JP2643428B2

JP2643428B2 - 生化学分析方法

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Publication number: JP2643428B2
Application number: JP8236089A
Authority: JP
Inventors: 順一松本
Original assignee: Shimazu Seisakusho KK
Current assignee: Shimazu Seisakusho KK
Priority date: 1989-03-31
Filing date: 1989-03-31
Publication date: 1997-08-20
Anticipated expiration: 2012-08-20
Also published as: JPH02259551A

Description

【発明の詳細な説明】（イ）産業上の利用分野この発明は、生化学分析方法に関する。さら詳しく
は、ことに血清、血漿、尿、リンパ液等の多成分を含む
生化学試料中の所定成分を定量するのに有用な分析方法
に関する。

（ロ）従来の技術従来から上記ごとき生化学試料中の所定成分の分析方
法として、試料液中に１種又は２種以上の所定の反応試
薬を混合して反応させ、この反応によって生じる試料液
の光学濃度値（吸光度値、蛍光光度値等）の変化や反応
途中の変化率に基づいて所定成分を定量する方法が、い
わゆるエンドポイント法やレート法として知られてお
り、各種自動生化学分析装置に適用されている。

そして、これらの具体的な分析において、上記光学濃
度値の変化や変化率の測定は、別に測定される反応試薬
ブランク液（試料成分未含有で同じ反応試薬を含有する
溶液）の光学濃度値Abをベースラインとして行われ、か
つ適正な定量を行う点から、ある一定の光学濃度値Ａ
（光学濃度限界値）までの光学濃度の範囲内で画一的に
行われている。

例えば、レート法においては、反応開始後から反応が
飽和する迄の反応途中における光学濃度が経時的に複数
測定されこれらの一連の実測光学濃度と時間の関係から
光学濃度変化率が求められ、定量が行われる。そして、
この変化率を求める光学濃度限界値Ａは、例えば酵素を
用いる反応試薬ではその基質の量等で規制される反応飽
和の前の光学濃度値付近とされていた。

従って、上記光学濃度限界値Ａを越えた部分について
の実測光学濃度値は変化率の測定用データの対象から外
されたことにより定量誤差の発生が極力防止されてい
た。

一方、エンドポイント法においては、反応終了状態の
光学濃度と前記試薬ブランクの光学濃度Abとの差に基づ
いて定量が行われるが、レート法の場合と同様に、所定
時間後の光学濃度が光学濃度限界値Ａを越えた場合に
は、定量が不適と判定されて再検が行われ、これにより
定量の信頼性が確保されていた。

（ハ）発明が解決しようとする課題しかしながら、上記光学濃度限界値Ａを用いるいずれ
の分析法においても、試料中に共存しうる光学的な干渉
成分、例えばビリルビン、ヘモグロビン、濁り成分等の
影響が問題となっていた。

すなわち、測定成分濃度自体が定量精度の点で適正な
範囲内であっても、これら干渉成分により光学濃度のベ
ースラインの変化をもたらし、例えばレート法の場合に
はベースライン増加時に定量のための変化率算出に供し
うる限界値Ａ内の実測光学濃度値のデータ数が減少して
定量精度の低下を招いたり、ベースライン減少時に光学
濃度定常域の値が誤って光学濃度変化域の値として算出
される不都合が生じたり、またエンドポイント法の場合
には、定量に不適と判定されて希釈した後の再検が必要
となったり、干渉成分による定量誤差が大きい、という
問題があった。

かかる干渉成分による定量操作の煩雑化や定量精度の
低下等の悪影響を防止すべく、従来から種々の提案がな
されている。例えば、特開昭57−82753号公報は、試料
と希釈液（生理的食塩水や第１試薬）の吸光度を測定し
て容量補正をし、反応スタート後得られる吸光度から差
し引く方法を提案している。また特開昭56−108941号、
同56−104238号、同56−104239号、同54−63785号は試
料と希釈液（生理的食塩水や他試薬の第１試薬）を加え
て、特定の波長で測定し干渉成分を計算し、測定すべき
波長での吸光度を計算し補正する方法を提案している。

しかしながら、上記前者の方法においては、別途希釈
液が必要であり、かつ液量の補正が必要となり、さらに
うすまりの影響を考慮する必要があるので試薬濃度を高
める必要があるという不都合があった。また、一試薬系
のものには適用ができなかった。

一方、上記後者の方法においては、装置的に別チャン
ネルが必要であるので、処理能力が低下し、かつ吸光度
の補正が必要となるなどの問題があった。

この発明は、かかる状況下なされたものであり、こと
に干渉成分の独立した測定を行うことなく、容量補正等
を行うことなく、簡便に干渉成分による悪影響を防止し
つつ所定成分の定量を行うことができる生化学分析方法
を提供するものである。

（ニ）課題を解決するための手段かくしてこの発明によれば、試料液に所定の反応試薬
を混合して反応させ、その光学濃度を経時的に測定した
後、得られた一連の実測光学濃度値における所定の光学
濃度限界値Ａの範囲内での光学濃度の変化又は変化率を
算出しこの算出値に基づいて上記試料液中の所定成分を
定量することからなり、上記試料液について反応時間
t₁,t₂における光学濃度値A_s（１）,A_s（２）と、標準試
料液について同様にして求められた反応時間t₁,T₂にお
ける光学濃度値A_st（１）,A_st（２）及び反応試薬ブラ
ンク液の光学濃度値A_bから下式（Ｉ）：に基づいて上記試料液中の干渉成分の光学濃度値A_Iを求
め、この光学濃度値A_Iによって前記一連の実測光学濃度
値又は光学濃度限界値Ａを補正した後に前記光学濃度の
変化又は変化率の算出を行うことを特徴とする生化学分
析方法が提供される。

この発明の方法は、第２図に示すごとく、反応後の２
つの反応時間における光学濃度の比b/aが被測定成分の
測定濃度範囲内で略一定（b₁/a₁≒b₂/a₂）である種々の
生化学測定項目、例えば、GOT,GPC（以上レート法）,TP
（総蛋白質）、NEFA（遊離脂肪酸）、GLU（以上エンド
ポイント法）等について適用することができる。なお、
ここで、反応時間は、２試薬系の反応試薬を用いる場合
には、第２反応試薬添加時から、１試薬系の反応試薬を
用いる場合には、その反応試薬添加時からの経過時間を
いう。

この発明は、経時的に測定された一連の実測光学濃度
値を用いて光学濃度限界値Ａ範囲内で光学濃度変化待た
は変化率を算出するに当り、この実測光学濃度値又は光
学濃度限界値Ａを前記した特定の方法で補正することを
最も特徴とするものである。

かかる補正は試料液についての反応時間t₁,t₂におけ
る光学濃度値A_s（１）,A_s（２）と、標準試料液につい
て得られた反応時間t₁,t₂における光学濃度値A
_st（１）,A_st（２）及び反応試薬ブランク液の光学濃度
値A_bを用いて行われる。ここで反応時間t₁,t₂は、反応
が飽和するまでの領域でできるだけ充分な間隔をもって
設定するのが好ましい。

また、標準試料液は、被測定成分を含有し干渉成分を
含有しないいわゆる標準液を意味し、該液中の被測定成
分の濃度は、測定濃度範囲内の濃度であればよくとくに
限界されない。例えば、生体内の標準値に設定すること
ができる。

（ホ）作用第２図に示す関係を満足する測定成分について、試料
液と標準試料液を測定した結果、第３図に示すごとき光
学濃度の変化曲線が得られた場合を想定して測定原理に
ついて説明する。

まず、反応時間t₁,t₂における試料液の光学濃度値をA
_s（１）,A_s（２）とし、標準試料液の光学濃度値をA_st
（１）,A_st（２）とし、反応試薬ブランク液の光学濃度
値をA_bとする。そして試料中の干渉成分による光学濃度
をA_Iとする。

この場合、試料液、標準液中の被測定成分の濃度の大
小を問わず、該被測定成分による光学濃度寄与分につい
てのt₁とt₂における比率は一定である。従って、この関
係からまず、下式が成立する。

従って、この関係式から、下式（Ｉ）：が導かれる。

従って、干渉成分による光学濃度値A_Iが算出でき、こ
の値を用いて試料液についての一連の実測光学濃度値を
補正することにより、干渉成分による算出定量における
種々の不都合を解消でき、レート法又はエンドポイント
法等による適正な分析を行うことができることとなる。

すなわち、レート法の場合には光学濃度限界値Ａを越
えた部分の光学濃度値は算出に使用されないため、変化
率測定に供するデータ数が減少して定量の精度が低下す
るが、上記補正によりデータ数を増加させることがで
き、定量精度が向上する。また、第３図とは逆に光学濃
度が減少する場合にも変化率測定に適さない領域のデー
タを誤って算出するようなことが排除できる。

一方、エンドポイント法の場合には、第３図の実測値
に示すように、反応が終了する迄に光学濃度が限界値Ａ
を越えると、再検が必要となるが、この発明の方法によ
れば、同様にA_Iの分だけ各実測光学濃度値が減算され
る。これにより反応が終了した時点（図中のプラトー
域）の光学濃度値も限界値Ａの範囲内となって、再検す
ることなく、定量することが可能となる。また限界値Ａ
の範囲内においても、干渉成分の誤差を簡便に除去でき
るため、定量精度をより向上化できる。

なお、かかる補正は、限界値Ａとの関係で相対的に行
われてもよいため、この限界値Ａを補正してもよい。

（ヘ）実施例第１図は、この発明の方法の実施に用いる生化学自動
分析装置の一例の構成説明図である。第１図において１
は試料分注ポンプ、２は試料分注ノズル、３は試料分注
ノズル移動機構、4,5はそれぞれ標準試料容器および標
準試料、６は試料用ターンテーブル、7,8はそれぞれ試
料容器および試料、９は反応ディスク、10,（10′,1
0″）は反応セル、11は第１試薬分注ポンプ、12は第１
試薬分注ノズル、13は第１試薬分注ノズル移動機構、14
は試薬庫、15,16はそれぞれ第１試薬容器および第１試
薬、17は分光器、18は分光器移動機構、19は制御および
データ処理コンピュータ、20は第２試薬分注ポンプ、21
は第23試薬分注ノズル、22は第２試薬分注ノズル移動機
構、23,24はそれぞれ第２試薬容器および第２試薬、25
は洗浄ポンプ、26は洗浄ノズル上下機構、27は洗浄ノズ
ルである。かかる装置において、試料分注ポンプ１と連
結されている試料分注ノズル２が試料分注ノズル移動機
構３によって移動し、標準試料容器４から一定量の標準
試料５を吸引し、続いて試料用ターンテーブル６にセッ
トされた試料容器７から一定量の試料８を吸引し、反応
ディスク９に配置されている反応セル10の中に試料８お
よび標準試料５を分注する。反応ディスク９が回転して
反応セル10が１ステップ進んだところで、第１試薬分注
ポンプ11と連結されている第１試薬分注ノズル12が第１
試薬分注ノズル移動機構13によって移動し、試薬庫14内
にセットされている第１試薬容器15から一定量の第１試
薬16を吸引し、続いて反応セル10′のところに移動して
反応セル10′内に分注する。このとき、一試薬系の反応
試薬を用いる項目の反応セルについて、分光器17が分光
器移動機構18により反応ディスク９と同じ軸の回りに往
復回転しながら、吸光度（Yt）を順次経時的に測定しな
がら制御およびデータ処理コンピュータ19に記憶する。

次いで反応セル10が反応セル10″の位置にきたところ
で第２試薬分注ポンプ20と連結した第２試薬分注ノズル
21が第２試薬分注ノズル移動機構22に上がって移動し、
試薬庫14内にセットされている第２試薬容器23から一定
量の第２試薬24を吸引し、続いて反応セル10″のところ
に移動して２試薬系の反応試薬を用いる項目の反応セル
10″内に分注する。第２試薬添加後に反応セル10″が洗
浄ポンプ25に連結され、洗浄ノズル上下機構26により上
下する洗浄ノズル27に位置に進むまでの間も前記のごと
き各位置での吸光度Y_tが測定されコンビュータ19に記憶
されている。そして、制御およびデータ処理コンビュー
タ19は、各部の動作を同期制御すると同時に、１試薬系
の項目については第１試薬分注後（反応開始後）からの
反応時間t₁,T₂における吸光度データA_s（１）,A_s（２）
及び２試薬系の項目については第２試薬分注後（反応開
始後）の反応時間t₁,T₂における吸光度データA_s（１）,
A_s（２）と予め標準試料液について求められた反応時間
t₁,t₂における吸光度データA_st（１）,A_st（２）及び反
応試薬ブランク液の光学濃度値A_bをパラメータとして前
記式（Ｉ）から干渉成分の光学濃度値A_Iを算出し、次い
でこのA_Iで上記吸光度（Y_t）を補正し、この派生された
吸光度データに基づいて各々所定の限界吸光度Ａの範囲
内でレート測定又はエンドポイント測定を行い、各測定
成分の定量値を換算測定する。

以下、実際に実施した際のデータについて説明する。

総蛋白（TP）の測定総蛋白を5.5g/dl（測定至適範囲）含有する液を試料
液とし、これにヘモグロビン（干渉成分:Hb）の希釈系
列を添加し、ヘモグロビンの濃度が100,200,300,400,50
0mg/dlになるように調製したものについて測定を行っ
た。反応試薬としては、１試薬系のTP測定用反応試薬
（和光純薬（株）製）を用いた。

この際の最終吸光度（ｎ＝５の平均値）を以下に示
す。

この結果に示されるように、ヘモグロビンは総蛋白の
測定時に吸光度のプラスの干渉成分となるため、その量
に応じて、各実測吸光度値が増加していることが判る。
そして、前記生化学分析装置においては、総蛋白の測定
時はエンドポイント法で行われる。

そこで、まず、上記試料液のうちのHb濃度500mg/dlの
吸光度の補正をこの発明の方法により行った。

標準試料液として用いたのは総蛋白4g/dl含有のHb未
含有の溶液である。

前記試料液及び標準試料液についてもt₁＝0.3分、T₂
＝6.0分における吸光度を測定した。この結果は以下の
通りであった。

上記各吸光度値及び反応試薬ブランク値（16mAbs）を
用いて、式（Ｉ）によって干渉成分の吸光度A_Iを算出し
たところ、A_I＝58.4mAbsの値が得られた。そこで、この
値の試料液の最終吸光度から減算することにより、干渉
成分の液晶が排除された試料液の補正吸光度143.1mAbs
が算出された同様にしてHb濃度が異なる他の試料液について各々式
（Ｉ）により同様な吸光度補正を行った結果を下表に示
す（ｎ＝５）。

なお、Hb濃度ゼロのものについての吸光度は139.1mAb
sであった。

このように、この発明の方法によれば、干渉成分の多
少に拘わらず、その光学的影響を除去することができ、
その結果補正吸光度を用いて精度良く目的成分たる総蛋
白の定量を行え、再検数も減少できることが判る。

なお、総蛋白10g/dlの溶液を標準試料液として用いて
同様に補正を行ったところ、補正吸光度は、136.5〜14
3,5mAbsの値となり、ほぼ同様の結果が得られた。

（ト）発明の効果この発明によれば、干渉成分の独立した測定や容量補
正等を行うことなく簡便に干渉成分の悪影響を排除して
所定成分の定量を行うことができ、ことにエンドポイン
ト法においては再検の煩雑さを減少でき、レート法にお
いては測定精度をより向上することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の生化学分析方法を実施する装置を
例示する構成説明図、第２図及び第３図は、この発明の
方法の原理説明図である。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】試料液に所定の反応試薬を混合して反応さ
せ、その光学濃度を経時的に測定した後、得られた一連
の実測光学濃度値における所定の光学濃度限界値Ａの範
囲内での光学濃度の変化又は変化率を算出しこの算出値
に基づいて上記試料液中の所定成分を定量することから
なり、上記試料液についての反応時間t₁,t₂における光学濃度
値A_s（１）、A_s（２）と、標準試料液について同様にし
て求められた反応時間t₁,t₂における光学濃度値A
_st（１）、A_st（２）及び反応試薬ブランク液の光学濃
度値A_bから下式（Ｉ）：に基づいて上記試料液中の干渉成分の光学濃度値A_Iを求
め、この光学濃度値A_Iによって前記一連の実測光学濃度
値又は光学濃度限界値Ａを補正した後に前記光学濃度の
変化又は変化率の算出を行うことを特徴とする生化学分
析方法。