JP2564536B2 - DNA sequence coding for a signal peptide having improved protein secretion promoting ability - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、改良されたタンパク質分泌促進能を有する
シグナルペプチド、およびそれをコードしているDNA配
列に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a signal peptide having an improved ability to promote protein secretion, and a DNA sequence encoding the signal peptide.

周知の如く、動物細胞のある種の分泌タンパク質は、
そのアミノ末端に、細胞膜を通過する機構に関与する約
15〜30個のペプチド、即ちシグナルペプチドを伴った形
で生合成される。このシグナルペプチドが、どの様な機
構で分泌タンパク質の膜通過を可能ならしめているかは
未だ完全には解明されていないが、信頼するに足る種々
の仮説が提出されている。それらによれば、シグナルペ
プチド中に含まれている極く少数の非疎水性アミノ酸が
まず細胞膜に付着し、残余の疎水性アミノ酸で構成され
るペプチド鎖が細胞膜内に侵入し、次いで膜を貫通して
外部へ突出し、次いでその突出部に連結している分泌タ
ンパク質が順次膜外へ引き出されるものと考えられてい
る。全ての分泌タンパク質が膜外に出た後、膜内に存在
する酵素によってシグナルペプチドと分泌タンパク質の
結合部が切断され、かくして細胞外環境内で成熟タンパ
ク質が完成する。As is well known, certain secreted proteins of animal cells are
At its amino terminus, about the mechanism involved in crossing the cell membrane
It is biosynthesized with 15 to 30 peptides, or signal peptides. Although the mechanism by which this signal peptide enables the secretory protein to cross the membrane has not yet been completely elucidated, various hypotheses have been proposed to be reliable. According to them, a very small number of non-hydrophobic amino acids contained in the signal peptide first attach to the cell membrane, a peptide chain composed of the remaining hydrophobic amino acid enters the cell membrane, and then penetrates the membrane. It is thought that the secretory protein that then projects to the outside and is then linked to the projecting portion is sequentially extracted to the outside of the membrane. After all the secreted proteins have exited the membrane, the enzyme existing in the membrane cleaves the junction between the signal peptide and the secreted protein, thus completing the mature protein in the extracellular environment.

遺伝子操作により、所望のタンパク質を細胞培養で製
造しようとする場合、シグナルペプチドが欠失していた
り、その機能が十分でないと、発現されたタンパク質が
細胞内に蓄積し、細胞内酵素で分解を受けたり、不溶化
したりして、これを純粋な形で回収することが極めて困
難になることがある。When a desired protein is produced in cell culture by genetic manipulation, if the signal peptide is deleted or its function is not sufficient, the expressed protein accumulates in the cell and is degraded by intracellular enzymes. Receiving or insolubilizing it can be extremely difficult to recover it in pure form.

この様に、生体内に於いても、また細胞培養によって
所望のタンパク質を生産する生命工学の分野に於いて
も、シグナルペプチドは極めて重要な役割を果たしてい
ることが理解されよう。Thus, it will be understood that the signal peptide plays an extremely important role both in vivo and in the field of biotechnology for producing a desired protein by cell culture.

一方、遺伝子工学の進歩によって、所望のタンパク質
を微生物を使って製造することが可能となってから、各
種の関連技術に著しい発展があり、初期の技術に全ゆる
面からの改良が加えられている。しかしながら、シグナ
ルペプチドを修飾して分泌効率を高め、所望のタンパク
質の回収率を改善しようとする試みはほとんどなされて
いない。本発明者らは、卵白リゾチームのシグナルペプ
チドをコードしているDNA配列とヒトリゾチームをコー
ドしているDNA配列を連結し、これを適当なプラスミド
に組み込んだ後、このプラスミドを酵母に導入してヒト
リゾチームを発現させる研究を行なっている過程で、該
シグナルペプチドの10番目の非疎水性アミノ酸であるシ
ステイン（Cys、Ｃ）を疏水性のロイシン（Leu、Ｌ）に
変換すると、細胞外に分泌されたヒトリゾチームの量が
顕著に上昇することを見いだした。かかる知見に基づ
き、該シグナルペプチドのアミノ酸配列について広範な
研究を行なった結果、18個のアミノ酸配列からなる卵白
リゾチームのシグナルペプチドの内、特定のアミノ酸を
除いた残りの大部分を他の疎水性アミノ酸、特にロイシ
ン（Ｌ）に変換したものが、ヒトリゾチームの分泌を著
しく促進することを発見した。このことをより具体的に
説明するために、卵白リゾチームの天然のシグナルペプ
チドを構成している18個のアミノ酸配列を以下に示し、
分泌を促進させるためのアミノ酸配列の改変についてよ
り詳細に説明する。On the other hand, due to advances in genetic engineering, it has become possible to produce desired proteins using microorganisms, and thus various related technologies have made remarkable progress, and improvements have been made in all aspects to the initial technology. There is. However, few attempts have been made to modify the signal peptide to enhance the secretion efficiency and improve the recovery rate of the desired protein. The present inventors ligated the DNA sequence encoding the signal peptide of egg white lysozyme and the DNA sequence encoding human lysozyme, integrated this into an appropriate plasmid, and then introduced this plasmid into yeast. In the process of expressing human lysozyme, if the 10th non-hydrophobic amino acid of the signal peptide, cysteine (Cys, C), was converted to hydrophobic leucine (Leu, L), it was secreted extracellularly. It was found that the amount of human lysozyme produced increased significantly. Based on such findings, extensive research was conducted on the amino acid sequence of the signal peptide, and as a result, among the signal peptides of egg white lysozyme consisting of 18 amino acid sequences, most of the remaining residues except for a specific amino acid were hydrophobic. It was discovered that amino acids, especially those converted to leucine (L), significantly enhance the secretion of human lysozyme. To explain this more specifically, the 18 amino acid sequences that make up the natural signal peptide of egg white lysozyme are shown below,
The modification of the amino acid sequence for promoting secretion will be described in more detail.

上記のアミノ酸配列式で理解される様に、本明細書に
於いては、アミノ酸は、主としてIUPAC−IUB生化学命名
委員会確認規則に基づく一文字記号による表記法に従っ
て記載した。以下にこの表記法によって表わされる代表
的アミノ酸を例示する。 As will be understood from the above amino acid sequence formula, amino acids are described herein mainly according to the one-letter code notation based on the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission Identification Rules. The following are representative amino acids represented by this notation.

Ｍ…メチオニン Ｒ…アルギニン Ｓ…セリン Ｌ…ロイシン Ｉ…イソロイシン Ｖ…バリン Ｃ…システイン Ｐ…プロリン Ａ…アラニン Ｇ…グリシン Ｆ…フェニルアラニン 上記のアミノ酸配列を改変するに当たり、第１および
第２番目のアミノ酸（ＭおよびＲ）並びに第16〜18番目
のアミノ酸（Ａ、ＬおよびＧ）は、それぞれ細胞膜への
付着およびタンパク質分泌後の切断（プロセシング）に
必要と思われるので、これらを改変することは望ましく
ないと考えられる。13番目のアミノ酸（Ｐ）を他の疎水
性アミノ酸で置換することについては多少疑問点があ
り、かかる置換が望ましいとは断言できない。しかしな
がら、以上の２点を除けば、このシグナルペプチドのア
ミノ酸配列の少なくとも大部分を１種の疎水性アミノ
酸、特にロイシンで置換したものが著しい分泌促進作用
を有することがわかった。従って、かかる改変されたア
ミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする様に
DNA配列を合成し、これを所望のタンパク質、特に分泌
タンパク質をコードしている遺伝子に連結し、適当な発
現ベクターに組み込んで宿主を形質転換すれば、極めて
回収の容易なタンパク質を得ることができる。本発明
は、かかる知見に基づき完成されたものであって、卵白
リゾチームの天然のシグナルペプチドの第１、第２およ
び第16〜18番目のアミノ酸を除く全て、または少なくと
も大部分のアミノ酸を１種の疎水性アミノ酸で置換した
シグナルペプチド、およびかかる改変されたシグナルペ
プチドをコードしているDNA配列を提供するものであ
る。本発明はさらに、かかる改変されたシグナルペプチ
ドを利用して、本来分泌性のタンパク質または本来非分
泌性のタンパク質を効率よく培養細胞外に分泌させる方
法を提供するものである。M ... Methionine R ... Arginine S ... Serine L ... Leucine I ... Isoleucine V ... Valine C ... Cysteine P ... Proline A ... Alanine G ... Glycine F ... Phenylalanine In modifying the above amino acid sequence, the first and second amino acids are modified. (M and R) and the 16th to 18th amino acids (A, L and G) are considered to be necessary for attachment to the cell membrane and cleavage after protein secretion (processing), so it is desirable to modify them. Not considered. There is some doubt about the substitution of the 13th amino acid (P) with another hydrophobic amino acid, and it cannot be asserted that such substitution is desirable. However, except for the above-mentioned two points, it was found that at least most of the amino acid sequence of this signal peptide was substituted with one hydrophobic amino acid, particularly leucine, to have a remarkable secretagogue action. Therefore, it is necessary to encode a signal peptide consisting of such a modified amino acid sequence.
By synthesizing a DNA sequence, ligating this to a gene encoding a desired protein, in particular a secretory protein, incorporating it into an appropriate expression vector and transforming a host, a protein that is extremely easy to recover can be obtained. . The present invention has been completed based on such findings, and all or at least most of the amino acid lysozyme natural signal peptides except for the 1st, 2nd and 16th to 18th amino acids Of the present invention, and a DNA sequence encoding such a modified signal peptide. The present invention further provides a method for efficiently secreting an originally secretory protein or an originally non-secretory protein to the outside of cultured cells using the modified signal peptide.

以下に、分泌されるタンパク質をヒトリゾチームと
し、改変されるアミノ酸配列を第３番目のセリン（Ｓ）
から第11番目のフェニルアラニン（Ｆ）までの９個のア
ミン酸とし、改変に使用する疎水性アミノ酸をロイシン
（Ｌ）とした場合を例にとって本発明を更に詳細に説明
する。Below, the secreted protein is human lysozyme, and the modified amino acid sequence is the third serine (S)
The present invention will be described in more detail by taking as an example the case where nine amine acids from the 11th to the 11th phenylalanine (F) are used and the hydrophobic amino acid used for modification is leucine (L).

卵白リゾチームのシグナルペプチドの下流にヒトリゾ
チームを接続したタンパク質をコードしているDNAを酵
母で発現させると、天然型ヒトリゾチームが発現される
ことは既に知られている［地神ら、昭和61年度日本農芸
化学会要旨集、p343（1986）、および吉村ら、第58回日
本遺伝学会第９回日本分子生物学会合同年会、p108（19
86）］。この知見を基に、シグナルペプチドとヒトリゾ
チームとの切断個所を変えることなく、より膜透過性の
良いシグナルペプチドをデザインすべく、卵白リゾチー
ムの天然のシグナルペプチドの第３番目〜第11番目のア
ミノ酸を全てロイシンに変換し、以下の方法で膜の透過
性を予想した。It is already known that when a DNA encoding a protein in which human lysozyme is connected downstream of the signal peptide of egg white lysozyme is expressed in yeast, natural human lysozyme is expressed [Jigami et al., 1986. Japan Society for Agricultural Chemistry, p343 (1986), and Yoshimura et al., The 58th Annual Meeting of the Genetic Society of Japan, The 9th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan, p108 (19)
86)]. Based on this knowledge, in order to design a signal peptide with better membrane permeability without changing the cleavage site between the signal peptide and human lysozyme, the 3rd to 11th amino acids of the natural signal peptide of egg white lysozyme were designed. Was converted into leucine, and the permeability of the membrane was predicted by the following method.

１）シグナルペプチドの疎水セグメントが水中でとって
いるランダム・コイルの状態から膜中でのα−ヘリック
ス（らせん）をとる時の自由エネルギーの変化、ΔGtr
＋Einitを求め、その値から膜の透過性を予想する［ヨ
ーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
（Eur.J.Biochem）、103、431（1980）］。1) Change in free energy when taking the α-helix in the membrane from the state of a random coil in which the hydrophobic segment of the signal peptide is taken in water, ΔGtr
Calculate + Einit and predict the permeability of the membrane from that value [European Journal of Biochemistry (Eur.J.Biochem), 103 , 431 (1980)].

２）シグナルペプチドの疎水セグメントの長さ（N_HY）
とその疎水性（H₈）を二次元にプロットし、その位置よ
り膜透過性を判断する［ウィルス・リサーチ（Virus Re
s.）、３、271（1985）］。2) Length of the hydrophobic segment of the signal peptide (N _HY )
And its hydrophobicity (H ₈ ) are two-dimensionally plotted, and the membrane permeability is judged from that position [Virus Research (Virus Re
s.), 3 , 271 (1985)].

卵白リゾチームシグナルペプチドの第３番目〜第11番
目のアミノ酸を全てロイシン（Ｌ）に置き換えたシグナ
ルペプチド（以下、Ｌ−変換体という）の膜透過性を上
記の方法で予想した結果、以下の表１に示す結果を得
た。As a result of predicting the membrane permeability of a signal peptide (hereinafter, referred to as an L-converter) in which all the 3rd to 11th amino acids of the egg white lysozyme signal peptide were replaced with leucine (L) by the above method, the following table The results shown in 1 were obtained.

表１に示した結果から、Ｌ−変換体は、ヒトリゾチー
ムを分泌させるシグナルペプチドとして、天然の卵白リ
ゾチームシグナルと比べて極めて優れていると予想され
た。 From the results shown in Table 1, it was expected that the L-converted substance was extremely superior to the natural egg white lysozyme signal as a signal peptide that secretes human lysozyme.

このＬ−変換体をコードするDNAは、化学合成したヌ
クレオチド断片を連結することにより得ることができ
る。このDNA配列は、酵母内で機能するシグナルペプチ
ドとして発現されるものであればいかなるDNAでもよい
が、酵母を用いた発現では、酵母に於いて高頻度で使用
されるコドンを使用するのが好ましい。なお、コドンの
使用頻度については「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリィ（The Journal of Biological Ch
emistry）、257、3026〜3031（1982）」に報告されてい
る。The DNA encoding this L-converted product can be obtained by ligating chemically synthesized nucleotide fragments. This DNA sequence may be any DNA so long as it is expressed as a signal peptide that functions in yeast, but in expression using yeast, it is preferable to use codons that are frequently used in yeast. . Regarding the frequency of codon usage, refer to “The Journal of Biological Ch
emistry), 257 , 3026-3031 (1982) ".

ヒトリゾチーム遺伝子の合成はすでに公表されており
［ケミカル・ファーマシューティカル・ブリテン（Che
m.Pharm.Bull）、34、2202（1986）］、それに従ってヒ
トリゾチーム合成遺伝子を得た。ただし、本発明者等
は、シグナルペプチドとの連結を考えて、ヒトリゾチー
ムの３番目のアミノ酸Ｆの位置にTeq Iサイトを、ま
た、終止コドンのうしろにXho Iサイトをもった、Ｎ末
端を一部欠いたヒトリゾチームをコードするDNA（Taq I
−Xho I）を合成した。このようにして得られた合成遺
伝子を量的に増やすためには、まず適当なベクターに組
み込みサブクローニングする必要がある。クローニング
ベクターとしては、該遺伝子を組み込むことができれば
如何なるものであってもよいが、具体的には大腸菌ベク
ターpBR322のBal IサイトをXho Iサイトに変換したpBR3
22Xを使用した。The synthesis of the human lysozyme gene has already been published [Chemical Pharmaceutical Britain (Che
m.Pharm.Bull), 34 , 2202 (1986)], and the human lysozyme synthetic gene was obtained accordingly. However, in consideration of the ligation with a signal peptide, the present inventors have a Teq I site at the position of the third amino acid F of human lysozyme and an Xho I site behind the stop codon at the N-terminus. DNA encoding human lysozyme (Taq I
-Xho I) was synthesized. In order to quantitatively increase the amount of the synthetic gene thus obtained, it is necessary to first integrate the gene into an appropriate vector and carry out subcloning. Any cloning vector may be used so long as it can incorporate the gene. Specifically, pBR3 obtained by converting the Bal I site of E. coli vector pBR322 into an Xho I site.
22X was used.

常法に従い、合成リゾチーム遺伝子をpBR322Xに組み
込む。このようにして得られた合成遺伝子含有ベクター
を用いて大腸菌を形質転換する。大腸菌の形質転換の方
法それ自体は公知であり、たとえばCohenらの方法［Coh
en,S.N.ら、プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA）、69、2110（1972）］によって行なうことができ
る。The synthetic lysozyme gene is incorporated into pBR322X according to a conventional method. Escherichia coli is transformed with the synthetic gene-containing vector thus obtained. Methods for transformation of E. coli are known per se, for example the method of Cohen et al. [Coh
en, SN et al., Proceeding of the National
Academy of Science (Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA), 69 , 2110 (1972)].

宿主としてはE.Coli294、E.Coli DH1、E.Coli W311
0、E.Coli C600などを用いることができる。E.Coli 294, E.Coli DH1, E.Coli W311 as the host
0, E.Coli C600, etc. can be used.

次に、該遺伝子が挿入されたプラスミドDNAをたとえ
ばアルカリ抽出法［Birnboim,H.C.およびDoly,J.、ヌク
レイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Re
s.）、７、1513（1979）］によって形質転換体から単離
する。得られるプラスミドDNAを適当な制限酵素で処理
することによって、挿入された該遺伝子を切り出し、た
とえばアガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルア
ミド電気泳動によってこれを単離することができる。こ
れら一連の操作は公知であり、文献、例えば「モレキュ
ラー・クローニング（Molecular Cloning）（1982）、C
old Spring Harbor Laboratoy」に詳しく記載されてい
る。単離された該遺伝子を適当な発現ベクターのプロモ
ーターおよびシグナルペプチドコード領域の下流にプロ
モーターと順方向に連結し、発現プラスミドを構築す
る。Next, the plasmid DNA into which the gene has been inserted is subjected to, for example, an alkaline extraction method [Birnboim, HC and Doly, J., Nucleic Acids Research (Nucleic Acids Research).
s.), 7 , 1513 (1979)]. By treating the resulting plasmid DNA with an appropriate restriction enzyme, the inserted gene can be excised and isolated by, for example, agarose gel electrophoresis or polyacrylamide electrophoresis. These series of operations are known, and are referred to in the literature, for example, “Molecular Cloning (1982), C.
Old Spring Harbor Laboratoy ”. The isolated gene is forwardly ligated to the promoter of an appropriate expression vector and downstream of the signal peptide coding region to construct an expression plasmid.

シグナルペプチドおよびヒトリゾチームをコードする
DNAの合成には、酵母のコドン使用頻度の高いものを用
いればよいが、制限酵素認識部位などの作成のため、後
順位のコダンを使用してもよい。Encodes a signal peptide and human lysozyme
For the synthesis of DNA, those having a high frequency of yeast codon usage may be used, however, in order to create a restriction enzyme recognition site and the like, a codan of lower rank may be used.

またDNAの化学合成は、たとえばCreaらの方法［Crea,
R.ら、プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、
75、5765（1978）］などに従って行なうことができる。Chemical synthesis of DNA can be performed, for example, by the method of Crea et al. [Crea,
R. et al., Proc. Of the National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci. USA),
75 , 5765 (1978)] and the like.

発現ベクターとしてはすでに多くのものが知られてお
り、該遺伝子の発現に実際に利用できるものであればい
かなるものであってもよい。具体的にはpPHO17、pGLD90
6−１、pcDX［Okayama,HおよびBerg,P、モレキュラー・
アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）、
３、280（1983）］、およびpKSV−10（ファルマシア社
製）などが挙げられる。Many expression vectors are already known, and any vector can be used so long as it can be actually used for expression of the gene. Specifically, pPHO17, pGLD90
6-1, pcDX [Okayama, H and Berg, P, Molecular
And Cellular Biology (Mol. Cell. Biol.),
3 , 280 (1983)], and pKSV-10 (Pharmacia).

即ち、宿主として酵母を用いた場合には、プロモータ
ーとして例えばPHO5プロモーター、GLDプロモーター、P
GKプロモーター、ADHプロモーター、PHO18プロモーター
などが、宿主として動物細胞を用いた場合には、プロモ
ーターとして例えばSV40初期遺伝子プロモーター、メタ
ロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモータ
ーなどがそれぞれ利用できる。That is, when yeast is used as a host, promoters such as PHO5 promoter, GLD promoter, P
When an animal cell is used as a host, GK promoter, ADH promoter, PHO18 promoter and the like can be used as the promoter, for example, SV40 early gene promoter, metallothionein promoter, heat shock promoter and the like.

なお、発現にエンハンサーを利用することも効果的で
ある。The use of an enhancer for expression is also effective.

なお、発現に利用される宿主としては、サッカロマイ
セス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）のよ
うな酵母、およびマウスＬ細胞、チャイニーズハムスタ
ー卵母細胞（CHO）などが挙げられるが、他の真核生物
細胞も利用することができる。Examples of the host used for expression include yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, mouse L cells, Chinese hamster oocytes (CHO), and the like, but other eukaryotic cells may also be used. can do.

宿主として酵母を用いる場合には、たとえばHinnenら
の方法［プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.US
A）、75、1927（1978）］によって形質転換を行なうこ
とができる。When yeast is used as a host, for example, the method of Hinnen et al. [Proc.Natl.Acad.Sci.US]
A), 75 , 1927 (1978)].

動物細胞などの真核細胞の形質転換法はそれ自体公知
であり、例えば［蛋白質・核酸・酵素、28巻、1983年、
“組換え遺伝子の細胞への導入と発現”（共立出版）」
の記載に従って行われる。Methods for transforming eukaryotic cells such as animal cells are known per se, and for example, [protein / nucleic acid / enzyme, 28, 1983,
"Transfection and expression of recombinant genes into cells" (Kyoritsu Shuppan)
It is performed according to the description of.

得られた分泌発現プラスミドで宿主細胞を形質転換
し、目的とする組換え体を得る。このようにして得られ
た形質転換体を自体公知の方法で培養する。A host cell is transformed with the obtained secretory expression plasmid to obtain the target recombinant. The transformant thus obtained is cultured by a method known per se.

酵母を使用する場合、培地としては、たとえばBurkho
lder最小培地［Bostian,K.L.ら、プロシージング・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA）、77、4505（1980）］が挙げら
れる。培養は通常15℃〜40℃、好ましくは24℃〜37℃で
10〜144時間、好ましくは24〜96時間行い、必要に応じ
て通気や攪拌を加えることもできる。When yeast is used, examples of the medium include Burkho
lder minimal medium [Bostian, KL et al., Proc. of the National Academy of Science (Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA), 77 , 4505 (1980)]. Culturing is usually at 15 ℃ ~ 40 ℃, preferably at 24 ℃ ~ 37 ℃
It is carried out for 10 to 144 hours, preferably 24 to 96 hours, and aeration and stirring can be added if necessary.

動物細胞などの真核生物細胞を宿主とした形質転換体
を使用する場合には、培地として例えばEagleのMEM［H.
Eagle、サイエンス（Science）、130、432（1959）］、
DulbeccoのModified Eagle′s Medium［Orgad Laubおよ
びWilliam J.Rutter、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、258、6043（198
3）］などが挙げられる。培養は通常30〜42℃、好まし
くは35℃〜37℃で約１〜10日間行なう。When a transformant using a eukaryotic cell such as an animal cell as a host is used, for example, Eagle's MEM [H.
Eagle, Science, 130 , 432 (1959)],
Dulbecco's Modified Eagle's Medium [Orgad Laub and William J. Rutter, Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 258 , 6043 (198).
3)]. Culturing is usually carried out at 30 to 42 ° C., preferably 35 to 37 ° C. for about 1 to 10 days.

培養終了後、自体公知の方法で細胞と上清とを分離す
る。細胞内に残存するヒトリゾチームは、当分野におけ
る通常の方法、たとえば超音波破砕法、フレンチプレス
など利用した破砕法、摩砕などの機械的破砕法、細胞溶
解酵素による破砕法などにより細胞を破砕した後抽出す
る。さらに必要ならば、トリトン−X100、デオキシコー
レートなどの界面活性剤加え、産生されたヒトリゾチー
ムを抽出する。このようにして得られた培養上清および
細胞内に含まれるヒトリゾチームを別々に定量し、両者
の比率を比較する。なお、得られたヒトリゾチームは、
通常のタンパク質精製法、たとえば塩析、等電点沈澱、
ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体ク
ロマトグラフィー（HPLC、FPLC等）などにしたがって精
製することができる。After completion of the culture, the cells and the supernatant are separated by a method known per se. Human lysozyme remaining in cells is crushed into cells by a conventional method in the art, for example, ultrasonic crushing method, crushing method using French press, mechanical crushing method such as grinding, crushing method using cytolytic enzyme, etc. And then extract. If necessary, a surfactant such as Triton-X100 or deoxycholate is added and the produced human lysozyme is extracted. The thus obtained culture supernatant and human lysozyme contained in the cells are separately quantified, and the ratio between the two is compared. In addition, the obtained human lysozyme,
Conventional protein purification methods such as salting out, isoelectric focusing,
It can be purified by gel filtration, ion exchange chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC, FPLC, etc.).

以下に実施例を示して本発明を具体的に例示するが、
実施例に示したシグナル配列はきわめて一般化されてい
るため、分泌の対象となる蛋白質は単にヒトリゾチーム
に限られるものではない。Hereinafter, the present invention will be specifically illustrated by way of Examples,
Since the signal sequences shown in the examples are extremely generalized, the protein to be secreted is not limited to human lysozyme.

実施例１ クローニングベクターpBR322Xの作製 大腸菌ベクターpBR322（５μｇ）に制限酵素Bal I
（1.5ユニット）を加え、40μの反応液［10mM Tris−
HCl（pH7.5）、10mM MgCl₂、1mM dithiothreitol］中で
37℃、５時間反応させた後、常法通りフェノール抽出
し、次いでDNAをエタノール沈澱させた。このDNAにリン
酸化したXho Iリンカーｄ［qCCTCGAGG］（New England
Biolabs製）50ngを加え、常法にしたがってT4DNリガー
ゼで両者を結合させた。Example 1 Construction of cloning vector pBR322X Escherichia coli vector pBR322 (5 μg) was digested with the restriction enzyme Bal I.
(1.5 units), and add 40 µl of the reaction solution [10 mM Tris-
HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl ₂ , 1 mM dithiothreitol]
After reacting at 37 ° C. for 5 hours, phenol extraction was carried out in the usual way, and then DNA was ethanol precipitated. Xho I linker d [qCCTCGAGG] phosphorylated on this DNA (New England
Biolabs) 50 ng were added, and both were bound with T4DN ligase according to a conventional method.

この反応液で大腸菌DH1株を形質転換し、得られたア
ンピリシン耐性、テトラサイリン耐性のコロニーからア
ルカリ抽出法（前出）でプラスミドを抽出し、Bal Iサ
イトがXho Iサイトに変換されたプラスミドpBR322Xを得
た。Escherichia coli DH1 strain was transformed with this reaction solution, and a plasmid was extracted from the obtained ampicillin-resistant and tetracyline-resistant colonies by the alkaline extraction method (described above) to obtain a plasmid pBR322X in which the Bal I site was converted to the Xho I site. Obtained.

実施例２ ヒトリゾチームのＮ末端近傍にTaq Iサイトを有するヒ
トリゾチーム遺伝子断片の作製 遺伝子の合成はIkeharaらの報告（前出）に従った。
ただし、Ikeharaらの報告におけるヌクレオチド断片、U
2（TTGAGAGATGCGAAT）の代わりにU2′（CGAGAGATGCGAA
T）を、L2（TCTGGCTAATTCGCATC）の代わりにL2′（TCTG
GCTAATTCGCATCTCT）を合成してU2′,U3〜U26,L2′,L3〜
L26のフラグメントを連結させた。Example 2 Preparation of human lysozyme gene fragment having Taq I site near N terminus of human lysozyme Gene synthesis was according to the report of Ikehara et al. (Supra).
However, the nucleotide fragment in the report of Ikehara et al., U
2 (TTGAGAGATGCGAAT) instead of U2 '(CGAGAGATGCGAA
T) is replaced by L2 '(TCTG) instead of L2 (TCTGGCTAATTCGCATC).
GCTAATTCGCATCTCT) to synthesize U2 ', U3 ~ U26, L2', L3 ~
The L26 fragment was ligated.

その結果、３番目のアミノ酸であるフェニルアラニン
（Ｆ）に対するコドンTTTがTTCになり、Ikeharaらの報
告とは違って、その部分に新しくTaq Iサイトを有し
た、５′末端の一部欠けた遺伝子が得られた（第１
図）。As a result, the codon TTT for the third amino acid, phenylalanine (F), became TTC, and unlike the report of Ikehara et al., A gene lacking a part at the 5 'end, which had a new Taq I site in that part. Was obtained (first
Figure).

実施例３ Taq Iサイトを有するヒトリゾチーム遺伝子断片のサブ
クローニング 実施例１で構築したプラスミドpBR322X2.6μｇに６ユ
ニットの制限酵素Xho Iと６ユニットの制限酵素Cla Iと
を35μの反応液［33mM酢酸緩衝液pH7.9、66mM酢酸カ
リウム、10mM酢酸マグネシウム、0.5mMジチオトレイッ
ト、0.01％BSA］中で37℃、１時間作用させた後、フェ
ノールで除蛋白し、冷エタノールで沈澱させた。該DNA
（200ng）を実施例２で調製したヒトリゾチーム遺伝子
断片100ngと混合し、10μの反応液［66mM Tris−HCl
（pH7.6）、10mM ATP、10mMスペルメジン、100mM MgC
l₂、150mM DTT、2mg/ml BSA、５ユニットのT4DNAリガー
ゼ］中、14℃で一夜作用させてDNAを結合させた。この
反応液を用いて大腸菌のDHI株を前期Cohenらの方法にし
たがって形質転換した。得られた形質転換体からアルカ
リ抽出法（前出）によってプラスミドを単離し、分子量
および制限酵素による分解パターンを調べ、ヒトリゾチ
ーム遺伝子断片が挿入されたpLYS221を得た。pLYS221の
EcoR I−Xho I断片を分離し、ジオキシヌクレオチド合
成鎖停止法によってその塩基配列を決定したところ、第
１図に示したように、予想通りヒトリゾチーム遺伝子Ta
q I−Xho I断片が得られた。Example 3 Subcloning of human lysozyme gene fragment having Taq I site 6 μl of restriction enzyme Xho I and 6 units of restriction enzyme Cla I were added to 2.6 μg of plasmid pBR322X constructed in Example 1 in a reaction solution of 35 μm [33 mM acetate buffer]. Solution pH 7.9, 66 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate, 0.5 mM dithiothreate, 0.01% BSA] was allowed to act at 37 ° C. for 1 hour, deproteinized with phenol, and precipitated with cold ethanol. The DNA
(200 ng) was mixed with 100 ng of the human lysozyme gene fragment prepared in Example 2, and 10 μl of the reaction solution [66 mM Tris-HCl was used.
(PH7.6), 10mM ATP, 10mM spermidine, 100mM MgC
l ₂ , 150 mM DTT, 2 mg / ml BSA, 5 units of T4 DNA ligase] at 14 ° C. overnight to bind the DNA. Using this reaction solution, the Escherichia coli DHI strain was transformed according to the method of Cohen et al. A plasmid was isolated from the obtained transformant by an alkali extraction method (described above), and the molecular weight and the degradation pattern by a restriction enzyme were examined to obtain pLYS221 into which a human lysozyme gene fragment was inserted. pLYS221
The EcoR I-Xho I fragment was isolated and its nucleotide sequence was determined by the dioxynucleotide synthetic chain termination method. As shown in FIG. 1, as expected, the human lysozyme gene Ta
A qI-XhoI fragment was obtained.

この配列はヒトリゾチームのアミノ酸配列のうち４番
目のGluから130番目のValまでをコードしている。This sequence encodes from Glu at position 4 to Val at position 130 in the amino acid sequence of human lysozyme.

実施例４ Ｌ−変換体をコードするDNAの調製 ヒトリゾチームを培地中へ分泌させるためのシグナル
配列として卵白リゾチームの第３番目〜第11番目の全て
のアミノ酸をロイシンに変換したＬ−変換体をコードす
るDNA配列を調製した。合成したヌクレオチド配列を第
２図に示したが、５′末端にXho Iサイトが、３′末端
にはヒトリゾチームのコード領域を含むTaq Iサイトが
それぞれ設けられている。全配列は８個のオリゴヌクレ
オチド（＃１〜＃８）から成り、それらの合成はホスフ
ォアミダイド法［Caruthers,M.H.ら、テトラヘドロン・
レターズ（Tetrahedron Letters）、22、1859（198
1）］に従って行なった。Example 4 Preparation of DNA Encoding L-Converter An L-converter in which all the 3rd to 11th amino acids of egg white lysozyme were converted to leucine as a signal sequence for secreting human lysozyme into the medium was prepared. The coding DNA sequence was prepared. The synthesized nucleotide sequence is shown in FIG. 2. An Xho I site is provided at the 5 'end, and a Taq I site containing a human lysozyme coding region is provided at the 3' end. The entire sequence consists of 8 oligonucleotides (# 1 to # 8), which are synthesized by the phosphoramidide method [Caruthers, MH et al., Tetrahedron.
Letters (Tetrahedron Letters), 22 , 1859 (198
1)].

まず、第２図に示したフラグメント＃２〜＃７をそれ
ぞれ10μ（５μｇ）づつ混合し、これに10倍濃度のキ
ナーゼ緩衝液［0.5M Tris−HCl、0.1M MgCl₂、0.1Mメル
カプトエタノールpH7.6］20μ、10mM ATP20μ、T4
ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）20μ（50
u）、蒸留水80μを加えて37℃で２時間反応させた
後、65℃で20分間処理して反応をとめた。この反応液に
フラグメント＃１と＃８をそれぞれ10μ（５μｇ）づ
つ加え、T4リガーゼ（NEB社製）10μを加えて14℃で
一夜反応させた。反応液を10％ポリアクリルアミド電気
泳動にかけ、76bpのフラグメントを切り出し、電気泳動
溶出によってゲルから抽出した。これを45μの蒸留水
に溶解し、これに10倍濃度のキナーゼ緩衝液（前出）６
μ、10mM ATP6μ、T4ポリヌクレオチドキナーゼ
（前出）２μ（5u）を加え、37℃で１時間反応させた
後、−20℃で保存した。First, each of the fragments # 2 to # 7 shown in FIG. 2 was mixed with 10 μm (5 μg), and the mixture was mixed with 10 times concentration of a kinase buffer [0.5M Tris-HCl, 0.1M MgCl ₂ , 0.1M mercaptoethanol pH7. .6] 20μ, 10mM ATP20μ, T4
Polynucleotide kinase (Takara Shuzo) 20μ (50
u), 80 µ of distilled water was added, and the reaction was carried out at 37 ° C for 2 hours, followed by treatment at 65 ° C for 20 minutes to stop the reaction. Fragments # 1 and # 8 were each added to this reaction solution in an amount of 10 μ (5 μg), and T4 ligase (manufactured by NEB) 10 μ was added, followed by reaction at 14 ° C. overnight. The reaction was subjected to 10% polyacrylamide electrophoresis, the 76 bp fragment was excised and extracted from the gel by electrophoretic elution. Dissolve this in 45μ distilled water and add 10 times the concentration of the kinase buffer (see above) 6
μ, 10 mM ATP6 μ, T4 polynucleotide kinase (supra) 2 μ (5u) were added, reacted at 37 ° C. for 1 hour, and then stored at −20 ° C.

実施例５ 分泌発現プラスミドの構築 実施例３で得たpLYS221（236μｇ）をEcoR I（ニツポ
ンジーン社製）120uおよびXho I（ニツポンジーン社
製）120uで37℃、２時間処理し、ヒトリゾチームコード
領域を切り出した。このフラグメントをさらにTaq I
（ニツポンジーン社製）26uで65℃、１時間処理し、Ｎ
末端を一部欠いたヒトリゾチームコード領域を切り出し
た。Example 5 Construction of Secretory Expression Plasmid pLYS221 (236 μg) obtained in Example 3 was treated at 37 ° C. for 2 hours with 120 u of EcoR I (manufactured by Nippon Gene) and 120 u of Xho I (manufactured by Nippon Gene) to obtain a human lysozyme code. The area was cut out. Add this fragment to Taq I
(Manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.)
A human lysozyme coding region partially truncated was cut out.

このフラグメント約１μｇに実施例４で得たＬ−変換
体シグナル配列をコードするDNA0.5μｇを混合し、T4−
リガーゼ（前出）800uの存在下で16℃、16時間反応させ
たのち、Xho I（42u）処理した。About 1 μg of this fragment was mixed with 0.5 μg of the DNA encoding the L-converter signal sequence obtained in Example 4, and T4-
After reacting in the presence of 800u of ligase (described above) at 16 ° C for 16 hours, it was treated with Xho I (42u).

得られたXho Iフラグメント10ngと、酵母の発現ベク
ターpGLD906−１（特開昭61−43991）をXho Iで処理し
たベクター1ngとを混合し、この両者をT4リガーゼの存
在下で結合させた。10 ng of the obtained XhoI fragment and 1 ng of a vector obtained by treating the yeast expression vector pGLD906-1 (Japanese Patent Laid-Open No. 61-43991) with XhoI were mixed, and both were ligated in the presence of T4 ligase.

この反応液でE.coli DH1を前述の方法で形質転換し、
GLDプロモーター下流にシグナル配列コード領域および
ヒロリゾチーム遺伝子がプロモーターと同一方向に挿入
されたプラスミドを多数得た。そのうちの１つをpGEL・
L10（第３図参照）と命名して以下の実験に供した。E. coli DH1 was transformed with the reaction solution as described above,
A large number of plasmids were obtained in which the signal sequence coding region and the hirolysozyme gene were inserted downstream of the GLD promoter in the same direction as the promoter. One of them is pGEL
It was named L10 (see FIG. 3) and used for the following experiments.

実施例６ 酵母形質転換体の調製 実施例５で得た発現プラスミドpGEL・L10でSaccharom
yces cerevisiae AH22R^-をHinnenらの方法（前出）で形
質転換され、形質転換体Saccharomyces cerevisiae AH2
2R^-/pGEL・L10を得た。この菌株は、工業技術院微生物
工業技術研究所に受託番号FERM P−9284で寄託されてい
る（寄託日：昭和62年３月16日）。Example 6 Preparation of Yeast Transformant The expression plasmid pGEL • L10 obtained in Example 5 was used for Saccharom.
yces cerevisiae AH22R ⁻ was transformed by the method of Hinnen et al. (supra) to obtain a transformant Saccharomyces cerevisiae AH2.
2R ^- was obtained / pGEL · L10. This strain has been deposited at the Institute for Microbial Technology, Institute of Industrial Science, with the deposit number FERM P-9284 (deposit date: March 16, 1987).

実施例７ 形質転換体の培養 実施例６で得た形質転換体Saccharomyces cerevisiae
AH22R^-/pGEL・L10をBurkholder［アメリカン・ジャー
ナル・オブ・ボタニー（Amer.J.Bot.）、30、206（194
3）］の改変培地III（１当たりKH₂PO₄0.4g、グルコー
ス10g、アスパラギン5g、シュークロース80gとした）5m
lを含む試験管に接種し、30℃で３日間振盪培養した。
得られた培養液の1mlをそれぞれ上記培地III 4mlを含む
試験管へ移し、30℃で１日振盪培養した。この培養液2m
lを上記培地III 18mlを含む200ml容三角フラスコに移
し、30℃で振盪培養し、48、72、96、120および144時間
後にアッセイ用試料を調製した。Example 7 Culture of transformant The transformant Saccharomyces cerevisiae obtained in Example 6
^{AH22R - (. Amer.J.Bot) / pGEL} · L10 the Burkholder [American Journal of Botany, 30, 206 (194
3)] modified medium III (KH ₂ PO ₄ 0.4 g per 1 and glucose 10 g, asparagine 5 g, sucrose 80 g) 5 m
The test tube was inoculated into a test tube containing 30 μl and shake-cultured at 30 ° C. for 3 days.
1 ml of the obtained culture solution was transferred to a test tube containing 4 ml of the above-mentioned medium III, and cultured with shaking at 30 ° C. for 1 day. 2m of this culture
l was transferred to a 200 ml Erlenmeyer flask containing 18 ml of the above-mentioned medium III, shake-cultured at 30 ° C., and assay samples were prepared after 48, 72, 96, 120 and 144 hours.

実施例８ アッセイ試料の調製 実施例７で得た培養液を遠心分離機にかけ、上清と菌
体を分離した。上清はアッセイに供し、菌体は1.2Mシュ
ークロースを含む50mMリン酸バッファー（pH7.0）で洗
浄した後、菌体を、Zymolyase［生化学工業（株）製］
を0.5mg/mlになるように加えた同バッファーに懸濁し、
室温で２時間反応させた。この反応液に４倍量の50mMリ
ン酸バッファー（pH7.0）［10mM EDTA、1mM PMSFを含
む］を加え、室温で１時間反応させたのち、上清を集め
て菌体抽出液とした。Example 8 Preparation of Assay Sample The culture solution obtained in Example 7 was centrifuged to separate the supernatant from the cells. The supernatant was subjected to the assay, and the bacterial cells were washed with 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 1.2 M sucrose, and then the bacterial cells were subjected to Zymolyase [Seikagaku Corporation].
Was suspended in the same buffer added to 0.5 mg / ml,
The reaction was carried out at room temperature for 2 hours. To this reaction solution, 4 volumes of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) [containing 10 mM EDTA and 1 mM PMSF] was added and reacted at room temperature for 1 hour. The supernatant was collected to obtain a cell extract.

実施例９ ヒトリゾチーム産生量の測定 実施例８で得た上清と菌体抽体液とをヒトリゾチーム
のアッセイに供した。Example 9 Measurement of production amount of human lysozyme The supernatant and the microbial cell extract obtained in Example 8 were subjected to a human lysozyme assay.

ヒトリゾチーム活性の測定は、ほぼワーシントン・エ
ンザイム・マニュアル（Worthigton Enzyme Manual、p1
00、Worthigton Biochemical Corporation,USA、1972）
によった。標準ヒトリゾチームとしてはSigma社製を使
用した。１単位は、0.1Mリン酸バッファー（pH6.9）中
でマイクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）
（生化学工業社製）を基質として25℃で１分間反応さ
せ、450mμの吸収を0.001減少させるに必要な酵素量と
した。同様の実験を３回行って得たヒトリゾチームの産
生量は以下の表２に示す通りであった。なお、卵白リゾ
チームの天然のシグナル配列を使用して上記と同様の実
験を行った結果を対象として示した。The measurement of human lysozyme activity is mostly performed using the Worthigton Enzyme Manual, p1
00, Worthigton Biochemical Corporation, USA, 1972)
According to Sigma was used as standard human lysozyme. 1 unit is Micrococcus luteus in 0.1M phosphate buffer (pH 6.9)
(Seikagaku Corporation) as a substrate was reacted at 25 ° C. for 1 minute, and the amount of enzyme required to reduce the absorption at 450 mμ by 0.001 was determined. The production of human lysozyme obtained by performing the same experiment three times was as shown in Table 2 below. The results of the same experiment as above using the natural signal sequence of egg white lysozyme are shown.

表２から明らかな様に、卵白リゾチームの天然のシグ
ナル配列の大部分のアミノ酸をロイシン（Ｌ）に変換し
たＬ−変換体を使用した場合、天然のシグナル配列を使
用した場合に比べて著しく多量のヒトリゾチームが菌体
外に分泌された。菌体内および菌体外のリゾチーム総生
産量に於いても顕著な差がみられた。 As is clear from Table 2, in the case of using the L-converted product in which most amino acids of the egg white lysozyme natural signal sequence are converted to leucine (L), a remarkably large amount is obtained as compared with the case of using the natural signal sequence. Human lysozyme was secreted extracellularly. There was also a significant difference in the total amount of lysozyme produced inside and outside the cells.

実施例10 分泌されたリゾチームの精製 実施例６で得た形質転換体Saccharomyces cerevisiae
AH22R^-/pGEL・L10を実施例７に示した培地5mlを含む試
験管３本に接種し30℃で３日間振盪培養した。上記培地
18mlを含む200ml容三角フラスコを５本用意し、その各
々に、上の培養液2mlを移し、30℃で１日振盪培養し
た。次に上記培地200mlを含む１容三角フラスコを５
本用意し、その各々にこの培養液20mlを移し、30℃で４
日間培養した。この培養液を遠心分離機にかけ、上清と
菌体を分離した。この上清（約１）を50mMリン酸ナト
リウム緩衝液（pH6.5）で平衡化した陽イオン交換樹脂
（CM−Toyopearl650C）カラム（1.6cm×36cm）に吸着さ
せ、同緩衝液500mlで洗條後、0.5M NaClを含む同緩衝液
で溶出した。溶出液は5mlずつ分取し、各フラクション
について実施例９に従ってリゾチーム活性を測定した。
リゾチーム活性が最大となるフラクションより200μ
を取り、逆相高速液体クロマトグラフィー（TSKgel ODS
120Tカラム）により、さらに精製した。このとき溶出
は、0.1％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの０
〜100％の30分間の直線濃度勾配により行い、280nmの吸
収ピークを分取した。この分取液の溶媒を減圧により蒸
発させ、乾燥粉末としてヒトリゾチームの精製標品を得
た。Example 10 Purification of secreted lysozyme The transformant Saccharomyces cerevisiae obtained in Example 6
AH22R ⁻ / pGEL·L10 was inoculated into 3 test tubes containing 5 ml of the medium described in Example 7 and cultured with shaking at 30 ° C. for 3 days. Above medium
Five 200 ml Erlenmeyer flasks containing 18 ml were prepared, and 2 ml of the above culture solution was transferred to each of them and cultured at 30 ° C. for 1 day with shaking. Next, 5 Erlenmeyer flasks containing 200 ml of the above medium
Prepare this, transfer 20 ml of this culture solution to each, and
Cultured for a day. The culture was centrifuged to separate the supernatant from the cells. This supernatant (about 1) was adsorbed on a cation exchange resin (CM-Toyopearl 650C) column (1.6 cm x 36 cm) equilibrated with 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5), and washed with 500 ml of the same buffer. Then, elution was performed with the same buffer containing 0.5 M NaCl. The eluate was collected in 5 ml portions, and the lysozyme activity of each fraction was measured according to Example 9.
200μ from the fraction with maximum lysozyme activity
And reverse phase high performance liquid chromatography (TSKgel ODS
It was further purified by 120T column). At this time, elution was performed with 0% acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid.
A linear concentration gradient of -100% for 30 minutes was performed, and an absorption peak at 280 nm was collected. The solvent of this fraction was evaporated under reduced pressure to obtain a purified human lysozyme sample as a dry powder.

実施例11 精製リゾチームの分析 上の方法で精製したヒトリゾチーム精製標品について
Ｎ末端10残基のアミノ酸配列の決定、及びアミノ酸分析
を行った。Ｎ末端配列の決定は、精製標品７μｇを用
い、プロテイン・シーケンサー（Applied Biosystems
社、477A）により自動的に行った。アミノ酸分析は精製
標品20μｇを0.2mlの6N HClで110℃、24時間処理して加
水分解した後、反応液を減圧乾固し、これを0.5mlの0.0
2N HClに溶解して自動アミノ酸分析計（日立・835）に
より行った。またシステイン残基の定量をするために、
別に精製標品20μｇを過ギ酸0.1ml中で０℃、2.5時間処
理し、減圧乾固後上と同様に処理してアミノ酸分析を行
った。Example 11 Analysis of Purified Lysozyme The purified human lysozyme preparation purified by the above method was subjected to determination of the amino acid sequence of the N-terminal 10 residues and amino acid analysis. To determine the N-terminal sequence, 7 μg of the purified sample was used, and a protein sequencer (Applied Biosystems) was used.
477A). Amino acid analysis was carried out by treating 20 μg of the purified sample with 0.2 ml of 6N HCl at 110 ° C. for 24 hours for hydrolysis, and drying the reaction solution under reduced pressure to dryness.
It was dissolved in 2N HCl and the analysis was performed using an automatic amino acid analyzer (Hitachi 835). To quantify cysteine residues,
Separately, 20 μg of the purified sample was treated with 0.1 ml of formic acid at 0 ° C. for 2.5 hours, dried under reduced pressure and treated in the same manner as above to analyze amino acids.

（Ａ）Ｎ末端配列の決定 以下の表に示す様な結果を得た。(A) Determination of N-terminal sequence The results shown in the table below were obtained.

（Ｂ）アミノ酸の組成分析 以下の表に示す様な結果を得た。 (B) Amino acid composition analysis The results shown in the following table were obtained.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

第１図は、ヒトリゾチームをコードしているDNA配列の
５′末端を一部欠失させた配列を示す模式図であり、第
２図はＬ−変換体シグナルペプチドと、対応するDNA配
列を示す模式図であり、第３図はヒトリゾチーム分泌発
現プラスミドpGEL・L10の組立てを示す模式図である。FIG. 1 is a schematic diagram showing a sequence obtained by partially deleting the 5 ′ end of the DNA sequence encoding human lysozyme, and FIG. 2 shows the L-converter signal peptide and the corresponding DNA sequence. FIG. 3 is a schematic diagram showing the construction of human lysozyme secretion expression plasmid pGEL • L10.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏ ｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，Ｖｏｌ. 831（1985）Ｐ．340−346 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (56) References Biochimica et Bio physica Acta, Vol. 831 (1985) P. 340-346

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】卵白リゾチームの天然のシグナルペプチド
の第１、第２および第16〜18番目のアミノ酸を除く全
て、または少なくとも大部分のアミノ酸をロイシンで置
換した該シグナルペプチドのアミノ酸配列をコードして
いるDNA配列。1. A natural signal peptide of egg white lysozyme, which encodes the amino acid sequence of the signal peptide in which all or at least most of the amino acid except the first, second and 16th to 18th amino acids are substituted with leucine. DNA sequence. 【請求項２】式： Ｍ−Ｒ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｐ
−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｇ で示されるアミノ酸配列をコードしている第１項に記載
のDNA配列。2. The formula: MRLLLLLLLLLLLPLP.
-The DNA sequence according to item 1, which encodes the amino acid sequence represented by L-A-A-L-G. 【請求項３】式： で示される第１項に記載のDNA配列。3. The formula: The DNA sequence according to item 1, which is represented by