DE3780184T2 - Mikrobielle esterase und verfahren zur herstellung von 2-arylpropionsaeuren. - Google Patents

Mikrobielle esterase und verfahren zur herstellung von 2-arylpropionsaeuren.

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DE3780184T2 DE8787200008T DE3780184T DE3780184T2 DE 3780184 T2 DE3780184 T2 DE 3780184T2 DE 8787200008 T DE8787200008 T DE 8787200008T DE 3780184 T DE3780184 T DE 3780184T DE 3780184 T2 DE3780184 T2 DE 3780184T2
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Wilhelmus Johannes Quax
Brian William Robertson
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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutisch aktiven Verbindung der Formel:
  • oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes oder Esters davon, wie eines Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalzes oder eines Pivaloylesters, in einer stereospezifischen Form, worin R&sub1; eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe, wie eine Phenyl- oder Naphthylgruppe, die gegebenenfalls in ein heterocyclisches Ringsystem eingebaut ist, das gegebenenfalls substituiert ist, darstellt oder ein heteroaromatisches Ringsystem darstellt, das zusätzlich zu Kohlenstoffatomen ein oder mehr Atome, die aus Stickstoff, Schwefel und Sauerstoff gewählt sind, enthält, wobei dieses Ringsystem gegebenenfalls substituiert ist.
  • Es ist bekannt, dass viele biologisch aktive Verbindungen als Gemisch von Stereoisomeren existieren. Bis jetzt werden diese Gemische häufig als solche für landwirtschaftliche und pharmazeutische Anwendungen verwendet. Gewöhnlich wohnt die biologische Aktivität einem der Stereoisomeren inne, so dass im Falle eines Gemisches aus zwei Stereoisomeren die Wirksamkeit des Gemisches auf die Hälfte herabgesetzt wird. Dennoch ist es ein Hauptgrund für die Verwendung von Gemischen von Stereoisomeren, dass die Kosten der Trennung der Stereoisomeren den potentiellen Vorteil einer möglichen Zunahme der Aktivität übersteigen. Jedoch ist es offensichtlich, dass sich moderne Pharmakologen zunehmend anderer Begleiterscheinungen der Verabreichung von Gemischen bewusst werden, in denen ein oder mehr Stereoiosmere als Verunreinigung angesehen werden müssen, die nicht die gewünschte therapeutische Wirkung haben kann, aber sogar andere unerwünschte physiologische Wirkungen, einschliesslich Toxizität, haben kann.
  • Insbesondere wurde entdeckt, dass die entzündungshemmende in vitro-Aktivität von Naproxen sowie Ibuprofen dem S-Enantiomeren (optisch aktives Stereoisomer) innewohnt, das bis zu 150-mal so aktiv ist wie sein Antipode, wie z.B. aus S. Adams et al, J.Pharm. Pharmac. 28 (976) 256 und A.J. Hutt und J. Caldwell, Clinical Pharmacokinetics 9 (1984) 371, bekannt ist.
  • S. Iriuchijima und A. Keiyu [Agric. Biol. Chem. 45 (1981) 1389] zeigten, dass ausgewählte Mikroorganismen die Methylester von Naproxen und Ketoprofen zu hydrolysieren vermögen, aber mit niedrigen Umsätzen. Aspergillus sojae hydrolysierte bevorzugt den Methylester von R-Naproxen unter Bildung von Naproxen, von dem 95 Gew.-% die R-Konfiguration haben, während Mycobacterium smegmatis bevorzugt den Methylester von S-Ketoprofen hydrolysierte unter Bildung von Ketoprofen, von dem nur 69 Gew.-% die S-Konfiguration haben.
  • In der deutschen Patentanmeldung DE 33 45 660 wird die Erzeugung von S-Naproxen aus racemischen Naproxenestern beschrieben. In dieser Patentanmeldung wird jedoch das S-Naproxen nicht direkt aus dem racemischen Gemisch von Naproxenestern gebildet, sondern wird durch Verseifung oder durch enzymatische Hydrolyse des S-Naproxenesters gebildet, der in dem Reaktionsgemisch zurückbleibt, nachdem der Ester von R-Naproxen enzymatisch hydrolysiert worden ist und das gebildete R-Naproxen von dem Ester von S-Naproxen abgetrennt worden ist.
  • In einer kürzlich erschienenen Publikation [Qu-Ming et al., Tetrahedron Letters, Band 27, Nr. 16 (1986) Seiten 17-63] ist ein Enzympräparat aus Candida cylindracea beschrieben worden, das S-Naproxenester stereoselektiv umzuwandeln vermag. Die Autoren zeigen, dass die Candida-Lipase, die in ihrem Präparat vorhanden ist, für die Naproxenesterhydrolyse verantwortlich ist. Jedoch ist die spezifische Aktivität ihres gereinigten Lipasepräparats extrem gering (3 x 10&supmin;&sup8; Mol/min pro mg Lipase unter den angegebenen Bedingungen).
  • Daher besteht noch ein grosser Bedarf für ein Verfahren in industriellem Massstab, das wirtschaftlich reizvolle Ausbeuten für die direkte Herstellung von S-Stereoisomeren liefert, und die Aufgabe der Erfindung ist es, ein solches Verfahren zur Verfügung zu stellen. Als Ergebnis umfangreicher Forschungen und Experimente wurde nun überraschenderweise eine verbesserte selektive Synthese für die Herstellung insbesondere des S-Stereoisomeren von Verbindung (I) gefunden, die dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Verbindung der Formel:
  • worin R&sub1; wie vorstehend definiert ist und R&sub2; ein Esterrest und vorzugsweise eine gegebenenfalls substituierte Alkylgruppe ist, der Einwirkung eines Mikroorganismus oder von daraus stammenden Substanzen unterwirft, die die Fähigkeit zur stereoselektiven Hydrolyse von Verbindung (II) zu Verbindung (I) haben, von der mindestens 80 Gew.-% die S-Konfiguration haben, und gewünschtenfalls Verbindung (I) in ein pharmakologisch unbedenkliches Salz oder einen pharmakologisch unbedenklichen Ester davon überführt.
  • Spezifischer bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur überwiegenden Herstellung einer pharmazeutisch aktiven Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes oder Esters davon, vorzugsweise eines Alkalimetallsalzes oder eines Erdalkalimetallsalzes davon, in einer stereospezifischen S-Konfiguration, worin R&sub1; eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe, wie eine Phenyl- oder Naphthylgruppe, die gegebenenfalls in ein heterocyclisches Ringsystem eingebaut ist, das gegebenenfalls substituiert ist, darstellt oder ein heterocyclisches Ringsystem darstellt, das zusätzlich zu Kohlenstoffatomen ein oder mehr Atome, die aus Stickstoff, Schwefel und Sauerstoff gewählt sind, enthält, wobei dieses Ringsystem gegebenenfalls substituiert ist, und worin R&sub2; eine gegebenenfalls substituierte Alkylgruppe ist, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel (II) der Einwirkung eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur stereoselektiven Hydrolyse von Verbindung (II) zu Verbindung (I) unterwirft.
  • Vorzugsweise ist R&sub2; eine lineare Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, bevorzugter ist R&sub2; eine Methyl- oder Ethylgruppe.
  • Vorzugsweise ist die Verbindung (I) Naproxen oder Ibuprofen.
  • Bevorzugter wird nach dem erfindungsgemässen Verfahren Naproxen hergestellt, das vorwiegend in der S-Konfiguration vorliegt.
  • Gemäss der bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren ausgeführt, indem man einen geeigneten Mikroorganismus oder daraus stammende Substanzen in solcher Weise auswählt, dass Verbindung (I) gebildet wird, von der mindestens 90 Gew.-% in der S-Konfiguration vorliegen.
  • Eine andere Aufgabe der Erfindung ist es, eine mikrobielle Esterase zur Verfügung zu stellen, die mindestens 10-mal aktiver ist als die oben beschriebene Candida cylindracea-Lipase und vorzugsweise 100-mal aktiver.
  • Diese mikrobielle Esterase hat die Fähigkeit zur stereoselektiven Hydrolyse von Naproxenester zu Naproxen, von dem mindestens 95 Gew.-% die S-Konfiguration haben.
  • Die genannte Esterase hat
  • - eine spezifische Aktivität von mindestens 0,1 Einheiten pro mg Protein, wie nachstehend definiert;
  • - einen isoelektrischen Punkt von 5,4;
  • - ein scheinbares Molekulargewicht von 31 000;
  • - ein HPLC-SEC-Profil, das der auf einer präparativen HPLC-SEC-(Ausschlusschromatographie)-Säule analysierten Esteraseaktivität von Fig. 1 entspricht;
  • - ein pH-Optimum zwischen 6,5 und 10,0; und
  • - ein Temperaturoptimum zwischen 25 und 45ºC.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Verbindung (I), von der mindestens 80% in der R-Konfiguration vorliegen, umfassend ein erfindungsgemässes Verfahren, wonach Verbindung (I) abgetrennt und der zurückbleibende Teil hydrolysiert wird, zur Verfügung zu stellen.
  • Mikroorganismen, die die Fähigkeit zur stereoselektiven Ueberführung von Verbindung (II) in Verbindung (I) durch die Einführung von neuem genetischem Material erhalten haben, werden von dem Ausdruck "geeigneter Mikroorganismus" umfasst.
  • Dies kann erzielt werden, indem man das klonierte Gen, das für eine Substanz codiert, die für die stereoselektive Hydrolyse verantwortlich ist, ein Esteraseenzym, aus einem beliebigen der getesteten Mikroorganismen in einen anderen Mikroorganismus, insbesondere in Escherichia coli, transferiert. Andere Mikroorganismen können zu den Gattungen Saccharomyces, Kluyveromyces, Aspergillus, Escherichia, Pseudomonas und Streptomyces gehören. Klonierte Gene können auf ihre Fähigkeit selektioniert werden, für ein Enzym zu codieren, das einen Ester, vorzugsweise beta-Naphthylacetat und Naproxenester, zu hydrolysieren vermag. Alternativ können sie durch Kreuzhybridisierung mit einem bereits selektionierten Gen, das für eine Esterase codiert, selektioniert werden. Die letztere Annahme beruht auf der Beobachtung, dass verwandte Mikroorganismen Homologie in der DNA-Sequenz entsprechender Enzyme zeigen (Ihara et al., 1985, J. Biochem. 98, Seite 95), und aus unserer eigenen Beobachtung, dass das Plasmid pNAPT-7 (siehe Beispiel 11) Kreuzhybridisierung mit chromosomaler DNA, die aus anderen Bacillus-Spezies stammt, zeigt. Zusätzlich umfasst diese Erfindung ein Verfahren zur Einführung von mehrfachen und/oder modifizierten Genkopien, die für die Esterase codieren, in einen Mikroorganismus mit dem Vorteil der Erhöhung der Aktivität des Mikroorganismus oder der daraus stammenden Substanzen in dem Umwandlungsprozess von Verbindung (II) in Verbindung (I). Dieser Mikroorganismus kann z.B. Bacillus subtilis sein.
  • Die Mikroorganismen können vorteilhaft immobilisiert werden, z.B. mit einem Polymergel. Dies kann mit lebenden und/oder abgetöteten Zellen getan werden, aber alternativ kann das Esteraseenzym in einem gewissen Ausmass gereinigt werden, wenn eine höhere spezifische Aktivität erforderlich ist.
  • Daher werden mit dem Ausdruck "Mikroorganismen oder daraus stammende Substanzen" die Mikroorganismen, abgetötet oder lebendig, und Extrakte daraus, gegebenenfalls eingeengt oder gereinigt, gemeint.
  • Die mikrobielle Esterase kann erhalten werden aus Stamm is III-25 (eine Probe dieser Spezies ist beim CBS unter der Ordnungsnummer 666.86 hinterlegt), Stamm LK 3-4 (eine Probe dieser Spezies ist beim CBS unter der Ordnungsnummer 667.86 hinterlegt), Stamm Sp 4 (eine Probe dieser Spezies ist beim CBS unter der Ordnungsnummer 668.86 hinterlegt), Stamm Thai III 18-1 (eine Probe dieser Spezies ist beim CBS unter der Ordnungsnummer 669.86 hinterlegt), Stamm Thai VI 12 (eine Probe dieser Spezies ist beim CBS unter der Ordnungsnummer 670.86 hinterlegt), Bacillus Spezies Thai 1-8 (eine Probe dieser Spezies ist beim CBS unter der Ordnungsnummer 679.85 hinterlegt), Spezies Bacillus Spezies In IV-8 (eine Probe dieser Spezies ist beim CBS unter der Ordnungsnummer 680.85 hinterlegt), Spezies Bacillus Spezies Nap 10-M (eine Probe dieser Spezies ist beim CBS unter der Ordnungsnummer 805.85 hinterlegt), Spezies Bacillus Spezies Sp III-4 (eine Probe dieser Spezies ist beim CBS unter der Ordnungsnummer 806.85 hinterlegt), Bacillus subtilis 1-85/pNAPT-7 (eine Probe dieser Spezies ist beim CBS unter der Ordnungsnummer 673.86 hinterlegt), Bacillus subtilis 1A-40/pNAPT-8 (eine Probe dieser Spezies ist beim CBS unter der Ordnungsnummer 674.86 hinterlegt), Bacillus subtilis 1A-40/pNAPT-7 (eine Probe dieser Spezies ist beim CBS unter der Ordnungsnummer 675.86 hinterlegt), Pseudomonas Spezies Kor I-6 (eine Probe dieser Spezies ist beim CBS unter der Ordnungsnummer 807.85 hinterlegt), Escherichia coli DH 1/pNAPT-2 (eine Probe dieser Spezies ist beim CBS unter der Ordnungsnummer 671.86 hinterlegt), Escherichia coli JM 101 hsds pNAPT-7 (eine Probe dieser Spezies ist beim CBS unter der Ordnungsnummer 712.86 hinterlegt) und Escherichia coli JM 101 hsds pNAPT-8 (eine Probe dieser Spezies ist beim CBS unter der Ordnungsnummer 672.86 hinterlegt). Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens muss ein Mikroorganisznus mit der Fähigkeit zur Ueberführung von Verbindung (II) in Verbindung (I), von der mindestens 80 Gew.-% die S-Konfiguration haben, ca. 0,5 bis 10 Tage lang kultiviert werden. Danach werden die Zellen in einem flüssigen Nährmedium suspendiert, und Verbindung (II) wird der Einwirkung der Zellen unterworfen. Alternativ werden die Zellen abgetötet, z.B. in einem Lysemedium suspendiert, und Verbindung (II) wird der Einwirkung der aus den Zellen stammenden Substanzen unterworfen.
  • Nach der oben erwähnten Kultivierung während ca. 0,5 bis 10 Tagen können die Zellen aus dem Kulturmedium isoliert werden, bevor die Zellen in dem flüssigen Nährmedium suspendiert werden oder die Zellen in einem Lysemedium suspendiert werden.
  • Um die für die selektive Hydrolyse von Verbindung (II) verwendeten Mikroorganismen zu kultivieren, können übliche Kulturmedien verwendet werden, die eine assimilierbare Kohlenstoffquelle (z.B. Glucose, Lactat, Saccharose usw.), eine Stickstoffquelle (z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid usw.) mit einem Mittel für eine organische Nährstoffquelle (z.B. Hefeextrakt, Malzextrakt, Pepton, Fleischextrakt usw.) und eine anorganische Nährstoffquelle (z.B. Phosphat, Magnesium, Kalium, Zink, Eisen und andere Metalle in Spurenmengen) enthalten.
  • Als bevorzugtes Kulturmedium wird ein Jap-Medium, das gegebenenfalls mit einem oder mehr Bestandteilen angereichert ist, verwendet. Ein Jap-Medium der folgenden Zusammensetzung kann verwendet werden: Sojabohnenmehl (30 g/l), Natriumnitrat (7,5 g/l), Ferrosulfat.7H&sub2;O (0,28 g/l), Natriumcitrat (6 g/l) und Fructose (12,5 g/l) , wobei der pH- Wert auf 7,2 eingestellt ist. Vor der Verwendung wurde das Medium 20 Minuten lang bei 120ºC sterilisiert.
  • Ein anderes bevorzugtes Kulturmedium ist ein TSB-Medium 2X, das gegebenenfalls mit einem oder mehr Bestandteilen angereichert ist. Ein Medium, das aus 60 g/l Trypticase-Sojabrühe (0xoid ) besteht, kann verwendet werden. Vor der Verwendung wurde das Medium 20 Minuten lang bei 120ºC sterilisiert. Ein anderes bevorzugtes Medium ist 2xTY, das gegebenenfalls mit einem oder mehr Bestandteilen angereichert ist. Ein Medium, das aus Trypton (Difco ) 30 g/l, Hefeextrakt (Difco ) 20 g/l, NaCl 3 g/l, (NH&sub4;)&sub2;HPO&sub2; 1 g/l und (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 1 g/l bei pH 6,8 besteht, kann verwendet werden. Vor der Verwendung wurde das Medium 30 Minuten lang bei 110ºC sterilisiert. Als bevorzugteres Kulturmedium wird ein Magermilchmedium, das gegebenenfalls mit einem oder mehr Bestandteilen angereichert ist, verwendet. Ein Magermilchmedium der folgenden Zusammensetzung wurde verwendet: 10%ige Magermilch aus Magermilchpulver, die vor der Verwendung 30 Minuten lang bei 110ºC sterilisiert wurde.
  • Als Anreicherungen für das Magermilchmedium können z.B. 0,5% Lactat oder PSIII-Salze oder Kombinationen davon verwendet werden. PSIII-Salzmedium der folgenden Zusammensetzung wurde verwendet: Kaliumdihydrogenphosphat (2,1 g/l), Ammoniummonohydrogenphosphat (1,0 g/l), Ammoniumsulfat (0,9 g/l), Kaliumchlorid (0,2 g/l), Natriumcitrat (0,29 g/l), Calciumsulfat.2H&sub2;O (0,005 g/l), Magnesiumsulfat.7H&sub2;O (0,2 g/l), Ammoniumferrosulfat.6H&sub2;O (2,5 mg/l), Zinksulfat.7H&sub2;O (0,5 mg/l), Manganchlorid.4H&sub2;O (0,3 mg/l), Kupfersulfat.5H&sub2;O (0,15 mg/l), Cobaltchlorid.6H&sub2;O (0,15 mg/l), Orthoborsäure (0,05 mg/l), Natriummolybdat.2H&sub2;O (0,055 mg/l) und Kaliumiodid (0,1 mg/l), wobei der pH-Wert auf 6,8 eingestellt war. Vor der Verwendung wurde das PSIII-Salzmedium 20 Minuten lang bei 120ºC sterilisiert.
  • Eine Temperatur zwischen 0 und 45ºC und ein pH zwischen 3,5 und 9 wird während der Kultivierung der Mikroorganismen aufrechterhalten. Vorzugsweise werden die Mikroorganismen bei einer Temperatur zwischen 20 und 37ºC und bei einem pH zwischen 5 und 9 kultiviert.
  • Die während der Kultivierung der Mikroorganismen erforderlichen aeroben Bedingungen können gemäss beliebigen der gut eingeführten Verfahrensweisen zur Verfügung gestellt werden, vorausgesetzt, dass die Sauerstoffzufuhr genügt, um den Stoffwechselbedarf der Mikroorganismen zu decken. Dies wird am zweckmässigsten erzielt, indem man Sauerstoff, zweckmässig in Form von Luft, zuführt und gegebenenfalls die Reaktionsflüssigkeit gleichzeitig schüttelt oder rührt. Während der Ueberführung von Verbindung (II) in Verbindung (I) könnten die Mikroorganismen unter Verwendung eines oben erwähnten üblichen Kulturmediums in einem wachsenden Stadium sein oder könnten in einem beliebigen System (Medium oder Puffer), das den Abbau von Enzymen verhindert, konserviert sein.
  • Während der Ueberführung von Verbindung (II) in Verbindung (I) kann ein übliches Kulturmedium verwendet werden, das erforderlichenfalls eine assimilierbare Kohlenstoffquelle (z.B. Glucose, Lactat, Saccharose usw.), erforderlichenfalls eine Stickstoffquelle (z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid usw.), mit erforderlichenfalls einem Mittel für eine organische Nährstoffquelle (z.B. Hefeextrakt, Malzextrakt, Pepton, Fleischextrakt usw.) und erforderlichenfalls eine anorganische Nährstoffquelle (z.B. Phosphat, Magnesium, Kalium, Zink, Eisen und andere Metalle in Spurenmengen) enthält.
  • Vorzugsweise wird während der Ueberführung von Verbindung (II) in Verbindung (I) ein Jap-Medium (wie oben beschrieben), das gegebenenfalls mit einem oder mehr Bestandteilen angereichert ist, verwendet. Bevorzugter wird ein Magermilchmedium (wie oben beschrieben), das gegebenenfalls mit einem oder mehr Bestandteilen angereichert ist, verwendet.
  • Die Mikroorganismen können z.B. durch Ausschluss der assimilierbaren Kohlenstoffquelle oder durch Ausschluss der Stickstoffquelle in dem nicht wachsenden Stadium gehalten werden. Eine Temperatur zwischen 0 und 45ºC und ein pH zwischen 3,5 und 9 werden während dieses Stadiums aufrechterhalten.
  • Vorzugsweise werden die Mikroorganismen bei einer Temperatur zwischen 20 und 37ºC und einem pH zwischen 5 und 8 gehalten. Die während dieser Stufe erforderlichen aeroben Bedingungen können gemäss beliebigen der gut eingeführten Verfahrensweisen zur Verfügung gestellt werden, vorausgesetzt, dass die Sauerstoffzufuhr genügt, um den Stoffwechselbedarf der Mikroorganismen zu decken. Dies wird am zweckmässigsten erzielt, indem man Sauerstoff, zweckmässig in Form von Luft, zuführt und gegebenenfalls die Reaktionsflüssigkeit gleichzeitig schüttelt oder rührt. Die durch die Mikroorganismen oder die daraus stammenden Substanzen, wie oben erwähnt, erzeugte Verbindung (I) kann gemäss beliebigen der an sich bekannten Verfahrensweisen für solche Produkte gewonnen und gereinigt werden.
  • Die Mikroorganismen können auf Agarschrägkulturen gehalten, in 50%igem Glycerin gefroren oder gefriergetrocknet werden. Erforderlichenfalls können Vorkulturen dieser Mikroorganismen gemäss beliebigen der gut eingeführten Verfahrensweisen gemacht werden, z.B. können die Mikroorganismen in Bouillon oder in BHI bei 30ºC 24 Stunden in einem Rundschüttler inkubiert werden. Ein Bouillonmedium der folgenden Zusammensetzung kann verwendet werden: Lab Lemco L 29 (Fleischextrakt,Oxoid ) (9 g/l), Bactopepton (10 g/l) und Natriumchlorid (5 g/l), wobei der pH-Wert auf 7,6 eingestellt ist. Vor der Verwendung wurde dieses Medium 20 Minuten lang bei 120ºC sterilisiert.
  • Ein BHI-(Hirn-Herz-Infusions)-Medium, das 0,037 g/l BHI (Oxoid ) enthält, wobei der pH auf 7,0 eingestellt ist, kann verwendet werden. Vor der Verwendung wurde dieses Medium 20 Minuten lang bei 120ºC sterilisiert.
  • Das Enzym, das für die Hydrolyse von S-Naproxenmethylester verantwortlich ist, von Bacillus Thai I-8 ist charakterisiert worden. Es wurde gefunden, dass die Esteraseaktivität nicht zu der in dem Mikroorganismus vorhandenen Lipaseaktivität in Beziehung steht. In der Tat schien die geringe Hydrolyse des falschen Isomeren von Naproxen hauptsächlich auf die verunreinigende Lipaseaktivität des Bacillus-Stammes zurückzuführen sein. Die gereinigte. Naproxenesterase von Thai I-8 hat eine signifikant höhere enantiomere Selektivität als das gesamte Zellysat von Bacillus.
  • E. coli/pNAPT-7 und Bacillus/pNAPT-7, wobei beide Stämme ein Plasmid haben, das die Thai I-8-Esterase enthält, erzeugen eine signifikante Menge S-Naproxen-Esterase. Ueberraschenderweise ist das Protein, das die Esteraseaktivität besitzt, wie durch SDS-PAGE, HPLC-SEC und Isoelektrofokussierung bestätigt, das Protein mit bei weitem der höchsten Konzentration in dem Zellysat der Mikroorganismen.
  • Obgleich es bekannt ist, dass die Genklonierung die Menge eines Enzymproduktes erhöhen kann, ist der Grad der Verbesserung im Fall von Esterase sehr überraschend. Sehr oft treten Probleme, wie falsche Faltung, Proteinabbau und Ausfällung innerhalb der Zelle,auf, wenn das Gen für ein Enzym kloniert wird (Harris, T.J.R., 1983, Genetic Engineering 4, Academic Press). Unerwarteterweise scheint keines dieser Probleme aufzutreten, wenn Esterasegene kloniert werden.
  • In der ganzen Beschreibung ist die S-Spezifität definiert als:
  • S (gebildet)/R (gebildet) + S (gebildet)
  • Die vorliegende Erfindung wird weiter unter Bezugnahme auf die Beispiele beschrieben, ohne dass der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung auf diese Beispiele eingeschränkt wird.
    • Beispiel 1 Transformation von RS-Naproxenethylester in S-Naproxen unter Verwendung von Bacillus Thai I-8, Bacillus In IV-8, Bacillus Nap 10-M, Bacillus Sp III-4 und Pseudomonas Kor I-6
  • Bacillus Thai I-8, Bacillus In IV-8, Bacillus Nap 10-M, Bacillus Sp III-4 und Pseudomonas Kor I-6 wurden jeweils in 25 ml 10%iger Magermilch inkubiert, die in mit Einbauten versehenen 500 ml-Kolben gehalten wurde, und 48 Stunden lang bei 30ºC auf einem Rundschüttler inkubiert. Nach dieser Kultivierungsperiode wurden 100 mg des Ethylesters von Naproxen in 500 ml Sojabohnenöl gelöst, zur Sterilisierung eine Stunde lang auf 110ºC gehalten und zu jeder der Kulturen zugesetzt. In Abhängigkeit von den Mikroorganismen wurden 2 bis 5 Kulturen verwendet. Die Kulturen wurden weitere 24 Stunden lang bei 30ºC auf dem Rundschüttler inkubiert. Danach wurden die Kulturen mit Orthophosphorsäure zu einem pH-Wert von 2 bis 3 angesäuert, eine kleine Menge Ammoniumsulfat wurde zugesetzt, und 20 ml Chloroform oder Ethylacetat pro 25 ml Medium wurden zur Extraktion zugesetzt. Die Extrakte wurden durch TLC analysiert. Für die Analyse durch TLC wurden Kieselgelplatten (Kieselgel 60 mit Fluoreszenzindikator F&sub2;&sub5;&sub4;) mit Chloroform + 1% Essigsäure eluiert, um eine Trennung des Ethylesters von Naproxen und Naproxen zu bewirken. Die gefundenen Rf-Werte waren für den Ethylester von Naproxen 0,7 und Naproxen 0,2. Die organische Phase wurde danach eingedampft und das Naproxen wurde aus dem resultierenden Oel durch Eluieren mit Ether auf einer Kieselgelsäule gereinigt. Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle 1 wiedergegeben.
  • Die optischen Drehungen wurden in einem Perkin- Elmer-141-Polarimeter in Küvetten mit einer Weglänge von 1 oder 10 cm (Volumen 0,5 bis 5 ml), die auf Raumtemperatur gehalten wurden, gemessen. Die Drehungen wurden bei 589 nm (Natrium-D-Linie) registriert.
  • Die optische Drehung wurde gemessen, indem man die gebildeten Produkte (bis zu einem Maximum von 50 mg) in 5 ml Methanol löste. Handelsübliches S-Naproxen (Secifarma) hat eine [α]rtD von +60º. Tabelle 1 Mikrobielle Hydrolyse von Ethyl-2-(6-methoxy-2-naphthyl)- propionat zu 2-(6-Methoxy-3-napthyl)-propionsäure, Umsätze des Substrats und optische Aktivität des Produkts. Mikroorganismen Gesamter zugesetzter Ester (mg) Nach Inkubation gewonnener Ester (mg) Gebildetes Naproxen (mg) Bacillus Thai I-8 Bacillus In IV-8 Bacillus Sp III-4 Bacillus Nap 10-M Pseudomonas Kor I-6 * nicht bestimmt ** Nach Isolierung zurückbleibende Menge
    • Beispiel 2 Die enantiomere Verteilung von durch mikrobielle Hydrolyse gebildetem R- und S-Naproxen
  • Alle Tests wurden mit 25 ml eines Mediums in mit Einbauten versehenen 100 ml-Kolben ausgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Alle Medien wurden geimpft aus Kulturen, die 24 Stunden in einem BHI-Medium vorkultiviert worden waren.
  • Der Versuch wurde 1 und 24 Stunden lang ausgeführt unter Verwendung von annäherungsweise 20 mg des Ethylesters von racemischem Naproxen, gelöst in Sojabohnenöl.
  • Die Extrakte wurden durch HPLC analysiert. Der Ester und die Säure wurden auf einer Siliciumdioxidsäule (CP-Sper-Si, Chrompack) getrennt. Mobile Phase: Isooctan/Ethylacetat/Ameisensäure (875 ml/125 ml/3,5 ml). Strömung: 1,7 ml/Minute. Die gefundenen Retentionszeiten waren 3,8 Minuten für den Ethylester von Naproxen und 9,0 Minuten für Naproxen.
  • Das Naproxen wurde derivatisiert, um seine enantiomere Reinheit zu bestimmen. Zu Naphthalinmethylamiden derivatisierte Naproxenproben wurden auf einer chiralen DNBPG-Säule getrennt, die mit Isooctan/Chloroform/Methanol (900 ml/70 ml/30 ml) eluiert wurde. Strömung: 2 ml/Minute.
  • Die Retentionszeiten für das derivatisierte S-Naproxen und R-Naproxen waren 28,1 Minuten bzw. 30,7 Minuten.
    • Derivatisierungsverfahrensweise:
  • 2 ml Extrakt wurden unter einem N&sub2;-Strom getrocknet. Die getrocknete Probe wurde mit 200 ul Benzol + 10 ul Thionylchlorid 10 Minuten lang bei 60ºC umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde unter N&sub2; getrocknet. 200 ul Naphthalinmethylamin, 5%ig gelöst in getrocknetem Dichlormethan, wurde zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur eine Stunde lang weiter behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde wieder unter N&sub2; getrocknet und dann mit 2 ml Isooctan/Chloroform (Volumenverhältnis 2:1, und 2 ml HCl, ln) extrahiert. Die organische Phase wurde durch HPLC analysiert.
  • Die Resultate sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Die enantiomere Verteilung von R- und S-Naproxen, das durch mikrobielle Hydrolyse gebildet wird Mikroorganismus Inkubationszeit (h) Gebildetes S-Naproxen (mg/Kultur) Gebildetes R-Naproxen mg/Kultur) % S-Naproxen % R-Naproxen Bacillus Thai I-8 Bacillus In IV-8 Pseudomonas Kor I-6 Bacillus Nap 10-M Bacillus Sp III-4
    • Beispiel 3 Transformation des Methylesters von RS-Naproxen in S-Naproxen durch verschiedene Mikroorganismen
  • Alle Tests wurden mit 25 ml Medium in mit Einbauten versehenen 100 ml-Kolben ausgeführt, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben. Aber anstelle des Ethylesters von racemischem Naproxen wurde der Methylester von racemischem Naproxen zu den Kulturen zugesetzt. Die Medien wurden aus Kulturen geimpft, die 24 Stunden lang in einem BHI-Medium vorkultiviert worden waren.
  • Die Resultate werden in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 Mikroorganismus Gebildetes Naproxen (mg/Kultur) Bacillus Thai I-8 Bacillus In IV-8 Bacillus Nap 10-M Bacillus Sp III-4
    • Beispiel 4 Transformation des Ethylesters von S-Naproxen in S-Naproxen unter Verwendung von Bacillus Thai I-8 und Bacillus In IV-8
  • Alle Tests wurden mit 25 ml Medium in mit Einbauten versehenen 100 ml-Kolben ausgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Alle Medien wurden aus Kulturen geimpft, die 24 Stunden lang in einem BHI-Medium vorkultiviert worden waren.
  • Die Mengen des Esters von S-Naproxen, die hydrolysiert werden, werden in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4 Mengen an Ethylester von S-Naproxen, die in 24 Stunden in einem angereicherten Magermilchmedium (PSIII und Lactat wurden zugesetzt) hydrolysiert wurden Mikroorganismus Restlicher Ester nach 24 h (mg) * Gebildetes Naproxen (mg) Bacillus Thai I-8 Bacillus In IV-8 *ca. 30 mg Ester wurden zu jeder Kultur von 25 ml zugesetzt
    • Beispiel 5 Transformation des Ethylesters von racemischem Naproxen in S-Naproxen durch Bacillus Spezies Thai I-8, der in einem Fermenter kultiviert wurde.
  • Bacillus Spezies Thai I-8 wurde 24 Stunden lang in einem BHI-Medium vorkultiviert. Danach wurden 50 ml Kultur in einen 10 l-Eschweilerfermenter geimpft, der 10%iges Magermilchmedium oder 10%ige Magermilch, die mit PSIII-Salzen und 5 g/l Lactat angereichert war, enthielt.
  • Die folgenden Fermentationsbedingungen wurden angewandt:
  • Volumen: : 5 l Medium
  • Temperatur : 30ºC
  • Rührgeschwindigkeit : 500 UpM
  • Luftstrom : 50 l/h
  • Antischaummittel: bekämpft durch automatische Zugabe von Pluronic L 81
  • pH : Nicht reguliert (frei zwischen pH-Werten von 6 und 9 gehalten)
  • Die Mikroorganismen wurden 70 Stunden lang kultiviert, und während dieser Zeit wurden mehrere Proben entnommen und auf ihre Aktivität in bezug auf den Ethylester von Naproxen analysiert. Die Analyse wurde ausgeführt, indem man eine 25 ml-Probe bei 30ºC eine Stunde lang in einem mit Einbauten versehenen Kolben inkubierte, in den 20 mg des Ethylesters von racemischem Naproxen, gelöst in Sojabohnenöl, zugegeben wurden. Nach dieser Inkubationsperiode wurden die Proben extrahiert, derivatisiert und durch HPLC analysiert.
  • Nach 24 Stunden blieben das Trockengewicht der Mikroorganismen und die volumetrische Aktivität konstant. Der pH-Wert der Kultur nahm während dieses Zeitraums von 6,0 auf 7,8 zu, wenn Magermilch verwendet wurde, und von 6,8 auf 8,4, wenn angereicherte Magermilch verwendet wurde.
  • Die Resultate sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Tabelle 5 Resultate der Fermentation des Bacillus Spezies Thai I-8 unter Verwendung von Magermilch bzw. angereicherter Magermilch Kultur unter Verwendung von Magermilch Kultur unter Verwendung von mit PS III und Lactat angereicherter Magermilch Trockengewicht Volumetrische Aktivität Enantiomere Verteilung Naproxen gebildet/l/h
    • Beispiel 6 Transformation des Ethylesters von racemischem Naproxen in S-Naproxen durch Bacillus Spezies In IV-8, der in einem Fermenter kultiviert wurde.
  • Die gleiche Verfahrensweise, wie sie in Beispiel 5 beschrieben wurde, wurden mit Bacillus Spezies In IV-8 ausgeführt. Proben wurden während der 70-stündigen Inkubationsperiode entnommen und wie vorstehend beschrieben analysiert. Während dieses Zeitraums blieben das Trockengewicht wie die volumetrische Aktivität im wesentlichen konstant. Der pH-Wert änderte sich während dieser Zeit von 6,4 nach 7,9 in der Magermilchkultur und von 6,2 nach 8,4 in der angereicherten Magermilchkultur.
  • Die Resultate sind in Tabelle 6 zusammengefasst. Tabelle 6 Resultate der Fermentation des Bacillus Spezies In IV-8 unter Verwendung von Magermilch bzw. angereicherter Magermilch Kultur unter Verwendung von Magermilch Kultur unter Verwendung von mit PSIII und Lactat angereicherter Magermilch Trockengewicht Volumetrische Aktivität Enantiomere Verteilung Naproxen gebildet/l/hr
    • Beispiel 7 Transformation des Ethylesters von R,S-Ibuprofen in S-Ibuprofen mit verschiedenen Mikroorganismen.
  • Alle Tests wurden mit 25 bis 100 ml Medium in mit Einbauten versehenen 100 bis 500 ml-Kolben ausgeführt, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben. Die Medien wurden aus Kulturen geimpft, die 24 Stunden lang in einem reichen Komplexmediuin (z.B. BHI) vorkultiviert und 48 Stunden lang kultiviert worden waren. Danach wurden in Abhängigkeit von dem Volumen der Kultur 20 oder 80 ul Ethylester von racemischem Ibuprofen zu den Kulturen zugegeben und 24 Stunden lang inkubiert.
  • Die Kulturen wurden nach Ansäuerung auf pH 2,5 mit H&sub3;PO&sub4; und dem Zusatz einer kleinen Menge Ammoniumsulfat mit CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert. Das in den Extrakten vorhandene Ibuprofen wurde zu einem Naphthalinmethylamidderivat derivatisiert, um seine enantiomere Reinheit zu bestimmen.
  • Zu 3 ml Extrakt wurden 200 ul einer Lösung von 2-Brom-1-methylpyridin-iodid in Dimethylformamid (50 mg/ml) und 200 ul einer Lösung von 1-Naphthalin-methylamin in CH&sub2;Cl&sub2; (100 mg/ml) zugesetzt und 5 Minuten lang bei 22ºC reagieren gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde unter N&sub2; bei 60ºC getrocknet. Der verbleibende Rückstand wurde in 3 ml Isooctan/CH&sub2;Cl&sub2; (Volumenverhältnis 2:1) gelöst und nach Zusatz von 2 ml 1n-H&sub2;SO&sub4; extrahiert.
  • Die organische Schicht wurde durch HPLC unter Verwendung einer chiralen DNBPG-Säule, die mit Isooctan/Isopropylalkohol/Methanol (Volumenverhältnis 97/2/1) oder in Fällen, in denen Verunreinigungen die Analyse störten, mit Isooctan/Isopropylalkohol/Methanol (Volumenverhältnis 98/1/1) eluiert wurde, analysiert.
  • Die Resultate sind in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7 Mikroorganismus Gebildetes Ibuprofen mg/Kultur Kulturvolumen (ml) Bacillus subtilis In IV-8 * CBS 680.85 Bacillus subtilis Nap 10-M CBS 805.85 Bacillus subtilis Sp III-4 CBS 806.86 Bacillus subtilis Thai I-8 CBS 679.85 Pseudomonas fluorescens Kor I-6 CBS 807.85 Stamm is III-25 CBS 666.86 Stamm LK 3-4 CBS 667.86 Stamm Sp 4 CBS 668.86 Stamm Thai III 18-1 CBS 669.86 Stamm Thai VI 12 CBS 670.86
  • Die dargestellten Werte sind die Mittelwerte aus Versuchen, die im Doppel ausgeführt wurden. Mit den Mikroorganismen, die mit * bezeichnet sind, wurden diese Werte aus einem einzigen Experiment erhalten. In diesem Falle wurden nur 10 ul Ibuprofen, gelöst in 50 ul Tetradecan, zu den Kulturen zugegeben.
    • Beispiel 8 Transformation des Methylesters von S-Ibuprofen in S-Ibuprofen mit verschiedenen Mikroorganismen.
  • Alle Tests wurden wie in Beispiel 7 beschrieben ausgeführt. Anstelle des Ethylesters von racemischem Ibuprofen wurde der Methylester von racemischem Ibuprofen zu den Kulturen zugesetzt.
  • Die Resultate sind in Tabelle 8 dargestellt. Tabelle 8 Mikroorganismus Gebildetes Ibuprofen mg/Kultur Kulturvolumen (ml) Bacillus subtilis In IV-8 * CBS 680.85 Bacillus subtilis Nap 10-M CBS 805.85 Bacillus subtilis Sp III-4 CBS 806.86 Bacillus subtilis Thai I-8 CBS 679.85 Stamm LK 3-4 CBS 667.86 Stamm Thai III 18-1 CBS 669.86 Stamm Thai VI 12 CBS 670.86
  • Die dargestellten Werte sind die Mittelwerte aus Experimenten, die im Doppel ausgeführt wurden. Mit den Mikroorganismen, die mit * bezeichnet sind, wurden diese Werte aus einem einzigen Experiment erhalten. In diesem Falle wurden nur 10 ul Ibuprofen, gelöst in 50 ul Tetradecan, zu den Kulturen zugesetzt.
    • Beispiel 9 Charakterisierung der in Bacillus subtilis Thai I-8 (CBS 679.85) vorhandenen Naproxenmethylesterase.
  • Bacillus Thai I-8 wurde in einem Eschweiler-Fermenter kultiviert, der 10%ige Magermilch enthielt (siehe Beispiel 5).
  • Nach 28 Stunden Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt. Die Zellen wurden in 0,1- molarem Tris-HCl pH 8,0 gelöst und bei Raumtemperatur 18 Stunden lang mit Lysosym (0,5 mg/ml Lysosym, 4 mg/ml EDTA) behandelt, gefolgt von einer DNase-Behandlung (0,01 mg/ml DNase, 3,5 mg/ml MgCl&sub2;) während einer Stunde bei der gleichen Temperatur.
  • Nach Zentrifugieren wurde der Proteinteil der überstehenden Flüssigkeit bei 70% Ammoniumsulfatsättigung ausgefällt. Nach Zentrifugieren wurde der Niederschlag in 0,01-molarem MOPS-[3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure]- Puffer pH 7,5 gelöst und 18 Stunden lang gegen den gleichen Puffer, der 0,02% NaN&sub3; als Konservierungsmittel enthielt, dialysiert.
  • Die schlussendlich erhaltene Lösung wurde auf einer präparativen HPLC-SEC-(Ausschlusschromatographie)- Säule (TSK 2000 SW, 600 x 21,5 mm) analysiert, die mit 0,1-molarem Natriumacetat pH 5,5 bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 6 ml/Minute eluiert wurde. Von 10 Minuten an wurden Säulenfraktionen von 2 ml gesammelt und auf das Vorhandensein von Lipase- und S-Naproxenmethylesterase- Aktivität getestet.
  • Die Lipaseaktivität wurde bestimmt in 0,1-molarein MOPS pH 7,5 mit 1 mg/ml p-Nitrophenyllaurat als Substrat. Die Lipaseaktivität, die der Bildung von p-Nitrophenol entspricht, kann bei 405 nm gemessen werden.
  • Die S-Naproxenmethylesterase wurde in 0,1-molarem MOPS pH 8,0 mit 20 mg S-Naproxenmethylester/ml analysiert. Nach 18 Stunden Inkubation wurde die gebildete Menge S-Naproxen durch HPLC wie in Beispiel 2 beschrieben gemessen.
  • Figur 1 zeigt das HPLC-SEC-Profil des Bacillus Thai I-8-Zell-Lysats. Die S-Naproxenmethylesterase- (Fraktion 37) ist deutlich von der Lipaseaktivität (Fraktion 31), die in diesem Mikroorganismus vorhanden ist, getrennt.
  • In Tabelle 9 werden die enantiomere Selektivität des Zellysats und der Fraktion 31 und 38 der HPLC-SEC verglichen. Die Esteraseaktivität in bezug auf R- und S-Naproxenmethylester wurden in der gleichen Weise wie oben beschrieben getestet.
  • Das scheinbare Molekulargewicht der Proteinfraktion, die die S-Naproxenesteraseaktivität enthielt, wurde unter Verwendung eines Proteingemisches von bekannten Molekulargewichten als Standard zu 27 000 bestimmt.
  • Die pH-Abhängigkeit der Hydrolyse von S-Naproxenmethylester unter den Analysenbedingungen ist in Fig. 2 gezeigt. Die verwendeten Puffer waren 0,1-molare Phosphorsäure (pH-Bereich 5,5 bis 7,5), 0,1-molares Tris-HCl (pH- Bereich 7,5 bis 9,0) und 0,1-molares Glycin (pH-Bereich 9,0 bis 10,0)
  • Der Einfluss der Temperatur auf die Esterasereaktion ist in Figur 3 gezeigt.
  • Bei einer Temperatur oberhalb 45ºC wird kaum irgendeine enzymatische Hydrolyse gefunden. Die Hydrolyse bei 37ºC ist grob zweimal höher als bei 25ºC. Tabelle 9 Enzymaktivität S-Naproxen, gebildet aus S-Ester (mM) R-Naproxen, gebildet aus R-Ester (mM) S-Spezifität (%) Thai-Zell-Lysat Fraktion "Lipase" "Esterase"
    • Beispiel 10 Molekulare Klonierung des Gens, das für die stereoselektive Umsetzung von R,S-Naproxenester verantwortlich ist.
  • Ein Plasmid, pNAPT-2, enthaltend ein chromosomales DNA-Fragment von Bacillus subtilis Thai I-8 (CBS 679.85) wurde wie unten beschrieben hergestellt.
  • Allgemeine Klonierungstechniken wurden angewendet, wie sie in dem Handbuch von T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, Could Spring Harbour Laboratory, beschrieben sind. Alle DNA modifizierenden Enzyme wurden von kommerziellen Lieferanten erhalten, und sie wurden gemäss den Instruktionen der Hersteller verwendet. Materialien und Apparaturen für die Trennung und Reinigung von DNA wurden gemäss den Instruktionen des Lieferanten verwendet.
  • Der positive Selektionsvektor pUN121 (Nilsson et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11, S. 8019) wurde verwendet. Dieser Vektor trägt ein Ampicillinresistenzgen, ein Tetracyclinresistenzgen und ein C&sub1;-Repressorgen. Die Transkription des Tetracyclingens wird durch das Genprodukt des C&sub1;- Repressorgens verhindert. Die Insertion von fremder DNA in die Schnittstelle von Bcl 1 des C&sub1;-Repressorgens führt zur Aktivierung des Tetracyclingens. Dies erlaubt eine positive Selektion von Rekombinanten auf Ampicillin/Tetracyclin- Agarplatten.
  • Partiell mit Sau3A verdaute Bacillus subtilis Thai I-8-DNA wurde mit mit Bcl 1 verdauter pUN121-DNA gemischt. Nach Rezirkularisation durch Verwendung von Polynucleotidligase wurde das DNA-Gemisch in E. coli DH1 (ATCC 33849) eingeführt unter Anwendung der CaCl&sub2;-Transformationsprozedur, wie sie beschrieben worden ist (T. Maniatis et al., 1982).
  • 1000 E. coli-Kolonien wurden erhalten, die gegen Ampicillin und Tetracyclin resistent waren. Alle Transformanten wurden aufbewahrt und gemäss J.P. Gergen et al. (Nucleic Acids Res. 7, S. 2115, 1979) replika-plattiert. Replizierte Kolonien wurden getestet unter Anwendung einer Technik, bei der Weichagar auf Platten aufgegossen wird und die auf einem vorher beschriebenen Verfahren zum Nachweis von Esteraseaktivität beruht (T.B. Higerd und H. Spizizen, 1973, J. Bacteriol. 114, S. 1184). Im wesentlichen ein Gemisch aus 0,5% niedrigschmelzender Agarose, 0 ,5-molarem Kaliumphosphat (pH 7,5), 0,5 mg/ml beta-Naphthylacetat und 0,5 mg/ml Echtblau wird über die Transformanten ausgebreitet. Innerhalb einiger Minuten färben sich Kolonien mit Esterase- oder Lipaseaktivität purpurfarben. Solche Kolonien wurden über Nacht in 2 x YT- (16 g/l Bactotrypton, 10 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl) Medium kultiviert und anschliessend auf ihre Fähigkeit untersucht, S-Naproxenester in S-Naproxen überzuführen (Methode von Beispiel 1). Ein E. coli-Transformant vermochte S-Naproxenester umzuwandeln. Das aus diesem Transformanten isolierte Plasmid, das pNAPT-2 genannt wurde, ist in Fig. 4 gekennzeichnet. Seine Grösse ist 9,4 kb.
  • Die Aktivität von E. coli/pNAPT-2 und E. coli/ pNAPT-7 (getestet gemäss Beispiel 12), die über Nacht in 2x YT-Medium kultiviert worden waren, ist in Tabelle 10 gezeigt. E. coli-Zellen mit nur dem Plasmid pUN121 waren unfähig, S- oder R-Naproxenester zu hydrolysieren. Dies beweist, dass alle für die S-Naproxen-Hydrolyse erforderliche Information auf dem 5 kb grossen, eingefügten Stück von Bacillus subtilis Thai I-8-DNA sitzt.
  • Eine Probe von E. coli DH1, die das Plasmid pNAPT-2 trägt, wurde beim CBS unter der Ordnungsnummer 671.86 hinterlegt. Tabelle 10 Aktivität (U/l) S-Spezifität (%) E. coli/pUN121 E. coli/pNAPT-2 E. coli/pNAPT-7
    • Beispiel 11 Verbesserung von Esteraseaktivität durch Einführung von mehrfachen Genkopien in Bacillus subtilis.
  • Das für Esterase codierende Plasmid pNAPT-2 trägt ein 5 kb grosses eingefügtes Stück von Bacillus subtilis Thai I-8 (CBS 679.85)-DNA. Da dies viel mehr ist als die Mindestgrösse, die für ein Gen erwartet wird, das für ein Protein von um 30 kb codiert, ist es denkbar, dass das eingefügte Stück ohne Verlust von Esteraseaktivität gekürzt werden könnte. Um diese Möglichkeit zu testen, wurden Hind III-Restriktionsenzym-Fragmente von pNAPT-2 in pPNeo/ori ligasiert. Dies wurde wie unten beschrieben ausgeführt. pPNeo/ori wurde konstruiert durch Ligasieren des 2,7 kb grossen EcoR1-Sma 1-Restriktionsfragments von pUC19 (C. Yanisch- Perron et al., Gene 33, S. 103, 1985) in das 2,5 kb grosse EcoR1-SnaB1-Restriktionsfragment von pUB110 (T.C. Gryczan et al., J Bacteriol. 134, S. 318, 1978). Das resultierende Schaukelplasmid, pPNeo/ori (5,2 kb), hat die Fähigkeit, sowohl in E. coli als auch in Bacillus-Spezies zu replizieren infolge des Vorhandenseins des pUC19-Startpunkts und des pUB110-Startpunkts. Zusätzlich trägt pPNeo/ori ein Gen, das für Ampicillinresistenz codiert, und ein Gen, das für Neomycinresistenz codiert (C. Yanisch-Perron et al., 1985; M. Matsumura et al., J. Bacteriol. 160, S. 413, 1984).
  • Zum Subklonieren wurde mit Hind III verdautes pNAPT-2 mit mit Hind III verdautem pPNeo/ori gemischt und ligasiert. Das Gemisch wurde in E. coli JM101 hsds transformiert, wie beschrieben wurde (Maniatis et al., 1982). E. coli JM101 hsds wurde aus der Phabagen-Sammlung erhalten (Ordnungsnummer PC 2493; Utrecht, Niederlande). Kolonien, die beta-Naphthylacetat zu hydrolysieren vermochten, wurden wie in Beispiel 10 beschrieben selektioniert. Aus zwei positiven Kolonien wurde Plasmid-DNA isoliert und im einzelnen charakterisiert, indem man mehrere Restriktionsenzym-Erkennungsstellen bestimmte. Die physikalischen Karten dieser Plasmide, pNAPT-7 und pNAPT-8, werden in Figur 5 und 6 wiedergegeben. Die Aktivität von E. coli/pNAPT-7 und E. coli/pNAPT-8 in bezug auf S-Naproxenmethylester wurde bestimmt (Tabelle 11).
  • Es ist ersichtlich, dass beide Plasmide die 2,2 kb grossen Hind III-Hind-III-Fragmente von pNAPT-2 als ihr eingefügtes Stück tragen, obgleich ihre Orientierungen entgegengesetzt sind. Es scheint auch, dass das Gen für die Esterase innerhalb ihres 2,0 kb grossen Teils von Thai I-8-DNA lokalisiert sein muss.
  • Nach Extraktion aus E. coli JM101 hsds wurden die Plasmide pNAPT-7 und pNAPT-8 transformiert in Protoplasten von Bacillus subtilis 1-85 und Bacillus subtilis 1 A-40 (S. Chang und S.N. Cohen, Mol. Gene Genet. 168, S. 111, 1979). Bacillus subtilis 1-85 (Yuki, S., 1967, Jpn. J. Genet. 42, S. 251) und Bacillus subtilis 1A40 (Bacillus Stock Center B.G.S.C. 1A40) sind beschrieben worden.
  • Neomycinresistente Kolonien wurden auf ihre Fähigkeit, S-Naproxenmethylester zu hydrolysieren, nach Fermentation in 2xYT-Medium gemäss der beschriebenen Methode (siehe Beispiel 12) getestet. In Tabelle 11 sind die Aktivitäten gezeigt. Es ist ersichtlich, dass die durch die Einführung von mehrfachen Genkopien erzielte Verbesserung ca. 300-fach ist. Daher wird die Eignung der Mikroorganismen und der daraus stammenden Substanzen für die Verwendung in einem Verfahren zum Hydrolysieren von S-Naproxenester in hohem Grade verbessert.
  • Obgleich bekannt ist, dass die Genklonierung die Menge eines Enzymproduktes erhöhen kann, ist das Ausmass der Verbesserung im Falle von Esterase sehr überraschend. Sehr oft treten Probleme wie falsche Faltung, Proteinabbau und Ausfällung innerhalb der Zelle auf, wenn man die Gene für ein Enzym kloniert (Harris, T.J.R., 1983, Genetic Engineering 4, Academic Press). Unterwarteterweise scheint keines dieser Probleme aufzutreten, wenn man Esterasegene kloniert. Tabelle 11 Aktivität (U/l) E. coli JM101 hsds/pNAPT-7 (CBS 712.86) E. coli JM101 hsds/pNAPT-8 (CBS 672.86) Bacillus subtilis 1-85/pNAPT-7 (CBS 673.86) Bacillus subtilis 1A40/pNAPT-7 (CBS 675.86) Bacillus subtilis 1A40/pNAPT-8 (CBS 674.86) E. coli JM101 hsds/pUN 121 Bacillus subtilis 1-85 Bacillus subtilis 1A40 (BGSC 1A40) Bacillus subtilis Thai I-8 (CBS 679.85)
    • Beispiel 12 Charakterisierung der Naproxenmethylesterase von E. coli JM 101 hsds/pNAPT-7
  • Ein Liter Fermentationsbrühe von E. coli JM 101 hsds/pNAPT-7 von Beispiel 11 wurde verwendet. Die Brühe wurde zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in 0,1-molarem Tris-HCl-Puffer pH 8,0 suspendiert und mit 1 mg/ml Lysosym, 4 mg/ml EDTA 60 Minuten lang bei 30ºC in Gegenwart von 1 Vol.-% Octanol inkubiert. Die DNA wurde durch 0,02 mg/ml DNase in Gegenwart von 15 mMol/l Mg²&spplus; hydrolysiert (30 Minuten bei 220ºC).
  • Nach Zentrifugieren wurde der Proteinteil der überstehenden Flüssigkeit bei 60% Ammoniumsulfatsättigung ausgefällt. Nach Zentrifugieren wurde der Niederschlag in 10-millimolarem MOPS pH 7,5 gelöst und durch Ultrafiltration (Amicon YM 10) 10-fach konzentriert. Die spezifische Aktivität des zurückgehaltenen Proteins, das aus E. coli pNAPT-7 stammt, in bezug auf den S-Naproxenmethylester [bestimmt in 0,1-molarem MOPS pH 7,5 bei 25ºC in Gegenwart von 20 mg S-Naproxenmethylester pro ml, 2% Tween, 1 mg/ml BSA (Bovine Serum Albumin)] wurde zu 1,6 Units pro mg Protein gefunden. In der ganzen Beschreibung ist 1 Unit (U) definiert als die Menge an Enzym, die unter den angegebenen Bedingungen 1 x 10&supmin;&sup6; Mol S-Naproxenmethylester pro Minute hydrolysiert. Tween wird zur Verbesserung der Löslichkeit des stark hydrophoben Esters und BSA zur Verhinderung der Inaktivierung des Enzyms durch aspezifische Adsorption zugesetzt. Die Proteinkonzentration wurde gemäss Bradford mit BSA als Standard bestimmt.
  • Das zurückgehaltene Protein, das aus E. coli pNAPT-7 stammt, wurde auf dem in Beispiel 9 beschriebenen HPLC-SEC-System analysiert.
  • Von 15 Minuten an wurden Säulenfraktionen von 2 ml gesammelt und auf S-Naproxenesteraseaktivität getestet (siehe Beispiel 9).
  • Figur 10 zeigt die OD-280 nm-Extinktion und die Esteraseaktivität der HPLC-SEC-Fraktionen. Die S-Naproxenesteraseaktivität (Fraktion 26) fällt zusammen mit einem Peak in dem Extinktionsprofil. Die Retentionszeit der Bacillus subtilis Thai I-8-Esterase, die in genau der gleichen Weise analysiert wurde, war die gleiche (Resultate nicht gezeigt).
  • Figur 8 zeigt eine 12,6% SDS-PAGE gemäss Laemmli des zurückgehaltenen Proteins, das aus E. coli PNAPT-7 stammt, und von Fraktion 26 der HPLC-SEC.
  • Die Bahn 4 enthält das E. coli JM 101 hsds/pUN 121. Die PAGE (Polyacrylamidgelelektrophorese) zeigt klar, dass die ausgeprägteste Proteinbande in dem zurückgehaltenen Protein, das aus E. coli pNAPT-7 stammt, die einzige Proteinbande ist, die in Fraktion 26 der HPLC-SEC nachweisbar ist, und ist in E. coli abwesend.
  • Figur 9 zeigt ein isoelektrisches Fokussierungsgel (LKB-Ampholine-PAG-Platte, pH 3,5-9,5) des zurückgehaltenen Proteins, das aus E. coli pNAPT-7 stammt. In A ist das Protein angefärbt mit Serva Blue R. In B ist die Esteraseaktivität der gleichen Proben sichtbar gemacht durch die beta-Naphthylacetat/FB-(Echtblau-RR-Salz)-Methode, die in Beispiel 10 beschrieben ist. Es wird gezeigt, dass die ausgeprägteste Proteinbande in A für die höchste Esteraseaktivität verantwortlich zu sein scheint.
    • Beispiel 13 Transformation des Ethylesters von Ibuprofen in Ibuprofen durch E. coli JM 101 hsds/pNAPT-7
  • Das E. coli pNAPT-7-Zell-Lysat wurde nach der Ammoniumsulfatfällung und Ultrafiltration auf die Hydrolyse des Ethylesters von R- und S-Ibuprofen getestet.
  • Die Enzymaktivität wurde bei 25ºC in 0,1-molarem MOPS-Puffer pH 7,5 mit 0,3 mg R- oder S-Ibuprofenethylester/ml, 2% Tween und 1 mg/ml BSA analysiert. Nach 2 Stunden Inkubation wurde die Reaktion durch Zusatz von Acetonitril abgebrochen.
  • Das Reaktionsgemisch wurde auf einer HPLC-Umkehrphasensäule (Chrompack Polygosil 60D-10CN, 250 x 4,6 mm), die mit 34% Acetonitril, 0,05-molarer Phosphorsäure pH 3,0 bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,5 ml/Minute elu-iert wurde, analysiert. Die Retentionszeiten für R- und S-Ibuprofen und den Ethylester von R- und S-Ibuprofen waren 5,98 Minuten bzw. 11,08 Minuten. Die Resultate sind in Tabelle 12 zusammengefasst.
  • Die Hydrolyse des Ethylesters von S-Ibuprofen entspricht 60% der Hydrolysierungsaktivität des Methylesters von S-Naproxen unter den gleichen Bedingungen. Tabelle 12 Substrat Estergruppe S-Spezifität S-Ibuprofen R-Ibuprofen S-Naproxen Ethyl Methyl
    • Beispiel 14 Charakterisierung der S-Naproxenesterase von Bacillus 1-85/pNAPT-7
  • Bacillus 1-85/pNAPT-7 wurde in einem 5 Liter- Eschweiler-Fermenter in 2xTY-Medium kultiviert.
  • Die Zellpaste wurde durch Zentrifugieren isoliert. Der Niederschlag wurde in 0,1-molarem Tris-HCl pH 8,0 gelöst und gemäss dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren lysiert.
  • Nach Zentrifugieren wurde die überstehende Flüssigkeit auf 60% Ammoniumsulfatsättigung gebracht und erneut zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in 0,02-molarem MOPS pH 7,5 gelöst und unter Verwendung eines Amicon YM10-Filters ultrafiltriert. Dieses Zellysat wurde auf einer analytischen HPLC-SEC-Säule (TSK 2000 SW, 2-mal 300 x 7,5 mm) analysiert, die mit 0,01-molarem MES [2-(N-Morpholino)- ethansulfonsäure] pH 5,6 und 0,1-molarem NaCl eluiert wurde. Strömungsgeschwindigkeit 1 ml/Minute. Von 10 Minuten an wurden 1 ml-Fraktionen des Säuleneluats gesammelt und auf S-Naproxenmethylesteraseaktivität unter Anwendung der in Beispiel 12 beschriebenen Methode getestet.
  • Figur 7 zeigt das OD-280 nm-Profil und die Esteraseaktivität der Fraktionen. Die Retentionszeit der S-Naproxenesterase entspricht einem scheinbaren Molekulargewicht von 27 000. Die spezifische Aktivität der verschiedenen Proteinproben ist in Tabelle 13 zusammengefasst. Die Esteraseaktivität wurde wie in Beispiel 12 beschrieben analysiert.
  • Die enantiomere Selektivität des zurückgehaltenen Proteins, das aus Bacillus pNAPT-7 stammt, ist in Tabelle 14 gezeigt. Die Aktivität wird wie in Beispiel 12 beschrieben analysiert.
  • In Figur 8 ist die 12,6% SDS-PAGE gemäss Laemmli des zurückgehaltenen Proteins, das aus Bacillus pNAPT-7 stammt, und von Fraktion 5 und 7 der HPLC-SEC gezeigt, die die Lipase- bzw. S-Naproxenesteraseaktivitäten darstellt. Die Hauptproteinbande in dem zurückgehaltenen Protein, das aus Bacillus stammt, ist das einzige in Fraktion 7 vorhandene Protein und ist in Fraktion 5 abwesend (Lipaseaktivität). Die Proteinbande in Bahn 8 entspricht einem scheinbaren Molekulargewicht von 31 000.
  • In Figur 9 ist ein isoelektrisches Fokussierungsgel von Bacillus pNAPT-7 und Fraktion 7 gezeigt (siehe für die technische Beschreibung Beispiel 12). In dem zurückgehaltenen Protein, das aus Bacillus pNAPT-7 stammt, ist die Lipaseaktivität mit einem isoelektrischen Punkt (IEP) von 4,5 die dominierende Aktivität in bezug auf das Naphthylacetatsubstrat. In Fraktion 7 der HPLC-SEC hat die Hauptproteinbande einen IEP von 5,4, der mit der Naphthylacetat- Hydrolysierungsaktivität zusammenfällt, die in Teil B gezeigt ist. Es muss festgehalten werden, dass der beta-Naphthyl-Echtblau-Test viel empfindlicher mit einer Lipase als mit einer Esterase reagiert.
  • Der OD 280 nm-Peak (Fraktion 7) der HPLC-SEC scheint die Naproxenesterase zu enthalten und besteht aus einer Hauptproteinbande auf der SDS-PAGE. Das isoelektrische Fokussierungsgel bestätigt, dass die Hauptproteinbande von Fraktion 7 die Esteraseaktivität besitzt. Dies bedeutet, dass die Klonierung der Esteraseaktivität von Bacillus subtilis Thai I-8 sowohl in E. coli als auch in Bacillus zu einer dramatischen Zunahme der Esteraseproduktion führt. In der Tat ist die Naproxenesterase in E. coli pNAPT-7 und Bacillus pNAPT-7 das Protein mit der höchsten Konzentration in dein Zellysat beider Mikroorganismen geworden. Tabelle 13 Probe Proteinkonz. (mg/ml) U/mg Protein Bacillus 1-85/pNAPT-7* Fraktion 6 HPLC-SEC Fraktion 7 HPLC-SEC Bacillus Thai I-8* * Zell-Lysat nach Lyse, Ammoniumsulfatfällung und Ultrafiltration. Tabelle 14 Zugesetzter Methylester S-Spezifität (%) Bacillus 1-85/pNAPT-7 S-Naproxen R-Naproxen
    • Legende zu den Figuren Figur 1 HPLC-Profil des Bacillus Thai I-8-Zell- Lysats Figur 2 pH-Abhängigkeit der Hydrolyse von S-Naproxenmethylester und den Testbedingungen von Beispiel 9 Figur 3 Einfluss der Temperatur auf die Esterasereaktion
  • = 25ºC, + = 300C, = 37ºC, = 45ºC und X = 60ºC
    • Figur 4 Restriktionskarte von pNAPT-2
  • Eine Anzahl von Restriktionsenzym-Erkennungsstellen sind in dem Plasmid pNAPT-2, das eine Grösse von 9,4 kb hat, bestimmt worden. pUN 121-DNA Thai I-8-DNA-Insert
  • Die Position, in der partiell mit Sau3A verdaute Thai I-8-DNA an pUN 121 ligasiert wurde, ist durch Bcl1/Sau3a angegeben.
    • Figuren 5 und 6. Restriktionskarten von pNAPT-7 bzw. pNAPT-8
  • Das 2,2 kb grosse Hind III-Fragment von pNAPT-2 wurde in pPNeo/ori kloniert. Die resultierenden Plasmide, pNAPT-7 und pNAPT-8,wurden im einzelnen mit mehreren Restriktionsenzymen analysiert. Beide Plasmide haben eine Grösse von 7,3 kb. Es ist ersichtlich, dass pNAPT-8 das 2,2 kb grosse Hind III-Fragment in einer entgegengesetzten Orientierung zu derjenigen von pNAPT-7 trägt. pUC 19-DNA pUB 110-DNA pUN 121-DNA Thai I-8-DNA Figur 7 OD-280 nm-Extinktion und Esteraseaktivität der HPLC-SEC-Fraktionen S-Naproxenmethylesteraseaktivität OD-280 nm
    • Figur 8 12,6% SDS-PAGE gemäss Laemmli des zurückgehaltenen, aus E. coli pNAPT-7 stammenden Proteins und von Fraktion 26 der HPLC-SEC
  • Bahnen 1, 5 und 9: Molekulargewichtmarkers
  • Bahn 2 : zurückgehaltenes Protein aus E. coli pNAPT-7
  • Bahn 3 : zurückgehaltenes Protein aus E. coli pNAPT-7 nach HPLC-Gelfiltration, aktive Fraktion 26
  • Bahn 4 : E. coli/pUN 121-Wirtsstamm
  • Bahn 6 : Bacillus subtilis 1-85 mit pNAPT-7
  • Bahnen 7 und 8 : Bacillus subtilis 1-85 mit pNAPT-7 nach HPLC-Gelfiltration, Fraktion 5 und 7
  • Bahn 10 : zurückgehaltenes Protein aus Bacillus Thai I-8
    • Figur 9 Ein isoelektrisches Fokussierungsgel (LKB-Ampholine-PAG-Platte, pH 3,5-9,5) des zurückgehaltenen Proteins aus E. coli pNAPT-7
  • A. Nach Anfärbung mit Serva Blue
  • B. Nach beta-Naphthylacetat/FBB-Anfärbung
  • Bahn 1 : Markerproteine mit bekanntem IEP
  • Bahn 4 : zurückgehaltenes Protein aus E. coli pNAPT-7
  • Bahn 3 : Bacillus subtilis 1-85 mit zurückgehaltenem Protein aus pNAPT-7
  • Bahn 2 : wie Bahn 3 nach HPLC-Gelfiltration, aktive Fraktion Figur 10 OD-280 nm Profil und Esteraseaktivität der HPLC-SEC-Fraktionen S-Naproxenmethylesteraseaktivität

Claims (22)

1. Mikrobielle Esterase mit der Fähigkeit zur stereoselektiven Hydrolyse von Naproxenester zu Naproxen, von dem mindestens 95 Gew.% die S-Konfiguration haben, wobei die genannte Esterase
- eine spezifische Aktivität von mindestens 0,1 Einheiten pro mg Protein, wie vorstehend definiert;
- einen isoelektrischen Punkt von 5,4;
- ein scheinbares Molekulargewicht von 31 000;
- ein HPLC-SEC-Profil, das der auf einer präparativen HPLC-SEC-(Ausschlusschromatographie)-Säule analysierten Esteraseaktivität von Fig. 1 entspricht;
- ein pH-Optimum zwischen 6,5 und 10,0; und
- ein Temperaturoptimum zwischen 25 und 45ºC hat.
2. Esterase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Esterrest des Naproxenesters eine gegebenenfalls substituierte Alkylgruppe ist.
3. Esterase nach Anspruch 1, erhältlich von Bacillus-Spezies.
4. Esterase nach Anspruch 3, erhältlich von Bacillus subtilis.
5. Esterase nach Anspruch 1, erhältlich von
Bacillus Spezies Thai 1-8 (CBS 679.85),
Bacillus Spezies In IV-8 (CBS 680.85),
Bacillus Spezies Nap 10-M (CBS 805.85),
Bacillus Spezies Sp III-4 (CBS 806.85),
Pseudomonas Spezies Kor I-6 (CBS 807.85),
Escherichia coli DH 1/pNAPT-2 (CBS 671.86),
Escherichia coli JM101 hsds/pNAPT-7 (CBS 712.86),
Bacillus subtilis 1-85/pNAPT-7 (CBS 673.86),
Bacillus subtilis 1A-40/pNAPT-7 (CBS 675.86),
Bacillus subtilis 1A-40/pNAPT-8 (CBS 674.86),
Escherichia coli JM101 hsds/pNAPT-8 (CBS 672.86),
Stamm LK 3-4 (CBS 667.86),
Stamm Sp 4 (CBS 668.86),
Stamm Thai III 18-1 (CBS 669.86),
Stamm Thai VI 12 (CBS 670.86) oder
Stamm is III-25 (CBS 666.86).
6. Esterase nach Anspruch 1 mit einer spezifischen Aktivität von mindestens 1 Einheit pro mg Protein, wie vorstehend definiert.
7. DNA-Fragment, das ein Gen aufweist, das für eine mikrobielle Esterase nach Anspruch 1 codiert, und welches Gen von Bacillus Spezies Thai 1-8 (CBS 679.85) erhältlich ist.
8. Plasmid, das das DNA-Fragment nach Anspruch 7 enthält.
9. Plasmid nach Anspruch 8, das pNAPT-7 (CBS 712.86) oder pNAPT-8 (CBS 672.86) ist.
10. Mikroorganismus, der durch Transformation mit einem DNA-Fragment nach Anspruch 7 Esteraseaktivität oder erhöhte Esteraseaktivität zur stereoselektiven Hydrolyse von Naproxenester zu Naproxen erhalten hat.
11. Verfahren zur Produktion einer mikrobiellen Esterase nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Kultivierung eines Mikroorganismus nach Anspruch 10.
12. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutisch aktiven Verbindung der Formel
oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes oder Esters davon in einer stereospezifischen Form, worin R&sub1; eine substituierte Arylgruppe, wie eine Phenyl- oder Naphthylgruppe, darstellt oder ein heterocyclisches Ringsystem, das gegebenenfalls substituiert ist, darstellt oder ein heteroaromatisches Ringsystem, das zusätzlich zu Kohlenstoffatomen ein oder mehr Atome enthält, die aus Stickstoff, Schwefel und Sauerstoff gewählt sind, darstellt, wobei dieses Ringsystem gegebenenfalls substituiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel
worin R&sub2; ein Esterrest und vorzugsweise eine gegebenenfalls substituierte Alkylgruppe ist, der Einwirkung eines Mikroorganismus nach Anspruch 10 oder von daraus stammenden Substanzen unterwirft und gewünschtenfalls die Verbindung (I) in das pharmazeutisch unbedenkliche Salz oder den pharmazeutisch unbedenklichen Ester davon überführt.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass R&sub2; eine lineare Alkylgruppe von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist.
14. Verfahren nach den Ansprüchen 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, dass R&sub2; eine Ethylgruppe ist.
15. Verfahren nach den Ansprüchen 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, dass R&sub2; eine Methylgruppe ist.
16. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass R&sub1; eine substituierte Phenyl- oder Naphthylgruppe ist.
17. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung (I) Naproxen ist.
18. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung (I) Ibuprofen ist.
19. Verfahren zur Herstellung von Verbindung (I), von der mindestens 80% in der R-Konfiguration vorliegen, gekennzeichnet durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 18, wonach die Verbindung (I) abgetrennt und der verbleibende Teil hydrolysiert wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass eine Substanz mit der Fähigkeit, die Verbindung (II) in die Verbindung (I) überzuführen, aus dem Mikroorganismus freigesetzt und als solche verwendet wird.
21. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus Escherichia coli, vorzugsweise E. coli JM101 hsds oder E. coli DH1, ist.
22. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus Bacillus, vorzugsweise Bacillus subtilis, bevorzugter Bacillus subtilis 1-85 oder Bacillus subtilis 1A40, ist.
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