JP2715187B2 - Method for immunological measurement of PTHrP - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、悪性腫瘍に最も高頻度
に随伴する高カルシウム血症（ Humoralhypercalcemia
of malignancy）（以下「ＨＨＭ」と略称する）の主原
因物質であるパラサイロイドホルモン関連プロテイン
（ Parathyroid hormonerelatedprotein）（以下「ＰＴ
ＨｒＰ」と略称する）の測定方法に関する。 更に詳し
くは免疫学的測定方の技法を応用した、簡便で極めて高
感度にＰＴＨｒＰを測定することができでき、ＨＨＭの
鑑別診断に直ちに利用できるＰＴＨｒＰの測定方法およ
びこれに利用することのできる検査用キットに関する。BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention is directed to the use of Humoral hypercalcemia which is most frequently associated with malignant tumors.
parathyroid hormone-related protein (hereinafter referred to as “PTM”), which is the main causative substance of “malignancy” (hereinafter abbreviated as “HHM”).
HrP ”). More specifically, a method for measuring PTHrP, which can measure PTHrP in a simple and extremely sensitive manner by applying the technique of immunological measurement and can be used immediately for differential diagnosis of HHM, and a test which can be used for this method For kits.

【０００２】[0002]

【従来の技術】 従来は、ＨＨＭの主原因物質であるＰ
ＴＨｒＰの同定がなされていなかったため、癌患者にお
いて血中カルシウム濃度が上昇し、その結果各種の臨床
症状（意識障害、口渇等）が進んだ段階で高カルシウム
血症を疑い、診断のための各種臨床検査が行なわれてい
た。 この臨床検査の１つとして血清カルシウム濃度の
測定が行われている。 この結果、血清カルシウム濃度
が高値の場合には、腫瘍の骨転移による高カルシウム血
症（Localosteolitic hypercalcemia）かあるいは希な
例として副甲状腺ホルモン（以下「ＰＴＨ」と略称す
る）の腫瘍異所産生の鑑別をする必要が生じる。 骨転
移が強く疑われる場合には、骨シンチグラフィーを施行
し骨転移巣の有無を確認する。 ＰＴＨ異所産生の鑑別
診断には、血中ＰＴＨ濃度の測定を実施し、濃度の上昇
により確認する。 一方、最も高頻度であるＨＨＭにつ
いては鑑別診断法はないのが実状である。 ＨＨＭの鑑
別診断をもし行うのであれば、腫瘍より産生されるＰＴ
ＨｒＰが腎臓にあるＰＴＨレセプターに作用し、その結
果尿中のｃＡＭＰ（腎原生ｃＡＭＰ）濃度が上昇する事
が知られているので、腎原生ｃＡＭＰ濃度の測定をおこ
なうことが間接的な検査の１つとして考えられる。 し
かし腎原生ｃＡＭＰ濃度の測定についても幾つかの問題
があり、仮に腎原生ｃＡＭＰ濃度の上昇が認められても
他の要因による濃度上昇も完全には否定しきれない。
例えば、血清カルシウム濃度の測定の場合には血清のカ
ルシウムは半分近くが蛋白質とくにアルブミンと結合し
ており、また、癌患者ではいわゆる悪液質などで血清蛋
白濃度が低下している事があり、その場合に結果として
総血清カルシウム濃度はアルブミンの減少に伴ない低く
なっている。 従って正確には血清カルシウムと血清ア
ルブミンを測定し、血清カルシウム濃度を血清アルブミ
ン濃度で補正することが必要となっている。 また、腎
原生ｃＡＭＰ濃度についても加齢とともに低下し、日内
変動や各種の薬剤の影響を受け、さらに各種の疾患、副
甲状腺機能亢進症、躁欝病、心筋梗塞、***などで高
値に出ることが知られている。 これらのことよりＨＨ
Ｍを血清カルシウム濃度と腎原生ｃＡＭＰ濃度をもって
鑑別診断するにも多種多様の要因を考慮しなければなら
ず容易ではない。 2. Description of the Related Art Conventionally, P which is a main cause substance of HHM is
Since THrP had not been identified, calcium levels in the blood increased in cancer patients, and as a result, hypercalcemia was suspected at the stage when various clinical symptoms (disturbed consciousness, dry mouth, etc.) advanced, and various types of diagnosis were made. Laboratory tests were being performed. As one of such clinical tests, measurement of serum calcium concentration is performed. As a result, when the serum calcium concentration is high, hypercalcemia due to tumor bone metastasis (Localosteolitic hypercalcemia) or rarely, tumor ectopic production of parathyroid hormone (hereinafter abbreviated as “PTH”) is caused. Discrimination is required. If bone metastasis is strongly suspected, perform bone scintigraphy to check for bone metastases. For differential diagnosis of PTH ectopic production, blood PTH concentration is measured and confirmed by increasing the concentration. On the other hand, there is no differential diagnosis method for the most frequent HHM. If a differential diagnosis of HHM is made, PT produced from tumor
It is known that HrP acts on the PTH receptor in the kidney, resulting in an increase in urinary cAMP (nephrogenic cAMP) concentration. Therefore, measurement of the renal progenitor cAMP concentration is one of the indirect tests. One. However, there are some problems in the measurement of the renal primordial cAMP concentration, and even if the renal primordial cAMP concentration is increased, the increase in the concentration due to other factors cannot be completely denied.
For example, when measuring serum calcium concentration, nearly half of serum calcium is bound to protein, especially albumin, and in cancer patients, serum protein concentration may be reduced due to so-called cachexia, The result is that the total serum calcium concentration is lower with decreasing albumin. Therefore, it is necessary to accurately measure serum calcium and serum albumin, and to correct the serum calcium concentration with the serum albumin concentration. The renal progenitor cAMP concentration also decreases with aging, is affected by circadian fluctuations and various drugs, and reaches a high level in various diseases, hyperparathyroidism, manic depression, myocardial infarction, uremia, etc. It is known. From these things HH
Differential diagnosis of M based on serum calcium concentration and renal progenitor cAMP concentration is not easy because a variety of factors must be considered.

【０００３】ＨＨＭを簡便かつ正確に鑑別診断するた
め、理論的には、悪性腫瘍によって産生され、高カルシ
ウム血症を惹起する主原因物質であるＰＴＨｒＰ濃度を
測定すれば良いことになる。 最近、スバ（Ｓｕｖａ）
ら（Science 1987:237:893-6）は肺癌のセルラインより
抽出して得たｃＤＮＡをクローニングしてＰＴＨｒＰの
全一次構造を解明した。 それによると、ＰＴＨｒＰは
次の式で表される１４１アミノ酸残基よりなるものであ
る。[0003] In order to make a simple and accurate differential diagnosis of HHM, it is theoretically sufficient to measure the concentration of PTHrP, which is produced by a malignant tumor and is a main causative substance causing hypercalcemia. Recently, Suva
(Science 1987: 237: 893-6) elucidated the entire primary structure of PTHrP by cloning cDNA extracted from a lung cancer cell line. According to this, PTHrP is composed of 141 amino acid residues represented by the following formula.

【０００４】Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ
−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−
Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｌ
ｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅ
ｕ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ
−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−
Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓ
ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅ
ｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ
−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｙ
ｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−
Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓ
ｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ
−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ そして、その生理活性を有するＮ端部のアミノ酸配列は
ＰＴＨのＮ端部のそれと高い相同性を示し、ＰＴＨと極
めて類似する生理活性を持つとされるこれまでの知見と
一致した。Ala-Val-Ser-Glu-His
-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-
Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-L
eu-Arg-Arg-Arg-Phe-Phe-Le
u-His-His-Leu-Ile-Ala-Glu
-Ile-His-Thr-Ala-Glu-Ile-
Arg-Ala-Thr-Ser-Glu-Val-S
er-Pro-Asn-Ser-Lys-Pro-Se
r-Pro-Asn-Thr-Lys-Asn-His
-Pro-Val-Arg-Phe-Gly-Ser-
Asp-Asp-Glu-Gly-Arg-Tyr-L
eu-Thr-Gln-Glu-Thr-Asn-Ly
s-Val-Glu-Thr-Tyr-Lys-Glu
-Gln-Pro-Leu-Lys-Thr-Pro-
Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Gly-L
ys-Pro-Gly-Lys-Arg-Lys-Gl
u-Gln-Glu-Lys-Lys-Lys-Arg
-Arg-Thr-Arg-Ser-Ala-Trp-
Leu-Asp-Ser-Gly-Val-Thr-G
ly-Ser-Gly-Leu-Glu-Gly-As
p-His-Leu-Ser-Asp-Thr-Ser
-Thr-Thr-Ser-Leu-Glu-Leu-
Asp-Ser-Arg-Arg-His The N-terminal amino acid sequence having the physiological activity shows high homology with that of the N-terminal portion of PTH, and has a physiological activity very similar to that of PTH. Was consistent with the findings of

【０００５】この報告に基づき、本発明者らは直接ＰＴ
ＨｒＰを測定する方法の可能性について検討を進めた。
まず、ＰＴＨｒＰとＰＴＨの生理活性はほぼ同じ強さで
あるとの数々の知見より、その血中における濃度は、数
ｐｍｏｌ/ｌ程度と極めて低いと予想するに至った。 従
ってその測定法としては極めて低濃度を測定できる方法
を用いなければならないので、本発明者は現在ペプチド
の最も高感度な測定法であるラジオイムノアッセイ法に
よる測定の検討を行った。 しかし、十分な測定感度を
有しながら、実際、ＨＨＭにおける血中ＰＴＨｒＰ濃度
の上昇は十分に確認されなかった。[0005] Based on this report, the present inventors directly
The possibility of a method for measuring HrP was examined.
First, based on various findings that the physiological activities of PTHrP and PTH have almost the same strength, it has been predicted that the concentration in blood is as low as several pmol / l. Therefore, a method capable of measuring an extremely low concentration must be used as the measurement method. Therefore, the present inventors have studied the measurement by a radioimmunoassay method, which is currently the most sensitive measurement method for peptides. However, in spite of having sufficient measurement sensitivity, in fact, an increase in blood PTHrP concentration in HHM was not sufficiently confirmed.

【０００６】この理由としては、 抗体が抗原と結合
する部分、すなわち抗体認識部位がＰＴＨｒＰ分子全体
からみた場合に結合しにくい部位であること、 その
抗体認識部位がいわゆる結合蛋白により包埋されている
こと、 腫瘍より分泌された抗原が血中では極めて分
解が早くそのため測定値が充分高く得られないこと等が
考えられるが、いずれにしろ直接ＰＴＨｒＰを測定する
ことはできなかった。したがって簡便でＨＨＭの鑑別診
断法はないのが実状とされる。The reason for this is that the antibody binds to the antigen, that is, the antibody recognition site is a site that is difficult to bind when viewed from the whole PTHrP molecule, and the antibody recognition site is embedded in a so-called binding protein. It is conceivable that the antigen secreted from the tumor is extremely rapidly degraded in the blood, so that the measured value cannot be obtained sufficiently high. However, in any case, PTHrP could not be measured directly. Therefore, the fact is that there is no simple differential diagnosis method for HHM.

【０００７】[0007]

【発明が解決しようとする課題】ＨＨＭは極めて重篤な
疾患であるため直ちに対応する必要があり、その主要因
物質を簡便かつ直接に測定してＨＨＭを鑑別診断するこ
とが要求されているが、前記したようにＨＨＭを直接鑑
別診断する方法が無いことが一番の問題であり、その解
決が求められている。Since HHM is an extremely serious disease, it is necessary to take immediate action, and it is required to easily and directly measure the main factor substance to make a differential diagnosis of HHM. However, as described above, the most serious problem is that there is no method for directly differentially diagnosing HHM, and a solution is required.

【０００８】[0008]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記した
ような予備試験の結果に基づき更にＰＴＨｒＰの直接検
出する方法の開発を行なった。 抗体作製に用いる抗原
の選択は測定系の性格を左右する最も重要な要素であ
り、有用な抗体を得るには比較的時間を要するため予め
一定の熟考のもとに行った。 これまでの本発明者らの
研究では、血中に存在するＰＴＨｒＰの存在様式は完全
な分子よりＣ端部のフラグメントが多く、また、予想外
に、それも比較的長い状態で安定に存在する事が判明し
た。 ＰＴＨｒＰの血中での形（存在様式）が重要な要
素と考えられるのは、つまりラジオイムアッセイ系にお
いて低濃度の物質を測定するには測定系自体の感度が高
いという事と共に測定する物質と測定系が認識する物質
つまり抗原が極めて同一性を要求すると言う原則に起因
する。The present inventors have further developed a method for directly detecting PTHrP based on the results of the preliminary test as described above. The selection of the antigen used for the production of the antibody is the most important factor that affects the characteristics of the assay system, and it takes a relatively long time to obtain a useful antibody. In our studies so far, the mode of PTHrP present in blood has more C-terminal fragments than the complete molecule, and unexpectedly, it is stably present in a relatively long state. The thing turned out. It is considered that the form (mode of existence) of PTHrP in blood is an important factor, that is, the sensitivity of the measurement system itself is high for measuring low concentrations of the substance in the radioimmunoassay system, and the substance to be measured is high. This is based on the principle that the substance recognized by the measurement system, that is, the antigen, requires extremely high identity.

【０００９】そこで、本発明者らはＰＴＨｒＰのＣ端に
着目し、これを認識する抗体を用いることにより容易に
ＰＴＨｒＰが測定できることを見出し、本発明を完成し
た。即ち本発明は、検体に、ＰＴＨｒＰのＣ端部を特異
的に認識する抗体を作用させ、生ずる抗原−抗体反応を
検出することを特徴とするＰＴＨｒＰの免疫学的測定方
法を提供するものである。The present inventors have focused on the C-terminus of PTHrP and found that PTHrP can be easily measured by using an antibody that recognizes the C-terminus, and completed the present invention. That is, the present invention provides a method for immunologically measuring PTHrP, which comprises causing an antibody that specifically recognizes the C-terminal portion of PTHrP to act on a sample, and detecting the resulting antigen-antibody reaction. .

【００１０】本発明で用いる抗体を調製するために、抗
原として用いるＰＴＨｒＰのＣ端部は、どの程度の長さ
のフラグメントであっても良いが、ＰＴＨｒＰの中間部
よりＣ端側には塩基性アミノ酸が連続する特異な構造を
有し、それらの構造は一般的に蛋白分解酵素により分解
され易いので、それらの塩基性アミノ酸以降のＣ端部の
フラグメントまたはこれと相同性を有するペプチドを抗
体作製に用いることが好ましい。[0010] In preparing the antibody used in the present invention, the C-terminal of PTHrP used as an antigen may be a fragment of any length. Since amino acids have a continuous and unique structure, and those structures are generally easily degraded by proteolytic enzymes, a C-terminal fragment after these basic amino acids or a peptide having homology thereto is prepared as an antibody. Is preferably used.

【００１１】より具体的には、ＰＴＨｒＰの１０７〜１
０９番以降の配列を有するペプチドまたはこれと相同性
を有するペプチドをＣ端部のフラグメントとして用いる
ことが好ましく、例えば次の式、 Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ
−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ−Ｈｉｓ で表されるＰＴＨｒＰの１０９−１４１番の配列を有す
るペプチド［ＰＴＨｒＰ（109-141）］およびこれと相
同性を有するペプチドが用いられる。なお、本明細書中
で、あるペプチドに対し相同性を有するペプチドとは、
配列の１部アミノ酸に変更、欠失等があり、元のペプチ
ドと同一ではないが、作用効果の面においては元のペプ
チドとほぼ同一であるものをいう。More specifically, PTHrP 107-1
It is preferable to use a peptide having a sequence from the 09th position onward or a peptide having homology thereto as a C-terminal fragment, for example, the following formula: Ser-Ala-Trp-Leu-Asp-Ser-G
ly-Val-Thr-Gly-Ser-Gly-Le
u-Glu-Gly-Asp-His-Leu-Ser
-Asp-Thr-Ser-Thr-Thr-Ser-
Leu-Glu-Leu-Asp-Ser-Arg-A
A peptide [PTHrP (109-141)] having a sequence of No. 109-141 of PTHrP represented by rg-His and a peptide having homology thereto are used. Incidentally, in the present specification, a peptide having homology to a certain peptide,
A part of the amino acid sequence has a change, deletion, etc., and is not the same as the original peptide, but is substantially the same as the original peptide in terms of the effect.

【００１２】ＰＴＨｒＰのＣ端部を用いて抗体調製する
には、公知の方法に従えば良く、例えば前述のごとくし
て選択された抗原を、常法にしたがって動物、例えば、
ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウスなどの動物に感作するこ
とにより抗体を得ることができる。このようにして得ら
れた抗体を用いて、検体中のＰＴＨｒＰを測定するに
は、検体中に当該抗体を加え、この結果生じる抗原−抗
体反応を検出すれば良い。検体としては、血液、血清、
血漿、尿、腹水、胸水、乳汁、羊水、脊随液、分泌液、
さん出液または漏出液等が用いられる。In order to prepare an antibody using the C-terminal portion of PTHrP, a known method may be used. For example, the antigen selected as described above may be converted into an animal, eg,
Antibodies can be obtained by sensitizing animals such as sheep, goats, rabbits and mice. In order to measure PTHrP in a sample using the antibody thus obtained, the antibody may be added to the sample, and the resulting antigen-antibody reaction may be detected. Samples include blood, serum,
Plasma, urine, ascites, pleural effusion, milk, amniotic fluid, spinal fluid, secretion,
Effluent or leaked liquid is used.

【００１３】検体中のＰＴＨｒＰ測定方法の１例として
は、抗体またはビオチン、蛋白質、不溶性物質等と結合
した抗体の一定量に対し、一定量の標識抗原および一定
量の検体を反応させる方法が挙げられる。 この方法に
よれば、標識抗原は検体中の抗原量に依存して抗体に対
する結合率が競合的に変化する。 その後、抗原（また
は標識抗原）−抗体複合物を第二抗体、ポリエチレング
リコールまたは不溶性物質に結合された第二抗体等を用
いる事により未反応の抗原（または標識抗原）と分離
し、複合物の放射活性、酵素活性、発光強度または蛍光
活性を測定することにより検体中の抗原の量を求めるの
である。 この反応において好ましく用いられる標識抗
原の例としては、ＰＴＨｒＰ（109-141）の標識体や次
の式、 Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓ
ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ
−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−
Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ で表されるＴｙｒ¹⁰⁸−ＰＴＨｒＰ（108-141）の標識体
であり、標識物としては放射性ヨウ素等の放射性物質、
酵素、発光を呈する物質、蛍光物質等が用いられる。特
に、標識抗原としてＴｙｒ¹⁰⁸−ＰＴＨｒＰ（108-141）
を用い、標識物として放射性物質を用いた場合、経時的
安定性が良好であり好ましい。One example of a method for measuring PTHrP in a sample is a method in which a fixed amount of a labeled antigen and a fixed amount of a sample are reacted with a fixed amount of an antibody or an antibody bound to biotin, a protein, an insoluble substance, or the like. Can be According to this method, the binding ratio of the labeled antigen to the antibody changes competitively depending on the amount of the antigen in the sample. Thereafter, the antigen (or labeled antigen) -antibody complex is separated from the unreacted antigen (or labeled antigen) by using a second antibody, polyethylene glycol or a second antibody conjugated to an insoluble substance, and the like. The amount of the antigen in the sample is determined by measuring the radioactivity, enzyme activity, luminescence intensity or fluorescence activity. Examples of the labeled antigen preferably used in this reaction include a labeled form of PTHrP (109-141) and the following formula: Tyr-Ser-Ala-Trp-Leu-Asp-S
er-Gly-Val-Thr-Gly-Ser-Gl
y-Leu-Glu-Gly-Asp-His-Leu
-Ser-Asp-Thr-Ser-Thr-Thr-
Ser-Leu-Glu-Leu-Asp-Ser-A
rg-Arg-His represented by Tyr ¹⁰⁸ -PTHrP (108-141), which is a radioactive substance such as radioactive iodine;
An enzyme, a substance that emits light, a fluorescent substance, or the like is used. In particular, Tyr ¹⁰⁸ -PTHrP (108-141) as a labeled antigen
When a radioactive substance is used as a labeling substance, the stability over time is good, which is preferable.

【００１４】本発明を簡便に実施するためには、ＰＴＨ
ｒＰ標準品、ＰＴＨｒＰのＣ端部を特異的に認識する抗
体および標識体からなる試薬キットを利用することが好
ましい。In order to easily carry out the present invention, PTH
It is preferable to use a reagent kit comprising an rP standard, an antibody that specifically recognizes the C-terminal of PTHrP, and a label.

【００１５】[0015]

【作用】ＨＨＭの鑑別診断には主原因物質であるＰＴＨ
ｒＰの測定が必要な事は明らかである。 従来、ＰＴＨ
ｒＰの測定系はＮ端部のＲＩＡの開発が進められている
が、Ｎ端部フラグメントは血中濃度が低く、また極めて
不安定で採取直後の新鮮な検体を用いた場合にはＨＨＭ
で高値に測定されるものの、保存した検体ではＮ端部フ
ラグメントは分解され実際より低く測定されることがあ
った。 また、健常者検体ではＰＴＨｒＰ値が各測定系
の測定感度以下となって測定不可能であり、正常値の設
定やＨＨＭとの鑑別の基準となるカットオフ値の設定は
できなかった。 これに対し本発明のＣ端部フラグメン
トの測定系では、これがＮ端部フラグメントに比較して
血中での安定性がよく、その血中濃度は、健常者におい
ても本測定系では十分に測定が可能であり、ＨＨＭの検
体では更に高濃度に測定される。 従って、ＨＨＭと健
常者の鑑別も可能となったのである。 特に、本測定系
の抗体作製にＣ端部の大部分（すなわちＰＴＨｒＰ（10
9-141））を抗原として用いた場合、これにより誘導さ
れる抗体は検体中のＣ端部を極めて強力に認識するもの
であるため、比較的ＰＴＨｒＰ濃度の低い健常者の検体
でも測定が可能となるものである。[Action] PTH which is the main causative substance for differential diagnosis of HHM
Obviously, the measurement of rP is necessary. Conventionally, PTH
As for the rP measurement system, the N-terminal RIA is under development, but the N-terminal fragment has a low blood concentration and is extremely unstable.
However, in the stored sample, the N-terminal fragment was decomposed and measured lower than the actual value. In addition, in a healthy subject, the PTHrP value was lower than the measurement sensitivity of each measurement system and measurement was impossible, so that it was not possible to set a normal value or a cutoff value as a reference for discrimination from HHM. On the other hand, the C-terminal fragment measurement system of the present invention has better stability in blood than the N-terminal fragment, and its blood concentration can be sufficiently measured by the present measurement system even in healthy subjects. Can be measured, and the HHM sample is measured at a higher concentration. Therefore, HHM can be distinguished from a healthy person. In particular, most of the C-terminal (ie, PTHrP (10
When 9-141)) is used as an antigen, the antibody induced by this can very strongly recognize the C-terminal in the sample, so that it can be measured even in a sample of a healthy person with a relatively low PTHrP concentration. It is what becomes.

【００１６】[0016]

【発明の効果】本発明方法によれば、健常者およびＨＨ
Ｍの検体中のＰＴＨｒＰ濃度が測定可能であり、かつＨ
ＨＭの測定値は健常者の値より特異的に高く測定出来る
ので、ＨＨＭの鑑別診断を容易に行なうことができる。
また、本発明の測定系は保存検体においても健常者のＰ
ＴＨｒＰ濃度を簡便に測定できるので、この点において
も極めて有利なものである。According to the method of the present invention, healthy subjects and HH
The PTHrP concentration in the M sample can be measured, and H
Since the measured value of HM can be measured specifically higher than the value of a healthy person, the differential diagnosis of HHM can be easily performed.
Further, the measurement system of the present invention can be applied to P
Since the THrP concentration can be easily measured, it is extremely advantageous also in this respect.

【００１７】[0017]

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳細に説
明する。 実 施 例 １ （１）抗体試薬の作製 ＰＴＨｒＰ（109-141）２ｍｇとウシサイログロブリン
（シグマ社製）８ｍｇを公知の技術を用いて複合体を作
製し、そのうち２００μｇをフロイント完全アジュバン
ト（カルビオケム社製）と混合してエマルジョンを作製
し、ヒツジの皮内に投与した。 さらに４週間で各１０
０μｇを追加免疫した。各免疫２週間後に頚静脈より血
液を採取し、血清を分離してＰＴＨｒＰ抗血清を得た。
得られた抗血清は、後に述べる標識抗原試薬を用いてそ
の力価と感度を検討した後、有用な抗血清を緩衝液
（０.５％ウシ血清アルブミンを含む０.１Ｍトリス緩衝
液ｐＨ８.５）にて約１００００倍に希釈して作製し
た。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. Example 1 (1) Preparation of Antibody Reagent A complex was prepared from 2 mg of PTHrP (109-141) and 8 mg of bovine thyroglobulin (Sigma) using a known technique, and 200 μg of the complex was mixed with Freund's complete adjuvant (Calbiochem). ) To form an emulsion, which was administered intradermally to sheep. 10 weeks each in 4 weeks
0 μg was boosted. Two weeks after each immunization, blood was collected from the jugular vein and the serum was separated to obtain a PTHrP antiserum.
The obtained antiserum was examined for its titer and sensitivity using a labeled antigen reagent described below, and then useful antiserum was added to a buffer (0.1 M Tris buffer containing 0.5% bovine serum albumin, pH 8. It was prepared by diluting about 10,000 times in 5).

【００１８】（２）標識抗原試薬の作製 ＰＴＨｒＰ（109-141）またはＴｙｒ¹⁰⁸−ＰＴＨｒＰ
（108-141）２μｇを７０ＭＢｑのＮａ¹²⁵Ｉでグリーン
ウッドおよびハンターの標準法に従ってクロラミンＴを
用いて標識した。 その後、２０％アセトニトリルを含
む０.１％トリフルオロ酢酸溶液で平衡化した逆相カラ
ムを用いる高速クロマトグラフィー（東ソー製）に添加
し、４０％アセトニトリルを含む０.１％トリフルオロ
酢酸溶液で溶出させることより未反応の¹²⁵Ｉと標識抗
原とを分離した。 分離された標識抗原は、緩衝液（０.
５％ウシ血清アルブミンを含む０.１Ｍトリス緩衝液
ｐＨ８.５）にて約７.４キロベクレル／ｍｌになるよう
に希釈して作製した。なお、Ｔｙｒ¹⁰⁸−ＰＴＨｒＰ（1
08-141）は、ペプチドシンセサイザーを用い、メリフィ
ールド（Merrifield）の方法に準じて固相法にて作成し
た。 作成に使用するアミノ酸は、第三ブチルカルボニ
ル（Boc）基、ｐ−トルエンスルフォニル基 （Tos）
基、Ｏ−ベンジルエーテル（OBzl）基およびベンジル基
（Bzl）基等によりアミノ基、グアニジノ基、カルボキ
シル基及び水酸基が保護されたものを用いた。 操作
は、まず、Ｔｙｒ¹⁰⁸−ＰＴＨｒＰ（108-141）のＣ末端
のアミノ基をポリスチレンよりなる樹脂に導入し、次
に、α−アミノ酸の保護基をトリフルオロ酢酸により除
去し、Ｎ端側のアミノ酸とＤＣＣを用い結合させた。
以下同様にして順次アミノ酸を結合させ、ペプチド鎖の
延長を行った。 作製されたペプチドはアニソール存在
下ＨＦで樹脂からの切断と保護基の除去を行った。 精
製は、低分子除去した後に逆相ＨＰＬＣにて実施され
た。このＴｙｒ¹⁰⁸−ＰＴＨｒＰ（108-141）は、以下に
示すような物性を有するものである。 外 観 ： 無色不定形粉体 アミノ酸分析（フェノール存在下、６Ｎ−ＨＣｌによ
り、１１０℃で２２時間分解後）：Ａｓｐ（４）３.９
９, Ｔｈｒ（４）３.７３, Ｓｅｒ（７）６.２８,Ｇｌ
ｕ（２）２.００, Ｇｌｙ（４）３.９３, Ａｌａ（１）
０.９８,Ｖａｌ（１）０.９７, Ｌｅｕ（５）５.０６,
Ｔｙｒ（１）０.９９,Ｈｉｓ（２）１.９６, Ｔｒｐ
（１）０.６６, Ａｒｇ（２）２.０５,(2) Preparation of labeled antigen reagent PTHrP (109-141) or Tyr ¹⁰⁸ -PTHrP
2 μg of (108-141) was labeled with chloramine T according to the standard method of Greenwood and Hunter with 70 MBq of Na ¹²⁵ I. Thereafter, the mixture was added to high-performance chromatography (manufactured by Tosoh Corporation) using a reversed-phase column equilibrated with a 0.1% trifluoroacetic acid solution containing 20% acetonitrile, and eluted with a 0.1% trifluoroacetic acid solution containing 40% acetonitrile. By doing so, unreacted ¹²⁵ I and the labeled antigen were separated. The separated labeled antigen was added to a buffer (0.
0.1 M Tris buffer containing 5% bovine serum albumin
(pH 8.5) and diluted to about 7.4 kB / ml. Note that Tyr ¹⁰⁸ -PTHrP (1
08-141) was prepared by a solid phase method using a peptide synthesizer and according to the method of Merrifield. Amino acids used for the preparation are tert-butylcarbonyl (Boc) group, p-toluenesulfonyl group (Tos)
Those whose amino group, guanidino group, carboxyl group and hydroxyl group were protected by a group, O-benzyl ether (OBzl) group and benzyl group (Bzl) group were used. First, the amino group at the C-terminus of Tyr ¹⁰⁸ -PTHrP (108-141) was introduced into a resin made of polystyrene, and then the protecting group of the α-amino acid was removed with trifluoroacetic acid. Amino acids were coupled with DCC.
Amino acids were sequentially linked in the same manner to extend the peptide chain. The prepared peptide was cleaved from the resin and the protective group was removed with HF in the presence of anisole. Purification was performed by reverse phase HPLC after removal of small molecules. This Tyr ¹⁰⁸ -PTHrP (108-141) has the following physical properties. Appearance: Colorless amorphous powder Amino acid analysis (after decomposing with 6N-HCl in the presence of phenol at 110 ° C. for 22 hours): Asp (4) 3.9
9, Thr (4) 3.73, Ser (7) 6.28, Gl
u (2) 2.00, Gly (4) 3.93, Ala (1)
0.98, Val (1) 0.97, Leu (5) 5.06,
Tyr (1) 0.99, His (2) 1.96, Trp
(1) 0.66, Arg (2) 2.05,

【００１９】（３）標準品試薬の作製 ＰＴＨｒＰ（109-141）を緩衝液（０.５％ウシ血清アル
ブミン，０.０１Ｍ 塩化ナトリウムを含む０.０１Ｍリ
ン酸緩衝液ｐＨ７.４）にて１０００ｐｍｏｌ／ｌの濃
度に希釈して作製した。(3) Preparation of standard product reagent PTHrP (109-141) was dissolved in a buffer solution (0.01 M phosphate buffer pH 7.4 containing 0.5% bovine serum albumin and 0.01 M sodium chloride) at 1000 pmol. / L.

【００２０】（４）正常ヒツジ血清試薬の作製 正常なヒツジより得られた血清を緩衝液（０.５％ウシ
血清アルブミン，０.０１Ｍ 塩化ナトリウムを含む０.
０１Ｍ リン酸緩衝液ｐＨ７.４）にて１００倍に希釈し
て作製した。(4) Preparation of Normal Sheep Serum Reagent Serum obtained from normal sheep was subjected to a buffer solution (0.5% bovine serum albumin containing 0.1M sodium chloride).
It was prepared by diluting 100-fold with a 01M phosphate buffer (pH 7.4).

【００２１】（５）第二抗体試薬の作製 ヒツジガンマグロブリンを公知の技術を用いてウマに対
して感作させて抗血清を得、緩衝液（０.０１Ｍ 塩化ナ
トリウムを含む０.０１Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ７.４）に
て約４０倍に希釈して第二抗体試薬を作製した。(5) Preparation of second antibody reagent Ovine gamma globulin is sensitized to horses using a known technique to obtain an antiserum, and a buffer solution (0.01 M phosphoric acid containing 0.01 M sodium chloride) is obtained. The buffer was diluted approximately 40-fold with a buffer (pH 7.4) to prepare a second antibody reagent.

【００２２】実 施 例 ２ ＰＴＨｒＰ抗体の特異性：実施例１で得られたＰＴＨｒ
Ｐ抗体の特異性を調べる目的で、次の実験を行った。
まず、プラスチック製の試験管（８×７５ｍｍ：以下試
験管）を用意し、被検物質として既知量のＰＴＨｒＰ
（1-34）、ＰＴＨｒＰ（67-86）、ＰＴＨｒＰ（109-14
1）、ＰＴＨｒＰ（107-138）、ＰＴＨ（1-84）、ＰＴＨ
（39-84）およびカルシトニンの各溶液および対照とし
て０ｐｍｏｌ／ｌの標準品試薬 （０.５％ウシ血清
アルブミン、０.０１Ｍ塩化ナトリウムを含む０.０１Ｍ
リン酸の緩衝液ｐＨ７.４）２００μｌを各々２本の試
験管に採取した。 標識抗原試薬１００μｌおよび抗体
試薬１００μｌを各試験管に分注し、軽く撹拌後、２５
℃で２２時間反応させた。 その後、正常ヒツジ血清試
薬１００μｌおよび第二抗体試薬５００μｌを分注し、
良く撹拌し、さらに２５℃で３０分間反応させた。 生
成した抗原−抗体−第二抗体複合物または標識抗原−抗
体−第二抗体複合物を４℃で３０分、 ３０００ｒｐｍ
で遠心分離することにより沈澱させた。 未反応の抗原
または標識抗原が含まれる上清は、アスピレーターを用
いて吸引した。 ウエル型シンチレーションカウンター
にて各試験管を測定し、平均放射能量を算出し、これを
Ｂとした。またＯｐｍｏｌ／ｌの標準品試薬の放射能量
を同様にして求め、これを Ｂ₀とし、先のＢをこれで除
して百分率を計算し、これをＢ／Ｂ₀（％）を求めた。
片対数グラフを用い、対数側に各物質のモル濃度を、も
う一方にＢ／Ｂ₀（％）をプロットして、各被検物質と
実施例１で得られた抗体が反応するかどうかを調べた
（図１）。この結果から明らかなように、実施例１で得
た抗体は、ＰＴＨｒＰ（107-138）およびＰＴＨｒＰ（1
09-141）以外の物質とは交差反応を示さず、Ｃ端部に特
異的な抗体であった。Example 2 Specificity of PTHrP antibody: PTHr obtained in Example 1
The following experiment was performed in order to examine the specificity of the P antibody.
First, a plastic test tube (8 × 75 mm: hereinafter referred to as a test tube) is prepared, and a known amount of PTHrP is used as a test substance.
(1-34), PTHrP (67-86), PTHrP (109-14)
1), PTHrP (107-138), PTH (1-84), PTH
(39-84) and each solution of calcitonin and 0 pmol / l of a standard reagent as a control (0.01 M containing 0.5% bovine serum albumin, 0.01 M sodium chloride)
200 μl of a phosphate buffer (pH 7.4) was collected in each of two test tubes. Dispense 100 μl of the labeled antigen reagent and 100 μl of the antibody reagent into each test tube, and gently mix.
Reaction was performed at 22 ° C. for 22 hours. Thereafter, 100 μl of normal sheep serum reagent and 500 μl of the second antibody reagent were dispensed,
The mixture was stirred well and reacted at 25 ° C. for 30 minutes. The resulting antigen-antibody-second antibody complex or labeled antigen-antibody-second antibody complex is 3,000 rpm at 4 ° C. for 30 minutes.
And precipitated by centrifugation. The supernatant containing unreacted antigen or labeled antigen was aspirated using an aspirator. Each test tube was measured using a well-type scintillation counter, and the average amount of radioactivity was calculated. In addition, the radioactivity of Opmol / l standard reagent was determined in the same manner, this was defined as B ₀ , and the above B was divided by this to calculate the percentage to obtain B / B ₀ (%).
Using a semilog graph, the molar concentration of each substance is plotted on the logarithmic side, and B / B ₀ (%) is plotted on the other side, to determine whether each test substance reacts with the antibody obtained in Example 1. It was examined (FIG. 1). As is clear from the results, the antibodies obtained in Example 1 were PTHrP (107-138) and PTHrP (1
No cross-reactivity was observed with substances other than 09-141), and the antibody was specific to the C-terminal.

【００２３】実 施 例 ３ （１）標準曲線の作成 １０００ｐｍｏｌ／ｌ濃度の標準品試薬を、緩衝液
（０.５％ウシ血清アルブミン、０.０１Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０.０１Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ７.４）を用いて
希釈し、２倍希釈の系列を７.８１ｐｍｏｌ／ｌの濃度
まで作製した。 試験管を用意し、これらの標準品の希
釈系列（１０００〜７.８１ｐｍｏｌ／ｌ）および対照
を各々２本の試験管に採取した。 対照としては、前記
の０ｐｍｏｌ／ｌの濃度の標準品試薬 ２００μｌを用
いた。標識抗原試薬１００μｌおよび抗体試薬１００μ
ｌを各試験管に添加後、軽く撹拌し、２５℃で２２時間
反応させた。 その後、正常ヒツジ血清試薬 １００ μ
ｌおよび第二抗体試薬５００μｌを添加し、良く撹拌し
た後、更に２５℃で ３０分間反応させた。 生成した抗
原−抗体−第二抗体複合物または標識抗原−抗体−第二
抗体複合物を４℃で３０分、３０００ｒｐｍで遠心分離
して沈澱させた。 未反応の抗原または標識抗原が含ま
れる上清はアスピレーターを用いて吸引した。 ウエル
型シンチレーションカウンターにて各標準品試薬の試験
管を測定し、平均放射能量を算出してこれをＢとした。
またＯｐｍｏｌ／ｌの標準品試薬の放射能量を同様に
して求め、これをＢ₀とした。 先のＢをＢ₀で除し百分
率を計算してこれをＢ／Ｂ₀（％）とした。 片対数グラ
フを用い対数側に標準品試薬のモル濃度を、もう一方に
Ｂ／Ｂ₀（％）をプロットした標準曲線（図２）を作成
した。Example 3 (1) Preparation of Standard Curve A standard reagent having a concentration of 1000 pmol / l was added to a buffer (0.01 M phosphate buffer pH7 containing 0.5% bovine serum albumin and 0.01 M sodium chloride). .4) to prepare a two-fold dilution series to a concentration of 7.81 pmol / l. Test tubes were prepared, and a dilution series (1000 to 7.81 pmol / l) of these standards and a control were collected in each of two test tubes. As a control, 200 μl of the above-mentioned standard reagent having a concentration of 0 pmol / l was used. 100 μl of labeled antigen reagent and 100 μl of antibody reagent
After adding 1 to each test tube, the mixture was gently stirred and reacted at 25 ° C. for 22 hours. Then, normal sheep serum reagent 100 μl
and 500 μl of the second antibody reagent were added, and the mixture was stirred well, and then reacted at 25 ° C. for 30 minutes. The resulting antigen-antibody-second antibody conjugate or labeled antigen-antibody-second antibody conjugate was precipitated by centrifugation at 4 ° C. for 30 minutes at 3000 rpm. The supernatant containing unreacted antigen or labeled antigen was aspirated using an aspirator. The test tube of each standard reagent was measured using a well-type scintillation counter, and the average amount of radioactivity was calculated.
Also obtained in the same manner the amount of radioactivity standards reagent Opmol / l, which was used as a B _0. The above B was divided by B ₀ to calculate a percentage, which was defined as B / B ₀ (%). A standard curve (FIG. 2) was prepared by plotting the molar concentration of the standard reagent on the logarithmic side and B / B ₀ (%) on the other side using a semilogarithmic graph.

【００２４】（２）検体の測定 血清、尿および希釈乳汁検体２００μｌを２本の試験管
に採取した。以下標準曲線の作製で示した方法と同様に
して検体の平均放射能量Ｂを算出し同様にしてＢ／Ｂ0
（％）を求めた。 これを予め作成した標準曲線より対
応する濃度を求めた。本発明による健常者およびＨＨＭ
患者の血清、尿、乳汁中のＰＴＨｒＰの濃度の測定結果
を表１に示す。(2) Measurement of Samples 200 μl of serum, urine and diluted milk samples were collected in two test tubes. Hereinafter, the average amount of radioactivity B of the sample was calculated in the same manner as in the method shown in the preparation of the standard curve, and B / B0 was similarly calculated.
(%) Was determined. The corresponding density was determined from a standard curve prepared in advance. Healthy people and HHM according to the present invention
Table 1 shows the measurement results of the concentrations of PTHrP in the serum, urine, and milk of patients.

【００２５】 表１および図３に示す如く、本発明により得られた血
清および尿中のＰＴＨｒＰ濃度は健常者においても測定
可能であり、ＨＨＭの疾患においては健常者に比して著
明に高値を示した。[0025] As shown in Table 1 and FIG. 3, the PTHrP concentration in the serum and urine obtained by the present invention was measurable even in healthy subjects, and in HHM disease, it was significantly higher than that in healthy subjects. .

【００２６】なお、表２に本測定系の血清の添加回収試
験を示すが、回収率は９９.７〜 １０１.５（％）と極
めて良好であった。 また血清の希釈試験を図４に示すがこれも良好であ
った。 これらより本測定系の信頼性は極めて高いもの
であることが示された。Table 2 shows the serum recovery test of the present measurement system. The recovery rate was as good as 99.7 to 101.5 (%). FIG. 4 shows a serum dilution test, which was also favorable. From these, it was shown that the reliability of the present measurement system was extremely high.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 本発明で用いられる抗体の特異性を示す図
面。FIG. 1 is a drawing showing the specificity of the antibody used in the present invention.

【図２】 本発明の測定法により得られた標準曲線を示
す図面。FIG. 2 is a drawing showing a standard curve obtained by the measurement method of the present invention.

【図３】 本発明測定法により測定した健常者およびＨ
ＨＭ患者の血清ＰＴＨｒＰの測定値を示す図面。FIG. 3 shows healthy subjects and H measured by the measurement method of the present invention.
The figure which shows the measured value of serum PTHrP of HM patient.

【図４】 本発明の測定法にて実施された血清の希釈試
験を示す図面。以 上FIG. 4 is a drawing showing a serum dilution test performed by the measurement method of the present invention. that's all

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 血液、血清、血漿または尿検体に、次の
式（Ｉ）、 Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ− Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ− Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ
−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ− Ｓｅｒ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ− Ｈｉｓ （Ｉ）で表されるＰＴＨｒＰ（１０９−１４１）を 特異的に認
識する抗体を作用させ、生じる抗原−抗体反応を競合反
応により検出することを特徴とするＰＴＨｒＰの免疫学
的測定方法。1. A blood, serum, plasma or urine sample, the following
Formula (I), Ser-Ala-Trp-Leu-Asp-Ser-G
ly-Val- Thr-Gly-Ser-Gly-Le
u-Glu-Gly-Asp- His-Leu-Ser
-Asp-Thr-Ser-Thr-Thr- Ser-
Leu-Glu-Leu-Asp-Ser-Arg-A
An antibody that specifically recognizes PTHrP (109-141) represented by rg- His (I) is acted on, and the resulting antigen-antibody reaction is competed against.
A method for immunologically measuring PTHrP, wherein the method comprises the steps of: 【請求項２】 ＰＴＨｒＰ（１０９−１４１）を特異的
に認識する抗体が、このペプチドまたは配列の一部アミ
ノ酸に変更、欠失等がありこのペプチドと相違するが、
抗原性において同一なペプチドを動物に免疫して得られ
たものである請求項１記載の方法。 Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ
−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ−Ｈｉｓ （Ｉ） 2. An antibody specifically recognizing PTHrP (109-141), wherein a partial amino acid of this peptide or sequence is
There is a change in amino acid, deletion etc. and this peptide is different,
2. The method according to claim 1, which is obtained by immunizing an animal with a peptide identical in antigenicity . Ser-Ala-Trp-Leu-Asp-Ser-G
ly-Val-Thr-Gly-Ser-Gly-Le
u-Glu-Gly-Asp-His-Leu-Ser
-Asp-Thr-Ser-Thr-Thr-Ser-
Leu-Glu-Leu-Asp-Ser-Arg-A
rg-His (I) 【請求項３】 抗原−抗体反応の検出に標識体を用いる
請求項第１項記載の方法。 3. The method according to claim 1, wherein a label is used for detecting the antigen-antibody reaction. 【請求項４】 標識体が、放射性物質、酵素、発光を呈
する物質もしくは蛍光物質から選ばれる標識物で標識さ
れたものである請求項第１項記載の方法。 4. The method according to claim 1, wherein the label is labeled with a label selected from a radioactive substance, an enzyme, a substance exhibiting luminescence, and a fluorescent substance. 【請求項５】 標識体が式（Ｉ）で表される、ＰＴＨｒ
Ｐ（１０９−１４１）または配列の一部アミノ酸に変
更、欠失等がありこのペプチドと相違するが、抗原性に
おいて同一なペプチドであり、標識物がこれに導入した
放射性ヨウ素である請求項第１項記載の方法。 Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ
−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ−Ｈｉｓ （Ｉ） 5. A PTHr wherein the label is represented by the formula (I):
Changes to P (109-141) or some amino acids in the sequence
This peptide differs from this peptide due to additional
2. The method according to claim 1, wherein the peptide is the same as the above , and the label is radioactive iodine introduced into the peptide. Ser-Ala-Trp-Leu-Asp-Ser-G
ly-Val-Thr-Gly-Ser-Gly-Le
u-Glu-Gly-Asp-His-Leu-Ser
-Asp-Thr-Ser-Thr-Thr-Ser-
Leu-Glu-Leu-Asp-Ser-Arg-A
rg-His (I) 【請求項６】 標識体が式（ＩＩ）で表されるＴｙｒ１
０８−ＰＴＨｒＰ（１０８−１４１）または配列の一部
アミノ酸に変更、欠失等がありこのペプチドと相違する
が、抗原性において同一なペプチドであり、標識物がこ
れに導入した放射性ヨウ素である請求項第１項記載の方
法。 Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓ
ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ
−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−
Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ （ＩＩ） 6. Tyr1 represented by the formula (II):
08-PTHrP (108-141) or a part of the sequence
Amino acid changes, deletions, etc., differ from this peptide
Is a peptide identical in antigenicity , and the label is radioactive iodine introduced therein. Tyr-Ser-Ala-Trp-Leu-Asp-S
er-Gly-Val-Thr-Gly-Ser-Gl
y-Leu-Glu-Gly-Asp-His-Leu
-Ser-Asp-Thr-Ser-Thr-Thr-
Ser-Leu-Glu-Leu-Asp-Ser-A
rg-Arg-His (II) 【請求項７】 次の式（Ｉ）、 Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ− Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ− Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｓ
ｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ− Ｓｅ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ− Ｈｉｓ （Ｉ）で表されるＰＴＨｒＰ（１０９−１４１）を 特異的に認
識する抗体、標識体およびＰＴＨｒＰ測定のための標準
品からなる検査用キット。 7. The following formula (I): Ser-Ala-Trp-Leu-Asp-Ser-G
ly-Val- Thr-Gly-Ser-Gly-Le
u-Glu-Gly-Asp- His-Leu-S
er-Asp-Thr-Ser-Thr-Thr- Se
r-Leu-Glu-Leu-Asp-Ser-Arg
-A test kit comprising an antibody that specifically recognizes PTHrP (109-141) represented by Arg- His (I) , a label, and a standard product for measuring PTHrP. 【請求項８】 式（ＩＩ）で表されるＴｙｒ１０８−Ｐ
ＴＨｒＰ（１０８−１４１）または配列の一部アミノ酸
に変更、欠失等がありこのペプチドと相違するが、抗原
性において同一なペプチド。 Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓ
ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ
−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−
Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ （ＩＩ） 8. Tyr108-P represented by the formula (II)
THrP (108-141) or a partial amino acid of the sequence
This peptide differs from this peptide in that
Peptides identical in gender . Tyr-Ser-Ala-Trp-Leu-Asp-S
er-Gly-Val-Thr-Gly-Ser-Gl
y-Leu-Glu-Gly-Asp-His-Leu
-Ser-Asp-Thr-Ser-Thr-Thr-
Ser-Leu-Glu-Leu-Asp-Ser-A
rg-Arg-His (II)