JP2677332B2 - ヒト−レラキシンｈ２遺伝子 - Google Patents
ヒト−レラキシンｈ２遺伝子Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、分子クローニング及
びヒト−レラキシンをコードする遺伝子配列の特徴付け
に関する。この発明はさらに、ヒト−レラキシン、プロ
レラキシン及びプレプロレラキシンを製造するための組
換ＤＮＡ技法に関する。 【０００２】発明者等は、オーストラリア特許出願第１
７９０６／８３号(ＰＦ５３５２／８２,１９８２年８月
１２日出願)においてヒト−レラキシンをコードする遺
伝子配列の分子クローニング及び特徴について記載し
た。発明者等はここに、ヒト−レラキシンをコードする
第２の遺伝子を見出した。さらに詳しくは、この発明
は、分離されそして精製された(クローン化された)、プ
ロレラキシン、プレプロレラキシン、及びヒト−レラキ
シンのＡ及び／又はＢ及び／又はＣペプチド鎖をコード
するヒト−遺伝子、該遺伝子の分離及び精製方法、並び
に該遺伝子を宿主細胞に移入してそして該宿主細胞中で
複製せしめる方法に関する。クローン化された遺伝子
は、宿主−発現性の原核性又は真核性遺伝子と融合した
場合、宿主細胞により発現される。従って、この遺伝子
は、治療用ヒト−レラキシンの製造に有用である。 【０００３】この発明はさらに、ペプチドたるヒト−レ
ラキシン、プロレラキシン及びプレプロレラキシン、こ
れらの配列を構成する個々のペプチド鎖、並びにこれら
のペプチドの変形に関する。この発明はさらに、個々の
レラキシン鎖及び上記のその変形をコードする変形され
た遺伝子に関する。この明細書において引用した文献は
後にまとめて記載してある。 【０００４】 【従来の技術】ヒサウ(Ｈisaw)(１９２６)の先駆的な研
究により、哺乳動物のペプチドホルモンであるレラキシ
ンの重要な役割が、その恥骨結合弛緩作用及びその作用
に基づく分娩促進作用により示唆された。レラキシン
は、妊娠中に卵巣の黄体中で合成されここに貯蔵され、
そして分娩に先立って血流中に放出される。卵巣を得る
ことにより、豚[ゼームス(Ｊames)等、１９７７、シュ
ワーベ(Ｓchwabe)等、１９７７]、ラット[ジョーン(Ｊo
hn)等、１９８１]、及びサメ(シュワーベ等、１９８２)
のレラキシンの分離及びアミノ酸配列の決定が可能とな
った。生物学的に活性なホルモンは、ジスルフィド結合
により結合された２つのペプチド鎖(Ａ鎖及びＢ鎖)から
成り、このジスルフィド結合は、２つの鎖間結合と１つ
の鎖内結合から成る。従って、この構造はジスルフィド
の配置においてインスリンに非常に類似しており、この
ことからこれらのホルモンの遺伝子は先祖を共通にする
と推定される(ゼームス等、１９７７、シュワーベ等、
１９７７)。 【０００５】ラットレラキシン及び豚レラキシンのいず
れについてもcＤＮＡクローンの分離に組換ＤＮＡ技法
が適用された[ハドソン(Ｈudson)等、１９８１、ハーレ
イ(Ｈaley)等、１９８２]。なお、オーストラリア特許
出願第１１８３４／８３(ＰＦ２６９６／８２)を参照の
こと。アミノ酸配列情報を基礎にして調製された合成１
１連ヌクレオチドが、卵巣組織から誘導された試料集団
(ライブラリー)中のレラキシンcＤＮＡクローンを同定
するためのcＤＮＡプローブを合成するためのプライマ
ーとして使用された。該プローブはレラキシンcＤＮＡ
配列に関し非常に濃縮されたものである。レラキシン構
造遺伝子は、全体構造においてプレプロインスリンに類
似する単鎖前駆体、すなわちシグナルペプチド／Ｂ鎖／
Ｃペプチド／Ａ鎖をコードすることが見出された。 【０００６】オーストラリア特許出願第１７９０６／８
３号において、発明者等は豚レラキシンのＣペプチドを
基礎にするプローブを用いるヒト−ゲノムライブラリー
からのレラキシン遺伝子の選択について記載した。この
研究において「Ｈ１」と称するゲノムクローンの同定に成
功し、このクローンからヒト−プレプロレラキシンのコ
ード領域全体の構造が決定された。 【０００７】 【発明が解決しようとする課題】この発明は、前記特許
出願において記載した遺伝子構造を確認することを意図
した研究の継続により完成したものである。発明者等
は、Ｃ−ペプチド／Ａ−鎖(アミノ酸６４−１６１)をコ
ードする領域の約３００ヌクレオチドに対応する、すで
に同定されたヒト−Ｈ１−遺伝子のセグメントをプロー
ブとして用いて、妊娠した女性(ヒト)の卵巣組織から得
られたライブラリー中のcＤＮＡクローンを研究した。
陽性のcＤＮＡクローンを分離し、そしてその配列を決
定することにより、このcＤＮＡ配列はすでに確立した
配列とは異なり、そして先行する特許出願に記載したプ
レプロレラキシンとは異なるプレプロレラキシンの１つ
をコードすることを明らかにした。 【０００８】さらに、発明者等は、発明者等の係属中の
オーストラリア特許出願第１７９０６／８３号(ＰＦ５
３５２／８２)に記載したヒト−ゲノムライブラリーか
ら、Ｈ２遺伝子のエクソン１を含有する組換ファージを
分離した。このエクソン１は、Ｈ１−遺伝子のそれと同
様に、シグナルペプチド、Ｂ−ペプチド、及びＣ−ペプ
チドの一部分をコードする領域を含んで成る。 【０００９】発明者等が「Ｈ２」と称してこの明細書に記
載する遺伝子及び発明者等の出願第１７９０６／８３号
に記載されている「Ｈ１」遺伝子はいずれもレラキシン様
活性を有するペプチドを発現するから、これらの一方又
は両者はヒトの生殖組織、例えば卵巣及び胎盤、及び／
又は腸、脳及び皮膚を含む他の組織(これらに限定され
ない)中で発現されると信じられる。 【００１０】卵巣の黄体、並びに脱落膜組織及び胎盤組
織が、レラキシン関連遺伝子が発現する可能性が最も高
い部位である。しかしながら、多くのペプチドホルモン
が広い範囲に分布していることから考えて、レラキシン
遺伝子が脳及び胃腸管を含む非生殖組織においても発現
する可能性が強い。レラキシンは生長因子としての一般
的性質を有し、そして結合組織の性質を変え、平滑筋の
収縮に影響を与えることができる。発明者等は、この明
細書に記載する遺伝子構造及び特許出願第１７９０６／
８３号に記載されている遺伝子構造の両者又は一方が体
内に広く分布しているものと信ずる。発明者等は、これ
らの遺伝子により発現されるレラキシンペプチドが、生
殖中のよく知られているホルモン機能のほかに重要な生
理的役割を演ずることを示唆する。 【００１１】 【課題を解決するための手段】この発明においては次の
略号を用いる。 Ｈ１ :オーストラリア特許出願第１７９０６／８３
に記載されているレラキシン遺伝子であって、ゲノムク
ローンに由来する。 Ｈ２ :この明細書に記載されているレラキシン遺伝
子であって、cＤＮＡクローンに由来する。 ＤＮＡ :デオキシリボ核酸 ＲＮＡ :リボ核酸 cＤＮＡ :相補的(コンプレメンタリー)ＤＮＡ(mＲＮＡ
配列から酵素的に合成される。) mＲＮＡ :メッセンジャーＲＮＡ Ａ :アデニン Ｔ :チミン Ｇ :グアニン Ｃ :シトシン Ｕ :ウラシル 【００１２】ＤＮＡ中のヌクレオチド配列と蛋白質中の
アミノ酸配列とのコード関係は遺伝コードとして全面的
に知られており、次にこれを示す。 【表１】 第１位 第 ２ 位 第３位 (５'末端) (３'末端) Ｕ Ｃ Ａ Ｇ Ｐhe Ｓer Ｔyr Ｃys Ｕ Ｕ Ｐhe Ｓer Ｔyr Ｃys Ｃ Ｌeu Ｓer Ｓtop Ｓtop Ａ Ｌeu Ｓer Ｓtop Ｔrp Ｇ Ｌeu Ｐro Ｈis Ａrg Ｕ Ｃ Ｌeu Ｐro Ｈis Ａrg Ｃ Ｌeu Ｐro Ｇln Ａrg Ａ Ｌeu Ｐro Ｇln Ａrg Ｇ Ｉle Ｔhr Ａsn Ｓer Ｕ Ａ Ｉle Ｔhr Ａsn Ｓer Ｃ Ｉle Ｔhr Ｌys Ａrg Ａ Ｍet Ｔhr Ｌys Ａrg Ｇ Ｖal Ａla Ａsp Ｇly Ｕ Ｇ Ｖal Ａla Ａsp Ｇly Ｃ Ｖal Ａla Ｇlu Ｇly Ａ Ｖal Ａla Ｇlu Ｇly Ｇ 【００１３】上の表中に使用するアミノ酸の略号は次の
意味を有する。 【表２】 フェニルアラニン(Ｐhe) ヒスチジン (Ｈis) ロイシン (Ｌeu) グルタミン (Ｇln) イソロイシン (Ｉle) アスパラギン (Ａsn) メチオニン (Ｍet) リジン (Ｌys) バリン (Ｖal) アスパラギン酸(Ａsp) セリン (Ｓer) グルタミン酸 (Ｇlu) プローリン (Ｐro) システイン (Ｃys) スレオニン (Ｔhr) トリプトファン(Ｔry)アラニン (Ａla) アルギニン (Ａrg)チロシン (Ｔyr) グリシン (Ｇly) 【００１４】表中に示した各３文字コードン、例えばＡ
ＵＧ、ＣＡＵ(デオキシヌクレオチドトリプレット又は
ヌクレオチドトリプレットとしても知られている)は、m
ＲＮＡのトリヌクレオチドに対応し、左側に５'末端を
有し、右側に３'末端を有する。文字は、ヌクレオチド
配列を形成するプリン塩基又はピリミジン塩基を示す。
この明細書に記載するすべてのＤＮＡ配列は鎖状を成し
ており、その配列はmＲＮＡ配列に対応し、但し、ウラ
シル(Ｕ)の代わりにチミン(Ｔ)を含んでいる。 【００１５】この発明を図面と関連させてさらに説明す
る。図１は、pＢＲ３２２中のcＤＮＡクローン、ゲノム
クローンＨ１１、及びＧＴ１０cＤＮＡクローンa〜fに
おける省略された制限地図、及び配列決定方法を示す。
矢印は、末端標識した断片の配列決定の方向を示す(方
法参照)。ＧＴ１０クローンa〜fは後記のごとくＭ１３
ベンターにサブクローニングすることにより配列決定し
た。ヌクレオチドの番号は開始コドンＡＵＧ(１〜３位)
から終結コドン(５５４〜５５６位)に向けて付してあ
る。 【００１６】図２〜図５はヒト−Ｈ２−プレプロレラキ
シン(上)のアミノ酸及びmＲＮＡ配列を、対応するＨ１
の配列(下)と対比したものである。相同性が最大になる
ように重ね合わされており、同一のヌクレオチドには＊
印が付されており、同一のアミノ酸は箱で囲んである。
アミノ酸の番号はＢ−鎖の出発部から付されている(Ｈ
２配列は−１から出発し、Ｈ１配列は＋１から出発す
る)。この位置はＢ鎖の配列の仮定的な出発部を示すも
のであり、関連する豚及びラットのプレプロレラキシン
構造に対する相同性から単純に導いたものである。Ｃペ
プチド中の４５番目のＡlaの下の＊印は、両遺伝子のＧ
／ＣＡ間にイントロンが位置することを示している。 【００１７】図６および図７は、同一のニトロセルロー
スストリップのラジオオートグラフであり、図６はヒト
−卵巣ＲＮＡ、図７はＨ１遺伝子(λＨ７)又はＨ２遺伝
子(λＧＴ１０−a)に対応するλプラックのナサン(Ｎor
thern)ゲル泳動を示し、それぞれＡ：ランダムプライム
６００bpＨ２レラキシンcＤＮＡ断片(７２〜６６０)、
Ｂ：Ｈ２特異的２５連(４８３〜５０７)、Ｃ：Ｈ１−特
異的２５連(４８３〜５０７)、Ｄ：Ｈ１特異的２５連
(２４８〜２７２)をハイブリド形成プローブとして使用
したものである。 【００１８】図８は、ハイブリド形成プローブとしてp
ＢＲ３２２(図１参照)中のＨ２cＤＮＡクローンの断片
を使用したヒト卵巣ＲＮＡのナサン(Ｎorthern)ゲル泳
動の同じニトロセルロースストリップのオートラジオグ
ラフである。 Ａ：コード領域のほとんどに対応する６００bp断片(７
２〜６６０)。 Ｂ：５'非翻訳領域(ヌクレオチド３０のＨinfＩ部位ま
で)。 Ｃ：３'非翻訳領域(ヌクレオチド６６０のＨinfＩ部位
から)。 Ｄ：３'非翻訳領域(ヌクレオチド８５０のＨpaＩ部位か
ら)。 【００１９】図９〜図１０は、Ａ鎖及びＢ鎖のアミノ酸
配列を、２種のヒト−レラキシン、ヒト−インシュリ
ン、及びその他のレラキシン類の間で比較したものであ
る。箱で囲んだ領域は２種のヒト−レラキシン及びその
他のレラキシン類の間で保存されている残基を示す。矢
印は蛋白質が切断される可能性がある部位を示したもの
であり、豚[シュワーベ(Ｓchwabe)等、１９７７、ゼー
ムス(Ｊames)等１９７７]、ラット[ジョーン(Ｊohn)等
１９８１]、サメ[シュワーベ等、１９８２]、及びツノ
ザメ[シュワーベ等、１９８３]のレラキシン類のＡ鎖及
びＢ鎖のアミノ末端残基の蛋白質配列データにより確認
したものである。 【００２０】図２〜図５に示すＨ２−mＲＮＡの配列は
後記の方法により決定した。比較を容易にするために、
Ｈ１配列から誘導されるペプチドについて使用したアミ
ノ酸の番号がこの発明のＨ２−誘導ペプチドについても
維持されている。Ｈ１−プレプロレラキシンの構造は、
豚レラキシン及びラットレラキシンの相同構造と比較す
ることにより、ゲノム配列から導いた。Ｈ２−プレプロ
レラキシンの構造は、Ｈ１の構造並びに豚レラキシン及
びラットレラキシンの構造と比較比することにより導い
た。Ａ及びＢペプチド鎖の構造を、合成、及び子宮収縮
試験において生物学的に活性である物質を生成する鎖連
結(試験管内)により確認した。 【００２１】図２〜図５から、この発明の配列と先行発
明のそれが、類似性と共に有為な相違を有することが明
らかである。注目すべき点は次の通りである。 (１) ３つの主要領域におけるアミノ酸の有意な相違; (a) Ｂ鎖のＮ末端、(b) Ａ鎖のＮ末端、(c) Ｃペプ
チドの中間、 (２) Ｂ鎖及びＣペプチド中の強相同性領域; (a) Ｖal6〜Ｉle47の１２０塩基が同一であり、(b)
Ｐhe101〜Ｓer132の８８〜９０塩基が同一である。 従って、２種の遺伝子は非常に類似しているが、Ｈ２−
遺伝子がたしかに第２の遺伝子であり、単にＨ１遺伝子
のポリモープではないことを示すに十分な相違が存在す
る。 【００２２】Ｈ１−プレプロレラキシンの生体内プロセ
シングの態様は十分には解明されていないが、豚レラキ
シンとの類似性から、シグナルペプチドの切断はＡla-1
−Ｌys1結合において生ずると予想される。同様に、Ｈ
１−Ｃペプチドの切り離しはＬeu32−Ｓer33、及びＡrg
136−Ａrg137において生じ、これにより、それぞれ３２
残基及び２４残基のＨ１−Ｂ鎖及びＨ１−Ａ鎖が生ずる
と予想される(図２〜図５)。 【００２３】Ｈ２−プレプロレラキシンにおいてはＡla
-1がＡspにより置き換えられているので、Ｈ１における
−２位に対応するアラニンの後でシグナルペプチドが切
断されると予想される。Ｈ２−Ｂ鎖／Ｃペプチド結合の
切断はＬeu32の後で生じ３３残基を有するＨ２−Ｂ鎖が
遊離することが、他のすべてのプレプロレラキシンとの
類似性から推定される。Ｈ２−Ｃペプチド／Ａ鎖結合の
切断はＡrg136の後で生じ２４残基のＨ２−Ａ鎖が遊離
することが、ラット−プレプロレラキシンとの類似性か
ら推定される。 【００２４】豚レラキシンについての発明者等の研究に
よれば、豚レラキシンＢ鎖及びＡ鎖中に、生物学的活性
のために必須のすべての要素を含有するコア−配列が存
在する。ヒト−レラキシン鎖についての発明者等の合成
研究においても同様の結果が得れた。これは、後に詳細
に記載する。 【００２５】この発明の１つの観点に従えばヒト−プレ
プロレラキシン発現遺伝子が提供される。特にことわら
ない限り、プレプロレラキシン、プロレラキシン、レラ
キシン、及びシグナルペプチド、Ａペプチド、Ｂペプチ
ド、及びＣペプチドのための遺伝子配列、並びにペプチ
ドそれ自体についての以下の記載は、Ｈ１に関してでは
なくＨ２に関する。さらに詳しくは、この発明のこの観
点に従えば、図２〜図５に示す完全mＲＮＡ(コードン−
２５〜１６０)配列に対応するコード鎖及び相補鎖を含
んで成る、ヒト−プレプロレラキシンの発現のための二
重鎖ＤＮＡ断片が提供される。 【００２６】この発明はさらに、この明細書に記載する
Ｈ２−プレプロレラキシン遺伝子配列の任意のサブユニ
ット、又は該配列もしくはそのサブユニットの同等物を
含む。これらのサブユニットの中には、シグナルペプチ
ド、及びヒト−プレプロレラキシンのＨ２−Ａ、Ｈ２−
Ｂ、及びＨ２−Ｃ鎖(図２〜図５)をコードする個々の構
造遺伝子を含む遺伝子、並びにこれらの鎖の任意の組合
わせをコードする遺伝子、例えばＨ２−Ａ及びＨ２−Ｂ
ペプチド鎖を別個に発現する遺伝子、又は(Ｃ鎖と共に)
プロレラキシンとして発現する遺伝子が含まれる。 【００２７】この発明の他の観点に従えば、ヒト−プロ
レラキシンを発現する遺伝子が提供される。さらに詳し
くは、この発明の上記の観点に従えば、図２〜図５に示
すmＲＮＡ配列の１〜１６０のコドンに対応するコード
鎖及び相補鎖を含んで成るヒト−プロレラキシンを発現
する二重鎖ＤＮＡ断片が提供される。 【００２８】この発明の他の観点に従えば、ヒト−レラ
キシンのＡ,Ｂ及びＣ鎖、又はこれらの鎖の２以上の任
意の組合わせを個別に発現する遺伝子、及び任意の断片
又は前記の鎖の断片の組合わせが提供される。さらに詳
しくは、この発明の上記の観点に従えば、図２〜図５に
示すmＲＮＡ配列の−１〜３２、３３〜１３６、及び１
３７〜１６０のコードに対応するコード配列及び相補配
列を含んで成り、ヒト−レラキシンのＡ鎖及び／又はＢ
鎖及び／又はＣ鎖を個別に発現する二重鎖ＤＮＡ断片が
提供される。 【００２９】上記の遺伝子は、特定されたコドンのほか
に適当な「開始」コドン及び「終結」コドン、すなわち、そ
れぞれＡＵＧ及びＵＧＡ(図２〜図５における−２５及
び１６１のコドン)を含むであろう。 【００３０】当業者はこれらの遺伝子の多形(polymorph
icforms)が存在することを認めるであろう。このような
多形もこの発明に含まれる。 【００３１】この発明はさらに、前記の配列、サブユニ
ット又は同等物、及び対応するＲＮＡ配列、サブユニッ
ト又は同等物の相補体をも包含する。 【００３２】この発明の他の観点に従えば、前記の遺伝
子に対応するデオキシヌクレオチド配列を副で成るＤＮ
Ａ移転ベクターが提供される。 【００３３】前記のごとく、遺伝コードは重複性を有す
る。すなわち、あるアミノ酸は複数のコドンによりコー
ドされる。従って、この発明は、図に示したコドンが同
じアミノ酸をコードする他のコドンによって置き換えら
れているデオキシヌクレオチド配列を包含する。 【００３４】さらに、すでに記載したごとく、天然レラ
キシンのＢ鎖及び／又はＡ鎖構造と構造を異にし、レラ
キシン活性を有するペプチドを製造することができる。
この構造の差異には、天然鎖中の１個又は複数個のアミ
ノ酸の除去及び／又は付加及び／又は置換が含まれる。
従って、この発明はさらに、天然コドンが除去されてお
りそして／又は天然コドンによってコードされるアミノ
酸と異なるアミノ酸をコードするコドンにより置き換え
られておりそして／又は天然配列に追加のコドンが付加
されている前記の遺伝子及びＤＮＡ移転ベクターをも包
含する。 【００３５】この発明の移転ベクターはさらに、特に、
宿主細胞に移入された場合に自己の複製を保障する遺伝
情報を含有する。この宿主細胞には、例えば原核微生物
の細胞及び真核細胞、例えば細菌、酵母、糸状菌の細
胞、哺乳動物の細胞、及びセルラインが含まれる。 【００３６】細菌遺伝学において一般に使用される移転
ベクターの例にはプラスミド及びある種のバクテリオフ
ァージのＤＮＡが含まれる。この発明においてはファー
ジＤＮＡ及び細菌プラスミドの両者を使用した。しかし
ながら他のタイプの移転ベクターを使用することができ
ることが理解できよう。このような移転ベクターを形成
し、そしてこれを微生物に導入する一般的な方法はよく
知られている。 【００３７】この発明はさらに前記の移転ベクターのい
ずれかにより形質転換された原核細胞及び真核細胞を包
含する。非常に親しまれているエッセリヒア・コリ(Ｅs
cherichia coli)が好ましい微生物の１つであるが、他
の任意の適当な微生物を使用することもできる。 【００３８】この発明の他の観点に従えば、ヒト−プレ
プロレラキシンをコードするデオキシヌクレオチド配列
を、制限酵素によって移転ベクターを切断することによ
り調製されたＤＮＡ分子と連結することを特徴とする、
ヒト−プレプロレラキシンをコードするデオキシヌクレ
オチド配列を維持しそして複製するために使用するＤＮ
Ａ移転ベクターの製造方法が提供される。 【００３９】同様にして、適当なデオキシヌクレオチド
から、ヒト−プレプロレラキシンをコードするデオキシ
ヌクレオチド配列、並びにヒト−レラキシンのＡ鎖及び
Ｂ鎖をコードするデオキシヌクレオチド配列を維持し、
そして複製するために使用するＤＮＡ移転ベクターを調
製することができる。 【００４０】Ａペプチド鎖及びペプチド鎖、並びにプロ
レラキシン及びプレプロレラキシンは、通常の遺伝子発
現方法により、すなわち適切に導入された移転ベクター
を含有する細胞を増殖せしめ、そして該細胞により生産
された目的ペプチドを分離し、そして精製することによ
り製造することができる。 【００４１】この発明はさらに、上記の方法により調製
された、ヒト−プレプロレラキシンをコードするデオキ
シヌクレオチドを含んで成る発現移転ベクターにより形
質転換された細胞を培養することを特徴とする、Ｃ末端
配列としてヒト−プレプロレラキシンのアミノ酸配列を
含みそしてＮ末端配列として真核性又は原核性蛋白質の
一部分を含んで成る融合蛋白質の製造方法を包含する。
同様にして、ヒト−プロレラキシン及び／又はヒト−レ
ラキシンのＡ鎖及び／又はＣ鎖を含んで成る融合蛋白質
を製造することができる。こうして得られた融合ペプチ
ド生成物は、所望のペプチドが宿主に特異的な原核性又
は真核性蛋白質の一部に連結された融合蛋白質の形で存
在するであろう。このような融合蛋白質も又この発明を
構成する。 【００４２】この発明はさらに、前記の方法により調製
された前記のヒト−プロレラキシンをコードするデオキ
シヌクレオチド配列を含んで成る発現移転ベクターによ
り形質転換された細胞を、ヒト−プロレラキシンをコー
ドする前記の配列の発現に適する条件下で培養し、そし
て前記細胞の分解物又は培養液からヒト−プロレラキシ
ンを精製することを特徴とする、Ｃペプチドにより相互
に分離されたＡペプチド及びＢペプチドを含んで成るヒ
ト−プロレラキシンの合成方法をも包含する。 【００４３】任意の適当な公知の切断法により、融合生
成物から目的ペプチドを回収することができる。 【００４４】すでに記載したごとく、コドンの除去／置
換／付加により移転ベクターを変形することができ、こ
のような変形により変形された融合ペプチドが生ずる。
このようにして適当な変形を行うことにより、融合ペプ
チドの切断、例えばＢ／ＣもしくはＣ／Ａ鎖結合部にお
ける切断を促進し、又は次に行う化学的もしくは生物学
的処理の間におけるペプチド鎖の挙動を変えることがで
きる。 【００４５】前記のごとく、この発明はさらにヒト−レ
ラキシン、プロレラキシン及びプレプロレラキシンを提
供する。 【００４６】レラキシンは、インスリンの製造のために
現在知られている任意の方法により別々のＡ鎖及びＢ鎖
を直接結合することにより製造することができる。又、
インスリンの場合と同様に、前記のようにして製造され
たレラキシンのＡペプチド及びＢペプチド上のスルヒド
リル基を酸化するか、又は他の方法で転換して該Ａペプ
チド及びＢペプチド間にジスルフィド架橋を形成させ、
そして次にＣペプチドを除去することにより、例えばＣ
ペプチドとＡ及びＢペプチドとの間の結合に特異的な酵
素的加水分解により除去することにより、プロレラキシ
ンからレラキシンを製造することができる。 【００４７】従って、この発明はさらに、レラキシンの
Ａ鎖及びＢ鎖(完全な長さにおいて、又は短縮されたも
しくは変形された形において)を、ヒト−インスリンの
Ａ鎖及びＢ鎖の結合のために知られている方法によって
結合せしめることから成るヒト−レラキシンの合成方法
を提供する。この方法の１つは、Ｓ−スルホン化された
Ａ鎖及びＢ鎖の混合物を還元し、そして次にこの混合物
を空気中で酸化することから成る。 【００４８】発明者等はさらに、Ａ鎖及びＢ鎖の一方又
は両方がＳ−スルホ形ではなくＳ−チオエチル−cys誘
導体の形である場合に上記方法の効率が改良されること
を見出した。 【００４９】発明者等は、オーストラリア特許出願第１
５４１３／８３号(ＰＦ４３８５／８２)において、生物
学者活性の有意な喪失を伴わないでレラキシンのＡ鎖及
びＢ鎖の一方又は両者のアミノ末端及び／又はカルボキ
シ末端を短縮することができ、これにより結合収率を改
良することができることを示した。 【００５０】この発明の他の観点に従えば、短縮されそ
して／又は変形された天然Ｂペプチド鎖及び／又はＡペ
プチド鎖により本質上構成されるヒト−レラキシン類似
体が提供される。 【００５１】この発明の上記の観点に従えば、短縮され
そして／又は変形されたＢペプチド鎖及び／又はＡペプ
チド鎖を形成し、そして次に上記の任意の方法によって
前記のペプチド鎖を結合せしめる段階を含んで成るヒト
−レラキシン類似体の製造方法が提供される。 【００５２】豚及びヒト−レラキシン(Ｈ１)を用いた発
明者等の研究により、レラキシン活性はＡ(１０〜２４)
から成る短いＡ鎖及びＢ(１０〜２２)からなる短いＢ鎖
により生ずることが示された。もっとも、期待される実
際的な最小鎖はＡ(４〜２４)及びＢ(４〜２３)である。
ペプチドＡ(４〜２４)−Ｂ(１〜２５)がレラキシン活性
を有することはすでに知られている。 【００５３】一般に、この発明のレラキシン構造(Ｈ２)
においては、Ａ鎖はＡ(１〜２４)ないしＡ(１０〜２４)
の範囲で変化することができ、Ｂ鎖はＢ(−１〜３２)な
いしＢ(１０〜２２)の範囲で変化することができる。 【００５４】好ましい組合わせは 【化１６】から誘導される。 【００５５】この発明におけるＢ鎖及び／又はＡ鎖の変
形は、前記の「遺伝的」変形、及びこの発明の結合に先立
つＢ鎖及び／又はＡ鎖の化学的変形(完全な長さにおけ
る又は短縮された形における)が含まれる。２つのタイ
プの変形を単独で又は組合わせて用いることができる。 【００５６】第１のタイブの変形は、天然の又は短縮さ
れたＢ鎖及び／又はＡ鎖における１個又は複数個のアミ
ノ酸の変形に関する。一般にこのような変形にはそれ自
体公知の方法による１個又は複数個のアミノ酸上の活性
基の保護が含まれ、そして所望により、保護基は(変形
された)Ａ鎖およびＢ鎖の結合の後除去される。このよ
うなタイブの変形の例には、Ｎ末端アミノ基を含む遊離
アミノ基のアセチル化、ホルミル化もしくはこれらと同
様の保護、Ｃ末端基のアミド化、又はヒドロキシル基も
しくはカルボキシル基のエステル形成が含まれる。ホル
ミル基が容易に除去される保護基の典型例である。 【００５７】第２のタイブの変形には、Ｂ鎖及び／又は
Ａ鎖中の１個又は複数個の天然アミノ酸の他のアミノ酸
(Ｄ−型の天然アミノ酸を含む)による置換が含まれる。
この一般的タイブの変形には又、鎖からの天然アミノ酸
の除去、又は１個又は複数個のアミノ酸の鎖への付加が
含まれる。このような変形の目的は、生成物、すなわち
レラキシンもしくはその類似体の活性を維持しながらＡ
鎖及びＢ鎖の結合収率を上昇せしめること、又は所定の
結合収率において生成物の活性を上昇せしめ又は変える
ことにある。このような変化は、レラキシン遮断効果又
はレラキシン拮抗効果を有する合成類似体の製造にも適
用することができよう。 【００５８】第１のタイブの変形の特定の例はホルミル
基の付加によるＢ２のトリプトファン残基の変形であ
る。第２のタイブの変形の特定の例は、Ｂ２４のメチオ
ニンのノルロイシン(Ｎle)、バリン(Ｖal)、アラニン
(Ａla)、グリシン(Ｇly)、セリン(Ｓer)又はホモセリン
(Ｈomo Ｓer)による置換である。 【００５９】上記の観点において、この発明は、この発
明に従って上記のごとく変形された天然の又は短縮され
たＢ鎖及び／又はＡ鎖から形成されるヒト−レラキシン
類似体を包含する。 【００６０】Ａペプチド鎖及びＢペプチド鎖、並びにさ
らにプロレラキシン及びプレプロレラキシンは通常の遺
伝子発現法により、すなわち適当に形成された移転ベク
ターを含有する微生物を増殖せしめ、そして該微生物に
より生産された目的ペプチドを分離しそして精製するこ
とにより製造することができる。こうして得られたペプ
チド生成物は、目的ペプチドが原核性蛋白質の一部と連
結されている融合蛋白質の形で存在することができる。 【００６１】 【実施例】次に、実験方法及びそれにより得られた結果
を記載することによりこの発明をさらに具体的に説明す
る。方法及び材料 メッセンジャーＲＮＡの分離及びcＤＮＡのクローニン
グ 子宮外妊娠の治療のための外科処置中に得たヒト−卵巣
組織をドライアイス上で急速に凍結し、そしてチルグウ
ィン(Ｃhirgwin)等１９７９、の方法に従って５Ｍグア
ニジウムチオシアナート(メルク)中にＲＮＡを分離し
た。ポリ−Ａ+ＲＮＡを、ウイッカーズ(Ｗickers)等、
１９７８、の方法により、２重鎖ＤＮＡに転換し、そし
てホモポリマーＧ／Ｃテーリング法によってpＢＲ３２
２プラスミドベクター[チャン(Ｃhang)等、１９７８]に
クローニングし、又はλＧＴ１０ベクター[ヒューン(Ｈ
uynh)等、１９８３]を用いるラムダパッキング法により
クローニングした。発明者等の経験においては、pＢＲ
３２２法による形質転換効率(１０4の組換体／μgのcＤ
ＮＡ)はラムダ法(１０6以下の組換体／μgのcＤＮＡ)に
比べて低かった。 【００６２】ハイブリド形成プローブの調製 子牛胸腺ＤＮＡの変性したランダムプライマーを用い
て、種々のＤＮＡ断片上でのプライム合成により放射能
標識プローブを調製したハドソン等(１９８３)、テイラ
ー等(１９７６)。ＤＮＡテンプレート(１００〜２００n
g)をランダムプライマー(１μg)と共に２０μlの水中で
２分間煮沸することにより変性した。５０mＭ Ｔris−
ＨＣl pＨ８.０、５０mＭ ＮaＣl、１mＭ ＤＴＴ、１０
mＭ ＭgＣl2、５ユニットのＥ.コリ(Ｅ.coli)ＤＮＡポ
リメラーゼ１[クルノウ(Ｋlenow)フラグメント]、５０
０μＭずつのdＣＴＰ、dＧＴＰ、dＴＴＰ、及び０.３μ
Ｍのα−(32p]−dＡＴＰ(約３０００Ｃi／ミリモル、ア
マーシャム)を含有する３０μlの反応混合物を加えるこ
とにより合成を開始した。３７℃にて３０分間インキュ
ベートした後、０.３Ｍ ＮaＣl、１０mＭ Ｔris−ＨＣ
l、pＨ８.０、１mＭ ＥＤＴＡを含有する緩衝液３００
μl中に希釈することにより反応を停止し、そして前記
緩衝液中セファテックスＧ５０のカラム(１cm×５cm)を
通した。放射能標識されたプローブをボイドボリウムに
おけるピーク分画から集め、そしてtＲＮＡ(１０μg)を
担体として用いて２容量のエタノールにより−２０℃に
て２時間沈澱せしめた。 【００６３】特異的cＤＮＡクローンの選択 ヒト−卵巣cＤＮＡクローンバンクからレラキシン特異
的配列をスクリーニングするために、すでに同定されて
いるヒト−Ｈ１遺伝子のセグメントをプローブとして使
用した。これは、Ｃペプチド、Ａ鎖のアミノ酸６４から
終結コドンまで及び３'非翻訳領域の８０塩基をコード
する４００ヌクレオチドのセグメントに対応する。pＢ
Ｒ３２２ライブラリーから１個の陽性cＤＮＡクローン
を分離し、そして配列決定した。λＧＴ１０ライブラリ
ーから２３の特異的組換体を分離したが、これらの内６
個のみを完全ヌクレオチド配列分析にかけた。 【００６４】ＤＮＡ分析 配列決定の方針及びcＤＮＡクローンの省略された制限
地図を図１に示す。pＢＲ３２２中の組換プラスミドを
制限酵素ＨpaII(Ｐ)、ＨinfＩ(Ｆ)又はＴaqＩ(Ｔ)を用
いて消化し、そして逆転写酵素及び適当なα−標識デオ
キシヌクレオチドトリホスフェート(ＨpaII及びＴaqＩ
のためにdＣＴＰ、ＨinfＩのためにdＡＴＰ)を用いて末
端標識した。断片を第２の制限エンドヌクレアーゼによ
り内部的に切断し、そして次に８％ポリアクリルアミド
ゲル上での電気泳動により分離し、そしてマクサム(Ｍa
xam)及びジルバート(Ｇilbert)等の化学的分解法(１９
７７)により配列決定した。λＧＴ１０中のcＤＮＡクロ
ーンは、ＥcoＲＩ制限断片をＭ１３mp９にサブクローニ
ングし、そしてサンガー(Ｓanger)等(１９７７)により
記載された方法を用いて配列決定した。 【００６５】サザン(Ｓouthern)及びナサン(Ｎorthern)
ゲル分析 制限エンドヌクレアーゼ切断の後、精製されたゲノムＤ
ＮＡについてサザン法(１９７５)により、又は精製され
たＲＮＡについて実施した。プローブとして使用したＤ
ＮＡ断片は、少量のフランク配列を有していたがＨ１−
ゲノムクローンのエクソンＩ又はエクソンIIのいずれか
に特異的であった。これらのフラグメントは、エクソン
Ｉのプローブの場合にはλＨ７クローンの５００bpＡlu
Ｉ断片を、エクソンIIの場合には４００bpのＥcoＲＩ−
ＡvaII断片を、Ｍ１３mp８にサブクローニングすること
により得た。Ｈ２cＤＮＡクローンからのプローブは、
ＨinfＩで消化し、そしてＡspＩから終結コドンまでの
コード領域及び３'非翻訳領域の１１０塩基に対応する
３００bp二重鎖(図１)を分離するとにより得た。オリゴ
ヌクレオチドプローブは、ビューケージ(Ｂeaucage)及
びカルサース(Ｃaruthers)のホスフィット法により合成
し、そしてγ−32Ｐ−ＡＴＰによりＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼを用いて末端標識した。ハイブリド形成条件
はＧ＋Ｃの含量を基礎にして計算した。 【００６６】Ｈ２ゲノムクローンの分離しヌクレオチド
配列分析 ラウン(Ｌawn)等(１９７８)のヒト−ゲノムラムダライ
ブラリーをすでに記載されている方法[ハドソン(Ｈudso
n)等、１９８３]によりスクリーニングした。但し前記
のように、プローブのためにＨ１ゲノムクローンのエク
ソンＩ及びIIに対応するＤＮＡ断片の混合物を使用し
た。陽性ファージをl規模の液体培養中に増殖せしめ、
ＤＮＡを分離し、そして制限エンドヌクレアーゼで消化
し、そしてエクソンＩ及びIIのプローブを用いてマッピ
ングした。４kbのＥcＲＩ断片が全エクソンＩコード領
域を含有していることが見出され、これによりこのクロ
ーンが相同のＨ１遺伝子構造と区別された。このクロー
ンをＭ１３mp８にサブクローンし、そしてマクサム及び
ジルバートの方法(１９７７)により配列決定した。Ａva
Ｉにより消化した後、コード領域を包含する断片を末端
ラベルし、そして第２の制限酵素(ＨpaII又はＨinfＩ)
により内部的に切断し、配列分析に適当な断片を生成せ
しめた。 【００６７】cＤＮＡクローンの分離 ヒト−黄体試料を、子宮外妊娠の外科的処置の結果とし
て、又は帝王切開におけるレテクトミー(lutectomy)か
ら得た。１つの黄体から分離したＲＮＡからpＢＲ３２
２中にcＤＮＡライブラリーを作成し、約３００の特異
的組換体を得た。このライブラリーをＨ１−cＤＮＡプ
ローブによりスクリーニングすることにより、ヒト−レ
ラキシンＩに相同な配列を有する１つの組換体が明らか
になった。このような少量の卵巣組織からさらに多くの
組換体を得るために、λＧＴ１０クローニング系(ヒュ
ーン等、１９８３)を用いてcＤＮＡライブラリーを作成
した。レラキシン特異的プローブを用いてスクリーニン
グした結果、２３の特異的なcＤＮＡを同定し、この内
６個を図１に示すように特徴付けた。ヌクレオチド配列
分析により６個のcＤＮＡ組換体のすべてが同じレラキ
シン構造遺伝子の断片をコードしていた(図２〜図５)
が、この配列はすでに報告されているゲノムクローン
[ハドソン(Ｈudson)等、１９８３]と異なっていた。こ
の新規な配列は、ゲノムＤＮＡ中に観察されている第２
のヒト−レラキシン遺伝子(Ｈ２)に対応すると予想され
る。驚くべきことに、pＢＲ３２２及びλＧＴ１０中のc
ＤＮＡクローンのサイズ(それぞれ、１８００bp及び１
９００bp)はクローニング操作中に大きな転写生成物が
合成されたことを示すが、cＤＮＡクローンのいずれも
が３'末端にポリアデノシン配列を有していなかった。
これら２つのcＤＮＡクローンは３'末端に重複配列を有
しており、これらが同一のmＲＮＡ構造から誘導された
ことが確認された。ポリＡ−テールが存在しないのは、
クローニング操作中に二重鎖形成転写反応が早く停止し
たためか、Ｓ１ヌクレアーゼの過剰な分解のためであろ
う。 【００６８】第２の遺伝子に対応するゲノムクローンの
分離 λＨ７レラキシンクローンのエクソンＩ又はIIに特異的
な混合プローブを用いることにより、ラウン(Ｌawn)等
(１９７８)のヒト−ゲノムライブラリーからの１０8個
の組換ファージを厳密にスクリーニングして１６の陽性
ファージを得た。小規模な制限地図分析により、これら
の組換体ファージの内１４個がすでに報告されているＨ
Ｉレラキシン遺伝子に対応した[１１個がλＨ７ゲノム
クローンと同じであり、３個がハドソン等(１９８３)に
よりすでに報告されているようにＨ１遺伝子の別のゲノ
ムクローンであるλＨ５と同じである]。しかし、他の
２個の組換体ファージは同じであり、そして図１に示す
Ｈ２レラキシン遺伝子に特異的な制限パターンを有して
いた。組換体の比率が異常なのは、もとのゲノムライブ
ラリーにおけるこれらの比率のためか、又は増幅中の選
択的増殖のためである。この新規な組換体ファージ(λ
Ｈ１１)を、λＨ７クローンのエクソンＩ又はIIに対応
する別々のプローブを用いてサザンブロット分析するこ
とによりλＨ１１がエクソンＩコード領域のみを含有す
ることが明らかになった。ラウン等(１９７８)のライブ
ラリー、又は他のライブラリー[Ｒ．クラウフォード(Ｃ
rawford)、未発表]中でＨ２−レラキシン遺伝子に対応
する全長ゲノムクローンを見出す試みはまだ成功してい
ない。λＨ１１のレラキシンコード領域のヌクレオチド
配列は図２〜図５に示すcＤＮＡクローン中に観察され
る配列と同じであった。イントロンが、λＨ７ゲノムク
ローンの場合と全く同じ位置でコード領域を中断してお
り、これらの遺伝子が進化のある時点での遺伝子の二重
化により生じたことが示唆される。 【００６９】ナサン(Ｎouthern)ゲル分析 子宮外妊娠の外科処置中に、又は帝王切開の手術中に異
なる個体から得たヒト−黄体の幾つかの試料からＲＮＡ
を分離した。いずれかのレラキシン遺伝子のコード領域
からのプローブを用いるナサンゲル分析により、試験し
た５個のヒト−卵巣ＲＮＡ試料中に、約１０００bp及び
２０００bpのサイズの２つの大mＲＮＡが存在すること
が明らかになった(図６および図７)。試験したＲＮＡ試
料中に小さい方のmＲＮＡは２〜３倍多く、この結果は
分析においてＨ１−レラキシンに対応するプローブを用
いるかＨ２−レラキシンに対応するプローブを用いるか
によって変わらず、この実験条件下では高い交差ハイブ
リド形成が生ずることが示された。これら２種のmＲＮ
ＡがＨ１遺伝子及びＨ２遺伝子のそれぞれの生成物のい
ずれを代表するかを区別するため、２つのレラキシン遺
伝子の間で相同性が最小(６０％)の領域(図２〜図５に
おける残基１３７〜１４４)にわたるオリゴヌクレオチ
ドプローブを合成した。これらの合成２５連ヌクレオチ
ドを、γ−32Ｐ−ＡＴＰを用いるキナーゼ反応により放
射性標識し、そしてＨ１遺伝子又はＨ２遺伝子に特異性
を供することが示される条件下でハイブリド形成プロー
ブとして使用した(図６および図７)。これらの放射能標
識したプローブを用いるナサンゲル分析により、いずれ
のmＲＮＡもＨ２遺伝子生成物に対応することが明らか
になった。これらの特異的プローブを用いてＨ１遺伝子
からの転写生成物プローブを用いてＨ１遺伝子からの転
写生成物を検出することはできなかった。もっとも、低
いレベルの発現(Ｈ２レベルの５％未満)を同定すること
は困難である。Ｈ２遺伝子からの異なるmＲＮＡ転写生
成物を分析するために、２つの大Ｈ２cＤＮＡクローン
のセグメントから、コード領域、５'非翻訳領域、及び
３'非翻訳領域に対応する特異的プローブを調製した(図
８)。大きい方のmＲＮＡ転写生成物(約２kbの長さ)が選
択的に両cＤＮＡクローン由来の３'非翻訳領域セグメン
ト(終結コドンから約１００塩基の位置から)とハイブリ
ド形成した。cＤＮＡクローンのヌクレオチド配列(停止
コドンから１４０塩基)中にポリアデニル化シグナルが
存在する可能性があり、そしてこの領域は豚−レラキシ
ンポリアデニル化部位に対する相同性を有する。しか
し、短い方のmＲＮＡ生成物がこの位置の近くでポリア
デニル化されているか否かの問題は、両mＲＮＡに対応
する全長cＤＮＡクローンが分離され、そして特徴付け
られるまでは解決することができない。Ｈ２遺伝子のゲ
ノム配列が不明である限り、２つのmＲＮＡ転写生成物
を生成する機構を明らかにすることはできない。コラー
ゲン遺伝子及びβ−ミクログロブリン遺伝子と同様に、
一次ＲＮＡ転写生成物の切断が他のポリアデニル化部位
において生ずる可能性がある。他方、カルシトニン遺伝
子、生長ホルモン遺伝子及びα−クリスタリン遺伝子に
おいても生ずるような他のスプライシング機構を除外す
ることはできない。 【００７０】Ｈ２遺伝子によりコードされるプレプロレ
ラキシンの一次構造 ヒト−プレプロレラキシン遺伝子の生体内プロセシング
の態様はまだ十分には理解されておらず、豚−及びラッ
ト−プレプロレラキシンとの類似性(図９〜図１０)によ
り推定するほかない。図９〜図１０において、Ｈ１遺伝
子及びＨ２遺伝子の予想されるＡ鎖及びＢ鎖構造が、他
のレラキシン類及びヒト−インスリンのそれに重ね合わ
せてある。Ｈ１におけるシグナルペプチドの切断は、Ａ
la−１、−２もしくは−４などの短い側鎖残基の後で、
又はＳer−６の後で生ずると予想されている(ハドソン
等、１９８３)。Ａla−１の後での切断は、豚プレプロ
レラキシン及びヒト−プレプロインスリンとの相同性と
一致する。同様に、Ｈ２−シグナルペプチドの切断は、
Ａla−４又はＳer−６の後で生ずる可能性もあるが、前
記の類似性からＡla−２の後で生ずると予想される。ラ
ット−及び豚−プロレラキシンとの類似性により、Ｂ鎖
／Ｃペプチド結合の切断は、Ｈ１前駆体及びＨ２前駆体
のいずれにおいてもＬeu３２の後で生ずるであろう。し
かしながら、いずれのヒト−レラキシンＢ鎖も２９−３
０位に保存されたジ塩基配列Ｌys−Ａrgを有し、この配
列が他のプロホルモンたとえばプロインスリンにおける
プロセシング部位であることが知られており、この部位
での切断を除外することはできない。このことを確定す
るためには、妊婦の黄体から分離したレラキシンの直接
アミノ酸配列分析を行うことが必要であろう。ともか
く、Ｈ１−Ｂ鎖構造の長さは３２残基(Ｌys１〜Ｌeu３
２)でありＨ２−Ｂ鎖のそれは３３残基(Ａsp−１〜Ｌeu
３２)である可能性が最も強い。Ｈ１−プロレラキシン
のＣペプチド／Ａ鎖の切断は、４個の塩基性残基中のＡ
rg１３６の後で生ずると予想されている(ハドソン等、
１９８３)。１３７−１３８におけるＡrg−Ｐroイミド
結合は蛋白質分解に対して耐性を有するからである。Ｈ
２−プロレラキシンは同じ４塩基性残基の配列を有し、
そしてＡrg１３６の後で同様のプロセシング段階が生
じ、これによりＨ１及びＨ２のレラキシンＡ鎖の長さは
いずれも２４残基であろう。 【００７１】Ｈ２−遺伝子の生物学的活性 合成された豚レラキシンペプチドについての先行する研
究において示されるように、豚−レラキシンＡ鎖及びＢ
鎖中には、生物学的活性のために必須の要素であるコア
−配列が存在する。発明者等のＨ１−レラキシンペプチ
ドについての合成研究により、完全Ｈ１−Ａ鎖(Ａrg１
３７〜Ｃys１６０)と短縮された形のＨ１−Ｂ鎖(Ｌys１
〜Ｓer２５)との組み合わせにより製造された物質が生
物学的活性を有することが示された(ハドソン等、１９
８３)。ペプチド合成を用いるＨ１−及びＨ２−遺伝子
構造についての研究により、いずれの遺伝子も、ラット
を用いる子宮収縮測定において生物学的活性を有する形
のレラキシンをコードすることが示された。 【００７２】変性させたヒト−レラキシンＨ２(hＲＬ
Ｘ)Ａ(１〜２４)−Ｂ(−１〜２４)の合成 (i) ヒト−レラキシンＡ鎖、Ｈ２−hＲＬＸ Ａ(１〜２
４)の合成 前記のcＤＮＡクローンのヌクレオチド配列から推定さ
れたヒト−レラキシンＡ鎖の１〜２４の残基に対応する
アミノ酸配列を、メリフィールド(Ｍerrifield)[例え
ば、バラニー(Ｂarany)Ｇ．及びメリフィールドＲ.Ｂ.,
Ｔhe Ｐeptides,Ｅ.Ｇross及びＪ.Ｍeienhofer,アカデ
ミック・プレス,ニューヨーク,１〜２８４頁,１９８０
年]により記載された一般的原理による固相法により合
成した。Ｎ−α−tert−ブチルオキシカルボニル＊−４
−メチルベンジル−Ｌ−システイン(＊ＢＯＣと略す)
を、タム(Ｔam)等の方法(Ｓynthesis１２,９５５〜９５
７,１９７９年)を用いて、フェニルアセトアミドメチル
(ＰＡＭ)結合を介して１％架橋ポリエチレン樹脂に、
０.３０ミリモル／g樹脂のレベルでカップリングせしめ
た。ＢＯＣ−Ｌ−ＣＹＳ−ＰＡＡＭ樹脂(８.０g)を、ベ
ックマンモデル９９０ペプチドシンセタイザーの反応容
器に入れ、そしてそれぞれ適当な保護アミノ酸を段階的
に付加することによって残基２３から１までのアミノ酸
配列を組み立てた。各アミノ酸のアミノ末端ＢＯＣ保護
基は、塩化メチレン中３５％トリフルオロ酢酸により３
０分間樹脂を処理し、そして次に、塩化メチレン中５％
ジイソプロビルエチルアミンにより１５分間中和するこ
とにより除去した。それぞれの処理の後、塩化メチレン
により樹脂を十分に洗浄した。配列中の次のアミノ酸
(α−アミノ基がＢＯＣ基により適当に保護されてお
り、必要により側鎖官能基が適当に保護されている、)
を、ジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)を使用し
ながら樹脂にカップリングせしめた。樹脂を塩化メチレ
ン中アミノ酸と共に１０分間撹拌し、その後で塩化メチ
レンに溶解したＤＣＣを導入した。各カップリングのた
めに２.５モル過剰(６.０ミリモル)のアミノ酸及びＤＣ
Ｃを使用した。１時間撹拌した後、反応混合物から樹脂
のサンブルを取り出し、そしてカイゼル(Ｋaeser)等の
ニンヒドリン法(Ａnal.Ｂiochem.,３４,５９５〜５９
８,１９７０年)を用いて遊離アミノ基の存在を試験し
た。ニンヒドリン反応が陰性であってカップリングが完
結したことが示されれば、ＢＯＣ脱保護、中和及び次の
アミノ酸のカップリングによって反応サイクルを継続し
た。ニンヒドリン試験陽性の場合には追加のアミノ酸及
びＤＣＣを用いてカップリング反応を反復した。 【００７３】側鎖官能基を有するアミノ酸は次の保護誘
導体として使用した。すなわち、Ｎ−α−ＢＯＣ−２,
６−ジクロロベンジル−Ｌ−チロシン、Ｎ−α−ＢＯＣ
−ξ−クロロベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン、
Ｎ−α−ＢＯＣ−Ｌ−セリンＯ−ベンジルエステル、Ｎ
−α−アミルオキシカルボニル−ＮG−トシル−Ｌ−ア
ルギニン、Ｎ−α−ＢＯＣ−Ｌ−スレオニンＯ−ベンジ
ルエーテル、Ｎ−α−ＢＯＣ−Ｓ−エチルメルカプト−
Ｌ−システイン(Ａ−鎖配列位置１５、１１及び１０の
システイン)である。１〜２４ペプチド配列の組立てに
続き、アミノ末端アルギニン上の最後のＢＯＣ基を、脱
保護中和サイクルを用いて除去し、そして真空中でペプ
チド樹脂を乾燥した(ペプチド−樹脂の重量１３.０g)。
ペプチド−樹脂の一部分(２g)を、アニソール(２ml)の
存在下で０℃にて３０分間無水弗化水素(ＨＦ)により処
理した。オイルポンプ真空下でＨＦを急速に除去するこ
とにより、樹脂−ペプチドと弗化水素(ＨＦ)との合計接
触時間を最小(７０分以下)に保持した。次に、樹脂−ペ
プチドを酢酸エチルにより数回洗浄することにより過剰
のアニソールを除去し、１Ｍ酢酸によりペプチドを抽出
し、そして溶液を凍結乾燥した。粗ペプチド(１０，１
１及び１５位のシステインはなおＳ−チオエチル誘導体
として保護されている)の収量は３９２mgであった。粗
ペプチドの最初の精製は０.１Ｍ酢酸中のバイオゲルＰ
１０を用いるゲル濾過により行った。分子量約３０００
に対応する位置でカラムから溶出した最大ピークを示す
分画を集め、そして凍結乾燥した。このペプチドのサン
プルのアミノ酸分析により、１〜２４配列のすべてのア
ミノ酸が正しい比率で存在することが示された。[Ｓ−
チオエチルＣys10,11,15]−hＲＬＸ Ａ(１〜２４)ペプ
チドの前記以後の精製は、ウォーターズＣ−１８ボンダ
パックカラムを用いる調製用逆相ＨＰＬＣにより、０.
１％ＴＦＡ−水−アセトニトリル溶剤系を用いて行っ
た。ゲル濾過により精製したペプチドのサンプル(８０m
g)を、ドゥー(Ｄu)等[Ｓcientia Ｓinica,１０Ｉ,８４
〜１０４(１９６１年)]に記載された方法に従って、亜
硫酸ナトリウム及びナトリウムテトラチオネートの混合
物を用いて(合計反応時間を３時間として)Ｓ−スルホン
化した。Ｓ−スルホン化中に生成した沈澱を濾過し、そ
して沈澱及び上澄液の両者を４℃にて４８時間蒸留水に
対して透析した。透析袋の内容物を凍結乾燥することに
より、上澄液から３９.５mg、Ｓ−スルホン化反応中に
生じた沈澱から２０.３mgのペプチドを得た。「可溶性」
[Ｓ−スルホＣys10,11,15,24]hＲＬＸ Ａ(１〜２４)ペ
プチドのサンプルを０.１％ＴＦＡ−水／アセトニトリ
ル溶媒系を用いて、ウォーターズＣ−１８ボンダパック
カラム上調製用逆相ＨＰＬＣにより精製した。 【００７４】(ii) 短縮されたヒト−レラキシンＢ−
鎖、Ｈ２−hＲＬＸ Ｂ(−１〜２４)の合成 Ｈ２−ヒト−レラキシンＢ−鎖の−１〜２４の残基に対
応するアミノ酸配列を前記の方法に従って合成した。こ
の合成は、０.５ミリモルＭet／gの負荷量のＮ−α−te
rt−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−メチオニン−Ｏ−ベ
ンジル−Ｌ−セリン−フェニルアセトアミド−メチルポ
リスチレン樹脂６.０gを用いて開始した。Ａ鎖の合成に
おいて使用した側鎖保護基を、Ｂ鎖の合成にも使用し
た。これには１０及び２２位の両システインのＳ−エチ
ルメルカプト誘導体が含まれる。４及び５位のグルタミ
ン酸残基及び−１位のアスパラギン酸残基はＮ−α−Ｂ
ＯＣ−ベンジルエステル誘導体として加えた。１８位の
グルタミンはＤＭＦ中のＮ−α−ＢＯＣ−Ｌ−グルタミ
ン−p−ニトロフェニルエステルを用いる活性エステル
法によりカップリングせしめた。２位のトリプトファン
のカップリングの後、トリフルオロ酢酸脱保護剤及びこ
れに次いで用いる塩化メチレン洗浄液に０．１％インド
ールを加えた。アミノ末端アスパラギン酸残基からＢＯ
Ｃ基を除去し、真空乾燥した後のペプチド−樹脂の最終
重量は８.５gであった。ペプチド−樹脂の一部(３.５g)
を、アニソール(２ml)の存在下、０℃にて３０分間無水
弗化水素で処理し、そしてＡ鎖について前記した方法を
用いてＢ鎖ペプチドを分離した。粗[Ｓ−チオエチルＣy
s10,22] hＲＬＸ Ｂ(−１〜２４)(０.９７g)を、１Ｍ酢
酸中バイオゲルＰ１０によりゲル濾過し、次いで調製用
ＨＰＬＣにより処理することにより精製した。ゲル濾過
により精製したペプチドのサンプル(１００mg)を、pＨ
８.３において３時間Ｓ−スルホン化し、反応混合物を
濾過し、そして沈澱及び上澄液を蒸留水に対して透析し
た。凍結乾燥後、４２.４mgの「可溶性」ペプチド及び５
９.５mgの「不溶性」ペプチドが回収された。Ｓ−スルホ
ン化Ｂ鎖ペプチドを、Ｃ−１８逆相カラム及び０.１％
ＴＦＡ−水−アセトニトリル溶剤系を用いる調製用ＨＰ
ＬＣによりさらに精製した。 【００７５】(iii) 鎖の結合 合成Ｈ２−hＲＬＸ Ａ(１〜２４)及びＨ２−hＲＬＸ
Ｂ(−１〜２４)ペプチドをチャンス(Ｃhance)及びホフ
マン(Ｈoffmann)によりインスリンについて記載された
方法(オーストラリア特許出願 第６８８４４／８１号)
を用いて結合せしめた。この方法においては、Ｓ−スル
ホン化ペプチドを、Ａ：Ｂ＝２６：１の比率で、ペプチ
ドの濃度をグリシン緩衝液(pＨ１０.５)中１０mg／mlと
して混合した。次に、グリシン緩衝液中ジチオスレイト
ールを、各Ｓ−スルホ基について合計１.０のスルヒド
リル基が生ずる量において加えた。次に、反応混合物を
開放容器中で２４時間撹拌した。発明者等は、この方法
の前記以外の変法として、ペプチド鎖の一方又は好まし
くは両方を、インスリンの場合についてチャンス及びホ
フマンにより記載されたＳ−スルホ形(前記)ではなくＳ
−チオエチル−Ｃys誘導体として使用することにより、
生物学的に活性なレラキシンを生成せしめるための鎖結
合反応を効果的に行うことができることを見出した。Ｓ
−チオエチルＣysペプチドの使用により、ペプチドをＳ
−スルホ誘導体に転換するのに必要な反応及び精製段階
が必要でなくなる。発明者等の経験によれば、レラキシ
ンペプチドのＳ−スルホン化反応にはＳ−スルホペプチ
ドの精製を困難にする傾向を有する副反応が伴い、これ
により収量が低下する。上記の条件を使用すれば、ウイ
ックビスト(Ｗiqvist)及びパウル(Ｐaul)(Ａcta Ｅndoc
rinol.,２９,１３５〜１３６,１９５８)のラット子宮収
縮測定における生物学的活性により測定した場合１.５
〜６.０％の鎖結合収率が達成された。 【００７６】鎖結合反応例 ヒト−レラキシンＨ２[Ｓ−チオエチルＣys10,11,15]Ａ
(１〜２４)(乾燥重量４.２mg、アミノ酸分析によるペプ
チド量２.４mg、０.８４μモル)を、３mlのプラスチッ
ク製蓋付き遠心チューブ中で５００μlの０.１Ｍグリシ
ン緩衝液(pＨ１０.５)に溶解した。ヒト−レラキシンＨ
２[Ｓ−スルホＣys10,11]Ｂ(−１〜２４)(１.６０mg、
アミノ酸分析によるペプチド量１.６mg、０.３３μモ
ル)を２００μlの０.１Ｍグリシン緩衝液(pＨ１０.５)
中に溶解し、そしてこれを前記の溶液に加え、そして混
合物を撹拌した。０.１Ｍグリシン緩衝液(pＨ１０.５)
中に調製したジチオスレイトール(ＤＴＴ)のストック溶
液(１０μl中の０.９６μモルＤＴＴ)のアリコート(２
３.０μl、２.２１μモルＤＴＴ)をペプチド溶液に加
え、そして短時間撹拌した後、反応混合物を空気に開放
して４℃にて２４時間静置した。次に混合物を遠心分離
し、そして上澄液のアリコートのレラキシン生物学的活
性をラット子宮収縮測定により測定した。反応混合物の
アリコートは、投与量に依存してラットの子宮の自発収
縮を阻害した。７５μlのアリコートにより子宮収縮が
完全に阻害され、これは、天然豚−レラキシンＡ２２Ｂ
３１標準と比較した場合５.３％の鎖結合収率に相当す
る。 【００７７】真正のヒト−レラキシンＨ２；hＲＬＸ Ａ
(１〜２４)−Ｂ(−１〜３２)の合成 (i) 全長Ｈ２−ヒト−レラキシンＢ鎖：hＲＬＸ Ｂ(−
１〜３２)の合成 全長Ｈ２−ヒト−レラキシンＢ鎖の残基−１〜＋３２に
対応するアミノ酸配列を、前記の方法を用いて合成し
た。０.２３ミリモル／gのＬeuを負荷したＮ−α−tert
−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシンフェニルアセ
タミドメチルポリスチレン樹脂６.４gを用いて開始し
た。Ａ(１〜２４)ペプチド及びＢ(−１〜２４)ペプチド
の合成のために使用した側鎖保護基を、全長Ｂ鎖合成の
ためにも使用した。これには１０位及び２２位の両シス
テインのためのＳ−エチルメルカプト誘導体が含まれ
る。この方法の変法として、２７位及び２位の配列にお
けるカップリングのためにＢＯＣ−Ｌ−トリプトファン
のＮ−ホルミル誘導体を使用した。鎖形成後のペプチド
−樹脂の最終重量は８.２gであった。ペプチド樹脂の１
部分(４.０g)を、前記の例に記載したようにして無水弗
化水素−アニソールにより処理して、１.５０gの粗[Ｓ
−チオエチルＣys10,22、Ｎ−ホルミルＴrp2,27]hＲＬ
Ｘ Ｂ(−１〜３２)を得た。粗ペプチドを、０.１Ｍ酢
酸中バイオゲルＰ６によるゲル濾過により精製した。ゲ
ル濾過カラムから溶出する大ピークを、アミノ酸分析に
より特徴付けた。−１〜＋３２のペプチド配列に一致す
る分析値を有する分画を集め、そして凍結乾燥した。ト
リプトファン残基の脱ホルミル化はペプチド(１００mg)
を水酸化ナトリウム溶液(５ml)pＨ１１.５で５分間処理
することにより行った。この間にペプチドが溶液から沈
澱した。この反応混合物を中和してペプチドを溶解し、
０.１Ｍ酢酸中バイオゲルＰ６カラムに直接適用したト
リプトファンからのホルミル基の除去は、３００nmにお
けるＮ−ホルミル吸収の消失と２８０nmに最大吸収を有
するトリプトファンに特異的なスペクトルの出現をＵＶ
スペクトル分析により追跡することにより監視した。正
しいアミノ酸分析結果を有するカラム溶出分画を集め、
そして凍結乾燥した。調製用ＨＰＬＣにより[Ｓ−チオ
エチルＣys10,22]hＲＬＸ Ｂ(−１〜３２)ペプチドを
さらに精製することは、ペプチドがカラムに吸着して減
少するために不成功に終わった。ゲルクロマトグラフィ
ーによって精製したペプチドを、鎖連結実験に直接使用
した。 【００７８】(ii) Ａ(１〜２４)とＢ(−１〜３２)との
鎖連結：ヒト−レラキシンＨ２の合成 合成Ｓ−スルホン化、及びＳ−チオエチルＨ２−ヒト−
レラキシンＡ(１〜２４)ペプチドを、短縮されたＢ鎖
(−１〜２４)と連結させるために前記したのと同じ鎖結
合法を用いて、Ｓ−チオエチルＨ２−ヒトレラキシンＢ
(−１〜３２)とカップリングせしめた。連結混合物のレ
ラキシン生物活性をラット子宮収縮測定法により試験し
た。反応混合物のアリコートは、物質の使用量と関連し
てラット子宮の自発的収縮を阻害した。１００μlのア
リコートが子宮の収縮を完全に阻害し、天然の豚レラキ
シンＡ２２Ｂ３１標準と比較した場合、鎖結合収率３.
０％に相当した。 【００７９】参考文献・ Anderson,M.L., Long,J.A.及び Hayashida,T., Immuno
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びヒト−レラキシンをコードする遺伝子配列の特徴付け
に関する。この発明はさらに、ヒト−レラキシン、プロ
レラキシン及びプレプロレラキシンを製造するための組
換ＤＮＡ技法に関する。 【０００２】発明者等は、オーストラリア特許出願第１
７９０６／８３号(ＰＦ５３５２／８２,１９８２年８月
１２日出願)においてヒト−レラキシンをコードする遺
伝子配列の分子クローニング及び特徴について記載し
た。発明者等はここに、ヒト−レラキシンをコードする
第２の遺伝子を見出した。さらに詳しくは、この発明
は、分離されそして精製された(クローン化された)、プ
ロレラキシン、プレプロレラキシン、及びヒト−レラキ
シンのＡ及び／又はＢ及び／又はＣペプチド鎖をコード
するヒト−遺伝子、該遺伝子の分離及び精製方法、並び
に該遺伝子を宿主細胞に移入してそして該宿主細胞中で
複製せしめる方法に関する。クローン化された遺伝子
は、宿主−発現性の原核性又は真核性遺伝子と融合した
場合、宿主細胞により発現される。従って、この遺伝子
は、治療用ヒト−レラキシンの製造に有用である。 【０００３】この発明はさらに、ペプチドたるヒト−レ
ラキシン、プロレラキシン及びプレプロレラキシン、こ
れらの配列を構成する個々のペプチド鎖、並びにこれら
のペプチドの変形に関する。この発明はさらに、個々の
レラキシン鎖及び上記のその変形をコードする変形され
た遺伝子に関する。この明細書において引用した文献は
後にまとめて記載してある。 【０００４】 【従来の技術】ヒサウ(Ｈisaw)(１９２６)の先駆的な研
究により、哺乳動物のペプチドホルモンであるレラキシ
ンの重要な役割が、その恥骨結合弛緩作用及びその作用
に基づく分娩促進作用により示唆された。レラキシン
は、妊娠中に卵巣の黄体中で合成されここに貯蔵され、
そして分娩に先立って血流中に放出される。卵巣を得る
ことにより、豚[ゼームス(Ｊames)等、１９７７、シュ
ワーベ(Ｓchwabe)等、１９７７]、ラット[ジョーン(Ｊo
hn)等、１９８１]、及びサメ(シュワーベ等、１９８２)
のレラキシンの分離及びアミノ酸配列の決定が可能とな
った。生物学的に活性なホルモンは、ジスルフィド結合
により結合された２つのペプチド鎖(Ａ鎖及びＢ鎖)から
成り、このジスルフィド結合は、２つの鎖間結合と１つ
の鎖内結合から成る。従って、この構造はジスルフィド
の配置においてインスリンに非常に類似しており、この
ことからこれらのホルモンの遺伝子は先祖を共通にする
と推定される(ゼームス等、１９７７、シュワーベ等、
１９７７)。 【０００５】ラットレラキシン及び豚レラキシンのいず
れについてもcＤＮＡクローンの分離に組換ＤＮＡ技法
が適用された[ハドソン(Ｈudson)等、１９８１、ハーレ
イ(Ｈaley)等、１９８２]。なお、オーストラリア特許
出願第１１８３４／８３(ＰＦ２６９６／８２)を参照の
こと。アミノ酸配列情報を基礎にして調製された合成１
１連ヌクレオチドが、卵巣組織から誘導された試料集団
(ライブラリー)中のレラキシンcＤＮＡクローンを同定
するためのcＤＮＡプローブを合成するためのプライマ
ーとして使用された。該プローブはレラキシンcＤＮＡ
配列に関し非常に濃縮されたものである。レラキシン構
造遺伝子は、全体構造においてプレプロインスリンに類
似する単鎖前駆体、すなわちシグナルペプチド／Ｂ鎖／
Ｃペプチド／Ａ鎖をコードすることが見出された。 【０００６】オーストラリア特許出願第１７９０６／８
３号において、発明者等は豚レラキシンのＣペプチドを
基礎にするプローブを用いるヒト−ゲノムライブラリー
からのレラキシン遺伝子の選択について記載した。この
研究において「Ｈ１」と称するゲノムクローンの同定に成
功し、このクローンからヒト−プレプロレラキシンのコ
ード領域全体の構造が決定された。 【０００７】 【発明が解決しようとする課題】この発明は、前記特許
出願において記載した遺伝子構造を確認することを意図
した研究の継続により完成したものである。発明者等
は、Ｃ−ペプチド／Ａ−鎖(アミノ酸６４−１６１)をコ
ードする領域の約３００ヌクレオチドに対応する、すで
に同定されたヒト−Ｈ１−遺伝子のセグメントをプロー
ブとして用いて、妊娠した女性(ヒト)の卵巣組織から得
られたライブラリー中のcＤＮＡクローンを研究した。
陽性のcＤＮＡクローンを分離し、そしてその配列を決
定することにより、このcＤＮＡ配列はすでに確立した
配列とは異なり、そして先行する特許出願に記載したプ
レプロレラキシンとは異なるプレプロレラキシンの１つ
をコードすることを明らかにした。 【０００８】さらに、発明者等は、発明者等の係属中の
オーストラリア特許出願第１７９０６／８３号(ＰＦ５
３５２／８２)に記載したヒト−ゲノムライブラリーか
ら、Ｈ２遺伝子のエクソン１を含有する組換ファージを
分離した。このエクソン１は、Ｈ１−遺伝子のそれと同
様に、シグナルペプチド、Ｂ−ペプチド、及びＣ−ペプ
チドの一部分をコードする領域を含んで成る。 【０００９】発明者等が「Ｈ２」と称してこの明細書に記
載する遺伝子及び発明者等の出願第１７９０６／８３号
に記載されている「Ｈ１」遺伝子はいずれもレラキシン様
活性を有するペプチドを発現するから、これらの一方又
は両者はヒトの生殖組織、例えば卵巣及び胎盤、及び／
又は腸、脳及び皮膚を含む他の組織(これらに限定され
ない)中で発現されると信じられる。 【００１０】卵巣の黄体、並びに脱落膜組織及び胎盤組
織が、レラキシン関連遺伝子が発現する可能性が最も高
い部位である。しかしながら、多くのペプチドホルモン
が広い範囲に分布していることから考えて、レラキシン
遺伝子が脳及び胃腸管を含む非生殖組織においても発現
する可能性が強い。レラキシンは生長因子としての一般
的性質を有し、そして結合組織の性質を変え、平滑筋の
収縮に影響を与えることができる。発明者等は、この明
細書に記載する遺伝子構造及び特許出願第１７９０６／
８３号に記載されている遺伝子構造の両者又は一方が体
内に広く分布しているものと信ずる。発明者等は、これ
らの遺伝子により発現されるレラキシンペプチドが、生
殖中のよく知られているホルモン機能のほかに重要な生
理的役割を演ずることを示唆する。 【００１１】 【課題を解決するための手段】この発明においては次の
略号を用いる。 Ｈ１ :オーストラリア特許出願第１７９０６／８３
に記載されているレラキシン遺伝子であって、ゲノムク
ローンに由来する。 Ｈ２ :この明細書に記載されているレラキシン遺伝
子であって、cＤＮＡクローンに由来する。 ＤＮＡ :デオキシリボ核酸 ＲＮＡ :リボ核酸 cＤＮＡ :相補的(コンプレメンタリー)ＤＮＡ(mＲＮＡ
配列から酵素的に合成される。) mＲＮＡ :メッセンジャーＲＮＡ Ａ :アデニン Ｔ :チミン Ｇ :グアニン Ｃ :シトシン Ｕ :ウラシル 【００１２】ＤＮＡ中のヌクレオチド配列と蛋白質中の
アミノ酸配列とのコード関係は遺伝コードとして全面的
に知られており、次にこれを示す。 【表１】 第１位 第 ２ 位 第３位 (５'末端) (３'末端) Ｕ Ｃ Ａ Ｇ Ｐhe Ｓer Ｔyr Ｃys Ｕ Ｕ Ｐhe Ｓer Ｔyr Ｃys Ｃ Ｌeu Ｓer Ｓtop Ｓtop Ａ Ｌeu Ｓer Ｓtop Ｔrp Ｇ Ｌeu Ｐro Ｈis Ａrg Ｕ Ｃ Ｌeu Ｐro Ｈis Ａrg Ｃ Ｌeu Ｐro Ｇln Ａrg Ａ Ｌeu Ｐro Ｇln Ａrg Ｇ Ｉle Ｔhr Ａsn Ｓer Ｕ Ａ Ｉle Ｔhr Ａsn Ｓer Ｃ Ｉle Ｔhr Ｌys Ａrg Ａ Ｍet Ｔhr Ｌys Ａrg Ｇ Ｖal Ａla Ａsp Ｇly Ｕ Ｇ Ｖal Ａla Ａsp Ｇly Ｃ Ｖal Ａla Ｇlu Ｇly Ａ Ｖal Ａla Ｇlu Ｇly Ｇ 【００１３】上の表中に使用するアミノ酸の略号は次の
意味を有する。 【表２】 フェニルアラニン(Ｐhe) ヒスチジン (Ｈis) ロイシン (Ｌeu) グルタミン (Ｇln) イソロイシン (Ｉle) アスパラギン (Ａsn) メチオニン (Ｍet) リジン (Ｌys) バリン (Ｖal) アスパラギン酸(Ａsp) セリン (Ｓer) グルタミン酸 (Ｇlu) プローリン (Ｐro) システイン (Ｃys) スレオニン (Ｔhr) トリプトファン(Ｔry)アラニン (Ａla) アルギニン (Ａrg)チロシン (Ｔyr) グリシン (Ｇly) 【００１４】表中に示した各３文字コードン、例えばＡ
ＵＧ、ＣＡＵ(デオキシヌクレオチドトリプレット又は
ヌクレオチドトリプレットとしても知られている)は、m
ＲＮＡのトリヌクレオチドに対応し、左側に５'末端を
有し、右側に３'末端を有する。文字は、ヌクレオチド
配列を形成するプリン塩基又はピリミジン塩基を示す。
この明細書に記載するすべてのＤＮＡ配列は鎖状を成し
ており、その配列はmＲＮＡ配列に対応し、但し、ウラ
シル(Ｕ)の代わりにチミン(Ｔ)を含んでいる。 【００１５】この発明を図面と関連させてさらに説明す
る。図１は、pＢＲ３２２中のcＤＮＡクローン、ゲノム
クローンＨ１１、及びＧＴ１０cＤＮＡクローンa〜fに
おける省略された制限地図、及び配列決定方法を示す。
矢印は、末端標識した断片の配列決定の方向を示す(方
法参照)。ＧＴ１０クローンa〜fは後記のごとくＭ１３
ベンターにサブクローニングすることにより配列決定し
た。ヌクレオチドの番号は開始コドンＡＵＧ(１〜３位)
から終結コドン(５５４〜５５６位)に向けて付してあ
る。 【００１６】図２〜図５はヒト−Ｈ２−プレプロレラキ
シン(上)のアミノ酸及びmＲＮＡ配列を、対応するＨ１
の配列(下)と対比したものである。相同性が最大になる
ように重ね合わされており、同一のヌクレオチドには＊
印が付されており、同一のアミノ酸は箱で囲んである。
アミノ酸の番号はＢ−鎖の出発部から付されている(Ｈ
２配列は−１から出発し、Ｈ１配列は＋１から出発す
る)。この位置はＢ鎖の配列の仮定的な出発部を示すも
のであり、関連する豚及びラットのプレプロレラキシン
構造に対する相同性から単純に導いたものである。Ｃペ
プチド中の４５番目のＡlaの下の＊印は、両遺伝子のＧ
／ＣＡ間にイントロンが位置することを示している。 【００１７】図６および図７は、同一のニトロセルロー
スストリップのラジオオートグラフであり、図６はヒト
−卵巣ＲＮＡ、図７はＨ１遺伝子(λＨ７)又はＨ２遺伝
子(λＧＴ１０−a)に対応するλプラックのナサン(Ｎor
thern)ゲル泳動を示し、それぞれＡ：ランダムプライム
６００bpＨ２レラキシンcＤＮＡ断片(７２〜６６０)、
Ｂ：Ｈ２特異的２５連(４８３〜５０７)、Ｃ：Ｈ１−特
異的２５連(４８３〜５０７)、Ｄ：Ｈ１特異的２５連
(２４８〜２７２)をハイブリド形成プローブとして使用
したものである。 【００１８】図８は、ハイブリド形成プローブとしてp
ＢＲ３２２(図１参照)中のＨ２cＤＮＡクローンの断片
を使用したヒト卵巣ＲＮＡのナサン(Ｎorthern)ゲル泳
動の同じニトロセルロースストリップのオートラジオグ
ラフである。 Ａ：コード領域のほとんどに対応する６００bp断片(７
２〜６６０)。 Ｂ：５'非翻訳領域(ヌクレオチド３０のＨinfＩ部位ま
で)。 Ｃ：３'非翻訳領域(ヌクレオチド６６０のＨinfＩ部位
から)。 Ｄ：３'非翻訳領域(ヌクレオチド８５０のＨpaＩ部位か
ら)。 【００１９】図９〜図１０は、Ａ鎖及びＢ鎖のアミノ酸
配列を、２種のヒト−レラキシン、ヒト−インシュリ
ン、及びその他のレラキシン類の間で比較したものであ
る。箱で囲んだ領域は２種のヒト−レラキシン及びその
他のレラキシン類の間で保存されている残基を示す。矢
印は蛋白質が切断される可能性がある部位を示したもの
であり、豚[シュワーベ(Ｓchwabe)等、１９７７、ゼー
ムス(Ｊames)等１９７７]、ラット[ジョーン(Ｊohn)等
１９８１]、サメ[シュワーベ等、１９８２]、及びツノ
ザメ[シュワーベ等、１９８３]のレラキシン類のＡ鎖及
びＢ鎖のアミノ末端残基の蛋白質配列データにより確認
したものである。 【００２０】図２〜図５に示すＨ２−mＲＮＡの配列は
後記の方法により決定した。比較を容易にするために、
Ｈ１配列から誘導されるペプチドについて使用したアミ
ノ酸の番号がこの発明のＨ２−誘導ペプチドについても
維持されている。Ｈ１−プレプロレラキシンの構造は、
豚レラキシン及びラットレラキシンの相同構造と比較す
ることにより、ゲノム配列から導いた。Ｈ２−プレプロ
レラキシンの構造は、Ｈ１の構造並びに豚レラキシン及
びラットレラキシンの構造と比較比することにより導い
た。Ａ及びＢペプチド鎖の構造を、合成、及び子宮収縮
試験において生物学的に活性である物質を生成する鎖連
結(試験管内)により確認した。 【００２１】図２〜図５から、この発明の配列と先行発
明のそれが、類似性と共に有為な相違を有することが明
らかである。注目すべき点は次の通りである。 (１) ３つの主要領域におけるアミノ酸の有意な相違; (a) Ｂ鎖のＮ末端、(b) Ａ鎖のＮ末端、(c) Ｃペプ
チドの中間、 (２) Ｂ鎖及びＣペプチド中の強相同性領域; (a) Ｖal6〜Ｉle47の１２０塩基が同一であり、(b)
Ｐhe101〜Ｓer132の８８〜９０塩基が同一である。 従って、２種の遺伝子は非常に類似しているが、Ｈ２−
遺伝子がたしかに第２の遺伝子であり、単にＨ１遺伝子
のポリモープではないことを示すに十分な相違が存在す
る。 【００２２】Ｈ１−プレプロレラキシンの生体内プロセ
シングの態様は十分には解明されていないが、豚レラキ
シンとの類似性から、シグナルペプチドの切断はＡla-1
−Ｌys1結合において生ずると予想される。同様に、Ｈ
１−Ｃペプチドの切り離しはＬeu32−Ｓer33、及びＡrg
136−Ａrg137において生じ、これにより、それぞれ３２
残基及び２４残基のＨ１−Ｂ鎖及びＨ１−Ａ鎖が生ずる
と予想される(図２〜図５)。 【００２３】Ｈ２−プレプロレラキシンにおいてはＡla
-1がＡspにより置き換えられているので、Ｈ１における
−２位に対応するアラニンの後でシグナルペプチドが切
断されると予想される。Ｈ２−Ｂ鎖／Ｃペプチド結合の
切断はＬeu32の後で生じ３３残基を有するＨ２−Ｂ鎖が
遊離することが、他のすべてのプレプロレラキシンとの
類似性から推定される。Ｈ２−Ｃペプチド／Ａ鎖結合の
切断はＡrg136の後で生じ２４残基のＨ２−Ａ鎖が遊離
することが、ラット−プレプロレラキシンとの類似性か
ら推定される。 【００２４】豚レラキシンについての発明者等の研究に
よれば、豚レラキシンＢ鎖及びＡ鎖中に、生物学的活性
のために必須のすべての要素を含有するコア−配列が存
在する。ヒト−レラキシン鎖についての発明者等の合成
研究においても同様の結果が得れた。これは、後に詳細
に記載する。 【００２５】この発明の１つの観点に従えばヒト−プレ
プロレラキシン発現遺伝子が提供される。特にことわら
ない限り、プレプロレラキシン、プロレラキシン、レラ
キシン、及びシグナルペプチド、Ａペプチド、Ｂペプチ
ド、及びＣペプチドのための遺伝子配列、並びにペプチ
ドそれ自体についての以下の記載は、Ｈ１に関してでは
なくＨ２に関する。さらに詳しくは、この発明のこの観
点に従えば、図２〜図５に示す完全mＲＮＡ(コードン−
２５〜１６０)配列に対応するコード鎖及び相補鎖を含
んで成る、ヒト−プレプロレラキシンの発現のための二
重鎖ＤＮＡ断片が提供される。 【００２６】この発明はさらに、この明細書に記載する
Ｈ２−プレプロレラキシン遺伝子配列の任意のサブユニ
ット、又は該配列もしくはそのサブユニットの同等物を
含む。これらのサブユニットの中には、シグナルペプチ
ド、及びヒト−プレプロレラキシンのＨ２−Ａ、Ｈ２−
Ｂ、及びＨ２−Ｃ鎖(図２〜図５)をコードする個々の構
造遺伝子を含む遺伝子、並びにこれらの鎖の任意の組合
わせをコードする遺伝子、例えばＨ２−Ａ及びＨ２−Ｂ
ペプチド鎖を別個に発現する遺伝子、又は(Ｃ鎖と共に)
プロレラキシンとして発現する遺伝子が含まれる。 【００２７】この発明の他の観点に従えば、ヒト−プロ
レラキシンを発現する遺伝子が提供される。さらに詳し
くは、この発明の上記の観点に従えば、図２〜図５に示
すmＲＮＡ配列の１〜１６０のコドンに対応するコード
鎖及び相補鎖を含んで成るヒト−プロレラキシンを発現
する二重鎖ＤＮＡ断片が提供される。 【００２８】この発明の他の観点に従えば、ヒト−レラ
キシンのＡ,Ｂ及びＣ鎖、又はこれらの鎖の２以上の任
意の組合わせを個別に発現する遺伝子、及び任意の断片
又は前記の鎖の断片の組合わせが提供される。さらに詳
しくは、この発明の上記の観点に従えば、図２〜図５に
示すmＲＮＡ配列の−１〜３２、３３〜１３６、及び１
３７〜１６０のコードに対応するコード配列及び相補配
列を含んで成り、ヒト−レラキシンのＡ鎖及び／又はＢ
鎖及び／又はＣ鎖を個別に発現する二重鎖ＤＮＡ断片が
提供される。 【００２９】上記の遺伝子は、特定されたコドンのほか
に適当な「開始」コドン及び「終結」コドン、すなわち、そ
れぞれＡＵＧ及びＵＧＡ(図２〜図５における−２５及
び１６１のコドン)を含むであろう。 【００３０】当業者はこれらの遺伝子の多形(polymorph
icforms)が存在することを認めるであろう。このような
多形もこの発明に含まれる。 【００３１】この発明はさらに、前記の配列、サブユニ
ット又は同等物、及び対応するＲＮＡ配列、サブユニッ
ト又は同等物の相補体をも包含する。 【００３２】この発明の他の観点に従えば、前記の遺伝
子に対応するデオキシヌクレオチド配列を副で成るＤＮ
Ａ移転ベクターが提供される。 【００３３】前記のごとく、遺伝コードは重複性を有す
る。すなわち、あるアミノ酸は複数のコドンによりコー
ドされる。従って、この発明は、図に示したコドンが同
じアミノ酸をコードする他のコドンによって置き換えら
れているデオキシヌクレオチド配列を包含する。 【００３４】さらに、すでに記載したごとく、天然レラ
キシンのＢ鎖及び／又はＡ鎖構造と構造を異にし、レラ
キシン活性を有するペプチドを製造することができる。
この構造の差異には、天然鎖中の１個又は複数個のアミ
ノ酸の除去及び／又は付加及び／又は置換が含まれる。
従って、この発明はさらに、天然コドンが除去されてお
りそして／又は天然コドンによってコードされるアミノ
酸と異なるアミノ酸をコードするコドンにより置き換え
られておりそして／又は天然配列に追加のコドンが付加
されている前記の遺伝子及びＤＮＡ移転ベクターをも包
含する。 【００３５】この発明の移転ベクターはさらに、特に、
宿主細胞に移入された場合に自己の複製を保障する遺伝
情報を含有する。この宿主細胞には、例えば原核微生物
の細胞及び真核細胞、例えば細菌、酵母、糸状菌の細
胞、哺乳動物の細胞、及びセルラインが含まれる。 【００３６】細菌遺伝学において一般に使用される移転
ベクターの例にはプラスミド及びある種のバクテリオフ
ァージのＤＮＡが含まれる。この発明においてはファー
ジＤＮＡ及び細菌プラスミドの両者を使用した。しかし
ながら他のタイプの移転ベクターを使用することができ
ることが理解できよう。このような移転ベクターを形成
し、そしてこれを微生物に導入する一般的な方法はよく
知られている。 【００３７】この発明はさらに前記の移転ベクターのい
ずれかにより形質転換された原核細胞及び真核細胞を包
含する。非常に親しまれているエッセリヒア・コリ(Ｅs
cherichia coli)が好ましい微生物の１つであるが、他
の任意の適当な微生物を使用することもできる。 【００３８】この発明の他の観点に従えば、ヒト−プレ
プロレラキシンをコードするデオキシヌクレオチド配列
を、制限酵素によって移転ベクターを切断することによ
り調製されたＤＮＡ分子と連結することを特徴とする、
ヒト−プレプロレラキシンをコードするデオキシヌクレ
オチド配列を維持しそして複製するために使用するＤＮ
Ａ移転ベクターの製造方法が提供される。 【００３９】同様にして、適当なデオキシヌクレオチド
から、ヒト−プレプロレラキシンをコードするデオキシ
ヌクレオチド配列、並びにヒト−レラキシンのＡ鎖及び
Ｂ鎖をコードするデオキシヌクレオチド配列を維持し、
そして複製するために使用するＤＮＡ移転ベクターを調
製することができる。 【００４０】Ａペプチド鎖及びペプチド鎖、並びにプロ
レラキシン及びプレプロレラキシンは、通常の遺伝子発
現方法により、すなわち適切に導入された移転ベクター
を含有する細胞を増殖せしめ、そして該細胞により生産
された目的ペプチドを分離し、そして精製することによ
り製造することができる。 【００４１】この発明はさらに、上記の方法により調製
された、ヒト−プレプロレラキシンをコードするデオキ
シヌクレオチドを含んで成る発現移転ベクターにより形
質転換された細胞を培養することを特徴とする、Ｃ末端
配列としてヒト−プレプロレラキシンのアミノ酸配列を
含みそしてＮ末端配列として真核性又は原核性蛋白質の
一部分を含んで成る融合蛋白質の製造方法を包含する。
同様にして、ヒト−プロレラキシン及び／又はヒト−レ
ラキシンのＡ鎖及び／又はＣ鎖を含んで成る融合蛋白質
を製造することができる。こうして得られた融合ペプチ
ド生成物は、所望のペプチドが宿主に特異的な原核性又
は真核性蛋白質の一部に連結された融合蛋白質の形で存
在するであろう。このような融合蛋白質も又この発明を
構成する。 【００４２】この発明はさらに、前記の方法により調製
された前記のヒト−プロレラキシンをコードするデオキ
シヌクレオチド配列を含んで成る発現移転ベクターによ
り形質転換された細胞を、ヒト−プロレラキシンをコー
ドする前記の配列の発現に適する条件下で培養し、そし
て前記細胞の分解物又は培養液からヒト−プロレラキシ
ンを精製することを特徴とする、Ｃペプチドにより相互
に分離されたＡペプチド及びＢペプチドを含んで成るヒ
ト−プロレラキシンの合成方法をも包含する。 【００４３】任意の適当な公知の切断法により、融合生
成物から目的ペプチドを回収することができる。 【００４４】すでに記載したごとく、コドンの除去／置
換／付加により移転ベクターを変形することができ、こ
のような変形により変形された融合ペプチドが生ずる。
このようにして適当な変形を行うことにより、融合ペプ
チドの切断、例えばＢ／ＣもしくはＣ／Ａ鎖結合部にお
ける切断を促進し、又は次に行う化学的もしくは生物学
的処理の間におけるペプチド鎖の挙動を変えることがで
きる。 【００４５】前記のごとく、この発明はさらにヒト−レ
ラキシン、プロレラキシン及びプレプロレラキシンを提
供する。 【００４６】レラキシンは、インスリンの製造のために
現在知られている任意の方法により別々のＡ鎖及びＢ鎖
を直接結合することにより製造することができる。又、
インスリンの場合と同様に、前記のようにして製造され
たレラキシンのＡペプチド及びＢペプチド上のスルヒド
リル基を酸化するか、又は他の方法で転換して該Ａペプ
チド及びＢペプチド間にジスルフィド架橋を形成させ、
そして次にＣペプチドを除去することにより、例えばＣ
ペプチドとＡ及びＢペプチドとの間の結合に特異的な酵
素的加水分解により除去することにより、プロレラキシ
ンからレラキシンを製造することができる。 【００４７】従って、この発明はさらに、レラキシンの
Ａ鎖及びＢ鎖(完全な長さにおいて、又は短縮されたも
しくは変形された形において)を、ヒト−インスリンの
Ａ鎖及びＢ鎖の結合のために知られている方法によって
結合せしめることから成るヒト−レラキシンの合成方法
を提供する。この方法の１つは、Ｓ−スルホン化された
Ａ鎖及びＢ鎖の混合物を還元し、そして次にこの混合物
を空気中で酸化することから成る。 【００４８】発明者等はさらに、Ａ鎖及びＢ鎖の一方又
は両方がＳ−スルホ形ではなくＳ−チオエチル−cys誘
導体の形である場合に上記方法の効率が改良されること
を見出した。 【００４９】発明者等は、オーストラリア特許出願第１
５４１３／８３号(ＰＦ４３８５／８２)において、生物
学者活性の有意な喪失を伴わないでレラキシンのＡ鎖及
びＢ鎖の一方又は両者のアミノ末端及び／又はカルボキ
シ末端を短縮することができ、これにより結合収率を改
良することができることを示した。 【００５０】この発明の他の観点に従えば、短縮されそ
して／又は変形された天然Ｂペプチド鎖及び／又はＡペ
プチド鎖により本質上構成されるヒト−レラキシン類似
体が提供される。 【００５１】この発明の上記の観点に従えば、短縮され
そして／又は変形されたＢペプチド鎖及び／又はＡペプ
チド鎖を形成し、そして次に上記の任意の方法によって
前記のペプチド鎖を結合せしめる段階を含んで成るヒト
−レラキシン類似体の製造方法が提供される。 【００５２】豚及びヒト−レラキシン(Ｈ１)を用いた発
明者等の研究により、レラキシン活性はＡ(１０〜２４)
から成る短いＡ鎖及びＢ(１０〜２２)からなる短いＢ鎖
により生ずることが示された。もっとも、期待される実
際的な最小鎖はＡ(４〜２４)及びＢ(４〜２３)である。
ペプチドＡ(４〜２４)−Ｂ(１〜２５)がレラキシン活性
を有することはすでに知られている。 【００５３】一般に、この発明のレラキシン構造(Ｈ２)
においては、Ａ鎖はＡ(１〜２４)ないしＡ(１０〜２４)
の範囲で変化することができ、Ｂ鎖はＢ(−１〜３２)な
いしＢ(１０〜２２)の範囲で変化することができる。 【００５４】好ましい組合わせは 【化１６】から誘導される。 【００５５】この発明におけるＢ鎖及び／又はＡ鎖の変
形は、前記の「遺伝的」変形、及びこの発明の結合に先立
つＢ鎖及び／又はＡ鎖の化学的変形(完全な長さにおけ
る又は短縮された形における)が含まれる。２つのタイ
プの変形を単独で又は組合わせて用いることができる。 【００５６】第１のタイブの変形は、天然の又は短縮さ
れたＢ鎖及び／又はＡ鎖における１個又は複数個のアミ
ノ酸の変形に関する。一般にこのような変形にはそれ自
体公知の方法による１個又は複数個のアミノ酸上の活性
基の保護が含まれ、そして所望により、保護基は(変形
された)Ａ鎖およびＢ鎖の結合の後除去される。このよ
うなタイブの変形の例には、Ｎ末端アミノ基を含む遊離
アミノ基のアセチル化、ホルミル化もしくはこれらと同
様の保護、Ｃ末端基のアミド化、又はヒドロキシル基も
しくはカルボキシル基のエステル形成が含まれる。ホル
ミル基が容易に除去される保護基の典型例である。 【００５７】第２のタイブの変形には、Ｂ鎖及び／又は
Ａ鎖中の１個又は複数個の天然アミノ酸の他のアミノ酸
(Ｄ−型の天然アミノ酸を含む)による置換が含まれる。
この一般的タイブの変形には又、鎖からの天然アミノ酸
の除去、又は１個又は複数個のアミノ酸の鎖への付加が
含まれる。このような変形の目的は、生成物、すなわち
レラキシンもしくはその類似体の活性を維持しながらＡ
鎖及びＢ鎖の結合収率を上昇せしめること、又は所定の
結合収率において生成物の活性を上昇せしめ又は変える
ことにある。このような変化は、レラキシン遮断効果又
はレラキシン拮抗効果を有する合成類似体の製造にも適
用することができよう。 【００５８】第１のタイブの変形の特定の例はホルミル
基の付加によるＢ２のトリプトファン残基の変形であ
る。第２のタイブの変形の特定の例は、Ｂ２４のメチオ
ニンのノルロイシン(Ｎle)、バリン(Ｖal)、アラニン
(Ａla)、グリシン(Ｇly)、セリン(Ｓer)又はホモセリン
(Ｈomo Ｓer)による置換である。 【００５９】上記の観点において、この発明は、この発
明に従って上記のごとく変形された天然の又は短縮され
たＢ鎖及び／又はＡ鎖から形成されるヒト−レラキシン
類似体を包含する。 【００６０】Ａペプチド鎖及びＢペプチド鎖、並びにさ
らにプロレラキシン及びプレプロレラキシンは通常の遺
伝子発現法により、すなわち適当に形成された移転ベク
ターを含有する微生物を増殖せしめ、そして該微生物に
より生産された目的ペプチドを分離しそして精製するこ
とにより製造することができる。こうして得られたペプ
チド生成物は、目的ペプチドが原核性蛋白質の一部と連
結されている融合蛋白質の形で存在することができる。 【００６１】 【実施例】次に、実験方法及びそれにより得られた結果
を記載することによりこの発明をさらに具体的に説明す
る。方法及び材料 メッセンジャーＲＮＡの分離及びcＤＮＡのクローニン
グ 子宮外妊娠の治療のための外科処置中に得たヒト−卵巣
組織をドライアイス上で急速に凍結し、そしてチルグウ
ィン(Ｃhirgwin)等１９７９、の方法に従って５Ｍグア
ニジウムチオシアナート(メルク)中にＲＮＡを分離し
た。ポリ−Ａ+ＲＮＡを、ウイッカーズ(Ｗickers)等、
１９７８、の方法により、２重鎖ＤＮＡに転換し、そし
てホモポリマーＧ／Ｃテーリング法によってpＢＲ３２
２プラスミドベクター[チャン(Ｃhang)等、１９７８]に
クローニングし、又はλＧＴ１０ベクター[ヒューン(Ｈ
uynh)等、１９８３]を用いるラムダパッキング法により
クローニングした。発明者等の経験においては、pＢＲ
３２２法による形質転換効率(１０4の組換体／μgのcＤ
ＮＡ)はラムダ法(１０6以下の組換体／μgのcＤＮＡ)に
比べて低かった。 【００６２】ハイブリド形成プローブの調製 子牛胸腺ＤＮＡの変性したランダムプライマーを用い
て、種々のＤＮＡ断片上でのプライム合成により放射能
標識プローブを調製したハドソン等(１９８３)、テイラ
ー等(１９７６)。ＤＮＡテンプレート(１００〜２００n
g)をランダムプライマー(１μg)と共に２０μlの水中で
２分間煮沸することにより変性した。５０mＭ Ｔris−
ＨＣl pＨ８.０、５０mＭ ＮaＣl、１mＭ ＤＴＴ、１０
mＭ ＭgＣl2、５ユニットのＥ.コリ(Ｅ.coli)ＤＮＡポ
リメラーゼ１[クルノウ(Ｋlenow)フラグメント]、５０
０μＭずつのdＣＴＰ、dＧＴＰ、dＴＴＰ、及び０.３μ
Ｍのα−(32p]−dＡＴＰ(約３０００Ｃi／ミリモル、ア
マーシャム)を含有する３０μlの反応混合物を加えるこ
とにより合成を開始した。３７℃にて３０分間インキュ
ベートした後、０.３Ｍ ＮaＣl、１０mＭ Ｔris−ＨＣ
l、pＨ８.０、１mＭ ＥＤＴＡを含有する緩衝液３００
μl中に希釈することにより反応を停止し、そして前記
緩衝液中セファテックスＧ５０のカラム(１cm×５cm)を
通した。放射能標識されたプローブをボイドボリウムに
おけるピーク分画から集め、そしてtＲＮＡ(１０μg)を
担体として用いて２容量のエタノールにより−２０℃に
て２時間沈澱せしめた。 【００６３】特異的cＤＮＡクローンの選択 ヒト−卵巣cＤＮＡクローンバンクからレラキシン特異
的配列をスクリーニングするために、すでに同定されて
いるヒト−Ｈ１遺伝子のセグメントをプローブとして使
用した。これは、Ｃペプチド、Ａ鎖のアミノ酸６４から
終結コドンまで及び３'非翻訳領域の８０塩基をコード
する４００ヌクレオチドのセグメントに対応する。pＢ
Ｒ３２２ライブラリーから１個の陽性cＤＮＡクローン
を分離し、そして配列決定した。λＧＴ１０ライブラリ
ーから２３の特異的組換体を分離したが、これらの内６
個のみを完全ヌクレオチド配列分析にかけた。 【００６４】ＤＮＡ分析 配列決定の方針及びcＤＮＡクローンの省略された制限
地図を図１に示す。pＢＲ３２２中の組換プラスミドを
制限酵素ＨpaII(Ｐ)、ＨinfＩ(Ｆ)又はＴaqＩ(Ｔ)を用
いて消化し、そして逆転写酵素及び適当なα−標識デオ
キシヌクレオチドトリホスフェート(ＨpaII及びＴaqＩ
のためにdＣＴＰ、ＨinfＩのためにdＡＴＰ)を用いて末
端標識した。断片を第２の制限エンドヌクレアーゼによ
り内部的に切断し、そして次に８％ポリアクリルアミド
ゲル上での電気泳動により分離し、そしてマクサム(Ｍa
xam)及びジルバート(Ｇilbert)等の化学的分解法(１９
７７)により配列決定した。λＧＴ１０中のcＤＮＡクロ
ーンは、ＥcoＲＩ制限断片をＭ１３mp９にサブクローニ
ングし、そしてサンガー(Ｓanger)等(１９７７)により
記載された方法を用いて配列決定した。 【００６５】サザン(Ｓouthern)及びナサン(Ｎorthern)
ゲル分析 制限エンドヌクレアーゼ切断の後、精製されたゲノムＤ
ＮＡについてサザン法(１９７５)により、又は精製され
たＲＮＡについて実施した。プローブとして使用したＤ
ＮＡ断片は、少量のフランク配列を有していたがＨ１−
ゲノムクローンのエクソンＩ又はエクソンIIのいずれか
に特異的であった。これらのフラグメントは、エクソン
Ｉのプローブの場合にはλＨ７クローンの５００bpＡlu
Ｉ断片を、エクソンIIの場合には４００bpのＥcoＲＩ−
ＡvaII断片を、Ｍ１３mp８にサブクローニングすること
により得た。Ｈ２cＤＮＡクローンからのプローブは、
ＨinfＩで消化し、そしてＡspＩから終結コドンまでの
コード領域及び３'非翻訳領域の１１０塩基に対応する
３００bp二重鎖(図１)を分離するとにより得た。オリゴ
ヌクレオチドプローブは、ビューケージ(Ｂeaucage)及
びカルサース(Ｃaruthers)のホスフィット法により合成
し、そしてγ−32Ｐ−ＡＴＰによりＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼを用いて末端標識した。ハイブリド形成条件
はＧ＋Ｃの含量を基礎にして計算した。 【００６６】Ｈ２ゲノムクローンの分離しヌクレオチド
配列分析 ラウン(Ｌawn)等(１９７８)のヒト−ゲノムラムダライ
ブラリーをすでに記載されている方法[ハドソン(Ｈudso
n)等、１９８３]によりスクリーニングした。但し前記
のように、プローブのためにＨ１ゲノムクローンのエク
ソンＩ及びIIに対応するＤＮＡ断片の混合物を使用し
た。陽性ファージをl規模の液体培養中に増殖せしめ、
ＤＮＡを分離し、そして制限エンドヌクレアーゼで消化
し、そしてエクソンＩ及びIIのプローブを用いてマッピ
ングした。４kbのＥcＲＩ断片が全エクソンＩコード領
域を含有していることが見出され、これによりこのクロ
ーンが相同のＨ１遺伝子構造と区別された。このクロー
ンをＭ１３mp８にサブクローンし、そしてマクサム及び
ジルバートの方法(１９７７)により配列決定した。Ａva
Ｉにより消化した後、コード領域を包含する断片を末端
ラベルし、そして第２の制限酵素(ＨpaII又はＨinfＩ)
により内部的に切断し、配列分析に適当な断片を生成せ
しめた。 【００６７】cＤＮＡクローンの分離 ヒト−黄体試料を、子宮外妊娠の外科的処置の結果とし
て、又は帝王切開におけるレテクトミー(lutectomy)か
ら得た。１つの黄体から分離したＲＮＡからpＢＲ３２
２中にcＤＮＡライブラリーを作成し、約３００の特異
的組換体を得た。このライブラリーをＨ１−cＤＮＡプ
ローブによりスクリーニングすることにより、ヒト−レ
ラキシンＩに相同な配列を有する１つの組換体が明らか
になった。このような少量の卵巣組織からさらに多くの
組換体を得るために、λＧＴ１０クローニング系(ヒュ
ーン等、１９８３)を用いてcＤＮＡライブラリーを作成
した。レラキシン特異的プローブを用いてスクリーニン
グした結果、２３の特異的なcＤＮＡを同定し、この内
６個を図１に示すように特徴付けた。ヌクレオチド配列
分析により６個のcＤＮＡ組換体のすべてが同じレラキ
シン構造遺伝子の断片をコードしていた(図２〜図５)
が、この配列はすでに報告されているゲノムクローン
[ハドソン(Ｈudson)等、１９８３]と異なっていた。こ
の新規な配列は、ゲノムＤＮＡ中に観察されている第２
のヒト−レラキシン遺伝子(Ｈ２)に対応すると予想され
る。驚くべきことに、pＢＲ３２２及びλＧＴ１０中のc
ＤＮＡクローンのサイズ(それぞれ、１８００bp及び１
９００bp)はクローニング操作中に大きな転写生成物が
合成されたことを示すが、cＤＮＡクローンのいずれも
が３'末端にポリアデノシン配列を有していなかった。
これら２つのcＤＮＡクローンは３'末端に重複配列を有
しており、これらが同一のmＲＮＡ構造から誘導された
ことが確認された。ポリＡ−テールが存在しないのは、
クローニング操作中に二重鎖形成転写反応が早く停止し
たためか、Ｓ１ヌクレアーゼの過剰な分解のためであろ
う。 【００６８】第２の遺伝子に対応するゲノムクローンの
分離 λＨ７レラキシンクローンのエクソンＩ又はIIに特異的
な混合プローブを用いることにより、ラウン(Ｌawn)等
(１９７８)のヒト−ゲノムライブラリーからの１０8個
の組換ファージを厳密にスクリーニングして１６の陽性
ファージを得た。小規模な制限地図分析により、これら
の組換体ファージの内１４個がすでに報告されているＨ
Ｉレラキシン遺伝子に対応した[１１個がλＨ７ゲノム
クローンと同じであり、３個がハドソン等(１９８３)に
よりすでに報告されているようにＨ１遺伝子の別のゲノ
ムクローンであるλＨ５と同じである]。しかし、他の
２個の組換体ファージは同じであり、そして図１に示す
Ｈ２レラキシン遺伝子に特異的な制限パターンを有して
いた。組換体の比率が異常なのは、もとのゲノムライブ
ラリーにおけるこれらの比率のためか、又は増幅中の選
択的増殖のためである。この新規な組換体ファージ(λ
Ｈ１１)を、λＨ７クローンのエクソンＩ又はIIに対応
する別々のプローブを用いてサザンブロット分析するこ
とによりλＨ１１がエクソンＩコード領域のみを含有す
ることが明らかになった。ラウン等(１９７８)のライブ
ラリー、又は他のライブラリー[Ｒ．クラウフォード(Ｃ
rawford)、未発表]中でＨ２−レラキシン遺伝子に対応
する全長ゲノムクローンを見出す試みはまだ成功してい
ない。λＨ１１のレラキシンコード領域のヌクレオチド
配列は図２〜図５に示すcＤＮＡクローン中に観察され
る配列と同じであった。イントロンが、λＨ７ゲノムク
ローンの場合と全く同じ位置でコード領域を中断してお
り、これらの遺伝子が進化のある時点での遺伝子の二重
化により生じたことが示唆される。 【００６９】ナサン(Ｎouthern)ゲル分析 子宮外妊娠の外科処置中に、又は帝王切開の手術中に異
なる個体から得たヒト−黄体の幾つかの試料からＲＮＡ
を分離した。いずれかのレラキシン遺伝子のコード領域
からのプローブを用いるナサンゲル分析により、試験し
た５個のヒト−卵巣ＲＮＡ試料中に、約１０００bp及び
２０００bpのサイズの２つの大mＲＮＡが存在すること
が明らかになった(図６および図７)。試験したＲＮＡ試
料中に小さい方のmＲＮＡは２〜３倍多く、この結果は
分析においてＨ１−レラキシンに対応するプローブを用
いるかＨ２−レラキシンに対応するプローブを用いるか
によって変わらず、この実験条件下では高い交差ハイブ
リド形成が生ずることが示された。これら２種のmＲＮ
ＡがＨ１遺伝子及びＨ２遺伝子のそれぞれの生成物のい
ずれを代表するかを区別するため、２つのレラキシン遺
伝子の間で相同性が最小(６０％)の領域(図２〜図５に
おける残基１３７〜１４４)にわたるオリゴヌクレオチ
ドプローブを合成した。これらの合成２５連ヌクレオチ
ドを、γ−32Ｐ−ＡＴＰを用いるキナーゼ反応により放
射性標識し、そしてＨ１遺伝子又はＨ２遺伝子に特異性
を供することが示される条件下でハイブリド形成プロー
ブとして使用した(図６および図７)。これらの放射能標
識したプローブを用いるナサンゲル分析により、いずれ
のmＲＮＡもＨ２遺伝子生成物に対応することが明らか
になった。これらの特異的プローブを用いてＨ１遺伝子
からの転写生成物プローブを用いてＨ１遺伝子からの転
写生成物を検出することはできなかった。もっとも、低
いレベルの発現(Ｈ２レベルの５％未満)を同定すること
は困難である。Ｈ２遺伝子からの異なるmＲＮＡ転写生
成物を分析するために、２つの大Ｈ２cＤＮＡクローン
のセグメントから、コード領域、５'非翻訳領域、及び
３'非翻訳領域に対応する特異的プローブを調製した(図
８)。大きい方のmＲＮＡ転写生成物(約２kbの長さ)が選
択的に両cＤＮＡクローン由来の３'非翻訳領域セグメン
ト(終結コドンから約１００塩基の位置から)とハイブリ
ド形成した。cＤＮＡクローンのヌクレオチド配列(停止
コドンから１４０塩基)中にポリアデニル化シグナルが
存在する可能性があり、そしてこの領域は豚−レラキシ
ンポリアデニル化部位に対する相同性を有する。しか
し、短い方のmＲＮＡ生成物がこの位置の近くでポリア
デニル化されているか否かの問題は、両mＲＮＡに対応
する全長cＤＮＡクローンが分離され、そして特徴付け
られるまでは解決することができない。Ｈ２遺伝子のゲ
ノム配列が不明である限り、２つのmＲＮＡ転写生成物
を生成する機構を明らかにすることはできない。コラー
ゲン遺伝子及びβ−ミクログロブリン遺伝子と同様に、
一次ＲＮＡ転写生成物の切断が他のポリアデニル化部位
において生ずる可能性がある。他方、カルシトニン遺伝
子、生長ホルモン遺伝子及びα−クリスタリン遺伝子に
おいても生ずるような他のスプライシング機構を除外す
ることはできない。 【００７０】Ｈ２遺伝子によりコードされるプレプロレ
ラキシンの一次構造 ヒト−プレプロレラキシン遺伝子の生体内プロセシング
の態様はまだ十分には理解されておらず、豚−及びラッ
ト−プレプロレラキシンとの類似性(図９〜図１０)によ
り推定するほかない。図９〜図１０において、Ｈ１遺伝
子及びＨ２遺伝子の予想されるＡ鎖及びＢ鎖構造が、他
のレラキシン類及びヒト−インスリンのそれに重ね合わ
せてある。Ｈ１におけるシグナルペプチドの切断は、Ａ
la−１、−２もしくは−４などの短い側鎖残基の後で、
又はＳer−６の後で生ずると予想されている(ハドソン
等、１９８３)。Ａla−１の後での切断は、豚プレプロ
レラキシン及びヒト−プレプロインスリンとの相同性と
一致する。同様に、Ｈ２−シグナルペプチドの切断は、
Ａla−４又はＳer−６の後で生ずる可能性もあるが、前
記の類似性からＡla−２の後で生ずると予想される。ラ
ット−及び豚−プロレラキシンとの類似性により、Ｂ鎖
／Ｃペプチド結合の切断は、Ｈ１前駆体及びＨ２前駆体
のいずれにおいてもＬeu３２の後で生ずるであろう。し
かしながら、いずれのヒト−レラキシンＢ鎖も２９−３
０位に保存されたジ塩基配列Ｌys−Ａrgを有し、この配
列が他のプロホルモンたとえばプロインスリンにおける
プロセシング部位であることが知られており、この部位
での切断を除外することはできない。このことを確定す
るためには、妊婦の黄体から分離したレラキシンの直接
アミノ酸配列分析を行うことが必要であろう。ともか
く、Ｈ１−Ｂ鎖構造の長さは３２残基(Ｌys１〜Ｌeu３
２)でありＨ２−Ｂ鎖のそれは３３残基(Ａsp−１〜Ｌeu
３２)である可能性が最も強い。Ｈ１−プロレラキシン
のＣペプチド／Ａ鎖の切断は、４個の塩基性残基中のＡ
rg１３６の後で生ずると予想されている(ハドソン等、
１９８３)。１３７−１３８におけるＡrg−Ｐroイミド
結合は蛋白質分解に対して耐性を有するからである。Ｈ
２−プロレラキシンは同じ４塩基性残基の配列を有し、
そしてＡrg１３６の後で同様のプロセシング段階が生
じ、これによりＨ１及びＨ２のレラキシンＡ鎖の長さは
いずれも２４残基であろう。 【００７１】Ｈ２−遺伝子の生物学的活性 合成された豚レラキシンペプチドについての先行する研
究において示されるように、豚−レラキシンＡ鎖及びＢ
鎖中には、生物学的活性のために必須の要素であるコア
−配列が存在する。発明者等のＨ１−レラキシンペプチ
ドについての合成研究により、完全Ｈ１−Ａ鎖(Ａrg１
３７〜Ｃys１６０)と短縮された形のＨ１−Ｂ鎖(Ｌys１
〜Ｓer２５)との組み合わせにより製造された物質が生
物学的活性を有することが示された(ハドソン等、１９
８３)。ペプチド合成を用いるＨ１−及びＨ２−遺伝子
構造についての研究により、いずれの遺伝子も、ラット
を用いる子宮収縮測定において生物学的活性を有する形
のレラキシンをコードすることが示された。 【００７２】変性させたヒト−レラキシンＨ２(hＲＬ
Ｘ)Ａ(１〜２４)−Ｂ(−１〜２４)の合成 (i) ヒト−レラキシンＡ鎖、Ｈ２−hＲＬＸ Ａ(１〜２
４)の合成 前記のcＤＮＡクローンのヌクレオチド配列から推定さ
れたヒト−レラキシンＡ鎖の１〜２４の残基に対応する
アミノ酸配列を、メリフィールド(Ｍerrifield)[例え
ば、バラニー(Ｂarany)Ｇ．及びメリフィールドＲ.Ｂ.,
Ｔhe Ｐeptides,Ｅ.Ｇross及びＪ.Ｍeienhofer,アカデ
ミック・プレス,ニューヨーク,１〜２８４頁,１９８０
年]により記載された一般的原理による固相法により合
成した。Ｎ−α−tert−ブチルオキシカルボニル＊−４
−メチルベンジル−Ｌ−システイン(＊ＢＯＣと略す)
を、タム(Ｔam)等の方法(Ｓynthesis１２,９５５〜９５
７,１９７９年)を用いて、フェニルアセトアミドメチル
(ＰＡＭ)結合を介して１％架橋ポリエチレン樹脂に、
０.３０ミリモル／g樹脂のレベルでカップリングせしめ
た。ＢＯＣ−Ｌ−ＣＹＳ−ＰＡＡＭ樹脂(８.０g)を、ベ
ックマンモデル９９０ペプチドシンセタイザーの反応容
器に入れ、そしてそれぞれ適当な保護アミノ酸を段階的
に付加することによって残基２３から１までのアミノ酸
配列を組み立てた。各アミノ酸のアミノ末端ＢＯＣ保護
基は、塩化メチレン中３５％トリフルオロ酢酸により３
０分間樹脂を処理し、そして次に、塩化メチレン中５％
ジイソプロビルエチルアミンにより１５分間中和するこ
とにより除去した。それぞれの処理の後、塩化メチレン
により樹脂を十分に洗浄した。配列中の次のアミノ酸
(α−アミノ基がＢＯＣ基により適当に保護されてお
り、必要により側鎖官能基が適当に保護されている、)
を、ジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)を使用し
ながら樹脂にカップリングせしめた。樹脂を塩化メチレ
ン中アミノ酸と共に１０分間撹拌し、その後で塩化メチ
レンに溶解したＤＣＣを導入した。各カップリングのた
めに２.５モル過剰(６.０ミリモル)のアミノ酸及びＤＣ
Ｃを使用した。１時間撹拌した後、反応混合物から樹脂
のサンブルを取り出し、そしてカイゼル(Ｋaeser)等の
ニンヒドリン法(Ａnal.Ｂiochem.,３４,５９５〜５９
８,１９７０年)を用いて遊離アミノ基の存在を試験し
た。ニンヒドリン反応が陰性であってカップリングが完
結したことが示されれば、ＢＯＣ脱保護、中和及び次の
アミノ酸のカップリングによって反応サイクルを継続し
た。ニンヒドリン試験陽性の場合には追加のアミノ酸及
びＤＣＣを用いてカップリング反応を反復した。 【００７３】側鎖官能基を有するアミノ酸は次の保護誘
導体として使用した。すなわち、Ｎ−α−ＢＯＣ−２,
６−ジクロロベンジル−Ｌ−チロシン、Ｎ−α−ＢＯＣ
−ξ−クロロベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン、
Ｎ−α−ＢＯＣ−Ｌ−セリンＯ−ベンジルエステル、Ｎ
−α−アミルオキシカルボニル−ＮG−トシル−Ｌ−ア
ルギニン、Ｎ−α−ＢＯＣ−Ｌ−スレオニンＯ−ベンジ
ルエーテル、Ｎ−α−ＢＯＣ−Ｓ−エチルメルカプト−
Ｌ−システイン(Ａ−鎖配列位置１５、１１及び１０の
システイン)である。１〜２４ペプチド配列の組立てに
続き、アミノ末端アルギニン上の最後のＢＯＣ基を、脱
保護中和サイクルを用いて除去し、そして真空中でペプ
チド樹脂を乾燥した(ペプチド−樹脂の重量１３.０g)。
ペプチド−樹脂の一部分(２g)を、アニソール(２ml)の
存在下で０℃にて３０分間無水弗化水素(ＨＦ)により処
理した。オイルポンプ真空下でＨＦを急速に除去するこ
とにより、樹脂−ペプチドと弗化水素(ＨＦ)との合計接
触時間を最小(７０分以下)に保持した。次に、樹脂−ペ
プチドを酢酸エチルにより数回洗浄することにより過剰
のアニソールを除去し、１Ｍ酢酸によりペプチドを抽出
し、そして溶液を凍結乾燥した。粗ペプチド(１０，１
１及び１５位のシステインはなおＳ−チオエチル誘導体
として保護されている)の収量は３９２mgであった。粗
ペプチドの最初の精製は０.１Ｍ酢酸中のバイオゲルＰ
１０を用いるゲル濾過により行った。分子量約３０００
に対応する位置でカラムから溶出した最大ピークを示す
分画を集め、そして凍結乾燥した。このペプチドのサン
プルのアミノ酸分析により、１〜２４配列のすべてのア
ミノ酸が正しい比率で存在することが示された。[Ｓ−
チオエチルＣys10,11,15]−hＲＬＸ Ａ(１〜２４)ペプ
チドの前記以後の精製は、ウォーターズＣ−１８ボンダ
パックカラムを用いる調製用逆相ＨＰＬＣにより、０.
１％ＴＦＡ−水−アセトニトリル溶剤系を用いて行っ
た。ゲル濾過により精製したペプチドのサンプル(８０m
g)を、ドゥー(Ｄu)等[Ｓcientia Ｓinica,１０Ｉ,８４
〜１０４(１９６１年)]に記載された方法に従って、亜
硫酸ナトリウム及びナトリウムテトラチオネートの混合
物を用いて(合計反応時間を３時間として)Ｓ−スルホン
化した。Ｓ−スルホン化中に生成した沈澱を濾過し、そ
して沈澱及び上澄液の両者を４℃にて４８時間蒸留水に
対して透析した。透析袋の内容物を凍結乾燥することに
より、上澄液から３９.５mg、Ｓ−スルホン化反応中に
生じた沈澱から２０.３mgのペプチドを得た。「可溶性」
[Ｓ−スルホＣys10,11,15,24]hＲＬＸ Ａ(１〜２４)ペ
プチドのサンプルを０.１％ＴＦＡ−水／アセトニトリ
ル溶媒系を用いて、ウォーターズＣ−１８ボンダパック
カラム上調製用逆相ＨＰＬＣにより精製した。 【００７４】(ii) 短縮されたヒト−レラキシンＢ−
鎖、Ｈ２−hＲＬＸ Ｂ(−１〜２４)の合成 Ｈ２−ヒト−レラキシンＢ−鎖の−１〜２４の残基に対
応するアミノ酸配列を前記の方法に従って合成した。こ
の合成は、０.５ミリモルＭet／gの負荷量のＮ−α−te
rt−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−メチオニン−Ｏ−ベ
ンジル−Ｌ−セリン−フェニルアセトアミド−メチルポ
リスチレン樹脂６.０gを用いて開始した。Ａ鎖の合成に
おいて使用した側鎖保護基を、Ｂ鎖の合成にも使用し
た。これには１０及び２２位の両システインのＳ−エチ
ルメルカプト誘導体が含まれる。４及び５位のグルタミ
ン酸残基及び−１位のアスパラギン酸残基はＮ−α−Ｂ
ＯＣ−ベンジルエステル誘導体として加えた。１８位の
グルタミンはＤＭＦ中のＮ−α−ＢＯＣ−Ｌ−グルタミ
ン−p−ニトロフェニルエステルを用いる活性エステル
法によりカップリングせしめた。２位のトリプトファン
のカップリングの後、トリフルオロ酢酸脱保護剤及びこ
れに次いで用いる塩化メチレン洗浄液に０．１％インド
ールを加えた。アミノ末端アスパラギン酸残基からＢＯ
Ｃ基を除去し、真空乾燥した後のペプチド−樹脂の最終
重量は８.５gであった。ペプチド−樹脂の一部(３.５g)
を、アニソール(２ml)の存在下、０℃にて３０分間無水
弗化水素で処理し、そしてＡ鎖について前記した方法を
用いてＢ鎖ペプチドを分離した。粗[Ｓ−チオエチルＣy
s10,22] hＲＬＸ Ｂ(−１〜２４)(０.９７g)を、１Ｍ酢
酸中バイオゲルＰ１０によりゲル濾過し、次いで調製用
ＨＰＬＣにより処理することにより精製した。ゲル濾過
により精製したペプチドのサンプル(１００mg)を、pＨ
８.３において３時間Ｓ−スルホン化し、反応混合物を
濾過し、そして沈澱及び上澄液を蒸留水に対して透析し
た。凍結乾燥後、４２.４mgの「可溶性」ペプチド及び５
９.５mgの「不溶性」ペプチドが回収された。Ｓ−スルホ
ン化Ｂ鎖ペプチドを、Ｃ−１８逆相カラム及び０.１％
ＴＦＡ−水−アセトニトリル溶剤系を用いる調製用ＨＰ
ＬＣによりさらに精製した。 【００７５】(iii) 鎖の結合 合成Ｈ２−hＲＬＸ Ａ(１〜２４)及びＨ２−hＲＬＸ
Ｂ(−１〜２４)ペプチドをチャンス(Ｃhance)及びホフ
マン(Ｈoffmann)によりインスリンについて記載された
方法(オーストラリア特許出願 第６８８４４／８１号)
を用いて結合せしめた。この方法においては、Ｓ−スル
ホン化ペプチドを、Ａ：Ｂ＝２６：１の比率で、ペプチ
ドの濃度をグリシン緩衝液(pＨ１０.５)中１０mg／mlと
して混合した。次に、グリシン緩衝液中ジチオスレイト
ールを、各Ｓ−スルホ基について合計１.０のスルヒド
リル基が生ずる量において加えた。次に、反応混合物を
開放容器中で２４時間撹拌した。発明者等は、この方法
の前記以外の変法として、ペプチド鎖の一方又は好まし
くは両方を、インスリンの場合についてチャンス及びホ
フマンにより記載されたＳ−スルホ形(前記)ではなくＳ
−チオエチル−Ｃys誘導体として使用することにより、
生物学的に活性なレラキシンを生成せしめるための鎖結
合反応を効果的に行うことができることを見出した。Ｓ
−チオエチルＣysペプチドの使用により、ペプチドをＳ
−スルホ誘導体に転換するのに必要な反応及び精製段階
が必要でなくなる。発明者等の経験によれば、レラキシ
ンペプチドのＳ−スルホン化反応にはＳ−スルホペプチ
ドの精製を困難にする傾向を有する副反応が伴い、これ
により収量が低下する。上記の条件を使用すれば、ウイ
ックビスト(Ｗiqvist)及びパウル(Ｐaul)(Ａcta Ｅndoc
rinol.,２９,１３５〜１３６,１９５８)のラット子宮収
縮測定における生物学的活性により測定した場合１.５
〜６.０％の鎖結合収率が達成された。 【００７６】鎖結合反応例 ヒト−レラキシンＨ２[Ｓ−チオエチルＣys10,11,15]Ａ
(１〜２４)(乾燥重量４.２mg、アミノ酸分析によるペプ
チド量２.４mg、０.８４μモル)を、３mlのプラスチッ
ク製蓋付き遠心チューブ中で５００μlの０.１Ｍグリシ
ン緩衝液(pＨ１０.５)に溶解した。ヒト−レラキシンＨ
２[Ｓ−スルホＣys10,11]Ｂ(−１〜２４)(１.６０mg、
アミノ酸分析によるペプチド量１.６mg、０.３３μモ
ル)を２００μlの０.１Ｍグリシン緩衝液(pＨ１０.５)
中に溶解し、そしてこれを前記の溶液に加え、そして混
合物を撹拌した。０.１Ｍグリシン緩衝液(pＨ１０.５)
中に調製したジチオスレイトール(ＤＴＴ)のストック溶
液(１０μl中の０.９６μモルＤＴＴ)のアリコート(２
３.０μl、２.２１μモルＤＴＴ)をペプチド溶液に加
え、そして短時間撹拌した後、反応混合物を空気に開放
して４℃にて２４時間静置した。次に混合物を遠心分離
し、そして上澄液のアリコートのレラキシン生物学的活
性をラット子宮収縮測定により測定した。反応混合物の
アリコートは、投与量に依存してラットの子宮の自発収
縮を阻害した。７５μlのアリコートにより子宮収縮が
完全に阻害され、これは、天然豚−レラキシンＡ２２Ｂ
３１標準と比較した場合５.３％の鎖結合収率に相当す
る。 【００７７】真正のヒト−レラキシンＨ２；hＲＬＸ Ａ
(１〜２４)−Ｂ(−１〜３２)の合成 (i) 全長Ｈ２−ヒト−レラキシンＢ鎖：hＲＬＸ Ｂ(−
１〜３２)の合成 全長Ｈ２−ヒト−レラキシンＢ鎖の残基−１〜＋３２に
対応するアミノ酸配列を、前記の方法を用いて合成し
た。０.２３ミリモル／gのＬeuを負荷したＮ−α−tert
−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシンフェニルアセ
タミドメチルポリスチレン樹脂６.４gを用いて開始し
た。Ａ(１〜２４)ペプチド及びＢ(−１〜２４)ペプチド
の合成のために使用した側鎖保護基を、全長Ｂ鎖合成の
ためにも使用した。これには１０位及び２２位の両シス
テインのためのＳ−エチルメルカプト誘導体が含まれ
る。この方法の変法として、２７位及び２位の配列にお
けるカップリングのためにＢＯＣ−Ｌ−トリプトファン
のＮ−ホルミル誘導体を使用した。鎖形成後のペプチド
−樹脂の最終重量は８.２gであった。ペプチド樹脂の１
部分(４.０g)を、前記の例に記載したようにして無水弗
化水素−アニソールにより処理して、１.５０gの粗[Ｓ
−チオエチルＣys10,22、Ｎ−ホルミルＴrp2,27]hＲＬ
Ｘ Ｂ(−１〜３２)を得た。粗ペプチドを、０.１Ｍ酢
酸中バイオゲルＰ６によるゲル濾過により精製した。ゲ
ル濾過カラムから溶出する大ピークを、アミノ酸分析に
より特徴付けた。−１〜＋３２のペプチド配列に一致す
る分析値を有する分画を集め、そして凍結乾燥した。ト
リプトファン残基の脱ホルミル化はペプチド(１００mg)
を水酸化ナトリウム溶液(５ml)pＨ１１.５で５分間処理
することにより行った。この間にペプチドが溶液から沈
澱した。この反応混合物を中和してペプチドを溶解し、
０.１Ｍ酢酸中バイオゲルＰ６カラムに直接適用したト
リプトファンからのホルミル基の除去は、３００nmにお
けるＮ−ホルミル吸収の消失と２８０nmに最大吸収を有
するトリプトファンに特異的なスペクトルの出現をＵＶ
スペクトル分析により追跡することにより監視した。正
しいアミノ酸分析結果を有するカラム溶出分画を集め、
そして凍結乾燥した。調製用ＨＰＬＣにより[Ｓ−チオ
エチルＣys10,22]hＲＬＸ Ｂ(−１〜３２)ペプチドを
さらに精製することは、ペプチドがカラムに吸着して減
少するために不成功に終わった。ゲルクロマトグラフィ
ーによって精製したペプチドを、鎖連結実験に直接使用
した。 【００７８】(ii) Ａ(１〜２４)とＢ(−１〜３２)との
鎖連結：ヒト−レラキシンＨ２の合成 合成Ｓ−スルホン化、及びＳ−チオエチルＨ２−ヒト−
レラキシンＡ(１〜２４)ペプチドを、短縮されたＢ鎖
(−１〜２４)と連結させるために前記したのと同じ鎖結
合法を用いて、Ｓ−チオエチルＨ２−ヒトレラキシンＢ
(−１〜３２)とカップリングせしめた。連結混合物のレ
ラキシン生物活性をラット子宮収縮測定法により試験し
た。反応混合物のアリコートは、物質の使用量と関連し
てラット子宮の自発的収縮を阻害した。１００μlのア
リコートが子宮の収縮を完全に阻害し、天然の豚レラキ
シンＡ２２Ｂ３１標準と比較した場合、鎖結合収率３.
０％に相当した。 【００７９】参考文献・ Anderson,M.L., Long,J.A.及び Hayashida,T., Immuno
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253, 2483-2495 (1978)。
【図面の簡単な説明】
【図１】 クローンの制限地図、及び配列決定の方法を
示す模式図である。 【図２】 Ｈ２及びＨ１のmＲＮＡ鎖及びアミノ酸鎖の
配列を示す配列図である(その１)。 【図３】 Ｈ２及びＨ１のmＲＮＡ鎖及びアミノ酸鎖の
配列を示す配列図である(その２)。 【図４】 Ｈ２及びＨ１のmＲＮＡ鎖及びアミノ酸鎖の
配列を示す配列図である(その３)。 【図５】 Ｈ２及びＨ１のmＲＮＡ鎖及びアミノ酸鎖の
配列を示す配列図である(その４)。 【図６】 ハイブリド形成のラジオオートグラフ図であ
る。 【図７】 ハイブリド形成のラジオオートグラフ図であ
る。 【図８】 ハイブリド形成のラジオオートグラフ図であ
る。 【図９】 ヒトインスリン及び各種のレラキシンのＢ鎖
及びＡ鎖を重ねて表示した配列図である(その１)。 【図１０】 ヒトインスリン及び各種のレラキシンのＢ
鎖及びＡ鎖を重ねて表示した配列図である(その２)。
示す模式図である。 【図２】 Ｈ２及びＨ１のmＲＮＡ鎖及びアミノ酸鎖の
配列を示す配列図である(その１)。 【図３】 Ｈ２及びＨ１のmＲＮＡ鎖及びアミノ酸鎖の
配列を示す配列図である(その２)。 【図４】 Ｈ２及びＨ１のmＲＮＡ鎖及びアミノ酸鎖の
配列を示す配列図である(その３)。 【図５】 Ｈ２及びＨ１のmＲＮＡ鎖及びアミノ酸鎖の
配列を示す配列図である(その４)。 【図６】 ハイブリド形成のラジオオートグラフ図であ
る。 【図７】 ハイブリド形成のラジオオートグラフ図であ
る。 【図８】 ハイブリド形成のラジオオートグラフ図であ
る。 【図９】 ヒトインスリン及び各種のレラキシンのＢ鎖
及びＡ鎖を重ねて表示した配列図である(その１)。 【図１０】 ヒトインスリン及び各種のレラキシンのＢ
鎖及びＡ鎖を重ねて表示した配列図である(その２)。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(72)発明者 ヒュー デイビッド ナイアル
オーストラリア国，ビクトリア，エルウ
ッド，ベンディゴ アベニュ３
(72)発明者 ジェオフリー ウィリアム トリガー
オーストラリア国，ビクトリア，ホーソ
ーン，ホーソーン グローブ62
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １． (a)以下の配列を有するヒトＨ２-レラキシンのＡ
鎖： 【化５】 および (b)以下の配列を有するヒトＨ２-レラキシンのＢ鎖： 【化６】において、Ａ鎖がアミノ末端の９個以下のアミノ酸の除
去により短縮されており、そして／またはＢ鎖がアミノ
末端の９個以下のアミノ酸の除去および／またはカルボ
キシ末端の９個以下のアミノ酸の除去により短縮されて
いるヒトＨ２-レラキシンのＡ鎖およびＢ鎖を含有す
る、レラキシン活性を有する実質的に純粋なポリペプチ
ド（Ａ鎖およびＢ鎖の両方が短縮されていないものを除
く）。 ２．Ａ鎖がアミノ末端の４個以下のアミノ酸の除去によ
り短縮されており、そして／またはＢ鎖がカルボキシ末
端の９個以下のアミノ酸の除去により短縮されている請
求項１に記載のポリペプチド。 ３．遊離のアミノ、カルボキシまたはヒドロキシ基を保
護することによりレラキシンのＡ鎖および／またはＢ鎖
が修飾されている請求項１または２に記載のポリペプチ
ド。 ４．レラキシンのＡ鎖および／またはＢ鎖がＮ-末端ア
ミノ基のところで修飾されている請求項１または２に記
載のポリペプチド。 ５．被修飾体がレラキシン活性を有するという条件のも
と、天然アミノ酸の１個以上を別のアミノ酸で置換する
ことによりヒトＨ２-レラキシンのＡ鎖および／または
Ｂ鎖が修飾されている請求項１または２に記載のポリペ
プチド。 ６．Ｂ鎖２４位のＭet残基を、バリン、アラニン、グリ
シンおよびセリンからなる群から選ばれる残基で置換す
ることによりＢ鎖が修飾されている請求項１または２に
記載のポリペプチド。 ７． (a)以下の配列を有するヒトＨ２-レラキシンのＡ
鎖： 【化１４】 および (b)以下の配列を有するヒトＨ２-レラキシンのＢ鎖： 【化１５】 において、Ａ鎖がアミノ末端の９個以下のアミノ酸の除
去により短縮されており、そして／またはＢ鎖がアミノ
末端の９個以下のアミノ酸の除去および／またはカルボ
キシ末端の９個以下のアミノ酸の除去により短縮されて
いるヒトＨ２-レラキシンのＡ鎖およびＢ鎖を含有す
る、レラキシン活性を有するポリペプチド（Ａ鎖および
Ｂ鎖の両方が短縮されていないものを除く）の製造方法
であって、Ｓ-スルホン化および／またはＳ-チオアルキ
ル化したＡ鎖とＢ鎖の混合物を還元し、該混合物を空気
中で酸化し、そして得られたポリペプチド産物を回収す
ることからなる方法。
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