JP2706568B2 - 新規な薬物および試薬の同定 - Google Patents

新規な薬物および試薬の同定

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JP2706568B2 JP3509967A JP50996791A JP2706568B2 JP 2706568 B2 JP2706568 B2 JP 2706568B2 JP 3509967 A JP3509967 A JP 3509967A JP 50996791 A JP50996791 A JP 50996791A JP 2706568 B2 JP2706568 B2 JP 2706568B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、療法、診断および研究用の新規な組成物の
同定、調製および使用、ならびにそれらの使用法に関す
るものである。より詳細には、本発明は新規なアンチセ
ンス組成物、すなわちハイブリダイゼーションにより核
酸と相互作用してそれらの機能に影響を及ぼし、これに
よりそれらの生物学的活性を変化させる組成物に関する
ものである。療法、診断および研究用の新規な組成物な
らびに診断、処置および実験のための方法をもたらすこ
れらのアンチセンス組成物の同定法が提供される。
発明の背景 大部分の疾病状態を含めて哺乳動物の身体状態は大部
分が蛋白質により影響されることは周知である。これら
の蛋白質は直接に、またはそれらの酵素機能を介して作
用することにより、動物およびヒトにおける多くの疾病
に主として関与する。古典的な療法は一般にこれらの蛋
白質との相互作用に注目し、それらが疾病を引き起こ
し、または疾病を増強する機能を緩和する努力を行って
きた。しかし最近では、それらの蛋白質の合成を指示す
る分子、すなわち細胞内RNAとの相互作用によりそれら
の蛋白質の実際の産生を調整する試みがなされている。
蛋白質の産生を阻害することにより最大の効果および最
小の副作用において療法結果に効果を得ることが期待さ
れた。これらの療法の一般的な目的は、望ましくない蛋
白質の形成をもたらす遺伝子発現を妨害その他の形で変
調させることである。
ある程度受け入れられている特異的遺伝子発現抑制の
ための１方法は、特異的なターゲットメッセンジャーRN
Aに相補的なオリゴヌクレオチド同族体による“アンチ
センス”法である。多数の研究所がこのような試みを報
告している。関連の総説には下記のものが含まれる：ス
タインおよびコーエン（C.A.Stein,J.S.Cohen），Cance
r Research,vol.48,p.2659−2669（1988）；ワルダー
（J.Walder），Gene ＆ Development,vol.2,p.502−5
04（1988）；マーカス−セクラ（C.J.Marcus−Sekur
a），Anal.Biochemistry,vol.172,289−295（1988）；
ゾン（G.Zon），Journal of Protein Chemistry,vo
l.6,p.131−145（1987）；ゾン（G.Zon），Pharmaceuti
cal Research,vol.5,p.539−549（1988）；ファン・デ
ル・クロル、モルおよびストゥイチェ（A.R.Krol,J.N.M
ol,A.R.Stuitje），BioTechniques,vol.6,p.958−973
（1988）およびルーズミッチェル（D.S.Loose−Mitchel
l），TIPS,vol.9,p.45−47（1988）。以上はそれぞれ一
般的アンチセンス理論に関する背景および先行技術を提
示する。
アンチセンス療法における従来の試みにより、特異的
mRNAにハイブリダイゼーションによって特異的に結合す
べく設計された−−それと特異的にハイブリダイズしう
る−−オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド同
族体が提供された。これらの同族体は多数の機構のうち
のいずれかにより、選ばれたmRNAの活性を抑制する−−
そのmRNAによりコードされる蛋白質が産生される翻訳反
応を阻害する−−ことを意図したものである。これらの
阻害されるmRNAによりコードされる特異的蛋白質の形成
の抑制が、療法上の利益をもたらすと期待されている。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの療法活性を高める
ために、多数の化学的修飾がそれらに導入された。それ
らの修飾はアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞透過
性を高めるべく、ヌクレアーゼのそのほか体内でそれら
オリゴヌクレオチド同族体の構造または活性を低下さ
せ、または阻害する酵素からそれらを安定化すべく、か
つそれら薬物動力学的特性を改良すべく設計される。し
かし現在では、一般化されたアンチセンスオリゴヌクレ
オチド療法または診断の方式は見出されていない。従来
の活動は、効果的な活性を起こさせるのに十分な量のア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを適宜な細胞に付与し得
なかったことにより制限されていた。現在入手しうるア
ンチセンスオリゴヌクレオチドの活性は、効果的な療
法、研究試薬または診断に用いるためには実際問題とし
て十分なものでなかった。従って、効果的な療法および
診断に使用しうるオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌク
レオチド同族体が長年の要望であった。
この長年の要望は、アンチセンスオリゴヌクレオチド
療法および診断の分野における従来の研究によっては満
たされなかった。他の人々は直ちに妥当な利用度で療法
または診断に効果を示す材料を提供し得なかったのであ
る。特に、感染性因子（infectious agent）を効果的
に処置しうるオリゴヌクレオチドを同定するための一般
化された方法がなかった。これらのヌクレオチドを同定
するための既知の従来法はすべて、ハイブリダイゼーシ
ョンを目的とする部分の核酸に関して予め核酸配列を知
ることが要求された。従って感染性因子に対する有効な
アンチセンスオリゴヌクレオチドを同定し、この同定法
が予め核酸配列を知る必要のないものであることが強く
要望される。
発明の目的 本発明の目的は、疾病状態のアンチセンス療法に有用
なオリゴヌクレオチドの同定法を提供することである。
他の目的は、動物の身体機能の状態を判定するのに有
用なオリゴヌクレオチドを同定することである。
さらに他の目的は、たとえば特定のRNA分子の遺伝子
発現を遮断するための研究用試薬として有用なオリゴヌ
クレオチドを同定することである。
本発明のさらに他の目的は、動物の身体機能に有意の
影響を及ぼすポリペプチドの発現を制御する核酸の座を
同定することである。
他の目的は、それに対するハイブリダイゼーションを
目的とする核酸の配列を予め知る必要なしに上記オリゴ
ヌクレオチドを同定および提供することである。
他の目的は本明細書を検討することにより当業者に明
らかになるであろう。
発明の要約 アンチセンスオリゴヌクレオチドは有効な療法薬とし
て現在研究されているが、特定のmRNAの発現を抑制する
最も可能性の高いヌクレオチドを選択する方法は明らか
でない。さらに、多くの場合疾病の経過を変化させるア
ンチセンス抑制の目標となる遺伝子を判定することすら
困難である。本発明方法はこれらの困難を克服するもの
である。
本発明によれば感染性因子の核酸とハイブリダイズし
うるオリゴヌクレオチドの同定法が提供され、この方法
は実質的にランダムに配列したオリゴヌクレオチドを含
む複数のベクターを調製し、これらのベクターを細胞に
取込ませることを含む。これらの細胞を感染性因子で感
染させ、細胞が増殖する条件を与える。次いで、感染に
対して耐性である細胞を同定する。好ましくは、感染に
対して耐性である細胞につき、含まれるオリゴヌクレオ
チドの核酸配列を決定する。
好ましい形態によれば、固相合成その他により約10−
約100核酸サブユニットからなる実質的にランダムに配
列したオリゴヌクレオチドを調製する。あるいは好まし
くは病原性生物からのcDNAまたはゲノムDNAをベクター
の調製に用いることができる。好ましくはこれらのDNA
をフラグメント化し、約50から数千の範囲の多数のサブ
ユニットを含むDNAのフラグメント部分を得る。約100−
約1000が好都合であり、好ましい。用いる細胞は、好ま
しくは感染性因子によって容易に感染しうるように選ば
れる。
他の形態によれば、感染性因子に耐性である細胞に由
来するものであることが確認されている挿入オリゴヌク
レオチドの核酸配列を少なくともその構成部分として含
む試薬を調製する。これらの試薬から療法、診断および
研究用の組成物ならびにキットが調製され、それらを用
いる療法、診断および研究のための方法が本発明に包含
されると解される。
図面の簡単な説明 第１図はベクターISIS RG−１の模式的構造を表す。
発明の詳細な記述 本発明は、感染性その他の因子の遺伝子発現を抑制す
るアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の同定法を提供
する。ランダム合成により形成された、感染性因子から
感染性因子のDNAもしくはcDNAをDNaseで処理することに
よりまたは粉砕により誘導された、あるいは感染性因子
に感染した細胞のmRNAから誘導されたオリゴヌクレオチ
ド配列を含む発現ベクターを細胞内へ形質転換する。次
いで細胞をその感染性その他の因子に感染させる。次い
で、感染性因子の発現を抑制し、従ってその感染性因子
の作用を抑止するのに有用であるオリゴヌクレオチド
を、感染性因子による感染の影響を示さない細胞の選択
により選択する；たとえば細胞が死滅しない、増大した
速度で細胞が増殖する、または感染の変調を示唆する他
の挙動を示すなどである。これらの細胞が同定される
と、軽減効果をもつオリゴヌクレオチドの配列を同定す
る。同定は、ベクターを回収し、挿入核酸物質を含む領
域を配列決定することにより達成される。
細胞、発現ベクター、およびオリゴヌクレオチド配列
選択法は、感染性その他の因子の種類により決定され
る。たとえばヘルペスウイルスに対するアンチセンスオ
リゴヌクレオチドを同定したい場合、選ばれる細胞の種
類はそのヘルペスウイルスに感染しうるものであり、発
現ベクターは選ばれた細胞と適合性であるものである。
本発明によれば、核酸の配列に適用される“ランダ
ム”という語は幾つかの関連する意味をもつ。たとえば
固相合成により形成された真にランダムなオリゴヌクレ
オチドを包含する。しかしこのプロトコールですら、実
際には完全におよび統計的にランダムである必要はな
い。たとえば本発明のある形態によれば、オリゴヌクレ
オチドのある部位においては、特定塩基のエンリッチメ
ント（enrichment）が望ましいであろう。
本発明の概念における“ランダム”という語の他の意
味は、生物、特に感染性因子からのゲノムDNAの使用に
関するものである。これらのゲノムDNAを生物から常法
により採取し、次いで粉砕またはDNase攻撃処理して、
多数のDNAフラグメントを形成する。母体DNAが一定の配
列をもつという点で真にランダムではないが、その配列
は一般に未知であり、そのフラグメント形成は一般に無
制御である。
本発明に適用される“ランダム”という語の他の意味
は、相補的DNAすなわちcDNAに関するものである。相補
的DNAは、生物、特に病原性生物のすべてまたは若干のR
NAにつき調製しうる。次いでこのcDNAをベクターに挿入
し、他の点では上記に述べたと同様に使用しうる。
本発明により意図されるランダムオリゴヌクレオチド
の使用が以上の形態すべてを包含することは理解される
であろう。オリゴヌクレオチドのフラグメントまたは部
分は、一般に本発明の実施に際して有効な大きさのもの
である。一般に、合成により形成されたランダム配列に
ついては約20−100塩基が用いられ、ゲノムDNAまたはcD
NAについては約100から数千の塩基ユニットが用いられ
る。
発現ベクターおよびオリゴヌクレオチドの操作ならび
に細胞の形質転換は、標準法、たとえばマニアチス（Ma
niatis）ら，Molecular Cloning,A Laboratory Manu
al，コールド・スプリング・ハーバー・プレス，ニュー
ヨーク州コールド・スプリング・ハーバー,1982、に見
られるものに従って実施される。
本発明方法に用いるのに適した発現ベクターには、市
販のプラスミドベクター、たとえばpMAMM−NEO（クロー
ンテク）その他の発現ベクターが含まれる。プラスミド
発現ベクターがそのベクターの構成および回収を可能に
する遺伝子を少なくとも１種類、たとえば抗性物質耐性
遺伝子、たとえばアンピシリン耐性遺伝子を含むことが
好ましい。プラスミド発現ベクターが、ランダムまたは
準ランダム配列を発現するための誘導性プロモーターお
よび転写開始領域、ならびにそれらのランダム配列を安
定化するポリアデニル化シグナルを含むことも好まし
い。これは、より効果的な発現のためにイントロンを含
んでもよく、含まなくてもよい。
好ましいプラスミド発現ベクターは第１図に模式的に
示したISIS RG−１である。このベクターは、培養に際
して安定に形質転換された細胞のG418選択のためのネオ
マイシン耐性遺伝子、および細菌性増幅のためのアンピ
シリン耐性遺伝子を含む。Hind IIIおよびXba Ｉ部位
において切断してスタッファー（stuffer）フラグメン
トを放出させることにより、挿入配列を適性方向に（di
rectionally）クローン化することができる。Hind III
部位はRSVプロモーターのすぐ３′側にあり、Xba Ｉ部
位はウシ成長ホルモン（BGH）ポリ（Ａ）部位のすぐ
５′側にある。
本発明方法に用いられるオリゴヌクレオチドは数種類
の供給源から得られる。ランダム配列は、DNA合成装置
により各位置においてＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔの等モル混合物を
用いて一定長さのDNAを形成することによって調製しう
る。相補的連鎖はDNAプライマーおよびDNAポリメラーゼ
を用いて調製しうる。ランダム配列のDNA末端を制限酵
素開裂により残されたオーバーハングに相補的なものと
なすことにより、ランダム混合物を発現ベクター内へク
ローン化することができる。準ランダムオリゴヌクレオ
チドを得るためには、感染性因子のDNAを剪断またはDNa
se処理することによって短片に切断しうる。たとえばヘ
ルペスDNAを剪断またはDNase処理して小サイズとなし、
そして発現ベクター内へ“ショットガンクローン化”す
ることができる。発現した配列のうちあるものはヘルペ
ス遺伝子に対してアンチセンスであろう。あるいは感染
細胞から単離されたmRNAよりcDNAライブラリーを形成す
る。次いでcDNAを発現ベクター内へ、RNAがアンチセン
ス配向で産生されるように方向付けてクローン化する。
この方法によって、有効な感染にとって重要な新規遺伝
子が同定されるであろう。
オリゴヌクレオチドを含む発現ベクターが構成される
と、これらの発現ベクターをその感染性因子に感染され
やすい細胞内へ挿入する。細胞は既にその感染性因子に
感染していてもよく、または発現ベクターの挿入後にそ
の感染性因子に感染させてもよい。発現ベクターは標準
法、たとえばリン酸カルシウムトランスフェクションま
たはエレクトロポレーションにより細胞内へ挿入され
る。
次いで細胞を培養し、感染性因子のmRNAに対してアン
チセンスであるオリゴヌクレオチドを選択する。選択法
は細胞の種類および感染性因子の作用に依存する。たと
えばネオマイシン耐性細胞を10cmの組織培養皿中でコン
フルエンシーに達するまで増殖させる。コンフルエンシ
ーに達した時点で集団全体を低MOIにおいてHSV−１に感
染させる。二次感染の頻度を低下させるために、感染の
のち培地を頻繁に交換する。感染に際して生存した細胞
をコンフルエンシーに達するまで増殖させ、次いで同様
にして２回目の感染を行う。すべての細胞が感染に際し
て生存するまで、または個々の耐性コロニーが選択され
るまで、この処理を反復する。
目的とするオリゴヌクレオチドを含む細胞が選択され
ると、活性をもつオリゴヌクレオチドの配列を決定す
る。オリゴヌクレオチド配列の同定は数種の方法により
行うことができる。オリゴヌクレオチドを発現ベクター
から取出し、配列決定する。あるいは適宜なプライマー
を用いてポリメラーゼ連鎖反応により細胞内でオリゴヌ
クレオチド配列を増幅させ、増幅された配列につき配列
決定してもよい。
実施例 ベクターの構成 以下の方法は、培養された哺乳動物細胞のHSV感染を
特異的に抑制する配列をスクリーンするためのランダム
および準ランダムアンチセンスメッセージを形成する方
式を示す。これは３種類の異なる手段で実施することが
できる。１）ランダム−一定の長さの合成オリゴマー、
２）準ランダム−ゲノムDNAの剪断により調製、および
３）HSV感染細胞からcDNAライブラリーを形成。いずれ
の場合も用いたベクターはISIS RG−１である。このベ
クターは培養において安定に形質転換された細胞をG418
選択するためのネオマイシン耐性遺伝子、および細菌性
増幅のためのアンピシリン耐性遺伝子を含む。Hind II
IおよびXba Ｉ部位において切断してスタッファーフラ
グメントを放出させることにより、挿入部位を適正方向
にクローン化することができる。Hind III部位はRSVプ
ロモーターのすぐ３′側にあり、Xba Ｉ部位はウシ成
長ホルモン（BGH）ポリ（Ａ）部位のすぐ５′側にある
（第１図参照）。
ランダム配列 各オリゴマーの５′末端がHind III部位、 からなるようにオリゴヌクレオチドのランダム集団を調
製する。これに約25ntのランダム配列、次いでテイル配
列 が続き、Xba Ｉ部位およびポリＡテイルが形成され
る。次いで、３′末端配列に相補的なプライマー、 を、形成されたランダムオリゴマーそれぞれに対する相
補鎖を合成するためのプライマーとして用いて、２本鎖
分子を形成する。次いでオリゴマー集団をHind IIIお
よびXba Ｉにより消化して、ベクターと適合性である
粘着末端を得る。
形質転換／選択 上記構造体の効果が確定されると、それらのプラスミ
ドをチェンおよびオカヤマの方法によりCV−１またはHe
La細胞内へ集団としてトランスフェクトする。適切な形
質転換体はG418に対する耐性に基づいて選択される。次
いで安定に形質転換された細胞の集団をHSVに感染させ
る。生存コロニーはHSV感染を特異的にブロックすべく
相互作用するmRNAを発現していると思われる。ついでこ
の作用に関与するプラスミドDNAを、Hind IIIおよびXb
a Ｉプライマーを用いるPCRにより形質転換細胞から単
離することができる。
参考例 ランダムゲノムフラグメント 前記で調製されたHind IIIおよびXba Ｉ末端を備え
たベクターをクレノー断片で充填して、平滑末端を形成
する。次いでリガーゼで処理して、分子を再環化する。
これによりXba Ｉ部位は再生されるが、Hind III部位
は除かれる。次いでこのベクターをXba Ｉで切断し、
両端をホスファターゼ処理して、再環化を防止する。次
いでゲノムDNA全体を種々の濃度のDNase Ｉで切断し、
調製用アガロースゲル上で目的サイズの生成物を単離す
ることにより、挿入配列を形成する。次いで剪断された
フラグメントの両端をT7 DNAポリメラーゼおよびXba
Ｉリンカー、 で修復し、平滑末端をリゲートしたのち、結合した挿入
配列をXba Ｉで切断し、挿入配列を直接にベクター内
へクローン化する。
cDNAフラグメント HSVに感染させた細胞からmRNAを単離する。これらの
配列をRG−１ベクター内へ適正方向にクローン化するた
めに、ポリＡ＋mRNAを でプライムする。プライマーのアニーリングののち、本
質的にグブラーおよびホフマン（Gubler,Hoffman）によ
る概説に従ってcDNAを形成する。
フロントページの続き (72)発明者 ヴィッカーズ，ティモシー アメリカ合衆国カリフォルニア州92084, ヴィスタ，マーリン・ドライブ 907 (72)発明者 エッカー，デービッド・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州92009, カールズバッド，コリブリ・レーン 2609 (56)参考文献 国際公開89／11547（ＷＯ，Ａ１) Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅ ｓｅａｒｃｈ，５（1988）Ｐ．539−549 Ｃａｎｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，48 （1988）ｐ．2659−2668 Ｇｅｎｅ，８’（1989）Ｐ．285−294

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】感染性因子の核酸とハイブリダイズしうる
    オリゴヌクレオチドを同定するための方法であって： （ａ）実質的にランダムに配列した合成オリゴヌクレオ
    チドを含む複数のベクターを調製し； （ｂ）これらのベクターを細胞に取り込ませ； （ｃ）これらの細胞を感染性因子で感染させ； （ｄ）これらの細胞が増殖する条件を与え； （ｅ）感染に対して耐性である細胞を同定し；そして （ｆ）耐性細胞に含まれるオリゴヌクレオチドの核酸配
    列を決定する； の各工程を含む方法。
  2. 【請求項２】ベクターに含まれるオリゴヌクレオチドが
    約10−約100核酸サブユニットからなり、固相合成法に
    より調製される、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】感染性因子に感染しうる細胞が選ばれる、
    請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】感染性因子がヘルペスウイルスであり、細
    胞が上皮細胞である、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】感染性因子の核酸とハイブリダイズしうる
    オリゴヌクレオチドを製造するための方法であって： （ａ）実質的にランダムに配列した合成オリゴヌクレオ
    チドを含む複数のベクターを調製し； （ｂ）これらのベクターを細胞に取り込ませ； （ｃ）これらの細胞を感染性因子で感染させ； （ｄ）これらの細胞が増殖する条件を与え； （ｅ）感染に対して耐性である細胞を同定し； （ｆ）耐性細胞に含まれるオリゴヌクレオチドの核酸配
    列を決定し；そして （ｇ）工程（ｆ）において決定された配列を有するオリ
    ゴヌクレオチドを合成する； の各工程を含む方法。
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