JPH10267888A - バイオセンサ - Google Patents
バイオセンサInfo
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- JPH10267888A JPH10267888A JP9107997A JP10799797A JPH10267888A JP H10267888 A JPH10267888 A JP H10267888A JP 9107997 A JP9107997 A JP 9107997A JP 10799797 A JP10799797 A JP 10799797A JP H10267888 A JPH10267888 A JP H10267888A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】従来、電気化学デバイスで検知できなかった代
謝関連物質や疾患特有の酵素やタンパク質を複合酵素系
や抗体−酵素系を用いて測定できるデバイス、及びその
作製法を提供することである。 【解決手段】第一に代謝関連物質を多孔性金属電極に固
定化した酵素によって中間生成物を得て、これを更に同
時に固定化した別種の酵素によって電極検知物質に変換
する。第二にマーカー酵素やマーカー物質を多孔性金属
電極にあらかじめ固定化しておいた抗体と結合させ、抗
体−酵素系を孔内部に形成させ、マーカー酵素の酵素反
応で生成される（電極不活性）物質をもうひとつの酵素
によって電極活性物質に変換することによって、マーカ
ー物質量の測定ができ、上記課題が解決可能である。酵
素活性を持たないタンパク質では酵素標識タンパク質と
の競争反応、酵素標識抗体とのサンドイッチ結合法も採
択可能である。
謝関連物質や疾患特有の酵素やタンパク質を複合酵素系
や抗体−酵素系を用いて測定できるデバイス、及びその
作製法を提供することである。 【解決手段】第一に代謝関連物質を多孔性金属電極に固
定化した酵素によって中間生成物を得て、これを更に同
時に固定化した別種の酵素によって電極検知物質に変換
する。第二にマーカー酵素やマーカー物質を多孔性金属
電極にあらかじめ固定化しておいた抗体と結合させ、抗
体−酵素系を孔内部に形成させ、マーカー酵素の酵素反
応で生成される（電極不活性）物質をもうひとつの酵素
によって電極活性物質に変換することによって、マーカ
ー物質量の測定ができ、上記課題が解決可能である。酵
素活性を持たないタンパク質では酵素標識タンパク質と
の競争反応、酵素標識抗体とのサンドイッチ結合法も採
択可能である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、所定条件下にて、
液体、特に血液、尿等の体液や測定試料中に含まれる特
定酵素、例えばグルタミン酸−オキザロ酢酸転移酵素
（ＧＯＴ）、および特定基質、例えばコレステロールエ
ステルなどの濃度に対応した電気化学的な応答を示すバ
イオセンサおよび測定試料中の特定酵素及び特定タンパ
ク質の量を測定するバイオセンサに関する。
液体、特に血液、尿等の体液や測定試料中に含まれる特
定酵素、例えばグルタミン酸−オキザロ酢酸転移酵素
（ＧＯＴ）、および特定基質、例えばコレステロールエ
ステルなどの濃度に対応した電気化学的な応答を示すバ
イオセンサおよび測定試料中の特定酵素及び特定タンパ
ク質の量を測定するバイオセンサに関する。
【０００２】
【従来の技術】白金や炭素電極表面に酵素や抗体、微生
物等の生物自体より成る生体機能物質を固定化したバイ
オセンサが種々の化学物質及び生体物質の量や濃度を迅
速かつ連続的に測定できることは既に知られている。
物等の生物自体より成る生体機能物質を固定化したバイ
オセンサが種々の化学物質及び生体物質の量や濃度を迅
速かつ連続的に測定できることは既に知られている。
【０００３】このバイオセンサは、その特長を活かして
様々な分野において利用されているが、特に盛んに利用
されているのは臨床検査の分野においてである。この様
なバイオセンサを化学物質の計測と酵素量の測定につい
て以下詳細に説明する。
様々な分野において利用されているが、特に盛んに利用
されているのは臨床検査の分野においてである。この様
なバイオセンサを化学物質の計測と酵素量の測定につい
て以下詳細に説明する。
【０００４】化学物質のうち単一酵素を用いて電極活性
物質が生成される場合には、バイオセンサは一般的に平
板状の白金等の電極の表面に固定化酵素膜を装着した構
造を有している。その作製法としては、別途調製した固
定化酵素膜を白金等の電極表面に張り付けるという方法
がしばしば用いられている。例えば、グルコースセンサ
では、酵素固定化膜にはグルコースオキシダーゼが固定
化されており、この酵素が血液、尿等の体液中のグルコ
ースに特異的に働いて、 グルコース＋Ｏ２＋Ｈ２Ｏ −−−→ グルコン酸＋Ｈ２Ｏ２ （１） の反応を引き起こす。この反応により発生した過酸化水
素の量を電気化学的方法により測定することによって体
液中のグルコース量や濃度を測定している。
物質が生成される場合には、バイオセンサは一般的に平
板状の白金等の電極の表面に固定化酵素膜を装着した構
造を有している。その作製法としては、別途調製した固
定化酵素膜を白金等の電極表面に張り付けるという方法
がしばしば用いられている。例えば、グルコースセンサ
では、酵素固定化膜にはグルコースオキシダーゼが固定
化されており、この酵素が血液、尿等の体液中のグルコ
ースに特異的に働いて、 グルコース＋Ｏ２＋Ｈ２Ｏ −−−→ グルコン酸＋Ｈ２Ｏ２ （１） の反応を引き起こす。この反応により発生した過酸化水
素の量を電気化学的方法により測定することによって体
液中のグルコース量や濃度を測定している。
【０００５】ところで、従来の酵素センサは電極活物質
を生成する場合には上記の電極検知法が有効であるが、
生成物が電極検知できない場合には電極法を採用できな
い。そこで、もうひとつの酵素を用いて、中間生成物を
更に変換して、生成物として電極活物質を得ようとする
方法、いわゆる複合酵素系の採用が試みられている。た
とえば、複数の酵素を膜状に固定し、これを電極に張り
付ける方法などがある。
を生成する場合には上記の電極検知法が有効であるが、
生成物が電極検知できない場合には電極法を採用できな
い。そこで、もうひとつの酵素を用いて、中間生成物を
更に変換して、生成物として電極活物質を得ようとする
方法、いわゆる複合酵素系の採用が試みられている。た
とえば、複数の酵素を膜状に固定し、これを電極に張り
付ける方法などがある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】上述のような従来技術
のバイオセンサに鑑み、発明が解決しようとする課題は
複数かつ多量の酵素を極めて多孔性に富む金属電極に主
として共有結合によって固定化し、その際の酵素のうち
少なくとも一種類の酵素が体液中の成分を認識分解した
ときの生成物を、同時に固定化した酵素によって電極活
物質に変換し検知しようとするものである。
のバイオセンサに鑑み、発明が解決しようとする課題は
複数かつ多量の酵素を極めて多孔性に富む金属電極に主
として共有結合によって固定化し、その際の酵素のうち
少なくとも一種類の酵素が体液中の成分を認識分解した
ときの生成物を、同時に固定化した酵素によって電極活
物質に変換し検知しようとするものである。
【０００７】更に、多孔性に富む金属電極に特定酵素を
認識する抗体を共有結合し体液中の酵素を多孔性電極に
免疫化学的に間接固定化することによって、この酵素の
生成物が電極活性物質でなくても、同時に固定化した酵
素によって電極活物質に変換されることによって検知し
ようとするものである。
認識する抗体を共有結合し体液中の酵素を多孔性電極に
免疫化学的に間接固定化することによって、この酵素の
生成物が電極活性物質でなくても、同時に固定化した酵
素によって電極活物質に変換されることによって検知し
ようとするものである。
【０００８】この様な方法によって体液中の代謝成分や
タンパク質成分を測定できるバイオセンサを提供でき
る。ここで、タンパク質成分が触媒活性を持たないとき
は一定量の酵素標識タンパク質と試料中の特定タンパク
質との競争的結合法により特定タンパク質を測定でき
る。
タンパク質成分を測定できるバイオセンサを提供でき
る。ここで、タンパク質成分が触媒活性を持たないとき
は一定量の酵素標識タンパク質と試料中の特定タンパク
質との競争的結合法により特定タンパク質を測定でき
る。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記の課題は、複数の酵
素、あるいは酵素と抗体を局所的空間に配置することに
よって解決されることが見出された。
素、あるいは酵素と抗体を局所的空間に配置することに
よって解決されることが見出された。
【０００１０】即ち、第一のアプローチにおいて、本発
明はポーラスな表面を有する金黒等の電極材料、転移酵
素、合成酵素等の一群の酵素、酸化還元酵素などの電極
活性物質を生成する酵素から成る。更に体液中のアミノ
基転移酵素等の量を測定対象とする際には、その酵素に
対する抗体と当該酵素の生成物を酸化する酵素から成る
抗体及び酵素を固定化した多孔性金属電極を用いる。
明はポーラスな表面を有する金黒等の電極材料、転移酵
素、合成酵素等の一群の酵素、酸化還元酵素などの電極
活性物質を生成する酵素から成る。更に体液中のアミノ
基転移酵素等の量を測定対象とする際には、その酵素に
対する抗体と当該酵素の生成物を酸化する酵素から成る
抗体及び酵素を固定化した多孔性金属電極を用いる。
【０００１１】本発明において、多孔性電極とは電極の
表面に塩化金酸等の金属化合物を還元的（電気化学的に
負の電位をかける）に析出させたもので、表面積は平滑
電極に対して、約数百倍から数千倍となったものをい
う。
表面に塩化金酸等の金属化合物を還元的（電気化学的に
負の電位をかける）に析出させたもので、表面積は平滑
電極に対して、約数百倍から数千倍となったものをい
う。
【０００１２】本発明においては複合酵素系を構築する
が、ここで複合酵素系とは直接複合酵素系と間接複合酵
素系から成る。直接複合酵素系は体液などの測定試料に
浸漬すると下記のように二種類の酵素によって電極不活
性の基質Ａ（測定対象）から電極活性物質が生成される
場合をいう。
が、ここで複合酵素系とは直接複合酵素系と間接複合酵
素系から成る。直接複合酵素系は体液などの測定試料に
浸漬すると下記のように二種類の酵素によって電極不活
性の基質Ａ（測定対象）から電極活性物質が生成される
場合をいう。
【０００１３】更に、間接複合酵素系では抗体による測
定試料中の特定酵素が結合固定化されることによって、
初めて複合酵素系が形成される。即ち、複合酵素系が形
成されて、下記のように測定試料中の酵素量が測定さ
れ、その酵素量が基質Ａの溶液中で測定される。ここで
測定対象は酵素Ａである。固定化特異抗体＋酵素Ａ−−
→免疫化学的固定化酵素Ａ （３）
定試料中の特定酵素が結合固定化されることによって、
初めて複合酵素系が形成される。即ち、複合酵素系が形
成されて、下記のように測定試料中の酵素量が測定さ
れ、その酵素量が基質Ａの溶液中で測定される。ここで
測定対象は酵素Ａである。固定化特異抗体＋酵素Ａ−−
→免疫化学的固定化酵素Ａ （３）
【０００１４】本発明において、酵素（あるいは抗体）
の固定化とは金黒表面等に金−メルカプチド結合法によ
って官能基を導入し、この官能基に酵素や抗体を結合す
ること、及び更にグルタルアルデヒドで多量の酵素や抗
体を結合することである。更に白金黒電極やカーボン電
極では直接タンパク質を固定化することである。
の固定化とは金黒表面等に金−メルカプチド結合法によ
って官能基を導入し、この官能基に酵素や抗体を結合す
ること、及び更にグルタルアルデヒドで多量の酵素や抗
体を結合することである。更に白金黒電極やカーボン電
極では直接タンパク質を固定化することである。
【０００１５】例えば、体液中の代謝物質を測定する一
例としてコレステロールエステルの量を測定する場合で
は、上記反応は以下のようになる。 （６）の反応も同時に起きるので、生成される過酸化水
素を測定することによって総コレステロールの測定が可
能になる。
例としてコレステロールエステルの量を測定する場合で
は、上記反応は以下のようになる。 （６）の反応も同時に起きるので、生成される過酸化水
素を測定することによって総コレステロールの測定が可
能になる。
【０００１６】体液ではないが、農産物中の澱粉の測定
も可能であり、この場合には以下のような複合酵素系を
用い、生成される過酸化水素を電極検知すれば澱粉を直
接測定できる。
も可能であり、この場合には以下のような複合酵素系を
用い、生成される過酸化水素を電極検知すれば澱粉を直
接測定できる。
【０００１７】本発明において、測定試料中の酵素の量
を測定するためには一例として下記のような抗体−酵素
系を採用する。なお抗体はモノクローナル抗体あるいは
ポリクロナル抗体何れであっても良い。例えば、ＧＯＴ
の直接測定を行う場合には抗ＧＯＴ抗体を固定化する。
従って測定試料のＧＯＴを抗原抗体反応によって間接的
に固定化した電極を基質溶液に浸漬することによってＧ
ＯＴの量を測定することになる。 抗ＧＯＴ抗体＋ＧＯＴ（試料中）−−−→抗ＧＯＴ抗体・ＧＯＴ複合体 （８）
を測定するためには一例として下記のような抗体−酵素
系を採用する。なお抗体はモノクローナル抗体あるいは
ポリクロナル抗体何れであっても良い。例えば、ＧＯＴ
の直接測定を行う場合には抗ＧＯＴ抗体を固定化する。
従って測定試料のＧＯＴを抗原抗体反応によって間接的
に固定化した電極を基質溶液に浸漬することによってＧ
ＯＴの量を測定することになる。 抗ＧＯＴ抗体＋ＧＯＴ（試料中）−−−→抗ＧＯＴ抗体・ＧＯＴ複合体 （８）
【０００１８】本発明において、電気化学的測定方法と
は、上述のような反応において生じる電流量（又は電荷
量）を測定し、それに基づいて基質の量あるいは酵素の
量、従って濃度を求める方法を意味する。
は、上述のような反応において生じる電流量（又は電荷
量）を測定し、それに基づいて基質の量あるいは酵素の
量、従って濃度を求める方法を意味する。
【０００１９】本発明の電極は、電気化学的測定法にお
いて作用電極（測定電極）として使用することができ、
本発明の電極（バイオセンサ）を作用電極として用いる
電気化学的測定方法において汎用される。参照電極とし
ても作用する対極から成る二電極系、並びに参照電極と
対極を分離した三電極系を構成し、反応により生じる電
流量を測定する。作用電極に所定電位を印加するが、本
発明のバイオセンサ以外の要素は周知であり、これ以上
の説明は必要ない。
いて作用電極（測定電極）として使用することができ、
本発明の電極（バイオセンサ）を作用電極として用いる
電気化学的測定方法において汎用される。参照電極とし
ても作用する対極から成る二電極系、並びに参照電極と
対極を分離した三電極系を構成し、反応により生じる電
流量を測定する。作用電極に所定電位を印加するが、本
発明のバイオセンサ以外の要素は周知であり、これ以上
の説明は必要ない。
【０００２０】本発明において、電極活性物質とは電気
化学的に容易に酸化もしくは還元できるものであって、
このときに電子メディエータを用いて更に容易に酸化還
元できるものを含む。
化学的に容易に酸化もしくは還元できるものであって、
このときに電子メディエータを用いて更に容易に酸化還
元できるものを含む。
【０００２１】本発明において、採用する複合酵素系と
は少なくとも一種類の酵素が電極活性物質でない生体物
質を別種の電極不活性物質に変換し、少なくとも一つの
酵素が最終的に電極活性物質に変換するものから構成さ
れる。この様な複合酵素系から成る金黒電極を模式的に
図１に示す。図１の（Ａ）は金黒のポーラスな孔の内部
に２つの酵素が固定されている様子を示し、（Ｂ）は金
メルカプチド結合によって２種類の酵素が共有結合され
ている状態を模式的に示す。
は少なくとも一種類の酵素が電極活性物質でない生体物
質を別種の電極不活性物質に変換し、少なくとも一つの
酵素が最終的に電極活性物質に変換するものから構成さ
れる。この様な複合酵素系から成る金黒電極を模式的に
図１に示す。図１の（Ａ）は金黒のポーラスな孔の内部
に２つの酵素が固定されている様子を示し、（Ｂ）は金
メルカプチド結合によって２種類の酵素が共有結合され
ている状態を模式的に示す。
【０００２２】本発明において、採用する抗体−酵素系
のうち、抗体とは測定試料中の測定対象となる特定酵素
と結合するものを示し、酵素とは特定酵素の生成物を電
極活性物質に変換するものをいう。この抗体−酵素系の
模式図を図２に示す。ここに抗体、酵素の何れも共有結
合によって固定化されている。抗体−酵素系は図３に示
す如く目的の酵素と結合することによって始めて複合酵
素系となるものである。
のうち、抗体とは測定試料中の測定対象となる特定酵素
と結合するものを示し、酵素とは特定酵素の生成物を電
極活性物質に変換するものをいう。この抗体−酵素系の
模式図を図２に示す。ここに抗体、酵素の何れも共有結
合によって固定化されている。抗体−酵素系は図３に示
す如く目的の酵素と結合することによって始めて複合酵
素系となるものである。
【０００２３】
【実施例１】 （グルコアミラーゼ及びグルコースオキシダーゼから成
る複合酵素系を金黒電極に共有結合法によって固定化し
たスターチセンサ）平滑金電極（直径１．６ｍｍ）を硫
酸（３０％）一過酸化水素（７０％）混液中で洗浄し、
電極表面をアルミナ研磨した。この電極を酢酸鉛を含む
塩化金酸溶液中で負の電位を印加すると、金が析出し金
黒電極が調製できた。なお金黒析出量は通電電気量で制
御した。即ち、電気量を制御することによって、金黒の
多孔性を制御できる。作製した金黒電極を１０ｍＭアミ
ノエタンチオール水溶液に２時間浸漬し、金黒表面にア
ミノ基を金−メルカプチド結合を介して導入した。エタ
ノールで洗浄後、１％グルタルアルデヒド水溶液に３０
分間浸漬して金黒表面にアルデヒド基を導入した。リン
酸緩衝液で洗浄後、グルコースオキシダーゼ（３０ｍｇ
／ｍｌ）溶液に３０分間浸漬し、洗浄後グルコアミラー
ゼ（３０ｍｇ／ｍｌ）溶液に浸漬することによって金黒
表面にバイエンザイムセンサを作製した。なお、孔の内
部の２つの酵素の固定化を強固にする必要がある場合
は、更にアルブミン溶液（１％）に浸漬した後、グルタ
ルアルデヒドで架橋処理した。
る複合酵素系を金黒電極に共有結合法によって固定化し
たスターチセンサ）平滑金電極（直径１．６ｍｍ）を硫
酸（３０％）一過酸化水素（７０％）混液中で洗浄し、
電極表面をアルミナ研磨した。この電極を酢酸鉛を含む
塩化金酸溶液中で負の電位を印加すると、金が析出し金
黒電極が調製できた。なお金黒析出量は通電電気量で制
御した。即ち、電気量を制御することによって、金黒の
多孔性を制御できる。作製した金黒電極を１０ｍＭアミ
ノエタンチオール水溶液に２時間浸漬し、金黒表面にア
ミノ基を金−メルカプチド結合を介して導入した。エタ
ノールで洗浄後、１％グルタルアルデヒド水溶液に３０
分間浸漬して金黒表面にアルデヒド基を導入した。リン
酸緩衝液で洗浄後、グルコースオキシダーゼ（３０ｍｇ
／ｍｌ）溶液に３０分間浸漬し、洗浄後グルコアミラー
ゼ（３０ｍｇ／ｍｌ）溶液に浸漬することによって金黒
表面にバイエンザイムセンサを作製した。なお、孔の内
部の２つの酵素の固定化を強固にする必要がある場合
は、更にアルブミン溶液（１％）に浸漬した後、グルタ
ルアルデヒドで架橋処理した。
【０００２４】作製したバイエンザイムセンサを作用電
極とし、対極に白金板電極、そして参照電極に銀・塩化
銀電極を用いてセンサ特性を明らかにした。基質として
スターチ溶液を用いた。センサに印加する電位は＋９０
０ｍＶとし、スターチ濃度を０．０１〜２．５（ｗ／
ｗ）％とした。
極とし、対極に白金板電極、そして参照電極に銀・塩化
銀電極を用いてセンサ特性を明らかにした。基質として
スターチ溶液を用いた。センサに印加する電位は＋９０
０ｍＶとし、スターチ濃度を０．０１〜２．５（ｗ／
ｗ）％とした。
【０００２５】図４に示すのは、スターチを添加したと
きの経時変化である。スターチ濃度の増加とともにセン
サ出力も大きくなっていることが分かる。これを検量線
として示したのが図５である。この図からスターチ濃度
０．０１〜０．５（ｗ／ｗ）％の範囲で直線関係が認め
られることが解った。
きの経時変化である。スターチ濃度の増加とともにセン
サ出力も大きくなっていることが分かる。これを検量線
として示したのが図５である。この図からスターチ濃度
０．０１〜０．５（ｗ／ｗ）％の範囲で直線関係が認め
られることが解った。
【０００２６】
【実施例２】 （総コレステロール測定用バイエンザイムセンサ）同様
にして、コレステロールエステラーゼとコレステロール
オキシダーゼから成る複合酵素センサを作製し、総コレ
ステロールセンサとして評価した。ここではコレステロ
ール及びコレステロールエステルを可溶化するためにＴ
ｒｉｔｏｎＸ−１００（１０％）を含むリン酸（０．１
Ｍ）緩衝液を用いた。印加電位を５００ｍＶとした。コ
レステロールエステルとしてコレステロールパルミチン
酸を添加したときの経時変化を図６に示す。更に図７に
同一センサにそれぞれコレステロール、コレステロール
リノール酸、そしてコレステロールパルミチン酸を添加
したときの基質濃度とセンサ出力との関係を示す。この
図からコレステロール及びその誘導体に補正係数を掛け
れば総コレステロールの推定が可能であることが解る。
にして、コレステロールエステラーゼとコレステロール
オキシダーゼから成る複合酵素センサを作製し、総コレ
ステロールセンサとして評価した。ここではコレステロ
ール及びコレステロールエステルを可溶化するためにＴ
ｒｉｔｏｎＸ−１００（１０％）を含むリン酸（０．１
Ｍ）緩衝液を用いた。印加電位を５００ｍＶとした。コ
レステロールエステルとしてコレステロールパルミチン
酸を添加したときの経時変化を図６に示す。更に図７に
同一センサにそれぞれコレステロール、コレステロール
リノール酸、そしてコレステロールパルミチン酸を添加
したときの基質濃度とセンサ出力との関係を示す。この
図からコレステロール及びその誘導体に補正係数を掛け
れば総コレステロールの推定が可能であることが解る。
【０００２７】
【実施例３】 （測定試料中のＧＯＴ量の測定センサ）グルタミン酸オ
キシダーゼ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）中に上述の処理で表
面にアルデヒド基を導入した金黒電極を３０分浸漬した
後、抗ウシＧＯＴ抗体溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）中に３０
分間浸漬し抗体−酵素系を構築した。
キシダーゼ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）中に上述の処理で表
面にアルデヒド基を導入した金黒電極を３０分浸漬した
後、抗ウシＧＯＴ抗体溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）中に３０
分間浸漬し抗体−酵素系を構築した。
【０００２８】上述の抗体−酵素系から成る金黒電極を
ＧＯＴウシ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）に浸し、抗原抗体反
応を攪拌下で１時間行った。このときウシＧＯＴ溶液量
を１ｍＬ、２ｍＬ、４ｍＬ、６ｍＬ、８ｍＬそして１０
ｍＬとした。反応後、アルパラギン酸及び２−オキソグ
ルタミン酸（各々１０ｍＭ）中で免疫化学的に調製した
複合酵素系を評価した。その結果ウシＧＯＴ溶液の量と
センサ出力との間に６ｍＬ以下の範囲で液量と出力との
間に直線性が得られた。
ＧＯＴウシ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）に浸し、抗原抗体反
応を攪拌下で１時間行った。このときウシＧＯＴ溶液量
を１ｍＬ、２ｍＬ、４ｍＬ、６ｍＬ、８ｍＬそして１０
ｍＬとした。反応後、アルパラギン酸及び２−オキソグ
ルタミン酸（各々１０ｍＭ）中で免疫化学的に調製した
複合酵素系を評価した。その結果ウシＧＯＴ溶液の量と
センサ出力との間に６ｍＬ以下の範囲で液量と出力との
間に直線性が得られた。
【０００２９】以上のことは抗体がウシＧＯＴを結合
し、このＧＯＴがアルパラギン酸と２−オキソグルタミ
ン酸の間のアミノ基を転移し、グルタミン酸とオキサロ
酢酸を生成することを示している。このグルタミン酸を
グルタミン酸酸化酵素がα−ケトグルタミン酸、アンモ
ニア、および過酸化水素に変換し、この過酸化水素が電
極で検知されることを示している。
し、このＧＯＴがアルパラギン酸と２−オキソグルタミ
ン酸の間のアミノ基を転移し、グルタミン酸とオキサロ
酢酸を生成することを示している。このグルタミン酸を
グルタミン酸酸化酵素がα−ケトグルタミン酸、アンモ
ニア、および過酸化水素に変換し、この過酸化水素が電
極で検知されることを示している。
【０００３０】ウシＧＯＴを含む溶液量（ウシＧＯＴ
量）とセンサ出力との間に直線性があることから、抗体
に結合されるウシＧＯＴは測定試料の量に依存している
ことが解る。即ち、溶液量一定のもとでウシＧＯＴ濃度
に依存することを示している。
量）とセンサ出力との間に直線性があることから、抗体
に結合されるウシＧＯＴは測定試料の量に依存している
ことが解る。即ち、溶液量一定のもとでウシＧＯＴ濃度
に依存することを示している。
【０００３１】
【発明の効果】本発明のバイオセンサ、及びその作製法
を使用することによって、従来電気化学デバイスで検知
できなかった代謝物質及び疾患特有のマーカー酵素やマ
ーカータンパク質の計測が可能となる。この事によっ
て、測定試料中の多種多様な物質の計測デバイスが実現
できる。
を使用することによって、従来電気化学デバイスで検知
できなかった代謝物質及び疾患特有のマーカー酵素やマ
ーカータンパク質の計測が可能となる。この事によっ
て、測定試料中の多種多様な物質の計測デバイスが実現
できる。
【図１】多孔性表面への複合酵素系（酵素Ａおよび酵素
Ｂ）の固定化されている様子（Ａ）、及びそれぞれの酵
素が金メルカプチド結合によって固定化されている模式
図（Ｂ）である。
Ｂ）の固定化されている様子（Ａ）、及びそれぞれの酵
素が金メルカプチド結合によって固定化されている模式
図（Ｂ）である。
【図２】多孔性金表面に抗体（Ａｂ）及び酵素（Ｅ）が
金メルカプチド結合によって固定化されている模式図で
ある。
金メルカプチド結合によって固定化されている模式図で
ある。
【図３】金メルカプチド結合によって固定化されている
抗体が対応する酵素ＧＯＴを認識結合している図であ
る。
抗体が対応する酵素ＧＯＴを認識結合している図であ
る。
【図４】グルコアミラーゼとグルコースオキシダーゼか
ら複合酵素系を結成させた金黒電極に９００ｍＶの電位
を印加しスターチを添加したときの経時変化である。
ら複合酵素系を結成させた金黒電極に９００ｍＶの電位
を印加しスターチを添加したときの経時変化である。
【図５】同上の方法で得られたスターチ濃度とセンサ出
力との関係を示す図である。
力との関係を示す図である。
【図６】金黒電極にコレステロールエステラーゼ及びコ
レステロールオキシダーゼから成る複合酵素系を形成
し、コレステロールパルミチン酸を添加したときのコレ
ステロールエステル濃度とセンサ応答の経時変化を示す
図である。
レステロールオキシダーゼから成る複合酵素系を形成
し、コレステロールパルミチン酸を添加したときのコレ
ステロールエステル濃度とセンサ応答の経時変化を示す
図である。
【図７】コレステロールエステラーゼーコレステロール
オキシダーゼ系にコレステロール、コレステロールリノ
ール酸、及びコレステロールパルミチン酸を適応したと
きの濃度（ｍＭ）とセンサ出力（ｎＡ）との関係を示す
図である。
オキシダーゼ系にコレステロール、コレステロールリノ
ール酸、及びコレステロールパルミチン酸を適応したと
きの濃度（ｍＭ）とセンサ出力（ｎＡ）との関係を示す
図である。
１．コレステロールの測定曲線 ２．コレステロールリノール酸の測定曲線 ３．コレステロールパルミチン酸の測定曲線
Claims (8)
- 【請求項１】 貴金属化合物を電解還元することによっ
て貴金属電極の表面に多孔性に富む表面を形成し、その
内部に二種類（以上）の酵素を固定化する。このとき酵
素Ａの生成物を酵素Ｂの触媒作用により、電極活物質に
変換し、多孔性電極自身によって検知る複合酵素センサ
及びその作製法 - 【請求項２】 請求項１のうち、金電極の場合には金メ
ルカプチド結合によって多孔性（表面積大）表面に主と
して化学的に結合させる方式の複合酵素センサ及びその
作製法。 - 【請求項３】 請求項１のうち、白金電極や炭素電極等
の場合には表面処理によって化学的に結合させる方式の
複合酵素センサ及びその作製法。 - 【請求項４】 共有結合で固定化した酵素にさらに多量
の酵素を架橋した構造の複合酵素センサ及びその作製法 - 【請求項５】 ポーラスな電極に、目的とする酵素マー
カーの抗体及びその抗体に結合されたマーカー酵素によ
って生成される物質を代謝する酵素を同時に固定化した
酵素免疫電極を作製し、血清（血液）中のマーカーと一
定時間共存させることによって、抗体で固定されたマー
カー酵素とその生成物を電極活物質に変換する酵素シス
テムから成る複合酵素系を創出し、マーカー酵素量を測
定する方法及びそのための電極。 - 【請求項６】 酵素マーカーとしてはトランスフェラー
ゼ類、アルカリ性フォスファターゼ、アミラーゼ、γ−
ＧＴＰ、クレアチンキナーゼ、ロイシンアミノペプチダ
ーゼ、コレステロールオキシダーゼ等の疾病マーカーの
みならず、前立腺特異抗原やＣ反応性タンパク質等を含
む。このうち酵素活性のないタンパク質の場合には酵素
標識タンパク質を用いた競争法、サンドイッチ法等の免
疫化学的方法によって測定する。この様な方式の酵素免
疫電極及びその作製法。 - 【請求項７】 最終産物が過酸化水素やＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
であるときは、適当なメディエータを用いる請求項１〜
５のいずれかの易酸化（あるいは易還元）型電極及びそ
の作製法。 - 【請求項８】 上記請求項に関して、検出感度を高める
ためのパルス電位検出法などの電気化学的測定法、その
デバイス及び作製法
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|---|---|---|---|
| JP10799797A JP3393361B2 (ja) | 1997-03-24 | 1997-03-24 | バイオセンサ |
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| JP10799797A JP3393361B2 (ja) | 1997-03-24 | 1997-03-24 | バイオセンサ |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10267888A true JPH10267888A (ja) | 1998-10-09 |
| JP3393361B2 JP3393361B2 (ja) | 2003-04-07 |
Family
ID=14473375
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|---|---|---|---|
| JP10799797A Expired - Lifetime JP3393361B2 (ja) | 1997-03-24 | 1997-03-24 | バイオセンサ |
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| JP (1) | JP3393361B2 (ja) |
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-
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- 1997-03-24 JP JP10799797A patent/JP3393361B2/ja not_active Expired - Lifetime
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