JP2699435B2 - Gel composition for nucleic acid electrophoresis - Google Patents
Gel composition for nucleic acid electrophoresisInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は核酸電気泳動用ゲル組成物に関する。Description: TECHNICAL FIELD The present invention relates to a gel composition for nucleic acid electrophoresis.
近年、バイオテクノロジーに関する研究の活発化によ
り、遺伝子工学に関する研究が活発に行なわれてきてい
る。この遺伝子工学の研究においては、生物細胞の遺伝
物質であるデオキシリボ核酸（DNA）の塩基配列の解
析、異種細胞への組換え等の研究が盛んに行われている
が、これらの研究においては、抽出されたDNAの分析、
それらの制限酵素による切断フラグメントの分析等が不
可欠であり、そのために電気泳動法が簡便かつ高感度分
析法として汎用されている。従って、このような電気泳
動を行なうためのゲル化剤及びゲル組成物を提供するこ
とは遺伝子工学研究の基礎及び応用において極めて有意
義である。2. Description of the Related Art In recent years, research on biotechnology has been actively conducted, and research on genetic engineering has been actively conducted. In this genetic engineering research, analysis of the base sequence of deoxyribonucleic acid (DNA), which is the genetic material of biological cells, and recombination into heterologous cells, etc., are actively conducted, but in these studies, Analysis of the extracted DNA,
It is essential to analyze cleavage fragments with these restriction enzymes, and for that purpose, electrophoresis is widely used as a simple and high-sensitivity analysis method. Therefore, providing a gelling agent and a gel composition for performing such electrophoresis is extremely significant in the basics and applications of genetic engineering research.
（従来技術） 従来核酸電気泳動用ゲルとしては、高純度寒天粉末を
電気泳動用緩衝液に添加し、加熱溶解後冷却してゲル化
させた寒天ゲル、アクリルアミドを適当な重合開始剤で
重合させて得られるポリアクリルアミドゲル等があり、
DNAのみならずRNA（リボ核酸）、タンパク質等の分離分
析用に利用されてきている。(Prior art) Conventionally, a gel for nucleic acid electrophoresis is prepared by adding high-purity agar powder to an electrophoresis buffer, dissolving by heating, cooling, and gelling agar gel or acrylamide with an appropriate polymerization initiator. There is a polyacrylamide gel obtained by
It has been used for separation and analysis of not only DNA but also RNA (ribonucleic acid) and proteins.
（発明の解決しようとする問題点） 核酸電気泳動用ゲルとして要求される性質としては、
従来、主として次のような点があげられている。(Problems to be solved by the invention) The properties required for a gel for nucleic acid electrophoresis include:
Conventionally, the following points are mainly mentioned.
DNAフラグメントの大きさの順に泳動されること
（小さいフラグメントほど早い）。Electrophoresis in order of DNA fragment size (smaller fragments are faster).
泳動可能なDNAフラグメントの大きさの範囲が広い
こと。A wide range of sizes of DNA fragments that can be electrophoresed.
ゲルが泳動しようとする核酸と反応、結合、分析分
解等の副反応をおこさないこと。Do not cause side reactions such as reaction, binding, and analytical decomposition with the nucleic acid to be migrated by the gel.
泳動後核酸フラグメントのシャープなバンドパター
ンを与えること。To give a sharp band pattern of nucleic acid fragments after electrophoresis.
分離性能が高いこと。 High separation performance.
泳動時間が短かくて済むこと。 Short running time is required.
ゲルが核酸と同じ吸収波長領域を持たないこと。 The gel does not have the same absorption wavelength range as the nucleic acid.
泳動した核酸フラグメントがゲル内で容易に拡散し
ないこと。The migrated nucleic acid fragments do not easily diffuse in the gel.
ゲルが適度の硬さを有し、取扱いが容易なこと。 The gel has an appropriate hardness and is easy to handle.
然るに、従来利用されている寒天ゲル、ポリアクリル
アミドゲル等においては、上記の性能のうち、及び
の性質において必ずしも満足のいく性質を与えるもの
とはなっていない。However, conventionally used agar gels, polyacrylamide gels and the like do not always provide satisfactory properties among the above-mentioned properties.
（問題点を解決しようとする手段） そこで本発明者等は、上記性質をすべて満足する核酸
電気泳動用ゲルの開発を目的として鋭意研究を行なった
結果、シュードモナス・エロディア（Psevdonoas elode
a）菌の生産する多糖類が、核酸電気泳動用ゲルとして
の良好な性質を有することを見出し、本発明を完成する
に至った。(Means for Solving the Problems) Accordingly, the present inventors have conducted intensive studies with the aim of developing a gel for nucleic acid electrophoresis that satisfies all of the above properties, and as a result, Pseudomonas elodea (Psevdonoas elode)
a) It has been found that polysaccharides produced by bacteria have good properties as a gel for nucleic acid electrophoresis, and the present invention has been completed.
すなわち本発明は、無機金属イオン含有が緩衝液とシ
ュードモナス・エロディア（Pseudomonas elodea）生産
する多糖類の混合物を加熱溶解せしめた後、冷却するこ
とによりゲル化せしめてなる核酸電気泳動用ゲル組成物
である。That is, the present invention provides a gel composition for nucleic acid electrophoresis obtained by heating and dissolving a mixture of a buffer solution containing an inorganic metal ion and a polysaccharide produced by Pseudomonas elodea and then cooling the mixture to form a gel. is there.
本発明において使用される無機金属イオン含有緩衝液
とは、従来核酸電気泳動用に使用されている緩衝液に、
使用しようとする濃度で、かつ目的とするゲル強度を与
えるのに必要な無機金属イオンを含有したものならば、
どのようなものでも使用可能である。すなわち、従来使
用されている緩衝液としては、トリスー酢酸緩衝液（0.
04M トリスー酢酸、0.001M EDTA pH8.0）、トリスーリ
ン酸緩衝液（0.08M トリスーリン酸、0.002M EDTA、pH
8.0）及びトリスーホウ酸緩衝液（0.089M トリスーホ
ウ酸、0.089Mホウ酸、0.002MEDTA、pH8.0）等が知られ
ているが、これら緩衝液にゲルを形成し、かつ目的とす
る核酸の分離能を与えるに十分な濃度の無機金属イオン
を含有せしめたものが使用される。The inorganic metal ion-containing buffer used in the present invention is a buffer conventionally used for nucleic acid electrophoresis,
At the concentration to be used, and if it contains inorganic metal ions necessary to give the desired gel strength,
Anything can be used. That is, as a conventionally used buffer, a tris-acetate buffer (0.
04M Tris-acetic acid, 0.001M EDTA pH8.0, Tris-phosphate buffer (0.08M Tris-phosphate, 0.002M EDTA, pH
8.0) and tris-borate buffer (0.089 M tris-borate, 0.089 M boric acid, 0.002 MEDTA, pH 8.0), etc., which form a gel in these buffers and have the ability to separate the target nucleic acid Used are those containing an inorganic metal ion at a concentration sufficient to give
また、無機金属イオン含有緩衝液における無機金属イ
オンとしては周期律表の第１族から第３族に属する金属
のイオンであり、ナトリウム、カリウム、マグネシウ
ム、カルシウム、亜鉛、マンガン等の陽イオンである。
これら陽イオンは、実用上では、塩酸塩、硫酸塩、硝酸
塩、有機酸塩等の形で、前述の緩衝液に溶解して使用さ
れ得るものである。また使用される金属イオンの濃度は
目的とするゲルの強度、泳動される核酸の種類と分子量
等に応じて適宜決定されるものであり、通常0.01重量％
〜１重量％、好ましくは0.05重量％〜0.5重量％の範囲
で使用される。In addition, the inorganic metal ion in the buffer containing an inorganic metal ion is an ion of a metal belonging to Groups 1 to 3 of the periodic table, and is a cation such as sodium, potassium, magnesium, calcium, zinc, and manganese. .
In practice, these cations can be used in the form of hydrochloride, sulfate, nitrate, organic acid salt or the like, dissolved in the above-mentioned buffer solution. The concentration of the metal ion used is appropriately determined according to the strength of the target gel, the type and molecular weight of the nucleic acid to be migrated, and is usually 0.01% by weight.
To 1% by weight, preferably 0.05% to 0.5% by weight.
次に、本発明において使用されるシュードモナス・エ
ロディア（Pseudomonas elodea）菌の生産する多糖類す
なわち、ジェランガムは、該菌株の培養物より抽出精製
されたもの、抽出精製前または後に脱アセチル化された
もの、または部分的に脱アセチル化された後精製された
もの等が、適宜使用されるものである。また使用される
濃度は、これもまた限定的でなく、目的とする電気泳動
におけるゲル強度、泳動される核酸の種類及び分子量
（大きさ）により適宜決定されるものであり、通常0.1
重量％〜３重量％の濃度で使用される。Next, the polysaccharide produced by the Pseudomonas elodea bacterium used in the present invention, ie, gellan gum, is extracted and purified from a culture of the strain, and deacetylated before or after extraction and purification. Or partially purified after deacetylation and the like are used as appropriate. The concentration used is not particularly limited either, and is appropriately determined depending on the desired gel strength in electrophoresis, the type and molecular weight (size) of the nucleic acid to be migrated, and is usually 0.1%.
It is used at a concentration of from 3% by weight to 3% by weight.
本発明においては、前記の如き、金属イオン含有核酸
電気泳動緩衝液とジェランガムの混合物を加熱溶解後冷
却することによりゲル化せしめてなる組成物に関するも
のであるが、該混合物の溶解方法としては、該混合物を
100℃前後の温度で数分間加熱することにより構成され
るものであり、この場合、加熱法としてはオートクレー
ブ、ガス電気等通常用いられる加熱法が利用可能であ
る。In the present invention, as described above, the present invention relates to a composition obtained by heating and dissolving a mixture of a metal ion-containing nucleic acid electrophoresis buffer and gellan gum and then cooling the mixture to form a gel. The mixture
It is constituted by heating at a temperature of about 100 ° C. for several minutes, and in this case, a commonly used heating method such as an autoclave or gas electricity can be used.
また、冷却によりゲル化させる方法としては、該混合
物の加熱溶解液を電気泳動用平板容器、カラム等に流し
込んだ後、室温で放置し自然冷却によってゲル化させる
方法、低温度室内で急速冷却によってゲル化させる方法
等があげられる。As a method of gelation by cooling, a heated solution of the mixture is poured into a flat plate container for electrophoresis, a column, and the like, and then left at room temperature to gel by natural cooling. Examples of the method include gelation.
以上の如くして、本発明の核酸電気泳動用ゲル組成物
は製造されるものであるが、該組成物を核酸電気泳動用
に使用するに際しては、泳動用緩衝液に、本発明のゲル
組成物作成時に用いられたと同じ金属イオンを同じ濃度
になるように含有せしめた緩衝液を用いて、寒天ゲル、
ポリアクリルアミドゲルを用いて行われる公知方法と全
く同様の方法により電気泳動を行なうことにより使用さ
れ得るものである。As described above, the nucleic acid electrophoresis gel composition of the present invention is manufactured. When the composition is used for nucleic acid electrophoresis, the gel composition of the present invention is added to the electrophoresis buffer. Agar gel, using a buffer solution containing the same metal ions used at the time of preparation
It can be used by performing electrophoresis by a method completely the same as a known method using a polyacrylamide gel.
このようにして得られた本発明の核酸電気泳動用ゲル
組成物を適用できる核酸としては、細菌、酵母、放射
菌、糸状菌等の各種微生物、動物植物、原生動物、ウイ
ルス等から抽出される遺伝子DNA、プラスミド及びこれ
らDNA、プラスミドの各種制御酵素によって得られる各
種分子量を有するフラグメントであり、また前記生物種
により抽出される各種分子量を有するRNA等があげられ
る。The nucleic acid to which the gel composition for nucleic acid electrophoresis of the present invention thus obtained can be applied is extracted from various microorganisms such as bacteria, yeast, radioactive bacteria, and filamentous fungi, animal plants, protozoa, and viruses. Gene DNAs, plasmids, and fragments having various molecular weights obtained by various control enzymes of these DNAs and plasmids, and RNAs having various molecular weights extracted by the above-mentioned organisms, and the like.
（発明の効果） 本発明による核酸電気泳動用ゲル組成物を用いてλ−
DNA、φ×174−DNA、pBR322−DNA及び各種微生物より抽
出された遺伝子DNAを各種制限酵素を用いて切断したDNA
フラグメントを電気泳動した結果、前述の核酸電気泳動
用ゲルとして要求される諸性質を満足することが明らか
となり、本発明の核酸電気泳動用ゲル組成物が実用上極
めて有用であることが判明した。(Effect of the Invention) The gel composition for nucleic acid electrophoresis according to the present invention is used for λ-
DNA obtained by cutting DNA, φ × 174-DNA, pBR322-DNA and gene DNA extracted from various microorganisms using various restriction enzymes
As a result of electrophoresis of the fragment, it was found that the above-mentioned properties required for the gel for nucleic acid electrophoresis were satisfied, and the gel composition for nucleic acid electrophoresis of the present invention was found to be extremely useful in practice.
また、本発明において使用されるジエランガムは、そ
の特徴的なゲル形成能と形成されたゲルの透明性によ
り、各種微生物・植物細胞培養用のゲルマトリックスと
してすでに利用され、また各種食品製造における増粘剤
分散剤等としての利用の可能性が見出されているが、本
発明のごとく核酸電気泳動用ゲルマトリックスとして利
用できることは本発明者等によってはじめて見出された
ものであり、ジエランガムの新規用途開発の点でも産業
上極めて有意義である。In addition, the dielan gum used in the present invention is already used as a gel matrix for culturing various microorganisms and plant cells due to its characteristic gel-forming ability and transparency of the formed gel, and also increases the viscosity in various food production. Although the possibility of use as a dispersant or the like has been found, the fact that it can be used as a gel matrix for nucleic acid electrophoresis as in the present invention was first discovered by the present inventors, and a novel use of dielan gum In terms of development, it is extremely significant in industry.
（実施例） 次に本発明を実施例を用いて更に詳しく説明する。(Examples) Next, the present invention will be described in more detail using examples.
実施例１ トリスヒドロキシメチルアミノメタン10.8g、ホウ酸
5.5g、0.5M EDTA水溶液4.0ml及び塩化マグネシウム1.0g
を蒸留水に溶解（最終的に１にフィルアップ）し、こ
れにジエランガム粉末5.0gを懸濁した。該懸濁液を120
℃、１、２気圧で５分間加熱し、ジエランガムを完全に
溶解させた。続いて、該溶解液を70〜80℃まで冷却した
後、１％濃度のエチジウムプロマイド水溶液を1ml添加
し、均一に溶解した。このように得られた溶液をポリア
クリルアミド樹脂製の電気泳動用平板型枠に流し込ん
だ。その後、本型枠の一端側（枠の端から１〜2cm）の
ところに、溶液がゲル化した後に、供試反応核酸フラグ
メント含有反応液を添加できるのに十分な容積（60〜80
μ）を形成することのできる櫛をさし込み、室温に静
置した。静置後前記溶液が十分に固化（ゲル化）した
後、前記櫛を注意して抜き取り、スロット含有の本発明
のゲル調製を行なった。こうして調製されたゲルの強度
は約550g/cm2であった。本ゲルを４℃の冷蔵庫中に暗所
下、次の実施例２で使用するまで保管した。Example 1 Trishydroxymethylaminomethane 10.8 g, boric acid
5.5g, 0.5M EDTA aqueous solution 4.0ml and magnesium chloride 1.0g
Was dissolved in distilled water (finally filled up to 1), and 5.0 g of dielan gum powder was suspended therein. Add the suspension to 120
The mixture was heated at 1,2 atm for 5 minutes to completely dissolve the dielan gum. Subsequently, the solution was cooled to 70 to 80 ° C., and 1 ml of a 1% aqueous solution of ethidium bromide was added to uniformly dissolve the solution. The solution thus obtained was poured into a plate form for electrophoresis made of polyacrylamide resin. Thereafter, at one end of the present mold (1-2 cm from the end of the frame), after the solution has gelled, a sufficient volume (60-80) to allow the reaction solution containing the test reaction nucleic acid fragment to be added.
μ) was inserted and allowed to stand at room temperature. After standing, the solution was sufficiently solidified (gelled), and then the comb was carefully pulled out to prepare a slot-containing gel of the present invention. The strength of the gel thus prepared was about 550 g / cm 2 . The gel was stored in a refrigerator at 4 ° C. in the dark until used in the next Example 2.
実施例２ λ−DNA １μｇを全量50μの反応液中に常法に従
って、制限酵素のBan I、Ban II、Ban III、Aat II、Hi
nd III、Sma I、Sac II、Sal I、Hae III、を用いて、
切断し、DNAフラグメントを調製した。上記で調製され
た各制限酵素のDNAフラグメント含有液（50μ）に7.5
mM トリス塩酸、15％フィコール、0.05％ブロムフェー
ルブルー,80mH EDTA含有の反応停止液５μ１を添加、混
合した後、実施例１で調製したプレートのゲルの各スロ
ットに、該各フラグメント溶液を入れた後、ゲル両端を
200V（ボルト）の電圧差で２時間電気泳動した。電気泳
動後、泳動されたフラグメントを含むゲルを切り出し、
暗黒中、紫外線ランプによる照射下に映し出されるフラ
グメントのパターンを写真撮影した。第１図は本撮影に
よって得られた写真を示すものであり、各制限酵素に特
徴的な切断フラグメントのパターンが明確に見出されたExample 2 1 .mu.g of .lambda.-DNA was added in a total amount of 50 .mu.
Using nd III, Sma I, Sac II, Sal I, Hae III,
Cleavage was performed to prepare a DNA fragment. Add 7.5 µl of the DNA fragment containing each restriction enzyme (50 µ) prepared above.
After adding and mixing 5 μl of a reaction stop solution containing mM Tris-HCl, 15% Ficoll, 0.05% Bromfer Blue, and 80mH EDTA, each fragment solution was placed in each slot of the gel of the plate prepared in Example 1. After, gel both ends
Electrophoresis was performed at a voltage difference of 200 V (volt) for 2 hours. After electrophoresis, cut out the gel containing the electrophoresed fragment,
In the dark, the fragment pattern projected under irradiation by an ultraviolet lamp was photographed. FIG. 1 shows a photograph obtained by this photographing, in which a pattern of cleavage fragments characteristic of each restriction enzyme was clearly found.
第１図は本発明の核酸電気泳動用ゲル組成物を用いて、
電気泳動したDNAフラグメントのパターンを示す写真で
ある。FIG. 1 shows the use of the gel composition for nucleic acid electrophoresis of the present invention.
It is a photograph which shows the pattern of the DNA fragment electrophoresed.
Claims (1)
モナス・エロディア（Pseudomonas elodea）が生産する
多糖類の混合物を加熱溶解せしめた後、冷却することに
よりゲル化せしめてなる核酸電気泳動用ゲル組成物。1. A gel composition for nucleic acid electrophoresis obtained by heating and dissolving a mixture of an inorganic metal ion-containing buffer and a polysaccharide produced by Pseudomonas elodea, followed by cooling to form a gel.
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|---|---|---|---|
| JP63205256A JP2699435B2 (en) | 1988-08-18 | 1988-08-18 | Gel composition for nucleic acid electrophoresis |
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|---|---|---|---|
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Publications (2)
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- 1988-08-18 JP JP63205256A patent/JP2699435B2/en not_active Expired - Fee Related
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