu nádoru se měří rychlost a četnost tvorby nádorů u těchto dvou skupin zvířat. Povaha buněčného infiltrátu, která je spojena s nádorovými buňkami se indentifikuje histologicky. Kromě toho se rekombinantní MDC (20 ng) smísí s netransfekovanými buňkami J558 a vzniklý přípravek se v dávce 20 ng/den injekčně podává do nádorů pocházejících z těchto buněk pro stanovení účinku MDC exogenně podaného do nádorových buněk.

Příklad 15

Intraperitoneální injekční stanovení

Buňky, které odpovídají na MDC in vivo se stanoví tak, že se 1 až 1000 ng purifikovaného MDC injekčně podá do intraperitoneální dutiny myši nebo jiného savce (například králíka nebo morčete) způsobem popsaným v Luo et al., J. Immunol. 153: 4616 až 4624 (1994). Po injekci se z periferní krve a z peritoneální dutiny izolují leukocyty, které se identifikují barvením pomocí soupravy Diff Quick Kit (Baxter, McGraw, IL, USA). V různé době se měří profil leukocytů za účelem stanovení kinetiky výskytu různých typů buněk. Při separátních pokusech se spolu s MDC injekčně podávají neutralizační protilátky zaměřené proti MDC • *· φ «· φφφφ (příklad 18) pro potvrzení, že k infiltraci leukocytů došlo díky aktivitě MDC.

Příklad 16

In vivo zkoušení aktivity - subkutánní injekce

Vlastnosti MDC jako chemoatraktantu se zkoušejí in vivo za použití přizpůsobeného protokolu popsaného v publikaci Meurer et al., J. Exp. Med. 178: 1913 až 1921 (1993). Rekombinantní MDC (10 až 500 pmol/místo) se injekčně intradermálně podává vhodnému savci, například psu nebo králíku. Infiltrace buněk v místě injekce se histologickými metodami stanovuje po 4 a 24 hodinách. Přítomnost MDC se potvrdí imunocytochemií za použití protilátek zaměřených proti MDC. Povaha buněčného infiltrátu se identifikuje barvením pomocí soupravy Baxter's Diff Quick Kit.

Příklad 17

Zkouška myelosupresivní účinnosti

Myelosupresivní účinnost MDC se zkouší tak, že se myším nebo jiným savcům (například králíkům nebo morčatům) injekčně podá MDC, například způsobem popsaným v Maze et al., J. Immunol., 149: 1004 až 1009 (1992), za účelem stanovení myelosupresivního účinku ΜΙΡ-Ια. Myším C3H/HeJ (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA) se intravenosní injekcí v jediné dávce podá 0,2 až 10 μg rekombinantního MDC. Myelosupresivní účinek chemokinu se stanoví změřením rychlosti cyklování myeloidních progenitorových buněk ve femorální kosti a slezině. Potlačení růstu a dělení progenitorových buněk má klinické implikace pro léčení pacientů, na něž je aplikována chemoterapie nebo ozařování. Myeloprotektivní účinek takového léčení chemokinem byl demonstro·· ···· · · ·· ···· • ♦ · · · * · ·· · • · · · · ·«· • · · « · ··»··* • · · · · · · ·· · ··· ··· ·· ·

- 68 ván na předklinických modelech (viz publikace Dunlop et al., Blood 79: 2221 (1992)).

Pro měření účinku MDC na myelosupresi bylo také použito in vitro stanovení, které bylo prováděno způsobem popsaným dříve v souvislosti s deriváty chemokinů, interleukinem-8 (11-8) a faktorem krevních destiček 4 (PF-4) (viz Daly et al., J. Biol. Chem., 270: 23282 (1995)). Použitou zkoušku lze v krátkosti popsat takto: Normální lidské buňky kostní dřeně o nízké hustotě (hustota menší než 1,077 g/cm) se navzorkují na 0,3% agarové kultivační médium s 10% fetálního hovězího séra (HyClone, Logan, UT, USA), rekombinantním humánním GM-CSF (100 jednotek/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) a rekombinantním lidským Steelovým faktorem (50 ng/ml) (Immunex Corp., Seattle, WA, USA) za nepřítomnosti (kontrolní pokus) nebo za přítomnosti MDC pro stanovení prekursorů granulocytů-makrofágů. Pro stanovení jednotek vytvářejících kolonie granulocytů erythroid myeloid megakaryocytů (granulocyte erythroid myeloid megakaryocyte colony forming units - CFU-GEMM) a jednotek vytvářejících erythroidní rupturu (erythroid burst forming unit - BFU-E) se buňky pěstují v 0,9% methylcelulosovém kultivačním médiu za přítomnosti rekombinantního lidského erythropoietinu (1 až 2 jednotky/ml) v kombinaci 50 ng/ml Steelova faktoru. Počet kolonií v miskách se zjištuje po inkubaci při 37C v atmosféře se sníženým obsahem kyslíku (5 %) po dobu 14 dnů. Kombinace GM-CSF a Steelova faktoru nebo erythropoietinu a Steelova faktoru umožňuje detekci velkých kolonií (obvykle obsahujících více než 1000 buněk v jedné kolonii), které pocházejí z časných méně zralých podmnožin CFU-GM, CFU-GEMM a BFU-E.

9999 ···· • 9 9 9 · 9 9 ··« · • 99 9 9 · ♦

9 999 999 99 9

- 69 Příklad 18

Protilátky proti lidskému MDC

A. Monoklonální protilátky

Pro získání monoklonálních protilátek bylo použito následujícícho potupu: Rekombinantní MDC získaný rozštěpením fúzovaného proteinu GST-MDC způsobem popsaným v příkladu 6 se použije pro imunizaci myši. Kromě toho se jiná myš imunizuje chemicky syntetizovaným peptidem odpovídajícím N-konci maturované formy MDC (zbytky 1 až 12 ze sekvence SEQ ID NO: 2). Tento peptid se syntetizuje v syntetizátoru peptidů Applied Biosystems Model 4 73A (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornie, USA) a konjuguje k hemocyaninu Keyhole Lympet Hemocyanine (Pierce) podle doporučení výrobce. Pro úvodní ošetření se použije subkutánní injekce přibližně 10 μg proteinu MDC nebo konjugovaného peptidů v podobě emulze ve Freundově úplném adjuvans. Další alikvoty proteinu MDC se emulgují ve Freundovém neúplném adjuvans v intervalech 2 až 3 týdnů a také se injekčně podají. Před podáním závěřečné prefusní posilovači dávky (prefusion boost) se očkovaným myším odebere vzorek séra. Sérum se zkouší analýzou Western blot, aby se v něm potvrdila aktivita s proteinem MDC. Jako prefusní posilovači dávka se myši injekčně podá MDC v PBS a 4 dny poté se myš usmrtí a vyjme se jí slezina. Slezina se umístí do 10 ml séraprostého média RPMI 1640 a rozmělnění mezi dvěma mikroskopickými sklíčky z ledovaného skla ponořenými v séruprostém médiu RPMI1640 (Gibco, Kanada) doplněném L-glutaminem (2mM), pyrohroznanem sodným (lmM), penicilinem (100 jednotek/ral), streptomycinem (100 μg/ml) na suspenzi jednotlivých buněk. Vzniklá suspenze buněk se přefiltruje přes sterilní buněčné síto Nitex (70 mesh, velikost oka 212 μπι) (Becton, Dickinson, Parsipanny, New Jersey, USA), 2 x promyje při 5 minutovém odstřelování (200 ·· ···· ·· ···» x g) po dobu 5 minut a vzniklá peleta se resuspenduje v 10 ml séraprostého RPMI. Thymocyty odebrané třem naivním myším Balb/c se připraví stejným způsobem a použije se jich jako vrstvy Feeder Layer. Myelomární buňky NS-1 udržované v logaritmické fázi v médiu RPMI s 10% fetálního hovězího séra (FBS) (HyClone Laboratories Inc., Logan, Utah, USA) po dobu 3 dnů před fúzí se 5 minut odstřeďují při 200 x g a vzniklá peleta se 2 x promyje způsobem popsaným v předchozím odstavci.

Slezinné buňky (2 x 10⁸) se smísí s 4 x 10⁷ buněk NS-1 a odstředí, přičemž supernatant se odsaje. Buněčná peleta se rozdruží poklepem na zkumavku a k buňkám se v průběhu 1 minuty za míchání přidají 2 ml polyethylenglykolu PEG 1500 (50% roztok v 75mM HEPES o pH 8,0, teplota 37°C (Boehringer Mannheim). Poté se během 7 minut přidá 14 ml séraprostého RPMI. Potom se přidá dalších 16 ml RPMI a buňky se 10 minut odstřeďují při 200 x g. Supernatant se zahodí a peleta se resuspenduje ve 200 ml RPMI s obsahem FBS (15%), hypoxanthinu sodného (ΙΟΟμΜ), aminopterinu (0,4μΜ), thymidinu (HAT, Gibco) (16μΜ), 11-6 (Boehringer Mannheim) (25 jednotek/ml) a thymocytů (1,5 x 10⁶ ml^-1). Suspenze se navzorkuje na 10 96-tijamkových ploten s plochým dnem pro tkáňové kultury (Corning, Corning, New York, USA).

V den 2, 4 a 6 po fúzi se z každé jamky z misek, v nichž probíhá fúze, odebere 100 μΐ média a odebrané médium se nahradí čerstvým médiem. V den 8 se fúze zkouší screeningem metodou ELISA. Při tomto stanovení se zjišťuje přítomnost myšího IgG navázaného na MDC následujícím způsobem: misky Immulon 4 (Dynatech, Cambridge, MA, USA) se během dvou hodin při 37°C potáhnou MDC (25mM roztok v pufru Tris o pH 7,5) v množství 100 ng/jamka. Potahovací roztok se odtáhne a do každé jamky se přidá 200 μΐ blokovacího roztoku (0,5% želatina z rybí kůže (Sigma) v médiu CMF-PBS) a jamky • · ···· • · ··· ·

- 71 se inkubují 30 minut při 37°C. Potom se blokovací roztok odsaje a přidá se 50μ1 supernatantu kultury. Po 30minutové inkubaci při 37“C a trojnásobném promytí PBS s obsahem Tween 20 (0,05%, PBST) se přidá 50 μΐ konjugátu křenové peroxidasy s kozím protimyším IgG(fc) (Jackson, ImmunoResearch, West Grove, Pensylvánie, USA) zředěným pomocí PBST v poměru l : 7000. Misky se inkubují výše popsaným způsobem, 4 x promyjí PBST a potom se k nim přidá 100 μΐ substrátu skládajícího se z o-fenylendiaminu (Sigma) (1 mg/ml) a peroxidu vodíku (30% peroxid vodíku v lOOmM citrátovém pufru o pH 4,5) (0,1 μΐ/ml). Barevná reakce se zastaví po 5 minutách přídavkem 50 μΐ 15% kyseliny sírové. V čtecím zařízení pro misky (Dynatech) se zjistí hodnota Α₄₉θ.

U zvolených jamek, v nichž proběhla fúze se provede dvojí klonování, při němž se provede zředění do 96-jamkových ploten, načež se po 5 dnech zjišťuje počet kolonií v jamkách. Monoklonální protilátky produkované hybridomy se isotypují za použití systému Isostrip (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA).

Anti-MDC protilátky se dále charakterizují blotováním (Western blot) proti rekombinantnímu MDC produkovanému výše popsaným způsobem v E. coli nebo savčích buňkách CHO. Pro přípravu blotu se přibližně 3 μΐ sedimentovaných buněk (transformované buňky E. coli produkující MDC; transfekované buňky CHO produkující MDC; netransformované buňky E. coli (kontrolní pokus) a netrasfekované buňky CHO (kontrolní pokus)) rozdělí ve standardním preparačním vzorkovém pufru obsahujícím SDS (dodecylsulfát sodný) a DTT (dithiothreitol) (Sambrook et al., výše uvedená citace). Po povaření se lysáty frakcionují denaturací na SDS-PAGE (18% akrylamidový Tris glycinový gel NOVEX) a elektroblotuji na PVDF membrány (Millipore, Bedford, MA, USA). MDC monoklonální protilátky se zředí na koncentraci ·· ···· « · · · · ·· · φ * • · · · · · · · ··· · · ······ • · · « ' · · · ·· « «·· ··· *· ·

- 72 0,7 μυ/ml v PBS pro použití při blotování Western. Při tom se použije standardních technik (viz výše uvedená citace Sambrook et al.). Dále se provede přídavná kontrola spočívající ve zkoušení monoklonálních protilátek na křížovou reaktivitu s bloty Western úplných tkáňových lysátů z lidské kůže, krčních mandlí a brzlíku.

Jedna z anti-MDC monoklonálních protilátek, která byla označena jako monoklonální protilátka 191D reaguje silně s rekombinantním MDC produkovaným jak v bakteriích, tak v savčích buňkách. Tato protilátka kromě toho vykazuje velmi malou reaktivitu pozadí proti bakterii, buněčné linii savčích buněk CHO nebo zkoušené úplné lidské tkáni. Tato protilátka dále také vykazuje schopnost imunoprecipitace rekombinantního MDC pocházejícícho z buněk CHO, když se použije standardních imunoprecipitačních protokolů (Sambrook et al., výše uvedená citace).

Hybridomální buněčná linie produkující monoklonální protilátku 191D (označená názvem hybridom 191D) byla uložena ve sbírce American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA) za podmínek Budapešťské dohody (datum uložení: 4. června 1996; přírůstkové číslo sbírky ATCC: HB-12122). Dostupnost uloženého materiálu nelze považovat za licenci k provádění tohoto vynálezu, jež by bylo považováno za porušení práv udělených v jednotlivých zemích příslušnými patentovými úřady.

B. Polyklonální protilátky

Polyklonální protilátky proti MDC byly vypěstovány v králících za použití standardních protokolů (Sambrook et al, výše uvedená citace). V krátkosti lze použitý postup charakterizovat takto: Rekombinantní protein MDC produ·· ···· · < ·· ···· • · · « · ·* · € · • · · · · · · · • * * · · ······ « 9 · 9 9 · ·

9 999 999 9 9 ·

- 73 kovaný jako fúzovaný protein GST-MDC (viz výše) se zředí v PBS, emulguje ve Freundově úplném adjuvans a subkutánní injekcí podá králíkům. V intervalech 3 a 6 týdnů se další MDC zředěný PBS emulguje ve Freundově neúplném adjuvans a vzniklý přípravek se subkutánně podá stejným králíkům. 10 dnů po třetím očkování se králíkům odebere sérum a lOx zředí roztokem chloridu sodného pufrovaného pufrem Tris s obsahem smáčedla Tween 20 (0,5%) (TBS-T, viz publikace Sambrook et al.) za účelem charakterizace blotováním Western proti rekombinantní mu MDC, jež byla popsána výše.

Příklad 19

Stanovení vápníkového toku

Změny intracelulární koncentrace vápníku, které jsou charakteristické pro aktivaci buněk chemokiny, byly sledovány v několika buněčných liniích za použití stanovení vápníkového toku, které je dobře známo v tomto oboru.

Použitý postup lze v krátkosti popsat takto: Buňky se inkubují v 1 ml úplného média obsahujícího Fura-2/AM (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) (ΙμΜ) po dobu 30 minut při teplotě místnosti, jednou se promyjí a resuspendují v D-PBS na koncentraci přibližně 10⁶ buněk/ml.

Suspenze buněk (2 ml) se umístí do kontinuálně míchané kyvety (37°C) fluorimetru (AMINCO-Bowman Series 2, Rochester, NY, USA). Koncentrace intracelulárního vápníku se zjišťuje na základě fluorescence, která se monitoruje při emisní vlnové délce 510 nm, přičemž přepínání na excitační vlnovou délku 340 nm a 380 nm se provádí každých 0,5 s.

Poměr emise naměřené v případě excitace při 340 nm k emisi naměřené v případě excitace při 380 nm odpovídá hladině intracelulárního vápníku.

Výše uvedené zkoušce byly podrobeny následující buněčné linie: lidská embryonální ledvinová buněčná linie HEK-293 stabilně transfekovaná putativním genem receptorů chemokinu V28 (Raport et al., Gene, 163: 295 až 299 (1995)); buňky HEK-293 stabilně transfekované genem receptorů chemokinu CCR5 [Samson et al., Biochemistry, 35: 3362 až 3367 (1996) a dále též viz US patentová přihláška pořadového čísla 08/575 967 podaná 20. prosince 1995, jež byla převedena na stejného majitele a jež je dosud v řízení; citace této přihlášky představuje náhradu za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu; v této přihlášce jsou popsány látky, jež jsou receptory chemokinu a způsoby vztahující se k těmto látkám, včetně CCR5 (který je v citované přihlášce označován názvem *'88C)], buněčná linie lidských monocytů THP-1, buněčná linie epithelu lidských plic A-549 a buněčná linie lidských fibroblastů IMR-90.

Žádná z těchto buněčných linií nevykazovala vápníkový tok v odpovědi na rekombinantní protein MDC. Silná odpověď transfektantů HEK-293 na thrombin (pozitivní kontrola) ukazuje, že stanovení bylo platné. Kromě toho buňky THP-1 vykazovaly silnou odpověď na obchodně dostupné chemokiny MCP-1 a MCP-3 (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA) při koncové koncentraci 25 ng/ml. Žádné další stimuly nebyly zkoušeny u buněčných linií A-549 a IMR-90.

Příklad 20

Inhibice proliferace HIV

Několik c-c chemokinů bylo implikováno při potlačování proliferace viru humánní imunodeficience (HIV), který je kauzativním činidlem syndromu získané imunitní nedostatečnosti (AIDS) (viz Gocchi et al., Science 270: 1811 (1995)). Antiproliferativní účinnost MDC proti HIV byla měřena způsobem popsaným ve výše uvedené citaci Gocchi et « · · · · · al. Při této zkoušce se linie T-buněk CD4⁺ akutně infikuje kmenem HIV a kultivuje za přítomnosti různých koncentrací MDC. Po 3 dnech se k buňkám přidá čerstvý roztok MDC v kultivačním médiu. Po 5 až 7 dnech od infekce se měří hladina HIV zkoušením supernatantu kultury na přítomnost HIV p24 antigenu za použití obchodně dostupné soupravy pro zkoušku ELISA (Coulter, Miami, FL, USA).

Protilátky proti MDC byly zkoušeny na svou schopnost neutralizovat supresivní účinnost produkovanou humánními lymfocyty (Gocchi, výše uvedená citace). Při zkouškách inhibice HIV byly také zkoušeny chemicky syntetizované analogy MDC (viz příklad 11) nebo analogy produkované rekombinantními metodami.

Příklad 21

Účinky MDC na proliferaci fibroblastů

Kromě schopnosti přitahovat a aktivovat leukocyty byla u některých chemokinů, jako je 11-8, zjištěna schopnost ovlivňovat proliferaci neleukocytových buněk (viz Tuschil,

J. Invest. Dermatol 99: 294 až 298 (1992)). Fibroblasty jsou v těle důležité pro strukturní integritu většiny tkání. Proliferace fibroblastů je důležitá pro léčení ran a v odpovědi na poškození, ale může být také škodlivá, jako je tomu v případě chronických zánětlivých chorob, jako je plicní fibrosa (Phan v Immunology of Inflammation, Elsevier (1983), Str. 121 až 162).

Pro stanovení účinků MDC na proliferaci fibroblastů bylo použito zkoušky s proliferaci buněk in vitro. Lidské fibroblasty (CRL-635) získané ze Sbírky ATCC byly uchovávány v kultuře s DMEM obsahující FBS (10 %) a antibiotika (1 %).

Zkouška proliferace byla prováděna a kvantitativné vyhodno-

cována způsobem popsaným v tomto oboru, viz Denholm a Han, Amer. J. Pathol., 134: 355 až 363 (1989). Tuto zkoušku lze v krátkosti popsat následujícím způsobem: V den 1 se buňky (2,5 x 10³ buněk/jamka) navzorkují na 96-jamkové plotny do DMEM s FBS (10 %). V den 2 (24 hodin po navzorkování buněk) se médium nad buňkami vymění za séruprosté médium DMEM. V den 3 se médium z buněk odstraní a nahradí MDC zředěným DMEM s obsahem FBS (0,4 %). V den 5 se do každé jamky přidá ³H-thymidin (1 μΰί) a pokračuje se v inkubaci dalších 5 hodin. Buňky se sklidí na filtrech ze skleněných vláken. Proliferace buněk se vyjádří v počtech rozpadů za minutu (cpm) ³H-thymidinu zavedeného do fibroblastů. Při kontrolních experimentech se používá základního média pro toto stanovení, tj. DMEM s FBS (0,4 %), jako negativní kontroly, a DMEM s FBS (10 %), jako pozitivní kontroly.

Jak je zřejmé z obr. 7, ošetření pomocí MDC snižuje proliferaci fibroblastů v rozsahu, který je závislý na dávce. Podobná inhibice proliferace fibroblastů byla jaké pozorována za použití MDC získaného purifikací z buněk CHO (plné kroužky) a chemicky syntetizovaného MDC (prázdné kroužky). Antiproliferativní účinek MDC na fibroblasty ukazuje na terapeutickou použitelnost MDC při léčení chorob, jako je plicní fibrosa a nádorové choroby, při nichž představuje zvýšená nebo nekontrolovaná proliferace buněk důležitý znak.

Příklad 22

Zkoušení proliferace buněk

Účinky MDC na proliferaci epitheliálních buněk,

T-buněk, fibroblastů, endotheliálních buněk, makrofágů a nádorových buněk byly zkoušeny metodami známými v tomto oboru, jako například metodami popsanými v publikaci Denholm ·» ···· ·« ···· et al., Amer. J. Pathol. 134: 355 až 363 (1989), a v In Vitro Assays of Lymphocyte Functions v Current Protocols Immunology, části 3 až 4, Wiley and Sons (1992) pro stanovení aktivit růstových faktorů. Při těchto metodách se měří zvýšení nebo inhibice růstu buněk a uvolňování růstových faktorů.

Účinky MDC na proliferaci epitheliálních buněk a endotheliálních buněk byly zkoušeny za použití stejných postupů, jaké byly popsány výše v souvislosti s fibroblasty (viz příklad 21).

Účinky na proliferaci T-buněk byly zkoušeny za použití lymfocytů periferní krve. V krátkosti lze použitý postup charakterizovat takto: Jednojaderné buňky se izolují z periferní krve způsobem popsaným v Denholm et al., Amer.

J. Pathol., 135: 571 až 580 (1989). Buňky se resuspendují v médiu RPMI s FBS (10 %) a inkubují přes noc v plastových nádobách pro tkáňové kultury. Lymfocyty zůstanou v suspenzní kultuře a oddělí se odstředěním kultivačního média. Do každé jamky 96-jamkové plotny se přidá 10⁵ lymfocytů a poté následuje třídenní inkubace v médiu RPMI doplněném FBS (10 %) s obsahem PHA (1 μg/ml) a bez nebo s MDC (50, 125, 250 nebo 500 ng/ml). Během posledních 18 hodin inkubace se přidá ³Hthymidin (1 μθΐ). Buňky se sklidí a proliferace se vyjádří stejným způsobem jako v případě fibroblastů (viz příklad 21).

Účinky MDC na proliferaci makrofágů byly stanoveny za použití izolovaných peritoneálních makrofágů morčete získaných způsobem popsaným v příkladu 13. Makrofágy se umístí do 96-jamkových ploten obsahujících médium RPMI s FBS (10 %) při hustotě 10⁵ buněk/jamka a poté se provede dvouhodinová inkubace umožňující adhezi buněk. Potom se médium odstraní a nahradí čerstvým médiem, které MDC buď • · · · 99 ·· 9·· ·

neobsahuje nebo které obsahuje MDC v koncentraci 50, 125,

250 nebo 500 ng/ml. Buňky s MDC se inkubují po dobu 3 dnů a proliferace se stanovuje stejným způsobem, jaký byl popsán výše v souvislosti s lymfocyty.

Regulace proliferace těchto buněk zprostředkovaná chemokinem vykazuje terapeutické implikace při zvyšování opravy tkání po jejich poškození a při omezování proliferace těchto buněk při chronických zánětlivých reakcích, jako je psoriasis, fibrosa a atherosklerosa a při neoplastických chorobách.

Příklad 23

Zkoušení in vivo proliferace fibroblastů

Antiproliferativní účinky MDC na fibróblasty byly zjišťovány in vivo za použití metod popsaných v tomto oboru, jako například metody publikované v Phan a Fantone, Amer. J. Pathol. 50: 587 až 591 (1984), při níž se používá krysího modelu plicní fibrosy, jež byla vyvolána bleomycinem. Tento model je dobře charakterizován a umožňuje stanovení proliferace fibroblastů a syntézy kolagenu ve všech stádiích této choroby.

Použití postup lze v krátkosti popsat takto: krysy se rozdělí podle ošetření do 4 skupin:

1) kontrolní krysy, kterým se intratracheální injekcí podá normální roztok chloridu sodného,

2) krysy, kterým se injekčně podává roztok chloridu sodného, ale které také každý den obdrží intraperitoneální injekci 500 ng MDC v roztoku chloridu sodného, ···· ·· *

3) krysy ošetřené bleomycinem (Calbiochem, Palo Alto, Kalifornie, USA), který byl podán intratracheální injekcí v dávce 1,5 mg/kg a

4) krysy ošetřené bleomycinem, kterým byla také každý den podána intraperitoneální injekce 500 ng MDC.

V den 4, 7 , 14, 21 a 28 po počáteční intratracheální injekci se krysy usmrtí (každá skupina obsahuje 3 krysy), vyjmou se jim plíce a z každého plicního laloku se odeberou vzorky pro histologické vyšetření a zjištění obsahu kolagenu .

Příklad 24

Zkoušení modulátorů MDC

Modulátory účinnosti MDC mohou být užitečné při léčení chorob nebo symptomů chorob, na nichž se podílí MDC. Takové modulátory mohou být buď agonisty nebo antagonisty vazby MDC. Dále uvedená stanovení vazby k receptorů představují postupy, jimiž je možno identifikovat takové modulátory MDC.

MDC se označí detegovatelnou značkou, jako například izotopem ¹²⁵I, ³H a ¹⁴C, biotinem nebo europiem. Z přírodních buněk odpovídajících na MDC, jako jsou lidské makrofágy, buňky THP-1 stimulované forbolesterem, lidské fibroblasty, buněčné linie lidských fibroblastů nebo makrofágy morčete, se vyrobí přípravek obsahující buněčné membrány s receptory MDC. (Alternativně se vyrobí rekombinantní receptorový přípravek z buněk transfekovaných cDNA MDC receptorů, pokud je taková cDNA MDC receptorů indentif ikována a klonována.) Membránový přípravek se například vystaví působení ¹²⁵I-značeného MDC a inkubuje za vhodných *· ···· · « ·· ···> 9 9 9 ·· ·· · · « • · · · « ·· · • 9 9 9 9 9 9 999 9

9 9 9 9 9 9

- 80 - »· · *·» ..· ·♦ .

podmínek (například 10 minut při 37’C). Membrány s jakýmkoliv vázaným ¹²⁵I-MDC se potom shromáždí na filtru vakuovou filtrací a promyjí se, aby se odstranil nenavázaný ¹²⁵I-MDC. Radioaktivita spojená s vázaným MDC se potom kvantifikuje kapalinovou scintilační spektrofotometr!i filtrů.

Specificitu vazby MDC je možno potvrdit opakováním výše uvedeného stavovení za přítomnosti zvyšujících se množství neznačeného MDC a měřením úrovně kompetitivní vazby k receptoru. Těchto vazebných stanovení se také může použít pro identifikaci modulátorů vazby MDC k receptoru.

Výše uvedené stanovení s vazbou k receptoru je také možno provádět ve verzi modifikované následujícím způsobem: Membránovému přípravku se kromě značeného MDC exponuje také potenciální modulátor MDC. Při takto obměněném stanovení ukazuje zvýšená hladina (množství) značky spojené s membránou, že potenciální modulátor je aktivátorem vazby MDC. Naopak, snížená hladina (množství) značky spojené s membránou ukazuje, že potenciální modulátor je inhibitorem vazby MDC. Tohoto stanovení je možno využít pro identifikaci specifických aktivátorů a inhibitorů vazby MDC z velkých knihoven chemických sloučenin nebo přírodních produktů. Konkrétně se může tohoto způsobu použít pro rychlý screeníng většího počtu potenciálních modulátorů současně.

Biologické funkce MDC, které jsou objasněny výše, představují potenciál pro několik klinických aplikací.

Chemokiny obecně přitahují a aktivují monocyty a makrofágy (Baggiolini et al., výše uvedená citace). MDC konkrétně přitahuje makrofágy a inhibuje chemotaxi monocytů. Exprese MDC v patogenní oblasti zánětu může potlačovat chorobné stavy přitahováním přídavných makrofágů nebo jiných leukocytů do místa choroby, aktivací leukocytů, které jsou

• Φ φ

φ« ·φφφ • · φ φ

φφ zde již přítomny, nebo indukcí setrvání leukocytů na tomto místě. Od inhibice účinnosti MDC, jako chemoatraktantu, je tedy možno očekávat potlačení škodlivých zánětlivých procesů. Významné je, že potenciální užitek vyplývající z tohoto přístupu již byl přímo demonstrován v experimentech s chemokiny 11-8 a C-X-C, které přitahují a aktivují neutrofily. Protilátky zaměřené proti 11-8 vykazují silnou schopnost inhibovat zánětlivé choroby zprostředkované neutrofily (Harada et al., J. Leukoc. Biol., 56: 559 (1994)). Od inhibice MDC se očekává podobný účinek při chorobách, u nichž hrajou roli makrofágy, například při Crohnově chorobě, rheumatoidní arthritis nebo atherosklerosis.

Alternativně může být prospěšné i zvýšení účinku MDC u některých chorob, poněvadž bylo ukázáno, že chemokiny pozitivně ovlivňují hojení ran a angiogenesi. Exogenní MDC a anogisty MDC by tedy mohly být prospěšné při rekonvalescenci z těchto chorob.

Kromě toho, myelosupresivní účinek, který byl demonstrován u C-C chemokinu ΜΙΡ-Ια (Maze et al., výše uvedená citace) naznačuje, že MDC by mohl vykazovat podobnou účinnost. Taková účinnost MDC nebo agonistů MDC by mohla poskytovat významný užitek pacientům léčeným chemoterapií nebo radiační terapií tím, že by snížila škodlivé účinky tohoto léčení na pacientovy myeloidní progenitorové buňky.

MDC nebo agonisty MDC by také mohly být klinicky důležité při léčení nádorů, jak naznačuje schopnost C-C chemokinu TCA3 inhibovat tvorbu nádorů u myší (viz Laning et al., výše uvedená citace). MDC by mohl přímo nebo nepřímo inhibovat tvorbu nádorů, například přitahováním a aktivací různých nespecifických efektorových buněk do místa nádoru nebo stimulací specifické protinádorové imunity. Antiproliferativní účinek MDC na filbroblasty poukazuje na terapeu·· ···« ·· ····

tickou užitečnost MDC při léčení takových chorob, jako je pulmonární fibrosa a nádory, při nichž hraje hlavní úlohu zvýšená nebo neregulovaná proliferace buněk.

Vynález byl sice objasněn na svých specifických formách provedení, ale je zřejmé, že do jeho rozsahu spadají i nejrůznější variace a modifikace, pokud se na ně vztahují dále uvedené patentové nároky.

Claims (46)

1. Purifikovány polynukleotid kódující polypeptid sekvenci chemokinu pocházejícího z makrofágu je znázorněna v SEQ ID NO: 2.
2. 2. Polynukleotid podle nároku 1, kterým je DNA.
3. 3. DNA podle nároku 2, obsahující nukleotidy 20 až 298 ze sekvence SEQ ID NO: 1.
4. 4. Purifikovaný polynukleotid kódující aminokyseliny MDC 1 až 69 ze sekvence SEQ ID NO: 2.
5. 5. Polynukleotid podle nároku 4, kterým je DNA.
6. 6. DNA podle nároku 5, obsahující nukleotidy 90 až 298 ze sekvence SEQ ID NO: 1.
7. 7. Purifikovány polynukleotid zvolený ze souboru zahrnuj ícího

   a) DNA se sekvencí SEQ ID NO: 1;

   b) polynukleotid, který za stringentních podmínek hybridizuje k nekódujícímu řetězci DNA se sekvencí SEQ ID NO. l;

   c) polynukleotid, který by hybridizoval za stringentních podmínek k nekódujícímu řetězci DNA se sekvencí SEQ ID NO. 1, kdyby nebylo redundance genetického kódu; a

   d) polynukleotid, který kóduje stejný polypeptid MDC jako DNA se sekvencí SEQ ID NO: 1.

   ·· ···· ·· *···
8. 8. Polynukleotid podle nároku 7, kterým je DNA.
9. 9. Purifikovaný polynukleotid kódující polypeptid s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 25.
10. 10. Polynukleotid podle nároku 9, kterým je DNA.
11. 11. Purifikovaný polynukleotid kódující aminokyseliny 1 až 69 ze sekvence SEQ ID NO: 25.
12. 12. Polynukleotid podle nároku 11, kterým je DNA.
13. 13. Purifikovaný polynukleotid zvolený ze souboru zahrnuj ícího

    a) DNA podle nároku 12;

    b) polynukleotid, který za stringentních podmínek hybridizuje k DNA podle nároku 12; a

    c) polynukleotid, který by hybridizoval za stringentních podmínek k DNA podle nároku 12, kdyby nebylo redundance genetického kódu.
14. 14. Polynukleotid podle nároku 13, kterým je DNA.
15. 15. Vektor obsahující DNA podle nároku 2, 5, 8, 10, 12 nebo 14.
16. 16. Vektor podle nároku 15, kterým je expresní vektor, v němž je DNA operativně připojena k sekvenci DNA řídící expresi.

    ·· ···· ··* • 9 ·

    - 105 - ·· · • · 4» • ·
17. 17. Hostitelská buňka stabilně transformovaná nebo transfekovaná DNA podle nároku 2 nebo 5 způsobem umožňujícím expresi MDC v hostitelské buňce.
18. 18. Způsob produkce MDC, vyznačuj ící se t i m , že se hostitelská buňka podle nároku 17 pěstuje v živném médiu a z buňky nebo z média se izoluje MDC.
19. 19. Hostitelská buňka stabilně transformovaná nebo transfekovaná DNA podle nároku 10 nebo 12 způsobem umožňujícím expresi polypeptidového analogu MDC v hostitelské buňce.
20. 20. Způsob produkce polypeptidového analogu MDC, vyznačující se tím, že se hostitelská buňka podle nároku 19 pěstuje v živném médiu a z buňky nebo z média se izoluje analog polypeptidů MDC.
21. 21. Purifikovány polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO. 25.
22. 22. Purifikovaný polypeptid podle nároku 21 mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2.
23. 23. Purifikovaný polypeptid obsahující aminokyseliny 1 až 69 ze sekvence SEQ ID NO: 25.
24. 24. Purifikovaný polypeptid podle nároku 23 obsahující aminokyseliny 1 až 69 ze sekvence SEQ ID NO: 2.
25. 25. Polypeptid zvolený ze souboru zahrnujícího

    a) polypeptid obsahující sekvenci aminokyselin identifikovanou polohami 1 až 70 ze sekvence SEQ ID NO: 30;

    - 106

    b) purifikovaný polypeptid obsahující sekvenci aminokyselin identifikovanou polohami 9 až 69 ze sekvence SEQ ID NO: 2;

    c) polypeptid obsahující sekvenci aminokyselin identifikovanou polohami 1 až 69 ze sekvence SEQ ID NO: 31; a

    d) polypeptid obsahující sekvenci aminokyselin identifikovanou polohami 1 až 69 ze sekvence SEQ ID NO: 32.
26. 26. Polynukleotid kódující polypeptid podle nároku

    25.
27. 27. Polynukleotid podle nároku 26, kterým je DNA.
28. 28. Vektor obsahující DNA podle nároku 27.
29. 29. Hostitelská buňka stabilně transformovaná nebo transfekovaná DNA podle nároku 27 způsobem umožňujícím expresi tohoto polypeptidu v hostitelské buňce.
30. 30. Protilátka, která je specificky reaktivní s polypeptidem podle nároku 21, 22, 23, 24 nebo 25.
31. 31. Protilátka podle nároku 30, kterou je monoklonální protilátka.
32. 32. Hybridomální buněčná linie produkující protilátku podle nároku 31.
33. 33. Polyklonální antisérum obsahující protilátku podle nároku 30.
34. 34. Protilátla, která je specificky reaktivní s MDC.

    • · · · · ·

    - 107
35. 35. Způsob modulace chemotaxe leukocytu v savčím hostiteli, vyznačující se tím, že zahrnuje stupeň aj podávání polypeptidu podle nároku 21, 22, 23, 24 nebo 25 savčímu hostiteli, přičemž tento polypeptid moduluje chemotaxi leukocytů v hostiteli.
36. 36. Způsob podle nároku 35, vyznačující se t í m , že leukocyty jsou zvoleny ze souboru zahrnujícího leukocyty a makrofágy.
37. 37. Způsob zmírňování zánětlivého stavu v pacientovi, pro kterýžto stav je charakteristický alespoň jeden jev zvolený ze souboru zahrnujícího i) chemotaxi monocytů směrem k místu zánětu v pacientovi a ii) proliferaci fibroblastových buněk, vyznačuj ící se t i m , že zahrnuje stupeň

    a) podávání terapeuticky účinného množství MDC pacientovi.
38. 38. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že terapeuticky účinným množstvím MDC je množství, které je schopno inhibovat chemotaxi monocytů.
39. 39. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že terapeuticky účinným množstvím MDC je množství, které je schopno inhibovat proliferaci fibroblastových buněk.
40. 40. DNA obsahující souvislou část nukleotidové sekvence SEQ ID NO: 1 nebo nekódujícího řetězce, který je k ní komplementární, přičemž tato souvislá část obsahuje při·♦ ···<

    • ·· · · • · ·· ·

    - 108 nej menší κι 18 nukleotidů a tato DNA je schopna hybridizovat za stringentních podmínek k lidskému genu MDC.
41. 41. DNA podle nároku 40, která není schopna hybridizovat za stringentních podmínek ke genu lidského chemokinu zvolenému ze souboru zahrnujícího geny MCP-1, geny MCP-2, geny MCP-3, geny RANTES, geny ΜΙΡ-Ια, geny MIP-Ιβ a geny 1-309.
42. 42. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se t i m , že obsahuje polypeptid podle nároku 21, 22, 23, 24 nebo 25 a farmaceuticky vhodný nosič.
43. 43. Použití farmaceutického prostředku podle nároku 42 pro léčení zánětlivého chorobného stavu.
44. 44. Použití podle nároku 43, kde pro zánětlivý chorobný stav je charakteristická chemotaxe monocytů směřem k místu zánětu v pacientovi postiženém tímto chorobným stavem.
45. 45. Použití podle nároku 43, kde pro zánětlivý chorobný stav je charakteristická proliferace fibroblastových buněk v pacientovi postiženém tímto chorobným stavem.
46. 46. Způsob identifikace chemické sloučeniny vykazující modulační účinnost na MDC, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně

    a) obstarání první a druhé receptorové směsi obsahující receptory MDC;

    b) obstarání kontrolní směsi obsahující detegovatělně značený MDC;

    • 9 ····

    - 109 • 9 ·

    c) obstarání zkoušené směsi obsahující detegovatelně značený MDC a dále též výše uvedenou chemickou sloučeninu;

    d) kontaktování první receptorové směsi s kontrolní směsí za podmínek, při nichž se MDC může vázat k receptorům MDC;

    e) kontaktování druhé receptorové směsi se zkoušenou směsí za podmínek, při nichž se MDC může vázat k receptorům MDC;

    f) promývání první a druhé receptorové směsi za účelem odstranění detegovatělně značeného MDC, který není vázán k receptorům MDC;

    g) měření detegovatělně značeného MDC v první a druhé receptorové směsi; a

    h) identifikaci chemické sloučeniny vykazující modulační účinnost na MDC, přičemž modulační účinnosti na MDC odpovídá rozdíl mezi hodnotami detegovatelně značeného MDC u první a druhé receptorové směsi.