JP2702915B2 - ２−アリールプロピオン酸の製造方法 - Google Patents
２−アリールプロピオン酸の製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、化学式
に示される立体特異的形状の薬学的に活性な化合物、及
びアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩又はピバロイル
エステルのようなその薬学的に許容できる塩及びエステ
ルで、R1が、任意に置換したヘテロ環システム中に任意
に含まれうる、フェニル基やナフチル基のような任意に
置換してもよいアリール基、もしくは、任意に置換され
うる、炭素原子と、窒素、硫黄及び酸素から選ばれた１
以上の原子とを含むヘテロ環システムを示すような化合
物の製造方法に関するものである。 数多くの生物学的に活性な化合物が、立体異性体の混
合物の形で存在することが知られている。 現在に至るまで、これらの混合物はしばしば、農業的
又は薬学的目的で利用されている。通常、望ましい生物
学的活性残基は、一方の立体異性体に存在するので、そ
の結果、２ケの立体異性体の混合物の場合、その混合物
の能力は半分に減ってしまう。しかし、立体異性体を混
合物のまま使用する大きな理由は、立体異性体の分離の
ためのコストが、それによる活性の増加による潜在的利
点を越えてしまうことにある。しかし現代の薬学者は徐
々に、いくつかの立体異性体中の１つは望ましい治療的
効果をもたないだけでなく、他の望ましくない、毒性も
含む生理学的効果をもつかもしれないというような、混
合物の投与に対する他の意味にも気付きはじめてきてい
る。 特に、S.アダムス（S.Adams）等によりジャーナル・
オブ・ファーム・アンド・ファーマキューティック（J.
Pharm.Pharmac.）28巻256頁（1976年）及び、A.J.ハッ
ト（A.J.Hutt）及びJ.コールドウェル（J.Caldwell）に
よる、クリニカル・ファーマコキネティクス（Clinical
Phamacokinetics）９巻371頁（1984年）の報告で知ら
れているように、ナプロキセン（naproxen）及びイブプ
ロフェン（ibuprofen）の試験管内における抗炎症活性
は、Ｓ−エナンチオマー（光学活性立体異性体）にあ
り、その対掌体の150倍にも及ぶことが発見された。 S.イリウチジマ（S.Iriuchijima）と、A.ケイユ（A.K
eiyu）（アグリカルチャナレ・アンド・バイオロジカル
・ケミストリー（Agric.Biol.Chem.）45巻、1389頁（19
81年））は、ある選ばれた微生物は、低い転換率ではあ
るが、ナプロキセン及びケトプロフェンのメチルエステ
ルを加水分解することができることを示した。アペルギ
ルス・ソジャエ（Aspergillus sojae）は選択的に、Ｒ
型ナプロキセンのメチルエステルを加水分解し、95重量
パーセントのＲ−配置をもつナプロキセンを生産し、一
方、ミクロバクテリウム・スメグマティス（Mycrobacte
rium smegmatis）は選択的にＳ型ケトプロフェン（keto
profen）のメチルエステルを加水分解し、69重量パーセ
ントではあるがＳ−配置をもつケトプロフェンを与え
る。 ドイツ特許出願DE 3345660号中には、ナプロキセン・
エステルのラセミ体からのＳ−ナプロキセンの生産が述
べられている。しかし、この特許出願中では、Ｓ型ナプ
ロキセンが、ナプロキセンエステルのラセミ体から直接
形成されるのではなく、Ｒ型のナプロキセンエステルを
酵素的に加水分解し、生じたＲ−ナプロキセンを、Ｓ型
ナプロキセンのエステルと分離した後、反応混合物中に
残存するＳ型ナプロキセンエステルのけん化又は酵素的
加水分解によって形成するものである。 最近の刊行されたもの（ク・ミン（Qu−Ming）等テト
ラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters）、27
巻、16号、17〜63頁（1986年））には、Ｓ型のナプロキ
センエステルを、立体選択的に転換しうる、キャンディ
ダ・シリンドラセア（Candida cylindracea）からの１
つの酵素の調製法が述べられている。著者らは、この調
製物中に存在する、キャンディダ・リパーゼが、ナプロ
キセンの加水分解を任っていることを示している。しか
し、彼等が精製したリパーゼ調製物の比活性は非常に低
い（ある条件下で、リパーゼ・ミリグラム当り、毎分３
×10-8モル）。 それ故、Ｓ型立体異性体の直接的調製に対し、経済的
に魅力のある収率を得ることができる工業的規模のプロ
セスに対する大きな需要が存在し、本発明の目的は、そ
のようなプロセスを与えることである。広範囲な研究と
実験の結果、化学式（Ｉ）： の化合物で、R1は先に定義したもので、R2は、エステル
残基及び好ましくは任意に置換したアルキル基である化
合物に、少なくとも80重量パーセント以上のＳ配置を有
する化合物（Ｉ）へと、化合物（II）を立体選択的に加
水分解しうる、微生物もしくは、微生物由来の物質を作
用させることを含む、化合物（Ｉ）のＳ型立体異性体を
特に精製するための、改良した選択的合成法がまさに今
発見されたのである。 さらに、本発明は、化学式（Ｉ）の立体特異的Ｓ配置
の薬学的に活性な化合物もしくは、好ましくはそのアル
カリ金属塩又はアルカリ土類金属塩である、薬学的に許
容できるその塩又はエステル（但し、R1が任意に置換さ
れうるヘテロ環システム中に任意に含まれうるフェニル
基や、ナフチル基のような任意に置換されうるアリール
基、もしくは、任意に置換されうるシステムで、炭素原
子の他に、窒素、硫黄及び酸素から選ばれる１以上の原
子を含むヘテロ環システムを表わし、R2が任意に置換さ
れるアルキル基である）を優先的に生産するための、化
学式（II）の化合物（II）に、化合物（II）を立体選択
的に加水分解して、化合物（Ｉ）に転換する能力を有す
る微生物を作用させることを含む方法に関するものであ
る。 好ましくは、R2は、１〜８ヶの炭素原子をもつ線状ア
ルキル基で、さらに好ましくはR2はメチルもしくはエチ
ル基である。 化合物（Ｉ）には、ナプロキセン、イブプロフェン、
スプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、ベ
ノキサプロフェン、カープロフェン、シクロプロフェ
ン、パープロフェン、リシプロフェナム、プルービプロ
フェン、クリダナック、ターチプロフェン、ヘキサプロ
フェン、インドプロフェン、メキソプロフェン、プラノ
プロフェン、R803、プロチジン酸、チアプロフェン酸又
はブロフェジルがあげられる。 さらに好ましくは本発明に沿ってナプロキセンが優先
的にＳ配置で精製される。 好ましい具体例によると、この方法は、化合物（Ｉ）
が少なくとも90重量パーセントＳ配置で形成されるよう
な適当な微生物又はそれに由来する物質を選択すること
により実行される。 本発明のもう１つの目的は、前述のキャンディダ・シ
リントラセア（Candida cylindracea）のリパーゼの少
なくとも10倍以上、望ましくは100倍以上の活性のある
酵素を提供することにある。 本発明の別の目的は、後に、化合物（Ｉ）を分離し、
他の部分を加水分解する、本発明に従った工程を含む、
少なくとも80重量パーセント以上のＲ配置を有する化合
物（Ｉ）の精製に対する工程を提供することにある。 “適当な微生物”という言葉は、例えば、バチルス
属、シュードモナス属、アースロバクター属、ムコール
属、ストレプトマイセス属に属する微生物を意味してい
る。 また、新しい遺伝的物質の導入を通して、化合物（I
I）を化合物（Ｉ）に立体選択的に転換する能力を得た
微生物も“適当な微生物”という言葉の具体例となる。 これは、立体選択的加水分解を任う物質、すなわち、
エステラーゼ酵素をコードするクローン化した遺伝子
を、スクリーニングした微生物から他の微生物、特に大
腸菌に転移させることにより行うことができる。他の微
生物は、サッカロミセス、クルイベロミセス、アスペル
ギラス、エシェリシア、シュードモナス及びストレプロ
ミセス属に属するものである。クローン化した遺伝子
は、エステル、好ましくは、β−ナフチル・アセテート
又はナプロゼンエステルを加水分解することのできる酵
素をコードする能力により選択することができる。一
方、それらは、すでに選択されている、エステラーゼの
遺伝子とクロス・ハイブリダイゼーションさせることに
より選択することができる。後者の仮定は、関連する微
生物は、対応する酵素のDNA配列中に相同性を示すとい
う観案（イハラ（Ihara）等、ジャーナル・オブ・バイ
オケミストリー（J.Biochem.）98巻、95頁（1985年））
及び、プラスミドpNAPT−７（実施例11参照）は、他の
バチルス種から誘導した染色体DNAとクロス・ハイブリ
ダイゼーションをするという我々の観察に基づいてい
る。加えて、この発明は化合物（II）を化合物（Ｉ）へ
転換するプロセスにおいて、微生物及びその微生物から
誘導した物質の活性を増加する目的で、微生物中に、そ
のエステラーゼをコードする遺伝子コピーを数多く、も
しくは修正した形で導入する方法を公開している。この
微生物は、例えば枯草菌である。 その微生物を、例えば、高分子ゲル中にうまく固定化
することができる。これは生菌又は死菌の状態でも、ま
た、もし、高い比活性が必要な場合には、ある程度精製
したエステラーゼ酵素を用いて行うことができる。 それ故、“微生物又は、それから誘導された物質”と
いう言葉は、死んでから、もしくは生きている微生物、
又はそれに由来する、任意の濃度と精製度の抽出物を意
味している。 特に、ナプロキセンのエチル及びメチルエステル〔エ
チル２−（６−メトキシ−２−ナフチル）プロピオネー
ト及びメチル２−（６−メトキシ−２−ナフチル）プロ
ピオネート〕をＳ−ナプロキセン〔２−（６−メトキシ
−２−ナフチル）プロピオン酸〕に加水分解する、そし
て、イブプロフェンのエチル及びメチルエステル〔エチ
ル２−（４−イソブチル−１−フェニル）プロピオネー
ト及びメチル２−（４−イソブチル−１−フェニル）プ
ロピオネート〕をＳ−イブプロフェン〔２−（４−イソ
ブチル−１−フェニル）プロピオン酸〕に加水分解する
微生物は、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・
リチェニホルミス（Bacillus licheniformis）（この種
の試料は、ATCC受理番号11945号に保管されている）、
シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluore
scence）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas puti
da）（この種の試料はIFO受理番号12996号で保管されて
いる）、シュードモナス・リボフラビナ（Pseudomonas
riboflavina）（この種の試料はIFO受理番号13584号で
保管されている）、シュードモナス・オバリス（Pseudo
monas ovalis）（この種の試料はIAM受理番号1049号で
保管されている）、シュードモナス・アエルギノザ（Ps
eudomonas aeruginosa）（この種の試料はIFO受理番号1
3130号で保管されている）、ムコール・アングリマクロ
スポラス（Mucor angulimacrosporus）（この種の試料
はIAM受理番号6149号で保管されている）、アースロバ
クター・パラフィネウス（Arthrobacter paraffinaus）
（この種の試料はATCC受理番号21218号で保管されてい
る）、IS III−25株（Strain IS III−25）（この種の
試料はCBS受理番号666.86号で保管されている）、LK3−
４株（Strain LK3−４）（この種の試料はCBS受理番号6
67.86号で保管されている）、Sp 4株（Strain Sp 4）
（この種の試料はCBS受理番号668.86号で保管されてい
る）、Thai III18−１株（Strain Thai III18−１）
（この種の試料はCBS受理番号669.86号で保管されてい
る）、Thai VI12株（Strain Thai VI12）（この種の試
料はCBS受理番号670.86号で保管されている）、の培養
物を含んでいる。好ましくは、枯草菌（Bacillus subti
lis）種の培養物は、バチルス種Thai1−８（Bacillus s
pecies Thai 1−８）（この種の試料は、CBBに受理番号
679.85号で保管されている）、（バチルス種In IV−８
（Bacillus speciesIn IV−８）（この種の試料は、CBS
に受理番号680.85号で保管されている）、バチルス種Na
p 10−Ｍ（Bacillus species Nap10−Ｍ）（この種の試
料はCBSに受理番号805.85号で保管されている）、バチ
ルス種Sp III−４（Bacillus species Sp III−４）
（この種の試料は、CBSに受理番号806.85号で保管され
ている）、枯草菌（Bacillus subtilis）１−85（ユキ
（Yuki）等、日本遺伝学雑誌（Jpn.J.Genet.）42巻、25
1頁（1967年））、枯草菌（Bacillus subtilis）１−85
/pNAPT−７（この種の試料はCBSに受理番号673.86号で
保管されている）、枯草菌（Bacilus subtilis）1A40/p
NAPT−８（この種の試料は、CBSに受理番号674.86号で
保管されている）及び枯草菌（Bacilus subtilis）1A40
/pNAPT−７（この種の試料は、CBSに受理番号675.86号
で保管されている）の培養物を含んでいる。シュードモ
ナス・フルオレセンス（Pseudomonas Fluorescens）の
培養物は、シュードモナス種Kor I−６（Pseudomanas s
pecies Kor I−６）（この種の試料はCBSに受理番号80
7.85号で保管されている）及び、IFOに受理番号3081号
で保管されているシュードモナス・フルオレセンス（Ps
eudomonas Flourescens）の培養物を含んでいる。IFOと
は日本の大阪に発酵研究所を示し、IAMは、日本の東京
大学の応用微生物学研究所のことである。本発明工程の
好ましい具体例によると、化合物（II）を、少なくとも
80重量パーセントＳ−配置をもつ化合物に転換できる微
生物は、約半日から10日間培養しなければならない。そ
の後、その細胞を、液体栄養培地に懸濁し、化合物（I
I）をその細胞の作用を受けさせる。一方では、その細
胞を例えば、細胞破壊培地に懸濁させることで殺ろし、
さらに化合物（II）を、その細胞由来の物質の作用を受
けさせる。 上述のような約半日から10日間の培養の後、その細胞
を、その培地から単離した後、その細胞を液体栄養培地
もしくは、細胞破壊培地に懸濁する。 化合物（II）の選択的加水分解に用いる微生物の生育
のために、同化可能な炭素源（例えば、グルコース、ラ
クテート、スクロース他）、窒素源（例えば、硫酸アン
モニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム他）
に、有機栄養源（例えば、酵母抽出物、モルト抽出物、
ペプトン、肉エキス他）、無機栄養源（例えば、リン
酸、マグネシウム、カリウム、亜鉛、鉄及び他の金属痕
跡量）のための試薬を補った通常の培地が用いられる。 より好ましい培地として、いくつかの成分を任意に補
ったジャップ培地（Jap medium）が用いられた。次の組
成で示されるジャップ培地を用いた；大豆粉（30g/
）、硝酸ナトリウム（7.5g/）、硫酸鉄・７水（0.2
8g/）、クエン酸ナトリウム（6g/）及びフラクトー
ス（12.5g/）pH7.2に調整。使用前に、培地を120℃、
20分で滅菌する。 もう１つの好ましい培地としては、任意にいくつかの
成分を補ったTSB−培地2Xがある。60g/のトリプチカ
ーゼ・ソイ・ブロス（オクソイド（OxoidR））を含む培
地を使用した。使用前にその培地を120℃で20分間滅菌
した。もう１つの好ましい培地は、いくつかの成分を補
った2XTY培地である。トリプトン（ディフコ（Difc
oR））30g/、イースト・イクストラクト（ディフコ
（DifcoR））20g/、塩化ナトリウム3g/、リン酸ア
ンモニウム1g/、及び硫酸アンモニウム1g/を含むpH
6.8の培地を用いた。使用前に、110℃で30分間滅菌し
た。また、さらに好ましい培地として、いくつかの成分
を任意に補ったスキム・ミルク培地を用いた。次の組成
のスキム・ミルク培地を用いた；スキムミルク粉から作
った10％スキムミルクを使用前に110℃で30分間滅菌し
た。 例えば、スキムミルク栄養添加としては、0.5％ラク
テート又はPS III塩、もしくはその双方の組合せで行っ
た。次の組成のPS III塩培地を用いた；リン酸二水素カ
リウム（2.1g/）、リン酸１水素アンモニウム（1.0g/
）、硫酸アンモニウム（0.9g/）、塩化カリウム
（0.2g/）、クエン酸ナトリウム（0.29g/）、硫酸
カルシウム・２水（0.005g/）、硫酸マグネシウム・
７水（0.2g/）、硫酸鉄アンモニウム・6H2O（2.5mg/
）、硫酸亜鉛・７水（0.5mg/）、塩化マンガン・4H
2O（0.3mg/）、硫酸銅・5H2O（0.15mg/）、塩化コ
バルト・6H2O（0.15mg/）、オルトーホウ酸（0.05mg/
）、モリブデン酸ナトリウム・２水（0.055mg/）、
ヨウ化カリウム（0.1mg/）、pH6.8に調整。PS III塩
培地は使用前に120℃20分間滅菌した。 微生物の生長の間、０から45℃の間の温度と、3.5か
ら９の間のpHが維持された。微生物の生育には、20から
37℃の間の温度と、５から９の間のpHが望ましい。 微生物の生育に必要な好気的条件は、もし、酸素の供
給が、その微生物の代謝必要量にみあうなら、既存のい
かなる操作によっても操作することができる。このこと
は、空気の形でうまく酸素を供給し、同時に任意に反応
液体を振盪又は撹拌することにより、最も簡単に行うこ
とができる。化合物（II）の化合物（Ｉ）への転換の
間、微生物は上記の通常の培地中で生長期にあるか、又
は、酸素の分解を防ぐべく、システム（培地又はバッフ
ァー）中に維持されなければならない。 化合物（II）の化合物（Ｉ）への転換の間、必要なと
きは、同化可能な炭素源（例えば、グルコース、ラクテ
ート、スクロース他）、窒素源（例えば硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム等）、有機栄
養源（例えば、酵母抽出物、モルト抽出物、ペプトン、
肉エキス等）、及び無機栄養源（例えば、リン酸、マグ
ネシウム、カリウム、亜鉛、鉄、他の微量金属）を含有
するような通常の培地が用いられる。 好ましくは、化合物（II）の化合物（Ｉ）への転換の
間、いくつかの成分を補ったジャップ培地（前述）を使
用した。またさらに好ましくは、いくつかの成分を補っ
たスキムミルク培地（前述）を用いた。 その微生物は、同化可能な炭素源又は、窒素源を除去
することにより、非生長期に維持することができる。こ
の段階の間、温度は０から45℃に、pHは3.5から９の間
に維持される。 好ましくは、その微生物を20から37℃の間の温度、５
から８の間のpHに維持する。この段階で必要とされる好
気的条件は、もし酸素の供給が、その微生物の代謝に必
要な量にみあうのに十分ならば、既存のいかなる操作で
も供給することができる。このことは、空気の形でうま
く酸素を供給し、同時に任意にその反応液を振盪又は撹
拌することにより、最も簡単に行うことができる。前述
したように、微生物もしくは、それから誘導した物質に
よって作られた化合物（Ｉ）は、そのような生産物に対
して知られている従来の操作に従って、回収及び精製さ
れる。 その微生物は寒天スラント、50％グリセリン保存、も
しくは、凍結乾燥により保存することができる。もし必
要なら、これらの微生物の前培養を、例えば、その微生
物を、ロータリーシェーカーにより、30℃で24時間ブイ
ヨン又はBHI中でインキュベートするといった、確立し
た操作により行なわれる。ブイロン培地は次の組成で用
いることがてきる；ラブ・レムコL29（肉エキス、オク
ソイド（OxoidR）（9g/）、バクトペプトン（10g/
）、塩化ナトリウム（5g/）、pH7.6に調整。使用前
に、培地を120℃で20分間滅菌する。 BHI（ブレイン・ハート・インフュージョン）培地は
0.037g/のBHI（オクソイド（OxoidR））を含み、pH7.
0に調整したものを使用した。使用前にこの培地を120
℃、20分間滅菌した。 ナプロキセンのメチルエステルの加水分解を任う、バ
チルスThai I−８の酵素が特性づけられた。そのエステ
ラーゼ活性はその微生物中に存在するリパーゼ活性とは
無関係であることがわかった。事実、ナプロキセンの不
適正な異性体が低レベル加水分解を起こすのは、主にバ
チルス株の混入したリパーゼ活性によるものと思われ
る。Thai I−８の精製したナプロキセン・エステラーゼ
は、バチルスの全細胞破壊物よりも有意に高い立体異性
体選択性をもっている。 Thai I−８エステラーゼを含むプラスミドをもつ、大
腸菌/pNAPT−７及びバチルス/pNAPT−７は、有意なＳ−
ナプロキセン・エステラーゼを生産する。驚くべきこと
に、SDS−PAGE、HPLC−SEC及びアイソエレクトリックフ
ォーカシングにより確証されたように、エステラーゼ活
性をもつタンパク質はその微生物の細胞破壊物中に最も
高い濃度で存在するタンパク質である。 遺伝子クローニングは、ある酵素の発現レベルを改良
することが知られているが、エステラーゼの場合のよう
な促進は驚くべきことである。酵素の遺伝子をクローニ
ングするときには、不適正な折りたたみ、タンパク質の
変性及び細胞内の沈殿というような問題にしばしば出く
わす（ハリス、T.J.R、遺伝子工学（Genetic.Engineeri
ng）、又、1983年、アカデミック・プレス（Academic P
ress））、予想できなかったことに、エステラーゼ遺伝
子のクローニングに際しては、これらの問題のどれもが
生じなかった。 Ｓ型特異性は以下のように定義した： 本発明は、さらに実施例について述べていくが、これ
は本発明の範囲をこれら実施例に制限するものではな
い。 実施例１ バチルスThai I−８、バチルスIn IV−８、バチルスNap
10M、バチルスSp III−４、バチルス・リチェニホルミ
ス（ATCC11945）及びシュードモナスKor I−６を用いた
RS−ナプロゼンエチルエステルのＳ−ナプロキセンへの
転換 バチルスThai I−８、バチルスIn IV−８、バチルスN
ap10M、バチルスSp III−４、バチルス・リチェニホル
ミス（ATCC11945）及びシュードモナスKor I−６を500m
lバッフルフラスコ中の25mlの10％スキムミルクで各々
インキュベートし、ロータリーシェーカー上で30℃、48
時間インキュベートした。この増殖後、100mgのナプロ
キセンエチルエステルを500mlの大豆油にとかし、110
℃、１時間の滅菌の後、各培養液に加えた。微生物に応
じて、２〜５回分の培養物を使用した。この培養物を、
ロータリーシューカー上、30℃でさらに24時間インキュ
ベートした。その後、その培養物をオルトリン酸でpH2
〜３に酸性化し、少量の硫酸アンモニウムを添加し、25
ml培地当り、20mlのクロロホルム又は酢酸エチルを添加
して抽出した。その抽出物はTLCで分析した。TLC分析
は、シリカゲルプレート（螢光指示薬F254を含むシリカ
ゲル60）をクロロホルム＋１％酢酸で展開し、ナプロキ
センとナプロキセンエチルエステルの分離を行った。Rf
値は、ナプロキセンのエチルエステルが0.7でナプロゼ
ンが0.2であった。有機層はその後エバポレートし、ナ
プロキセンはシリカゲルカラムをエーテルで溶出する方
法で、残渣油から精製した。得られた結果をTable Iに
示す。 旋光性が、室温で、１又は10cm光路長セル（体積0.5
〜5ml）を用い、パーキン−エルマー141ポーラリメータ
ー（Parkin Elmer141 polarimeter）を用いて測定され
た。旋光度は589nmで記録した（ナトリウムＤ−線）。
旋光性は生成物を5mlメタノールに溶解（最高50mg）し
て測定した。市販のＳ−ナプロキセン（セシファーマ
（Secifarma））は＋60゜の｜α|prt値をもっている。実施例２ 微生物による加水分解により生じたＲ及びＳ型ナプロキ
センの立体異性体の分布 実施例１に述べたように、すべてのテストは、100ml
バッフル・フラスコ中25mlの培地をつかって行った。す
べての培地は、BHI培地中24時間前培養した培養物をイ
ノキュレートされた。 検定は、およそ20mgのナプロキセンエチルエステルの
ラセミ体を大豆油に溶かしたものを使って、１から24時
間かけて行った。抽出物はHPLCで分析した。そのエステ
ルと酸はシリカカラム（CP−Sper−Si、クロムパク（Ch
rompack））で分析した。移動相：イソオクタン／エチ
ルアセテート／ギ酸（875ml/125ml/3.5ml）。流速:1.7m
l/min、溶出時間は、ナプロキセンエチルエステルが3.8
分、ナプロキセンが9.0分であった。 その立体異性体純度を測定するためにナプロキセンを
誘導体化した。ナフタレンメチルアミドに誘導したナプ
ロキセン試料は、キラルDNBPGカラムで、イソオクタン
／クロロホルム／メタノール（900ml/70ml/30ml）の溶
出液で分離した。流速は2ml/min。誘導体化したＳ−ナ
プロキセン及びＲ−ナプロキセンの溶出時間は、それぞ
れ28.1分及び30.7分であった。 誘導操作：抽出物2mlを窒素気流中で乾燥させた。その
乾燥試料を200μのベンゼンと10μのチオニルクロ
ライドと60℃で10分間反応させた。反応混合物を窒素気
流中で乾燥させた。乾燥したジクロロメタン中に溶かし
た５％ナフタレンメチルアミン200μを加え、反応を
室温で１時間行った。反応混合物を再び窒素で乾燥し、
それから2mlのイソオクタン／クロロホルム（2:1、v/v
及び2ml1N塩酸）で抽出した。有機層をHPLCで分析し
た。結果を表２に示す。 実施例３ 種々の微生物を用いたRS−ナプロキセンのメチルエステ
ルのＳ−ナプロキセンへの転換 実施例１及び２で述べたように、すべてのテストは10
0mlのバッフルフラスコ中、25mlの培地をつかって行っ
た。しかし、ラセミ体のナプロキセン・エチルエステル
の代りに、ラセミ体のナプロキセンメチルエステルを培
養液に添加した。その培地は、BHI培地中で24時間前培
養した培養液がイノキュレートされた。結果をTable 3
に示す。 実施例４ バチルスThai I−８、バチルスIn IV−８及びバチル
ス・リチュニホルミス（ATCC11945）を用いた、Ｓ−ナ
プロキセン・エチルエステルのＳ−ナプロキセンへの転
換。 実施例１で述べたようにすべてのテストは100mlバッ
フルフラスコ中25mlの培地をつかって行った。すべての
培地は、BHI培地で24時間前培養した培養液がイノキュ
レートされた。加水分解したＳ−ナプロキセンエチルエ
ステルの量はTable 4に示した。 Table 4 栄養添加スキムミルク培地（PS III及びラクテート添
加）中24時間加水分解をうけたＳ−ナプロキセンエチル
エステルの量 実施例５ ファーメンタ中で生育したバチルスThai I−８による
ラセミ体ナプロキセンエチルエステルのＳ−ナプロキセ
ンへの転換。 バチルスThai I−８をBHI培地中24時間前培養した。
その後、50mlの培養物を、10％スキムミルク培地又は、
PS III塩及び5g/のラクテートを補った10％スキムミ
ルクを含む１エッヒウェィラー・ファーメンター（Es
chweiler Fermenter）にイノキュレートした。 次の培養条件が使われた： 容 積 :5培地 温 度 :30℃ 撹拌速度:500rpm 空気流量:50/h 消泡剤：プルロニックL81の自動添加でコントロール pH ：制御せず（pH値は６〜９の間に保たれた） 微生物は70時間生育させ、その間、いくつかの試料が
取り出され、ナプロキセンのエチルエステルに対する活
性の検定をした。その検定は、25mlの試料に、大豆油に
溶かした20mgのラセミ体ナプロキセンエチルエステルを
添加し、バッフルフラスコ中30℃、１時間インキュベー
トすることにより行った。このインキュベーション後、
その試料を抽出、誘導体化そして、HPLCで分析した。 24時間後、微生物の乾燥重量と、容量活性は一定に保
たれた。培養液のpH値は、培養の間、スキムミルクが用
いられたときは6.0から7.8に、栄養添加したスキムミル
クを用いたときは6.0から8.4に増加した。 その結果をTable 5に示す。 Table 5 スキムミルク及び栄養添加スキムミルクを用いたとき
の、バチルスThai I−８の培養結果実施例６ ファーメンターで生育させたバチルスIn IV−８によ
る、ラセミ体ナプロキセン・エチルエステルのＳ−ナプ
ロキセンへの転換 実施例５で述べたのと同じ操作を、バチルスIn IV−
８について行った。70時間のインキュベーションの間、
いくつかの試料を取り、その時間内に、容量活性同様乾
燥重量が実質的に一定になるまで、先に述べた検定を行
った。その間、pH値は、スキムミルクの場合64から7.9
に、栄養添加スキムミルクの場合、6.2から8.4に変化し
た。 結果をTable 6にまとめた。 Table 6 スキムミルク及び栄養添加スキムミルクを用いた、バチ
ルスIn IV−８の培養結果 実施例７ 種々の微生物を用いた、Ｒ、Ｓ−イブプロフェンのエチ
ルエステルのＳ−イブプロフェンへの転換 実施例１及び２で述べたように、すべてのテストは、
100〜500mlのバッフルフラスコ中、25〜100mlの培地で
行った。その培地は栄養混合培地（例えばBHI）で24時
間前培養した培養液をイノキュレートし、48時間培養し
た。その後、培地体積に応じて、20〜80μのラセミ体
イブプロフェンのエチルエステルをその培養液に添加
し、24時間インキュベートした。 その培養液を、H3PO4でpH2.5に酸性化し、少量の硫酸
アンモニウムを添加後、CH2Cl2で抽出した。抽出物中に
存在するイブプロフェンをナフタレン−メチルアミド誘
導体に誘導し、その立体異性的純度を測定した。 3mlの抽出物に、２−ブロモ−１−メチルピリジン・
ヨーダイドのジメチルホルムアミド溶液（50mg/ml）200
μと、１−ナフタレン−メチルアミンのCH2Cl2溶液
（100mg/ml）100μを加え、22℃で５分間反応させ
た。この反応溶液を窒素気流中60℃で乾燥させた。残渣
を3mlのイソオクタン/CH2Cl2（2:1、v/v）にとかし、2m
lの1N H2SO4を添加後抽出した。 有機層をキラルDNBPGカラムでイソオクチル／イソプ
ロピルアルコール／メタノール（92/2/1v/v）を用い
て、また不純物が分析を妨害するときには、イソオクタ
ン／イソプロピルアルコール／メタノール（98/1/1、v/
v）を用いてHPLC分析した。 結果をTable 7に示す。 表示されている値は、２回の実験の平均値である。＊
で示されている微生物を用いた値は単一の実験の結果で
ある。この場合には、50μのテトラデカンに10μの
イブプロフェンを培養液に添加した。 実施例８ 種々の微生物を用いた、Ｓ−イブプロフェンメチルエス
テルのＳ−イブプロフェンへの転換 すべてにテストは、実施例７と同様に行った。ラセミ
体のイブプロフェンエチルエステルの代りに、ラセミ体
のイブプロフェンメチルエステルを培養液に加えた。結
果をTable 8に示した。 表示されている値は、２回の実験の平均値である。＊
で示した微生物を用いたときは、単一の実験から得られ
た値である。この場合には、50μのテトラデカンに溶
かした10μのイブプロフェンを培養液に添加した。 実施例９ 枯草菌Thai I−８（CBS 679.85）中に存在するナプロ
キセンメチルエステラーゼの特性化 バチルスThai I−８を10％のスキムミルクを含むエスヒ
ワイラー・ファーメンター（Eschweiler fermenter）で
生育させた（実施例５参照） 28時間の増殖後、細胞を遠心で集菌した。その細胞を
0.1Mトリス−塩酸（pH8.0）に溶解し、リゾチーム（0.5
mg/mlリゾチーム、4mg/ml EDTA）で室温18時間処理し、
ついでDNase（0.01mg/ml DNase、3.5mg/ml MgCl2）で同
温度で１時間処理した。 遠心後、上清のタンパク画分を70％硫酸アンモニウム
飽和により沈殿させた。遠心後、そのペレットを0.01M
MOPS（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）バ
ッファ（pH7.5）で溶解し、保存剤として0.02％アジ化
ナトリウムを含む同バッファーで18時間透析した。 最終溶液を精製用HPLC−SEC（サイス−エクスクルー
ジョン・クロマトグラフィー）カラム（TSK2000SW、600
×21.5mm）で、0.1M酢酸ナトリウム（pH5.5）を6ml/min
の流速で溶出することにより分析した。10分後から、2m
lづつのフラクションを集め、リパーゼ及びＳ−ナプロ
キセンメチルエステラーゼ活性の検定を行った。 リパーゼ活性は、気質として、pH8.0の0.1MMOPS中で2
0mg/mlのＳ−ナプロキセンメチルエステルを用いて検定
した。18時間のインキュベーションの後、生成したＳ−
ナプロキセンの量を実施例２で述べたようにHPLCにより
測定した。 図１は、バチルスThai I−８細胞破壊物のHPLC−SEC
溶出パターンを示している。Ｓ−ナプロキセン・メチル
・エステラーゼ（フラクション37）は、この微生物中に
存在するリパーゼ活性（フラクション31）と明らかに分
離している。 Table 9では、細胞破壊物、HPLC−SECのフラクション
31及びフラクション38の立体異性選択性の比較がしてあ
る。Ｒ及びＳ−ナプロキセンメチルエステルのエステラ
ーゼ活性は前述の方法でテストした。 Ｓ−ナプロキセンエステラーゼ活性を含むタンパク画
分の見かけの分子量は、標準物質として、27000までの
既知の分子量のタンパク質混合物を用いて見積もった。 検定条件下での、Ｓ−ナプロキセンメチルエステルの
加水分解反応のpH依存性が図２に示してある。用いたバ
ッファーは0.1Mリン酸（pH領域5.5〜7.5）、0.1Mトリス
−塩酸（pH領域7.5〜9.0）、0.1Mグリシン（pH領域9.0
〜10.0）である。 エステラーゼ反応の温度依存性は図３に示してある。
45℃以上の温度では、エステラーゼ反応はほとんどみら
れなかった。37℃での加水分解は大ざっぱにいって25℃
での反応の２倍である。 実施例10 Ｒ−Ｓナプロキセンエステルの立体選択的転換を任う遺
伝子の分子クローニング 枯草菌（Bacillus subtilis）Thai I−８（CBS679.8
5）の染色体DNAフラグメントを含むプラスミド、pNAPT
−２を以下のように調製した。 T.マニアチス（Maniatis）等が1982年コールド・スプ
リングハーバー、ラボラトリーから出版した分子クロー
ニングのハンドブックに述べられているように、一般的
なクローニング技術を用いた。全てのDNA修飾酵素は市
販されているもので、製造業者の指示に従って用いた。
DNAの分離及び精製のための物質及び器具は、業者の指
示に従って用いた。 ポジティブ・セレクション・ベクターpUN121（ニルソ
ン（Nilsson）等、1983年、核酸研究（Nucleic Acids R
esearch）11巻、8019頁）を用いた。このプラスミド
は、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺
伝子及びC1−リプレッサー遺伝子を持っている。このテ
トラサイクリン遺伝子の転写は、C1−リプレッサー遺伝
子の遺伝子産物によって阻害される。C1−リプレッサー
遺伝子のBc1 1部位への外来DNAの挿入は、テトラサイク
リン遺伝子の活性化をうながす。これは、アンピシリン
／テトラサイクリン寒天プレート上での組換えのポジテ
ィブ・セレクションを可能にする。 Sau3Aで部分分解した枯草菌Thai1−8 DNAを、Bc1 1で
消化したpUN121DNAと混合した。ポリヌクレオチドリガ
ーゼの使用による再環状化の後、そのDNA混合物を、前
述の（T.マニアチス（Maniatis）等、1982年）CaCl2の
トランスフォーメション操作によって大腸菌DH1（ATCC3
3849）に導入した。 アンピシリン及びテトラサイクリンに耐性な1000個の
大腸菌コロニーを得た。すべてのトランスフォーマント
を保存し、J.P.ジャーゲン（Gergen）等の方法に従っ
て、レプリカプレートを作った。複製コロニーは、以前
に述べられた手順に基づく、軟寒天重層技術によって、
エステラーゼ活性の検出を行った（T.B.ハイガード（Hi
gerd）とJ.スピジゼン（Spizizen）、1973年、ジャーナ
ル．オブ．バクテリオロジー（J.Bacteriol.）114巻、1
184頁） 基本的には、0.5％の低融点アガロース、0.5Mリン酸
カリウム（pH7.5）、0.5mg/のベーターナフチル・ア
セテート及び0.5mg/mlのファースト・ブルーをトランス
フォーマーの上に散布する。数分後、エステラーゼ又は
リパーゼ活性をもつコロニーは紫色を呈す。そのコロニ
ーを２×TY培地（16g/バクトトリプトン、10g/イー
スト・エクストラクト、5g/塩化ナトリウム）中で１
晩増殖させ、つづいてＳ−ナプロキシエステルをＳ−ナ
プロキセンに転換する（実施例１の方法）能力を検定す
る。１つの大腸菌トランスフォーマントは、Ｓ−ナプロ
キセンエステルを転換することができた。pNAPT−２と
呼ばれる、このトランスフォーマントから単離したプラ
スミドを図４に示した。その大きさは9.4kbである。 ２×TY培地で１晩増殖した大腸菌/pNAPT−２及び大腸
菌/pNAPT−７の活性をTable 10に示した。プラスミドpU
N121のみをもつ大腸菌は、Ｓ又はＲ−ナプロキセンエス
テルを加水分解することができない。これは、Ｓ−ナプ
ロキセンの加水分解に必要な全ての情報は、5kbの枯草
菌Thai 1−8DNA挿入物中に存在することを示している。 pNAPT−２を持つ大腸菌DH1の試料はCBS受理番号671.8
6号に保管されている。 実施例11 枯草菌中に多数の遺伝子コピーを導入することによるエ
ステラーゼ活性の改良 エステラーゼをコードするプラスミドpNAPT−２は、5
kbの枯草菌Thai I−８（CBS 679.85）のDNA挿入物を持
っている。これは、約30kbのタンパク質をコードする遺
伝子に対して予期されるに十分小さい大きさであるの
で、その挿入物は、エステラーゼ活性を失うことなしに
短かくなっているということが考えられる。この可能性
を試すために、pNAPT−２のHind III制限酵素断片をpPN
eo/oriに連結した。これは以下のように行った。pPNeo/
oriは、pUB110（T.C.グリクザン（Gryczan）等、1978
年、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacterio
l.）134巻、318頁）の2.5kbのEcoR I−SnaB1制限断片
に、pUC19（C.ヤニッシュ−ペロン（C.Yanisch−Perro
n）等、ジーン（Jene）、33巻、103頁、1985年）の2.7k
b EcoR I−Sma I制限断片を連結することにより構築し
た。生じたシャトル・プラスミドpPNeo/ori（5.2kb）は
pUC19とオリジンとpLB110オリジンの存在のために、大
腸菌中及びバチルス種中で複製する能力をもっている。
さらにpPNeo/oriは、アンピシリン耐性遺伝子と、ネオ
マイシン耐性遺伝子を持っている（C.ヤニッシュ−ペロ
ン（C.Yanisch−Perro）等、1985年、M.マツムラ（Mats
umura）等、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.B
acteriol.）160巻、413頁、1984年）。 サブクローニングのために、Hind IIIで消化したpNAP
T−２をHind IIIで消化したpPNeo/oriと混合し、連結し
た。その混合物を先に述べたように（マニアチス（Mani
atis）等、1982年）大腸菌JM101hsdsにトランスフォー
ムした。大腸菌JM101hadsは、ファーバゲン・コレクシ
ョン（Phabagen collection）から入手した（オラン
ド、ウトレクト（Utrecht）受理番号PC2493）。ベータ
・ナフチル・アセテートを加水分解することのできるコ
ロニーを実施例10で述べたように選択した。２ケの陽性
コロニーから、プラスミドDNAを単離し、いくつかの制
限酵素認識部位を決定することにより詳細に特徴づけ
た。これらのプラスミド、pNAPT−７及びpNAPT−８の遺
伝子地図を図５と図６に示した。Ｓ−ナプロキセンメチ
ルエステルに対する、大腸菌/pNAPT−７及び大腸菌/pNA
PT−８の活性を測定した（Table 11）。 両方のプラスミドは、挿入物として、方向は逆である
が、2.2kbのpNAPT−２のHind III−Hind IIIフラグメン
トを有していることがわかろう。また、エステラーゼの
遺伝子は。それらのThai I−8DNAの2.0kb領域に存在し
なければならないであろう。大腸菌JM101hsdsからの抽
出後、そのプラスミドpNAPT−７及びpNAPT−８を、枯草
菌１−85及び枯草菌1A−40のプロトプラストにトランス
フォームした（C.チャング（Chang）とS.N.コーエン（C
ohen）、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネテ
ィクス（J.Gene.Genet.）、168巻、111頁、1979年）、
枯草菌１−85（ユキ（Yuki）、S.ジャパニーズ・ジャー
ナル・オブ・ジェネティクス（Jpn.J.Genet.）42巻、25
1頁、1967年）と、枯草菌1A40（バルチス・ストック・
センターB.G.S.C.1A40）はすでに述べられてきている。 ネオマイシン耐性コロニーを、先に述べた方法に従っ
て（実施例12参照）２×TY培地で増殖後、Ｓ−ナプロキ
センメチルエステルを加水分解する能力をテストした。
Table 11にその活性を示した。多数の遺伝子コピーの導
入によって、約300倍の改良が成遂げられた。それ故、
この微生物及びこれらが誘導された物質の、Ｓ−ナプロ
キセンエステルを加水分解するための工程に用いるため
の適性が大巾に改良されたことになる。 遺伝子クローニングがある酵素の発現レベルを改善す
ることは知られてはいるが、エステラーゼの場合の、こ
の促進度には、驚くべきものがある。酵素に対する遺伝
子のクローニングの際には、不適正な折りたたみ、タン
パク質の変性及び細胞内沈殿といった問題に、非常にし
ばしば出くわす。（ハリス（Harris）、T.J.R.1983年、
遺伝子工学４アカデミックプレス）予想に反して、エス
テラーゼの遺伝子のクローニングの場合、これらの問題
は１つも生じなかったようである。実施例12 大腸菌JM101hsds/pNAPT−７のナプロキセンメチルエス
テラーゼの特性化 実施例11の大腸菌JM101hsds/pNAPT−７の１リットル
培養培地を用いた。その培地を遠心し、ペレットをpH8.
0の0.1Mトリス−塩酸バッファに懸濁、１％v/vオクタノ
ールの存在下、1mg/mlリゾチーム、4mg/ml EDTAと、30
℃で１時間、インキュベートした。そのDNAを15mM Mg2+
の存在下0.02mg/mlのDNaseで加水分解した（30分、22
℃）。 遠心後、上清のタンパク質画分を60％硫酸アンモニウ
ム飽和で沈殿させた。遠心後、そのペレットをpH7.5の1
0mM MOPSに溶解し、超遠心により10倍に濃縮した（アミ
コン（Amicon）YM10）。１ミリリットル中20mgのＳ−ナ
プロキセンメチルエステル、２％トウィーン、1mg/ml B
SA（仔牛血清アルブミン）の存在下、250℃、pH7.5の0.
1M MOPS中で検定した大腸菌pNAPT−７のＳ−ナプロキセ
ンエステルに関する比活性はタンパク質１ミリグラム当
り、1.6ユニットであることがわかった。明細書をとお
して、１ユニット（ｕ）とは、特定条件下で、分当り１
×10-6モルのＳ−ナプロキセンメチルエステルを加水分
解する酵素量である。トウィーンは、強い疎水性エステ
ルとBSAの溶解度を変え、特異的吸着による酵素の不活
性変を妨ぐ目的で加えた。タンパク質濃度は、BASを標
準物質としたブラッドフォード（Bradford）の方法に従
がい決定した。 大腸菌pNAPT保持体は超遠心後、実施例９で述べた、H
PLC−SECシステムで分析した。 15分後から、カラムからのフラクションを2mlづつ集
め、Ｓ−ナプロキセンエステラーゼ活性をテストした
（実施例９参照）。 図７は、HPLC−SECフラクションのOD−280nm吸光度と
エステラーゼ活性を示してある。Ｓ−ナプロキセンエス
テラーゼ活性は、吸光度溶出プロフィールのピークのと
ころに存在する。まったく同様に分析した、枯草菌Thai
I−８エステラーゼの溶出時間も同じであった（結果は
示していない）。 図８は、大腸菌pNAPT−７保持体と、HPLC−SECのフラ
クション26の、リームリ（Laemmli）の方法による12.6
％SDS−PAGEの結果を示してある。 レーン４は大腸菌JM101hsds/pUN121を含んでいる。PA
GE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって、大腸
菌pNAPT−７保持体中のもっとも顕著なタンパク質バン
ドは大腸菌にはみられないが、HPLC−SECのフラクショ
ン26に検出される唯一のタンパク質バンドである。 図９は、大腸菌pNAPT−７の等電点ゲル電気泳動（LKB
アムホリン（Ampholine PAG−プレート、PH3.5〜9.5）
の結果を示した。Ａでは、タンパク質をサーバ・ブルＲ
（Serva Blue R）で染色した。Ｂでは、同試料のエステ
ラーゼ活性を、実施例10に述べたβ−ナフチルアセテー
ト/FB（ファースト・ブルーRR塩）により視覚化した。
Ａ中の最も顕著なタンパク質バンドが、最も高いエステ
ラーゼ活性を任うことが示された。 実施例13 大腸菌JM101hsds/pNAPT−７によるイブプロフェンのエ
チルエステルのイブプロフェンへの転換 硫安沈殿と超遠心の後、大腸菌pNAPT細胞破壊物は、
Ｒ−及びＳ−イブプロフェン・エチルエステルの加水分
解に関するテストを行った。 酵素活性は、0.3mg/mlのＲ又はＳ−イブプロフェンエ
チルエステル、２％トウィーン及び1mg/ml BSAの存在下
pH7.5の0.1M MOPSバッファ中25℃で検定した。２時間
後、アセトニトリルを添加することにより反応を停止し
た。 反応混合物は、HPLC逆相カラム（クロムパックポリゴ
シル60D−10CN（chromack polygosil）、250×4.6m
m）、を使い、1.5ml/minの流速で、34％アセトニトリ
ル、0.05Mリン酸（pH3.0）を流すことにより分析した。
Ｒ、Ｓ−イブプロフェン及びＲ、Ｓ−イブプロフェンエ
チルエステルの溶出時間は5.98分及び11.08分であっ
た。結果をTable 12にまとめた。 Ｓ−イブプロフェンのエチルエステルの加水分解は同
条件下でテストしたＳ−ナプロキセンメチルエステルの
加水分解活性の60％であった。 実施例14 バチルス１−85/pNAPT−７のＳ−ナプロキセンエステラ
ーゼの特性化 バチルス１−85/pNAPT−７を２×TY培地で５リットル
エスヒバイラ・ファーメンターを用いて増殖させた。細
胞ペーストを遠心で単離した。そのペレットをpH8.0の
0.1Mトリス−塩酸に溶解し、実施例９に述べた方法で分
解した。 遠心後、上清を60％飽和硫酸アンモニウムにし、再び
遠心した。ペレットをpH7.5 0.02M MOPSに溶かし、アミ
コンYM10（Amicon YM10）フィルターで濾過した。この
細胞分解物を分析用HPLC−SECカラム（TSK 2000 SW、２
×（300×7.5mm））を用い、pH5.6の0.01M MES（２−
（−Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、0.1M NaClで
溶出した。流速は1ml/min。10分後から1mlづつフラクシ
ョンを集め、実施例12の方法に従がいＳ−ナプロキセン
メチルエステラーゼ活性をテストした。 図10は、そのフラクションのOD−280nmのプロフィー
ルとエステラーゼ活性を示してある。Ｓ−ナプロキセン
エステラーゼの溶出時間は、見かけの分子量27000に相
当する。種々のタンパク質試料の比活性をTable 13にま
とめた。エステラーゼ活性は実施例12に述べた方法で検
定した。 バチルスpNAPT−７保持体の立体異性選択性をTable 1
4に示した。その活性は、実施例12に従って検定した。 図８に、リームリ（Laemmli）の方法に従った、バチ
ルスpNAPT−７と、各々、リパーゼ活性と、Ｓ−ナプロ
キセンエステラーゼ活性を示すHPLC−SECのフラクショ
ン５及び７の12.6％SDS−PAGEの結果を示す。バチルス
保持体におけるタンパク質の主なバンドは、フラクショ
ン５中には存在せず（リパーゼ活性）、フラクション７
中に存在する唯一のバンドである。レーン８のタンパク
質バンドは、見かけの分子量31000に相当する。 図９には、バチルスpNAPT−７とフラクション７の等
電点ゲル電気泳動の結果が示されている。（技術的な詳
細は実施例12参照）。バチルスpNAPT−７保持体では、
等電点（IEP）4.5をもつリパーゼ活性がナフチルアセテ
ートの基質に関するもっとも卓越した活性である。HPLC
−SECのフラクション７においては、タンパク質の主バ
ンドはIEP5.4を有しており、パートＢ中に示したナフチ
ルアセテート加水分解活性と共存する。β−ナフチル・
ファースト・ブルー検定法は、エステラーゼよりも、リ
パーゼに対し、より感受性が高いことに注意しなければ
ならない。 HPLC−SECのOD280nmピーク（フラクション７）は、ナ
プロキセンエステラーゼ活性を含み、SDS−PAGEで１つ
の主タンパク質バンドからなるようである。等電点ゲル
電気泳動は、フラクション７の主タンパク質バンドがエ
ステラーゼ活性をもつことを示した。これは、大腸菌及
びバチルスの両方に存在する枯草菌Thai I−８のエステ
ラーゼ活性のクローニングがエステラーゼ産生を増加し
ていることを意味する。事実、大腸菌pNAPT−７及びバ
チルスpNAPT−７中のナプロキセンエステラーゼは、両
方の微生物の細胞分解物中、もっとも高い濃度をもつタ
ンパク質である。
びアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩又はピバロイル
エステルのようなその薬学的に許容できる塩及びエステ
ルで、R1が、任意に置換したヘテロ環システム中に任意
に含まれうる、フェニル基やナフチル基のような任意に
置換してもよいアリール基、もしくは、任意に置換され
うる、炭素原子と、窒素、硫黄及び酸素から選ばれた１
以上の原子とを含むヘテロ環システムを示すような化合
物の製造方法に関するものである。 数多くの生物学的に活性な化合物が、立体異性体の混
合物の形で存在することが知られている。 現在に至るまで、これらの混合物はしばしば、農業的
又は薬学的目的で利用されている。通常、望ましい生物
学的活性残基は、一方の立体異性体に存在するので、そ
の結果、２ケの立体異性体の混合物の場合、その混合物
の能力は半分に減ってしまう。しかし、立体異性体を混
合物のまま使用する大きな理由は、立体異性体の分離の
ためのコストが、それによる活性の増加による潜在的利
点を越えてしまうことにある。しかし現代の薬学者は徐
々に、いくつかの立体異性体中の１つは望ましい治療的
効果をもたないだけでなく、他の望ましくない、毒性も
含む生理学的効果をもつかもしれないというような、混
合物の投与に対する他の意味にも気付きはじめてきてい
る。 特に、S.アダムス（S.Adams）等によりジャーナル・
オブ・ファーム・アンド・ファーマキューティック（J.
Pharm.Pharmac.）28巻256頁（1976年）及び、A.J.ハッ
ト（A.J.Hutt）及びJ.コールドウェル（J.Caldwell）に
よる、クリニカル・ファーマコキネティクス（Clinical
Phamacokinetics）９巻371頁（1984年）の報告で知ら
れているように、ナプロキセン（naproxen）及びイブプ
ロフェン（ibuprofen）の試験管内における抗炎症活性
は、Ｓ−エナンチオマー（光学活性立体異性体）にあ
り、その対掌体の150倍にも及ぶことが発見された。 S.イリウチジマ（S.Iriuchijima）と、A.ケイユ（A.K
eiyu）（アグリカルチャナレ・アンド・バイオロジカル
・ケミストリー（Agric.Biol.Chem.）45巻、1389頁（19
81年））は、ある選ばれた微生物は、低い転換率ではあ
るが、ナプロキセン及びケトプロフェンのメチルエステ
ルを加水分解することができることを示した。アペルギ
ルス・ソジャエ（Aspergillus sojae）は選択的に、Ｒ
型ナプロキセンのメチルエステルを加水分解し、95重量
パーセントのＲ−配置をもつナプロキセンを生産し、一
方、ミクロバクテリウム・スメグマティス（Mycrobacte
rium smegmatis）は選択的にＳ型ケトプロフェン（keto
profen）のメチルエステルを加水分解し、69重量パーセ
ントではあるがＳ−配置をもつケトプロフェンを与え
る。 ドイツ特許出願DE 3345660号中には、ナプロキセン・
エステルのラセミ体からのＳ−ナプロキセンの生産が述
べられている。しかし、この特許出願中では、Ｓ型ナプ
ロキセンが、ナプロキセンエステルのラセミ体から直接
形成されるのではなく、Ｒ型のナプロキセンエステルを
酵素的に加水分解し、生じたＲ−ナプロキセンを、Ｓ型
ナプロキセンのエステルと分離した後、反応混合物中に
残存するＳ型ナプロキセンエステルのけん化又は酵素的
加水分解によって形成するものである。 最近の刊行されたもの（ク・ミン（Qu−Ming）等テト
ラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters）、27
巻、16号、17〜63頁（1986年））には、Ｓ型のナプロキ
センエステルを、立体選択的に転換しうる、キャンディ
ダ・シリンドラセア（Candida cylindracea）からの１
つの酵素の調製法が述べられている。著者らは、この調
製物中に存在する、キャンディダ・リパーゼが、ナプロ
キセンの加水分解を任っていることを示している。しか
し、彼等が精製したリパーゼ調製物の比活性は非常に低
い（ある条件下で、リパーゼ・ミリグラム当り、毎分３
×10-8モル）。 それ故、Ｓ型立体異性体の直接的調製に対し、経済的
に魅力のある収率を得ることができる工業的規模のプロ
セスに対する大きな需要が存在し、本発明の目的は、そ
のようなプロセスを与えることである。広範囲な研究と
実験の結果、化学式（Ｉ）： の化合物で、R1は先に定義したもので、R2は、エステル
残基及び好ましくは任意に置換したアルキル基である化
合物に、少なくとも80重量パーセント以上のＳ配置を有
する化合物（Ｉ）へと、化合物（II）を立体選択的に加
水分解しうる、微生物もしくは、微生物由来の物質を作
用させることを含む、化合物（Ｉ）のＳ型立体異性体を
特に精製するための、改良した選択的合成法がまさに今
発見されたのである。 さらに、本発明は、化学式（Ｉ）の立体特異的Ｓ配置
の薬学的に活性な化合物もしくは、好ましくはそのアル
カリ金属塩又はアルカリ土類金属塩である、薬学的に許
容できるその塩又はエステル（但し、R1が任意に置換さ
れうるヘテロ環システム中に任意に含まれうるフェニル
基や、ナフチル基のような任意に置換されうるアリール
基、もしくは、任意に置換されうるシステムで、炭素原
子の他に、窒素、硫黄及び酸素から選ばれる１以上の原
子を含むヘテロ環システムを表わし、R2が任意に置換さ
れるアルキル基である）を優先的に生産するための、化
学式（II）の化合物（II）に、化合物（II）を立体選択
的に加水分解して、化合物（Ｉ）に転換する能力を有す
る微生物を作用させることを含む方法に関するものであ
る。 好ましくは、R2は、１〜８ヶの炭素原子をもつ線状ア
ルキル基で、さらに好ましくはR2はメチルもしくはエチ
ル基である。 化合物（Ｉ）には、ナプロキセン、イブプロフェン、
スプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、ベ
ノキサプロフェン、カープロフェン、シクロプロフェ
ン、パープロフェン、リシプロフェナム、プルービプロ
フェン、クリダナック、ターチプロフェン、ヘキサプロ
フェン、インドプロフェン、メキソプロフェン、プラノ
プロフェン、R803、プロチジン酸、チアプロフェン酸又
はブロフェジルがあげられる。 さらに好ましくは本発明に沿ってナプロキセンが優先
的にＳ配置で精製される。 好ましい具体例によると、この方法は、化合物（Ｉ）
が少なくとも90重量パーセントＳ配置で形成されるよう
な適当な微生物又はそれに由来する物質を選択すること
により実行される。 本発明のもう１つの目的は、前述のキャンディダ・シ
リントラセア（Candida cylindracea）のリパーゼの少
なくとも10倍以上、望ましくは100倍以上の活性のある
酵素を提供することにある。 本発明の別の目的は、後に、化合物（Ｉ）を分離し、
他の部分を加水分解する、本発明に従った工程を含む、
少なくとも80重量パーセント以上のＲ配置を有する化合
物（Ｉ）の精製に対する工程を提供することにある。 “適当な微生物”という言葉は、例えば、バチルス
属、シュードモナス属、アースロバクター属、ムコール
属、ストレプトマイセス属に属する微生物を意味してい
る。 また、新しい遺伝的物質の導入を通して、化合物（I
I）を化合物（Ｉ）に立体選択的に転換する能力を得た
微生物も“適当な微生物”という言葉の具体例となる。 これは、立体選択的加水分解を任う物質、すなわち、
エステラーゼ酵素をコードするクローン化した遺伝子
を、スクリーニングした微生物から他の微生物、特に大
腸菌に転移させることにより行うことができる。他の微
生物は、サッカロミセス、クルイベロミセス、アスペル
ギラス、エシェリシア、シュードモナス及びストレプロ
ミセス属に属するものである。クローン化した遺伝子
は、エステル、好ましくは、β−ナフチル・アセテート
又はナプロゼンエステルを加水分解することのできる酵
素をコードする能力により選択することができる。一
方、それらは、すでに選択されている、エステラーゼの
遺伝子とクロス・ハイブリダイゼーションさせることに
より選択することができる。後者の仮定は、関連する微
生物は、対応する酵素のDNA配列中に相同性を示すとい
う観案（イハラ（Ihara）等、ジャーナル・オブ・バイ
オケミストリー（J.Biochem.）98巻、95頁（1985年））
及び、プラスミドpNAPT−７（実施例11参照）は、他の
バチルス種から誘導した染色体DNAとクロス・ハイブリ
ダイゼーションをするという我々の観察に基づいてい
る。加えて、この発明は化合物（II）を化合物（Ｉ）へ
転換するプロセスにおいて、微生物及びその微生物から
誘導した物質の活性を増加する目的で、微生物中に、そ
のエステラーゼをコードする遺伝子コピーを数多く、も
しくは修正した形で導入する方法を公開している。この
微生物は、例えば枯草菌である。 その微生物を、例えば、高分子ゲル中にうまく固定化
することができる。これは生菌又は死菌の状態でも、ま
た、もし、高い比活性が必要な場合には、ある程度精製
したエステラーゼ酵素を用いて行うことができる。 それ故、“微生物又は、それから誘導された物質”と
いう言葉は、死んでから、もしくは生きている微生物、
又はそれに由来する、任意の濃度と精製度の抽出物を意
味している。 特に、ナプロキセンのエチル及びメチルエステル〔エ
チル２−（６−メトキシ−２−ナフチル）プロピオネー
ト及びメチル２−（６−メトキシ−２−ナフチル）プロ
ピオネート〕をＳ−ナプロキセン〔２−（６−メトキシ
−２−ナフチル）プロピオン酸〕に加水分解する、そし
て、イブプロフェンのエチル及びメチルエステル〔エチ
ル２−（４−イソブチル−１−フェニル）プロピオネー
ト及びメチル２−（４−イソブチル−１−フェニル）プ
ロピオネート〕をＳ−イブプロフェン〔２−（４−イソ
ブチル−１−フェニル）プロピオン酸〕に加水分解する
微生物は、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・
リチェニホルミス（Bacillus licheniformis）（この種
の試料は、ATCC受理番号11945号に保管されている）、
シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluore
scence）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas puti
da）（この種の試料はIFO受理番号12996号で保管されて
いる）、シュードモナス・リボフラビナ（Pseudomonas
riboflavina）（この種の試料はIFO受理番号13584号で
保管されている）、シュードモナス・オバリス（Pseudo
monas ovalis）（この種の試料はIAM受理番号1049号で
保管されている）、シュードモナス・アエルギノザ（Ps
eudomonas aeruginosa）（この種の試料はIFO受理番号1
3130号で保管されている）、ムコール・アングリマクロ
スポラス（Mucor angulimacrosporus）（この種の試料
はIAM受理番号6149号で保管されている）、アースロバ
クター・パラフィネウス（Arthrobacter paraffinaus）
（この種の試料はATCC受理番号21218号で保管されてい
る）、IS III−25株（Strain IS III−25）（この種の
試料はCBS受理番号666.86号で保管されている）、LK3−
４株（Strain LK3−４）（この種の試料はCBS受理番号6
67.86号で保管されている）、Sp 4株（Strain Sp 4）
（この種の試料はCBS受理番号668.86号で保管されてい
る）、Thai III18−１株（Strain Thai III18−１）
（この種の試料はCBS受理番号669.86号で保管されてい
る）、Thai VI12株（Strain Thai VI12）（この種の試
料はCBS受理番号670.86号で保管されている）、の培養
物を含んでいる。好ましくは、枯草菌（Bacillus subti
lis）種の培養物は、バチルス種Thai1−８（Bacillus s
pecies Thai 1−８）（この種の試料は、CBBに受理番号
679.85号で保管されている）、（バチルス種In IV−８
（Bacillus speciesIn IV−８）（この種の試料は、CBS
に受理番号680.85号で保管されている）、バチルス種Na
p 10−Ｍ（Bacillus species Nap10−Ｍ）（この種の試
料はCBSに受理番号805.85号で保管されている）、バチ
ルス種Sp III−４（Bacillus species Sp III−４）
（この種の試料は、CBSに受理番号806.85号で保管され
ている）、枯草菌（Bacillus subtilis）１−85（ユキ
（Yuki）等、日本遺伝学雑誌（Jpn.J.Genet.）42巻、25
1頁（1967年））、枯草菌（Bacillus subtilis）１−85
/pNAPT−７（この種の試料はCBSに受理番号673.86号で
保管されている）、枯草菌（Bacilus subtilis）1A40/p
NAPT−８（この種の試料は、CBSに受理番号674.86号で
保管されている）及び枯草菌（Bacilus subtilis）1A40
/pNAPT−７（この種の試料は、CBSに受理番号675.86号
で保管されている）の培養物を含んでいる。シュードモ
ナス・フルオレセンス（Pseudomonas Fluorescens）の
培養物は、シュードモナス種Kor I−６（Pseudomanas s
pecies Kor I−６）（この種の試料はCBSに受理番号80
7.85号で保管されている）及び、IFOに受理番号3081号
で保管されているシュードモナス・フルオレセンス（Ps
eudomonas Flourescens）の培養物を含んでいる。IFOと
は日本の大阪に発酵研究所を示し、IAMは、日本の東京
大学の応用微生物学研究所のことである。本発明工程の
好ましい具体例によると、化合物（II）を、少なくとも
80重量パーセントＳ−配置をもつ化合物に転換できる微
生物は、約半日から10日間培養しなければならない。そ
の後、その細胞を、液体栄養培地に懸濁し、化合物（I
I）をその細胞の作用を受けさせる。一方では、その細
胞を例えば、細胞破壊培地に懸濁させることで殺ろし、
さらに化合物（II）を、その細胞由来の物質の作用を受
けさせる。 上述のような約半日から10日間の培養の後、その細胞
を、その培地から単離した後、その細胞を液体栄養培地
もしくは、細胞破壊培地に懸濁する。 化合物（II）の選択的加水分解に用いる微生物の生育
のために、同化可能な炭素源（例えば、グルコース、ラ
クテート、スクロース他）、窒素源（例えば、硫酸アン
モニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム他）
に、有機栄養源（例えば、酵母抽出物、モルト抽出物、
ペプトン、肉エキス他）、無機栄養源（例えば、リン
酸、マグネシウム、カリウム、亜鉛、鉄及び他の金属痕
跡量）のための試薬を補った通常の培地が用いられる。 より好ましい培地として、いくつかの成分を任意に補
ったジャップ培地（Jap medium）が用いられた。次の組
成で示されるジャップ培地を用いた；大豆粉（30g/
）、硝酸ナトリウム（7.5g/）、硫酸鉄・７水（0.2
8g/）、クエン酸ナトリウム（6g/）及びフラクトー
ス（12.5g/）pH7.2に調整。使用前に、培地を120℃、
20分で滅菌する。 もう１つの好ましい培地としては、任意にいくつかの
成分を補ったTSB−培地2Xがある。60g/のトリプチカ
ーゼ・ソイ・ブロス（オクソイド（OxoidR））を含む培
地を使用した。使用前にその培地を120℃で20分間滅菌
した。もう１つの好ましい培地は、いくつかの成分を補
った2XTY培地である。トリプトン（ディフコ（Difc
oR））30g/、イースト・イクストラクト（ディフコ
（DifcoR））20g/、塩化ナトリウム3g/、リン酸ア
ンモニウム1g/、及び硫酸アンモニウム1g/を含むpH
6.8の培地を用いた。使用前に、110℃で30分間滅菌し
た。また、さらに好ましい培地として、いくつかの成分
を任意に補ったスキム・ミルク培地を用いた。次の組成
のスキム・ミルク培地を用いた；スキムミルク粉から作
った10％スキムミルクを使用前に110℃で30分間滅菌し
た。 例えば、スキムミルク栄養添加としては、0.5％ラク
テート又はPS III塩、もしくはその双方の組合せで行っ
た。次の組成のPS III塩培地を用いた；リン酸二水素カ
リウム（2.1g/）、リン酸１水素アンモニウム（1.0g/
）、硫酸アンモニウム（0.9g/）、塩化カリウム
（0.2g/）、クエン酸ナトリウム（0.29g/）、硫酸
カルシウム・２水（0.005g/）、硫酸マグネシウム・
７水（0.2g/）、硫酸鉄アンモニウム・6H2O（2.5mg/
）、硫酸亜鉛・７水（0.5mg/）、塩化マンガン・4H
2O（0.3mg/）、硫酸銅・5H2O（0.15mg/）、塩化コ
バルト・6H2O（0.15mg/）、オルトーホウ酸（0.05mg/
）、モリブデン酸ナトリウム・２水（0.055mg/）、
ヨウ化カリウム（0.1mg/）、pH6.8に調整。PS III塩
培地は使用前に120℃20分間滅菌した。 微生物の生長の間、０から45℃の間の温度と、3.5か
ら９の間のpHが維持された。微生物の生育には、20から
37℃の間の温度と、５から９の間のpHが望ましい。 微生物の生育に必要な好気的条件は、もし、酸素の供
給が、その微生物の代謝必要量にみあうなら、既存のい
かなる操作によっても操作することができる。このこと
は、空気の形でうまく酸素を供給し、同時に任意に反応
液体を振盪又は撹拌することにより、最も簡単に行うこ
とができる。化合物（II）の化合物（Ｉ）への転換の
間、微生物は上記の通常の培地中で生長期にあるか、又
は、酸素の分解を防ぐべく、システム（培地又はバッフ
ァー）中に維持されなければならない。 化合物（II）の化合物（Ｉ）への転換の間、必要なと
きは、同化可能な炭素源（例えば、グルコース、ラクテ
ート、スクロース他）、窒素源（例えば硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム等）、有機栄
養源（例えば、酵母抽出物、モルト抽出物、ペプトン、
肉エキス等）、及び無機栄養源（例えば、リン酸、マグ
ネシウム、カリウム、亜鉛、鉄、他の微量金属）を含有
するような通常の培地が用いられる。 好ましくは、化合物（II）の化合物（Ｉ）への転換の
間、いくつかの成分を補ったジャップ培地（前述）を使
用した。またさらに好ましくは、いくつかの成分を補っ
たスキムミルク培地（前述）を用いた。 その微生物は、同化可能な炭素源又は、窒素源を除去
することにより、非生長期に維持することができる。こ
の段階の間、温度は０から45℃に、pHは3.5から９の間
に維持される。 好ましくは、その微生物を20から37℃の間の温度、５
から８の間のpHに維持する。この段階で必要とされる好
気的条件は、もし酸素の供給が、その微生物の代謝に必
要な量にみあうのに十分ならば、既存のいかなる操作で
も供給することができる。このことは、空気の形でうま
く酸素を供給し、同時に任意にその反応液を振盪又は撹
拌することにより、最も簡単に行うことができる。前述
したように、微生物もしくは、それから誘導した物質に
よって作られた化合物（Ｉ）は、そのような生産物に対
して知られている従来の操作に従って、回収及び精製さ
れる。 その微生物は寒天スラント、50％グリセリン保存、も
しくは、凍結乾燥により保存することができる。もし必
要なら、これらの微生物の前培養を、例えば、その微生
物を、ロータリーシェーカーにより、30℃で24時間ブイ
ヨン又はBHI中でインキュベートするといった、確立し
た操作により行なわれる。ブイロン培地は次の組成で用
いることがてきる；ラブ・レムコL29（肉エキス、オク
ソイド（OxoidR）（9g/）、バクトペプトン（10g/
）、塩化ナトリウム（5g/）、pH7.6に調整。使用前
に、培地を120℃で20分間滅菌する。 BHI（ブレイン・ハート・インフュージョン）培地は
0.037g/のBHI（オクソイド（OxoidR））を含み、pH7.
0に調整したものを使用した。使用前にこの培地を120
℃、20分間滅菌した。 ナプロキセンのメチルエステルの加水分解を任う、バ
チルスThai I−８の酵素が特性づけられた。そのエステ
ラーゼ活性はその微生物中に存在するリパーゼ活性とは
無関係であることがわかった。事実、ナプロキセンの不
適正な異性体が低レベル加水分解を起こすのは、主にバ
チルス株の混入したリパーゼ活性によるものと思われ
る。Thai I−８の精製したナプロキセン・エステラーゼ
は、バチルスの全細胞破壊物よりも有意に高い立体異性
体選択性をもっている。 Thai I−８エステラーゼを含むプラスミドをもつ、大
腸菌/pNAPT−７及びバチルス/pNAPT−７は、有意なＳ−
ナプロキセン・エステラーゼを生産する。驚くべきこと
に、SDS−PAGE、HPLC−SEC及びアイソエレクトリックフ
ォーカシングにより確証されたように、エステラーゼ活
性をもつタンパク質はその微生物の細胞破壊物中に最も
高い濃度で存在するタンパク質である。 遺伝子クローニングは、ある酵素の発現レベルを改良
することが知られているが、エステラーゼの場合のよう
な促進は驚くべきことである。酵素の遺伝子をクローニ
ングするときには、不適正な折りたたみ、タンパク質の
変性及び細胞内の沈殿というような問題にしばしば出く
わす（ハリス、T.J.R、遺伝子工学（Genetic.Engineeri
ng）、又、1983年、アカデミック・プレス（Academic P
ress））、予想できなかったことに、エステラーゼ遺伝
子のクローニングに際しては、これらの問題のどれもが
生じなかった。 Ｓ型特異性は以下のように定義した： 本発明は、さらに実施例について述べていくが、これ
は本発明の範囲をこれら実施例に制限するものではな
い。 実施例１ バチルスThai I−８、バチルスIn IV−８、バチルスNap
10M、バチルスSp III−４、バチルス・リチェニホルミ
ス（ATCC11945）及びシュードモナスKor I−６を用いた
RS−ナプロゼンエチルエステルのＳ−ナプロキセンへの
転換 バチルスThai I−８、バチルスIn IV−８、バチルスN
ap10M、バチルスSp III−４、バチルス・リチェニホル
ミス（ATCC11945）及びシュードモナスKor I−６を500m
lバッフルフラスコ中の25mlの10％スキムミルクで各々
インキュベートし、ロータリーシェーカー上で30℃、48
時間インキュベートした。この増殖後、100mgのナプロ
キセンエチルエステルを500mlの大豆油にとかし、110
℃、１時間の滅菌の後、各培養液に加えた。微生物に応
じて、２〜５回分の培養物を使用した。この培養物を、
ロータリーシューカー上、30℃でさらに24時間インキュ
ベートした。その後、その培養物をオルトリン酸でpH2
〜３に酸性化し、少量の硫酸アンモニウムを添加し、25
ml培地当り、20mlのクロロホルム又は酢酸エチルを添加
して抽出した。その抽出物はTLCで分析した。TLC分析
は、シリカゲルプレート（螢光指示薬F254を含むシリカ
ゲル60）をクロロホルム＋１％酢酸で展開し、ナプロキ
センとナプロキセンエチルエステルの分離を行った。Rf
値は、ナプロキセンのエチルエステルが0.7でナプロゼ
ンが0.2であった。有機層はその後エバポレートし、ナ
プロキセンはシリカゲルカラムをエーテルで溶出する方
法で、残渣油から精製した。得られた結果をTable Iに
示す。 旋光性が、室温で、１又は10cm光路長セル（体積0.5
〜5ml）を用い、パーキン−エルマー141ポーラリメータ
ー（Parkin Elmer141 polarimeter）を用いて測定され
た。旋光度は589nmで記録した（ナトリウムＤ−線）。
旋光性は生成物を5mlメタノールに溶解（最高50mg）し
て測定した。市販のＳ−ナプロキセン（セシファーマ
（Secifarma））は＋60゜の｜α|prt値をもっている。実施例２ 微生物による加水分解により生じたＲ及びＳ型ナプロキ
センの立体異性体の分布 実施例１に述べたように、すべてのテストは、100ml
バッフル・フラスコ中25mlの培地をつかって行った。す
べての培地は、BHI培地中24時間前培養した培養物をイ
ノキュレートされた。 検定は、およそ20mgのナプロキセンエチルエステルの
ラセミ体を大豆油に溶かしたものを使って、１から24時
間かけて行った。抽出物はHPLCで分析した。そのエステ
ルと酸はシリカカラム（CP−Sper−Si、クロムパク（Ch
rompack））で分析した。移動相：イソオクタン／エチ
ルアセテート／ギ酸（875ml/125ml/3.5ml）。流速:1.7m
l/min、溶出時間は、ナプロキセンエチルエステルが3.8
分、ナプロキセンが9.0分であった。 その立体異性体純度を測定するためにナプロキセンを
誘導体化した。ナフタレンメチルアミドに誘導したナプ
ロキセン試料は、キラルDNBPGカラムで、イソオクタン
／クロロホルム／メタノール（900ml/70ml/30ml）の溶
出液で分離した。流速は2ml/min。誘導体化したＳ−ナ
プロキセン及びＲ−ナプロキセンの溶出時間は、それぞ
れ28.1分及び30.7分であった。 誘導操作：抽出物2mlを窒素気流中で乾燥させた。その
乾燥試料を200μのベンゼンと10μのチオニルクロ
ライドと60℃で10分間反応させた。反応混合物を窒素気
流中で乾燥させた。乾燥したジクロロメタン中に溶かし
た５％ナフタレンメチルアミン200μを加え、反応を
室温で１時間行った。反応混合物を再び窒素で乾燥し、
それから2mlのイソオクタン／クロロホルム（2:1、v/v
及び2ml1N塩酸）で抽出した。有機層をHPLCで分析し
た。結果を表２に示す。 実施例３ 種々の微生物を用いたRS−ナプロキセンのメチルエステ
ルのＳ−ナプロキセンへの転換 実施例１及び２で述べたように、すべてのテストは10
0mlのバッフルフラスコ中、25mlの培地をつかって行っ
た。しかし、ラセミ体のナプロキセン・エチルエステル
の代りに、ラセミ体のナプロキセンメチルエステルを培
養液に添加した。その培地は、BHI培地中で24時間前培
養した培養液がイノキュレートされた。結果をTable 3
に示す。 実施例４ バチルスThai I−８、バチルスIn IV−８及びバチル
ス・リチュニホルミス（ATCC11945）を用いた、Ｓ−ナ
プロキセン・エチルエステルのＳ−ナプロキセンへの転
換。 実施例１で述べたようにすべてのテストは100mlバッ
フルフラスコ中25mlの培地をつかって行った。すべての
培地は、BHI培地で24時間前培養した培養液がイノキュ
レートされた。加水分解したＳ−ナプロキセンエチルエ
ステルの量はTable 4に示した。 Table 4 栄養添加スキムミルク培地（PS III及びラクテート添
加）中24時間加水分解をうけたＳ−ナプロキセンエチル
エステルの量 実施例５ ファーメンタ中で生育したバチルスThai I−８による
ラセミ体ナプロキセンエチルエステルのＳ−ナプロキセ
ンへの転換。 バチルスThai I−８をBHI培地中24時間前培養した。
その後、50mlの培養物を、10％スキムミルク培地又は、
PS III塩及び5g/のラクテートを補った10％スキムミ
ルクを含む１エッヒウェィラー・ファーメンター（Es
chweiler Fermenter）にイノキュレートした。 次の培養条件が使われた： 容 積 :5培地 温 度 :30℃ 撹拌速度:500rpm 空気流量:50/h 消泡剤：プルロニックL81の自動添加でコントロール pH ：制御せず（pH値は６〜９の間に保たれた） 微生物は70時間生育させ、その間、いくつかの試料が
取り出され、ナプロキセンのエチルエステルに対する活
性の検定をした。その検定は、25mlの試料に、大豆油に
溶かした20mgのラセミ体ナプロキセンエチルエステルを
添加し、バッフルフラスコ中30℃、１時間インキュベー
トすることにより行った。このインキュベーション後、
その試料を抽出、誘導体化そして、HPLCで分析した。 24時間後、微生物の乾燥重量と、容量活性は一定に保
たれた。培養液のpH値は、培養の間、スキムミルクが用
いられたときは6.0から7.8に、栄養添加したスキムミル
クを用いたときは6.0から8.4に増加した。 その結果をTable 5に示す。 Table 5 スキムミルク及び栄養添加スキムミルクを用いたとき
の、バチルスThai I−８の培養結果実施例６ ファーメンターで生育させたバチルスIn IV−８によ
る、ラセミ体ナプロキセン・エチルエステルのＳ−ナプ
ロキセンへの転換 実施例５で述べたのと同じ操作を、バチルスIn IV−
８について行った。70時間のインキュベーションの間、
いくつかの試料を取り、その時間内に、容量活性同様乾
燥重量が実質的に一定になるまで、先に述べた検定を行
った。その間、pH値は、スキムミルクの場合64から7.9
に、栄養添加スキムミルクの場合、6.2から8.4に変化し
た。 結果をTable 6にまとめた。 Table 6 スキムミルク及び栄養添加スキムミルクを用いた、バチ
ルスIn IV−８の培養結果 実施例７ 種々の微生物を用いた、Ｒ、Ｓ−イブプロフェンのエチ
ルエステルのＳ−イブプロフェンへの転換 実施例１及び２で述べたように、すべてのテストは、
100〜500mlのバッフルフラスコ中、25〜100mlの培地で
行った。その培地は栄養混合培地（例えばBHI）で24時
間前培養した培養液をイノキュレートし、48時間培養し
た。その後、培地体積に応じて、20〜80μのラセミ体
イブプロフェンのエチルエステルをその培養液に添加
し、24時間インキュベートした。 その培養液を、H3PO4でpH2.5に酸性化し、少量の硫酸
アンモニウムを添加後、CH2Cl2で抽出した。抽出物中に
存在するイブプロフェンをナフタレン−メチルアミド誘
導体に誘導し、その立体異性的純度を測定した。 3mlの抽出物に、２−ブロモ−１−メチルピリジン・
ヨーダイドのジメチルホルムアミド溶液（50mg/ml）200
μと、１−ナフタレン−メチルアミンのCH2Cl2溶液
（100mg/ml）100μを加え、22℃で５分間反応させ
た。この反応溶液を窒素気流中60℃で乾燥させた。残渣
を3mlのイソオクタン/CH2Cl2（2:1、v/v）にとかし、2m
lの1N H2SO4を添加後抽出した。 有機層をキラルDNBPGカラムでイソオクチル／イソプ
ロピルアルコール／メタノール（92/2/1v/v）を用い
て、また不純物が分析を妨害するときには、イソオクタ
ン／イソプロピルアルコール／メタノール（98/1/1、v/
v）を用いてHPLC分析した。 結果をTable 7に示す。 表示されている値は、２回の実験の平均値である。＊
で示されている微生物を用いた値は単一の実験の結果で
ある。この場合には、50μのテトラデカンに10μの
イブプロフェンを培養液に添加した。 実施例８ 種々の微生物を用いた、Ｓ−イブプロフェンメチルエス
テルのＳ−イブプロフェンへの転換 すべてにテストは、実施例７と同様に行った。ラセミ
体のイブプロフェンエチルエステルの代りに、ラセミ体
のイブプロフェンメチルエステルを培養液に加えた。結
果をTable 8に示した。 表示されている値は、２回の実験の平均値である。＊
で示した微生物を用いたときは、単一の実験から得られ
た値である。この場合には、50μのテトラデカンに溶
かした10μのイブプロフェンを培養液に添加した。 実施例９ 枯草菌Thai I−８（CBS 679.85）中に存在するナプロ
キセンメチルエステラーゼの特性化 バチルスThai I−８を10％のスキムミルクを含むエスヒ
ワイラー・ファーメンター（Eschweiler fermenter）で
生育させた（実施例５参照） 28時間の増殖後、細胞を遠心で集菌した。その細胞を
0.1Mトリス−塩酸（pH8.0）に溶解し、リゾチーム（0.5
mg/mlリゾチーム、4mg/ml EDTA）で室温18時間処理し、
ついでDNase（0.01mg/ml DNase、3.5mg/ml MgCl2）で同
温度で１時間処理した。 遠心後、上清のタンパク画分を70％硫酸アンモニウム
飽和により沈殿させた。遠心後、そのペレットを0.01M
MOPS（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）バ
ッファ（pH7.5）で溶解し、保存剤として0.02％アジ化
ナトリウムを含む同バッファーで18時間透析した。 最終溶液を精製用HPLC−SEC（サイス−エクスクルー
ジョン・クロマトグラフィー）カラム（TSK2000SW、600
×21.5mm）で、0.1M酢酸ナトリウム（pH5.5）を6ml/min
の流速で溶出することにより分析した。10分後から、2m
lづつのフラクションを集め、リパーゼ及びＳ−ナプロ
キセンメチルエステラーゼ活性の検定を行った。 リパーゼ活性は、気質として、pH8.0の0.1MMOPS中で2
0mg/mlのＳ−ナプロキセンメチルエステルを用いて検定
した。18時間のインキュベーションの後、生成したＳ−
ナプロキセンの量を実施例２で述べたようにHPLCにより
測定した。 図１は、バチルスThai I−８細胞破壊物のHPLC−SEC
溶出パターンを示している。Ｓ−ナプロキセン・メチル
・エステラーゼ（フラクション37）は、この微生物中に
存在するリパーゼ活性（フラクション31）と明らかに分
離している。 Table 9では、細胞破壊物、HPLC−SECのフラクション
31及びフラクション38の立体異性選択性の比較がしてあ
る。Ｒ及びＳ−ナプロキセンメチルエステルのエステラ
ーゼ活性は前述の方法でテストした。 Ｓ−ナプロキセンエステラーゼ活性を含むタンパク画
分の見かけの分子量は、標準物質として、27000までの
既知の分子量のタンパク質混合物を用いて見積もった。 検定条件下での、Ｓ−ナプロキセンメチルエステルの
加水分解反応のpH依存性が図２に示してある。用いたバ
ッファーは0.1Mリン酸（pH領域5.5〜7.5）、0.1Mトリス
−塩酸（pH領域7.5〜9.0）、0.1Mグリシン（pH領域9.0
〜10.0）である。 エステラーゼ反応の温度依存性は図３に示してある。
45℃以上の温度では、エステラーゼ反応はほとんどみら
れなかった。37℃での加水分解は大ざっぱにいって25℃
での反応の２倍である。 実施例10 Ｒ−Ｓナプロキセンエステルの立体選択的転換を任う遺
伝子の分子クローニング 枯草菌（Bacillus subtilis）Thai I−８（CBS679.8
5）の染色体DNAフラグメントを含むプラスミド、pNAPT
−２を以下のように調製した。 T.マニアチス（Maniatis）等が1982年コールド・スプ
リングハーバー、ラボラトリーから出版した分子クロー
ニングのハンドブックに述べられているように、一般的
なクローニング技術を用いた。全てのDNA修飾酵素は市
販されているもので、製造業者の指示に従って用いた。
DNAの分離及び精製のための物質及び器具は、業者の指
示に従って用いた。 ポジティブ・セレクション・ベクターpUN121（ニルソ
ン（Nilsson）等、1983年、核酸研究（Nucleic Acids R
esearch）11巻、8019頁）を用いた。このプラスミド
は、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺
伝子及びC1−リプレッサー遺伝子を持っている。このテ
トラサイクリン遺伝子の転写は、C1−リプレッサー遺伝
子の遺伝子産物によって阻害される。C1−リプレッサー
遺伝子のBc1 1部位への外来DNAの挿入は、テトラサイク
リン遺伝子の活性化をうながす。これは、アンピシリン
／テトラサイクリン寒天プレート上での組換えのポジテ
ィブ・セレクションを可能にする。 Sau3Aで部分分解した枯草菌Thai1−8 DNAを、Bc1 1で
消化したpUN121DNAと混合した。ポリヌクレオチドリガ
ーゼの使用による再環状化の後、そのDNA混合物を、前
述の（T.マニアチス（Maniatis）等、1982年）CaCl2の
トランスフォーメション操作によって大腸菌DH1（ATCC3
3849）に導入した。 アンピシリン及びテトラサイクリンに耐性な1000個の
大腸菌コロニーを得た。すべてのトランスフォーマント
を保存し、J.P.ジャーゲン（Gergen）等の方法に従っ
て、レプリカプレートを作った。複製コロニーは、以前
に述べられた手順に基づく、軟寒天重層技術によって、
エステラーゼ活性の検出を行った（T.B.ハイガード（Hi
gerd）とJ.スピジゼン（Spizizen）、1973年、ジャーナ
ル．オブ．バクテリオロジー（J.Bacteriol.）114巻、1
184頁） 基本的には、0.5％の低融点アガロース、0.5Mリン酸
カリウム（pH7.5）、0.5mg/のベーターナフチル・ア
セテート及び0.5mg/mlのファースト・ブルーをトランス
フォーマーの上に散布する。数分後、エステラーゼ又は
リパーゼ活性をもつコロニーは紫色を呈す。そのコロニ
ーを２×TY培地（16g/バクトトリプトン、10g/イー
スト・エクストラクト、5g/塩化ナトリウム）中で１
晩増殖させ、つづいてＳ−ナプロキシエステルをＳ−ナ
プロキセンに転換する（実施例１の方法）能力を検定す
る。１つの大腸菌トランスフォーマントは、Ｓ−ナプロ
キセンエステルを転換することができた。pNAPT−２と
呼ばれる、このトランスフォーマントから単離したプラ
スミドを図４に示した。その大きさは9.4kbである。 ２×TY培地で１晩増殖した大腸菌/pNAPT−２及び大腸
菌/pNAPT−７の活性をTable 10に示した。プラスミドpU
N121のみをもつ大腸菌は、Ｓ又はＲ−ナプロキセンエス
テルを加水分解することができない。これは、Ｓ−ナプ
ロキセンの加水分解に必要な全ての情報は、5kbの枯草
菌Thai 1−8DNA挿入物中に存在することを示している。 pNAPT−２を持つ大腸菌DH1の試料はCBS受理番号671.8
6号に保管されている。 実施例11 枯草菌中に多数の遺伝子コピーを導入することによるエ
ステラーゼ活性の改良 エステラーゼをコードするプラスミドpNAPT−２は、5
kbの枯草菌Thai I−８（CBS 679.85）のDNA挿入物を持
っている。これは、約30kbのタンパク質をコードする遺
伝子に対して予期されるに十分小さい大きさであるの
で、その挿入物は、エステラーゼ活性を失うことなしに
短かくなっているということが考えられる。この可能性
を試すために、pNAPT−２のHind III制限酵素断片をpPN
eo/oriに連結した。これは以下のように行った。pPNeo/
oriは、pUB110（T.C.グリクザン（Gryczan）等、1978
年、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacterio
l.）134巻、318頁）の2.5kbのEcoR I−SnaB1制限断片
に、pUC19（C.ヤニッシュ−ペロン（C.Yanisch−Perro
n）等、ジーン（Jene）、33巻、103頁、1985年）の2.7k
b EcoR I−Sma I制限断片を連結することにより構築し
た。生じたシャトル・プラスミドpPNeo/ori（5.2kb）は
pUC19とオリジンとpLB110オリジンの存在のために、大
腸菌中及びバチルス種中で複製する能力をもっている。
さらにpPNeo/oriは、アンピシリン耐性遺伝子と、ネオ
マイシン耐性遺伝子を持っている（C.ヤニッシュ−ペロ
ン（C.Yanisch−Perro）等、1985年、M.マツムラ（Mats
umura）等、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.B
acteriol.）160巻、413頁、1984年）。 サブクローニングのために、Hind IIIで消化したpNAP
T−２をHind IIIで消化したpPNeo/oriと混合し、連結し
た。その混合物を先に述べたように（マニアチス（Mani
atis）等、1982年）大腸菌JM101hsdsにトランスフォー
ムした。大腸菌JM101hadsは、ファーバゲン・コレクシ
ョン（Phabagen collection）から入手した（オラン
ド、ウトレクト（Utrecht）受理番号PC2493）。ベータ
・ナフチル・アセテートを加水分解することのできるコ
ロニーを実施例10で述べたように選択した。２ケの陽性
コロニーから、プラスミドDNAを単離し、いくつかの制
限酵素認識部位を決定することにより詳細に特徴づけ
た。これらのプラスミド、pNAPT−７及びpNAPT−８の遺
伝子地図を図５と図６に示した。Ｓ−ナプロキセンメチ
ルエステルに対する、大腸菌/pNAPT−７及び大腸菌/pNA
PT−８の活性を測定した（Table 11）。 両方のプラスミドは、挿入物として、方向は逆である
が、2.2kbのpNAPT−２のHind III−Hind IIIフラグメン
トを有していることがわかろう。また、エステラーゼの
遺伝子は。それらのThai I−8DNAの2.0kb領域に存在し
なければならないであろう。大腸菌JM101hsdsからの抽
出後、そのプラスミドpNAPT−７及びpNAPT−８を、枯草
菌１−85及び枯草菌1A−40のプロトプラストにトランス
フォームした（C.チャング（Chang）とS.N.コーエン（C
ohen）、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネテ
ィクス（J.Gene.Genet.）、168巻、111頁、1979年）、
枯草菌１−85（ユキ（Yuki）、S.ジャパニーズ・ジャー
ナル・オブ・ジェネティクス（Jpn.J.Genet.）42巻、25
1頁、1967年）と、枯草菌1A40（バルチス・ストック・
センターB.G.S.C.1A40）はすでに述べられてきている。 ネオマイシン耐性コロニーを、先に述べた方法に従っ
て（実施例12参照）２×TY培地で増殖後、Ｓ−ナプロキ
センメチルエステルを加水分解する能力をテストした。
Table 11にその活性を示した。多数の遺伝子コピーの導
入によって、約300倍の改良が成遂げられた。それ故、
この微生物及びこれらが誘導された物質の、Ｓ−ナプロ
キセンエステルを加水分解するための工程に用いるため
の適性が大巾に改良されたことになる。 遺伝子クローニングがある酵素の発現レベルを改善す
ることは知られてはいるが、エステラーゼの場合の、こ
の促進度には、驚くべきものがある。酵素に対する遺伝
子のクローニングの際には、不適正な折りたたみ、タン
パク質の変性及び細胞内沈殿といった問題に、非常にし
ばしば出くわす。（ハリス（Harris）、T.J.R.1983年、
遺伝子工学４アカデミックプレス）予想に反して、エス
テラーゼの遺伝子のクローニングの場合、これらの問題
は１つも生じなかったようである。実施例12 大腸菌JM101hsds/pNAPT−７のナプロキセンメチルエス
テラーゼの特性化 実施例11の大腸菌JM101hsds/pNAPT−７の１リットル
培養培地を用いた。その培地を遠心し、ペレットをpH8.
0の0.1Mトリス−塩酸バッファに懸濁、１％v/vオクタノ
ールの存在下、1mg/mlリゾチーム、4mg/ml EDTAと、30
℃で１時間、インキュベートした。そのDNAを15mM Mg2+
の存在下0.02mg/mlのDNaseで加水分解した（30分、22
℃）。 遠心後、上清のタンパク質画分を60％硫酸アンモニウ
ム飽和で沈殿させた。遠心後、そのペレットをpH7.5の1
0mM MOPSに溶解し、超遠心により10倍に濃縮した（アミ
コン（Amicon）YM10）。１ミリリットル中20mgのＳ−ナ
プロキセンメチルエステル、２％トウィーン、1mg/ml B
SA（仔牛血清アルブミン）の存在下、250℃、pH7.5の0.
1M MOPS中で検定した大腸菌pNAPT−７のＳ−ナプロキセ
ンエステルに関する比活性はタンパク質１ミリグラム当
り、1.6ユニットであることがわかった。明細書をとお
して、１ユニット（ｕ）とは、特定条件下で、分当り１
×10-6モルのＳ−ナプロキセンメチルエステルを加水分
解する酵素量である。トウィーンは、強い疎水性エステ
ルとBSAの溶解度を変え、特異的吸着による酵素の不活
性変を妨ぐ目的で加えた。タンパク質濃度は、BASを標
準物質としたブラッドフォード（Bradford）の方法に従
がい決定した。 大腸菌pNAPT保持体は超遠心後、実施例９で述べた、H
PLC−SECシステムで分析した。 15分後から、カラムからのフラクションを2mlづつ集
め、Ｓ−ナプロキセンエステラーゼ活性をテストした
（実施例９参照）。 図７は、HPLC−SECフラクションのOD−280nm吸光度と
エステラーゼ活性を示してある。Ｓ−ナプロキセンエス
テラーゼ活性は、吸光度溶出プロフィールのピークのと
ころに存在する。まったく同様に分析した、枯草菌Thai
I−８エステラーゼの溶出時間も同じであった（結果は
示していない）。 図８は、大腸菌pNAPT−７保持体と、HPLC−SECのフラ
クション26の、リームリ（Laemmli）の方法による12.6
％SDS−PAGEの結果を示してある。 レーン４は大腸菌JM101hsds/pUN121を含んでいる。PA
GE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって、大腸
菌pNAPT−７保持体中のもっとも顕著なタンパク質バン
ドは大腸菌にはみられないが、HPLC−SECのフラクショ
ン26に検出される唯一のタンパク質バンドである。 図９は、大腸菌pNAPT−７の等電点ゲル電気泳動（LKB
アムホリン（Ampholine PAG−プレート、PH3.5〜9.5）
の結果を示した。Ａでは、タンパク質をサーバ・ブルＲ
（Serva Blue R）で染色した。Ｂでは、同試料のエステ
ラーゼ活性を、実施例10に述べたβ−ナフチルアセテー
ト/FB（ファースト・ブルーRR塩）により視覚化した。
Ａ中の最も顕著なタンパク質バンドが、最も高いエステ
ラーゼ活性を任うことが示された。 実施例13 大腸菌JM101hsds/pNAPT−７によるイブプロフェンのエ
チルエステルのイブプロフェンへの転換 硫安沈殿と超遠心の後、大腸菌pNAPT細胞破壊物は、
Ｒ−及びＳ−イブプロフェン・エチルエステルの加水分
解に関するテストを行った。 酵素活性は、0.3mg/mlのＲ又はＳ−イブプロフェンエ
チルエステル、２％トウィーン及び1mg/ml BSAの存在下
pH7.5の0.1M MOPSバッファ中25℃で検定した。２時間
後、アセトニトリルを添加することにより反応を停止し
た。 反応混合物は、HPLC逆相カラム（クロムパックポリゴ
シル60D−10CN（chromack polygosil）、250×4.6m
m）、を使い、1.5ml/minの流速で、34％アセトニトリ
ル、0.05Mリン酸（pH3.0）を流すことにより分析した。
Ｒ、Ｓ−イブプロフェン及びＲ、Ｓ−イブプロフェンエ
チルエステルの溶出時間は5.98分及び11.08分であっ
た。結果をTable 12にまとめた。 Ｓ−イブプロフェンのエチルエステルの加水分解は同
条件下でテストしたＳ−ナプロキセンメチルエステルの
加水分解活性の60％であった。 実施例14 バチルス１−85/pNAPT−７のＳ−ナプロキセンエステラ
ーゼの特性化 バチルス１−85/pNAPT−７を２×TY培地で５リットル
エスヒバイラ・ファーメンターを用いて増殖させた。細
胞ペーストを遠心で単離した。そのペレットをpH8.0の
0.1Mトリス−塩酸に溶解し、実施例９に述べた方法で分
解した。 遠心後、上清を60％飽和硫酸アンモニウムにし、再び
遠心した。ペレットをpH7.5 0.02M MOPSに溶かし、アミ
コンYM10（Amicon YM10）フィルターで濾過した。この
細胞分解物を分析用HPLC−SECカラム（TSK 2000 SW、２
×（300×7.5mm））を用い、pH5.6の0.01M MES（２−
（−Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、0.1M NaClで
溶出した。流速は1ml/min。10分後から1mlづつフラクシ
ョンを集め、実施例12の方法に従がいＳ−ナプロキセン
メチルエステラーゼ活性をテストした。 図10は、そのフラクションのOD−280nmのプロフィー
ルとエステラーゼ活性を示してある。Ｓ−ナプロキセン
エステラーゼの溶出時間は、見かけの分子量27000に相
当する。種々のタンパク質試料の比活性をTable 13にま
とめた。エステラーゼ活性は実施例12に述べた方法で検
定した。 バチルスpNAPT−７保持体の立体異性選択性をTable 1
4に示した。その活性は、実施例12に従って検定した。 図８に、リームリ（Laemmli）の方法に従った、バチ
ルスpNAPT−７と、各々、リパーゼ活性と、Ｓ−ナプロ
キセンエステラーゼ活性を示すHPLC−SECのフラクショ
ン５及び７の12.6％SDS−PAGEの結果を示す。バチルス
保持体におけるタンパク質の主なバンドは、フラクショ
ン５中には存在せず（リパーゼ活性）、フラクション７
中に存在する唯一のバンドである。レーン８のタンパク
質バンドは、見かけの分子量31000に相当する。 図９には、バチルスpNAPT−７とフラクション７の等
電点ゲル電気泳動の結果が示されている。（技術的な詳
細は実施例12参照）。バチルスpNAPT−７保持体では、
等電点（IEP）4.5をもつリパーゼ活性がナフチルアセテ
ートの基質に関するもっとも卓越した活性である。HPLC
−SECのフラクション７においては、タンパク質の主バ
ンドはIEP5.4を有しており、パートＢ中に示したナフチ
ルアセテート加水分解活性と共存する。β−ナフチル・
ファースト・ブルー検定法は、エステラーゼよりも、リ
パーゼに対し、より感受性が高いことに注意しなければ
ならない。 HPLC−SECのOD280nmピーク（フラクション７）は、ナ
プロキセンエステラーゼ活性を含み、SDS−PAGEで１つ
の主タンパク質バンドからなるようである。等電点ゲル
電気泳動は、フラクション７の主タンパク質バンドがエ
ステラーゼ活性をもつことを示した。これは、大腸菌及
びバチルスの両方に存在する枯草菌Thai I−８のエステ
ラーゼ活性のクローニングがエステラーゼ産生を増加し
ていることを意味する。事実、大腸菌pNAPT−７及びバ
チルスpNAPT−７中のナプロキセンエステラーゼは、両
方の微生物の細胞分解物中、もっとも高い濃度をもつタ
ンパク質である。
【図面の簡単な説明】
図１はバチルスThai I−８細胞分解物のHPLC−SECの結
果を示す図である。 図２は実施例９の検定条件下におけるＳ−ナプロキセン
メチルエステルの加水分解のpH依存性を示す図である。 図３はエステラーゼ反応における温度の影響を示す図で
ある。 図４はpNAPT−２の制限地図であって、制限酵素認識部
位の数は9.4kbの大きさをもつプラスミドpNAPT−２にお
いて決定され、San3aで部分消化したThai I−8DNAとpUN
121との連結部位はBcl 1/San3aと表わされる。 図５及び図６は、各々、pNAPT−７とpNAPT−８の制限地
図を示す。 pNAPT−２の2.2kbのHind IIIフラグメントをpPNeo/ori
にクローン化した。生じたプラスミドpNAPT−７とpNAPT
−８を、いくつかの制限酵素をつかって詳細に解析し
た。双方のプラスミドとも7.3kbの大きさをもってい
る。pNAPT−８は2.2kbのHind IIIフラグメントをpNAPT
−７と逆方向の向きにもっていることがわかる。 図７はHPLC−SECフラクションのOD−280nm吸光度とエス
テラーゼ活性とを示す図である。 図８は大腸菌pNAPT−７保持体と、HPLC−SECのフラクシ
ョン26の、リムリー（Laemmli）の方法による12.6％SDS
−PAGEの図である。 図９は大腸菌pNAPT−７保持体の等電点ゲル電気泳動（L
KBアンホリン（Ampholine PAGプレート、pH3.5〜9.5）
の結果を示す図である。 図10はHPLC−SECフラクションのOD−280nmプロフィール
と、エステラーゼ活性を示す図である。
果を示す図である。 図２は実施例９の検定条件下におけるＳ−ナプロキセン
メチルエステルの加水分解のpH依存性を示す図である。 図３はエステラーゼ反応における温度の影響を示す図で
ある。 図４はpNAPT−２の制限地図であって、制限酵素認識部
位の数は9.4kbの大きさをもつプラスミドpNAPT−２にお
いて決定され、San3aで部分消化したThai I−8DNAとpUN
121との連結部位はBcl 1/San3aと表わされる。 図５及び図６は、各々、pNAPT−７とpNAPT−８の制限地
図を示す。 pNAPT−２の2.2kbのHind IIIフラグメントをpPNeo/ori
にクローン化した。生じたプラスミドpNAPT−７とpNAPT
−８を、いくつかの制限酵素をつかって詳細に解析し
た。双方のプラスミドとも7.3kbの大きさをもってい
る。pNAPT−８は2.2kbのHind IIIフラグメントをpNAPT
−７と逆方向の向きにもっていることがわかる。 図７はHPLC−SECフラクションのOD−280nm吸光度とエス
テラーゼ活性とを示す図である。 図８は大腸菌pNAPT−７保持体と、HPLC−SECのフラクシ
ョン26の、リムリー（Laemmli）の方法による12.6％SDS
−PAGEの図である。 図９は大腸菌pNAPT−７保持体の等電点ゲル電気泳動（L
KBアンホリン（Ampholine PAGプレート、pH3.5〜9.5）
の結果を示す図である。 図10はHPLC−SECフラクションのOD−280nmプロフィール
と、エステラーゼ活性を示す図である。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
(Ｃ１２Ｐ 41/00
Ｃ１２Ｒ 1:125）
(Ｃ１２Ｐ 41/00
Ｃ１２Ｒ 1:10）
(Ｃ１２Ｐ 41/00
Ｃ１２Ｒ 1:38）
(Ｃ１２Ｐ 41/00
Ｃ１２Ｒ 1:785）
(Ｃ１２Ｐ 41/00
Ｃ１２Ｒ 1:06）
(Ｃ１２Ｐ 41/00
Ｃ１２Ｒ 1:39）
(Ｃ１２Ｐ 41/00
Ｃ１２Ｒ 1:40）
(Ｃ１２Ｐ 41/00
Ｃ１２Ｒ 1:385）
(Ｃ１２Ｐ 41/00
Ｃ１２Ｒ 1:465）
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:125）
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
微生物の受託番号 ＣＢＳ ８０６．８５
微生物の受託番号 ＣＢＳ ８０７．８５
微生物の受託番号 ＣＢＳ ６７１．８６
微生物の受託番号 ＣＢＳ ７１２．８６
微生物の受託番号 ＣＢＳ ６７３．８６
微生物の受託番号 ＣＢＳ ６７５．８６
微生物の受託番号 ＣＢＳ ６７４．８６
微生物の受託番号 ＣＢＳ ６７２．８６
前置審査
(72)発明者 マウロ アッティリオ ベルトラ
オランダ国 2624 ペーイェー デルフ
ト ア ファン シェルトマプレイン
91
(72)発明者 アーサー フリードリッヒ マルクス
オランダ国 2614 ヘーエム デルフト
エフエル ナイティンゲールラーン
12
(72)発明者 ヘイン シモン コーヘル
オランダ国 2064 イックス エル ス
パールンダム ヘー フェルモーテンス
トラート 32
(72)発明者 ウィルヘルムス ヨハネス クワックス
オランダ国 2253 ヴェーベー フォー
ルショーテン ヤン ファン ハーレン
ラーン ８
(72)発明者 コーネリス ヤコブス ファン デル
ラーケン
オランダ国 2315 テーハー レイデン
ヘームスケルクストラート 103
(72)発明者 ガーレス トーマス フィリップス
英国 ケント シッティングボーン ザ
フィンチェス ５
(72)発明者 ブライアン ウィリアム ロバートソン
英国 ケント ＭＥ９ ８ＡＧ シッテ
ィングボーン バップチャイルド ロー
ズ クローズ 16
(72)発明者 ピーター ダグラス ワッツ
英国 ケント シッティングボーン ウ
ーレット ロード ９
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．式（Ｉ）： （ただし、R1は、置換フェニル又は置換ナフチル基であ
る）で示される立体特異的形態の薬学的に活性な化合物
（Ｉ）、もしくは薬学的に許容し得るその塩、もしくは
そのエステルの製造方法であって、該製造方法が、 式（II）： （ただし、R2は、エステル残基、好ましくは任意に置換
されうるアルキル基である。） で示されるＲ−配置及びＳ−配置の化合物（II）を、バ
チルス属、シュードモナス属、アースロバクタ属、ムコ
ール属又はストレプマイセス属に属する微生物又は死ん
だもしくは生きているその抽出物であって、前記化合物
（II）を立体選択的に加水分解して少なくとも80重量％
のＳ−配置を有する前記化合物（Ｉ）に変えるエステラ
ーゼ能力を有するものの作用に付し、必要により前記化
合物（Ｉ）を薬学的に許容し得る塩又はエステルに変え
ることを特徴とする製造方法。 ２．R2が１から８ケの炭素原子からなる線状アルキル基
である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３．R2がエチル基である特許請求の範囲第１項又は第２
項記載の方法。 ４．R2がメチル基である特許請求の範囲第１項又は第２
項記載の方法。 ５．前記化合物（Ｉ）がナプロキセン、イブプロフェ
ン、スプロフェン、カープロフェン、ケトプロフェン、
ベノキサプロフェン、フェノプロフェン、パープロフェ
ン、フラービプロフェン、インドプロフェン、プラノプ
ロフェン又はプロチジン酸である特許請求の範囲第１項
〜第４項のいずれかに記載の方法。 ６．前記化合物（Ｉ）がナプロキセンである特許請求の
範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の方法。 ７．前記化合物（Ｉ）がイブプロフェンである特許請求
の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の方法。 ８．前記微生物が、前記化合物（II）を少なくとも90重
量％のＳ−配置の前記化合物（Ｉ）に転換できる特許請
求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の方法。 ９．前記微生物を生菌又は死菌の状態で固定化する特許
請求の範囲第１項〜第８項のいずれかに記載の方法。 １０．前記微生物が、枯草菌又はバチルス・リチェニホ
ルミスである特許請求の範囲第１項〜第９項のいずれか
に記載の方法。 １１．前記微生物がムコール・アングリマクロスポラス
である特許請求の範囲第１項〜第10項のいずれかに記載
の方法。 １２．前記微生物がシュードモナス・フルオレセンス、
シュードモナス・アエルギノサ、シュードモナス・プチ
ダ、シュードモナス・オバリス又はシュードモナス・リ
ボフラビナである特許請求の範囲第１項〜第９項に記載
の方法。 １３．前記微生物がストレプトマイセス・フラボビレン
スである特許請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに記
載の方法。 １４．前記微生物が、IS III−25株（CBS666.86）、LK
3−４株（CBS667.86）、SP4株（CBS668.86）、THAI II
I−18−１株（CBS669.86）、又はTHAI VI−12株（CBS6
70.86）である特許請求の範囲第１項〜第９項のいずれ
かに記載の方法。 １５．前記微生物がアースロバクタ・パラフィネウスで
ある特許請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに記載の
方法。 １６．前記微生物がエステラーゼをコードするDNAフラ
グメントで形質転換した微生物である特許請求の範囲第
１項〜第９項のいずれかに記載の方法。 １７．前記DNAフラグメントがいずれかのバチルス種由
来のものである特許請求の範囲第16項記載の方法。 １８．前記DNAフラグメントが枯草菌由来のものである
特許請求の範囲第17項記載の方法。 １９．前記DNAフラグメントがプラスミド中に挿入され
ている特許請求の範囲第16項記載の方法。 ２０．前記プラスミドがpNAPT−７又はpNAPT−８である
特許請求の範囲第19項記載の方法。 ２１．前記微生物が大腸菌であり、好ましくは、大腸菌
JM101hsds又は大腸菌DH1である特許請求の範囲第16項又
は第17項に記載の方法。 ２２．前記微生物が、枯草菌であり、好ましくは枯草菌
１−85又は枯草菌1A40である特許請求の範囲第16項又は
第17項に記載の方法。 ２３．式（Ｉ）： （ただし、R1は、置換フェニル又は置換ナフチル基であ
る）で示される立体特異的形態の薬学的に活性でかつ少
なくとも80％がＲ−配置である化合物（Ｉ）、もしくは
薬学的に許容し得るその塩、もしくはそのエステルを製
造する方法であって、 （１） 式（II）： （ただし、R2は、エステル残基、好ましくは任意に置換
されうるアルキル基である。） で示されるＲ−配置及びＳ−配置の化合物（II）を、バ
チルス属、シュードモナス属、アースロバクタ属、ムコ
ール属又はストレプマイセス属に属する微生物又は死ん
だもしくは生きているその抽出物であって、前記化合物
（II）を立体選択的に加水分解して少なくとも80重量％
のＳ−配置を有する前記化合物（Ｉ）に変えるエステラ
ーゼ能力を有するものの作用に付し、必要により前記化
合物（Ｉ）を薬学的に許容し得る塩又はエステルに変え
る工程、 次いで、 （２） 前記化合物（Ｉ）を分離し、残存部分を加水分
解する工程、 を特徴とする方法。 ２４．R2が１から８ヶの炭素原子からなる線状アルキル
基である特許請求の範囲第23項記載の方法。 ２５．R2がエチル基である特許請求の範囲第23項又は第
24項記載の方法。 ２６．R2がメチル基である特許請求の範囲第23項又は第
24項記載の方法。 ２７．前記化合物（Ｉ）がナプロキセン、イブプロフェ
ン、スプロフェン、カープロフェン、ケトプロフェン、
ベノキサプロフェン、フェノプロフェン、パープロフェ
ン、フラービプロフェン、インドプロフェン、プラノプ
ロフェン又はプロチジン酸である特許請求の範囲第23項
〜第26項のいずれかに記載の方法。 ２８．前記化合物（Ｉ）がナプロキセンである特許請求
の範囲第23項〜第26項のいずれかに記載の方法。 ２９．前記化合物（Ｉ）がイブプロフェンである特許請
求の範囲第23項〜第26項のいずれかに記載の方法。 ３０．前記微生物が、前記化合物（II）を少なくとも90
重量％のＳ−配置の前記化合物（Ｉ）に転換できる特許
請求の範囲第23項〜第26項のいずれかに記載の方法。 ３１．前記微生物を生菌又は死菌の状態で固定化する特
許請求の範囲第23項〜第30項のいずれかに記載の方法。 ３２．前記微生物が、枯草菌又はバチルス・リチェニホ
ルミスである特許請求の範囲第23項〜第31項のいずれか
に記載の方法。 ３３．前記微生物がムコール・アングリマクロスポラス
である特許請求の範囲第23項〜第32項のいずれかに記載
の方法。 ３４．前記微生物がシュードモナス・フルオレセンス、
シュードモナス・アエルギノサ、シュードモナス・プチ
ダ、シュードモナス・オバリス又はシュードモナス・リ
ボフラビナである特許請求の範囲第23項〜第32項に記載
の方法。 ３５．前記微生物がストレプトマイセス・フラボビレン
スである特許請求の範囲第23項〜第32項のいずれかに記
載の方法。 ３６．前記微生物が、IS III−25株（CBS666.86）LK3
−４株（CBS667.86）、SP4株（CBS668.86）、THAI III
−18−１株（CBS669.86）又はTHAI VI−12株（CBS670.
86）である特許請求の範囲第23項〜第32項のいずれかに
記載の方法。 ３７．前記微生物がアースロバクター・パラフィネウス
である特許請求の範囲第23項〜第32項のいずれかに記載
の方法。 ３８．前記微生物がエステラーゼをコードするDNAフラ
グメントで形質転換した微生物である特許請求の範囲第
23項〜第32項のいずれかに記載の方法。 ３９．前記DNAフラグメントがいずれかのバチルス種由
来のものである特許請求の範囲第38項記載の方法。 ４０．前記DNAフラグメントが枯草菌由来のものである
特許請求の範囲第39項記載の方法。 ４１．前記DNAフラグメントがプラスミド中に挿入され
ている特許請求の範囲第38項記載の方法。 ４２．前記プラスミドがpNAPT−７又はpNAPT−８である
特許請求の範囲第41項記載の方法。 ４３．前記微生物が大腸菌であり、好ましくは、大腸菌
JM101hsds又は大腸菌DH1である特許請求の範囲第32項又
は第39項に記載の方法。 ４４．前記微生物が、枯草菌であり、好ましくは枯草菌
１−85又は枯草菌1A40である特許請求の範囲第32項又は
第39項に記載の方法。
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|---|---|
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| JP7312840A Expired - Fee Related JP2729044B2 (ja) | 1986-01-07 | 1995-11-30 | 立体選択的に加水分解する微生物エステラーゼ及びその利用 |
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|---|---|---|---|
| JP7312840A Expired - Fee Related JP2729044B2 (ja) | 1986-01-07 | 1995-11-30 | 立体選択的に加水分解する微生物エステラーゼ及びその利用 |
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