JP2731344B2 - Mutant human lysozyme - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】本発明は、組換ＤＮＡ技術による変異型ヒ
トリゾチームおよびその製造に関するものである。より
詳しくは、本発明は、天然型ヒトリゾチーム(以下、単
にヒトリゾチームともいう)のアミノ酸配列の第７４位
のＶと第７５位のＮの間に細胞接着活性を有するアミノ
酸配列が挿入された変異型ヒトリゾチームをコードして
いる変異型ヒトリゾチーム遺伝子、該遺伝子を含有して
いる発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された形
質転換体、該形質転換体を用いてヒトリゾチーム活性お
よび挿入されたアミノ酸配列に基づく細胞接着活性を有
するタンパク質を製造する方法、並びにこのようにして
製造された変異型ヒトリゾチームに関するものである。[0001] The present invention relates to a mutant human lysozyme by recombinant DNA technology and its production. More specifically, in the present invention, an amino acid sequence having cell adhesion activity is inserted between V at position 74 and N at position 75 in the amino acid sequence of natural human lysozyme (hereinafter, also simply referred to as human lysozyme). Mutant human lysozyme gene encoding mutant human lysozyme, expression vector containing the gene, transformant transformed with the expression vector, human lysozyme activity and inserted using the transformant The present invention also relates to a method for producing a protein having cell adhesion activity based on the amino acid sequence, and a mutant human lysozyme produced in this manner.

【従来の技術】[Prior art]

【０００２】リゾチームは１９２２年にフレミングによ
り発見された抗菌活性を有する酵素タンパク質であり、
細菌細胞壁のペプチドグリカンに作用してＮ−アセチル
グルコサミン(ＮＡＧ)とＮ−アセチルムラミン酸(ＮＡ
Ｍ)との間のβ−１,４結合を特異的に切断することによ
り、溶菌を引き起こす。その分布は動物、植物、バクテ
リオファージなどに広く認められており、ヒトではおも
にミルク、涙、尿などに見い出されているが、その生理
的意義はまだ完全には明らかにされていない。ヒトリゾ
チームは、１３０残基のアミノ酸からなる単純タンパク
質で、分子内に４対のジスルフィド結合を有する。その
立体構造はＡrtymiukとＢlakeにより解析が行なわれ(P.
J.Artymiuk, C.C.F.Blake, J.Mol.Biol., 152 737 198
1)、すでに完全なＸ線結晶解析がなされていたニワトリ
卵白リゾチームとほとんど等しい分子構造をもっている
ことがわかっている。一方、ＤＮＡ組換え技術により、
卵白リゾチームのシグナルペプチドにヒトリゾチームを
接続したタンパク質をコードするＤＮＡが化学合成さ
れ、これが酵母発現系においてヒトリゾチームと全く同
一のタンパク質を生産させることがすでに知られている
(K.Yoshimura et al.B.B.R.C. 145 712 1987, Y.Jigami
et al．Gene 43 273 1986)。この手法により現在まで
に多種の変異型ヒトリゾチームが創製され、リゾチーム
を用いたタンパク質の構造機能相関、安定性や折りたた
み機構に関して多くの成果が得られている(Y.Taniyama
et al．B.B.R.C．152 962 1988, Y.Taniyama et al．J.
B.C．2657570 1990など)。[0002] Lysozyme is an enzyme protein having antibacterial activity discovered by Fleming in 1922,
N-acetylglucosamine (NAG) and N-acetylmuramic acid (NA
By specifically cleaving the β-1,4 bond with M), lysis is caused. Its distribution is widely recognized in animals, plants, bacteriophages, etc., and in humans it is mainly found in milk, tears, urine, etc., but its physiological significance has not yet been completely elucidated. Human lysozyme is a simple protein consisting of 130 amino acids and has four pairs of disulfide bonds in the molecule. The three-dimensional structure was analyzed by Artymiuk and Blake (P.
J. Artymiuk, CCFBlake, J. Mol. Biol., 152 737 198
1) It is known that it has a molecular structure almost identical to that of chicken egg white lysozyme, for which complete X-ray crystallography has already been performed. On the other hand, by DNA recombination technology,
DNA encoding a protein in which human lysozyme is connected to the signal peptide of egg white lysozyme is chemically synthesized, and it is already known that this protein produces exactly the same protein as human lysozyme in a yeast expression system.
(K. Yoshimura et al. BBRC 145 712 1987, Y. Jigami
et al. Gene 43 273 1986). To date, a variety of mutant human lysozymes have been created by this method, and many results have been obtained regarding the structure-function relationship, stability and folding mechanism of proteins using lysozyme (Y. Taniyama
et al. BBRC. 152 962 1988, Y. Taniyama et al. J.
BC. 265 7570 1990).

【０００３】一方、フィブロネクチンは、コラーゲン、
エラスチン、プロテオグリカン、ラミニン、ビトロネク
チン、フィブリンなどと同様に細胞を取り囲む細胞外マ
トリックスの構成成分の一つであり、その分子内にヘパ
リン、フィブリン、コラーゲンなどの分子や細胞と相互
作用する部位を有する多機能性の糖タンパク質である。
約２２０ＫＤaの２本のサブユニットからなり、全体と
しては４４０ＫＤaぐらいの分子量を持つといわれてい
る。フィブロネクチンの細胞に対する相互作用、つまり
細胞接着という機能は、多細胞生物の発生と形態形成に
不可欠であるばかりでなく、臨床的にも創傷治癒、血栓
形成、癌転移などの病態の場においても重要な役割を演
じていることが知られている。また、フィブロネクチン
の合成ペプチドを用いたＰierschbacherとＲuoslahtiの
研究から(M.D.Pierschbacher ＆ E.Ruoslahti, Nature
309 30 1984)、フィブロネクチンの細胞に対する結合部
位がＲＧＤ(Ａrg−Ｇly−Ａsp)という簡単な配列よりな
ることが示され、この細胞接着シグナルは、フィブリノ
ーゲン、ラミニン、コラーゲン、ビトロネクチンなどに
も共通に存在し、機能している。さらにフィブロネクチ
ンに対する細胞表面のレセプターも遺伝子が同定され、
他の細胞外マトリックスに関するレセプターと相同性が
あり、インテグリンファミリーとよばれている(E.Ruosl
ahti, Ann.Rev.Biochem．57 375 1988)。このように細
胞接着という重要な生体機能がＲＧＤという簡単な配列
に収束できたことはきわめて興味深く、この接着シグナ
ルの立体構造に関しても情報が待たれているところであ
る。そこで、本発明者らは、以前、ＲＧＤ配列を含む細
胞接着機能部位の高次構造を解析できるようなキメラ蛋
白質を創製することを目的とし、ヒトリゾチームにＲＧ
Ｄ配列を含むペプチドを挿入した多機能性のキメラ蛋白
質(たとえば、ＲＧＤＳを挿入したＲＧＤ４やＴＧＲＧ
ＤＳＰＡを挿入したＲＧＤ８)を創製した(T.Yamada et
al.J.B.C. 268 10588 1993)。ヒトリゾチームは本発
明者らによってすでに精密なＸ線結晶解析が完了し、そ
の立体構造の全容が明らかになっている。ヒトリゾチー
ム−ＲＧＤキメラ蛋白質がヒトリゾチームと類似の立体
構造をとるならば、ＲＧＤ配列を含む挿入ペプチド部分
の構造解析はきわめて容易になってくると考えられる。
事実、創製したＲＧＤ４およびＲＧＤ８蛋白質はＸ線結
晶構造解析が比較的、容易に行われ、その解析結果か
ら、これらキメラ蛋白質のＲＧＤ配列はきわめてflexib
ilityの高い領域に存在することが示された(T.Yamada e
t al.J.B.C．268 105881993)。[0003] On the other hand, fibronectin is collagen,
Like elastin, proteoglycan, laminin, vitronectin, fibrin, etc., it is one of the components of the extracellular matrix that surrounds cells, and contains molecules such as heparin, fibrin, collagen, etc. It is a functional glycoprotein.
It consists of two subunits of about 220 KDa, and is said to have a molecular weight of about 440 KDa as a whole. The interaction of fibronectin with cells, the function of cell adhesion, is not only essential for the development and morphogenesis of multicellular organisms, but also important in clinical situations such as wound healing, thrombus formation and cancer metastasis. Is known to play a significant role. In addition, a study by Pierschbacher and Ruoslahti using synthetic peptides of fibronectin (MDPierschbacher & E. Ruoslahti, Nature
309 30 1984), indicating that the binding site of fibronectin to cells consists of a simple sequence of RGD (Arg-Gly-Asp), and this cell adhesion signal is commonly present in fibrinogen, laminin, collagen, vitronectin, etc. And working. In addition, genes for cell surface receptors for fibronectin have been identified,
It has homology to receptors for other extracellular matrices and is called the integrin family (E. Ruosl
ahti, Ann. Rev. Biochem. 57 375 1988). It is very interesting that the important biological function of cell adhesion has converged to a simple sequence of RGD, and information on the three-dimensional structure of this adhesion signal is awaited. Accordingly, the present inventors have previously aimed at creating a chimeric protein capable of analyzing the higher-order structure of a cell adhesion function site containing an RGD sequence,
Multifunctional chimeric proteins into which a peptide containing the D sequence is inserted (for example, RGD4 or TGRG into which RGDS is inserted)
RGD8 into which DSPA was inserted) (T. Yamada et.
al. JBC 268 10588 1993). Precise X-ray crystallographic analysis of human lysozyme has already been completed by the present inventors, and the entire three-dimensional structure has been elucidated. If the human lysozyme-RGD chimeric protein has a three-dimensional structure similar to that of human lysozyme, it will be extremely easy to analyze the structure of the inserted peptide portion containing the RGD sequence.
In fact, the created RGD4 and RGD8 proteins can be easily and easily subjected to X-ray crystal structure analysis. From the analysis results, it can be seen that the RGD sequences of these chimeric proteins are extremely flexib
(T. Yamada e
t al. JBC. 268 105881993).

【課題を解決するための手段】[Means for Solving the Problems]

【０００４】本発明者らはＲＧＤ配列の細胞接着機能を
増強し、さらには、その機能構造を決定することが期待
できるキメラ蛋白質を創製した。創製した蛋白質はヒト
リゾチームの７４位のＶと７５位のＮの間にＣＲＧＤ
Ｃ、ＣＲＧＤＳＣおよびＣＧＲＧＤＳＣを挿入したキメ
ラ蛋白質である。ＲＧＤ配列を含有するペプチド(たと
えば、ＧＲＧＤＳＰなど)はそれ自身、細胞接着作用や
他の接着蛋白質がもつ接着活性を阻害する作用を有して
いるが、これらのペプチドを環化させることにより(た
とえば、(cyclo)ＧＲＧＤＳＰなど)、その作用が上昇す
ることが知られている(M.D.Pierschbacher ＆ E.Ｒuosl
ahti J.B.C．262 17294 1987, H.Kumagai et al.B.
B.R.C. 177 74 1991)。従って、本発明者らが創製し
たキメラ蛋白質においても、ＲＧＤ配列を取り囲む２つ
のシステイン残基がジスルフィド結合を形成することに
よりＲＧＤ領域が環化され、細胞接着活性が増強される
ことが十分に考えられる。また、ＲＧＤを含有するペプ
チドの場合と同様に、ＲＧＤ領域が環化されることによ
って、その構造が制約をうけ、構造決定を可能にするこ
とが期待できる。さらにこの立体構造に関する情報が得
られれば、ＲＧＤ配列を有する細胞接着シグナルに対す
るアゴニストやアンタゴニストが、ペプチドあるいは低
分子有機化合物でも設計できるであろう。しかも、細胞
接着という現象は創傷治癒、血栓形成、癌転移に関連性
が深いことから、設計されたアゴニストやアンタゴニス
トが臨床応用の場で利用される可能性は十分にあると考
えられる。また、ヒトリゾチーム−ＲＧＤキメラ蛋白質
自体に関しても、リゾチームに由来する抗菌作用とＲＧ
Ｄ配列に由来する創傷治癒作用を合わせ持つことから、
例えば角膜損傷時などにおける殺菌作用を伴った治療薬
として、臨床応用が期待できる。[0004] The present inventors have created a chimeric protein that can be expected to enhance the cell adhesion function of the RGD sequence and further determine its functional structure. The created protein is CRGD between V at position 74 and N at position 75 of human lysozyme.
It is a chimeric protein into which C, CRGDSC and CGRGDSC have been inserted. Peptides containing an RGD sequence (eg, GRGDSP and the like) themselves have an action of inhibiting cell adhesion and the adhesion activity of other adhesion proteins, but by cyclizing these peptides (eg, , (Cyclo) GRGDDSP, etc.), its action is known to increase (MDPierschbacher & E. Ruosl)
ahti JBC. 262 17294 1987, H. Kumagai et al. B.
BRC 177 74 1991). Therefore, even in the chimeric protein created by the present inventors, it is sufficiently considered that the two cysteine residues surrounding the RGD sequence form a disulfide bond, thereby cyclizing the RGD region and enhancing cell adhesion activity. Can be Further, as in the case of the peptide containing RGD, it can be expected that the cyclization of the RGD region limits the structure and enables the structure to be determined. Further, if information on the three-dimensional structure is obtained, an agonist or antagonist for a cell adhesion signal having an RGD sequence could be designed with a peptide or a low-molecular organic compound. Moreover, since the phenomenon of cell adhesion is closely related to wound healing, thrombus formation, and cancer metastasis, it is considered that there is a good possibility that the designed agonists and antagonists will be used in clinical applications. Further, regarding the human lysozyme-RGD chimeric protein itself, the antibacterial activity derived from lysozyme and RG
Because it has a wound healing effect derived from the D sequence,
For example, clinical application can be expected as a therapeutic agent having a bactericidal action at the time of corneal injury or the like.

【０００５】即ち、本発明は、天然型ヒトリゾチームの
アミノ酸配列の第７４位のＶと第７５位のＮの間に細胞
接着活性を有するアミノ酸配列が挿入されたポリペプチ
ドをコードしている変異型ヒトリゾチーム遺伝子を提供
するものである。挿入されるアミノ酸配列としては、Ｃ
ＲＧＤＣ、ＣＲＧＤＳＣおよびＣＧＲＧＤＳＣなどが挙
げられる。That is, the present invention relates to a mutation encoding a polypeptide having an amino acid sequence having cell adhesion activity inserted between V at position 74 and N at position 75 in the amino acid sequence of natural human lysozyme. And a human lysozyme gene. The amino acid sequence to be inserted is C
RGDC, CRGDSC, and CGRGDSC.

【０００６】また本発明は、上記の変異型ヒトリゾチー
ム遺伝子を含有する発現ベクターを提供するものであ
る。更に本発明は、上記の発現ベクターで形質転換され
た、変異型ヒトリゾチームを産生し、分泌し得る宿主細
胞を提供するものである。更に本発明は、上記の形質転
換宿主細胞を培養し、培養液中に分泌されたヒトリゾチ
ーム活性および挿入されたアミノ酸配列に基づく細胞接
着活性を有するタンパク質を分離し、所望により精製す
ることからなる変異型ヒトリゾチームの製造方法、およ
びこの方法によって製造された変異型ヒトリゾチームを
提供するものである。[0006] The present invention also provides an expression vector containing the above mutant human lysozyme gene. The present invention further provides a host cell capable of producing and secreting mutant human lysozyme transformed with the above-mentioned expression vector. Further, the present invention comprises culturing the above-mentioned transformed host cell, separating a protein having human lysozyme activity secreted into the culture solution and a cell adhesion activity based on the inserted amino acid sequence, and purifying the protein, if desired. It is intended to provide a method for producing a mutant human lysozyme, and a mutant human lysozyme produced by this method.

【０００７】本明細書に於いては、アミノ酸は以下に示
す一文字表示法によって記載されている。 Ｑ グルタミン Ｆ フェニルアラ
ニン Ｍ メチオニン Ｐ プロリン Ｎ アスパラギン Ｈ ヒスチジン Ｄ アスパラギン酸 Ｇ グリシン Ｉ イソロイシン Ｋ リジン Ｔ スレオニン Ａ アラニン Ｌ ロイシン Ｒ アルギニン Ｓ セリン Ｃ システイン Ｙ チロシン Ｗ トリプトファ
ン Ｅ グルタミン酸 Ｖ バリン[0007] In the present specification, amino acids are described by the one-letter designation method shown below. Q Glutamine F Phenylalanine M Methionine P Proline N Asparagine H Histidine D Aspartic acid G Glycine I Isoleucine K Lysine T Threonine A Alanine L Leucine R Arginine S Serine C Cysteine Y Tyrosine V Glutamin E Glutaline

【０００８】本発明の変異型ヒトリゾチーム遺伝子の調
製、該遺伝子を含有する発現ベクターの構築、該発現ベ
クターによる宿主細胞の形質転換、および得られた形質
転換体を用いる変異型ヒトリゾチームの製造は、全て本
出願人の出願に係る特開平１−８６８７６号に開示した
方法に準じて行われた。The preparation of the mutant human lysozyme gene of the present invention, the construction of an expression vector containing the gene, the transformation of a host cell with the expression vector, and the production of a mutant human lysozyme using the obtained transformant are described in US Pat. All the processes were performed according to the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-86876 filed by the present applicant.

【０００９】即ち、図１に示すように、天然のヒトリゾ
チームのアミノ酸配列をコードしている合成遺伝子を含
有する公知のプラスミドpＥＲＩ８６０２(特開平１−８
６８７６号)から、ＸhoＩ−ＳmaＩ制限断片を切り取っ
た。That is, as shown in FIG. 1, a known plasmid pERI8602 containing a synthetic gene encoding the amino acid sequence of natural human lysozyme (Japanese Patent Laid-Open Publication No.
No. 6876), an XhoI-SmaI restriction fragment was cut out.

【００１０】一方、挿入しようとするアミノ酸配列をコ
ードする部分およびヒトリゾチームのＸbaＩ−ＨincＩ
Ｉ部分を４本（上下各２本)のオリゴマーで合成し、Ｍ
１３mp１９hＬＺＭ ＲＦ ＤＮＡ(特開平１−８６８７６
号)のＸbaＩ−ＨincＩＩ部位に挿入して、Ｍ１３mp１９
Ｃys−ＲＧＤ３ ＲＦ ＤＮＡ、Ｍ１３mp１９ Ｃys−Ｒ
ＧＤ４ ＲＦ ＤＮＡおよびＭ１３mp１９ Ｃys−ＲＧＤ
５ ＲＦ ＤＮＡを得る。これをＸhoＩおよびＳmaＩで消
化することによって、所望のアミノ酸配列をコードして
いるヌクレオチド配列が挿入されたＸhoＩ−ＳmaＩ制限
断片を得る。On the other hand, a portion coding for the amino acid sequence to be inserted and XbaI-HincI of human lysozyme
The I portion is synthesized with four (upper and lower two) oligomers.
13 mp 19 h LZM RF DNA (Japanese Unexamined Patent Publication No. 1-86876)
No.) at the XbaI-HincII site to give M13mp19
Cys-RGD3 RF DNA, M13mp19 Cys-R
GD4 RF DNA and M13mp19 Cys-RGD
5 Obtain RF DNA. This is digested with XhoI and SmaI to obtain an XhoI-SmaI restriction fragment into which a nucleotide sequence encoding a desired amino acid sequence has been inserted.

【００１１】このＸhoＩ−ＳmaＩ断片をpＥＲＩ８６０
２のＸhoＩ−ＳmaＩ断片とライゲーションし、発現プラ
スミド、pＧＥＬＣys−ＲＧＤ３、pＧＥＬＣys−ＲＧＤ
４およびpＧＥＬＣys−ＲＧＤ５を構築する。これらの
プラスミドは全て同様にして構築されるが、代表的にp
ＧＥＬＣys−ＲＧＤ４の構築模式図を図１に示す。The XhoI-SmaI fragment was converted to pERI860
2 and ligated with the expression plasmids, pGELCys-RGD3, pGELCys-RGD
Construct 4 and pGELCys-RGD5. All of these plasmids are constructed in a similar manner, but typically
FIG. 1 shows a schematic diagram of the construction of GELCys-RGD4.

【００１２】以上に概説した一連の操作における個々の
操作は、当業者によく知られている。例えば、ＤＮＡの
クローニング等における大腸菌の形質転換は、コーエン
(Cohen)らの方法[Cohen,S.N.ら、プロシージング・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA) 69 2110(1972)]によって行うこ
とができる。大腸菌宿主としては、たとえばＥ.coli Ｔ
Ｇ−１、Ｅ.coli ＤＨ−１、Ｅ.coli ２９４などを用い
ることができる。The individual operations in the series of operations outlined above are well known to those skilled in the art. For example, transformation of E. coli for cloning DNA, etc.
(Cohen, SN, et al., The Proceeding of the National Academy of Science (Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA) 69 2110 (1972)]. Examples of E. coli hosts include E. coli T
G-1, E. coli DH-1, E. coli 294 and the like can be used.

【００１３】また、形質転換体から、所望の遺伝子が挿
入されたプラスミドＤＮＡを単離するには、アルカリ抽
出法[Birnboim,H.C.およびDoly,J.,ヌクレイック・アシ
ッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.) 7 1513(1979)]等
を利用することができる。次いで、プラスミドＤＮＡを
適当な制限酵素で処理することによって、挿入された該
遺伝子を切り出し、たとえばアガロースゲル電気泳動あ
るいはポリアクリルアミド電気泳動によってこれを単離
する。これらの一連の操作は公知であり、文献、例えば
「モレキュラー・クローニング(Ｍolecular Cloning)(19
82), Cold Spring Harbor Laboratory」に詳しく記載さ
れている。In order to isolate a plasmid DNA into which a desired gene has been inserted from a transformant, an alkaline extraction method [Birnboim, HC and Doly, J., Nucleic Acids Res. 7 1513 (1979)]. Next, the inserted gene is excised by treating the plasmid DNA with an appropriate restriction enzyme, and isolated by, for example, agarose gel electrophoresis or polyacrylamide electrophoresis. These series of operations are known and described in the literature, for example, "Molecular Cloning (19)
82), Cold Spring Harbor Laboratory ".

【００１４】ＤＮＡの化学合成は、例えばCreaらの方法
[Crea,R.ら,プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.US
A) 75 765(1978)]などに従って行うことができる。The chemical synthesis of DNA is carried out, for example, by the method of Crea et al.
[Crea, R. et al., The Prossing of the National.
Academy of Science (Proc.Natl.Acad.Sci.US
A) 75 765 (1978)].

【００１５】さらに、ＤＮＡの所望の部位に、特異的に
変異を起こさせるためには、市販のキット(例えばアマ
ーシャム社製キットなど)が用いられ、その配列の確認
には、ジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法[Sanger,F.
ら,プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.USA) 74 54
63(1977)]が用いられる。In order to specifically mutate a desired site in DNA, a commercially available kit (eg, a kit manufactured by Amersham) is used. Law [Sanger, F.
Proc. Of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 74 54
63 (1977)] is used.

【００１６】本明細書では、天然型ヒトリゾチームをコ
ードしている発現プラスミドpＥＲＩ８６０２を使用し
て本発明の発現プラスミドの構築例を示したが、これに
限定されない。In the present specification, an example of construction of the expression plasmid of the present invention using the expression plasmid pERI8602 encoding natural human lysozyme has been described, but the present invention is not limited to this.

【００１７】酵母宿主の場合には、プロモーターとし
て、たとえばＰＨＯ５プロモーター、ＧＬＤプロモータ
ー、ＰＧＫプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＰＨＯ
８１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０
プロモーターなどが、動物細胞宿主を用いた場合には、
プロモーターとして、たとえばＳＶ４０初期遺伝子プロ
モーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショ
ックプロモーターなどがそれぞれ利用できる。なお発現
にエンハンサーの利用も効果的である。In the case of a yeast host, examples of the promoter include PHO5 promoter, GLD promoter, PGK promoter, ADH promoter, and PHO5 promoter.
81 promoter, GAL1 promoter, GAL10
When a promoter or the like uses an animal cell host,
As the promoter, for example, SV40 early gene promoter, metallothionein promoter, heat shock promoter and the like can be used. Use of an enhancer for expression is also effective.

【００１８】本発明のプラスミドpＧＥＬＣys−ＲＧＤ
３、pＧＥＬＣys−ＲＧＤ４およびpＧＥＬＣys−ＲＧＤ
５は、酵母宿主内で変異型ヒトリゾチームを発現させ、
分泌させるのに好適である。とりわけ好ましい宿主はサ
ッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)ＡＨ２２である。The plasmid pGELCys-RGD of the present invention
3, pGELCys-RGD4 and pGELCys-RGD
5 expresses mutant human lysozyme in a yeast host,
Suitable for secretion. A particularly preferred host is Saccharomyces cerevisia
e) AH22.

【００１９】本発明の変異ヒトリゾチーム遺伝子を動物
細胞用ベクターに挿入することにより、マウスＬ細胞、
チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)、さらには他
の真核細胞を宿主として用い得る。By inserting the mutant human lysozyme gene of the present invention into a vector for animal cells, mouse L cells,
Chinese hamster ovary cells (CHO), as well as other eukaryotic cells, can be used as hosts.

【００２０】真核細胞の形質転換方法は当業者既知であ
り、例えば酵母の形質転換は、ヒネン(Hinnen)らの方法
[プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.USA) 75 19
27 (1978)]により、また、真核細胞の形質転換は、「蛋
白質・核酸・酵素・28巻、1983年、 “組み換え遺伝子
の細胞への導入と発現"(共立出版)」記載の方法で行うこ
とができる。Transformation methods for eukaryotic cells are known to those skilled in the art. For example, yeast transformation is performed according to the method of Hinnen et al.
[Processings of the National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 75 19
27 (1978)], and transformation of eukaryotic cells can be performed by the method described in “Transduction and Expression of Recombinant Genes into Cells” (Kyoritsu Shuppan), “Protein, Nucleic Acid, Enzyme, Vol. 28, 1983”. It can be carried out.

【００２１】形質転換体の培養も、当業者既知の方法の
いずれを用いても行うことができる。酵母を使用する場
合、培地としては、例えばバークホルダー(Ｂurkholde
r)最小培地[ボスチヤン(Bostian,K.L.)ら,プロシージン
グス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス USA,77 4505(1980)]が挙げられる。培養は通常
１５℃〜４０℃、好ましくは２４℃〜３７℃で１０〜１
４４時間、好ましくは２４〜９６時間行い、必要に応じ
て通気や撹拌を加えてもよい。The cultivation of the transformant can be performed by any method known to those skilled in the art. When yeast is used, the medium may be, for example, Burkholder.
r) minimum medium [Bosuchiyan (Bostian, KL), et al., Proceedings Managing scan of the National Academy of Sciences USA, 77 4505 (1980)], and the like. The culture is usually performed at 15 ° C to 40 ° C, preferably at 24 ° C to 37 ° C for 10 to 1 hour.
The treatment is performed for 44 hours, preferably for 24 to 96 hours, and if necessary, ventilation or stirring may be added.

【００２２】動物細胞などの真核生物細胞を宿主とした
形質転換体を使用する場合には、培地として例えばイー
グル(Eagle)のＭＥＭ[H.Eagle,サイエンス(Science) 13
0 432(1959)]、ダルベッコ(Dulbecco)の改良イーグル培
地(Modified Eagle's Medium)[Orgad LaubおよびWillia
m J.Rutter,ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー(J.Biol.Chem.) 258 6043(1983)]などが挙げら
れる。培養は通常３０〜４２℃、好ましくは３５℃〜３
７℃で約１〜１０日間行う。When a transformant using a eukaryotic cell such as an animal cell as a host is used, a medium such as Eagle's MEM [H. Eagle, Science 13 ] may be used.
0 432 (1959)], Modified Eagle's Medium from Dulbecco [Orgad Laub and Willia
m J. Rutter, Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.) 258 6043 (1983)]. Culture is usually performed at 30 to 42 ° C, preferably at 35 to 3 ° C.
Perform at 7 ° C. for about 1-10 days.

【００２３】培養終了後、当業者既知の方法で細胞と上
清とを分離する。本発明の発現ベクターによれば、生成
した変異型ヒトリゾチームは効率良く分泌されるので上
清から得られるが、細胞内に残存する場合には、当分野
における通常の方法、例えば超音波破砕法、フレンチプ
レスなどを利用した破砕法、摩砕などの機械的破砕法、
細胞溶解酵素による破砕法などにより細胞を破砕した後
抽出する。さらに必要ならば、トリトン−Ｘ１００、デ
オキシコーレートなどの界面活性剤を加え、産生された
変異型ヒトリゾチームを抽出する。得られた変異型ヒト
リゾチームは、通常のタンパク質精製法、例えば塩析、
等電点沈澱、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ
ー、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ
等)などに従って精製することができる。After completion of the culture, the cells and the supernatant are separated by a method known to those skilled in the art. According to the expression vector of the present invention, the produced mutant human lysozyme is obtained from the supernatant because it is efficiently secreted.However, when the mutant human lysozyme remains in cells, it is a usual method in the art, for example, sonication. , Crushing method using French press, mechanical crushing method such as grinding,
The cells are crushed by a lysis method using a cell lytic enzyme or the like and then extracted. If necessary, a surfactant such as Triton-X100 or deoxycholate is added to extract the produced mutant human lysozyme. The obtained mutant human lysozyme is subjected to a conventional protein purification method, for example, salting out,
Isoelectric point precipitation, gel filtration, ion exchange chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC, FPLC
Etc.).

【００２４】このようにして得られた形質転換体培養物
から分離した培養上清並びに菌体中のヒトリゾチームを
精製単離し、その活性を後述のアッセイ法で測定したと
ころ、本発明の変異型ヒトリゾチームは、溶菌活性を保
持したままで強い細胞接着活性を発現させることがわか
った。The culture supernatant and the human lysozyme in the cells obtained from the culture of the transformant thus obtained were purified and isolated, and their activities were measured by the assay method described below. Human lysozyme was found to express strong cell adhesion activity while maintaining lytic activity.

【００２５】即ち、本発明の変異ヒトリゾチーム遺伝子
を含んだ発現ベクターを適当な宿主に導入し、得られた
形質転換体を適当な条件下で培養し、培養上清のヒトリ
ゾチーム活性を有するタンパク質を単離し、所望により
常法にしたがって精製することにより、溶菌活性と細胞
接着活性を有する変異型ヒトリゾチームを得ることがで
きる。That is, an expression vector containing the mutant human lysozyme gene of the present invention is introduced into an appropriate host, the resulting transformant is cultured under appropriate conditions, and a protein having human lysozyme activity in the culture supernatant is obtained. Is isolated and, if desired, purified according to a conventional method to obtain a mutant human lysozyme having lytic activity and cell adhesion activity.

【００２６】以下、実施例を挙げ、本発明をさらに詳し
く説明する。尚、以下の実施例は単なる例示にすぎず、
如何なる意味においても、本発明を制限するものではな
い。Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples. It should be noted that the following examples are merely examples,
It is not intended to limit the invention in any way.

【実施例】【Example】

【００２７】実施例１ ＲＧＤ配列を含むペプチドをコ
ードする部分およびヒトリゾチームのＸbaＩ−ＨincＩ
Ｉ部分に対応する合成オリゴヌクレオチドの作製 表１に示した８種類のオリゴヌクレオチドを、それぞれ
アプライド・バイオシステムズ社製のＤＮＡシンセサイ
ザー３８０Ｂを用いて合成し、トリチル基を脱保護した
状態で得た。 Example 1 Part encoding a peptide containing an RGD sequence and XbaI-HincI of human lysozyme
Preparation of Synthetic Oligonucleotides Corresponding to Part I Eight kinds of oligonucleotides shown in Table 1 were respectively synthesized using DNA synthesizer 380B manufactured by Applied Biosystems, and obtained in a state where the trityl group was deprotected.

【００２８】[0028]

【表１】 合成オリゴヌクレオチド S R Y W C N D G 共通 5'-CTAGATATTGGTGTAACGATGGGA-3' 3'-TATAACCACATTGCTACCCTTCTGA-5' K T P G A V C R G D C Cys-RGD3 5'-AGACTCCAGGTGCTGTTTGCCGCGGTGATTGT-3' 3'-GGTCCACGACAAACGGCGCCACTAACA-5' K T P G A V C R G D S C Cys-RGD4 5'-AGACTCCAGGTGCCGTCTGCCGCGGTGATTCTTGT-3' 3'-GGTCCACGACAGACGGCGCCACTAAGAACA-5' K T P G A V C G R G D S C Cys-RGD5 5'-AGACTCCAGGTGCTGTTTGCGGCCGTGGTGATTCTTGT-3' 3'-GGTCCACGACAAACGCCGGCACCACTAAGAACA-5' [Table 1] Synthetic oligonucleotide SRYWCNDG Common 5'-CTAGATATTGGTGTAACGATGGGA-3 '3'-TATAACCACATTGCTACCCTTCTGA-5' KTPGAVCRGDC Cys-RGD3 5'-AGACTCCAGGTGCTGTTTGCCGCGGTGATTGT-3 '3'-GGTCCACGACAAACGGCGCCTGTCCGCGTCGCGTCGTCGCGATCGSCGTCGTCCGCGTCGTCCGCGTCGTCCGCGTCGTCCGCGTCGTCCGCGTCGTCTGCGCTCGTCGTCCGCGTGCTCGCGTCTGCGCTCGTCGTCTGCGCTCGTCGATCTGCGTCGTCTGCGCTCGTCGTCTGCGCTCGTCGGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCTGCGTCGATCTGCGTCGATC -GGTCCACGACAGACGGCGCCACTAAGAACA-5 'KTPGAVCGRGDSC Cys-RGD5 5'-AGACTCCAGGTGCTGTTTGCGGCCGTGGTGATTCTTGT-3'3'-GGTCCACGACAAACGCCGGCACCACTAAGAACA-5'

【００２９】このオリゴヌクレオチドを５５℃で６時間
アンモニア処理した後、乾固し、５ＯＤ₂₆₀ 量を、５０
％尿素を含む１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
負荷した。泳動後、ガラス板をはずし、ＴＬＣプレート
(メルクArt5554DC-AlutolienKieselgel-60F₂₅₄)上でＵ
Ｖランプを照射して目的とするバンドを切り出し、０.
５Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム溶液(０.５Ｍ Ｔ
ＥＡＢ:和光核酸合成用)(５ml)中に室温で一晩浸し、ゲ
ルからの溶出を行った。次に、溶出されたオリゴヌクレ
オチドをＳＥＰ−ＰＡＫR Ｃ１８カートリッジ(ウォー
ターズ製)に負荷し、２５mＭ ＴＥＡＢ(１５ml)で洗っ
たのち、１７％アセトニトリル−０.１ＭＴＥＡＢ(４m
l)で溶出し、乾固した。オリゴヌクレオチドの５'−リ
ン酸化は、５０mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ８.０)−１０mＭ
ＭgＣl₂−５mＭ ＤＴＴ溶液(２０μl)中、精製した合成
オリゴヌクレオチド０.０５５ＯＤ₂₆₀ 量にＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ(宝酒造製)(１０unit)を３７℃で４５
分間作用させて行い、９５℃、５分間の熱処理でキナー
ゼを失活させた。After the oligonucleotide was treated with ammonia at 55 ° C. for 6 hours, it was dried and the amount of 5 OD _{260 was} reduced to 50.
Loaded on 10% polyacrylamide gel electrophoresis with% urea. After the electrophoresis, remove the glass plate and set the TLC plate
U on (Merck Art5554DC-AlutolienKieselgel-60F ₂₅₄₎
A target band is cut out by irradiating a V lamp,
5M triethylammonium bicarbonate solution (0.5M T
(EAB: for Wako nucleic acid synthesis) (5 ml) at room temperature overnight to elute from the gel. Next, the eluted oligonucleotide was loaded on a SEP-PAKR® C18 cartridge (manufactured by Waters), washed with 25 mM TEAB (15 ml), and then 17% acetonitrile-0.1 MTEAB (4 ml).
Eluted in l) and evaporated to dryness. The 5'-phosphorylation of the oligonucleotide was 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) -10 mM.
In a MgCl ₂ -5 mM DTT solution (20 μl), T4 polynucleotide kinase (manufactured by Takara Shuzo) (10 units) was added at 45 ° C at 37 ° C to 0.055 OD _{260 of} purified synthetic oligonucleotide.
The enzyme was inactivated by a heat treatment at 95 ° C. for 5 minutes.

【００３０】実施例２ Ｍ１３mp１９hＬＺＭ ＲＦ Ｄ
ＮＡからのＸbaＩ−ＨincＩＩ消化フラグメントの作製 ５０mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ７.５)−１０mＭ ＭgＣl₂−
１mＭ ＤＴＴ−１００mＭ ＮaＣl溶液(７０μl)中、野
性型ヒトリゾチーム遺伝子が挿入されたＭ１３mp１９h
ＬＺＭ ＲＦ ＤＮＡ(１５μg)に、ＸbaＩ−(宝酒造製)
(６０unit)およびＨincＩＩ(宝酒造製)(６０unit)を３
７℃で１時間作用させた。次に０.８％低融点アガロー
ス(SeaPlaque^R agarose:FMC製)を用いてゲル電気泳動
し、ＸbaＩ−ＨincＩＩ消化フラグメントを精製した。 Example 2 M13mp19hLZM RF D
Preparation 50 mM Tris-HCl of XbaI-HincII digested fragment from NA (pH7.5) -10mM MgCl ₂ -
M13mp19h in which wild-type human lysozyme gene was inserted in a 1 mM DTT-100 mM NaCl solution (70 μl)
XbaI- (Takara Shuzo) was added to LZM RF DNA (15 μg).
(60 units) and HincII (Takara Shuzo) (60 units)
Acted for 1 hour at 7 ° C. Then 0.8% low melting point agarose: gel electrophoresis using (SeaPlaque ^R agarose Ltd. FMC), was purified XbaI-HincII digested fragment.

【００３１】実施例３ Ｍ１３mp１９ Ｃys−ＲＧＤ４
ＲＦ ＤＮＡの作製 実施例２で得られたＭ１３mp１９hＬＺＭ ＲＦ ＸbaＩ
−ＨincＩＩ消化フラグメント(５μg)と実施例１で得ら
れた共通およびＣys−ＲＧＤ４作製用の合計４種類の合
成オリゴヌクレオチド０.０５５ＯＤ₂₆₀ 量を加えた後、
エタノール沈澱を行った。次に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
(宝酒造製)(３５０unit)を加えて６６mＭTris−ＨＣl(p
Ｈ７.６)−６.６mＭ ＭgＣl₂−１０mＭ ＤＴＴ−０.１m
Ｍ ＡＴＰ溶液(２０μl)中、１６℃で一晩、反応させた
後、大腸菌ＴＧ−１株にトランスフェクトした。得られ
たクローンから、アルカリ抽出法によりＭ１３mp ＲＦ
ＤＮＡを調製した。これらのクローンの中から東洋紡績
社製の７−デアザシーケネースキットを用いたＤＮＡシ
ークエンシングにより、所望のクローンを選択した。 Example 3 M13mp19 Cys-RGD4
Preparation of RF DNA M13mp19hLZM RF XbaI obtained in Example 2
After adding the HincII digested fragment (5 μg) and a total of 0.055 OD ₂₆₀ of a total of four kinds of synthetic oligonucleotides for the preparation of common and Cys-RGD4 obtained in Example 1,
Ethanol precipitation was performed. Next, T4 DNA ligase
(Takara Shuzo) (350 units) and 66 mM Tris-HCl (p
_{H7.6) -6.6mM MgCl 2 -10mM DTT-} 0.1m
After reacting overnight at 16 ° C. in a MATP solution (20 μl), E. coli TG-1 strain was transfected. From the obtained clone, M13mp RF was extracted by alkali extraction.
DNA was prepared. A desired clone was selected from these clones by DNA sequencing using a 7-deazasequence kit manufactured by Toyobo.

【００３２】実施例４ 発現用ベクターpＧＥＬＣys−
ＲＧＤ４の作製 １０mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ８.０)−７mＭ ＭgＣl₂−２
０mＭ ＫＣl−７mＭ ２−メルカプトエタノール溶液(１
５μl)中、実施例３で得られたＭ１３mp１９ Ｃys−Ｒ
ＧＤ４ ＲＦ ＤＮＡ(各２μg)にＳmaＩ(宝酒造製)(１０
unit)を３０℃で４５分間作用させた。この反応液にさ
らに１.５Ｍ ＮaＣl(１.３μl)とＸhoＩ(宝酒造製)(１
０unit)を加え、蒸留水で２０μlとした後、３７℃で４
５分間反応させた。得られたＸhoＩ−ＳmaＩフラグメン
トを１％アガロース電気泳動によって精製した後、ミリ
ポア社製ウルトラフリーＣ３ＨＶを用いて４０００×
g、１０分間の遠心を２回行い、回収した。同様にしてp
ＥＲＩ８６０２(３μg)のＸhoＩ−ＳmaＩ消化を行い、
得られたベクターのＸhoＩ−ＳmaＩ断片を０.８％低融
点アガロースゲル電気泳動で精製した。このようにして
得られたＭ１３mp１９Ｃys−ＲＧＤ４ ＲＦ ＤＮＡのＸ
hoＩ−ＳmaＩ断片(１００ng)とpＥＲＩ８６０２ベクタ
ーのＸhoＩ−ＳmaＩ断片(３００ng)を、宝酒造製ＤＮＡ
ライゲーションキットを用いて結合させた後、大腸菌Ｄ
Ｈ−１株のコンピーテントセルにトラスンスフェクトさ
せた。得られたクローンを制限酵素消化によりスクリー
ニングし、所望のプラスミドＤＮＡ(pＧＥＬＣys−ＲＧ
Ｄ４)を得た。得られたプラスミドＤＮＡは、図４に示
す天然型ヒトリゾチームをコードするＤＮＡ配列中、太
線で示したヌクレオチドが表１のＣys−ＲＧＤ４で示さ
れるＤＮＡ断片で置換されているＤＮＡ配列を含んでい
ることを確認した。尚、Ｃys−ＲＧＤ３およびＣys−Ｒ
ＧＤ５についても同様の確認を行った。 Example 4 Expression vector pGELCys-
RGD4 Preparation 10mM Tris-HCl (pH8.0) -7mM MgCl 2 -2
0 mM KCl-7 mM 2-mercaptoethanol solution (1
5 μl) in the M13mp19 Cys-R obtained in Example 3.
GD4 RF DNA (2 μg each) was added to SmaI (Takara Shuzo) (10
unit) was allowed to act at 30 ° C. for 45 minutes. 1.5 M NaCl (1.3 μl) and XhoI (Takara Shuzo) (1
0 unit), make up to 20 μl with distilled water, and then add
The reaction was performed for 5 minutes. The obtained XhoI-SmaI fragment was purified by 1% agarose electrophoresis, and then 4000 × using Millipore Ultrafree C3HV.
g, centrifugation was performed twice for 10 minutes, and collected. Similarly, p
XhoI-SmaI digestion of ERI8602 (3 μg) was performed,
The XhoI-SmaI fragment of the resulting vector was purified by 0.8% low melting point agarose gel electrophoresis. X of the thus obtained M13mp19Cys-RGD4 RF DNA
The hoI-SmaI fragment (100 ng) and the XhoI-SmaI fragment (300 ng) of the pERI8602 vector were combined with Takara Shuzo DNA
After binding using a ligation kit, E. coli D
The cells were transfected into competent cells of the H-1 strain. The obtained clone was screened by restriction enzyme digestion, and the desired plasmid DNA (pGELCys-RG
D4) was obtained. The obtained plasmid DNA contains a DNA sequence in which, in the DNA sequence encoding natural human lysozyme shown in FIG. 4, nucleotides shown by bold lines are replaced by DNA fragments shown by Cys-RGD4 in Table 1. It was confirmed. In addition, Cys-RGD3 and Cys-R
Similar confirmation was performed for GD5.

【００３３】実施例５ 酵母形質転換体の調製 実施例４で得た発現用プラスミドpＧＥＬＣys−ＲＧＤ
４でＳaccharomyces cerevisiae ＡＨ２２株(ロイシン
要求性)を形質転換させ、形質転換体Ｓ.cerevisiae Ａ
Ｈ２２／pＧＥＬＣys−ＲＧＤ４を得た。形質転換体に
おける変異型ヒトリゾチーム(Ｃys−ＲＧＤ４)の分泌発
現は、Ｍicrococcus菌体を含むアガロースプレート上で
のハロー活性、および液体培養での培養上清中の溶菌活
性を測定することによって確認された。尚、形質転換体
Ｓ.cerevisiae ＡＨ２２／pＧＥＬＣys−ＲＧＤ４、並
びに同様にして得たＳ.cerevisiae ＡＨ２２／pＧＥＬ
Ｃys−ＲＧＤ３およびＳ.cerevisiae ＡＨ２２／pＧＥ
ＬＣys−ＲＧＤ５は、工業技術院生命工学工業技術研究
所に寄託されている(受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１３９
９１，Ｐ−１３９９０およびＰ−１３９９２；受託日：
いずれも平成５年１２月２日）。 Example 5 Preparation of yeast transformant The expression plasmid pGELCys-RGD obtained in Example 4
4 was used to transform Saccharomyces cerevisiae AH22 strain (requiring leucine), and the transformant S. cerevisiae A
H22 / pGELCys-RGD4 was obtained. Secretory expression of mutant human lysozyme (Cys-RGD4) in the transformant was confirmed by measuring the halo activity on an agarose plate containing Micrococcus cells and the lytic activity in the culture supernatant in liquid culture. Was. The transformant S. cerevisiae AH22 / pGELCys-RGD4, and the S. cerevisiae AH22 / pGEL obtained in the same manner.
Cys-RGD3 and S. cerevisiae AH22 / pGE
LCys-RGD5 has been deposited at the National Institute of Bioscience and Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Accession number: FERM P-139).
91, P-13990 and P-13992;
Both are on December 2, 1993).

【００３４】実施例６ 酵母形質転換体の培養 実施例５で得た酵母形質転換体Ｓ．cerevisiae ＡＨ２
２／pＧＥＬＣys−ＲＧＤ４を、Ｂurkholderの改変培地
ＩＩＩ(１Ｌ当たり、ＫＨ₂ＰＯ₄(０.４g)、グルコース
(１０g)、アスパラギン(５g)、シュークロース(８０g)
とした)(５ml)を含む試験管に接種し、３０℃で３日間
振盪培養した。得られた培養液(４ml)を同一培地ＩＩＩ
(１６ml)を含む２００ml容コルベンに移し、３０℃で１
日振盪培養した。この培養液(２０ml)を同一培地ＩＩＩ
(１８０ml)を含む５００ml容コルベンに移し、３０℃で
４日間振盪培養した。 Example 6 Culture of Yeast Transformant The yeast transformant S. cerevisiae AH2
2 / pGELCys-RGD4 was added to a modified Bulkholder's medium III (0.4 g of KH ₂ PO ₄ per liter, glucose).
(10g), asparagine (5g), sucrose (80g)
(5 ml) was inoculated and cultured with shaking at 30 ° C. for 3 days. The obtained culture solution (4 ml) was used in the same medium III.
(16 ml) into a 200 ml Kolben and 30 ° C at room temperature.
The cells were cultured with shaking on the day. This culture solution (20 ml) was added to the same medium III.
(180 ml) was transferred to a 500 ml Kolben, and cultured with shaking at 30 ° C. for 4 days.

【００３５】実施例７ 変異型ヒトリゾチーム(Ｃys−
ＲＧＤ４)の精製 実施例６で得た培養液から、遠心分離操作により培養上
清を得た。次に、５０mＭリン酸ナトリウム緩衝液(pＨ
６.５)で平衡化したＣＭ−トヨパール６５０Ｍカラム
(１.６cmφ×５cm,１０ml)に２０ml／hの流速で培養上
清を負荷した。同一緩衝液(５０ml)で洗浄した後、０.
６Ｍ ＮaＣl−５０mＭリン酸ナトリウム緩衝液(pＨ６.
５)を用いて１０ml／hの流速で溶出を行った。ＹＭ５メ
ンブレンを用いたダイアフロー装置によってこの溶出液
(１０ml)を濃縮脱塩し、最終的に５０mＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液(pＨ６.５)(１ml)の試料溶液とした。さら
に、Ａsahipak ＥＳ−５０２Ｃカラム(７.６mmφ×１０
cm)を用いた高速液体クロマトグラフィーを下記の条件
で行った。Ａ液:５０mＭリン酸ナトリウム(pＨ６.５)、
Ｂ液:０.６Ｍ Ｎa₂ＳＯ₄−５０mＭリン酸ナトリウム(p
Ｈ６.５)、溶出条件:０分(％Ａ８５,％Ｂ１５)−４５分
(％Ａ７０,％Ｂ３０)−５０分(％Ａ０,％Ｂ１００)、流
速:１ml／min。本条件下で、変異型ヒトリゾチームＣys
−ＲＧＤ４は、３０〜４０分で溶出された。この画分を
集め、蒸留水に対して十分透析した後、凍結乾燥によっ
て最終標品を得た。Ｃys−ＲＧＤ３、Ｃys−ＲＧＤ４お
よびＣys−ＲＧＤ５のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動(ゲル濃度１５％, 還元条件)における泳動パタ
ーンを図２に示す。図２において、レーン１は天然型ヒ
トリゾチーム(２μg)、レーン２はＣys−ＲＧＤ３(２μ
g)、レーン３はＣys−ＲＧＤ４(２μg)、レーン４はＣy
s−ＲＧＤ５(２μg)、レーン５は分子量マーカー(２μ
g)の泳動パターンである。 Example 7 Mutant human lysozyme (Cys-
Purification of RGD4) From the culture solution obtained in Example 6, a culture supernatant was obtained by centrifugation. Next, a 50 mM sodium phosphate buffer solution (pH
CM-Toyopearl 650M column equilibrated in 6.5)
(1.6 cmφ × 5 cm, 10 ml) was loaded with the culture supernatant at a flow rate of 20 ml / h. After washing with the same buffer (50 ml), 0.1
6M NaCl-50mM sodium phosphate buffer (pH 6.
Elution was carried out using 5) at a flow rate of 10 ml / h. This eluate was collected by a diaflow device using a YM5 membrane.
(10 ml) was concentrated and desalted, and finally used as a sample solution of 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5) (1 ml). Further, an Asahipak ES-502C column (7.6 mmφ × 10
cm) was performed under the following conditions. Solution A: 50 mM sodium phosphate (pH 6.5),
Solution B: 0.6 M Na ₂ SO ₄ -50 mM sodium phosphate (p
H6.5), elution condition: 0 min (% A85,% B15) -45 min
(% A70,% B30)-50 minutes (% A0,% B100), flow rate: 1 ml / min. Under these conditions, the mutant human lysozyme Cys
-RGD4 eluted in 30-40 minutes. This fraction was collected, dialyzed sufficiently against distilled water, and then freeze-dried to obtain a final preparation. FIG. 2 shows the migration patterns of Cys-RGD3, Cys-RGD4 and Cys-RGD5 in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 15%, reducing conditions). In FIG. 2, lane 1 is natural human lysozyme (2 μg), and lane 2 is Cys-RGD3 (2 μg).
g), lane 3 is Cys-RGD4 (2 μg), lane 4 is Cy
s-RGD5 (2 μg), lane 5 is a molecular weight marker (2 μg)
It is a migration pattern of g).

【００３６】実施例８ 変異型ヒトリゾチームＣys−Ｒ
ＧＤ３、Ｃys−ＲＧＤ４、およびＣys−ＲＧＤ５の溶菌
活性の測定 実施例２〜７と同様にして、変異型リゾチームＣys−Ｒ
ＧＤ３、Ｃys−ＲＧＤ４およびＣys−ＲＧＤ５を製造
し、０.１Ｍリン酸カリウム緩衝液(pＨ６.２)(２ml)中
でＭicrococcus luteus(シグマ社製)(０.４mg)を基質と
して２５℃で３分間反応させ、４５０nmにおける吸光度
の減小を測定することによって溶菌活性の測定を行なっ
た。標準ヒトリゾチームとしては、ミドリ十字製のヒト
尿由来の天然型ヒトリゾチームを使用した。試料液中の
ヒトリゾチーム蛋白量は、２８０nmにおける吸光度をも
とに決定された。溶菌活性の測定を３回行って得た結果
は、以下の表２に示す通りであった。 Example 8 Mutant human lysozyme Cys-R
Measurement of lytic activity of GD3, Cys-RGD4, and Cys-RGD5 In the same manner as in Examples 2 to 7, mutant lysozyme Cys-R
GD3, Cys-RGD4 and Cys-RGD5 were prepared, and 0.1% potassium phosphate buffer (pH 6.2) (2 ml) was prepared using Micrococcus luteus (manufactured by Sigma) (0.4 mg) as a substrate at 25 ° C for 3 hours. After reacting for 1 minute, the lysis activity was measured by measuring the decrease in absorbance at 450 nm. As the standard human lysozyme, a natural human lysozyme derived from human urine manufactured by Green Cross was used. The amount of human lysozyme protein in the sample solution was determined based on the absorbance at 280 nm. The results obtained by measuring the lysis activity three times are as shown in Table 2 below.

【００３７】[0037]

【表２】 溶菌活性(％) 天然型ヒトリゾチーム １００ Ｃys−ＲＧＤ３ ９０ Ｃys−ＲＧＤ４ ９７ Ｃys−ＲＧＤ５ ９２ [Table 2] Lysis activity (%) Native human lysozyme 100 Cys-RGD3 90 Cys-RGD4 97 Cys-RGD5 92

【００３８】実施例９ 変異型ヒトリゾチームＣys−Ｒ
ＧＤ３、Ｃys−ＲＧＤ４およびＣys−ＲＧＤ５の細胞接
着活性の測定 １）試料の調製 試料を０.１Ｍ ＮaＨＣＯ₃で希釈し、テルモ社製２４穴
平型プレートにウエル当り４００μl添加し、４℃で一
晩吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢ
Ｓ(５００μl)を加え、室温で３〜４時間インキュベー
トした後、ＰＢＳで洗浄し、接着活性の測定に用いた。 Example 9 Mutant human lysozyme Cys-R
Measurement of Cell Adhesion Activity of GD3, Cys-RGD4 and Cys-RGD5 1) Preparation of Sample The sample was diluted with 0.1 M NaHCO ₃ , added to a 24-well flat plate manufactured by Terumo Co., and added at 400 μl per well. Adsorbed overnight. After washing with PBS, PB containing 1% BSA
After adding S (500 μl) and incubating at room temperature for 3 to 4 hours, the plate was washed with PBS and used for measurement of adhesive activity.

【００３９】２）細胞懸濁液の調製 継代培養中のＢＨＫ細胞を、０.２５％トリプシン、０.
０２％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中、３７℃で２分間インキ
ュベートしてはく離した後、氷冷したＤＭＥ／ＨＥＰＥ
Ｓ生理的食塩水(１:１)(１０ml)に懸濁した。ここで、
ＤＭＥはダルベッコの最少培地を表わし、ＨＥＰＥＳ生
理的食塩水は１３７mＭ ＮaＣlおよび３mＭ ＫＣlを含
む２０mＭ ＨＥＰＥＳバッファー(pＨ７.１)を表わす。
遠心分離して上清を除き、ＳＴＩ(大豆トリプシンイン
ヒビター)(1mg)を含有している氷冷ＤＭＥ／ＨＥＰＥＳ
生理的食塩水(１０ml)に細胞を懸濁させた。遠心分離
し、ＳＴＩ不含の氷冷ＤＭＥ／ＨＥＰＥＳ生理的食塩水
で洗浄した後、細胞を同液に１×１０⁵cells／mlとなる
ように懸濁した。2) Preparation of Cell Suspension The BHK cells in the subculture were subjected to 0.25% trypsin, 0.2%.
After incubating at 37 ° C. for 2 minutes in PBS containing 02% EDTA and releasing, ice-cooled DME / HEPE
Suspended in 10 ml of S physiological saline (1: 1). here,
DME stands for Dulbecco's minimal medium, and HEPES saline means 20 mM HEPES buffer (pH 7.1) containing 137 mM NaCl and 3 mM KCl.
The supernatant was removed by centrifugation, and ice-cold DME / HEPES containing STI (soybean trypsin inhibitor) (1 mg)
The cells were suspended in physiological saline (10 ml). After centrifugation and washing with ice-cold DME / HEPES physiological saline without STI, the cells were suspended in the same solution at 1 × 10 ⁵ cells / ml.

【００４０】３）接着活性の測定 上記試料を吸着させたプレートに細胞懸濁液(３００μ
l)を加え、３７℃で１時間インキュベートした。３７℃
のＤＭＥ／ＨＥＰＥＳ生理的食塩水で３回洗浄すること
によって未吸着の細胞を除き、残った細胞を４％ホルマ
リン／ＰＢＳで固定し、顕微鏡下に細胞の伸展を観察し
た。3) Measurement of Adhesive Activity Cell suspension (300 μl) was placed on a plate on which the above sample was adsorbed.
l) was added and incubated at 37 ° C. for 1 hour. 37 ° C
Unadsorbed cells were removed by washing three times with DME / HEPES physiological saline, and the remaining cells were fixed with 4% formalin / PBS, and the extension of the cells was observed under a microscope.

【００４１】測定結果を図３に示す。横軸は測定系に添
加された試料蛋白質の濃度、縦軸は伸展が観察された細
胞の個数を示している。図３から、細胞接着活性はＣys
−ＲＧＤ５＜Ｃys−ＲＧＤ４＝Ｃys−ＲＧＤ３の順に増
大していることが認められた。また、ＲＧＤ４の接着活
性と比較すると、Ｃys−ＲＧＤ４の接着活性は２〜３倍
高いことも認められた。FIG. 3 shows the measurement results. The horizontal axis indicates the concentration of the sample protein added to the measurement system, and the vertical axis indicates the number of cells where extension was observed. FIG. 3 shows that the cell adhesion activity was Cys.
-RGD5 <Cys-RGD4 = Cys-RGD3. In addition, it was also found that the adhesive activity of Cys-RGD4 was 2-3 times higher than that of RGD4.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 酵母における変異型ヒトリゾチーム発現用ベ
クターpＧＥＬＣys−ＲＧＤ４の構築に関する模式図で
ある。FIG. 1 is a schematic diagram relating to the construction of a vector pGELCys-RGD4 for expressing mutant human lysozyme in yeast.

【図２】 変異型ヒトリゾチームＣys−ＲＧＤ３、Ｃys
−ＲＧＤ４およびＣys−ＲＧＤ５のＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真の模写図であ
る。FIG. 2 Mutant human lysozyme Cys-RGD3, Cys
It is a mimic of a photograph which shows the result of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of -RGD4 and Cys-RGD5.

【図３】 変異型ヒトリゾチームＣys−ＲＧＤ３、Ｃys
−ＲＧＤ４およびＣys−ＲＧＤ５の細胞接着活性の測定
結果を示したグラフである。FIG. 3 Mutant human lysozyme Cys-RGD3, Cys
It is the graph which showed the measurement result of cell adhesion activity of -RGD4 and Cys-RGD5.

【図４】 天然型ヒトリゾチームをコードするＤＮＡ配
列および対応するアミノ酸配列を示す模式図。太線は表
１に示す変異部位をコードするＤＮＡで置換される部位
を示す。FIG. 4 is a schematic diagram showing the DNA sequence encoding native human lysozyme and the corresponding amino acid sequence. The bold line indicates the site that is replaced with the DNA encoding the mutation site shown in Table 1.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/36 Ｃ１２Ｒ 1:865） ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification number Agency reference number FI Technical indication (C12N 9/36 C12R 1: 865)

Claims (14)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の
第７４位のＶ残基と第７５位のＮ残基の間に、細胞接着
活性を有するアミノ酸配列ＲＧＤを含みかつ両端にＣ残
基を有するアミノ酸配列が挿入されたポリペプチドをコ
ードしている変異型ヒトリゾチーム遺伝子。1. An amino acid sequence of natural human lysozyme comprising an amino acid sequence RGD having cell adhesion activity between the V residue at position 74 and the N residue at position 75 and having C residues at both ends. A mutant human lysozyme gene encoding a polypeptide having an inserted amino acid sequence. 【請求項２】 挿入された細胞接着活性を有するアミノ
酸配列がＣＲＧＤＣである請求項１に記載の変異型ヒト
リゾチーム遺伝子。2. The mutant human lysozyme gene according to claim 1, wherein the inserted amino acid sequence having cell adhesion activity is CRGDC. 【請求項３】 挿入された細胞接着活性を有するアミノ
酸配列がＣＲＧＤＳＣである請求項１に記載の変異型ヒ
トリゾチーム遺伝子。3. The mutant human lysozyme gene according to claim 1, wherein the inserted amino acid sequence having cell adhesion activity is CRGDSC. 【請求項４】 挿入された細胞接着活性を有するアミノ
酸配列がＣＧＲＧＤＳＣである請求項１に記載の変異型
ヒトリゾチーム遺伝子。4. The mutant human lysozyme gene according to claim 1, wherein the inserted amino acid sequence having cell adhesion activity is CGRGDSC. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載の変異型
ヒトリゾチーム遺伝子を含有し、真核生物内で自律的に
複製可能な発現ベクター。5. An expression vector containing the mutant human lysozyme gene according to claim 1 and capable of autonomously replicating in eukaryotes. 【請求項６】 プラスミドpＧＥＬＣys−ＲＧＤ３であ
る請求項５に記載の発現ベクター。6. The expression vector according to claim 5, which is a plasmid pGELCys-RGD3. 【請求項７】 プラスミドpＧＥＬＣys−ＲＧＤ４であ
る請求項５に記載の発現ベクター。7. The expression vector according to claim 5, which is a plasmid pGELCys-RGD4. 【請求項８】 プラスミドpＧＥＬＣys−ＲＧＤ５であ
る請求項５に記載の発現ベクター。8. The expression vector according to claim 5, which is a plasmid pGELCys-RGD5. 【請求項９】 請求項５〜８のいずれかに記載の発現ベ
クターで形質転換された、変異型ヒトリゾチームを産生
し、分泌し得る宿主細胞。9. A host cell transformed with the expression vector according to claim 5 and capable of producing and secreting mutant human lysozyme. 【請求項１０】 形質転換体Ｓaccharomyces cerevisia
e ＡＨ２２／pＧＥＬＣys−ＲＧＤ３である請求項９に
記載の宿主細胞。10. The transformant Saccharomyces cerevisia
The host cell according to claim 9, which is eAH22 / pGELCys-RGD3. 【請求項１１】 形質転換体Ｓaccharomyces cerevisia
e ＡＨ２２／pＧＥＬＣys−ＲＧＤ４である請求項９に
記載の宿主細胞。11. The transformant Saccharomyces cerevisia
The host cell according to claim 9, which is eAH22 / pGELCys-RGD4. 【請求項１２】 形質転換体Ｓaccharomyces cerevisia
e ＡＨ２２／pＧＥＬＣys−ＲＧＤ５である請求項９に
記載の宿主細胞。12. The transformant Saccharomyces cerevisia
The host cell according to claim 9, which is eAH22 / pGELCys-RGD5. 【請求項１３】 請求項９〜１２のいずれかに記載の形
質転換体を培養し、培養液中に分泌されたヒトリゾチー
ム活性および挿入されたアミノ酸配列に基づく細胞接着
活性を有するタンパク質を分離し、所望により精製する
ことからなる変異型ヒトリゾチームの製造方法。13. A transformant according to any one of claims 9 to 12, which is cultured to isolate a protein having human lysozyme activity secreted into the culture solution and a cell adhesion activity based on the inserted amino acid sequence. And optionally purifying the mutant human lysozyme. 【請求項１４】 請求項１３に記載の方法で製造された
変異型ヒトリゾチーム。14. A mutant human lysozyme produced by the method according to claim 13.