JP2716470B2 - Ｌ−イソロイシンの製造方法 - Google Patents
Ｌ−イソロイシンの製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はＬ−イソロイシンの製造方法に関し、さらに
詳しくは、酵素法ないし発酵法によりＬ−イソロイシン
を副生物の生成を抑制して高収量で製造する方法に関す
る。
詳しくは、酵素法ないし発酵法によりＬ−イソロイシン
を副生物の生成を抑制して高収量で製造する方法に関す
る。
Ｌ−イソロイシンは必須アミノ酸の１つであり、人間
及び動物の栄養上主要な役割を果すアミノ酸として、医
薬品、食品、飼料添加物等に配合されており、近年その
需要が急激に増加しつつある。
及び動物の栄養上主要な役割を果すアミノ酸として、医
薬品、食品、飼料添加物等に配合されており、近年その
需要が急激に増加しつつある。
Ｌ−イソロイシンは、他のアミノ酸と同様に立体異性
体が存在するため、化学的に合成することは一般には困
難であり、工業的には主として発酵法により生産されて
いる。例えば、DL−α−アミノ酪酸、スレオニン等のＬ
−イソロイシンの前駆物質中で発酵を行なう方法（特公
昭43−8709号公報、特公昭40−2880号公報等参照）；か
かる前駆物質を用いない所謂直接発酵による方法（特公
昭38−7091号公報、特公昭49−93586号公報等参照）等
が採用されている。
体が存在するため、化学的に合成することは一般には困
難であり、工業的には主として発酵法により生産されて
いる。例えば、DL−α−アミノ酪酸、スレオニン等のＬ
−イソロイシンの前駆物質中で発酵を行なう方法（特公
昭43−8709号公報、特公昭40−2880号公報等参照）；か
かる前駆物質を用いない所謂直接発酵による方法（特公
昭38−7091号公報、特公昭49−93586号公報等参照）等
が採用されている。
一方、酵素法としては、例えば、アンモニウムイオ
ン、またはイソロイシン以外のＬ−もしくはDL−アミノ
酸の存在下にＤ−、Ｌ−またはDL−α−ケト−β−メチ
ル酪酸からＬ−イソロイシンを製造する方法（特公昭46
−29789号公報参照）；アンモニウムイオン、またはイ
ソロイシン以外のＬ−もしくはDL−アミノ酸の存在下に
Ｄ−イソロイシンまたはＤ−アロイソロイシンの単独も
しくは混合物またはこれらとその光学異性体との適宜混
合物に作用させてＬ−イソロイシンを製造する方法（特
公昭46−29788号公報参照）；セラチア（Serratia）属
細菌の固定化物を用いてグルコースとＤ−スレオニンか
らＬ−イソロイシンを製造する方法（日本醗酵工学会大
会講演要旨集、47−48頁、昭和52年度）等が報告されて
いる。
ン、またはイソロイシン以外のＬ−もしくはDL−アミノ
酸の存在下にＤ−、Ｌ−またはDL−α−ケト−β−メチ
ル酪酸からＬ−イソロイシンを製造する方法（特公昭46
−29789号公報参照）；アンモニウムイオン、またはイ
ソロイシン以外のＬ−もしくはDL−アミノ酸の存在下に
Ｄ−イソロイシンまたはＤ−アロイソロイシンの単独も
しくは混合物またはこれらとその光学異性体との適宜混
合物に作用させてＬ−イソロイシンを製造する方法（特
公昭46−29788号公報参照）；セラチア（Serratia）属
細菌の固定化物を用いてグルコースとＤ−スレオニンか
らＬ−イソロイシンを製造する方法（日本醗酵工学会大
会講演要旨集、47−48頁、昭和52年度）等が報告されて
いる。
しかしながら、これらの方法は、原料コストが嵩む、
収率が低い等の問題があり、十分に満足しうるものでは
ない。
収率が低い等の問題があり、十分に満足しうるものでは
ない。
また、本発明者らは先に、ブレビバクテリウム（Brev
ibacterium）属に属し且つエタノール資化性を有する微
生物を、DL−α−アミノ酪酸を含むエタノールを主炭素
源とする培地で好気的に培養して、培養液中にＬ−イソ
ロイシンを生成蓄積せしめ、この培養液からＬ−イソロ
イシンを採取することを特徴とする、発酵法によるＬ−
イソロイシンの製造法（特公昭57−26755号公報、特公
昭59−28398号公報参照）；並びにブレビバクテリウム
属に属し且つエタノール資化性を有する微生物菌体もし
くはその処理物又はこれらの固定化物の存在下に、エタ
ノール及びα−アミノ酪酸を含有する水溶液を酵素反応
させて該溶液中にＬ−イソロイシンを生成せしめ、これ
からＬ−イソロイシンを採取することを特徴とするＬ−
イソロイシンの製造法（特願昭61−133773号出願明細書
参照）を提案した。
ibacterium）属に属し且つエタノール資化性を有する微
生物を、DL−α−アミノ酪酸を含むエタノールを主炭素
源とする培地で好気的に培養して、培養液中にＬ−イソ
ロイシンを生成蓄積せしめ、この培養液からＬ−イソロ
イシンを採取することを特徴とする、発酵法によるＬ−
イソロイシンの製造法（特公昭57−26755号公報、特公
昭59−28398号公報参照）；並びにブレビバクテリウム
属に属し且つエタノール資化性を有する微生物菌体もし
くはその処理物又はこれらの固定化物の存在下に、エタ
ノール及びα−アミノ酪酸を含有する水溶液を酵素反応
させて該溶液中にＬ−イソロイシンを生成せしめ、これ
からＬ−イソロイシンを採取することを特徴とするＬ−
イソロイシンの製造法（特願昭61−133773号出願明細書
参照）を提案した。
本発明者らは、先に提案した上記２つの方法につき、
Ｌ−イソロイシンをさらに高収率で取得すべく改良研究
を行なっている過程で、発酵培養液中又は酵素反応溶液
中にＯ−エチルホモセリンが副生し、この物質が培養液
又は反応液からのＬ−イソロイシンの分離精製を煩雑に
し、Ｌ−イソロイシンの回収率を低下させていることを
究明した。そこで、本発明者らは、発酵培養液中又は酵
素反応溶液中におけるＯ−エチルホモセリンの副生を抑
制すれば、Ｌ−イソロイシンの収率を向上させうると考
え、その抑制方法につき鋭意検討を重ねた結果、今回、
前述したブレビバクテリウム属に属するビオチン要求性
微生物又はその処理物を用いる発酵法又は酵素法による
Ｌ−イソロイシンの製造を、Ｌ−もしくはDL−メチオニ
ンの存在下に実施すれば、Ｏ−エチルホモセリンの副生
が大幅に低減し、培養液又は酵素反応液からのＬ−イソ
ロイシンの分離精製が容易となり、Ｌ−イソロイシンの
収率も向上させうることが見出され、本発明を完成する
に至った。
Ｌ−イソロイシンをさらに高収率で取得すべく改良研究
を行なっている過程で、発酵培養液中又は酵素反応溶液
中にＯ−エチルホモセリンが副生し、この物質が培養液
又は反応液からのＬ−イソロイシンの分離精製を煩雑に
し、Ｌ−イソロイシンの回収率を低下させていることを
究明した。そこで、本発明者らは、発酵培養液中又は酵
素反応溶液中におけるＯ−エチルホモセリンの副生を抑
制すれば、Ｌ−イソロイシンの収率を向上させうると考
え、その抑制方法につき鋭意検討を重ねた結果、今回、
前述したブレビバクテリウム属に属するビオチン要求性
微生物又はその処理物を用いる発酵法又は酵素法による
Ｌ−イソロイシンの製造を、Ｌ−もしくはDL−メチオニ
ンの存在下に実施すれば、Ｏ−エチルホモセリンの副生
が大幅に低減し、培養液又は酵素反応液からのＬ−イソ
ロイシンの分離精製が容易となり、Ｌ−イソロイシンの
収率も向上させうることが見出され、本発明を完成する
に至った。
かくして本発明によれば、ブレビバクテリウム（Brev
ibacterium）属に属するビチオン要求性微生物の菌体又
はその処理物の存在下に、Ｌ−もしくはDL−α−アミノ
−ｎ−酪酸もしくはその塩、α−ケト酪酸もしくはその
塩及びＬ−もしくはDL−α−ヒドロキシ酪酸もしくはそ
の塩より選ばれる酪酸誘導体を水性エタノール溶液中で
酵素反応せしめてＬ−イソロイシンを製造するに当り、
該酵素反応をＬ−もししくはDL−メチオニンの共存下に
行なうことを特徴とするＬ−イソロイシンの製造方法
［以下、酵素法という］が提供される。
ibacterium）属に属するビチオン要求性微生物の菌体又
はその処理物の存在下に、Ｌ−もしくはDL−α−アミノ
−ｎ−酪酸もしくはその塩、α−ケト酪酸もしくはその
塩及びＬ−もしくはDL−α−ヒドロキシ酪酸もしくはそ
の塩より選ばれる酪酸誘導体を水性エタノール溶液中で
酵素反応せしめてＬ−イソロイシンを製造するに当り、
該酵素反応をＬ−もししくはDL−メチオニンの共存下に
行なうことを特徴とするＬ−イソロイシンの製造方法
［以下、酵素法という］が提供される。
本発明によればさらに、ブレビバクテリウム属に属す
るビオチン要求性微生物を、Ｌ−もしくはDL−α−アミ
ノ−ｎ−酪酸もしくはその塩、α−ケト酪酸もしくはそ
の塩及びＬ−もしくはDL−ヒドロキシ酪酸もしくはその
塩より選ばれる酪酸誘導体を含有するエタノールを主炭
素源とする培地で好気的に培養し、培養液中にＬ−イソ
ロイシンを生産蓄積せしめるに当り、該培養をＬ−もし
くはDL−メチオニンの存在下に行なうことを特徴とする
Ｌ−イソロイシンの製造方法［以下、発酵法という］が
提供される。
るビオチン要求性微生物を、Ｌ−もしくはDL−α−アミ
ノ−ｎ−酪酸もしくはその塩、α−ケト酪酸もしくはそ
の塩及びＬ−もしくはDL−ヒドロキシ酪酸もしくはその
塩より選ばれる酪酸誘導体を含有するエタノールを主炭
素源とする培地で好気的に培養し、培養液中にＬ−イソ
ロイシンを生産蓄積せしめるに当り、該培養をＬ−もし
くはDL−メチオニンの存在下に行なうことを特徴とする
Ｌ−イソロイシンの製造方法［以下、発酵法という］が
提供される。
以下、本発明の方法につきさらに詳細に説明する。
本発明の方法において使用される微生物は、ブレビバ
クテリウム（Brevibacterium）属に属するビオチン要求
性微生物であり、好ましくはエタノール資化性を有する
ものである。その中にはＬ−イソロイシン生産菌も含ま
れる。そのような微生物の具体例としては、 ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）MJ−233:（微工研条寄第1497号）、 ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）MJ−233−AB−41（微工研条寄第1498号）、 ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）MJ−233−ABT−11（微工研条寄第1500号）、 ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）MJ−233−ABD−21（微工研条寄第1499号）、等 が挙げられ、これらの菌が本発明において好適に用いら
れる。
クテリウム（Brevibacterium）属に属するビオチン要求
性微生物であり、好ましくはエタノール資化性を有する
ものである。その中にはＬ−イソロイシン生産菌も含ま
れる。そのような微生物の具体例としては、 ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）MJ−233:（微工研条寄第1497号）、 ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）MJ−233−AB−41（微工研条寄第1498号）、 ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）MJ−233−ABT−11（微工研条寄第1500号）、 ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）MJ−233−ABD−21（微工研条寄第1499号）、等 が挙げられ、これらの菌が本発明において好適に用いら
れる。
なお、上記の微工研条寄第1498号の菌株は、微工研条
寄第1497号の菌株を親株としてDL−α−アミノ酪酸耐性
を積極的に付与されたエタノール資化性微生物である
（特公昭59−28398号公報第３〜４欄参照）。また、微
工研条寄第1500号の菌株は、微工研条寄第1497号の菌株
を親株としたＬ−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ高
活性変異株である（特願昭60−190609号明細書３−５頁
参照）。さらに、微工研条寄第1499号の菌株は微工研条
寄第1497号の菌株を親株としたＤ−α−アミノ酪酸デア
ミナーゼ高活性変異株である（特願昭61−177993号公報
参照）。
寄第1497号の菌株を親株としてDL−α−アミノ酪酸耐性
を積極的に付与されたエタノール資化性微生物である
（特公昭59−28398号公報第３〜４欄参照）。また、微
工研条寄第1500号の菌株は、微工研条寄第1497号の菌株
を親株としたＬ−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ高
活性変異株である（特願昭60−190609号明細書３−５頁
参照）。さらに、微工研条寄第1499号の菌株は微工研条
寄第1497号の菌株を親株としたＤ−α−アミノ酪酸デア
ミナーゼ高活性変異株である（特願昭61−177993号公報
参照）。
これらの微生物の他に、ブレビバクテリウム・アンモ
ニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）ATCC 687
1、同ATCC13745、同ATCC 13746;ブレビバクテリウム・
デバリカタム（Brevibacterium divaricatum）ATCC 14
020等を用いることもできる。
ニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）ATCC 687
1、同ATCC13745、同ATCC 13746;ブレビバクテリウム・
デバリカタム（Brevibacterium divaricatum）ATCC 14
020等を用いることもできる。
以上に述べた如きブレビバクテリウム属に属するビオ
チン要求性微生物の培養は、通常の方法に従い、エタノ
ール主炭素源とし、そしてさらに窒素源、無機塩等の栄
養分を含む培地を用いて行なうことができる。発酵法に
よってＬ−イソロイシンを製造する場合には、培地にＬ
−もしくはDL−α−アミノ−ｎ−酪酸もしくはその塩、
α−ケト酪酸もしくはその塩及びＬ−もしくはDL−ヒド
ロキシ酪酸もしくはその塩より選ばれる酪酸誘導体を含
有せしめる。
チン要求性微生物の培養は、通常の方法に従い、エタノ
ール主炭素源とし、そしてさらに窒素源、無機塩等の栄
養分を含む培地を用いて行なうことができる。発酵法に
よってＬ−イソロイシンを製造する場合には、培地にＬ
−もしくはDL−α−アミノ−ｎ−酪酸もしくはその塩、
α−ケト酪酸もしくはその塩及びＬ−もしくはDL−ヒド
ロキシ酪酸もしくはその塩より選ばれる酪酸誘導体を含
有せしめる。
培地に含ませうる窒素源としては、微生物の培養に際
して通常使用しうる窒素含有有機または無機物質、例え
ば、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、尿素等を単独若しくは混合して
用いることができ、また、無機塩としては、例えば、リ
ン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグ
ネシウム等を用いることができる。こ他に菌の生育及び
Ｌ−イソロイシンの生成に必要であれば、ペプトン、肉
エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミ
ノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添加し用いる。
して通常使用しうる窒素含有有機または無機物質、例え
ば、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、尿素等を単独若しくは混合して
用いることができ、また、無機塩としては、例えば、リ
ン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグ
ネシウム等を用いることができる。こ他に菌の生育及び
Ｌ−イソロイシンの生成に必要であれば、ペプトン、肉
エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミ
ノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添加し用いる。
培養は通気撹拌、振盪等の好気的条件下で行なわれ、
培養温度は一般に20〜40℃、好ましくは25〜35℃の範囲
内とすることができる。また、培地のpHは通常５〜10の
範囲、好ましくは７〜８付近が適当であり、培養中のpH
の調整は培地に適宜酸又はアルカリを添加して行なうこ
とができる。
培養温度は一般に20〜40℃、好ましくは25〜35℃の範囲
内とすることができる。また、培地のpHは通常５〜10の
範囲、好ましくは７〜８付近が適当であり、培養中のpH
の調整は培地に適宜酸又はアルカリを添加して行なうこ
とができる。
培養開始時のエタノール濃度は好ましくは１〜５容量
％、更に好ましくは２〜３容量％の範囲内が適当であ
る。培養期間は通常２〜９日間、好ましくは４〜７日間
である。
％、更に好ましくは２〜３容量％の範囲内が適当であ
る。培養期間は通常２〜９日間、好ましくは４〜７日間
である。
発酵法において、培地に対する前記酪酸誘導体の添加
濃度は、一般に0.1〜５重量％、好ましくは１〜３重量
％の範囲内とすることができる。
濃度は、一般に0.1〜５重量％、好ましくは１〜３重量
％の範囲内とすることができる。
本発明の方法を発酵法で行なう場合、本発明は培養を
Ｌ−もしくはDL−メチオニンの存在下に実施する点に本
質的特徴を有するものである。培地へのＬ−もしくはDL
−メチオニンの添加濃度は、用いる培地の組成や微生物
の種類等に応じて変えることができるが、一般には0.01
〜５重量％、好ましくは0.05〜２重量％の範囲内が適当
である。
Ｌ−もしくはDL−メチオニンの存在下に実施する点に本
質的特徴を有するものである。培地へのＬ−もしくはDL
−メチオニンの添加濃度は、用いる培地の組成や微生物
の種類等に応じて変えることができるが、一般には0.01
〜５重量％、好ましくは0.05〜２重量％の範囲内が適当
である。
一方、本発明の方法を酵素法で実施する場合、上記の
如く培養することにより得られる培養物から菌体を集
め、水や適当な緩衝液で洗浄した後そのまま使用するこ
とができる。或いは該菌体をそれ自体既知の方法で固定
化し固定化物として使用することができ、又は該菌体を
超音波、圧搾等の手段で破砕し、その破砕物もしくはそ
れをさらにそれ自体既知の方法で固定化した固定化酵素
を使用することもできる。微生物菌体又はその破砕物の
固定化法としては、例えば、アクリルアミド等の重合性
モノマーを用いる方法、アルギン酸塩やカラギーナン等
の適当な担体を用いて不溶化させる方法等が挙げられ
る。
如く培養することにより得られる培養物から菌体を集
め、水や適当な緩衝液で洗浄した後そのまま使用するこ
とができる。或いは該菌体をそれ自体既知の方法で固定
化し固定化物として使用することができ、又は該菌体を
超音波、圧搾等の手段で破砕し、その破砕物もしくはそ
れをさらにそれ自体既知の方法で固定化した固定化酵素
を使用することもできる。微生物菌体又はその破砕物の
固定化法としては、例えば、アクリルアミド等の重合性
モノマーを用いる方法、アルギン酸塩やカラギーナン等
の適当な担体を用いて不溶化させる方法等が挙げられ
る。
本発明に従う酵素法は、上記の如き微生物菌体又はそ
の処理物の存在下且つＬ−もしくはDL−メチオニンの共
存下に、前述の酪酸誘導体が水性エタノール溶液中で反
応せしめられる。上記水性エタノール溶液中におけるエ
タノールの濃度は一般に0.5〜40容量％、好ましくは１
〜20容量％の範囲内とすることができる。
の処理物の存在下且つＬ−もしくはDL−メチオニンの共
存下に、前述の酪酸誘導体が水性エタノール溶液中で反
応せしめられる。上記水性エタノール溶液中におけるエ
タノールの濃度は一般に0.5〜40容量％、好ましくは１
〜20容量％の範囲内とすることができる。
該水性溶液は、エタノールを含有する水あるいはリン
酸又はトリス塩酸等の緩衝液であることもできるが、好
ましくはエタノールを含み更に窒素源及び／又は無機塩
類を含む水溶液が用いられる。
酸又はトリス塩酸等の緩衝液であることもできるが、好
ましくはエタノールを含み更に窒素源及び／又は無機塩
類を含む水溶液が用いられる。
本発明の方法において、酵素反応系に添加しうる窒素
源及び無機塩類としては、通常の微生物菌体の培養液に
際して使用される培地に添加されるものから選んで使用
することができる。ただし、この場合、ビオチンを含ま
ないものを用いるのが望ましい。
源及び無機塩類としては、通常の微生物菌体の培養液に
際して使用される培地に添加されるものから選んで使用
することができる。ただし、この場合、ビオチンを含ま
ないものを用いるのが望ましい。
上記水性溶液中に含ませうる窒素源の具体例として
は、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機窒
素源等を例示することができ、また、無機塩としては、
リン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マ
グネシウム、硫酸マンガン、硫酸鉄等が挙げられる、こ
れらの窒素源及び無機塩は、単独でも２種以上混合して
用いることもできる。
は、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機窒
素源等を例示することができ、また、無機塩としては、
リン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マ
グネシウム、硫酸マンガン、硫酸鉄等が挙げられる、こ
れらの窒素源及び無機塩は、単独でも２種以上混合して
用いることもできる。
これら窒素源及び／又は無機塩の水性溶液中の濃度
は、通常の微生物菌体の培養に使用される培地における
と同程度の範囲とすることができ、特に限定されない。
は、通常の微生物菌体の培養に使用される培地における
と同程度の範囲とすることができ、特に限定されない。
このような反応液の一例を示すと、（NH4）2SO4 2g/
、;KH2PO4 0.5g/;K2HPO4 0.5g/;MgSO4・7H2O 0.5
g/;FeSO4・7H2O 20ppm;MnSO4・４〜6H4O 20ppm含有す
るpH7.6の水溶液が挙げられる。
、;KH2PO4 0.5g/;K2HPO4 0.5g/;MgSO4・7H2O 0.5
g/;FeSO4・7H2O 20ppm;MnSO4・４〜6H4O 20ppm含有す
るpH7.6の水溶液が挙げられる。
さらに、上記水性溶液にはビチオンを含有しないアミ
ノ酸、ビタミン、糖類等を添加することもできる。
ノ酸、ビタミン、糖類等を添加することもできる。
水性溶液中における前記Ｌ−もしくはDL−α−アミノ
−ｎ−酪酸もしくはその塩、α−ケト酪酸もしくはその
塩およびＬ−もしくはDL−α−ヒドロキシ酪酸もしくは
その塩より選ばれる酪酸誘導体の濃度には特に制限はな
いが、一般には0.1〜20％（wt/vol）、好ましくは0.2〜
５％（wt/vol）の範囲が適当である。
−ｎ−酪酸もしくはその塩、α−ケト酪酸もしくはその
塩およびＬ−もしくはDL−α−ヒドロキシ酪酸もしくは
その塩より選ばれる酪酸誘導体の濃度には特に制限はな
いが、一般には0.1〜20％（wt/vol）、好ましくは0.2〜
５％（wt/vol）の範囲が適当である。
一方、水性溶液中に存在せしめられる微生物菌体又は
その処理物の濃度も又特に制限されるものではないが、
一般には１〜50％（wt/vol）、好ましくは２〜20％（wt
/vol）の範囲で存在させるのが好適である。
その処理物の濃度も又特に制限されるものではないが、
一般には１〜50％（wt/vol）、好ましくは２〜20％（wt
/vol）の範囲で存在させるのが好適である。
また、本発明の方法に従い酵素反応系共存せしめられ
るＬ−もしくはDL−メチオンの反応時における濃度は、
用いる微生物菌体又はその処理物の種類や形態、水性溶
液の組成等に応じて変え得るが、一般には0.01〜５重量
％、好ましくは0.05〜２重量％の範囲とすることができ
る。
るＬ−もしくはDL−メチオンの反応時における濃度は、
用いる微生物菌体又はその処理物の種類や形態、水性溶
液の組成等に応じて変え得るが、一般には0.01〜５重量
％、好ましくは0.05〜２重量％の範囲とすることができ
る。
本発明に従う酵素反応は、一般に約20〜約50℃、好ま
しくは約30〜約40℃の温度で、通常約10〜約72時間行わ
れる。
しくは約30〜約40℃の温度で、通常約10〜約72時間行わ
れる。
以上に述べた発酵法及び酵素法により培養液又は反応
液中に生成するＬ−イソロイシンの培養液又は反応液か
らの分離・精製は、それ自体既知の方法に従い、例えば
イオン交換樹脂処理法、沈殿法等を適宜組合わせて行な
うことができる。
液中に生成するＬ−イソロイシンの培養液又は反応液か
らの分離・精製は、それ自体既知の方法に従い、例えば
イオン交換樹脂処理法、沈殿法等を適宜組合わせて行な
うことができる。
次に実施例を挙げて本発明の方法をさらに具体的に説
明する。下記実施例において、Ｏ−エチルホモセリン及
びＬ−イソロイシンの定性はペーパークロマトグラフの
Rf値、電気泳動法の移動度より行なった。また定量は高
速液体クロマトグラフィー（島津LC−5A）を用いて行っ
た。なお、下記の実施例において％は重量％を意味す
る。
明する。下記実施例において、Ｏ−エチルホモセリン及
びＬ−イソロイシンの定性はペーパークロマトグラフの
Rf値、電気泳動法の移動度より行なった。また定量は高
速液体クロマトグラフィー（島津LC−5A）を用いて行っ
た。なお、下記の実施例において％は重量％を意味す
る。
実施例 １ 培地（尿素0.4％、硫酸アンモニウム1.4％、KH2PO4
0.05％、K2HPO4 0.05％、MgSO4・7H2O 0.05％、CaCl2・
2H2O 2ppm、FeSO4・7H2O 2ppm、MnSO4・４〜6H2O 2pp
m、ZnSO4・7H2O 2ppm、NaCl 2ppm、ビチオン 200μg/
、チアミン・HCl 100μg/、カザミノ酸 0.1％、酵
母エキス 0.1％）100mlを500ml容三角フラスコに分注、
滅菌（滅菌後pH7.0）した後、ブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233（微工研条寄
第1497号）を植菌し、無菌的にエタノールを2ml加え、3
0℃にて２日間振盪培養を行った。
0.05％、K2HPO4 0.05％、MgSO4・7H2O 0.05％、CaCl2・
2H2O 2ppm、FeSO4・7H2O 2ppm、MnSO4・４〜6H2O 2pp
m、ZnSO4・7H2O 2ppm、NaCl 2ppm、ビチオン 200μg/
、チアミン・HCl 100μg/、カザミノ酸 0.1％、酵
母エキス 0.1％）100mlを500ml容三角フラスコに分注、
滅菌（滅菌後pH7.0）した後、ブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233（微工研条寄
第1497号）を植菌し、無菌的にエタノールを2ml加え、3
0℃にて２日間振盪培養を行った。
次に、本培養培地（硫酸アンモニウム2.3％、KH2PO4
0.05％、K2HPO4 0.05％、MgSO4・7H2O 0.05％、FeSO4・
7H2O 20ppm、MnSO4・nH2O 20ppm、ビチオン 200μg/
、チアミン・HCl 100μg/、カザミノ酸 0.3％、酵
母エキス 0.3％）1000mlを２容通気撹拌槽に仕込み、
滅菌（102℃、20分間）後、エタノールの20mlと前記前
培養物の20mlを添加して、回転数1000rpm、通気量1vv
m、温度33℃pH7.6にて48時間培養を行った。
0.05％、K2HPO4 0.05％、MgSO4・7H2O 0.05％、FeSO4・
7H2O 20ppm、MnSO4・nH2O 20ppm、ビチオン 200μg/
、チアミン・HCl 100μg/、カザミノ酸 0.3％、酵
母エキス 0.3％）1000mlを２容通気撹拌槽に仕込み、
滅菌（102℃、20分間）後、エタノールの20mlと前記前
培養物の20mlを添加して、回転数1000rpm、通気量1vv
m、温度33℃pH7.6にて48時間培養を行った。
なお、エタノールは、培養液中培地の濃度が２容量％
を越えないように、約１〜２時間ごとに断続的に添加し
た。
を越えないように、約１〜２時間ごとに断続的に添加し
た。
培養終了後、培養物500mlからの遠心分離にて集菌し
た。これを脱塩蒸留水にって２度洗浄して得た菌体を、
反応液［（NH4）2SO4 2.3％、KH2PO4 0.05％、K2HPO4
0.05％、MgSO4・7H2O 0.05％、FeSO4・7H2O 200ppm、Mn
SO4・４〜6H2O 200ppm、チアミン−塩酸100μg/（pH
7.6）］1000mlに懸濁後、該懸濁液を２容通気撹拌槽
に仕込み、これに更にエタノール20ml及びDL−メチオニ
ン0.5g及びDL−α−アミノ酪酸１％又はα−ケト酪酸ナ
トリウム0.5％又はDL−α−ヒドロキシ酪酸ナトリウム
１％を添加して、回転数300rpm、温度33℃、pH7.6（25
％アンモニア水にて調節）にて15時間反応を行った。
た。これを脱塩蒸留水にって２度洗浄して得た菌体を、
反応液［（NH4）2SO4 2.3％、KH2PO4 0.05％、K2HPO4
0.05％、MgSO4・7H2O 0.05％、FeSO4・7H2O 200ppm、Mn
SO4・４〜6H2O 200ppm、チアミン−塩酸100μg/（pH
7.6）］1000mlに懸濁後、該懸濁液を２容通気撹拌槽
に仕込み、これに更にエタノール20ml及びDL−メチオニ
ン0.5g及びDL−α−アミノ酪酸１％又はα−ケト酪酸ナ
トリウム0.5％又はDL−α−ヒドロキシ酪酸ナトリウム
１％を添加して、回転数300rpm、温度33℃、pH7.6（25
％アンモニア水にて調節）にて15時間反応を行った。
反応終了後、遠心分離（4000rpm、15分間、４℃）に
て除菌した上清液中のＯ−エチルホモセリン及びＬ−イ
ソロイシンを定量した。
て除菌した上清液中のＯ−エチルホモセリン及びＬ−イ
ソロイシンを定量した。
なお、比較例としてはDL−メチオニンを添加しないて
同様の反応を行った。結果を下記第１表に示す。
同様の反応を行った。結果を下記第１表に示す。
実施例 ２ 微生物をブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacte
rium flavum）MJ−233−AB−41（微工研条寄第1498号）
に変えた以外は実施例１と同様に実施した。
rium flavum）MJ−233−AB−41（微工研条寄第1498号）
に変えた以外は実施例１と同様に実施した。
結果を下記第２表に示す。
実施例 ３ 微生物をブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacte
rium flavum）MJ−233−ABT−11（微工研条寄第1500
号）に変えた以外は実施例１と同様に実施した。
rium flavum）MJ−233−ABT−11（微工研条寄第1500
号）に変えた以外は実施例１と同様に実施した。
結果を下記第３表に示す。
実施例 ４ 微生物をブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacte
rium flavum）MJ−233−ABD−11（微工研条寄第1499
号）に変えた以外は実施例１と同様に実施した。
rium flavum）MJ−233−ABD−11（微工研条寄第1499
号）に変えた以外は実施例１と同様に実施した。
結果を下記第４表に示す。
実施例 ５ 実施例１の本培養培地の50mlを500ml三角フラスコに
分注し、滅菌後、該培地にDL−メチオニン0.05％及びDL
−α−アミノ酪酸0.5％又はα−ケト酪酸ナトリウム0.5
％又はDL−α−ヒドロキシ酪酸0.5％及びエタノール1ml
を添加し、さらに実施例１の前培養物の2mlを添加して
回転数220rpm、温度33℃にて48時間振盪培養を行った。
分注し、滅菌後、該培地にDL−メチオニン0.05％及びDL
−α−アミノ酪酸0.5％又はα−ケト酪酸ナトリウム0.5
％又はDL−α−ヒドロキシ酪酸0.5％及びエタノール1ml
を添加し、さらに実施例１の前培養物の2mlを添加して
回転数220rpm、温度33℃にて48時間振盪培養を行った。
培養終了後、遠心分離（4000rpm、15分間、４℃）に
て除菌した上清液中のＯ−エチルホモセリン及びＬ−イ
ソロイシンを定量した。なお、比較例としては、DL−メ
チオニンを添加しないで同様の培養を行った。結果を下
記第５表に示す。
て除菌した上清液中のＯ−エチルホモセリン及びＬ−イ
ソロイシンを定量した。なお、比較例としては、DL−メ
チオニンを添加しないで同様の培養を行った。結果を下
記第５表に示す。
実施例 ６ 微生物をブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacte
rium flavum）MJ−233−AB−41（微工研条寄第1498号）
に変えた以外は実施例５と同様に実施した。
rium flavum）MJ−233−AB−41（微工研条寄第1498号）
に変えた以外は実施例５と同様に実施した。
結果を下記第６表に示す。
実施例 ７ 微生物をブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacte
rium flavum）MJ−233−ABT−11（微工研条寄第1500
号）に変えた以外は実施例５と同様に実施した。
rium flavum）MJ−233−ABT−11（微工研条寄第1500
号）に変えた以外は実施例５と同様に実施した。
結果を下記第７表に示す。
実施例 ８ 微生物をブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacte
rium flavum）MJ−233−ABD−21（微工研条寄第1499
号）に変えた以外は実施例５と同様に実施した。
rium flavum）MJ−233−ABD−21（微工研条寄第1499
号）に変えた以外は実施例５と同様に実施した。
結果を下記第８表に示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 四方 和通 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社中央研究所内 (72)発明者 寺沢 真人 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社中央研究所内 (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社中央研究所内
Claims (2)
- 【請求項１】ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属
に属するビオチン要求性微生物の菌体又はその処理物の
存在下に、Ｌ−もしくはDL−α−アミノ−ｎ−酪酸もし
くはその塩、α−ケト酪酸もしくはその塩及びＬ−もし
くはDL−α−ヒドロキシ酪酸もしくはその塩より選ばれ
る酪酸誘導体を水性エタノール溶液中で酵素反応せしめ
てＬ−イソロイシンを製造するに当り、該酵素反応をＬ
−もしくはDL−メチオニンの共存下に行なうことを特徴
とするＬ−イソロイシンの製造方法。 - 【請求項２】ブレビバクテリウム属に属するビオチン要
求性微生物を、Ｌ−もしくはDL−アミノ−ｎ−酪酸もし
くはその塩、α−ケト酪酸もしくはその塩及びＬ−もし
くはDL−ヒドロキシ酪酸もしくはその塩より選ばれる酪
酸誘導体を含有するエタノールを主炭素源とする培地で
好気的に培養し、培養液中にＬ−イソロイシンを生産蓄
積せしめるに当り、該培養をＬ−もしくはDL−メチオニ
ンの存在下に行なうことを特徴とするＬ−イソロイシン
の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20329588A JP2716470B2 (ja) | 1988-08-17 | 1988-08-17 | Ｌ−イソロイシンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20329588A JP2716470B2 (ja) | 1988-08-17 | 1988-08-17 | Ｌ−イソロイシンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0253493A JPH0253493A (ja) | 1990-02-22 |
| JP2716470B2 true JP2716470B2 (ja) | 1998-02-18 |
Family
ID=16471673
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20329588A Expired - Lifetime JP2716470B2 (ja) | 1988-08-17 | 1988-08-17 | Ｌ−イソロイシンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2716470B2 (ja) |
-
1988
- 1988-08-17 JP JP20329588A patent/JP2716470B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0253493A (ja) | 1990-02-22 |
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