JP2718162B2

JP2718162B2 - 免疫反応用試薬の製造方法

Info

Publication number: JP2718162B2
Application number: JP8158389A
Authority: JP
Inventors: 美佐小倉; 規男萩; 哲史松本
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1989-04-03
Filing date: 1989-04-03
Publication date: 1998-02-25
Anticipated expiration: 2013-02-25
Also published as: JPH02262059A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は免疫反応用試薬の製造方法に関するものであ
り、詳しくは抗体を使用する免疫反応用の標準液又は希
釈液（以下これらを単に試薬とすることがある）の製造
方法に関するものである。

（従来の技術）例えば血清又は尿等の動物生体試料（これらは時には
ヒトに由来する試料である）に含まれる蛋白質等の生体
成分を、該成分を認識する抗体を用いて測定する方法が
知られている。

この様な免疫測定方法においては、一般に検量線を作
製するための標準液や生体試料を希釈するために希釈液
が使用される。標準液や希釈液等の免疫反応用試薬は、
生体試料と被測定物（測定されるべき生体成分）以外の
成分が同一であることが性格な免疫測定のために要求さ
れる。この様な要求に従い、従来では、例えば標準液で
あれば生体試料自体に一定濃度の被測定物を添加した
り、又例えば希釈液であれば生体試料自体をそのまま使
用することがある。

生体試料自体を利用して試薬を製造する場合には特別
な準備作業等を必要としないため、大量の試薬を得る上
では簡便である。しかし、多くの場合には、被測定物は
通常の生体試料中に初めから存在していることから、こ
れを予め除去することが正確な免疫測定には必要であ
る。

近年では、より正確な免疫反応を実施するため、例え
ば、被測定物を認識する抗体を固相に固定化した担体を
使用したアフィニティクロマトグラフィーを実施するこ
とで、生体試料中の被測定物を除去し、試薬を製造する
方法が知られる様になった。

（発明が解決しようとする課題）アフィニティクロマトグラフィーによる試薬の製造方
法においては、驚くべきことに固相に固定した抗体が遊
離し、製造された試薬がこれら被測定物を認識する抗体
で汚染されることがある。

また、生体試料中の被測定物を除去するために使用す
る抗体の取得は、通常、繁雑な操作と時間を要する。従
ってこれら抗体として免疫測定において使用する被測定
物を認識する抗体と同種の抗体を使用することが好都合
であるが、測定系で使用する抗体と同種の除去用抗体に
より汚染された試薬においては、該汚染除去用抗体が被
測定物に対して測定系で使用する抗体と競争的に反応す
るため、これを標準液として使用した場合には正確な被
測定物濃度を示す標準液とは成り得ず、又希釈液として
使用した場合も生体試料中の被測定物を正確に測定する
ことが出来ない。

以上のような課題点に鑑みて、本発明者らはより正確
な免疫測定を実施するための免疫測定用試薬を製造する
方法について検討した結果本発明を完成するに至った。
本発明は、少なくとも一種の被測定物を認識する抗体を
用いる免疫測定において使用される免疫測定用試薬の製
造方法であって、前記被測定物を含有する液体材料を固
相に固定された前記免疫測定において使用される抗体と
同種の抗体（第１抗体）と接触させる操作と、第１抗体
を固定する固相と液相を分離する操作と、分離された液
相を固相に固定された第１抗体を認識する抗体（第２抗
体）と接触させる操作と、第２抗体を固定する固相と液
相を分離する操作を含む方法、であり、以下詳細に説明
する。

（課題を解決するための手段）本発明でいう被測定物とは、例えば種々のホルモン、
抗体、腫瘍マーカー、薬物等の、免疫診断等の免疫測定
において測定されるべき対象を意味する。被測定物自体
あるいはその由来等に特別の制限はなく、ヒトに由来す
るものであってもその他の動物に由来するものであって
も良い。

本発明でいう少なくとも一種の被測定物の認識する抗
体を用いる免疫測定とは、試料中の被測定物濃度を、該
被測定物を認識する抗体で使用して測定する免疫測定系
を示す。ここで、抗体の種とは、その抗原認識部位が同
一である抗体を一種とすることを意味する。従って、被
測定物を認識する一種のモノクローナル抗体を使用する
測定は本発明では一種の抗体を使用する測定であり、被
測定物を認識するポリクローナル抗体を使用する測定は
本発明では少なくとも一種の抗体を使用する測定であ
る。ここで、例えば被測定物を認識する抗体のラベル化
等のために使用される当該抗体を認識する抗体等は本発
明でいう被測定物を認識する抗体には該当しない。

従来知られた免疫測定としては、少なくとも二種以上
の被測定物を認識する抗体を使用するサンドイッチ測
定、少なくとも一種以上の被測定物を認識する抗体を使
用する競争的測定等が本発明でいう免疫測定に該当す
る。

本発明で使用される液体材料とは、それ自体が前記免
疫測定系で測定される被測定物を含有する液体である。
先に説明した様に、正確な免疫測定のためには被測定物
以外の成分が測定に供される試料と同一であることが好
ましい。例えば測定に供される試料が動物血清である場
合には液体材料として該動物の血清を使用することが好
ましい。この様に、測定に供される試料と同一動物から
得られる材料を使用する以外にも、同種の動物から得ら
れる液体材料もしくは類似の動物から得られる液体材料
を使用しても良い。具体的に、液体材料としては、試料
として免疫測定に供される、例えば血液、血清、尿等が
例示できる。

第１及び第２抗体を固定するための固相は、特別の制
限なしに通常の免疫測定系で使用される固相と同様のも
のを使用することができる。例えばアガロース、セファ
ロース、アクリルアミド、ポリスチレン等を用いて適当
な形状の固相を形成し、これに後記する抗体を、該抗体
の免疫的活性を阻害しない様に結合させれば良い。結合
のための操作としては、例えば物理的な吸着法や、固相
中の水酸基等あるいは抗体中のチオール基、アミノ基等
を利用した化学的な結合法を用いれば良い。また、第１
抗体を固定するための固相と、第２抗体を固定するため
の固相は同じものであっても良い。時には、例えば本発
明の実施のための免疫的反応空間を提供する反応容器内
壁を固相として使用することもできる。

第１抗体は、前記した免疫測定系で使用される被測定
物を認識する抗体と同種の抗体であれば良く、他に何等
制限はない。従って、第１抗体としては、免疫測定で使
用される抗体以外のものを新たに調製することなく本発
明を実施できる。

免疫測定系で用いる被測定物を認識する抗体が複数種
ある場合に使用される第１抗体は、それらの内の少なく
とも一種と同種であれば良い。この場合には、また、そ
れらの内の二種以上を第１抗体として使用することも出
来るが、後に説明する第２抗体の準備のため、一種を使
用することが好ましい。しかし、例えば免疫測定系で使
用される複数種の抗体の内、同一動物に由来し同一の免
疫グロブリンクラスに属する二種以上の抗体を使用する
ことでも第２抗体の準備を簡単にすることができる。即
ち、後で説明する様に、第２抗体として、当該クラスの
抗体に特徴的なFc部分を認識するものを用いれば良い。

第１抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクロ
ーナル抗体であっても良い。また免疫測定系で使用され
る被測定物を認識する抗体と同種という制限は、例えば
該抗体をプロテアーゼ等により消化処理し、フラグメン
ト化して使用することを妨げるものではない。

本発明でいう第２抗体は前記の第１抗体を認識する抗
体であり、第１抗体を免疫源として、第１抗体を製造す
るために使用した動物以外の動物に免疫することで製造
することができる。この様な第２抗体の製造法として
は、従来公知の方法を採用することができる。第２抗体
はポリクローナル抗体であっても良いが、均一な免疫的
性質を示すモノクローナル抗体が好ましい。第１抗体と
して複数種の抗体が使用された場合には、第２抗体とし
てこれらすべての第１抗体の対応する一種以上の抗体を
使用する。第２抗体の準備を簡便にするためには第１抗
体として一種の抗体を使用すれば良いが、同一動物に由
来し同一の免疫グロブリンクラスに属する二種以上の抗
体を使用した場合であっても第２抗体としてこれら抗体
の属するクラスに特徴的な部分、即ちFc部分を認識する
抗体を使用すれば良い。ここで、第２抗体として第１抗
体のFc部分を認識する抗体を使用することは、第２抗体
による試薬の汚染の影響をも払拭することができるため
好ましい。即ち、免疫測定で用いられる被測定物を認識
する抗体の少なくとも一と第２抗体のそのFc部分への反
応は、該抗体と被測定物との免疫反応を阻害しないから
である。

本発明の方法に従って製造された試薬を、二種以上の
同一の免疫グロブリンクラスに属する、即ちFc部分が同
一又は類似する被測定物を認識する抗体を用いる免疫測
定で使用する場合には、第２抗体として、第１抗体のFc
部分を認識しかつ一価性の抗体を使用することが好まし
い。前記の様な測定として、例えば同一のクラスに属す
る二種の抗体を使用する二抗体サンドイッチ測定が例示
できるが、この場合、試薬を汚染した第２抗体の存在
が、固相に固定された抗体と検出用試薬を結合した抗体
を結合させることが予想されるからである。また、サン
ドイッチ測定又は競争的測定において、検出用試薬を結
合した抗体が同一のクラスに属する二種又はそれ以上の
抗体である場合には、第２抗体がこれら抗体を互いに結
合させてしまう結果、これら抗体と被測定物の反応が影
響され、強いては測定影響が影響されると予想されるか
らである。従って、この場合においては、第２抗体とし
て例えばFab又はFab′断片等の一価性の抗体を使用する
ことで第２抗体を介した、免疫測定で用いられる抗体間
の結合を防ぐことができる。

本発明で、抗体としてモノクローナル抗体を使用する
場合には、ケーラーとミルシュタインの方法（G.Kohle
r,C.Milstein,Nature,256巻、495頁、1975年）を参考に
すれば良い。

本発明の方法は、第１又は第２抗体を固定した固相を
カラムに充填して用いることにより簡便に、又迅速に実
施できる。特に、第１及び第２抗体のカラムをそれぞれ
用意し、それらを直列に接続することで、液体材料の添
加後は適当なpHとイオン強度等を有する例えばリン酸緩
衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液を添加する
のみで試薬を製造することができる。このときの緩衝液
のpHやイオン強度等は通常の免疫測定で使用される条件
を設定すれば良い。

（発明の作用）本発明の製造方法は、材料中の被測定物を第１抗体と
反応させこれを捕え、該第１抗体が固相に固定されてい
ることを利用して液相と固相を分離し、さらに液相を汚
染した、測定に影響を与える第１抗体を第２抗体と反応
させこれを捕え、該第２抗体が固相に固定されているこ
とを利用して液相と固相を分離することで試薬を製造す
るものである。第２抗体として第１抗体のFc部分を認識
する交代を使用すれば、試薬が第２抗体により汚染され
た場合の、第２抗体による免疫測定における被測定物と
抗体の反応の更に減少させることが出来る。更に、第２
抗体として一価性の抗体を使用すれば、二種以上の同一
免疫グロブリンクラスに属する抗体を使用する免疫測定
においての、それら抗体間の結合を引起こすことがな
い。

（発明の効果）本発明の方法では、少なくとも一種の被測定物を認識
する抗体を使用する免疫測定系において使用される免疫
測定用試薬を、それ自体が該被測定物を含有する材料、
即ち、該測定系に供される試料と同一材料又は同一の動
物から得られる材料もしくは類似の動物から得られる材
料から製造することを可能とするから、被測定物以外の
成分が免疫測定に供される試料と同一又は類似という特
徴をもった、より正確な免疫測定を実施するために好適
な試薬を提供することができる。

また、本発明で使用する第１抗体は、免疫測定系で使
用される被測定物を認識する抗体と同種であるから、そ
の準備には特別の操作を必要としない。特に、本発明の
方法は液体クロマトグラフィーの形態で実施することに
より、より簡便に実施することができる。

（発明の実施例）以下本発明を更に詳細に説明するため実施例を記載す
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。

（ヒトLH（黄体形成ホルモン）免疫測定用試薬の製造）実施例１第１抗体による材料の処理ミルシュタインとケーラーの方法に従って予め調製さ
れた抗ヒトLHマウスモノクローナル抗体を用いる免疫測
定で使用する試薬を製造した。該抗体100mgを予め0.1M
のPBS溶液（塩化ナトリウム5g/l、リン酸水素カリウム
0.2g/l、リン酸水素２ナトリウム1.15g/l、塩化カリウ
ム0.2g/lを含むpH7.5の水溶液）にて洗浄した固相（Bio
−Rad社製、Affi−prep10）25mlに対して混和して固定
化し、0.1Mモノエタノールアミンを服務0.1M PBS（pH
7.5）を加えてブロッキングした。次いで該固相をバイ
オラッド社製エコノカラム（内径2.5cm）に充填した。

前記カラムを0.1M PBS（pH7.5）で洗浄した後、ヒト
血清を添加し、LHを除去した。

イムノプレートII（日本インターメッド社、カタログ
No.442404）に、抗マウスIgGヤギ抗体（スキャンタイボ
ディ社;Scantibodies Laboratory Inc.製Ab−９）を
固定化し、前記の様にして得たLH除去ヒト血清中のマウ
ス抗体量を測定したところ、17ng/mlのマウス抗体が検
出された。このことは、製造された試薬が第１抗体によ
り汚染されていることを示す。

実施例２第１抗体による試薬汚染の影響の調査実施例１で使用した抗ヒトLHマウスモノクトーナル抗
体及び該抗体とは異なる部位でLHを認識する抗LHマウス
モノクローナル抗体（Igクラス）の２種の抗体につい
て、一方に標識としてアルカリ性ホスファターゼを結合
させ、もう一方を特開昭63−15167号に記載されたグリ
シジルメタアクリレートで表面を被覆された固相に固定
化した。

ヒト血清に、それぞれ０、３、6.15、3.01、60.2、12
0.4ng/mlとなる様に実施例１で使用した抗ヒトLHマウス
モノクローナル抗体を添加し、第１抗体存在下でのサン
ドイッチ測定を行った。

反応容器に前記の様にして固定化した抗体を入れた
後、先に調整した第１抗体を含む各試薬50μｌ及び標識
された抗ヒトLHマウスモノクローナル抗体を添加し、37
℃で40分間反応させた。その後、0.005％ Tween 20を
含むPBS（塩化ナトリウム5g/l、リン酸水素カリウム0.2
g/l、リン酸水素２ナトリウム1.15g/l、塩化カリウム0.
2g/lを含むpH7.4の水溶液）で洗浄し、４メチルウンベ
ルフェリルリン酸（以下4MUPと略す）を添加後、励起波
長369nm、蛍光波長450nmで蛍光強度の増加速度を測定し
た。抗LHマウスモノクローナル抗体（第１抗体）を添加
していない血清における蛍光強度増加速度を１とした場
合のそれぞれの相対値を図１に示す。図１からは、実施
例で１得られた約20ng/mlの抗体を含む試薬では、抗体
を含まない試薬（ヒト血清）に比例して10％程度免疫反
応レスポンスが低下することが分る。

実施例３第２抗体による処理実施例１で得られた、ヒトLH除去用抗体（第１抗体）
で汚染された試薬を、さらに第１抗体除去用カラムで処
理した。

実施例１でマウスIgG量の検出に使用した抗マウスIgG
ヤギ抗体を実施例１と同様にして固定化し、同様のカラ
ムに充填した。該カラムを洗浄後、実施例１で製造され
た試薬を添加し、本発明の方法に従ったヒトLH免疫測定
用試薬を製造した。

実施例４第２抗体による試薬汚染の影響の調査実施例２で使用したヒトLHの免疫測定のための測定系
を用いて、実施例３で使用された第２抗体（抗マウスIg
Gヤギ抗体）による試薬の汚染の影響を調査した。

ヒト血清にそれぞれ０、10、20、30、50、75、100、2
00、500、1000ng/mlずつ抗マウスIgG抗体を添加した試
薬を用いて実施例２と同様の免疫測定を行った。結果を
図２に示す。図２から、第２抗体による試薬の汚染が２
種の被測定物を認識する抗体を用いる免疫測定に影響を
及ぼさないことがわかる。

（ヒトAFP（アルファフェトプロテイン）免疫測定用試
薬の製造）実施例５第１抗体による試薬汚染の影響の調査２種の抗ヒトAFPマウスモノクローナル抗体（IgGクラ
ス）をミルシュタインとケーラーの方法に従って調製し
た。50mM炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.6）（以下この緩
衝液をＡ液とする）で1.0μg/mlに調整した一方の抗ヒ
トAFPマウスモノクローナル抗体を、実施例１で使用し
たプレートに100μｌずつ分注して固定化した。これを
４℃にて一晩放置した後、（塩化ナトリウム5g/l、リン
酸水素カリウム0.2g/l、リン酸水素２ナトリウム1.15g/
l、塩化カリウム0.2g/l、Tween20 0.5ml/lを含むpH7.4
に調製した水溶液；以下この水溶液をＢ液とする）にて
洗浄し、更に0.1重量％となる様に牛血清アルブミンを
添加したＢ液を300μｌずつウェルに添加して４℃にて
一晩放置してブロッキングした。

牛血清アルブミンを、（塩化ナトリウム5g/l、リン酸
水素カリウム0.2g/l、リン酸水素２ナトリウム1.15g/
l、塩化カリウム0.2g/lを含むpH7.4の水溶液；以下この
水溶液をＤ液とする）に0.1重量％添加した水溶液（以
下この水溶液をＥ液とする）に一定量のヒトAFP及び前
記抗ヒトAFPマウスモノクローナル抗体（固定化した抗
体と同じ）をそれぞれ０、2.5、５、10、20、40、80、8
00ng/mlとなる様に添加した試料を100μｌずつウェルに
添加し、37℃にて２時間放置した後、Ｂ液にて３回洗浄
し、西洋ペルオキシダーゼで標識した一方の抗ヒトAFP
マウスモノクローナル抗体溶液100μｌを分注した。な
お、西洋ペルオキシダーゼ標識抗AFPマウス抗体は、Nak
ane,P.K.らの方法（J.Histochem.Cytochem.,22:1084−1
091、1974）に従って調製した。

各ウェルに過酸化水素を含むABTSを100μｌを添加
し、室温にて１時間放置した後、シュウ酸溶液（pH1）
を添加して酸素反応を停止させた後、各ウェルの415nm
における吸光度を測定した。結果を図３に示す。この結
果、AFPの免疫測定における第１抗体による試薬の汚染
は、測定結果に影響を及ぼすことが分る。

実施例６第２抗体による試薬汚染の調査実施例５で使用した抗ヒトAFPマウスモノクローナル
抗体（1.0μg/ml）100μｌを実施例１と同様にプレート
に結合させ、Ｃ液にてブロッキングを行った。

Ｅ液に通常の方法に従ってペプシン処理して得た抗マ
ウスIgGヤギ抗体のFab′断片をそれぞれ０、10、30、10
0、300、1000、3000ng/mlに溶解した試料及び抗マウスI
gGヤギ抗体をFab′断片と同濃度になる様に溶解した試
料を各ウェルに分注し、37℃にて２時間放置した後、Ｂ
液にて３回洗浄した。

実施例５と同様の西洋ペルオキシダーゼ標識抗ヒトAF
Pマウスモノクローナル抗体（1.0μg/ml）100μｌを各
ウェルに分注し、37℃にて２時間放置した後、100μｌ
の過酸化水素溶液を添加し、室温にて１時間放置した。
酵素反応を停止させた後、各ウェルにおける415nmの吸
光度を測定した。結果を図４に示す。この結果からは第
２抗体による試薬の汚染は、免疫測定における影響が少
ないことが分る。また、Fab′断片の様な一価性第２抗
体は、二価性第２抗体に比較して、より好ましいことが
分る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例２の結果を示す。横軸は免疫測
定に供された試料（ヒト血清）中の第１抗体（抗ヒトLH
マウスモノクローナル抗体）濃度を示し、縦軸は第１抗
体が存在しない試料における免疫測定の結果を１とした
場合の各試料の相対的な値を示す。第２図は本発明の実施例４の結果を示す。横軸は免疫測
定に供された試料（ヒト血清）中の第２抗体（抗マウス
IgG抗体）濃度（ただし、図中の抗体濃度を示す数字は
実際の抗体濃度の1/1000を示す）を示し、縦軸は各試料
における免疫測定の結果（単位時間当りの蛍光強度）を
示す。第３図は本発明の実施例５の結果を示す。横軸は免疫測
定に供された試料（ヒト血清）中の第１抗体（抗ヒトAF
Pウサギ抗体）濃度を示し、縦軸は各試料における免疫
測定の結果（吸光度）を示す。第４図は本発明の実施例６の結果を示す。横軸は免疫測
定に供された試料（ヒト血清）中の第２抗体（抗ウサギ
IgGヤギ抗体）濃度を示し、縦軸は各試料における免疫
測定の結果（吸光度）を示す。図中、白丸は第２抗体と
して抗ウサギIgGヤギ抗体Fab′断片（一価性）を添加し
た場合の結果を、黒丸は第２抗体として抗ウサギIgGヤ
ギ抗体を添加した結果を示す。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも一種の被測定物を認識する抗体
を用いる免疫測定において使用される免疫測定用試薬の
製造方法であって、前記被測定物を含有する液体材料を
固相に固定された前記免疫測定において使用される抗体
と同種の抗体（第１抗体）と接触させる操作と、第１抗
体を固定する固相と液相を分離する操作と、分離された
液相を固相に固定された第１抗体を認識する抗体（第２
抗体）と接触させる操作と、第２抗体を固定する固相と
液相を分離する操作を含む方法
【請求項２】第２抗体は一価性の抗体である請求項第
（１）項記載の方法
【請求項３】第２抗体は第１抗体のFc部分を認識する抗
体である請求項第（１）項又は第（２）項記載の方法
【請求項４】免疫測定は二種以上の同一の免疫クロブリ
ンクラスに属する被測定物を認識する抗体を使用する測
定であり、第２抗体は第１抗体のFc部分を認識する抗体
であり同時に一価性の抗体である請求項第（１）項記載
の方法