JP2638877B2 - 免疫化学的測定法 - Google Patents
免疫化学的測定法Info
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- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
- G01N33/5438—Electrodes
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- G—PHYSICS
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、微量な抗原または抗体を検出できる免疫化
学的測定法に関し、特に酵素免疫測定法において水素イ
オン選択性電極あるいは水素イオン感応性FETを検出電
極に用いる免疫化学的測定法に関する。
学的測定法に関し、特に酵素免疫測定法において水素イ
オン選択性電極あるいは水素イオン感応性FETを検出電
極に用いる免疫化学的測定法に関する。
［従来の技術］ 抗原−抗体反応の特異性を利用した微量の抗原あるい
は抗体の測定法として酵素免疫測定法（Enzyme immunoa
ssay,以下EIAと略す）が知られている。
は抗体の測定法として酵素免疫測定法（Enzyme immunoa
ssay,以下EIAと略す）が知られている。
EIAの原理は次のようである。サンドイッチ法の場
合、測定すべき抗原または抗体を、それと特異的に反応
する固定化された抗体または抗原と反応させた後、未反
応物を取除き、さらに測定すべき抗原または抗体と特異
的に反応する酵素標識された抗体または抗原と反応させ
る。その後、未反応物を除き、抗原−抗体反応により固
定化された酵素標識抗体または抗原の割合を酵素反応の
測定から求めることにより、被測定抗原または抗体の量
を測定することができる。また、競合法の場合、測定す
べき抗原または抗体を含む溶液に所定量の標識抗原また
は標識抗体を添加し、測定すべき抗原または抗体と特異
的に反応する固定化された抗体または抗原と反応させた
後、未反応物を取除き、反応により固定化された酵素標
識抗原または抗体の割合を酵素反応の測定から求めるこ
とにより、被測定抗原または抗体の量を測定することが
できる。
合、測定すべき抗原または抗体を、それと特異的に反応
する固定化された抗体または抗原と反応させた後、未反
応物を取除き、さらに測定すべき抗原または抗体と特異
的に反応する酵素標識された抗体または抗原と反応させ
る。その後、未反応物を除き、抗原−抗体反応により固
定化された酵素標識抗体または抗原の割合を酵素反応の
測定から求めることにより、被測定抗原または抗体の量
を測定することができる。また、競合法の場合、測定す
べき抗原または抗体を含む溶液に所定量の標識抗原また
は標識抗体を添加し、測定すべき抗原または抗体と特異
的に反応する固定化された抗体または抗原と反応させた
後、未反応物を取除き、反応により固定化された酵素標
識抗原または抗体の割合を酵素反応の測定から求めるこ
とにより、被測定抗原または抗体の量を測定することが
できる。
従来、上記したような方法で用いられてきた酵素標識
された抗原または抗体を測定するための酵素活性測定の
手段としては、酵素の作用をうける基質または生成物の
吸光度や螢光の測定や、酸素電極などを用いる溶存酸素
の変化の測定、およびイオン選択性電極によるpH変化の
測定等が用いられてきた。このうち、pH変化による酵素
活性測定法は、pH電極として水素イオン感応性FET（以
下、ISFETと略す）を使用することができ、このため、I
SFETを用いた微量なサンプルを測定できるセンサの実現
が期待されている。
された抗原または抗体を測定するための酵素活性測定の
手段としては、酵素の作用をうける基質または生成物の
吸光度や螢光の測定や、酸素電極などを用いる溶存酸素
の変化の測定、およびイオン選択性電極によるpH変化の
測定等が用いられてきた。このうち、pH変化による酵素
活性測定法は、pH電極として水素イオン感応性FET（以
下、ISFETと略す）を使用することができ、このため、I
SFETを用いた微量なサンプルを測定できるセンサの実現
が期待されている。
［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、グルコースオキシダーゼを標識酵素に
用いる免疫化学的測定法において、水素イオン選択性電
極または水素イオン感応性FETを検出電極として用いた
場合、免疫反応によりグルコースオキシダーゼで標識さ
れた抗体または抗原が検出電極に固定化された後、グル
コースオキシダーゼにより酸化されるグルコースを含む
酵素活性測定溶液に上記検出電極を浸して標識酵素の量
を測定した場合、pH変化が遅いと共に、その値も小さ
く、実用化するには不十分なものであった。
用いる免疫化学的測定法において、水素イオン選択性電
極または水素イオン感応性FETを検出電極として用いた
場合、免疫反応によりグルコースオキシダーゼで標識さ
れた抗体または抗原が検出電極に固定化された後、グル
コースオキシダーゼにより酸化されるグルコースを含む
酵素活性測定溶液に上記検出電極を浸して標識酵素の量
を測定した場合、pH変化が遅いと共に、その値も小さ
く、実用化するには不十分なものであった。
本発明の目的は、酵素免疫測定において水素イオン選
択性電極やISFETを検出電極とする場合に、十分大きなp
H変化が得られ、かつ速いスピードで測定することを可
能にする高感度な免疫化学的測定法を提供することにあ
る。
択性電極やISFETを検出電極とする場合に、十分大きなp
H変化が得られ、かつ速いスピードで測定することを可
能にする高感度な免疫化学的測定法を提供することにあ
る。
［課題を解決するための手段］ 本発明は、酵素標識抗原または抗体を用いた酵素免疫
測定法において、標識抗原あるいは標識抗体として、少
なくともグルコースオキシダーゼおよびグルコノラクト
ナーゼの２種類の酵素で標識された抗原あるいは抗体を
用い、かつ免疫反応の検出電極として水素イオン選択性
電極ないしは水素イオン選択性FETを用いてなることを
特徴とする免疫化学的測定法である。
測定法において、標識抗原あるいは標識抗体として、少
なくともグルコースオキシダーゼおよびグルコノラクト
ナーゼの２種類の酵素で標識された抗原あるいは抗体を
用い、かつ免疫反応の検出電極として水素イオン選択性
電極ないしは水素イオン選択性FETを用いてなることを
特徴とする免疫化学的測定法である。
［作用］ 本発明において、グルコースオキシダーゼおよびグル
コノラクトナーゼで標識された抗体あるいは抗原は、免
疫反応により検出電極表面に固定化された後、グルコー
ス溶液に浸されることにより次の反応を引起す。
コノラクトナーゼで標識された抗体あるいは抗原は、免
疫反応により検出電極表面に固定化された後、グルコー
ス溶液に浸されることにより次の反応を引起す。
グルコースオキシダーゼだけで標識した場合、グルコ
ースがグルコースオキシダーゼにより酸化されて生成し
たグルコノラクトンは、グルコン酸に変化するのに時間
がかかる。このためpH電極で検出する方法では、pH変化
が緩慢で小さな信号しか得られなかった。一方、グルコ
ースオキシダーゼとグルコノラクトナーゼで標識した場
合は、グルコースがグルコースオキシダーゼにより酸化
されて生成したグルコノラクトンは、直ちにグルコノラ
クトナーゼにより加水分解されてグルコン酸になり、大
きなpH変化を引起す。このため、イオン選択性電極やIS
FETで検出する場合も、大きな信号が得られる。
ースがグルコースオキシダーゼにより酸化されて生成し
たグルコノラクトンは、グルコン酸に変化するのに時間
がかかる。このためpH電極で検出する方法では、pH変化
が緩慢で小さな信号しか得られなかった。一方、グルコ
ースオキシダーゼとグルコノラクトナーゼで標識した場
合は、グルコースがグルコースオキシダーゼにより酸化
されて生成したグルコノラクトンは、直ちにグルコノラ
クトナーゼにより加水分解されてグルコン酸になり、大
きなpH変化を引起す。このため、イオン選択性電極やIS
FETで検出する場合も、大きな信号が得られる。
［実施例］ 以下本発明の一実施例について図面を参照して詳細に
説明する。
説明する。
本実施例では人免疫グロブリンＧ（以下、人IgGと略
す）を検出する場合について述べる。グルコースオキシ
ダーゼおよびグルコノラクトナーゼをそれぞれ5mgおよ
び10mgを、1.25％グルタルアルデヒドを含む0.2Mリン酸
緩衝液（pH6.8）0.3ml中に溶かし、室温で20時間放置し
た後、セファデックスカラムを用い、0.15M塩化ナトリ
ウム（NaCl）で平衡化、溶出する。その後、グルコース
オキシダーゼおよびグルコノラクトナーゼ溶液1mlを、
抗人ヒツジIgG5mgを含む0.15MのNaCl溶液1.0mlおよび1M
炭酸ソーダ緩衝液（pH9.5）0.1mlと混合し、４℃で２時
間放置した後、生理食塩緩衝液に対し透析を行う。以上
のようにしてグルコースオキシダーゼおよびグルコノラ
クトナーゼで標識された抗人ヒツジIgGが得られた。
す）を検出する場合について述べる。グルコースオキシ
ダーゼおよびグルコノラクトナーゼをそれぞれ5mgおよ
び10mgを、1.25％グルタルアルデヒドを含む0.2Mリン酸
緩衝液（pH6.8）0.3ml中に溶かし、室温で20時間放置し
た後、セファデックスカラムを用い、0.15M塩化ナトリ
ウム（NaCl）で平衡化、溶出する。その後、グルコース
オキシダーゼおよびグルコノラクトナーゼ溶液1mlを、
抗人ヒツジIgG5mgを含む0.15MのNaCl溶液1.0mlおよび1M
炭酸ソーダ緩衝液（pH9.5）0.1mlと混合し、４℃で２時
間放置した後、生理食塩緩衝液に対し透析を行う。以上
のようにしてグルコースオキシダーゼおよびグルコノラ
クトナーゼで標識された抗人ヒツジIgGが得られた。
次に、得られた酵素標識された抗人ヒツジIgGを用い
て人IgGの濃度を次のようにして測定した。
て人IgGの濃度を次のようにして測定した。
まず、第１図（ａ）に示すように抗人ヒツジIgGが表
面に固定化されたISFET 1を、人IgGを含む被測定溶液２
に５分間浸し、抗原−抗体反応を行わせる。更に、この
ISFET 1を第１図（ｂ）に示すように、上記グルコース
オキシダーゼおよびグルコノラクトナーゼで標識された
抗人ヒツジIgG溶液３に５分間浸す。その後、第１図
（ｃ）に示すように上記ISFET 1をグルコース濃度500mg
/dlの0.01mM、pH6.8リン酸緩衝液４に浸し、ISFET 1の
表面に固定化された膜中のpH変化を測定した。
面に固定化されたISFET 1を、人IgGを含む被測定溶液２
に５分間浸し、抗原−抗体反応を行わせる。更に、この
ISFET 1を第１図（ｂ）に示すように、上記グルコース
オキシダーゼおよびグルコノラクトナーゼで標識された
抗人ヒツジIgG溶液３に５分間浸す。その後、第１図
（ｃ）に示すように上記ISFET 1をグルコース濃度500mg
/dlの0.01mM、pH6.8リン酸緩衝液４に浸し、ISFET 1の
表面に固定化された膜中のpH変化を測定した。
第２図は、人IgGの濃度が10、20および30μＭの場合
に対する、免疫反応後にISFETがグルコース溶液に浸さ
れた時の応答特性を示す図である。ISFETの出力は、ソ
ースフォロワー回路により測定した。第２図に示すよう
に、ISFETの出力は、時間と共に増加した。ISFETをグル
コース溶液に浸して１分後のISFETの出力と人IgG濃度と
の関係を第３図に示す。
に対する、免疫反応後にISFETがグルコース溶液に浸さ
れた時の応答特性を示す図である。ISFETの出力は、ソ
ースフォロワー回路により測定した。第２図に示すよう
に、ISFETの出力は、時間と共に増加した。ISFETをグル
コース溶液に浸して１分後のISFETの出力と人IgG濃度と
の関係を第３図に示す。
本実施例からわかるように、グルコースオキシダーゼ
と共にグルコノラクトナーゼを標識すると、免疫反応後
のISFETはグルコース浸漬時に短時間で大きな出力が得
られ、高感度な測定ができるようになった。
と共にグルコノラクトナーゼを標識すると、免疫反応後
のISFETはグルコース浸漬時に短時間で大きな出力が得
られ、高感度な測定ができるようになった。
なお、本実施例では、グルコースオキシダーゼとグル
コノラクトナーゼを同時に抗体と反応させる標識抗体を
得たが、グルコースオキシダーゼとグルコノラクトナー
ゼを別々に抗体と反応させた後、混ぜて用いることも可
能である。
コノラクトナーゼを同時に抗体と反応させる標識抗体を
得たが、グルコースオキシダーゼとグルコノラクトナー
ゼを別々に抗体と反応させた後、混ぜて用いることも可
能である。
［発明の効果］ 以上説明したように、本発明によれば、ISFETのよう
なポテンショメトリーによる検出電極を用い酵素免疫セ
ンサを構成した場合においても、高感度な測定が可能に
なる。これは、ポテンショメトリー型酵素免疫センサに
おいて、グルコースを基質に用いた場合、従来アンペロ
メトリー型酵素免疫センサで行われたグルコースオキシ
ダーゼだけで標識した抗体あるいは抗原を使用すると、
免疫反応により検出電極の表面に固定化されるグルコー
スオキシダーゼは、グルコースをグルコノラクトンに酸
化するが、グルコノラクトンがイオン電極やISFETによ
り検出できるグルコン酸に変化するためには長時間かか
り、免疫センサからの出力は非常に小さくなるのに対
し、グルコースオキシダーゼと共にグルコノラクトナー
ゼも同時に標識することにより、免疫反応により検出電
極にはグルコースオキシダーゼと共にグルコノラクトナ
ーゼも固定化され、グルコースオキシダーゼにより酸化
されてグルコノラクトンになったグルコースは、すみや
かに加水分解されてグルコン酸になり、短時間で大きな
pH変化を引起し、水素イオン電極やISFETを使用する場
合にも高感度な測定が可能になる。
なポテンショメトリーによる検出電極を用い酵素免疫セ
ンサを構成した場合においても、高感度な測定が可能に
なる。これは、ポテンショメトリー型酵素免疫センサに
おいて、グルコースを基質に用いた場合、従来アンペロ
メトリー型酵素免疫センサで行われたグルコースオキシ
ダーゼだけで標識した抗体あるいは抗原を使用すると、
免疫反応により検出電極の表面に固定化されるグルコー
スオキシダーゼは、グルコースをグルコノラクトンに酸
化するが、グルコノラクトンがイオン電極やISFETによ
り検出できるグルコン酸に変化するためには長時間かか
り、免疫センサからの出力は非常に小さくなるのに対
し、グルコースオキシダーゼと共にグルコノラクトナー
ゼも同時に標識することにより、免疫反応により検出電
極にはグルコースオキシダーゼと共にグルコノラクトナ
ーゼも固定化され、グルコースオキシダーゼにより酸化
されてグルコノラクトンになったグルコースは、すみや
かに加水分解されてグルコン酸になり、短時間で大きな
pH変化を引起し、水素イオン電極やISFETを使用する場
合にも高感度な測定が可能になる。
第１図は、本発明の方法によって抗人ヒツジIgGが表面
に固定化されたISFETを用いて人IgGを測定する手順を示
す説明図、第２図は免疫反応後のISFETがグルコース溶
液に浸された時の応答特性を示す図、第３図はISFETの
出力と人IgG濃度との関係を示す図である。 １……ISFET ２……被測定溶液 ３……標識抗人ヒツジIgG溶液 ４……リン酸緩衝液 ５……参照電極
に固定化されたISFETを用いて人IgGを測定する手順を示
す説明図、第２図は免疫反応後のISFETがグルコース溶
液に浸された時の応答特性を示す図、第３図はISFETの
出力と人IgG濃度との関係を示す図である。 １……ISFET ２……被測定溶液 ３……標識抗人ヒツジIgG溶液 ４……リン酸緩衝液 ５……参照電極
Claims (1)
- 【請求項１】酵素標識抗原または抗体を用いた酵素免疫
測定法において、標識抗原あるいは標識抗体として、少
なくともグルコースオキシダーゼおよびグルコノラクト
ナーゼの２種類の酵素で標識された抗原あるいは抗体を
用い、かつ免疫反応の検出電極として水素イオン選択性
電極ないしは水素イオン選択性FETを用いてなることを
特徴とする免疫化学的測定法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63027471A JP2638877B2 (ja) | 1988-02-10 | 1988-02-10 | 免疫化学的測定法 |
| DE89301237T DE68912151D1 (de) | 1988-02-10 | 1989-02-09 | Elektrochemische Sensoren für immunologische Testverfahren. |
| EP19890301237 EP0328380B1 (en) | 1988-02-10 | 1989-02-09 | Electrochemical sensors in immunological measurement |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63027471A JP2638877B2 (ja) | 1988-02-10 | 1988-02-10 | 免疫化学的測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01203962A JPH01203962A (ja) | 1989-08-16 |
| JP2638877B2 true JP2638877B2 (ja) | 1997-08-06 |
Family
ID=12222028
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63027471A Expired - Lifetime JP2638877B2 (ja) | 1988-02-10 | 1988-02-10 | 免疫化学的測定法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0328380B1 (ja) |
| JP (1) | JP2638877B2 (ja) |
| DE (1) | DE68912151D1 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2591641B2 (ja) * | 1988-02-19 | 1997-03-19 | 株式会社クラレ | 微量アナライト物質の測定方法及び測定装置 |
| DE4028086A1 (de) * | 1990-09-05 | 1992-03-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Stabile 6-phosphogluconolactonase, verfahren zu deren gewinnung sowie verwendung des enzyms zur bestimmung |
| DE4216980C2 (de) * | 1992-05-19 | 1994-04-21 | Eppendorf Geraetebau Netheler | Immunosensorisches Nachweisverfahren |
| US5427912A (en) * | 1993-08-27 | 1995-06-27 | Boehringer Mannheim Corporation | Electrochemical enzymatic complementation immunoassay |
| AU2949795A (en) * | 1994-12-19 | 1996-07-10 | Boehringer Mannheim Corporation | Competitive binding assays having improved linearity |
| EP1084409B1 (en) | 1998-06-01 | 2004-05-12 | Roche Diagnostics Corporation | Method and device for electrochemical immunoassay of multiple analytes |
| DE60029127T2 (de) | 1999-11-16 | 2007-05-31 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd., Kadoma | Biosensor |
| WO2008102639A1 (ja) * | 2007-02-20 | 2008-08-28 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | グルコースの電気化学的定量方法、グルコース脱水素酵素組成物、及び、グルコース測定用電気化学センサー |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8314523D0 (en) * | 1983-05-25 | 1983-06-29 | Lowe C R | Diagnostic device |
| GB8406955D0 (en) * | 1984-03-16 | 1984-04-18 | Serono Diagnostics Ltd | Assay |
-
1988
- 1988-02-10 JP JP63027471A patent/JP2638877B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-02-09 DE DE89301237T patent/DE68912151D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-02-09 EP EP19890301237 patent/EP0328380B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0328380A2 (en) | 1989-08-16 |
| DE68912151D1 (de) | 1994-02-24 |
| EP0328380A3 (en) | 1990-06-27 |
| JPH01203962A (ja) | 1989-08-16 |
| EP0328380B1 (en) | 1994-01-12 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |