JP2732544B2 - 細胞接着のオリゴヌクレオチド変調 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は、細胞接着分子の合成あるいは代謝における
変調に反応する疾患状態の診断、研究試薬、および治療
に関する。特に、本発明は白血球が他の白血球や他の種
類の細胞へ接着することを調節するタンパク質の合成に
関与する特定のメッセンジャーリボ核酸（mRNA）あるい
はDNAと相互に作用する、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドに関する。ここでは、細胞間接着分子１（ICAM−
１）、内皮白血球接着分子１（ELAM−１）、および血管
細胞接着分子１（VCAM−１）をコードするmRNAとハイブ
リッドを形成するように設計されたアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドが提供されている。これらのオリゴヌクレ
オチドは、前記RNAあるいはDNAの活性を変調させ、特定
の細胞接着分子の合成および代謝を変調させることがわ
かっており、前記疾病の緩和や治療に効果的であること
が認められている。

発明の背景 炎症とは、傷害、感染、組織破壊等に対する組織の局
部的防御反応であり、感染因子あるいは傷害因子を破壊
し、傷害を受けた組織を分離させるものである。典型的
な炎症反応は、抗原を外来因子として認識したり組織の
損傷を認識し、可溶性の炎症媒体の合成および放出、感
染部位あるいは組織損傷部位に炎症細胞を動員し、侵入
してきた有機物あるいは損傷を受けた組織を破壊、除去
し、いったん侵入有機物や損傷が消失すれば炎症系を不
活化するという工程で進行する。炎症因子を伴うヒトの
数多くの疾患において、炎症反応を弱めようとする通常
の恒常性維持機序には欠陥があり、正常な組織にも損傷
を及ぼす。

前記のように炎症反応の各段階における免疫反応の活
性化には、細胞同士の相互作用が関与している。正常な
炎症反応において最も早く検出されるのは白血球の内皮
細胞への接着であり、脈管から感染あるいは傷害部位へ
の白血球の遊走がこれに続く。白血球が脈管から遊走す
るためには、まず内皮細胞に接着することが必要である
（J.M.Harlan、Blood、65:513−525（1985））。炎症部
位に最初に現われる炎症細胞は一般的に好中球であり、
その後に単球、リンパ球が続く。液性および細胞性免疫
を誘導するＢリンパ球およびＴリンパ球のいずれかの増
殖にも、細胞同士の相互作用は重要である。

白血球の内皮細胞や他の種類の細胞への接着は、白血
球および内皮細胞の両方の形質膜上にある、「接着分
子」と呼ばれる特定のタンパク質間の相互作用によって
媒介される。この接着分子間の相互作用は古典的なレセ
プター／リガンド相互作用と類似しているが、リガンド
が可溶化状態にはなく、細胞表面に固定していることが
相違点である。白血球の接着に関して遺伝疾患がある患
者を同定することにより、白血球の接着に関与するタン
パク質群も同定されている。白血球接着不全（LAD）
は、再発性細菌感染および膿形成や傷害治癒の傷害を特
徴とする、常染色体性のまれな疾患である。正常な白血
球の細胞外膜上に発現する３つのヘテロダイマー糖タン
パク質、Mac−１、LFA−１、およびp150,95に共通する
Ｂサブユニットに欠陥が認められていた（Andersonおよ
びSpringer、Ann.Rev.Med.38:175−194（1987））。LAD
の患者は、顆粒球、単球、リンパ球の広範囲の接着依存
性機能に欠陥が生じる。LFA−１には、細胞間接着分子
１および２（ICAM−１およびICAM−２）の２つのリガン
ドが同定されている。Mac−１およびp150,95のいずれに
ついても補体断片C3biに結合することがわかっている
他、まだ同定されていないリガンドがあると思われる。

またこの他にも、白血球が内皮細胞に接着し続いて血
管から遊走することに関与する接着分子が同定されてい
る。このような接着分子としては、内皮白血球接着分子
１（ELAM−１）、血管細胞接着分子１（VCAM−１）、お
よび顆粒球膜タンパク質140（GMP−140）と各々のレセ
プターが挙げられる。白血球の血管内皮への接着には、
ICAM−１、ICAM−２、ELAM−１、VCAM−１、およびGMP
−140の５つの細胞接着分子が、全面的にではないが部
分的に関与していると思われる（DustinおよびSpringe
r、J.Cell Biol.、107:321−331（1987））。ICAM−
１、ELAM−１、VCAM−１、およびGMP−140接着分子の細
胞表面での発現は炎症性刺激により誘導される。これに
対して、ICAM−２の発現は構造性のものであり、サイト
カインによる誘導に感受性ではない。GMP−140の誘導
は、一般的に、ヒスタミン、ロイコトリエンB4、血小板
活性化因子、トロンビンのようなオータコイドによって
誘導される。内皮細胞上で発現が最大に見られるのは、
刺激を与えてから30分ないし１時間後であり、２時間か
ら３時間以内にベースラインに戻る。ELAM−１およびVC
AM−１の内皮細胞上での発現は、インターロイキン １
βおよび腫瘍壊死因子などのサイトカインによって誘導
されるが、ガンマーインターフエロンによっては誘導さ
れない。ELAM−１が内皮細胞表面上に最大に発現するの
は、刺激を与えてから４ないし６時間後であり、16時間
でベースラインに戻る。ELAM−１の発現は、新しいmRNA
とタンパク質の合成に依存している。VCAM−１では、腫
瘍壊死因子による処置から２時間で発現の上昇が検出さ
れ、８時間後に最大となり、刺激投与から少なくとも48
時間は発現の上昇が維持されていた（RiceおよびBevila
cqua、Science、246:1303−1306（1989））。ICAM−１
の内皮細胞での発現は、インタロイキン−１、腫瘍壊死
因子、およびγ−インターフエロンなどのサイトカイン
により誘導される。ICAM−１の最大発現はELAM−１のそ
れに次いで刺激投与後８ないし10時間後であり、最低48
時間は発現が維持される。

GMP−140およびELAM−１は、主に好中球の血管内皮細
胞への接着に関与している。VCAM−１は主にＴリンパ球
およびＢリンパ球に結合する。VCAM−１はさらにメラノ
ーマの転移に関与していると思われ、他の癌にも関係し
ている可能性がある。ICAM−１は、好中球の血管内皮へ
の接着に関与すると共に、単球およびリンパ球の血管内
皮、組織繊維芽細胞、およびケラチン生成表皮細胞への
接着にも関与している。さらにICAM−１は、抗原提示細
胞のＴ細胞認識、ナチュラルキラー細胞による標的細胞
の融解、リンパ球活性化と増殖、および胸腺におけるＴ
細胞の成熟にも関与している。また最近のデータでは、
ICAM−１が、感冒の50％以上の原因となっているライノ
ウイルスの主要血清型の細胞レセプターであることが実
証されている（Stauntonら、Cell、56:849−853（198
9）、Greveら、Cell、56:839−847（1989））。

ICAM−１の発現は、アレルギー性接触皮膚炎、固定薬
疹、偏平苔せん、乾せんのような各種の炎症性皮膚疾患
に関連がある（Hoら、J.Am.Acad.Dermaltol.22:64−68
（1990）;GriffithsおよびNickoloff、Am、J.Patholog
y、135:1045−1053（1989）;Lisbyら、Br.J.Dermaltol.
120:479−484（1989）;Shioharaら、Arch.Dermaltol.、
125:1371−1376（1989））。ICAM−１の発現はまた、リ
ューマチ性関節炎の患者の滑膜（Haleら、Arth.Rheu
m.、32:22−30（1989））、糖尿病患者の膵臓Ｂ細胞（C
ampbellら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、86:4282−428
6（1989））、バセドウ病患者の甲状腺濾胞細胞（Weetm
anら、J.Endocrinol.、122:185−191（1989）、および
腎臓および肝臓の同種移植拒絶反応（FaullおよびRuss,
Transplantation、48:226−230（1989）;Adamsら、Lanc
et、1122−1125（1989））でも検出されている。

そのため、ICAM−１、VCAM−１、およびELAM−１の発
現阻害剤があれば、喘息、リューマチ性関節炎、同種移
植拒絶、各種の皮膚炎、乾せんのような炎症疾患あるい
は炎症成分の見られる疾患に対して治療効果を発揮する
抗炎症剤になると期待されている。ICAM−１、VCAM−
１、およびELAM−１の阻害剤は、ライノウイルスによる
感冒、AIDS、ある種の癌とその転移にも効果があると思
われる。現在までのところでは、細胞接着分子であるEL
AM−１、VCAM−１、およびICAM−１の発現を効果的に回
避させるような薬剤は知られていない。ICAM−１に対す
る中和モノクローナル抗体を用いた動物モデルの実験で
は、前記のような阻害剤が同定されれば、以下の疾患に
対して治療効果が得られることが実証されている；喘息
（Wegnerら、Science、247:456−459（1990）、腎臓同
種移植（Cosimiら、J.Immunol.、144:4604−4612（199
0））。ICAM−１の可溶型を用いた実験では、培養細胞
のライノウイルス感染を回避する効果も認められた（Ma
rlinら、Nature、344:70:72（1990））。

細胞内接着分子に影響を与える薬剤として現在知られ
ているのは、合成ペプチド、モノクローナル抗体、およ
び接着分子の可溶型である。これまでのところ、ICAM−
１、VCAM−１、あるいはELAM−１との相互作用を遮断す
るような合成ペプチドは同定されていない。ICAM−１、
VCAM−１、およびELAM−１の発現による急性炎症反応の
治療には、モノクローナル抗体が有効であると思われ
る。しかし慢性治療の場合では、宿主動物内にモノクロ
ーナル抗体に対する抗体が生じ、これにより有効性が減
少する。またモノクローナル抗体は大きなタンパク質で
あるために炎症部位への接近が難しい。可溶型の細胞接
着分子の場合はモノクローナル抗体と同様の制限に加え
て、生成に手数がかかる。従って長い間、細胞内接着分
子を効果的に阻害するような分子の必要性が挙げられて
いる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ICAM−１、
VCAM−１、およびELAM−１の効果を阻害するために用い
られている現在の薬剤のこのような多くの欠点を回避し
たものである。

PCT/US90/02357（Hessionら）では、ELAM−１、VCAM
−１、およびVCAM−1bを含む内皮接着分子（ELAMs）を
コードするDNA配列が開示されている。このDNA配列は、
（１）この接着分子に反応し、白血球が内皮細胞に結合
することを阻害する治療薬剤として用いられるモノクロ
ーナル抗体の生成、（２）白血球上のELAMリガンドに結
合し、つぎに内皮細胞上のELAMに結合して白血球が内皮
細胞に結合することを阻害するELAMペプチドの生成、
（３）ELAMSに結合する分子（抗ELAM抗体、あるいはリ
ガンドやその断片などのマーカー）を用いた炎症の検
出、（４）ELAMおよびELAMリガンドDNA配列を用いて、
アンチセンス核酸およびリボザイムを用い、mRNAをアン
チセンス核酸でマスクするかあるいはリボザイムで切断
するいずれかの方法により、特定のmRNAの翻訳を遮断し
て、翻訳レベルにおけるELAMあるいはELAMリガンド発現
に介入するような核酸分子の生成など、多数の用途に用
いられる。また、コード領域が選択の標的であることが
示されている。VCAM−１の場合ではAUGがそのコード領
域である可溶性が高いと考えられており、実施例17で
は、特にAUGにハイブッド形成する15merが開示されてい
る。

発明の目的 本発明の目的は、免疫成分が関与する疾患、同種移
植、癌および転移、感冒、AIDSに対して、炎症細胞接着
分子の合成や発現を混乱させることによる治療を提供す
ることにある。

また、細胞間接着タンパク質をコードする核酸の機能
を阻害しうるアンチセンスオリゴヌクレオチドあるいは
オリゴヌクレオチド類似体を提供することも本発明の目
的である。

さらに、細胞間接着の機能傷害を診断する手段を提供
することも目的である。

本発明のこのような目的は、本明細書により明かであ
る。

図面の簡単な説明 第１図はヒト細胞間接着分子−１（ICAM−１）のmRNA
配列を示す。

第２図はヒト内皮白血球接着分子−１（ELAM−１）の
mRNA配列を示す。

第３図はヒト血管細胞接着分子−１（VCAM−１）のmR
NA配列を示す。

第４図はインターロイキン−１および腫瘍壊死因子に
より各種ヒト細胞系の細胞表面上でのICAM−１発現の誘
導を示すグラフである。

第５図はヒト臍帯静脈内皮細胞でのICAM−１の発現に
対する選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの効
果を示すグラフである。

第6A図および第6B図は、腫瘍壊死因子およびインター
ロイキン−１により刺激されたヒト臍帯静脈内皮細胞に
おけるICAM−１発現に対するアンチセンスオリゴヌクレ
オチドの効果を示すグラフである。

第７図は、対照のためにDMSO分化HL−60細胞および腫
瘍壊死因子処置したヒト臍帯静脈内皮細胞へのICAM−１
媒介接着に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効
果を示すグラフである。

第８図は、A549ヒト肺癌腫細胞におけるICAM−１発現
に対する選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの
効果を示すグラフである。

第９図は、初期のヒトケラチノサイトにおけるICAM−
１発現に対する選択されたアンチセンスオリゴヌクレオ
チドの効果を示すグラフである。

第10図は、オリゴヌクレオチドの長さ、TmおよびICAM
−１発現の阻害効果との関係を示すグラフである。

第11図は、対照のためにDMSO分化HL−60細胞および腫
瘍壊死因子処置したヒト臍帯静脈内皮細胞へのICAM−１
媒介接着に対する選択されたアンチセンスオリゴヌクレ
オチドの効果を示すグラフである。

第12図は、腫瘍壊死因子処置したヒト臍帯静脈内皮細
胞におけるELAM−１発現に対する選択されたアンチセン
スオリゴヌクレオチドの効果を示すグラフである。

発明の概要 本発明によれば、細胞間接着分子−１（ICAM−１）、
血管細胞接着分子−１（VCAM−１）、および内皮白血球
接着分子−１（ELAM−１）をコードする核酸と特異的に
ハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドおよびオリゴ
ヌクレオチド類似体が提供される。より詳細には、本発
明によれば、細胞間接着分子−１をコードする遺伝子の
AUG翻訳開始コドン領域、３′−非翻訳領域、５′−キ
ャップ部位、コード領域もしくは翻訳終止コドン領域、
または内皮白血球接着分子−１をコードする遺伝子のAU
G翻訳開始コドン領域、５′−非翻訳領域もしくは３′
−非翻訳領域を標的とする、細胞接着分子の発現を変調
しうるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類
似体が提供される。このオリゴヌクレオチドおよびオリ
ゴヌクレオチド類似体は、直接にmRNAと結合するか、あ
るいは選択されたDNA部分に結合して３重らせん構造を
形成し、それによって遺伝子から生成されるmRNAの量を
変えるように設計される。

mRNAと結合するような前者の関係を「アンチセンス」
という。オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド
類似体は、RNAあるいはDNAの機能、すなわちタンパク質
への翻訳、細胞質へのトランスロケーション、あるいは
生物学的機能全体に必要な他の活性を阻害することがで
きるようになっている。RNAあるいはDNAがその機能の全
体あるいは一部を実行することができなければ、細胞接
着分子の適切な発現の制御を行っているゲノムの一部が
機能を発揮できず、その代謝が変調を受けることにな
る。

このアンチセンス攻撃は特定遺伝子に標的を定めて行
うことが望ましい。ICAM−１、VCAM−１、およびELAM−
１をコードする遺伝子はこの攻撃に特に有効であること
がわかっており、これらの発現を阻害することで、炎症
疾患、炎症成分を伴う疾患、同種移植、癌および転移、
ウイルス感染の治療に役立つことが期待されている。

細胞接着を変調させる方法は、細胞接着を変調しうる
タンパク質をコードする核酸とハイブリッド形成するよ
うなオリゴヌクレオチドあるいはオリゴヌクレオチド類
似体に動物を接触させることから成る。オリゴヌクレオ
チドあるいはオリゴヌクレオチド類似体としては、ICAM
−１、VCAM−１、およびELAM−１とハイブリッド形成す
るものが望ましい。診断方法も本発明に含まれる。

好ましい態様の詳細な説明 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、多数のヒト疾患
の治療薬として非常に有望視されている。概念上では、
酵素の活性部位あるいはレセプターのリガンド結合部位
と相互作用を行う化合物を設計するよりも、塩基対を作
ることによりRNA分子としての分子の一次構造と相互作
用を行う化合物を設計する方がはるかに容易である。オ
リゴヌクレオチドは、ワトソン／クリックの塩基対によ
り定義されているように、mRNA前駆体あるいは成熟mRNA
のいずれかの相補的な配列に特異的に結合し、DNAから
タンパク質への遺伝子情報の流れを阻害する。このアン
チセンスオリゴヌクレオチドは標的とする配列に特異的
に作用する特徴を示し、非常に用途が広くなっている。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは４つの単量体ユニッ
トから成る長い鎖であるために、どのような標的RNA配
列についても容易に合成することができる。最近の多く
の研究では、標的タンパク質を研究するための生物ツー
ルとしてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性が
実証されている（Rothenbergら、J.Natl.Cancer Ins
t.、81:1539−1544（1989）;Zon、G.Pharmaceutical Re
s.、5:539:549）。オリゴヌクレオチドの化学的研究の
進歩、ヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチドの合成、
および細胞への取り込みの上昇を示すオリゴヌクレオチ
ド類似体により、アンチセンスオリゴヌクレオチドを新
規の治療形態として考えることが可能となった。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、従来の方法では
解決されなかった問題を解消する理想的なものである。
所定のイソ酵素を選択的に阻害するように設計すること
ができ、このイソ酵素の生成を阻害し、フリーラジカル
の補集や多重レセプターへの結合のような非特異的な機
序が回避されるからである。また特異的な阻害剤を設計
するのに、酵素機序やレセプター／リガンドの相互作用
を完全に理解している必要もない。

標的の説明 炎症部位に好中球が急速に浸潤していくのは、内皮細
胞上のGMP−140、ELAM−１、およびICAM−１の発現が増
大するためであると考えられる。炎症反応の後期の段階
でリンパ球や単球が現われるのは、VCAM−１およびICAM
−１によって媒介されるからと考えられる。ELAM−１お
よびGMP−140の血管内皮細胞上に発現するのは一時的で
あるが、VCAM−１およびICAM−１の発現は持続的なもの
である。

ヒトICAM−１は3.3kbのmRNAによってコードされる
が、このmRNAからは55219ダルトンのタンパク質が生成
される（第１図）。ICAM−１は窒素結合グリコシル化部
位を介して高度にグリコシル化される。成熟タンパク質
の分子量はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
れば見かけ上90キロダルトンである（Stauntonら、Cel
l、52:925−933）。ICAM−１は免疫グロブリン超遺伝子
族の一種であり、アミノ末端に５つの免疫様ドメインを
保持し、その後にトランスメンブランドメインおよび細
胞質ドメインが続いている。LFA−１およびライノウイ
ルスの第一結合部位は、いずれも第１の免疫グロブリン
様ドメインにあるが、各々の結合部位ははっきり区別さ
れる（Stauntonら、Cell、61:243−354（1990））。最
近の電子顕微鏡による研究では、ICAM−１は長さ18.7n
m、直径２ないし3nmの曲がった棒状であることが実証さ
れている（Stauntonら、Cell、61:243−254（199
0））． ICAM−１は広範囲の組織と細胞に分散しており、白血
球、内皮細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイト、および他
の上皮細胞にも見られる。ICAM−１の発現は、細菌性リ
ポ多糖類およびインターロイキン−１、腫瘍壊死因子、
γ−インターフェロン、リンフオトキシンのようなサイ
トカインでの処置により、血管内皮細胞、繊維芽細胞、
ケラチノサイト、星状膠細胞、および数種の細胞系での
発現を調節することができる（例えば、Frohmanら、J.N
euroimmunol.、23:117−124（1989）参照）。サイトカ
イン処置後にICAM−１の発現が上昇する分子レベル機序
については解明されていない。

ELAM−１は115キロダルトンの膜糖タンパク（第２図
参照）であり、膜糖タンパクのセレクトリン族の一種で
ある（Bevilacquaら、Science、243:1160−1165（198
9））。ELAM−１のアミノ末端領域は、レクチン様タン
パク質の一種と相同する配列に表皮性成長因子に類似す
るドメインが続き、さらに補体レセプター１および２で
見られるアミノ酸配列と類似する60個のアミノ酸が縦に
６列反復した構成となっている。リンパ球ホーミング
（homing）抗原であるGMP−140およびMEL−14抗原も同
じような構成となっている。ELAM−１は3.9kbのmRNAに
よってコードされる。ELAM−1mRNAの３′非翻訳領域に
はATTA配列モチーフが何か所かに含まれ、これは細胞内
mRNAの迅速な変化を担っており、ELAM−１の一過性の発
現と一致する。

ELAM−１は血管内皮細胞でのみ同定されている、限定
された細胞上の分布を表す。ELAM−１はICAM−１と同様
に、腫瘍壊死因子、インターロイキン−１、およびリン
フオトキシンなどを含むの多数のサイトカインや細菌性
リポ多糖類によって誘導され得る。ICAM−１とは対照的
にELAM−１はガンマーインターフエロンでは誘導されな
い（Bevilacquaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84:9238
−9242（1987）。;Wellicomeら、J.Immunol.,144:2558
−2565（1990））。ELAM−１のmRNAのヒト臍帯静脈内皮
細胞での誘導および消失の動力学には、この細胞表面上
でELAM−１の出現および消失が重要である。ICAM−１と
同様に、ELAM−１誘導の分子レベルの機序についても解
明されていない。

VCAL−１は110キロダルトンの膜糖タンパク質であ
り、3.3kbのmRNAによってコードされる（第３図参
照）。VCAM−１単一複写遺伝子によってコードされると
考えられている（Osbornら、Cell、59:1203−1211（198
9））。ICAM−１と同様に、VCAM−１は免疫グロブリン
超遺伝子族の一種であり、６個のＨ型免疫グロブリン様
ドメインを含む。VCAM−１のレセプターはCD29であり、
これはCD29に対するモノクローナル抗体によりラモス細
胞のVCAM−１への接着が遮断されるということから、実
証されている。VCAM−１は主に血管内皮細胞で発現され
る。ICAM−１およびELAM−１同様、血管内皮上でのVCAM
−１の発現はサイトカインの処置により調節される（Ri
ceおよびBevilacqua、Sceience,246:1303−1306（198
9）;Riceら、J.Exp.Med.、171:1369−1374（1990））。
発現の上昇は、mRNAの誘導によるものと思われる。

治療に関しては本発明によるオリゴヌクレオチドある
いはオリゴヌクレオチド類似体を投与して、ICAM−１、
VCAM−１、およびELAM−１の発現を減少させることによ
って疾患を有すると思われる動物を処置することができ
る。当業者であれば、最適な用量、投与法、および投与
頻度を容易に決定することができる。この治療は、効果
が現われるかあるいは疾病の症状が緩和されるまで継続
するのが一般的である。長期にわたる治療になる疾患も
あるだろう。

本発明では、炎症細胞の接着を変調させることのでき
るタンパク質に対応するRNAおよびDNAの機能をアンチセ
ンス阻害に有用な、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌ
クレオチド類似体を用いる。本発明における「オリゴヌ
クレオチド」とは、天然のホスホジエステル結合により
天然に存在する塩基およびフラノシル基が結合して形成
されたポリヌクレオチドを言う。これは、自然に存在す
る種、または自然に存在するサブユニットあるいはその
近似する相同体から合成された種類のいずれをも示す有
効な言葉である。

本発明との関連で用いられる「オリゴヌクレオチド類
似体」という言葉は、オリゴヌクレオチドと同様の機能
を発揮するが、天然には存在しない部分を保持する成分
を示す。従ってオリゴヌクレオチド類似体には、変形し
た糖部分、あるいは糖間結合が含まれていてもよい。例
としては、ホスホロチオエートや従来より既知で用いら
れている他の硫黄含有種が挙げられる。本発明の好適な
態様によれば、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル
結合の少なくともいくつかは、活性を変調させようとし
ているRNAあるいはDNAの存在する細胞の領域への浸透性
を高めるように機能する構造で置換させる。このような
置換としては、ホスホロチオエート結合、メチルホスホ
ネート結合、あるいは短鎖アルキル、シクロアルキル構
造が挙げられる。本発明の他の好適な態様では、ホスホ
ジエステル結合が同時に実質的に非イオン性かつ非キラ
ルか、あるいはキラルかつ鏡像異性的に特異的となって
いる構造で置換される。当業者であれば、本発明の実施
にあたり他にどのような結合を用いたらよいか容易に選
択することができる。

オリゴヌクレオチド類似体は、少なくともいくつかの
修飾塩基を含む種を含んでもよい。従って天然に存在す
るものとは別のプリンおよびピリミジンを用いることも
できる。同様に本発明の基本的な原則が守られていれ
ば、ヌクレオチドサブユニットのフラノシル部分に修飾
があってもよい。修飾例としては、２′−Ｏ−アルキル
−および２′−ハロゲン−置換ヌクレオチドが挙げられ
る。

このような類似体は、機能上は天然のオリゴヌクレオ
チド（あるいは自然系に従って合成されたオリゴヌクレ
オチド）に代替させることができるが、天然の構造とは
１つかそれ以上の相違がある。しかし、細胞内接着を変
調させることのできるタンパク質の１つの対応する遺伝
子から誘導されるRNAおよびDNAと効果的にハイブリッド
形成する機能を保持している限りは、すべて本発明のオ
リゴヌクレオチド類似体に含まれる。本発明によれば、
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は
約３ないし50のサブユニットから構成されていることが
望ましい。サブユニットの数は、約８ないし25、そして
約12ないし22がいっそう望ましい。１つのサブユニット
は塩基−糖の組合せから構成され、隣接のサブユニット
とはホスホジエステルあるいは他の方法により結合され
ていると理解されるであろう。

本発明で用いられるオリゴヌクレオチドおよびオリゴ
ヌクレオチド類似体は、よく知られている固相合成法に
より簡便かつ日常的に生成することができる。この合成
法に用いる装置は、アプライド・バイオシステムズ（Ap
plied Biosystems）などいくつかの企業が販売してい
る。このような合成法にはどのような手法を用いてもよ
いが、オリゴヌクレオチドの実際の合成は日常的な作業
者の技術範囲内にある。ホスホロチオエートやアルキル
化誘導体のような別のオリゴヌクレオチド類似体を調製
する同様の方法も知られている。

本発明によれば、転写元のDNAの読み取り枠（ORF）に
より同定されるメッセンジャーRNAが、DNAのORFからの
情報だけでなく、５′−非翻訳領域、３′−非翻訳領
域、および介在配列リボヌクレオチドとして当業者に知
られている領域を形成する関連リボヌクレオチドをも含
有していることが、当業者に理解される。従って本発明
により形成されるオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌク
レオチド類似体は、この関連リボヌクレオチドと情報リ
ボヌクレオチドのいずれをもその全体あるいは部分を標
的とするものである。望ましい実施例では、オリゴヌク
レオチドあるいはオリゴヌクレオチド類似体は、転写開
始部位、翻訳開始部位、介在配列、および３′非翻訳領
域の配列と特異的にハイブリッド形成される。

本発明によればオリゴヌクレオチドは、白血球が他の
白血球あるいは別の種類の細胞に接着する際に関与する
タンパク質をコードする核酸の一部と、特異的にハイブ
リッド形成する。望ましい実施例では、このタンパク質
は細胞間接着分子−１、血管細胞接着分子−１、および
内皮白血球接着分子−１である。本発明ではこれと対応
する配列あるいはその一部を含むオリゴヌクレオチドあ
るいはその類似体が有用である。例えば第１図には、ヒ
ト細胞間接着分子−1mRNA配列が示されている。全体と
してあるいは部分的に有効で有り得る望ましい配列部分
は： 第２図にはヒト内皮白血球接着分子−1mRNA配列が示
されている。全体としてあるいは部分的に有効で有り得
る望ましい配列部分は： 第３図にはヒト血管細胞接着分子−1mRNA配列が示さ
れている。全体としてあるいは部分的に有効で有り得る
望ましい配列部分は： 図に示された配列は正確であると考えられるが、万が
一誤りがあるとしたら、本発明は正しい配列を意図して
いることをつけ加えたい。本発明による有効なオリゴヌ
クレオチドあるいはその類似体はこのような配列の内の
１つ、あるいはその一部分から構成される。従って、上
記のようなオリゴヌクレオチド（あるいはその類似体）
の内の任意のもの、あるいは当業者が炎症細胞接着分子
の合成を変調させるための望ましいアンチセンス標的の
知識から調製しうるような同様のオリゴヌクレオチドお
よびその類似体の任意のものを用いることが望ましい。

本発明による望ましい具体例を以下の非限定的な実施
例に従って説明する。変調を目的とする標的mRNAとは、
細胞間接着分子−１、内皮白血球接着分子−１、および
血管細胞接着分子−１に関連するものである。当業者で
あれば本発明が限定的なものでなく、一般に応用可能な
ものであることが理解される。ICAM−１および／または
ELAM−１および／またはVCAM−１の生成を阻害あるいは
変調することにより、疾病の治療に相当の効果があるこ
とが期待されている。当該組成物の効果を評価するため
には、１つあるいは複数の一連のアッセイが必要であ
る。

実施例 実施例１ 細胞表面上のICAM−１、VCAM−１、およびELAM−１の
発現量は、特異的なモノクローナル抗体を用いたELISA
法で定量することができる。まず細胞を96ウエルマイク
ロタイタープレートで集密状態（confluence）にまで増
殖させる。インターロイキン−１あるいは腫瘍壊死因子
のいずれかを、ELAM−１を定量する場合には４ないし８
時間、またICAM−１およびVCAM−１を定量する場合には
８ないし24時間添加することにより細胞に刺激を与え
る。こうしてサイトカインにより適当なインキュベーシ
ョンを行った後、細胞をダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水
（Ｄ−PBS）のような、カルシウムとマグネシウムを含
有する緩衝化等張性溶液で穏やかに３回洗浄する。次に
細胞を、Ｄ−PBSで希釈した１ないし２％のパラホルム
アルデヒドを用いて25℃で20分、直接マイクロタイター
プレートに固定する。そして細胞をＤ−PBSで３回洗浄
する。マイクロタイタープレートの非特異的結合部位
は、２％ウシ血清アルブミンを含有するＤ−PBS溶液で3
7℃において１時間ブロッキングを行う。そして細胞を
ブロッキング溶液で希釈した適切なモノクローナル抗体
で37℃において１時間インキュベーションする。非結合
抗体は、細胞をＤ−PBSで３回洗浄することにより除去
される。細胞に結合した抗体の検出は、1:1000の希釈率
でビオチン化ヤギ抗マウスIgG（Bethesda Research L
aboratories、Gaithersberg,MD）を含有するブロッキン
グ溶液を用いた37℃における１時間のインキュベーショ
ンで行なわれる。次に細胞をＤ−PBSで３回洗浄し、希
釈率を1:1000のβ−ガラクトシダーゼ結合ストレプトア
ビジン（ベセスダ リサーチ ラボラトリーズ、ゲチス
バーグ、メリーランド州:Bethesda Research Laborat
ories社製）で37℃において１時間インキュベーション
する。そして細胞をＤ−PBSで５分ずつ３回洗浄する。
特定のモノクローナル抗体に結合しているβ−ガラクト
シダーゼは、プレートを3.3mMクロロフエノールレッド
−β−Ｄ−ガラトピラノシド、50mM燐酸ナトリウム、1.
5mMのMgC12;pH＝7.2の混合溶液で37℃において２ないし
15分間展開することにより測定する。生成物の濃度はEL
ISAマイクロタイタープレートリーダーで575nmにおける
吸光度を計測することによって求められる。

インターロイキン−１βあるいは腫瘍壊死因子αのい
ずれかをヒト細胞系に与えて刺激し、ICAM−１を誘導す
る実施例が第４図に示されている。細胞はインターロイ
キン−１あるいは腫瘍壊死因子を濃度を上げながら15時
間投与し上記のように処理する。ICAM−１の発現は、1:
1000希釈のモノクローナル抗体84H10（アマック社、ウ
エストブロック、メイン州:Amac Inc.、Westbrook、M
E）でインキュベーションして確認する。使用した細胞
系は第４代ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）、ヒト表皮
癌細胞系（A431）、ヒトメラノーマ細胞系（SK−MEL−
２）、およびヒト肺癌細胞系（A549）であった。ICAM−
１はどの細胞系においても誘導されたが、細胞表面上で
のICAM−１の誘導はインターロイキン−１よりも腫瘍壊
死因子の方が効果的であった（第４図参照）。

ICAM−１、VCAM−１、あるいはELAM−１の発現を阻害
するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは上記の方
法でスクリーニングを行うが、細胞はサイトカインで攻
撃する前にオリゴヌクレオチドで予め処理しておく。第
５図には、ICAM−１の発現をアンチセンスオリゴヌクレ
オチドで阻害する例が示されている。ここではヒト臍帯
静脈内皮細胞（HUVEC）を、16μＭのＮ−［１−（２、
３−ジオレイルオキシ）プロピル］−N,N,N−トリメチ
ルアンモニウムクロライド（DOTMA）を含有するOpit ME
M（ギブコグランドアイランド、ニューヨーク州:GIBC
O、Grand Island、NY）に希釈したオルゴヌクレオチド
の濃度を次第に上昇させて、37℃において４時間処理す
ることにより、オルゴヌクレオチドの取り込みを促進し
た。培地の交換は、指示された濃度のオリゴヌクレオチ
ドを含有する内皮成長培地（EGM−UV;クローンテック
ス、サンディエゴ、カリフォルニア州:Clonetics,San
Diego、CA）でさらに４時間行った。細胞には５単位/ml
の濃度のインターロイキン−１βを添加し、37℃におい
て14時間インキュベーションした。細胞でのICAM−１の
発現は、1:1000の希釈率のモノクローナル抗体84H10を
用いて前記のように定量した。用いられたオリゴヌクレ
オチドは： 化合物１−（ISIS 1558） 翻訳開始コドンAUGを包含するmRNAの67−80位とハイ
ブリッド形成するように設計されたホスホジエステルオ
リゴヌクレオチド。以下の配列を保持する： ５′−TGGGAGCCATAGCGAGGC−３′ 化合物２−（ISIS 1570） ホスホロチオエートを含有する化合物１と同様の配列
に対応するオリゴヌクレオチド。

化合物３−化合物１および化合物２と相補的なホスホロ
チオエートオリゴヌクレオチド。以下の配列を保持す
る： ５′−GCCTCGCTATGGCTCCCA−３′ 化合物４−（ISIS 1572） mRNAの３′非翻訳領域の2190−2210位とハイブリッド
形成するように設計されたホスホロチオエート含有オリ
ゴヌクレオチド。以下の配列を保持する： ５′−GACACTCAATAAATAGCTGGT−３′ 化合物５−（ISIS 1821） 以下の配列を含む対照として使用されたヒト５−リポ
キシゲナーゼmRNAとハイブリッド形成するように設計さ
れたホスホロチオエート含有オリゴヌクレオチド。

５′−CATGGCGCGGGCCGCGGG−３′。

ヒトICAM−1mRNAの翻訳領域の開始コドンAUGを標的と
するホスホジエステルオリゴヌクレオチド（化合物１）
ではICAM−１の発現を阻害することはできなかったが、
化合物１と対応するホスホロチオエートを含有するオリ
ゴヌクレオチド（化合物２）では、0.1μＭでは70％、
また１μＭでは90％の阻害が示された（第４図）。ホス
ホロチオエートオリゴヌクレオチドの方がホスホジエス
テルよりも効力の上昇が認められたが、これはおそらく
安定性が高いためだと思われる。化合物２に対するセン
スストランドである化合物３の場合は、10μＭの濃度で
ICAM−１の発現の阻害は軽度であった。化合物２を細胞
に添加する前に予め化合物３とハイブリッド形成させる
とICAM−１の発現に対する化合物２の効力は弱められた
が、これは化合物２の活性化がアンチセンスオリゴヌク
レオチドの効力によるもので、mRNAとのハイブリッド形
成が必要であることが示唆された。３′非翻訳配列に対
するアンチセンスオリゴヌクレオチド（化合物４）で
は、１μＭの濃度でICAM−１の発現が62％抑制された
（図５）。ヒト５−リポキシゲナーゼを標的とする対照
オリゴヌクレオチド（化合物５）でのICAM−１の阻害率
は20％であった。以上のデータより、オリゴヌクレオチ
ドはヒト臍帯静脈内皮細胞上のICAM−１の発現を阻害す
ることが可能であること実証され、またそれがアンチセ
ンス活性によるものであることが示唆された。

アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物２は１μＭ濃
度で、腫瘍壊死因子およびインターロイキン−１の濃度
を上昇させながら刺激を与えたヒト臍帯静脈内皮細胞で
のICAM−１の発現を阻害する（第６図）。このデータに
より、化合物２の効力はインターロイキン−１で刺激を
与えた細胞に特異的なものではないことが実証されてい
る。

同じ様なアッセイを行って、アンチイセンスオリゴヌ
クレオチドによるELAM−１およびVCAM−１の発現の阻害
を実証することも可能である。

実施例２ ICAM−１、VCAM−１、およびELAM−１の発現に対する
アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を実証する第２
の細胞アッセイとしては、細胞接着アッセイがある。ま
ず標的細胞のマルチウエルプレート内で増殖させて単層
とし、オリゴヌクレオチド、次にサイトカインで処理す
る。次に接着性の細胞を単層細胞に添加し、37℃で30な
いし60分インキュベーションし、洗浄して非接着細胞を
除去する。単層に接着している細胞の定量は、直接接着
している細胞を計算してもよいし、⁵¹Crのようなラジオ
アイソトープで細胞を予めラベリングしておき、記載さ
れているように単層での放射活性を計測することによっ
て行ってもよい（DustinおよびSpringer、J.Cell Bio
l.、107:321−331（（1988））。このアッセイでアンチ
センスオリゴヌクレオチドが標的とするのは、ICAM−
１、VCAM−１、あるいはELAM−１のいずれかである。

第７図は、DMSO分化HL−60細胞が腫瘍壊死因子で処理
されたヒト臍帯静脈内皮細胞に接着する場合の、ICAM−
1mRNAを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの
効果を示す実施例である。ヒト臍帯静脈内皮細胞は12−
ウエルプレートで増殖させ、80％の集密状態とした。次
にこの細胞を８μM DOTMAを含有するOpti−MEMで希釈し
た２μＭのオリゴヌクレオチドで37℃において４時間処
理を行った。培地は、２μＭの指定されたオリゴヌクレ
オチドを含有する新鮮な内皮細胞成長培地（EGM−UV）
と交換し、37℃において４時間インキュベーションを行
った。指示するように細胞には1ng/mlの腫瘍え死因子の
添加を行い、さらに19時間インキュベーションした。そ
して細胞をEGM−UVで１回洗浄し、1.6x10⁶のHL−60細胞
に1.3％DMSOを添加して４日間の分化を行った。そして3
7℃において１時間細胞の接着を行わせ、37℃に加温し
たダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水（Ｄ−PBS）で緩徐に
４回洗浄する。接着細胞は、単層に5mMEDTAを含有する
冷（４℃）燐酸緩衝生理食塩水を添加し、氷温にて５分
間インキュベーションを行って分離した。EDTA処理によ
り分離した細胞の数は、血球数で計算する。EDTA処理に
より単層から分離した内皮細胞は、HL−60細胞とは形態
上異なっているので、区別は容易である。

腫瘍壊死因子による処理を行わない場合に内皮細胞に
結合したHL−60細胞は３％であった。内皮細胞の単層を
1ng/mlの腫瘍壊死因子で処理した場合には、接着細胞数
が添加した細胞全体の59％に上昇した（第７図）。アン
チセンスオリゴヌクレオチド化合物２あるいは対照オリ
ゴヌクレオチド化合物５による処理では、腫瘍壊死因子
による処理を行わなければ、単層に接着する細胞数には
変化がなかった（第７図）。アンチセンスオリゴヌクレ
オチド、すなわち化合物２では、接着細胞数が添加細胞
全体の59％から17％に減少した（第７図）。反対に、対
照ヌクレオチド化合物５では、腫瘍壊死因子で処理した
内皮細胞単層に接着する細胞数を有意に減少させること
はなく、すなわち化合物５で処理した細胞に関しては、
加えられた全細胞の53％であるのに対し、対照細胞は59
％であった。

以上のデータにより、アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドにより内皮細胞上のICAM−１の発現を阻害することが
可能であり、そのICAM−１の発現の阻害は好中球様細胞
の内皮単層への接着が配列に特異的な様式で減少するこ
とと関連していることが示されている。ELAM−１および
VCAM−１のような他の分子も白血球の内皮細胞への接着
を媒介するので、接着を完全に遮断することは期待でき
ない。

実施例３ オリゴヌクレオチドおよび類似体の合成と特徴の決定 沃素酸化による標準ホスホアミダイト化学を使用し
て、自動DNA合成機（Applied Biosystems社製、380B
型）を用いて、非修飾DNAオリゴヌクレオチドを合成し
た。β−シアノエチルジイソプロピル−ホスホアミダイ
トは、アプライドバイオシステム社（Applied Biosyst
ems社、ホスター市、カリフォルニア州）より購入し
た。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの場合は、
標準酸化ボトルを0.2Mの3H−１、２−ベンゾジチオール
−３−オン １、１−ジオキサイドを含有するアセトニ
トリル溶液に変えて、ホスファイット結合の段階的なチ
エーション（thiation）を行った。チエーションサイク
ルでの待ち工程を68秒に増加し、次にキャッピング工程
を行った。

２′−Ｏ−メチル β−シアノエチルジイソプロピル
−ホスホアミダイト（ケミジェーン、ニードハム、マサ
チューセッツ州:Chemgenes、Needham MA）を用い、非
修飾オリゴヌクレオチドの標準サイクルに従って、２′
−Ｏ−メチル ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
を合成した。ただし、テトラゾールおよび塩基のパルス
送りだしの後の待ち工程を360秒に増加させた。合成開
始に用いる３′−塩基は２′−デオキシリボヌクレオチ
ドであった。

５′−ジメトキシトリチル−３′−ホスホアミダイト
を用いて２′−フルオロホスホロチオエートオリゴヌク
レオチドを合成し、米国特許出願番号第463358号（1990
年１月11日出願）および第566977号（1990年８月13日出
願）（いずれの出願も本出願として同一の受託人に受託
されており、本願には参考文献として引用した）に開示
されている方法に従って調製した。この２′−フルオロ
オリゴヌクレオチドの調製ではホスホアミダイト化学を
用い、また標準DNA合成手順を多少変え、脱保護はメタ
ノール性アンモニアを用いて室温で行った。

オリゴヌクレオチドの精製は、制御された細孔ガラス
カラム（Applied Biosystems社製）から切断し濃水酸
化アンモニウムで55℃において18時間脱ブロッキングし
た後、0.5MNaClを２倍量のエタノールに溶かした溶液か
ら２回沈殿させることにより行った。次に20％アクリル
アミド、8M尿素、45mMTris−ほう酸緩衝液（pH7.0）に
より、ゲル電気泳動を行って分析したところ、オリゴデ
オキシヌクレオチドおよびそのホスホロチオエート類似
体は、80％以上が完全長であると判断された。

RNAオリゴヌクレオチドの合成は、ABIモデル380BDNA
合成機を用いて行った。標準合成サイクルを変え、テト
ラゾールのパルス送りだしの後の待ち工程を900秒に延
長した。塩基はメタノール性アンモニア中で一晩インキ
ュベーションすることにより脱保護を施した。脱保護次
にオリゴヌクレオチドを真空下で乾燥させた。２′−ヒ
ドロキシルを保護しているｔ−ブチルジメチルシリル
は、オリゴヌクレオチドを1Mテトラブチルアンモニウム
フロリドのテトラヒドロフラン溶液で一晩インキュベー
ションすることにより除去した。さらにRNAオリゴヌク
レオチドをC₁₈Sep−Pakカートリッジ（ウォーターズ、
ミリポア社、ミルホード、マサチューセッツ州:Water
s、Division of Millipore Corp.社製、Milford M
A）で精製し、エタノールで沈殿させた。

この合成で得られたホスホロチオエートおよびホスホ
ジエステル結合の相対量は、³¹P NMR分光光度測定によ
り周期的にチェックした。このスペクトルは、酸化重水
素あるいはジメチルスルフォキシド−d₆を用い周囲温度
で得られた。ホスホロチオエートサンプルは典型的には
１％より少ないホスホジエステル結合を含有した。

PRP−１カラム（ハミルトン社、レノ、ネバタ州）で
トリチル−オンHPLCにより、50mM酢酸トリエチルアンモ
ニウム（pH7.0）溶液中のアセトニトリルのグラジエン
トをかけて（30分で４ないし32％、流速:1.5ml/分）オ
リゴヌクレオチドを精製し、二次評価を行った。このHP
LCで集めた適切なフラクションを蒸発させ、５％の酢酸
により周囲温度で15分間処理した。溶液を当量の酢酸エ
チルで抽出し、水酸化アンモニウムで中和し、凍結乾燥
させた。こうしてHPLCにより精製したオリゴヌクレオチ
ドは、ELISAアッセイでICAM−１の発現を判定した結
果、析出により得られたオリゴヌクレオチドと効力の点
で有意な相違のないことが認められた。

実施例 ４ 細胞培養およびオリゴヌクレオチドによる処理 ヒト肺癌細胞系A549は、アメリカンタイプカルチャー
コレクション（ベセスダ、メリーランド州:Bethesda M
D）より入手した。細胞の増殖は、1gmグルコース/1およ
び10％牛胎児血清（イリビン サイエンティフィック
社:Irvine Scientific社製）を含有するダルベッコ改
良イーグル培地（Irvine Scientific社製、Irvine C
A）で行った。ヒト臍体静脈内皮細胞（HUVEC）（クロー
ンテック社，サンディエゴ、カリフォルニア:Clonetic
s,San Diego CA）は、EGM−UV培地（クローンテック
社製）で培養した。使用したHUVECは第２代と第６代と
の間である。ヒト上皮癌A431細胞はアメリカンタイプカ
ルチャーコレクションより入手し、グルコース4.5g/lを
添加したDMEM中で培養した。初代ヒトケラチノサイトは
クローンテックより入手し、KGM（ケラチノサイト増殖
培地、クローンテック社製）にて増殖させた。

96ウエルプレートで増殖させた後細胞は、予め37℃に
暖めておいたOpti−MEM（ギブコ社製、グランドアイラ
ンド、ニューヨーク:GIBCO社製、Grand Island、NY）
で３回洗浄した。HUVECの場合は10μg/mlのＮ−［１−
（２、３−ジオレイルオキシ）プロピル］−N,N,N−ト
リメチル塩化アンモニウム（ドットマ:DOTMAベセスダリ
サーチラボ、ベセスダ、MD）を含有し、またA549細胞の
場合には20μg/mlのDOTMAを含有する100μｌのOpti−ME
Mのいずれかを、各ウェルに添加した。オリゴヌクレオ
チドの殺菌は、0.2μｍのセントレックス（Centrex）の
酢酸セルロースフイルタ（シュライヒャーアンドシゥエ
ル社製:Schleicher and Schuell社製、Keene、NH）を
通す遠心分離により行った。

そしてこのオリゴヌクレオチドを20x貯蔵溶液として
ウエルに添加し、37℃にて４時間インキュベーションし
た。培地の交換は、指定された濃度のオリゴヌクレオチ
ドを含有する適切な成長培地150μｌで行った。そして3
7℃においてさらに３ないし４時間のインキュベーショ
ンを行い、前記のように適切なサイトカインで14ないし
16時間刺激を行った。実施例１に記載されるように、IC
AM−１発現が測定された。オリゴヌクレオチドによる最
初の４時間のインキュベーションにDOTMAを添加したこ
とにより、オリゴヌクレオチドの効力は少なくとも100
倍に上昇した。この効力の増加はオリゴヌクレオチドの
細胞への取り込みの増加と関係がある。

実施例５ インターロイキン−１βで刺激した細胞におけるICAM−
１遺伝子発現に対する活性に関してさらなるアンチセン
スオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体
のELISAスクリーニング まず、ヒトICAM−1mRNA上の５つの標的部位とハイブ
リッド形成を行うように、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドを設計した。オリゴヌクレオチドの合成では、ホス
ホジエステル（Ｐ＝O;ISIS1558、1559、1563、1564、お
よび1565）とホスホロチオエート（Ｐ＝S;ISIS 1570、
1571、1572、1573、および1574）の両方の形態を作成し
た。表１にオリゴヌクレオチドとその類似体が示されい
る。

実施例１ではオリゴヌクレオチドあるいはオリゴヌク
レオチド類似体による、インターロイキン−１β刺激を
受けた細胞表面上でのICAM−１の発現の阻害をELISAア
ッセイにより定量した例が示されている。ここでは２種
の異なる細胞系でオリゴヌクレオチドを試験している
が、どのホスホジエステルオリゴヌクレオチドもICAM−
１発現を阻害しなかった。これは、細胞内でホスホジエ
ステルオリゴヌクレオチドが速く分解してしまうためだ
と思われる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの
場合は５種類の内ISIS1570が最も活性が高く、これは翻
訳開始コドンAUGとハイブリッド形成する。

基本的な５種類の標的で得られた初期データに基づ
き、ICAM−1mRNAとハイブリッド形成を行うオリゴヌク
レオチドをさらに12種類（ISIS1930、1940、および306
7、第１表参照）設計した。第８図に示されているよう
に、転写開始部位（５′キャップ部位）と予測されてい
る部位とハイブリッド形成を行うアンチセンスオリゴヌ
クレオチド（ISIS3067）の活性は、IL−１β−刺激細胞
において、AUGコドンとハイブリッド形成するオリゴヌ
クレオチド（ISIS1570）とほとんど同じ程度であった。
ISIS1931および1932は、各々翻訳開始コドンAUGの５′
と３′にハイブリッド形成を行う。AUG領域にハイブリ
ッド形成する３種類のオリゴヌクレオチドはすべてICAM
−１の発現を阻害するが、ISIS1932の活性はISI1580お
よびISIS1931に比較してわずかに低い。ICAM−1mRNAの
コード領域とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド
（ISIS1933、1934、1935、1574、および1936）の示す活
性は低い。翻訳終止コドンとハイブリッド形成するオリ
ゴヌクレオチド（ISIS1937および1938）の示す活性はゆ
るやかである。驚くべきことに、最も活性の高いアンチ
センスオリゴヌクレオチド、すなわちISIS1939が標的と
するのは、ICAM−1mRNAの３′−非翻訳領域の特異的配
列である。このISIS1939に実証されたアンチセンス活性
は、３′−非翻訳配列とハイブリッド形成する他のオリ
ゴヌクレオチド（ISIS1572、1573、1940）では示されな
かった。実際、ポリアデニル化信号を標的とするISIS19
40はICAM−１発現を阻害しなかった。

もとの試験した16種類のオリゴヌクレオチドの中で
は、ISIS1939が予想に反して最大のアンチセンス活性を
示したため、他のオリゴヌクレオチドもICAM−1mRNAの
３′−非翻訳領域の配列とハイブリッド形成するように
設計された（表１に示されているように、ISIS2302、23
03、2304、2305、および2307）。この中では、ISI1939
標的の３′末端より５つの塩基のみの部位とハイブリッ
ド形成するISIS2307が最も活性が低かった（第８図参
照）。ISIS1939の標的に対して３末端より14 ３個目の
塩基においてICAM−1mRNAとハイブリッド形成するISIS2
302は最も活性が高く、ISIS1939に匹敵する。ヒトICAM
−1mRNAの３′−非翻訳領域のRNAの予測される二次構造
を調べたところ（M.Zuker、Science、244:48−52,198
9）、ISIS1939とISIS2302のいずれもが安定なステム／
ループ構造と思われる配列にハイブリッド形成している
ことがわかった。現在のドグマでは、アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを設計する場合、RNA二次構造の領域は
回避すべきであると示唆されている。従ってISIS1939お
よびISIS2302がICAM−１の発現を阻害するとは予測され
ていない。

２′位置に修飾を含む数種類のアンチセンスオリゴヌ
クレオチド類似体についても分析を行った。ISIS1570の
２′−Ｏ−メチルホスホロチオエート類似体であるISIS
2974は、HUVECおよびA549細胞のいずれにおいてもICAM
−１の発現を阻害する活性がISIS1570の３分の１程度で
ある。これとは対照的に、ISIS1939の２′−Ｏ−メチル
フオスフォロチオエート類似体であるISIS2973は、前記
いずれの細胞系においてもICAM−１の発現を抑制できな
かった。ISIS1570の２′−フルオロ類似体であるISIS19
39についても同様の結果であった（それぞれISIS2634お
よび2637）。

対照オリゴヌクレオチドISIS1821の場合には、HUVEC
細胞のICAM−１発現をISIS1934に匹敵する効力で阻害
し；しかし、A549細胞においては、ISIS1821はISIS1934
より効果が低かった。陰性コントロールであるISIS1821
もICAM発現に対してわずかな活性を有することが分かっ
たが、これはおそらく（13個の塩基適合の内12個が）AU
G翻訳開始コドンに対して３′末端より15個の塩基にお
いてICAM−1mRNAとハイブリッド形成し得ることが、部
分的な原因と思われる。

この試験では、ICAM−1mRNAのAUG翻訳開始コドンおよ
び特異的な３′−非翻訳配列が、ICAM−１発現のアンチ
センスオリゴヌクレオチド阻害を最も受けやすいことが
示されている。

ヒト臍帯静脈細胞およびヒト肺癌細胞（A549）におい
てICAM−１の発現を阻害することに加えて、ISIS1570、
ISIS1939、およびISIS2302は、ヒト表皮癌A431細胞およ
び初期のヒトケラチノサイトにおいてICAM−１の発現を
阻害することが示された（第９図参照）。このデータに
より、アンチセンスオリゴヌクレオチドはいくつかのヒ
ト細胞系でのICAM−１の発現を阻害することが実証す
る。さらに、試験を行ったこの４種類の細胞系におい
て、オリゴヌクレオチドの効力の順序関係は同じであっ
た。初期ヒトケラチノサイトにおいてICAM−１発現を阻
害することができたという事実は、表皮ケラチノサイト
がアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的として意図さ
れるために重要である。

実施例６ その他のサイトカインにより刺激された細胞におけるIC
AM−１発現のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる阻
害 ISIS1570およびISIS1939の２種類のオリゴヌクレオチ
ドについて、TNF−αおよびTFN−γ誘導性ICAM−１を阻
害する能力について試験を行った。A549細胞を１μＭア
ンチセンスオリゴヌクレオチドで処置したところ、IL−
１β、TNF−α、およびIFN−γ誘導性ICAM−１の発現が
配列特異的に阻害された。アンチセンスオリゴヌクレオ
チドはIL−１βとTNF−α誘導性ICAM−１発現を同程度
阻害したが、IFN−γ誘導性ICAM−１の発現はアンチセ
ンス阻害に対してより感受性であった。一方対照オリゴ
ヌクレオチドであるISIS1821では、以下に示されるよう
に、IL−１βあるいはTNF−α誘導性ICAM−１発現を有
意に阻害することはなく、IFN−γ誘導性ICAM−１の発
現をわずかに阻害した。

実施例７ センス鎖対照により消失するアンチセンス効果 オリゴヌクレオチドISIS1570およびISIS1939によるIC
AM−１発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害は、
オリゴヌクレオチドを各々のセンスストランドとハイブ
リッド形成させることにより、消失させることができ
る。ISI1570のホスホロチオエートセンスストランド（I
SIS1575）では、単独に使用した場合、IL−１β誘導性I
CAM−１の発現をわずかに促進する。細胞に添加する前
にISIS1570を等モル量のISIS1575と予め混合させると、
ISIS1570の効力を遮断してしまう。ISIS1939の相補鎖
（ISIS2115）では細胞に単独に添加した場合のICAM−１
の発現を46％まで上昇させる。ISIS2115をISIS1939に予
めハイブリッド形成させると、ISIS1939によりICAM−１
の発現阻害は完全に遮断されてしまう。

実施例８ オリゴヌクレオチドTm（オリゴヌクレオチドが標的から
解離する温度）の計測 アンチセンスオリゴヌクレオチドによるICAM−１発現
の阻害効力がオリゴヌクレオチドの標的部位への親和性
によるものであるかどうかを調べるために、各オリゴヌ
クレオチドについて熱力学的な計測を行った。まずアン
チセンスオリゴヌクレオチド（ホスホロチオエートとし
て合成されたもの）をその相補的なDNA配列（ホスホジ
エステルとして合成されたもの）とハイブリッド形成さ
せた。吸光度と温度との関係は、100mMのNa＋、10mMの
燐酸、0.1mMのEDTA（pH7.0）中に４μＭの各鎖オリゴヌ
クレオチドを溶解させて計測した。二重鎖形成のTmおよ
び自由エネルギーは、線状傾斜基線値の二状態モデルに
対するデータの調整（fits）から得られた（Petershei
m、M.およびD.H.Turner（1983）Biochemistry、22:256
−263）。少なくとも３回試験を行い、その平均を結果
とした。

アンチセンスオリゴヌクレオチドにその相補的なDNA
配列（ホスホジエステルとして合成されたもの）とハイ
ブリッド形成をさせると、ISIS1940以外のすべてのアン
チセンスオリゴヌクレオチドのTmは最低50℃であった。
従って標的配列が露出していれば、オリゴヌクレオチド
はすべて標的ICAM−1mRNAにハイブリッド結合すること
が可能であるはずである。意外なことに、アンチセンス
オリゴヌクレオチドの効力は、TmあるいはG゜37と直接
的には関連していない。生物活性が最大のオリゴヌクレ
オチド、ISIS1939が示したTmは他の大部分のオリゴヌク
レオチドのTmより小さかった。従ってハイブリッド形成
親和性だけでは、生物活性を保証するのに十分ではな
い。

実施例９ ICAM−１発現に対するアンチセンス阻害に与えるオリゴ
ヌクレオチドの長さの影響 ISIS1570の短縮型（ISIS2165、2173、2149、2163、お
よび2164）とISIS1939の短縮型（ISIS2540、2544、254
5、2546、2547、および2548）を用いて、オリゴヌクレ
オチドの長さがアンチセンス活性に与える影響を試験し
た。一般的にはオリゴヌクレオチドの長さが短くなる
と、アンチセンス活性も減少した。16塩基のオリゴヌク
レオチドが示す活性は18塩基のオリゴヌクレオチドより
もわずかに低かった。14塩基オリゴヌクレオチドの場合
はよれより有意に活性が低く、12塩基あるいは10塩基で
は弱い活性しか認められなかった。オリゴヌクレオチド
の長さ、Tm、およびアンチセンス活性の関係を調べたと
ころ、14塩基から16塩基の間で鋭い転移が見られ、一方
Tmと長さの関係は直線的であった（第10図参照）。

実施例10 ICAM−１に対するアンチセンス阻害の特異性 アンチセンスオリゴヌクレオチドISIS1570およびISIS
1939のICAM−１に対する特異性を、³⁵Sラベル化タンパ
ク質の免疫沈降を用いて評価した。A549細胞を25cm²組
織培養フラスコで集密状態になるまで増殖させ、実施例
４に記載されているアンチセンスオリゴヌクレオチドで
処理した。細胞をインターロイキン１−１βで14時間刺
激を与え、メチオニン非含有DMEMと10％透析ウシ胎児血
清で洗浄し、指示されているように10％透析ウシ胎児血
清、１μＭオリゴヌクレオチド、およびインタロイキン
−１βを含むメチオニン非含有培地で１時間インキュベ
ーションした。³⁵S−メチオニン／システイン混合物（T
ran³⁵S−ラベル、ICN社より購入、コスタ メサ、カリ
フォルニア:Costa Mesa、CA）を100μCi/ml活性となる
まで添加し、さらに２時間インキュベーションした。細
胞タンパク質の抽出は、50mMTris−HCl（pH8.0）、150m
MNaCl、1.0％NP−40、0.5％デオキシコール酸、および2
mMEDTA（0.5ml/ウエル）で４℃において30分インキュベ
ーションすることによって行った。抽出物は18000xgで2
0分間遠心分離することにより清澄化し、得られた上清
は200μｌのプロテインＧ−セフアロースビーズ（ベセ
スダリサーチラボ、ベセスダ、メリーランド）で４℃に
おいて２時間予め吸着させ、等量に分割し、５μｇのIC
AM−１モノクローナル抗体（アオック社より購入、ウエ
ストブロック、メリーランド:AMAC Inc.、Westbrook
Me）あるいはHLA−Ａ、Ｂ抗体（W6/32、アメリカンタイ
プカルチャーコレクション、ベセスダ，メリーランドよ
り入手したネズミハイブリドーマ細胞より生成）のいず
れかで４℃において15時間インキュベーションした。免
疫複合体は、プロテインＧ−セフアロース（v/v）の50
％懸濁液200μｌで４℃において２時間インキュベーシ
ョンすることにより閉じこめ、溶解バッファで５回洗浄
し、SDS−ポリアクリルアミドゲル上で分析した。タン
パク質の検出はオートラジオグラフで行った。

A549細胞を５単位/mlのインターロイキン−１βで処
理したところ、95−100キロダルトンのタンパク質が二
両体として移動し、ICAM−１に対するモノクローナル抗
体と共に免疫沈降した。二両体の出現は、ICAM−１のグ
リコシル化が相違しているからだと考えられる。細胞を
１μＭ濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドISIS1570
で予め処理すると、ICAM−１の合成が約50％まで低下
し、一方１μＭのISIS1939ではICAM−１の合成はバック
グラウンド付近にまで低下した。アンチセンスオリゴヌ
クレオチド1940はICAM−１のELISAアッセイでは不活性
であったが（実施例１および５）、ここでもICAM−１の
合成を有意に減少させることはなかった。ICAM−１標的
とハイブリッド形成が可能なアンチセンスオリヌクレオ
チドでHLA−Ａ、Ｂ合成に効果が実証されたものはな
く、オリゴヌクレオチドがICAM−１に特異的であること
が実証されている。さらに、ICAM−１抗体およびプロテ
インＧ−セフアロースと非特異的に沈澱するタンパク質
は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを処理することで
有意に影響を受けることはなかった。

実施例11 ICAM−１に対する活性を示すさらなるアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドおよびその類似体の細胞接着アッセイに
よるスクリーニング 実施例４に示されているように、ヒト臍帯静脈内皮細
胞（HUVEC）を増殖させ、オリゴヌクレオチドで処理し
た。細胞の処理は、アンチセンスオリゴヌクレオチドIS
IS1939、不活性アンチセンスオリゴヌクレオチド1940、
あるいは対照オリゴヌクレオチドISIS1821で４時間行
い、次にTNF−αで20時間刺激し、基本HUVECがHL−60細
胞に結合する量は極微量であるが、TNF−α刺激HUVECは
添加した細胞全体の19％に結合した。第11図に示されて
いるように、HUVECの単層を予め0.3μＭのISIS1939で処
理すると、HL−60細胞への接着は基本レベルにまで低下
した。対照オリゴヌクレオチドISIS1821および不活性オ
リゴヌクレオチドISIS1940で処理した場合には、細胞の
接着率は19％から９％に減少した。上記の３つのデータ
より、ICAM−１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレ
オチドにより、白血球様細胞系（HL−60）のTNF−α−
処理HUVECへの接着を特異的に減少することが示されて
いる。

実施例12 ELAM−１遺伝子発現に対するさらなるアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドおよびその類似体のELISAスクリーニン
グ 初期ヒト臍体静脈内皮細胞（HUVEC）の第２代ないし
第５代細胞を96ウエルプレートで培養し、集密状態とし
た。そしてOpti−MEM（GIBCO社製、Grand Island N
Y）で３回洗浄した。次に、10μg/mlDOTMA溶液（Bethes
da Research Labs社製、Bethesda MD）を含有するOp
ti−MEMで希釈した次第に濃度を上昇させたオリゴヌク
レオチドで、37℃において４時間処理した。培地の交換
はEGM−UV（Clonetics社製、San Diego、CA）およびオ
リゴヌクレオチドの混合物で行った。培地（2.5ng/ml）
には腫瘍え死因子αを添加し、さらに37℃において４時
間インキュベーションをした。

ELAM−１の発現はELISAにより測定した。まず細胞を
予め37℃に加温しておいたダルベッコ燐酸緩衝生理食塩
水（Ｄ−PBS）で穏やかに３回洗浄した。そして95％エ
タノールで４℃において20分間固定し、Ｄ−PBSで３回
洗浄し、２％BSA含有Ｄ−PBS溶液でブロッキングを行っ
た。次に２％BSA含有Ｄ−PBS溶液で0.5μg/mlに希釈し
たELAM−１モノクローナル抗体BBA−１（Ｒ＆Ｄ Syste
ms社製、Minneapolis MN）で37℃において１時間イン
キュベーションした。細胞の洗浄はＤ−PBSにより３回
行い、実施例１に記載されているように、結合ELAM−１
抗体をビオチン化ヤギ抗−マウス二次抗体、続いてβ−
ガラクトシダーゼ結合ストレプトアビジンにより検出し
た。

ELAM−1cのDNAの11の異なる領域を標的とするアンチ
センスホスホチオエートオリゴヌクレオチド類似体と、
ICAM−１（対照といて）を標的とする２種類のオリゴヌ
クレオチドの活性は、ELAM−1ELISAを用いて測定した。
表２には、オリゴヌクレオチド類似体とその標的が示さ
れている。

ICAM−１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドで観察された（実施例５）こととは対照的に、ELAM−
１活性の最も強力なオリゴヌクレオチド変調体（modula
tor）（ISIS2679）は、ELAM−１の５′非翻訳領域の特
異的な配列とハイブリッド形成を行った。ISIS2679標的
の上流の最後の３つの塩基配列とハイブリッド形成を行
ったオリゴヌクレオチド、ISIS2687では、有意な活性を
示さなかった（第12図参照）。従って、ISIS2679がハイ
ブリッド形成をするELAM−1mRNAの単一部位は、アンチ
センスオリゴヌクレオチドでの阻害に対して独特の感受
性を示す部位であることがわかる。この部位のアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの阻害に対する感受性は、RNA
の二次構造や文献に記載された情報から予測することは
できなかった。ELAM−1AUGコドンとハイブリッド形成を
行うオリゴヌクレオチド（ISIS2683およびISIS2686）は
軽度の活性を示す（第12図参照）。

配列表 （１）一般情報 （ｉ）出願人：ベネットら（Bennett et al.,） （ii）発明の名称：細胞接着のオリゴヌクレオチド変
調 （iii）配列の数:39 （iv）書信連絡先： （Ａ）住所：ウッドコックウォシュバーン クルツ
アンド ノリス（Woodcock Washburn Kurtz Macki
ewicz ＆ Norris） （Ｂ）地区：ワン リバティ プレイス46階（One
Liberty Place−46th Floor） （Ｃ）都市：フィラデルフィア（Philadelphia） （Ｄ）州：ペンシスバニア（PA） （Ｅ）国：米国（USA） （Ｆ）郵便番号:19103 （ｖ）コンピュータ読み取り形式： （Ａ）中型：小型ディスク、3.5インチ、記憶容量
1.44Mb （Ｂ）コンピュータ:IBM PS/2 （Ｃ）操作システム:PC−DOS （Ｄ）ソフトウエア：ワードパーフエクタ5.0 （vi）現在の出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）以前の出願データ （Ａ）出願番号:567286 （Ｂ）出願日:1990年８月14日 （viii）弁理士／代理人に関する情報： （Ａ）氏名：ジェーン マッシィ リカタ（Jane
Masey Licata） （Ｂ）登録番号:32257 （Ｃ）参照／通し番号:ISIS−0334 （ix）通信情報： （Ａ）電話番号：（215）568−3100 （Ｂ）フアックス：（215）568−3439 （２）配列番号1:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:18 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号1: TGGGAGCCAT AGCGAGGC 18 （２）配列番号2:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:20 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号2: GAGGAGCTCA GCGTCGACTG 20 （２）配列番号3:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号3: GACACTCAAT AAATAGCTGG Ｔ 21 （２）配列番号4:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:18 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号4: GAGGCTGAGG TGGGAGGA 18 （２）配列番号5:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:18 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号5: CGATGGGCAG TGGGAAAG 18 （２）配列番号６に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:20 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号6: GGGCGCGTGA TCCTTATAGC 20 （２）配列番号７に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:20 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号7: CATAGCGAGG CTGAGGTTGC 20 （２）配列番号８に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:20 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号8: CGGGGGCTGC TGGGAGCCAT 20 （２）配列番号９に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:20 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号9: AGAGCCCCGA GCAGGACCAG 20 （２）配列番号10に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:20 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号10: TGCCCATCAG GGCAGTTTGA 20 （２）配列番号11に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:20 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号11: GGTCACACTG ACTGAGGCCT 20 （２）配列番号12に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:20 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号12: CTCGGGTG ACCTCCCCTT 20 （２）配列番号13に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:20 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号13: TCAGGGAGGC GTGGCTTGTG 20 （２）配列番号14:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:20 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号14: CCTGTCCCGG GATAGGTTC Ａ 20 （２）配列番号15:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:20 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号15: CCCCCACCAC TTCCCCTCTC 20 （２）配列番号16:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:20 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号16: TTGAGAAAGC TTTATTAACT 20 （２）配列番号17:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:14 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号17: AGCCATAGCG AGGC 14 （２）配列番号18:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:12 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号18: CCATAGCGAG GC 12 （２）配列番号19:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:10 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号19: ATAGCGAGGC 10 （２）配列番号20:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:16 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号20: TGGGAGCCAT AGCGAG 16 （２）配列番号21:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:16 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号21: GGAGCCATAG CGAGGC 16 （２）配列番号22:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:20 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号22: GCCCAAGCTG GCATCCGTCA 20 （２）配列番号23:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:20 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号23: TCTGTAAGTC TGTGGGCCTC 20 （２）配列番号24:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:20 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号24: AGTCTTGCTC CTTCCTCTTG 20 （２）配列番号25:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:20 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号25: CTCATCAGGC TAGACTTTAA 20 （２）配列番号26:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:20 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号26: TGTCCTCATG GTGGGGCTAT 20 （２）配列番号27:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:22 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号27: TCTGAGTAGC AGAGGAGCTC GA 22 （２）配列番号28:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:22 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号28: CAATCATGAC TTCAAGAGTT CT 22 （２）配列番号29:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:20 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号29: ACCACACTGG TATTTCACAC 20 （２）配列番号30:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号30: GTATGGAAGA TTATAATATA Ｔ 21 （２）配列番号31:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号31: CACAATCCTT AAGAACTCTT Ｔ 31 （２）配列番号32:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:20 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号32: ACCTCTGCTG TTCTGATCCT 20 （２）配列番号:33に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:20 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号33: CTGCTGCCTC TGTCTCAGGT 20 （２）配列番号:34に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:15 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号34: GGTATTTGAC ACAGC 15 （２）配列番号:35に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号35: AATCATGACT TCAAGAGTTC Ｔ 21 （２）配列番号36:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号36: TGAAGCAATC ATGACTTCAA Ｇ 21 （２）配列番号37:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号37: TATAGGAGTT TTGATGTGAA 21 （２）配列番号38:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号38: ACAATGAGGG GGTAATCTAC Ａ 21 （２）配列番号39:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （iv）アンチセンスの有無：有 （xi）配列：配列番号39: GACAATATAC AAACCTTCCA Ｔ 21

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平４−502859（ＪＰ，Ａ) Ｊ．ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｖｔｅ, Ｖｏｌ．81，Ｎｏ．20（1989）ｐ．1539 −1544 Ｐｈａｒｍａｃｅｖｔｉｃａｌ Ｒｅ ｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．９ （1988）ｐ．539−549 Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．52（1988）Ｐ. 925−933 Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．59（1989) Ｐ．1160−1164 Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．59（1989）Ｐ. 1203−1211

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号１、３、４、５、７、10、14、1
   5、22、23、24、25、26、27、33、35もしくは36に規定
   される配列または配列TCTGAGTAGCAGAGGAGCTCを有するホ
   スホロチオエートオリゴヌクレオチド。
2. 【請求項２】mRNAと特異的にハイブリッド形成しうる、
   請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
3. 【請求項３】遺伝子と特異的にハイブリッド形成を行
   い、三重鎖構造を形成してこの遺伝子由来のmRNAの量を
   変調させる、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
4. 【請求項４】細胞接着分子の発現に関連する疾患を治療
   するための医薬組成物であって、配列番号１、３、４、
   ５、７、10、14、15、22、23、24、25、26、27、33、35
   もしくは36に規定される配列または配列TCTGAGTAGCAGAG
   GAGCTCを有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
   および医薬として許容される担体を含む組成物。
5. 【請求項５】前記オリゴヌクレオチドが、mRNAと特異的
   にハイブリッド形成しうる、請求項４記載の組成物。
6. 【請求項６】前記オリゴヌクレオチドが、遺伝子と特異
   的にハイブリッド形成を行い、三重鎖構造を形成してこ
   の遺伝子由来のmRNAの量を変調させる、請求項４記載の
   組成物。