JP2637010B2 - ポリエチレンタンパク質接合体 - Google Patents

ポリエチレンタンパク質接合体

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JP2637010B2
JP2637010B2 JP4097261A JP9726192A JP2637010B2 JP 2637010 B2 JP2637010 B2 JP 2637010B2 JP 4097261 A JP4097261 A JP 4097261A JP 9726192 A JP9726192 A JP 9726192A JP 2637010 B2 JP2637010 B2 JP 2637010B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、タンパク質の新規なポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）接合体(conjugates)に関する。
【０００２】種々の自然および組み換えのタンパク質は
医学的および製剤学的実用性を有する。それらはいった
ん精製され、分離され、そして配合されると、それらは
種々の治療学的適用のための非経口的に投与することが
できる。しかしながら、非経口的に投与されるタンパク
質は免疫原性であり、比較的水不溶性であり、そして短
い薬理学的半減期を有することがある。結局、患者にお
いて治療学的に有用な血液レベルを達成ことは困難であ
ることがある。
【０００３】これらの問題はタンパク質をポリマー、例
えば、ポリエチレングリコールに接合することによって
克服することができる。米国特許第４，１７９，３３７
号（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．）は、タンパク質の免疫
原性が少なく且つその生理学的活性の実質的部分を保持
した接合体を生ぜしめるために、ポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）を酵素及びインシユリンのようなタンパク
質に接合することを開示している。米国特許第４，７９
１，１９２号（Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．）は、
ＰＥＧを小島活性化（ｉｓｌｅｔ−ａｃｔｉｖａｔｉｎ
ｇ）タンパク質に接合してその副作用および免疫原性を
減少することを開示している。ベロネーズ（Ｖｅｒｏｎ
ｅｓｅ）ら、アプライド・バイオケミストリー・アンド
・バイオテクニークス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｍ
ｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）、１１：１４１−１
５２（１９８５）は、ポリエチレングリコールをフェニ
ルクロロホルムで活性化して、リボヌクレアーゼおよび
スーパーオキシドを変性することを開示している。米国
特許第４，７６６，１０６号および第４，９１７，８８
８号（Ｋａｔｒｅ ｅｔ ａｌ．）は、また、タンパク
質をポリマーの接合により可溶化することを開示してい
る。ＰＥＧおよび他のポリマーを組み換えタンパク質に
接合して免疫原性を減少しそして半減期を増加する。参
照：米国特許第４，９０２，５０２号（Ｎｉｔｅｃｋｉ
ｅｔ ａｌ．）、国際出願第Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ９０
／０２１３３（Ｅｎｚｏｎ，Ｉｎｃ．）、欧州特許出願
第１５４，３１６号（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａ
ｌ．）および国際出願第Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ８５／０２
５７２（Ｔｏｍａｓｉ）、キング（Ｋｉｎｇ）ら、Ｉｎ
ｔ．Ａｒｃｈｓ．Ａｌｌｅｒｇｙ ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕ
ｎ．６６、４３９−４４６（１９８１）は、Ｏ−（ＲＯ
−ＰＥＧ）−Ｓ−カルボキシアミドメチル−ジチオカー
ボネート中間体を使用することによって、タンパク質を
ＰＥＧに結合する方法を記載している。
【０００４】従来のＰＥＧ−タンパク質接合体を形成す
る方法およびその方法から生ずる接合体は、いくつかの
問題を生ずる。これらの問題には、タンパク質−ＰＥＧ
を形成するある種の方法はタンパク質を不活性化し、こ
うして生ずる接合体が劣った生物学的活性を有すること
がある。さらに、これらのＰＥＧ−タンパク質接合体の
形成において利用するある種のリンカーは生体内の加水
分解の切断を受け易い。このような切断が投与後に起こ
るとき、これらの接合体はＰＥＧにより提供される有益
な性質を損失する。
【０００５】本発明は、タンパク質中の種々のアミノ基
をＰＥＧに接続する独特のリンカーを使用して新規なＰ
ＥＧ−タンパク質接合体を提供するものであつて、これ
らの接合体はＰＥＧとの接合体の形成に関連する問題を
回避する。
【０００６】とくに、本発明は、式
【０００７】
【化１１】
【０００８】式中、Ｒ１は低級アルキルであり、Ｒ２は
−Ｏ−または−ＮＨ−であり、Ｒ３は＝Ｎ−Ｒ４、＝Ｓ
または＝Ｏであり、Ｒ４は低級アルキルまたはシクロア
ルキルであり、ｍおよびｎは接合体が非接合タンパク質
の生物学的活性の少なくとも一部分を有するような方法
で整数≧１から選択され、ただしＲ２が−Ｏ−であると
き、Ｒ３は＝Ｎ−Ｒ４以外であり、Ｒ２が−Ｏ−であり
かつＲ３ が＝Ｏであるとき、タンパク質はインターフェ
ロン−アルファ、インターロイキン−１またはインター
ロイキン−１ｒａであり、そしてＲ２が−Ｏ−でありか
つＲ３が＝Ｓであるとき、タンパク質はブタクサ（ｒａ
ｇｗｅｅｄ）の花粉またはウシ血漿アルブミンからの抗
原Ｅではない、のタンパク質の生理学的に活性な接合体
を提供する。
【０００９】よりとくに、本発明は、式
【００１０】
【化１２】
【００１１】
【化１３】
【００１２】式中Ｒ1、Ｒ4、ｍ、ｎおよびタンパク質は
上に定義した通りである、のタンパク質接合体をを提供
する。
【００１３】本発明に従い、われわれはＰＥＧに接合し
たタンパク質のインターロイキン−１レセプタ拮抗剤
（ＩＬ−１ｒａ）およびインターロイキン−１（ＩＬ−
１）を最初に提供した。
【００１４】本発明に従い、式Ｉのタンパク質の接合体
は活性化されたＰＥＧ、すなわち、１つのヒドロキシ基
が活性化されたリンカーにより置換されたＰＥＧ、を、
タンパク質中の遊離アミノ基の１または２以上と縮合す
ることによって生成する。接合体の生成に使用する活性
化されたＰＥＧは、次の式を有する：
【００１５】
【化１４】
【００１６】式中、Ｒ1は低級アルキルであり、Ｒ4は低
級アルキルまたはシクロアルキルであり、そしてＲ5は
低級アルキルまたはＨであり、そしてｎは１〜１０００
の整数である。
【００１７】本発明に従い、接合体の生成に式ＩＩ−
Ａ、ＩＩ−Ｂ、ＩＩ−Ｃ、ＩＩ−Ｄ、ＩＩ−Ｅ、ＩＩ−
ＦまたはＩＩ−Ｇの活性化されたＰＥＧ化合物を使用す
ることによって、タンパク質中の遊離アミノ基とＰＥＧ
との間の結合が形成されるので、生ずる接合体はタンパ
ク質の生物学的活性の少なくとも一部分を保持すると同
時にその免疫原性を減少する。式ＩＩ−Ａ〜ＩＩ−Ｇの
活性化されたポリエチレングリコールの任意の１つを使
用して本発明の接合体の中で形成された結合基は、生体
内の加水分解の切断を受け易くなく、そして先行技術の
ＰＥＧタンパク質接合体の中に存在する多数の欠点をも
たないタンパク質接合体を生成する。
【００１８】本発明に従い、Ｒ1およびＲ5は任意の低級
アルキル、好ましいメチルであることができる。用語低
級アルキルは１〜６個の炭素原子を有する低級アルキ
ル、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロ
ピルなどを表示する。一般に、好ましいアルキル基は１
〜４を有する低級アルキル基であり、メチルは最も好ま
しい。
【００１９】本発明に従い、ｍおよびｎはタンパク質の
生ずる接合体が接合体を形成するタンパク質の生物学的
活性の少なくとも一部分を有するような方法で任意の整
数≧１から選択される。明らかなように、ｎおよびｍの
合計は接合体が保持するタンパク質の生物学的活性の量
に逆比例する。ｎの数値は接合体を形成するポリエチレ
ングリコール中のエチレングリコール単位の数に関係
し、そして１〜１０００である。用語ｍは活性化された
ＰＥＧと反応するタンパク質が含有する遊離アミノ基の
数に関係する。好ましくは、ｍの値は１〜５の範囲であ
り、１は最も好ましい。ｍ＋ｎの値が高くなればなるほ
ど、接合体の分子量は高くなる。式ＩＩ−Ａ〜ＩＩ−Ｇ
のポリエチレングリコールのポリマーおよび式Ｉおよび
Ｉ−Ａ〜Ｉ−Ｅのタンパク質接合体の分子量は、当業者
により容易に決定されることができる。決定された分子
量から、ｍおよびｎの値の値は推定することができる。
用語タンパク質は、一方において、ポリペプチドおよ
び、他方において、製剤学的に許容されうる付加塩を包
含する。
【００２０】式ＩＩ−Ａ〜ＩＩ−Ｇの任意の１つの化合
物をタンパク質と反応させ、そしてタンパク質が１より
多い遊離アミノ基を含有するとき、接合体は種々のタン
パク質ＰＥＧ接合体の混合物として生成することができ
る。タンパク質が２つの遊離アミノ基を含有する場合、
活性化されたＰＥＧは遊離アミノ基の１つとおよび遊離
アミノ基の両者と反応することができる。この場合にお
いて、混合物は２つの遊離アミノ基がＰＥＧと反応して
形成した１つの接合体および１つのみの遊離アミノ基が
ＰＥＧと反応して形成した第２接合体を含有する。この
混合物中の種々の接合体は異なる分子量を有するので、
これらの接合体は慣用方法、例えば、クロマトグラフィ
ーにより分離することができる。ｍおよびｎが適切に選
択されたかどうかを決定するために、分離された接合体
は親のタンパク質のスクリーングに使用したのと同一の
手段により生物学的活性についてスクリーングして、接
合体がその形成に使用した生物学的活性の一部分をなお
保持するかどうかを決定することができる。この方法に
おいて、数ｍおよびｎは任意の所望の方法で調節して所
望の活性を得ることができる。
【００２１】本発明の好ましい実施態様に従い、ｍおよ
びｎはタンパク質の分子量を排除した接合体の分子量が
ほぼ３００〜ほぼ３０，０００ダルトンの間であるよう
な、任意の整数である。好ましい実施態様に従い、ｍは
１である。ｍが１であるとき、この接合体は、２または
それ以上の遊離アミノ基が存在するときでさえ、得るこ
とができる。活性化されたＰＥＧ化合物は、まず、タン
パク質の基内に含有される遊離アミノ基の１つと反応す
るであろう。アミン縮合の標準の方法に従い、試薬、例
えば、タンパク質の濃度、および反応条件を調節するこ
とによって、タンパク質内に含有される遊離アミノ基の
ペギル化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）の程度を調節するこ
とができる。１または２以上の遊離アミノ基を含有し、
遊離アミノ基の１つが他の遊離アミノ基より反応性であ
るタンパク質において、条件はそのタンパク質が活性化
されたＰＥＧ化合物と反応してｍが１である式Ｉの化合
物を形成するように選択することができる。タンパク質
を形成するアミノ酸内に含有される他の遊離アミノ基
を、引き続いて、縮合反応をより長く進行させるか、あ
るいは他のより強い条件を利用することによって、ＰＥ
Ｇと反応させることができる。ｍが１である好ましい実
施態様に従い、ｎは接合体を形成するポリエチレングリ
コールがほぼ６〜６８０であるｎに相当する３００〜３
０，０００の分子量を有するような任意の整数である。
より好ましくは、ｎは、それぞれ、１３２５、５０００
および１００００の分子量に相当する約２８、１１２お
よび２２５であり、最も好ましくはｎは１１２の領域で
ある。分子量によるポリエチレングリコールの特性決定
は、整数ｎを使用するＰＥＧポリマー中の自己反復単位
の表示より好ましい。なぜなら、出発ＰＥＧ化合物の潜
在的不均質性が存在し、これは通常それらの自己反復単
位ではなく、それらの平均分子量により定義されるから
である。種々の分子量の出発ＰＥＧ化合物は、この分野
において知られている方法により調製することができる
か、あるいは商業的に入手可能である。
【００２２】分子量の決定により得られるｍおよびｎの
値が整数ではない場合（一般の場合におけるように）、
これらの値は通常の方法で丸めなくてはならない。
【００２３】Ｒ４が低級アルキルであるとき、Ｒ４が上
に定義したような１〜６個の炭素原子を有する任意の低
級アルキルであることができる。Ｒ ４ はシクロアルキル
であるとき、Ｒ ４ は好ましくは３〜７個の炭素原子を有
するシクロアルキル基、例えば、シクロプロピル、シク
ロペンチル、シクロブチル、およびシクロヘキシルであ
る。好ましいシクロアルキル基はシクロヘキシルであ
る。
【００２４】次の実施例の各々の標題化合物は、ＩＵＰ
ＡＣ命名法に従い命名する。しかしながら、これらの化
合物は、また、次のように命名することができる： 実施例１、２、３および４：アルファ−［２−［［（シ
クロヘキシルカーボンイミドイル）アミノ］エチル］オ
メガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）
は、別に、アルファ−［２−［［（シクロヘキシルアミ
ノ）メチレン］アミノ］エチル］オメガ−メトキシポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル）と命名される。
【００２５】実施例１Ａ、１ａおよび１ｄ アルファ−（２−クロロエチル）−オメガ−メトキシポ
リ（オキシ−１，２−エタンジイル）は、別に、アルフ
ァ−メトキシ−オメガ−（２−クロロエチル）ポリ（オ
キシ−１，２−エタンジイル）と命名される。
【００２６】実施例１Ｂ、１ｂおよび１ｅ：アルファ−
（２−アジドエチル）−オメガ−メトキシポリ（オキシ
−１，２−エタンジイル）は、アルファ−メトキシ−オ
メガ−（２−アジドエチル）ポリ（オキシ−１，２−エ
タンジイル）と命名される。
【００２７】実施例１Ｃ、１ｃおよび１ｆ：アルファ−
（２−アミノエチル）−オメガ−メトキシポリ（オキシ
−１，２−エタンジイル）は、アルファ−メトキシ−オ
メガ−（２−アミノエチル）ポリ（オキシ−１，２−エ
タンジイル）と命名される。
【００２８】実施例１１、１１ａ、１１ｂ、１２、１２
Ａおよび１３〜１７：アルファ−メチル−オメガ−［２
−［［（２−ピリジニルオキシ）カルボニル］アミノ］
エトキシ］ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）は、
別に、アルファ−［２−［［（２−ピリジニルオキシ）
カルボニル］アミノ］エチル］−オメガ−メトキシポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル）と命名される。
【００２９】実施例１８、１８ａ、１９、１９Ａ、２
０、２０Ａ、２１および２２：アルファ−［［（２−ピ
リジニルオキシ）カルボニル］オメガ−メトキシポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル）は、別に、アルファ
−メチル−オメガ−［２−［［（２−ピリジニルオキ
シ）カルボニル］オキシ］エトキシ］ポリ（オキシ−
１，２−エタンジイル）と命名される。
【００３０】実施例２３〜２７：アルファ−［２−（イ
ソシアナト）エチル］−オメガ−メトキシポリ（オキシ
−１，２−エタンジイル）は、別に、アルファ−［メト
キシ−オメガ−［２−（イソシアナト）エチル］ポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル）と命名される。
【００３１】実施例２８：アルファ−［［（２−ピリジ
ニルオキシ）チオカルボニル］オメガ−メトキシポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル）は、別に、アルファ
−メチル−オメガ−［２−［［（２−ピリジニルオキ
シ）チオカルボニル］オキシ］エトキシ］ポリ（オキシ
−１，２−エタンジイル）と命名される。
【００３２】本発明は、また、一般式
【００３３】
【化１５】
【００３４】式中Ｒ１、Ｒ ４ 、Ｒ５およびｎは上に定義
した通りである、で示される活性化された化合物の１つ
をタンパク質の遊離アミノ基またはその塩と反応させ、
そしてタンパク質接合体を反応混合物から単離すること
からなる、一般式Ｉまたは式Ｉ−Ａ〜Ｉ−ＥのＰＥＧ−
タンパク質接合体の製造方法からなる。とくに、タンパ
ク質とカップリングすべき個々のＰＥＧ誘導体の合成な
らびに製造とそれらのタンパク質との反応は、次の節お
よび実施例に記載するようにして実施することができ
る。
【００３５】Ｒ2が−ＮＨ−であり、そしてＲ3が＝Ｎ−
Ｒ4であるタンパク質接合体（式Ｉ−Ａの化合物）を生
成するために、次の反応の概要を使用することができ
る：
【００３６】
【化１６】
【００３７】式中、Ｒ1、Ｒ4、ｎ、ｍおよびタンパク質
は上に定義した通りである。
【００３８】この反応の概要において、ＰＥＧ分子の末
端におけるヒドロキシル基は普通の手段により、例え
ば、ハロゲン化チオニルで処理することによってハロゲ
ン基に転化する。生ずるＰＥＧハライドを普通の手段に
より、例えば、アジ化ナトリウムで処理することによっ
てアジドに転化する。次いで、ＰＥＧアジドを普通の手
段により、例えば、水素化によりアミンに転化すること
ができる。次いで、ＰＥＧ−アミンをアルキルまたはシ
クロアルキルイソチオアネート、例えば、シクロヘキシ
ルイソチオアネートと反応させて、式ＩＩＩのチオ尿素
を形成し、次いでこれを普通の手段により脱硫して、カ
ーボジイミド官能基を含有する式ＩＩ−Ａの化合物を式
ＩＩＩのチオ尿素を式ＩＩ−ＡのＰＥＧカーボジイミド
に転化するとき、好ましい脱硫剤はトリフェニルホスフ
ィンである。
【００３９】次いで、式ＩＩ−ＡのＰＥＧカーボジイミ
ドをカーボジイミドとアミンとの縮合のための任意の普
通の条件下にタンパク質と縮合させる。一般に、この反
応はｐＨ７〜９を有する標準の水性緩衝液中で実施し
て、式Ｉ−Ａの接合体を生成する。生ずる縮合反応は、
タンパク質内の遊離アミノ基の数および反応時間に依存
して、種々の分子量のＰＥＧタンパク質接合体の混合物
を生成することができる。次いで、ＰＥＧタンパク質接
合体は、慣用方法、例えば、高性能液体クロマトグラフ
ィーまたはゲル電気泳動により、それらの個々の化合物
に分割することができる。
【００４０】Ｒ2が−Ｏ−でありそしてＲ3が＝Ｓである
タンパク質接合体（式Ｉ−Ｂの化合物）を生成するため
に、次の反応の概要を使用するすることができる：
【００４１】
【化１７】
【００４２】式中、Ｒ1、ｍ、ｎおよびタンパク質上に
定義した通りである。
【００４３】この反応において、ＰＥＧを１，１−カー
ボンチオイルビス２（１Ｈ）−ピリジノンと高い沸点の
炭化水素溶媒中で還流させて、式ＩＩ−Ｂの化合物を生
成する。式ＩＩ−Ａの化合物とタンパク質との縮合に関
して記載したのと同一の方法において、式ＩＩ−Ｂの化
合物をタンパク質の遊離アミノ基の１または２以上と縮
合して、式Ｉ−Ａの接合体混合物を調製する。この混合
物の分割は、前述したように生成物の分子量に従い実施
することができる。
【００４４】あるいは、Ｒ2が−Ｏ−でありそしてＲ3が
＝Ｓである本発明のタンパク質接合体（式Ｉ−Ｂの化合
物）は、次の反応の概要により調製することができる：
【００４５】
【化１８】
【００４６】式中、Ｒ1、ｍ、ｎおよびタンパク質上に
定義した通りである。
【００４７】この反応の概要に従い、ＰＥＧを式ＶＩの
チオカーボネートと有機溶媒中で反応させて、式ＩＩ−
ＦのＰＥＧチオカーボネートを形成する。チオカーボネ
ートをヒドロキシ基と縮合させる慣用方法をこの反応の
実施において使用することができる。
【００４８】式ＩＩ−Ｆの化合物をタンパク質の少なく
とも１つの遊離アミノ基と縮合させることによって、式
Ｉ−Ｂの接合体に転化する。この反応は、式ＩＩ−Ａの
化合物の式Ｉ−Ａの接合体への転化について記載した方
法において実施する。この反応により生成する生成物
は、使用するタンパク質中の遊離アミノ基の量に依存し
て異なる分子量の接合体の混合物であることができる。
これらの接合体は、前述の手順に従い分子量により分割
することができる。
【００４９】Ｒ2が−ＮＨ−でありそしてＲ3が＝Ｏであ
るタンパク質接合体（式Ｉ−Ｃの化合物）を調製するた
めに、次の反応の概要を使用することができる：
【００５０】
【化１９】
【００５１】式中、Ｒ1、Ｒ5、ｍ、ｎおよびタンパク質
は上に定義した通りである。
【００５２】式ＩＶの化合物は、酸ハライドとアルコー
ルとを縮合させる慣用方法に従い、ホスゲンを２−ヒド
ロキシピリジン（Ｒ5が低級アルキルである場合、置換
されている）と縮合させることによって生成する。
【００５３】ＰＥＧアミンと式ＩＶの化合物との縮合
は、ハロゲン化炭化水素溶媒中で還流させることによっ
て実施して、式ＩＩ−Ｃの化合物を生成する。式ＩＩ−
Ｃの化合物をタンパク質とタンパク質上の１または２以
上の遊離アミノ基を通して縮合させて、式Ｉ−Ｃの化合
物を生成する。この反応は式ＩＩ−Ａの化合物の縮合に
ついて記載した方法で実施して、式Ｉ−Ａの接合体を生
成する。タンパク質内に含有され、式ＩＩ−Ｃの化合物
と反応する、遊離アミノ基の数に依存して、式Ｉ−Ｃの
接合体は異なる分子量を有する混合物として形成するこ
とができる。この接合体混合物は前述の方法で分割する
ことができる。
【００５４】Ｒ2が−ＮＨ−でありそしてＲ3が＝Ｓであ
る本発明のタンパク質接合体（式Ｉ−Ｄの化合物）を生
成するために、次の反応の概要を使用することができ
る。
【００５５】
【化２０】
【００５６】式中、Ｒ1、ｍ、ｎおよびタンパク質上に
定義した通りである。
【００５７】この反応の概要において、ＰＥＧアミンを
ジ−２−ピリジルチオノカーボネートと反応させて、式
ＩＩ−Ｄの化合物を生成する。この手順において、アミ
ンをチオカーボネートと縮合させてイソチオアネートを
生成する慣用方法を使用することができる。式ＩＩ−Ａ
を化合物の式Ｉ−Ａの化合物への転化について記載した
方法において、式ＩＩ−Ｄの化合物をタンパク質と反応
させて式Ｉ−Ｄの接合体を形成する。タンパク質が含有
する遊離アミノ基の量に依存して、式ＩＩ−Ｄの化合物
とタンパク質との縮合は接合体の混合物を生成し、この
混合物は式Ｉの接合体の分割について前述した方法によ
り個々の成分に分割することができる。あるいは、式Ｉ
−Ｄの化合物は次の反応の概要に従い調製することがで
きる:
【００５８】
【化２１】
【００５９】酸ハライドをアルコールと縮合する慣用方
法に従い、チオホスゲンを２−ヒドロキシピリジン（Ｒ
5が低級アルキルである場合、置換されている）と縮合
させることによって、式Ｖの化合物を生成する。次い
で、式ＩＩ−Ｃの化合物の生成について記載した方法に
より、ＶをＰＥＧ−アミンと反応させる。生ずる化合物
はＩＩ−Ｅである。式ＩＩ−Ｅの化合物をタンパク質上
の１または２以上の遊離アミノ基と縮合させて、式Ｉ−
Ｄの接合体を生成する。この反応は接合体Ｉ−Ａの形成
について記載した方法で実施する。
【００６０】Ｒ2が−Ｏ−でありそしてＲ3がＯである本
発明の接合体（式Ｉ−Ｅの化合物）を生成するために、
次の反応の概要を使用することができる。
【００６１】
【化２２】
【００６２】式中、Ｒ1、ｍ、ｎおよびタンパク質は上
に定義した通りである。
【００６３】上の反応の概要において、ジ−２−ピリジ
ルカーボネートをＰＥＧと反応させて、式ＩＩ−Ｇの化
合物を生成する。この反応はアルコールとカーボネート
とを縮合させる慣用方法により実施する。式ＩＩ−Ｇの
化合物をタンパク質中の１または２以上の遊離アミノ基
と縮合させることによって、式ＩＩ−Ｇの化合物を式Ｉ
−Ｅの化合物に転化する。この反応は式ＩＩ−Ａの化合
物の式Ｉ−Ａへの転化に関して記載したのと同一の方法
で実施する。こうして生成する反応混合物は、タンパク
質が含有する遊離アミノ基に依存して式Ｉ−Ｅの接合体
の混合物を含有することができる。この混合物は異なる
分子量の種々の接合体を構成する。種々の接合体は前述
の手順により混合物から分離することができる。
【００６４】本発明の好ましい実施態様に従い、インタ
ーフェロン−アルファとＰＥＧとの接合体は次の反応の
概要により生成することができる。
【００６５】
【化２３】
【００６６】式中、Ｒ1はメチルであり、そしてｎは約
１１２である。この反応はサブタイプのインターフェロ
ン−アルファＡ（また、インターフェロン−アルファ２
と命名される）のインターフェロン−アルファについて
とくに重要である。
【００６７】活性化されたＰＥＧ化合物の合成は、Ｒ2
が−ＮＨ−でありそしてＲ3が＝Ｏであるタンパク質接
合体の合成に関して前述した。インターフェロン−アル
ファの最終の接合体は、前述した方法に類似する方法に
よるか、あるいはタンパク質接合体Ｉ−Ｃの合成につい
て実施例に記載する方法で得ることができる。
【００６８】生理学的活性をもつタンパク質またはその
塩は、このタンパク質が縮合のための少なくとも１つの
遊離アミノ基を有するかぎり、ＰＥＧとの接合体の調製
に使用することができる。
【００６９】本発明において使用することができる好ま
しいタンパク質は、次の通りである：インターロイキン
−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−１レセプタ拮抗剤（ＩＬ−１
ｒａ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）およびイン
ターフェロン、すなわち、ＩＦＮ−アルファ（白血球イ
ンターフェロン）、ＩＦＮ−ベータ（線維芽インターフ
ェロン）およびＩＦＮ−ガンマ（免疫インターフェロ
ン）、それらの天然に存在する形態ならびにそれらの類
似体、同族体または切頭された形態。
【００７０】ここにおけるインターロイキン−１レセプ
タ拮抗剤（ＩＬ−１ｒａ）は、組織培養物からまたは組
み換え技術により得ることができる。ＩＬ−１ｒａを得
る１つの方法は、Ｕ９３７ヒト骨髄単球細胞(human mye
lomonocytic cells)（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５９３）を
分化剤(differentiating agent)のホルボールミリステ
ートアセテート（ＰＭＡ）で処理し、次いでそれらを顆
粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌ
ｏｃｙｔｅ Ｍａｃｒｐｈａｒｇｅ−ＣｏｌｏｎｙＳｔ
ｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）［ＧＭ−ＣＳＦ；
アムゲン（Ａｍｇｅｎ）から入手することができる］で
刺激し、そして培養上澄み液からＩＬ−１ｒａを分離お
よび精製しする［カーター（Ｃａｔｅｒ）ら、ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ）３４４、６３３−６３７（１９９
０）］。
【００７１】組み換えＩＬ−１ｒａは、自然ＩＬ−１ｒ
ａに匹敵する生物学的活性を有するが、カーター（Ｃａ
ｔｅｒ）ら，ｓｕｒｐａまたはアイゼンバーグ（Ｅｉｓ
ｅｎｂｅｒｇ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３４
３、３４１−３４６（１９９０）に記載されているよう
に組み換え技術により調製されたＩＬ−１ｒａを意味す
る。
【００７２】インターフェロンはすべての型のインター
フェロン、例えば、α、β、γまたはωインターフェロ
ンおよび任意の型のサブタイプを包含する。インターフ
ェロンは組織または組織培養物から得ることができる
か、あるいは文献、例えば、欧州特許出願公開第４３，
９８０号に記載されているように組み換え技術を使用し
て産生ことができる。自然または組み換えインターフェ
ロンを発生させそして分離する他の方法は、また、この
分野においてよく知られている。
【００７３】本発明に従い、本発明のタンパク質−接合
体は接合体の形成に使用したタンパク質と同一の実用性
を有する。したがって、これらの接合体はそれらの形成
に使用したのと同一の方法で治療学的に活性であり、そ
して、タンパク質それら自体の被検体への投与に関係づ
けることができる望ましくない免疫応答を生成しない
で、タンパク質それ自体と同一の方法で使用することが
できる。したがって、本発明は、また、式Ｉの化合物ま
たはそれらの塩に基づく製剤学的組成物およびそれらを
調製する方法を包含する。
【００７４】病気の抑制または予防において使用する本
発明の製剤学的組成物は、一般式Ｉのタンパク質接合体
および治療学的に不活性な、無毒のおよび治療学的に許
容されうる担体物質からなる。使用すべき製剤学的組成
物は、処置すべき疾患、個々の患者の状態、タンパク質
接合体の供給部位、投与の方法および実施者に知られて
いる他の因子を考慮したすぐれた医学的実施と合致する
方法で、配合および投与することができる。
【００７５】次の実施例によって、本発明の実施態様を
さらに説明する。これらの実施例は本発明を限定するも
のではない。
【００７６】
【実施例】実施例１ アルファ−［２−［［（シクロヘキシルカーボンイミド
イル）アミノ］エチル］−オメガ−メトキシポリ（オキ
シ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ１１１．７の調製 Ａ．アルファ−（２−クロロエチル）−オメガ−メトキ
シポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ１１
１．７の調製（ここで使用するとき、ＳＲＵはＰＥＧポ
リマーの中に存在する自己反復単位の数を表示する）。
【００７７】７００ｍｌのトルエン中の５０ｇのＭＰＥ
Ｇ（メトキシポリエチレングリコール、分子量５００
０）のスラリーから、２００ｍｌの溶媒を蒸留した。こ
の還流する溶液に、０．８ｍｌの乾燥ピリジンおよび
２．２ｍｌの塩化チオニルを滴々添加した。１時間還流
した後、反応を一夜撹拌した。次いで溶媒を減圧下に除
去し、そして５００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2を残留物に添加し
た。次いで生ずる溶液を無水炭酸カリウムで乾燥し、そ
して５０ｇの塩基性アルミナ（Ｗｏｌｅｍ Ｓｕｐｅｒ
Ｉ）に通過させた。次いでＣＨ2Ｃｌ2の大部分を減圧
下に除去し、そして１リットルのジエチルエーテルを生
ずるシロップに添加した。エーテルを蒸留により除去
し、そして追加のジエチルエーテルを添加して沈澱を引
き起こした。この混合物を室温において２時間撹拌し、
次いで濾過すると、４５ｇのアルファ−（２−クロロエ
チル）−オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタ
ンジイル）ＳＲＵ１１１．７が得られた。
【００７８】分析：Ｃ3Ｈ7ＣｌＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）
111.7についての計算値：Ｃ，５３.９７；Ｈ，９.１
２；Ｃｌ，０.７１。
【００７９】 実測値：Ｃ，５４.２１；Ｈ，８.７０；Ｃｌ０.７１。
【００８０】Ｂ．アルファ−（２−アジドエチル）−オ
メガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）
ＳＲＵ１１１．７の調製 ２０ｇのアジ化ナトリウムおよび５０ｇのアルファ−
（２−クロロエチル）−オメガ−メトキシポリ（オキシ
−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ１１１．７の混合物
を、３７５ｍｌの乾燥ＤＭＦ中で１２０〜１２５℃に加
熱した。７時間後、溶媒を高い真空下に除去した。残留
物を５００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中に溶解し、そしてケイ藻
土を通して濾過した。次いでＣＨ2Ｃｌ2の大部分を沸騰
除去し、そしてジエチルエーテルを添加して沈澱を引き
起こした。この混合物を一夜撹拌し、次いで濾過した。
次いで残留物を５０℃において最小量のグリム中に溶解
し、この溶液を冷却し、そして沈澱した生成物を濾過す
ると、アルファ−（２−アジドエチル）−オメガ−メト
キシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ１１
１．７が得られた。
【００８１】分析：Ｃ3Ｈ3Ｎ3Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）111.7
についての計算値：Ｃ，５３.７７；Ｈ，９.０９；Ｎ，
０.８４。
【００８２】 実測値：Ｃ，５３.６１；Ｈ，９.０８；Ｈ，０.８９。
【００８３】Ｃ．アルファ−（２−アミノエチル）−オ
メガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）
ＳＲＵ１１１．７の調製 ２５０ｍｌの乾燥グリム中の２５ｇのアルファ−（２−
アジドエチル）−オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，
２−エタンジイル）ＳＲＵ１１１．７の混合物に、３．
５ｇの１０％のＰｄ／Ｃを添加した。次いでこの混合物
を５０ｐｓｉのＨ2の雰囲気下に配置し、そして５０℃
において１８時間震盪した。次いでこの混合物を濾過
し、固体をＣＨ2Ｃｌ2で洗浄し、そして一緒にした有機
溶液を減圧下に配置して溶媒を除去した。次いで残留物
を１００ｍｌの加温したグリム中に溶解し、そして生成
物を冷却した溶液から沈澱させた。沈澱を濾過し、そし
て減圧下に加温することによって乾燥して、２３ｇのア
ルファ−（２−アミノエチル）−オメガ−メトキシポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ１１１．７を
得た。
【００８４】分析：Ｃ3Ｈ9ＮＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）111.7
についての計算値：Ｃ，５４.４３；Ｈ，９.２０；Ｎ，
０.２８。
【００８５】 実測値：Ｃ，５４.４３；Ｈ，９.１８；Ｎ，０.３６。
【００８６】あるいは、２００ｍｌの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中
に溶解した４０ｇのアルファ−（２−アミノエチル）−
オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイ
ル）ＳＲＵ１１１．７の溶液をアルゴン雰囲気下に一夜
撹拌した。水（２ｍｌ）を添加し、そしてこの混合物を
さらに１２時間撹拌した。塩化メチレンの大部分を真空
下に除去し、そして４００ｍｌのジエチルエーテルを添
加した。沈澱を濾過し、エーテルで洗浄し、そして３０
０ｍｌの加温（５０℃）のグリム中に溶解した。この溶
液を室温において一夜放置し、そして生ずる沈澱を濾過
し、２×１００ｍｌのグリム、２×１００ｍｌのジエチ
ルエーテルで洗浄し、そして真空炉内でＮ2の流れ下に
乾燥すると、３５ｇのアルファ−（２−アミノエチル）
−オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイ
ル）ＳＲＵ１１１．７が得られた。 Ｄ．アルファ−［２−［［（シクロヘキシルアミノ）チ
オカルボニル］アミノ］エチル］−オメガ−メトキシポ
リ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ１１１．７
の調製 ６０ｍｌの乾燥グリム中の４ｇのアルファ−（２−アミ
ノエチル）−オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−
エタンジイル）ＳＲＵ１１１．７の溶液に、０．１ｍｌ
のシクロヘキシルイソチオシアネートを添加した。この
溶液を４０℃において１８時間撹拌した。次いでこの混
合物を濾過し、そして溶媒を高い真空下に除去した。次
いで残留物を１００ｍｌの加温グリム中に溶解し、この
溶液を冷却し、生ずる沈澱を濾過し、そして高い真空下
に乾燥すると、３．５ｇのアルファ−［２−［［（シク
ロヘキシルアミノ）チオカルボニル］アミノ］エチル］
−オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイ
ル）ＳＲＵ１１１．７が得られた。
【００８７】分析：Ｃ10Ｈ20Ｎ2ＯＳ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）
117.7についての計算値：Ｃ，５４.２５；Ｈ，９.１
３；Ｎ，０.５４；Ｓ，０.６２。
【００８８】実測値：Ｃ，５４.３９；Ｈ，８.８７；
Ｎ，０.５５；Ｓ，０.５９。
【００８９】Ｅ．アルファ−［２−［［（シクロヘキシ
ルカーボンイミドイル）アミノ］エチル］−オメガ−メ
トキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ１
１１．７の調製 ５ｍｌの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の１ｇのアルファ−［２−
［［（シクロヘキシルアミノ）チオカルボニル］アミ
ノ］エチル］−オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２
−エタンジイル）ＳＲＵ１１１．７、１２０ｍｇのトリ
フェニルホスフィン、９０μｌのＣＣｌ4および８４μ
ｌのトリエチルアミンの溶液を７２時間還流した。次い
で溶媒を減圧下に除去し、そして残留物を最小量の乾燥
グリム中に溶解した。冷却後、生成物は沈澱し、これを
濾過し、そして真空下に乾燥すると、アルファ−［２−
［［（シクロヘキシルカーボンイミドイル）アミノ］エ
チル］−オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタ
ンジイル）ＳＲＵ１１１．７が得られた。
【００９０】分析：Ｃ10Ｈ18Ｎ2Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）
111.7についての計算値：Ｃ，５４.６１；Ｈ，９.１
５；Ｎ，０.５５。
【００９１】 実測値：Ｃ，５４.９５；Ｈ，９.２７；Ｎ，０.５０。
【００９２】実施例１ａ アルファ−（２−クロロエチル）−オメガ−メトキシポ
リ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ２２５の調
製 実施例１Ａに記載する手順により、ＭＰＥＧ分子量１
０，０００をアルファ−（２−クロロエチル）−オメガ
−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲ
Ｕ２２５に転化した。
【００９３】分析：Ｃ3Ｈ7ＣｌＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）225
についての計算値：Ｃ，５４.３７；Ｈ，９.１４；Ｃ
ｌ，０.３５。
【００９４】 実測値：Ｃ，５４.３０；Ｈ，９.１５；Ｃｌ，０.４
１。
【００９５】実施例１ｂ アルファ−（２−アジドエチル）−オメガ−メトキシポ
リ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ２２５の調
製 実施例１Ｂに記載する手順により、アルファ−（２−ク
ロロエチル）−オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２
−エタンジイル）ＳＲＵ２２５をアルファ−（２−アジ
ドエチル）−オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−
エタンジイル）ＳＲＵ２２５に転化した。
【００９６】分析：Ｃ3Ｈ7Ｎ3Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）225に
ついての計算値：Ｃ，５４.３４；Ｈ，９.１３；Ｎ，
０.４２。
【００９７】 実測値：Ｃ，５４.３２；Ｈ，９.２８；Ｎ，０.５０。
【００９８】実施例１ｃ アルファ−（２−アミノエチル）−オメガ−メトキシポ
リ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ２２５の調
製 実施例１Ｃに記載する手順により、アルファ−（２−ア
ジドエチル）−オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２
−エタンジイル）ＳＲＵ２２５をアルファ−（２−アミ
ノエチル）−オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−
エタンジイル）ＳＲＵ２２５に転化した。
【００９９】分析：Ｃ3Ｈ9ＮＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）225に
ついての計算値：Ｃ，５４.４８；Ｈ，９.１７；Ｎ，
０.１４。
【０１００】 実測値：Ｃ，５４.８０；Ｈ，９.２１；Ｎ，０.１２。
【０１０１】実施例１ｄ アルファ−（２−クロロエチル）−オメガ−メトキシポ
リ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ２８．３の
調製 ４０ｍｌの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の新しく蒸留した塩化オキ
サリル（０．５ｍｌ）の溶液に０℃において、１０ｍｌ
のＣＨ2Ｃｌ2中の０．５ｍｌの乾燥ＤＭＦを滴々添加し
た。生ずる溶液を室温に加温し、１５分間撹拌し、次い
で再び０℃に冷却した。次いでＭＰＥＧ分子量１３２５
（５．６ｇ）を添加し、そして生ずる溶液を５時間還流
した。次いでこの混合物を水中に注ぎ、そしてこの混合
物をＣＨ2Ｃｌ2で抽出した。ＣＨ2Ｃｌ2溶液を硫酸マグ
ネシウムで乾燥し、そして溶媒を減圧下に除去すると、
１．７ｇのアルファ−（２−クロロエチル）−オメガ−
メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ
２８．３が白色固体として得られた。
【０１０２】分析：Ｃ3Ｈ7ＣｌＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）28.3
についての計算値：Ｃ，５３.３８；Ｈ，９.０３；Ｃ
ｌ，２.６４。
【０１０３】 実測値：Ｃ，５３.４８；Ｈ，９.１０；Ｃｌ，２.４
１。
【０１０４】実施例１ｅ アルファ−（２−アジドエチル）−オメガ−メトキシポ
リ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ２８．３の
調製 実施例１Ｂに記載する手順により、アルファ−（２−ク
ロロエチル）−オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２
−エタンジイル）ＳＲＵ２８．３をアルファ−（２−ア
ジドエチル）−オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２
−エタンジイル）ＳＲＵ２８．３に転化した。
【０１０５】分析：Ｃ3Ｈ7Ｎ3Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）28.3
についての計算値：Ｃ，５３.１２；Ｈ，８.９９；Ｎ，
３.１１。
【０１０６】 実測値：Ｃ，５３.２１；Ｈ，９.０７；Ｎ，２.９８。
【０１０７】実施例１ｆ アルファ−（２−アミノエチル）−オメガ−メトキシポ
リ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ２８．３の
調製 実施例Ｃに記載する手順により、アルファ−（２−アジ
ドエチル）−オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−
エタンジイル）ＳＲＵ２８．３をアルファ−（２−アミ
ノエチル）−オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−
エタンジイル）ＳＲＵ２８．３に転化した。
【０１０８】分析：Ｃ3Ｈ9ＮＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）28.3に
ついての計算値：Ｃ，５４.４７；Ｈ，９.１７；Ｎ，
０.１４。
【０１０９】 実測値：Ｃ，５４.４４；Ｈ，９.１９；Ｎ，０.１５。
【０１１０】実施例２ 試薬アルファ−［２−［［（シクロヘキシルカーボンイ
ミドイル）アミノ］エチル］−オメガ−メトキシポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ１１１．７に
よるＰＥＧに接合した組み換えインターフェロン−アル
ファ（ＩＦＮ−アルファ）の調製 実施例１に従い調製したアルファ−［２−［［（シクロ
ヘキシルカーボンイミドイル）アミノ］エチル］−オメ
ガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）Ｓ
ＲＵ１１１．７を、２００μｌの緩衝液（０．１モルの
ホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．０）中の１ｍｇの均質なＩ
ＦＮ−アルファに、１０モルの試薬／１モルのＩＦＮ−
アルファのモル比で添加した。この溶液をよく混合し、
そしてペギル化反応を室温において６０分間進行させ
た。
【０１１１】ＩＦＮ−アルファの誘導化（またはペギル
化）の量を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により推定した（表Ｉ）。タン
パク質をクーマッー・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂ
ｌｕｅ）の染色により可視化した。６０分の反応からの
生成物の分析は、ＰＥＧ−接合したＩＦＮ−アルファに
相当する新しいより高い分子量の種を明らかにする。Ｉ
ＦＮ−アルファはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより１５ｋＤの見
掛けの分子量を有する。したがって、見掛けの分子量が
変化しないままである未変性のＩＦＮ−アルファはＰＥ
Ｇと接合しない。ＰＥＧ変性したＩＦＮ−アルファ生成
物は２８ｋＤの見掛けの分子量を有する。
【０１１２】
【表１】表Ｉ：実施例１に記載する試薬を使用するＩＦＮ−アルファの変性 ＩＦＮタンパク質の 反応からの合計の 見掛けの分子量（ｋＤ） タンパク質の％ １５ （未変性） ８０ ２８ ２０実施例３ 試薬アルファ−［２−［［（シクロヘキシルカーボンイ
ミドイル）アミノ］エチル］−オメガ−メトキシポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ１１１．７に
よるＰＥＧに接合した組み換え インターロイキン−２
（ｒＩＬ−２）の調製 実施例１に従い調製したアルファ−［２−［［（シクロ
ヘキシルカーボンイミドイル）アミノ］エチル］−オメ
ガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）Ｓ
ＲＵ１１１．７を、２００μｌの緩衝液（０．１モルの
ホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．０）中の２ｍｇのｒＩＬ−
２に、１０モルの試薬／１モルのｒＩＬ−２のモル比で
添加した。この溶液をよく混合し、そしてペギル化反応
を室温において６０分間進行させた。
【０１１３】このタンパク質の誘導化（またはペギル
化）の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより推定した（表Ｉ
Ｉ）。タンパク質をクーマッー・ブルーの染色により可
視化した。６０分の反応からの生成物の分析は、ＰＥＧ
−接合したｒＩＬ−２タンパク質に相当する新しいより
高い分子量の種を明らかにする。ｒＩＬ−２はＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより１５ｋＤの見掛けの分子量を有する。未
変性のｒＩＬ−２は見掛けの分子量が変化しないままで
ある反応混合物から分離されたタンパク質であり、した
がってＰＥＧと接合しない。主要量のＰＥＧ変性したｒ
ＩＬ−２生成物は２８ｋＤの見掛けの分子量を有する。
【０１１４】
【表２】表ＩＩ：実施例１に記載する試薬を使用するｒＩＬ−２の変性 ｒＩＬ−２タンパク質の 反応からの合計の 見掛けの分子量（ｋＤ） タンパク質の％ １５ （未変性） ２０ ２８ ５０ ３３ ２０ ４３ １０ ペギル化ｒＩＬ−２は、反応混合物から、ケイター（Ｋ
ａｔｒｅ）ら［プロシーディングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８４：１４８３−１
４９１（１９８７）］が記載するように親水***換クロ
マトグラフィー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；Ｂｉｏｇｅｌ−フェ
ニル５−ＰＷ）を使用して精製した。５０ミリモルのリ
ン酸ナトリウムｐＨ７．０中の３０分で１．５３から
０．０モルの（ＮＨ4）2ＳＯ4に減少する直線の勾配を
使用して、ＰＥＧ変性したおよび未変性のｒＩＬ−２を
分離した。分画のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
評価し、そしてプールした分画をギリス（Ｇｉｌｌｉ
ｓ）ら［ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ）、１２０：２０２７−２０３２（１９７
８）］が記載する方法によりＣＴＬＬ細胞増殖アッセイ
においてその比活性を決定した。タンパク質の濃度はｒ
ＩＬ−２について０．６６７の消光係数を使用して２８
０ｎｍにおいて分光光度測定的に決定した。ｒＩＬ−２
単離されたタンパク質の比活性は単位／ｍｇタンパク質
として表し、そして結果を表ＩＩＩに要約する。ｒＩＬ
−２の比活性はＰＥＧとの接合により有意に変更しない
ことが明らかである。
【０１１５】
【表３】表ＩＩＩ：実施例１に記載する試薬を使用してＰＥＧに接合したｒＩＬ−２の生 物学的活性 ｒＩＬ−２タンパク質の 見掛けの分子量（ｋＤ） 比活性（単位／ｍｇ） １５（未変性 ＩＬ２） ２.０×１０7 ２８ ２.４×１０7 実施例４ 試薬アルファ−［２−［［（シクロヘキシルカーボンイ
ミドイル）アミノ］エチル］−オメガ−メトキシポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ１１１．７に
よるＰＥＧに接合した組み換えインターロイキン−１−
アルファ（ｒＩＬ−１アルファ）の調製 実施例１に記載する試薬を１．０ｍｌの０．１モルのホ
ウ酸ナトリウム、ｐＨ９．０中の２．０ｍｇのｒＩＬ−
１アルファに、１０モルの試薬／１モルのｒＩＬ−１ア
ルファのモル比で添加した。この溶液をよく混合し、そ
してペギル化反応を室温において６０分間進行させた。
【０１１６】このタンパク質の誘導化（またはペギル
化）の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより推定した（表Ｉ
Ｖ）。タンパク質をクーマッー・ブルーの染色により可
視化した。６０分の反応からの生成物の分析は、ＰＥＧ
−接合したｒＩＬ−１アルファタンパク質に相当する新
しいより高い分子量の種を明らかにする。ｒＩＬ−１ア
ルファはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより１７ｋＤの見掛けの分
子量を有する。未変性のｒＩＬ−１アルファは見掛けの
分子量が変化しないままである反応混合物から分離され
たタンパク質であり、したがってＰＥＧと接合しない。
主要量のＰＥＧ変性したｒＩＬ−１アルファ生成物は２
０ｋＤの見掛けの分子量を有する。
【０１１７】
【表４】表ＩＶ：実施例１に記載する試薬を使用するｒＩＬ−１アルファの変性 ｒＩＬ−１アルファタンパク質の 反応からの合計の 見掛けの分子量（ｋＤ） タンパク質の％ １７ （未変性） ８５ ３０ １５実施例５ アルファ−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−１−ピ
リジニル）チオカルボニル］−オメガ−メトキシポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ１１１．７の
調製 １５ｍｌの乾燥トルエン中の１ｇ（０．２ミリモル）の
ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）分子量５
０００の溶液から、５ｍｌの溶媒を蒸留した。生ずる溶
液を冷却し、そして４６．５ｍｇ（０．２ミリモル）の
１，１−カーボンチオイルビス２（１Ｈ）−ピリジノン
を添加した。次いでこの混合物をアルゴン雰囲気下に４
時間還流した。次いで溶媒を真空下に除去し、そして残
留物を５ｍｌの乾燥グリム中に溶解し、そして一夜放置
した。次いで生ずる沈澱を濾過し、そして２×５ｍｌの
乾燥グリムおよび５ｍｌのジエチルエーテルで洗浄し
た。次いで生成物を真空炉内でＮ2の遅い流れ下に乾燥
すると、０．９６ｇのアルファ−［（１，２−ジヒドロ
−２−オキソ−１−ピリジニル）チオカルボニル］−オ
メガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）
ＳＲＵ１１１．７が得られた。
【０１１８】分析：Ｃ9Ｈ11ＮＯ3Ｓ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）
111.7についての計算値：Ｃ，５４.３７；Ｈ，８.９
９；Ｎ，０.２７；Ｓ，０.６２。
【０１１９】実測値：Ｃ，５４.０３；Ｈ，８.９８；
Ｎ，０.１８，Ｓ，０.５９。
【０１２０】実施例５ａ アルファ−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−１−ピ
リジニル）チオカルボニル］−オメガ−メトキシポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ２２５の調製 実施例５に記載する手順により、ＭＰＥＧ（メトキシポ
リエチレングリコール）分子量１０，０００をアルファ
−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−１−ピリジニ
ル）チオカルボニル］−オメガ−メトキシポリ（オキシ
−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ２２５に転化した。
【０１２１】分析：Ｃ9Ｈ11ＮＯ3Ｓ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）
225についての計算値：Ｃ，５４.５４；Ｈ，９.０８；
Ｎ，０.１４；Ｓ，０.３２。
【０１２２】実測値：Ｃ，５４.３８；Ｈ，９.１６；
Ｎ，０.１５，Ｓ，０.３１。
【０１２３】実施例６ 試薬アルファ−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−１
−ピリジニル）チオカルボニル］−オメガ−メトキシポ
リ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ１１１．７
によりＰＥＧに接合したインターロイキン−１レセプタ
拮抗剤（ＩＬ−１ｒａ）の調製 アルファ−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−１−ピ
リジニル）チオカルボニル］−オメガ−メトキシポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ１１１．７
を、１．０ｍｌのの衝液（０．１モルのホウ酸ナトリウ
ム、ｐＨ９．０）中の１０ｍｇの均質なＩＬ−１ｒａ
に、５モルの試薬／１モルのＩＬ−１ｒａのモル比で添
加した。この溶液をよく混合し、そしてペギル化反応を
室温において６０分間進行させた。
【０１２４】このタンパク質の誘導化（またはペギル
化）の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより推定した（表
Ｖ）。タンパク質をクーマッー・ブルーの染色により可
視化した。６０分の反応からの生成物の分析は、ＰＥＧ
−接合したＩＬ−１ｒａタンパク質に相当する新しいよ
り高い分子量の種を明らかにする。ＩＬ−１ｒａはＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより１９ｋＤの見掛けの分子量を有す
る。未変性のＩＬ−１ｒａは見掛けの分子量が変化しな
いままである反応混合物から分離されたタンパク質であ
り、したがってＰＥＧと接合しない。
【０１２５】主要量のＰＥＧ変性したＩＬ−１ｒａタン
パク質は２６および３３ｋＤの見掛けの分子量を有す
る。
【０１２６】
【表５】表Ｖ：実施例５に記載する試薬を使用するＩＬ−１ｒａの変性 ＩＬ−１ｒａタンパク質の 反応からの合計の 見掛けの分子量（ｋＤ） タンパク質の％ １９ （未変性） ３６ ２６ ３３ ３３ ２１ ＞３３ １０ ペギル化ｒＩＬ−２は、反応混合物から、親水***換ク
ロマトグラフィー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；Ｂｉｏｇｅｌ−フ
ェニル５−ＰＷ）を使用して精製した。５０ミリモルの
リン酸ナトリウムｐＨ７．０中の２０分で０．４３から
０．０モルの（ＮＨ4）2ＳＯ4に減少する直線の勾配を
使用して、ペギル化ＩＬ−１ｒａおよび未変性のｒＩＬ
−２を分離した。分画のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により評価し、そしてプールした分画をＩＬ−１ラジオ
レセプタ競争結合アッセイにおいてアッセイした。［キ
リアン（Ｋｉｌｉａｎ）ら、ジャーナル・オブ・イムノ
ロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ）、１３６：４５０９−４
５１７（１９８６）］。簡単に述べると、ＩＬ−１ｒａ
およびＰＥＧ−ＩＬ−１ｒａを変化する濃度でＥＬ−４
膜とともに３０分間３７℃においてインキュベーション
した。次いで［125Ｉ］ＩＬ−１を添加し、そして３０
分間インキュベーションした。このアッセイを真空濾過
により停止し、そしてフィルタープレート上の細胞結合
した［125Ｉ］ＩＬ−１を集めた。［125Ｉ］ＩＬ−１の
結合を５０％だけ阻害するＩＬ−１ｒａまたはＰＥＧ−
ＩＬ−１ｒａの濃度（ＩＣ50）をグラフで決定した。結
果を表ＶＩに示す。このアッセイにおけるＩＬ−１ｒａ
のＩＣ50は１〜２．０ｎｇ／ｍｌである。ペギル化ＩＬ
−１ｒａ混合物は、未変性ＩＬ−１ｒａに関して２〜３
倍のファクター内で、ＥＬ−４膜上のＩＬ−１レセプタ
に結合するその能力を保持した。
【０１２７】
【表６】表ＶＩ：実施例５に記載する試薬を使用して接合したＩＬ−１ｒａによる ［125Ｉ］ＩＬ−１結合の阻害 ＩＬ−１ｒａタンパク質の 見掛けの分子量（ｋＤ） ＩＣ50（ｎｇ／ｍｌ） １９Ｋ （未変性） ２.０ ２６Ｋ，３３Ｋ（混合物） ５.０ ＩＬ−１ｒａタンパク質の薬力学を生体内でＩＬ−１ｒ
ａがインターロイキン−６のｒＩＬ−１アルファの誘発
を阻害する能力により評価した。ｒＩＬ−１アルファで
処置したマウスからの血清は高いレベルのＩＬ−６を含
有した［マクイントシュ（ＭｃＩｎｔｏｓｈ）ら、イム
ノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）１４３：１６２−１
６７（１９８９）］。未変性ＩＬ−１ｒａをＩＬ−１ア
ルファと一緒に投与すると（０時間の時点）ＩＬ−６の
誘発を阻害する。この試験系を使用して未変性およびＰ
ＥＧ−ＩＬ−１ｒａの薬力学的性質を比較した。３匹の
Ｃ５７Ｂ１／６マウスの群に２００μｇの未変性ＩＬ−
１アルファまたはＰＥＧ−ＩＬ−１ｒａを４８時間、２
４時間または６時間前に、あるいは０．２μｇのｒＩＬ
−１アルファと同時に皮下注射した。３時間後、血清試
料を集めた。ＩＬ−６のレベル（単位）は、従来記載さ
れたＩＬ−６アッセイの変法を使用して決定した［バン
・スニック（Ｖａｎ Ｓｎｉｃｋ）ら、プロシーディン
グス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳ
Ａ、８３：９６７９−９６８３（１９８６）］。ＩＬ−
６のアッセイにおいて、Ｂ９ハイブリドーマ細胞を９６
ウェルのマイクロタイタープレート中で試験血清の２倍
の系統的希釈物で処置した。５％のＣＯ2および９５％
の空気から構成される加湿した雰囲気中で３７℃におい
て３日間インキュベーションした後、ウェルを０．５μ
Ｃｉのトリチウム化チミジンでパルシングし、そしてさ
らに１８時間インキュベーションした。次いで細胞をガ
ラス繊維の濾液上に収穫し、そしてトリチウム化チミジ
ンの組み込みのレベルをシンチレーションカウンターに
より決定した。ＩＬ−６の活性をＵ／ｍｌとして表す。
ＩＬ−６単位を参照標準と比較して最大のトリチウム化
チミジン組み込みの１／２を産生する血清希釈の逆数と
して定義する。
【０１２８】薬力学的データを表Ｄ１に要約する。ＩＬ
−１のみで処置したマウスは２８８５２Ｕ／ｍｌのＩＬ
−６を示した。未変性および変性のＩＬ−１ｒａは０時
間でＩＬ−６の誘発を阻害した。しかしながら、ｐｇｌ
ＩＬ−１ｒａは、投与後８および２４時間において、未
変性ＩＬ−１ｒａと比較して延長したＩＬ−６阻害作用
を実証した。
【０１２９】
【表７】表Ｄ１．実施例５に記載する試薬を使用して接合したＩＬ−１ｒａの薬力学的プ ロフィル ＩＬ−１投与の前の時間 ＩＬ−６（単位／ｍｌ） （時間） １９ｋＤ ２６ｋＤ 0 772 705 6 8361 1587 24 22525 9844 48 18485 21119 72 13220 21470実施例６Ａ 試薬アルファ−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−１
−ピリジニル）チオカルボニル］−オメガ−メトキシポ
リ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ２２５によ
りＰＥＧに接合したＩＬ−１レセプタ拮抗剤（ＩＬ−１
ｒａ）の調製 ＩＬ−１ｒａを実施例６に例示する手順に従い実施例５
ａに記載する試薬を使用して接合しそして精製した。
【０１３０】主要量のＰＥＧ−変性ＩＬ−１ｒａタンパ
ク質は３３ｋＤおよび４８ｋＤの見掛けの分子量を有す
る。３３ｋＤおよび４８ｋＤのタンパク質は反応混合物
中の合計タンパク質の、それぞれ、４６および２７％を
構成する。
【０１３１】実施例６に記載するように、ＩＬ−１結合
を阻害するこれらのタンパク質の能力を表ＶＩＩに要約
する。３３ｋＤのＰＥＧ変性タンパク質はＩＬ−１ｒａ
に関して６倍内でＩＬ−１の結合を阻害する能力を保持
し、そしてこの４８ｋＤのタンパク質で観測されるＰＥ
Ｇを使用するタンパク質のより広範な変性はＩＬ−１レ
セプタへのその結合を実質的に損失する。
【０１３２】
【表８】表ＶＩＩ：実施例５ａに記載する試薬を使用して接合したＩＬ−１ｒａタンパク 質による［125Ｉ］ＩＬ−１結合の阻害 ＩＬ−１ｒａタンパク質の 見掛けの分子量（ｋＤ） ＩＣ50（ｎｇ／ｍｌ） １９ （未変性） １.６ ３３ ９.０ ４８ ５０.０ ＰＥＧ−ＩＬ−１ｒａ種の薬力学的プロフィルを決定す
るために、Ｃ５７ＢＦ／６マウスに１００μｇの変性ま
たはペギル化したＩＬ−１ｒａ種を皮下に投与した。未
変性ＩＬ−１ｒａを与えたマウスから１、２、３、４お
よび６時間後に、およびＰＥＧ−ＩＬ−１ｒａを与えた
マウスから２、４、８、１０および２４時間後に、血清
試料を集めた。実施例６に記載するＥＬ４膜結合アッセ
イにおいて、血清レベルを決定した。データを表Ｄ２に
要約する。ＰＥＧ−ＩＬ−１ｒａは、ＩＬ−１ｒａと比
較して、より高い高い濃度においてかつ延長した時間の
間血清試料の中に検出することができ、延長された血清
時間の過程を実証した。
【０１３３】
【表９】表Ｄ２．実施例６ａにおけるようにペギル化したＩＬ−１ｒａの薬力学的プロフ ィル ＩＬ−１ｒａの血清濃度 ＩＬ−１投与後の時間(時間) １９ｋＤ ３３ｋＤ 1 400 2 130 2500 40 4 15 800 6 16 8 300 10 250 24 15実施例７ 試薬アルファ−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−１
−ピリジニル）チオカルボニル］−オメガ−メトキシポ
リ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ１１１．７
によりＰＥＧに接合したｒＩＬ−１アルファの調製 組み換えＩＬ−１アルファを実施例５に記載する試薬を
使用して実施例４に記載するように方法によりペギル化
した。反応混合物からの３つの主要な分子量の種をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより同定し、見掛けの分子量は１７（未
変性）、２６および３３ｋＤに相当する。後者の２つの
ペギル化タンパク質は、合計のタンパク質の、それぞ
れ、２５および５５％を構成する。
【０１３４】ペギル化ｒＩＬ−１アルファは、反応混合
物から、親水***換クロマトグラフィー（Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ；ＨＲＬＣ ＭＰ７ ＨＩＣ）を使用して精製した。
５０ミリモルのリン酸ナトリウムｐＨ７．０中の２０分
で０．４３から０．０モルの（ＮＨ4）2ＳＯ4に減少す
る塩濃度の直線の勾配を使用して、ペギル化ｒＩＬ−１
アルファおよび未変性のｒＩＬ−１アルファを分離し
た。分画のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価
し、そしてプールした分画をケイエ（Ｋａｙｅ）ら［ジ
ャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン
（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）、１５８：８３６−８５４
（１９８３）］が記載する方法によりＤ１０細胞増殖ア
ッセイにおいてその比活性を決定した。タンパク質の濃
度はｒＩＬ−１アルファについて１．０の消光係数を使
用して２８０ｎｍにおいて分光光度測定的に決定した。
ｒＩＬ−１アルファの比活性はほぼ１．０×１０8単位
／ｍｇである。比活性の結果を表ＶＩＩＩに要約する。
２６ｋＤのペギル化ＩＬ−１アルファ接合体はＩＬ−１
アルファに関して２〜３倍内の生物学的活性を保持す
る。３３ｋＤのタンパク質をを生ずるそれ以上の変性
は、生物学的活性を実質的に損失する。
【０１３５】
【表１０】表ＶＩＩＩ：実施例５に記載する試薬を使用してＰＥＧに接合したｒＩＬ−１ア ルファの生物学的活性 ｒＩＬ−１アルファタンパク質の 見掛けの分子量（ｋＤ） 比活性（単位／ｍｇ） １７ （未変性） ４.６×１０7 ２６ １.９×１０7 ３３ ４.５×１０6 実施例８ アルファ−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−１−ピ
リジニル）チオカルボニル］−オメガ−メトキシポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ１１１．７に
よりＰＥＧに接合したＩＦＮ−アルファの調製 実施例５に従い調製したアルファ−［（１，２−ジヒド
ロ−２−オキソ−１−ピリジニル）チオカルボニル］−
オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイ
ル）ＳＲＵ１１１．７を、２００μｌの緩衝液（０．１
モルのホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．０）中の１ｍｇのＩ
ＦＮ−アルファに、８モルの試薬／１モルのＩＦＮ−ア
ルファのモル比で添加した。この溶液をよく混合し、そ
してペギル化反応を室温において６０分間進行させた。
【０１３６】反応混合物からの主要な分子量の種をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより同定し、見掛けの分子量は１５（未
変性）および２８ｋＤであった。２８ｋＤのペギル化タ
ンパク質は合計のタンパク質の４０％を構成した。ペギ
ル化ＩＦＮ−アルファは、反応混合物から、親水***換
クロマトグラフィー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；Ｂｉｏｇｅｌ−
フェニル５−ＰＷ）を使用して精製しそして特性決定し
た。５０ミリモルのリン酸ナトリウムｐＨ７．０中の２
０分で０．４２から０．０モルの（ＮＨ4）2ＳＯ4に減
少する塩濃度の直線の勾配を使用して、ペギル化ＩＦＮ
−アルファおよび未変性のＩＦＮ−アルファを分離し
た。分画のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価
し、そしてプールした分画をファミレッチ（Ｆａｍｉｌ
ｌｅｔｔｉ）ら［メソッズ・イン・エンジモロジー（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍ．）、７８：３８７−３９４
（１９８７）］が記載する方法によりＭＤＢＫアッセイ
において抗ウイルス活性（比活性）についてアッセイし
た。
【０１３７】タンパク質の濃度は１ｍｇ／ｍｌのＩＦＮ
−アルファ緩衝化溶液について１．０の消光係数を使用
して２８０ｎｍにおいて分光光度測定的に決定した。単
離されたタンパク質の比活性は単位／ｍｇタンパク質と
して表し、そして結果を表ＩＸに要約する。
【０１３８】結果が示すように、２８ｋＤのペギル化Ｉ
ＦＮ−アルファの比活性はＩＦＮ−アルファに関して有
意に変更されない。
【０１３９】
【表１１】表ＩＸ：実施例５の試薬を使用してＰＥＧに接合したＩＦＮ−アルファの生物学 的活性 ＩＦＮ−アルファタンパク質の 見掛けの分子量（ｋＤ） 比活性（単位／ｍｇ） １５ （未変性） １.１×１０8 ２８ １.４×１０8 実施例８Ａ 試薬アルファ−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−１
−ピリジニル）チオカルボニル］−オメガ−メトキシポ
リ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ２２５によ
りＰＥＧに接合したＩＦＮ−アルファの調製 ＩＦＮ−アルファを実施例８におけるように実施例５ａ
に記載する試薬でペギル化した。３つの主要な分子量の
飽和炭酸カリウム溶液を６０分の反応混合物からＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより同定し、見掛けの分子量は１５（未変
性）、３５および４３ｋＤに対応した。後者２つのペギ
ル化タンパク質を反応混合物中の合計のタンパク質の、
それぞれ、３５および３３％を構成する。
【０１４０】実施例８に記載する手順により決定したＩ
ＦＮ−アルファのペギル化種の比活性を表Ｘに要約す
る。結果が示すように、３５ｋＤのペギル化ＩＦＮ−ア
ルファはＩＦＮ−アルファの２〜３倍内で生物学的活性
を保持した。４３ｋＤの接合体は実質的な活性を損失し
た。
【０１４１】
【表１２】表Ｘ：実施例５ａの試薬を使用してＰＥＧに接合したＩＦＮ−アルファの生物学 的活性 ＩＦＮ−アルファタンパク質の 見掛けの分子量（ｋＤ） 比活性（単位／ｍｇ） １５ （未変性） ３.３×１０8 ３５ １.２×１０8 ４３ １.５×１０7 実施例８Ｂ 試薬アルファ−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−１
−ピリジニル）チオカルボニル］−オメガ−メトキシポ
リ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ１１１．７
によりＰＥＧに接合したｒＩＬ−２の調製 ｒＩＬ−２を実施例５に記載する試薬でペギル化し、そ
して実施例３に記載する手順を使用して精製した。
【０１４２】６０分後の反応混合物からの主要な分子量
の種をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、見掛けの分子量
は１５（未変性）および２５ｋＤであった。２５ｋＤの
ペギル化タンパク質は反応における合計のタンパク質の
６０％を構成した。
【０１４３】ｒＩＬ−２の単離したタンパク質の比活性
を実施例３に記載するように測定し、そして単位／ｍｇ
タンパク質として表し、そして結果を表ＸＩに要約す
る。
【０１４４】表ＸＩにおいて見ることができるように、
ＩＬ−２の生物学的活性はＰＥＧとの接合後変更しなか
った。
【０１４５】
【表１３】表ＸＩ：実施例５に記載する試薬を使用してＰＥＧに接合したｒＩＬ−２の生物 学的活性 ｒＩＬ−２タンパク質の 見掛けの分子量（ｋＤ） 比活性（単位／ｍｇ） １５ （未変性） ２.０×１０7 ２５ ２.０×１０7 実施例８Ｃ 試薬アルファ−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−１
−ピリジニル）チオカルボニル］−オメガ−メトキシポ
リ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ２２５によ
りＰＥＧに接合したｒＩＬ−２の調製 ｒＩＬ−２を実施例３に記載する手順により実施例５ａ
に記載する試薬を使用してペギル化した。
【０１４６】６０分後の反応混合物からの主要な分子量
の種をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、見掛けの分子量
は１５ｋＤ（未変性）、３３ｋＤおよび４３ｋＤであっ
た。３３および４３ｋＤのペギル化タンパク質は反応に
おける合計のタンパク質の、それぞれ、６０および２０
％を構成した。
【０１４７】実施例９ 試薬アルファ−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−１
−ピリジニル）チオカルボニル］−オメガ−メトキシポ
リ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ１１１．７
によりＰＥＧに接合したＩＦＮ−アルファの調製 ＩＦＮ−アルファをＰＥＧへ接合する別の方法を次のよ
うにして実施した：ＩＦＮ−アルファ（１ｍｌ中の５ｍ
ｇ）を５ミリモル酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０、１２０
ミリモルＮａＣｌを含有する緩衝液に対して透析した。
透析したタンパク質溶液に、固体のチオシアン酸カリウ
ムを０．５モルの塩の最終濃度に添加し、そしてｐＨを
１／１０の体積のトリシン−水酸化ナトリウム、ｐＨ１
１．９を添加してｐＨ１０．０の溶液に調節した。アル
ファ−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−１−ピリジ
ニル）チオカルボニル］−オメガ−メトキシポリ（オキ
シ−１，２−エタンジイル）をこの試料に３モルの試薬
／１モルのタンパク質の比で添加した。変性反応を室温
において３０分間進行させ、そして１モルのグリシン、
ｐＨ６．３を２０ミリモルの最終濃度に添加して反応を
停止させた。３．５モルの硫酸アンモニウム、５０ミリ
モルリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を含有する緩衝液を
１．１モルの硫酸アンモニウムの最終濃度に添加するこ
とによって、ＰＥＧ変性されたタンパク質を沈澱させ、
そして沈澱を遠心（１０，０００×ｇ、１２分間）によ
り集めた。沈澱を１．１モルの硫酸アンモニウム、５０
ミリモルのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、を含有する
緩衝液ですすいだ後、沈澱を２５ミリモルの硫酸アンモ
ニウムを含有する緩衝液の中に再溶解した。ＰＥＧ変性
タンパク質を実施例２に記載するように精製し、そして
特性決定した。２８ｋＤの見掛けの分子量をもつ単一の
ペギル化ＩＦＮ種が得られた。変性されたタンパク質の
抗ウイルス活性（比活性）を実施例８に記載する手順に
より決定した。出発ＩＦＮ−アルファの比活性は２．６
×１０8Ｕ／ｍｇであり、そしてＰＥＧに接合したＩＦ
Ｎ−アルファの比活性は１．０×１０8Ｕ／ｍｇであ
り、ＰＥＧ接合ＩＦＮ−アルファはＩＦＮ−アルファに
関して３倍以内の生物学的活性を保持することが実証さ
れた。
【０１４８】実施例１０ 試薬アルファ−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−１
−ピリジニル）チオカルボニル］−オメガ−メトキシポ
リ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ２２５によ
りＰＥＧに接合したＩＦＮ−アルファの調製 ＩＦＮ−アルファを実施例９に記載する手順に従いＰＥ
Ｇに接合させた。タンパク質を実施例２および９に記載
するように精製しそして特性決定した。３１ｋＤの見掛
けの分子量を有しそして実施例８に記載するように１．
０×１０8Ｕ／ｍｇを有するＰＥＧに接合したＩＦＮ−
アルファを使用して、出発ＩＦＮ−アルファは２．６×
１０8Ｕ／ｍｇの比活性を有した。接合したＩＦＮ−ア
ルファの生物学的活性はＩＦＮ−アルファの３倍内であ
った。
【０１４９】実施例１１ アルファ−メチル−オメガ−［２−［［（２−ピリジニ
ルオキシ）カルボニル］アミノ］エトキシ］ポリ（オキ
シ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ１１１．７の調製 ４０ｍｌの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の１ｇ（０．２ミリモル）
のアルファ−（２−アミノエチル）−オメガ−メトキシ
ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ１１１．
７（実施例１Ｃにおいて調製した）の溶液から、１５ｍ
ｌの溶媒を蒸留した。次いで０℃において生ずる溶液
に、６５ｍｇ（０．３ミリモル）のジ−２−ピリジルカ
ーボネートを添加し、そしてこの混合物をさらに４時間
撹拌した。次いで溶媒を減圧下に除去し、そして残留物
をジエチルエーテルで粉砕した。次いで沈澱を濾過し、
５０ｍｌのエーテルで洗浄し、次いで５０ｍｌのヘキサ
ンで洗浄した。次いで生成物を真空炉内でＮ2の遅い流
れ下に乾燥すると、１ｇのアルファ−メチル−オメガ−
［２−［［（２−ピリジニルオキシ）カルボニル］アミ
ノ］エトキシ］ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）
ＳＲＵ１１１．７が得られた。
【０１５０】分析：Ｃ9Ｈ12Ｎ2Ｏ3（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）
111.7についての計算値：Ｃ，５４.５６；Ｈ，９.０
４；Ｎ，０.５５。
【０１５１】 実測値：Ｃ，５４.２６；Ｈ，９.００；Ｎ，０.５３。
【０１５２】実施例１１ａ アルファ−メチル−オメガ−［２−［［（２−ピリジニ
ルオキシ）カルボニル］アミノ］エトキシ］ポリ（オキ
シ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ２２５の調製 実施例１１に記載する手順により、アルファ−（２−ア
ミノエチル）−オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２
−エタンジイル）ＳＲＵ２２５（実施例１ｃにおいて調
製した）をアルファ−メチル−オメガ−［２−［［（２
−ピリジニルオキシ）カルボニル］アミノ］エトキシ］
ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ２２５に
転化した。
【０１５３】分析：Ｃ9Ｈ12Ｎ2Ｏ3（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）225
についての計算値：Ｃ，５４.５４；Ｈ，９.１０；Ｎ，
０.２８。
【０１５４】 実測値：Ｃ，５４.４９；Ｈ，９.２７；Ｎ，０.３１。
【０１５５】実施例１１ｂ アルファ−メチル−オメガ−［２−［［（２−ピリジニ
ルオキシ）カルボニル］アミノ］エトキシ］ポリ（オキ
シ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ２８．３の調製 実施例１１に記載する手順により、アルファ−（２−ア
ミノエチル）−オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２
−エタンジイル）ＳＲＵ２８．３（実施例１ｆにおいて
調製した）をアルファ−メチル−オメガ−［２−
［［（２−ピリジニルオキシ）カルボニル］アミノ］エ
トキシ］ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ
２８．３に転化した。
【０１５６】分析：Ｃ9Ｈ12Ｎ2Ｏ3（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）
28.3についての計算値：Ｃ，５４.６１；Ｈ，８.７５；
Ｎ，１.９４。
【０１５７】 実測値：Ｃ，５４.６７；Ｈ，８.９６；Ｎ，１.６３。
【０１５８】実施例１２ 試薬アルファ−メチル−オメガ−［２−［［（２−ピリ
ジニルオキシ）カルボニル］アミノ］エトキシ］ポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ１１１．７に
よりＰＥＧに接合したＩＬ−１ｒａの調製 アルファ−メチル−オメガ−［２−［［（２−ピリジニ
ルオキシ）カルボニル］アミノ］エトキシ］ポリ（オキ
シ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ１１１．７を、２．
５ｍｌの緩衝液（０．１モルのホウ酸ナトリウム、ｐＨ
９．０）中の２５ｍｇのＩＬ−１ｒａに、１モルの試薬
／１モルのＩＬ−１ｒａのモル比で添加した。この溶液
をよく混合し、そしてペギル化反応を室温において６０
分間進行させた。次いでＰＥＧ変性ＩＬ−１ｒａを実施
例６に記載する手順に従い精製した。
【０１５９】６０分の反応からの主要なペギル化生成物
は２８ｋＤおよび３８ｋＤの見掛けの分子量を有し、反
応混合物からの合計のタンパク質の、それぞれ、ほぼ４
２および２９％を構成した。
【０１６０】反応混合物から精製したＩＬ−１ｒａがＩ
Ｌ−１の結合を阻害する能力を実施例６に記載するよう
にして決定し、そして表ＸＩＩに要約する。２８ｋＤの
生成物の結合性質は有意に変更せず、そして３８ｋＤの
タンパク質の結合能力はＩＬ−１ｒａの５倍以内の活性
を保持した。
【０１６１】
【表１４】表ＸＩＩ：実施例１１に記載する試薬でペギル化したＩＬ−１ｒａタンパク質に よる［125Ｉ］ＩＬ−１の結合の阻害 ＩＬ−１ｒａタンパク質の ＩＣ50 見掛けの分子量（ｋＤ） (ng／ml) １９ （未変性） ２.０ ２８ ３.０ ３８ １０.０ ＰＥＧ−ＩＬ−１ｒａの薬力学的プロフィルを実施例６
に記載するように決定した。データを表Ｄ３に要約す
る。ＩＬ−２単独は２７２８３ｕ／ｍｌのＩＬ−６を誘
発した。未変性ＩＬ−１ｒａは投与の６時間以内にＩＬ
−１の応答の５０％より小さくを阻害した。対照的に、
ＰＥＧ ＩＬ−１ｒａは早い時点で活性に劣るが、注射
後２４および４８時間において非常に活性であった。こ
うして、ＰＥＧ−ＩＬ−１ｒａは延長した薬力学的プロ
フィルを示した。
【０１６２】
【表１５】表Ｄ３．実施例１１に記載する試薬で接合したＩＬ−１ｒａの薬力学的プロフィ ル ＩＬ−１投与の前の時間 ＩＬ−６（単位／ｍｌ） （時間） １９ｋＤ ２６ｋＤ 0 4789 23806 6 15324 10833 24 24841 5727 48 16348 9364 72 12067 12054 実施例１２Ａ試薬アルファ−メチル−オメガ−［２−［［（２−ピリ
ジニルオキシ）カルボニル］アミノ］エトキシ］ポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ２２５により
ＰＥＧに接合したＩＬ−１ｒａの調製 アルファ−メチル−オメガ−［２−［［（２−ピリジニ
ルオキシ）カルボニル］アミノ］エトキシ］ポリ（オキ
シ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ２２５（実施例１１
ａにおいて前述した）を、２．５ｍｌの緩衝液（０．１
モルのホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．０）中の２５ｍｇの
ＩＬ−１ｒａに、４モルの試薬／１モルのＩＬ−１ｒａ
のモル比で添加した。この溶液をよく混合し、そしてペ
ギル化反応を室温において６０分間進行させた。次いで
ＰＥＧ変性ＩＬ−１ｒａを実施例６に記載する手順に従
い精製した。
【０１６３】６０分の反応からの主要なペギル化生成物
は３３ｋＤおよび４８ｋＤの見掛けの分子量を有し、反
応混合物からの合計のタンパク質の、それぞれ、ほぼ７
６および１５％を構成した。反応混合物から精製したＩ
Ｌ−１ｒａがＩＬ−１の結合を阻害する能力を表ＸＩＩ
Ｉに要約する。３３ｋＤのＰＥＧ変性タンパク質はＩＬ
−１ｒａに関して８倍以内でＩＬ−１結合を阻害するそ
の能力を保持した。４８ｋＤの生成物は実質的な結合能
力を損失した。
【０１６４】
【表１６】表ＸＩＩＩ：実施例１１ａに記載する試薬でペギル化したＩＬ−１ｒａタンパク 質による［125Ｉ］ＩＬ−１の結合の阻害 ＩＬ−１ｒａタンパク質の 見掛けの分子量（ｋＤ） ＩＣ50（ng／ml) １９ （未変性） ０.８ ３３ ６.０ ４８ １８.０ ＰＥＧ−ＩＬ−１ｒａの薬力学的プロフィルを実施例６
Ａに記載するように決定した。データを表Ｄ４に要約す
る。ＩＬ−２は、未変性ＩＬ−１ｒａと比較して、より
高い濃度において延長した時間の間血清試料中で検出す
ることができる。
【０１６５】
【表１７】表Ｄ４．実施例１１ａに記載する試薬で接合したＩＬ−１ｒａの薬力学的プロフ ィル ＩＬ−１投与後の時間 ＩＬ−１ｒａの血清レベル(ng／mg) （時間） １９ｋＤ ３３ｋＤ １ ２２０ ２ ３３ ７００ ３ １３ ４ ５.３ ５００ ６ １.５ ８ １５０ １０ ８３ ２４ ５実施例１３ 試薬アルファ−メチル−オメガ−［２−［［（２−ピリ
ジニルオキシ）カルボニル］アミノ］エトキシ］ポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル）、ＳＲＵ１１１．７
によりＰＥＧに接合したｒＩＬ−２の調製 ｒＩＬ−２をアルファ−メチル−オメガ−［２−
［［（２−ピリジニルオキシ）カルボニル］アミノ］エ
トキシ］ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）、ＳＲ
Ｕ１１１．７で、実施例３および８Ｂに記載する手順に
従いペギル化した。ＩＬ−２タンパク質の比活性を実施
例８に記載するように決定した。１５ｋＤの未変性ｒＩ
Ｌ−２の比活性は２×１０7単位／ｍｇであり、そして
２９ｋＤのペギル化ＩＬ−２の比活性は２．４×１０7
単位／ｍｇであり、ペギル化の結果として生物学的活性
の実質的な損失がないことを示した。
【０１６６】実施例１４ 試薬アルファ−メチル−オメガ−［２−［［（２−ピリ
ジニルオキシ）カルボニル］アミノ］エトキシ］ポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル）、ＳＲＵ１１１．７
によりＰＥＧ変性ｒＩＬ−１の調製 ｒＩＬ−１を実施例１１に記載する試薬、アルファ−メ
チル−オメガ−［２−［［（２−ピリジニルオキシ）カ
ルボニル］アミノ］エトキシ］ポリ（オキシ−１，２−
エタンジイル）、ＳＲＵ１１１．７で、実施例４および
７に記載する手順に従いペギル化した。ＩＬ−２タンパ
ク質の比活性を実施例７に記載するように決定した。２
８ｋＤおよび３８ｋＤの見掛けの分子量をもつ２つのペ
ギル化ｒＩＬ−１アルファタンパク質を精製し、そして
６０分における反応混合物からの合計のタンパク質の、
それぞれ、５０および２５％を構成した。
【０１６７】実施例１５ ＩＦＮ−アルファを実施例１１に記載する試薬、アルフ
ァ−メチル−オメガ−［２−［［（２−ピリジニルオキ
シ）カルボニル］アミノ］エトキシ］ポリ（オキシ−
１，２−エタンジイル）、ＳＲＵ１１１．７で、実施例
８に記載する手順に従いペギル化した。タンパク質の４
０％は６０分後誘導化し、そして生成物は２６ｋＤの見
掛けの分子量を有した。
【０１６８】実施例１６ 試薬アルファ−メチル−オメガ−［２−［［（２−ピリ
ジニルオキシ）カルボニル］アミノ］エトキシ］ポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル）、ＳＲＵ１１１．７
によりＰＥＧに接合したＩＦＮ−アルファの調製 、ＩＦＮ−アルファをペギル化する別の方法 実施例９に例示する手順を使用して、ＩＦＮ−アルファ
をＰＥＧにアルファ−メチル−オメガ−［２−［［（２
−ピリジニルオキシ）カルボニル］アミノ］エトキシ］
ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）、ＳＲＵ１１
１．７により接合した。ＩＦＮ−アルファの比活性は実
施例８に記載するように決定した。出発ＩＦＮ−アルフ
ァの比活性は１．７×１０8Ｕ／ｍｇであり、そしてア
ルファ−メチル−オメガ−［２−［［（２−ピリジニル
オキシ）カルボニル］アミノ］エトキシ］ポリ（オキシ
−１，２−エタンジイル）によりＰＥＧに接合したＩＦ
Ｎ−アルファは０．８×１０8Ｕ／ｍｇであり、これは
ＩＦＮ−アルファの２〜３倍以内である。
【０１６９】実施例１７ 試薬アルファ−メチル−オメガ−［２−［［（２−ピリ
ジニルオキシ）カルボニル］アミノ］エトキシ］ポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル）、ＳＲＵ２２５によ
りＰＥＧに接合したＩＦＮ−アルファの調製 、ＩＦＮ−アルファをペギル化する別の方法 実施例９に例示する手順を使用して、ＩＦＮ−アルファ
を実施例１１ａに記載する試薬によりペギル化した。Ｐ
ＥＧに接合したＩＦＮ−アルファの実施例８に記載する
方法により決定した比活性は０．４×１０8Ｕ／ｍｇで
あり、生物学的活性の有意の損失がないこと実証した。
【０１７０】実施例１８ アルファ−［［（２−ピリジニルオキシ）カルボニル］
オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイ
ル）ＳＲＵ１１１．７の調製 ３０ｍｌの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中に溶解した１ｇのＭＰＥＧ
分子量５０００の溶液から、１０ｍｌの溶媒を蒸留し
た。この溶液を室温に冷却し、そして１３２ｍｇ（０．
６ミリモル）のジ−２−ピリジルカーボネートおよび４
ｍｇのＤＭＡＰを添加した。次いで生ずる溶液を１４時
間撹拌し、そして溶媒を真空下に除去した。残留物をジ
エチルエーテルで粉砕し、そして生ずる沈澱を濾過し
た。次いで生成物を７ｍｌの乾燥グリム中に溶解し、加
温して溶解し、そして生ずる溶液を冷却し、そして室温
において数時間撹拌した。次いで生ずる沈澱を濾過し、
そして２×５ｍｌの乾燥グリムで洗浄した。次いで固体
を真空炉内でＮ2の流れ下に乾燥すると、０．７ｇのア
ルファ−［［（２−ピリジニルオキシ）カルボニル］オ
メガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）
ＳＲＵ１１１．７が得られた。
【０１７１】分析：Ｃ9Ｈ11ＮＯ4（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）
111.7についての計算値：Ｃ，５４.５７；Ｈ，９.０
２；Ｎ，０.２８。
【０１７２】 実測値：Ｃ，５４.５１；Ｈ，９.１９；Ｎ，０.２８。
【０１７３】実施例１８ａ アルファ−［［（２−ピリジニルオキシ）カルボニル］
エトキシ］ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲ
Ｕ２２５の調製 実施例１８に記載する手順により、ＭＰＥＧ（メトキシ
ポリエチレングリコール）分子量１０，０００をアルフ
ァ−［［（２−ピリジニルオキシ）カルボニル］オメガ
−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲ
Ｕ２２５に転化した。
【０１７４】分析：Ｃ9Ｈ11ＮＯ4（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）225
についての計算値：Ｃ，５４.５４；Ｈ，９.０８；Ｎ，
０.１４。
【０１７５】 実測値：Ｃ，５４.５４；Ｈ，９.１２；Ｎ，０.１１。
【０１７６】実施例１９ 試薬アルファ−［［（２−ピリジニルオキシ）カルボニ
ル］オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジ
イル）ＳＲＵ１１１．７によりＰＥＧに接合したＩＬ−
１ｒａの調製 ＩＬ−１ｒａをアルファ−［［（２−ピリジニルオキ
シ）カルボニル］オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，
２−エタンジイル）ＳＲＵ１１１．７で実施例６および
１２に記載する手順によりペギル化した。主要なペギル
化生成物は２６ｋＤおよび３３ｋＤの見掛けの分子量を
有し、そして６０分の反応混合物からの合計のタンパク
質の、それぞれ、ほぼ３１および５７％を構成した。反
応混合物から精製したＩＬ−１ｒａタンパク質のＩＬ−
１の結合を阻害する能力を実施例６に記載するように決
定し、そして表ＸＩＶに要約する。２６ｋＤのペギル化
接合体はその結合能力をＩＬ−１ｒａの４倍以内に保持
した。３３ｋＤの接合体は、競争結合活性の１５倍減少
により示されるように、有意の結合活性を損失した。
【０１７７】
【表１８】表ＸＩＶ：実施例１８に記載する試薬でペギル化したＩＬ−１ｒａタンパク質に よる［125Ｉ］ＩＬ−１の結合の阻害 ＩＬ−１ｒａタンパク質の 見掛けの分子量（ｋＤ） ＩＣ50（ng／ml) １９ （未変性） ２.０ ２６ ８.０ ３３ ３０.０実施例１９Ａ 試薬アルファ−［［（２−ピリジニルオキシ）カルボニ
ル］オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジ
イル）ＳＲＵ２２５によりＰＥＧに接合したＩＬ−１ｒ
ａの調製 ＩＬ−１ｒａをアルファ−［［（２−ピリジニルオキ
シ）カルボニル］オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，
２−エタンジイル）ＳＲＵ２２５で実施例１９に記載す
る手順によりペギル化した。主要なペギル化生成物は３
３ｋＤおよび４８ｋＤの見掛けの分子量を有し、そして
反応混合物からの合計のタンパク質の、それぞれ、ほぼ
４７および３１％を構成した。
【０１７８】反応混合物から精製したＩＬ−１ｒａタン
パク質のＩＬ−１の結合を阻害する能力を実施例６およ
び１２に記載するように決定し、そして表ＸＶに要約す
る。３３ｋＤのペギル化接合体はその結合能力をＩＬ−
１ｒａの６倍以内に保持した。より高い分子量の接合体
は有意な活性を損失した。
【０１７９】
【表１９】表ＸＶ：実施例１８ａに記載する試薬でペギル化したＩＬ−１ｒａタンパク質に よる［125Ｉ］ＩＬ−１の結合の阻害 ＩＬ−１ｒａタンパク質の 見掛けの分子量（ｋＤ） ＩＣ50（ng／ml) １９ （未変性） １.５ ３３ ９.０ ４８ ４０.０ ＰＥＧ−ＩＬ−１ｒａの薬力学的プロフィルを実施例６
Ａに記載するように決定した。データを表Ｄ５に要約す
る。ＰＥＧ−ＩＬ−１ｒａは未変性のＩＬ−１ｒａと比
較して延長した時間の間血清試料中で検出することがで
き、延長した血清半減期を実証した。ＰＥＧ−ＩＬ−１
ｒａの薬力学的プロフィルは実施例６に記載するように
決定したが、ただし０．０５μｇのｒＩＬ−１アルファ
を投与した。ＩＬ−１単独に対する応答は９２０３単位
／ｍｌのＩＬ−６であった。延長した阻害作用は、未変
性のＩＬ−１ｒａと比較して、ＰＥＧ−ＩＬ−１ｒａの
投与後７２時間までにおいて見ることができ、改良され
た薬力学的性質を実証した。総合的に、これらのデータ
が例示するように、ペギル化タンパク質は試験管内の活
性を減少した場合でさえ、それは生体内薬力学的性質を
改良した。
【０１８０】
【表２０】表Ｄ５．実施例１８ａに記載する試薬を使用して接合したＩＬ−１ｒａの薬力学 的プロフィル 血清ＩＬ−６（単位／ｍｌ） 投与後の時間（時間） １９ｋＤ ３３ｋＤ １ ５８０ ２ ７５ １００ ３ ３０ ４ ３０ ６０ ６ ８ ８ １２ １０ １７ ２４ １０
【０１８１】
【表２１】表Ｄ６．実施例１８に記載する試薬を使用して接合したＩＬ−１ｒａの薬力学的 プロフィル ＩＬ−６（単位／ｍｌ） ＩＬ−１投与前の時間（時間） １９ｋＤ ２６ｋＤ 0 521 454 6 2334 416 24 13486 2552 48 16577 4667 72 12800 5148実施例２０ 試薬アルファ−［［（２−ピリジニルオキシ）カルボニ
ル］オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジ
イル）ＳＲＵ１１１．７によりＰＥＧに接合したＩＦＮ
−アルファの調製 試薬アルファ−［［（２−ピリジニルオキシ）カルボニ
ル］オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジ
イル）ＳＲＵ１１１．７を、２００μｌの緩衝液（０．
１モルのホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．０）中の１ｍｇの
ＩＬ−１ｒａに、１０モルの試薬／１モルのＩＬ−１ｒ
ａのモル比で添加した。この溶液をよく混合し、そして
ペギル化反応を室温において６０分間進行させた。次い
でＰＥＧ変性ＩＬ−１ｒａを実施例８に記載する手順に
従い精製した。タンパク質の３６％を誘導化し、そして
生成物は２８ｋＤの見掛けの分子量を有した。
【０１８２】反応混合物からの精製したＩＦＮタンパク
質の比活性を実施例８に記載するように決定し、そして
値を表ＸＶＩに要約する。変性したＩＦＮを試験管内の
生物学的活性の５〜６倍の減少を有した。
【０１８３】
【表２２】表ＸＶＩ：実施例１８に記載する試薬を使用してＰＥＧに接合した生物学的活性 ＩＦＮ−アルファのタンパク質の 見掛けの分子量（ｋＤ） 比活性（単位／ｍｇ） １５ （未変性） １.８８×１０8 ２８ ８.０×１０7 実施例２０Ａ 試薬アルファ−［［（２−ピリジニルオキシ）カルボニ
ル］オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジ
イル）ＳＲＵ１１１．７によりＰＥＧに接合したｒＩＬ
−２の調製 試薬アルファ−［［（２−ピリジニルオキシ）カルボニ
ル］オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジ
イル）ＳＲＵ１１１．７（実施例１８に前に記載した）
を、２００μｌの緩衝液（０．１モルのホウ酸ナトリウ
ム、ｐＨ９．０）中の１ｍｇのＩＬ−１ｒａに、５モル
の試薬／１モルのＩＬ−１ｒａのモル比で添加した。こ
の溶液をよく混合し、そしてペギル化反応を室温におい
て６０分間進行させた。
【０１８４】６０分の反応混合物から１５ｋＤ（未変
性）および２５ｋＤの見掛けの分子量をもつ主要な分子
量の種が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定された。２５ｋ
Ｄのペギル化タンパク質は合計のタンパク質の６０％を
構成した。
【０１８５】実施例２１ 試薬アルファ−［［（２−ピリジニルオキシ）カルボニ
ル］オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジ
イル）ＳＲＵ１１１．７によりＰＥＧに接合したＩＦＮ
−アルファの調製 ＩＦＮ−アルファを実施例１８に記載する試薬と実施例
９ジ手順に従いペギル化した。
【０１８６】実施例８に記載する方法により決定した出
発未変性ＩＦＮ−アルファの比活性は１．０×１０8Ｕ
／ｍｇであり、そしてＰＥＧに接合したＩＦＮ−アルフ
ァの比活性は０．４×１０8Ｕ／ｍｇであり、生物学的
活性の有意の損失がないことを実証した。
【０１８７】実施例２２ 試薬アルファ−［［（２−ピリジニルオキシ）カルボニ
ル］オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジ
イル）ＳＲＵ２２５によりＰＥＧに接合したＩＦＮ−ア
ルファの調製 ＰＥＧをＩＦＮ−アルファに実施例１８ａに記載する試
薬を使用して実施例９の手順に従い接合した。実施例８
に記載する方法により決定したＰＥＧに接合したＩＦＮ
−アルファの比活性は０．３×１０8Ｕ／ｍｇであっ
た。
【０１８８】実施例２３ アルファ−［２−（イソシアナト）エチル］−オメガ−
メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ
１１１．７の調製 １００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中の２ｇのアルファ−（２−ア
ミノエチル）−オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２
−エタンジイル）ＳＲＵ１１１．７に、９４．２ｍｇの
ジ−２−ピリジルチオノカーボネートを添加した。この
溶液を１８時間撹拌し、次いで少量の冷水で抽出した。
ＣＨ2Ｃｌ2の大部分を減圧下に除去し、そしてエーテル
を添加して沈澱を引き起こした。生成物を濾過し、そし
て高真空下に乾燥すると、アルファ−［２−（イソシア
ナト）エチル］−オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，
２−エタンジイル）ＳＲＵ１１１．７が得られた。
【０１８９】分析：Ｃ4Ｈ7ＮＯＳ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）
111.7についての計算値：Ｃ，５３.８８；Ｈ，９.０
７；Ｎ，０.２８；Ｓ，０.６４。
【０１９０】実測値：Ｃ，５４.４５；Ｈ，８.９３；
Ｎ，０.２８；Ｓ，０.５３。
【０１９１】実施例２４ 試薬アルファ−［２−（イソシアナト）エチル］−オメ
ガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）Ｓ
ＲＵ１１１．７によりＰＥＧに接合したＩＦＮ−アルフ
ァの調製 試薬アルファ−［２−（イソシアナト）エチル］−オメ
ガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）Ｓ
ＲＵ１１１．７（実施例２３に前述した）を、２００μ
ｌの緩衝液（０．１モルのホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．
０）中の１０ｍｇのＩＦＮ−アルファに、１０モルの試
薬／１モルのＩＦＮ−アルファのモル比で添加した。こ
の溶液をよく混合し、そしてペギル化反応を室温におい
て６０分間進行させた。生成物の３０％が誘導化され、
そして２６ｋＤの見掛けの分子量を有した。
【０１９２】実施例２５ 試薬アルファ−［２−（イソシアナト）エチル］−オメ
ガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）Ｓ
ＲＵ１１１．７によりＰＥＧに接合したｒＩＬ−２の調
製 試薬アルファ−［２−（イソシアナト）エチル］−オメ
ガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）Ｓ
ＲＵ１１１．７（実施例２３に前述した）を、１００μ
ｌの緩衝液（０．１モルのホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．
０）中の１．０ｍｇの組み換えＩＬ−２（ｒＩＬ−２）
に、１０モルの試薬／１モルのｒＩＬ−２のモル比で添
加した。この溶液をよく混合し、そしてペギル化反応を
室温において６０分間進行させた。次いで精製したｒＩ
Ｌ−２が実施例３に記載する手順により得られた。誘導
化の結果を表ＸＶＩＩに要約する。
【０１９３】
【表２３】表ＸＶＩＩ．実施例２３に記載する試薬を使用するｒＩＬ−２の変性 ｒＩＬ−２タンパク質の 反応からの合計の 見掛けの分子量（ｋＤ） タンパク質の％ １５ （未変性） ７０ ２６ ２０ ３０ １０実施例２６ 試薬アルファ−［２−（イソシアナト）エチル］−オメ
ガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）Ｓ
ＲＵ１１１．７によりＰＥＧに接合したＩＬ−１ｒａの
調製 ＩＬ−１ｒａをアルファ−［２−（イソシアナト）エチ
ル］−オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタン
ジイル）ＳＲＵ１１１．７で実施例６に記載する手順に
従いペギル化した。主要なペギル化生成物は２６、３
１、３８および４８ｋＤの分子量を有し、そして合計の
タンパク質の、それぞれ、ほぼ１７、４４、１５および
１０％を構成した。
【０１９４】６０分の反応混合物から精製した２６ｋＤ
のＩＬ−１ｒａタンパク質のＩＬ−１の結合を阻害する
能力を実施例６に記載する方法により決定し、そして表
ＸＶＩＩＩに要約する。ペギル化タンパク質はその活性
をＩＬ−１ｒａの２〜３倍以内に保持した。
【０１９５】
【表２４】表ＸＶＩＩＩ：実施例２３に記載する試薬でペギル化したＩＬ−１ｒａタンパク 質による［125Ｉ］ＩＬ−１の結合の阻害 ＩＬ−１ｒａタンパク質の 見掛けの分子量（ｋＤ） ＩＣ50（ng／ml) １９ ２.０ ２６ ５.０実施例２７ 試薬アルファ−［２−（イソシアナト）エチル］−オメ
ガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）Ｓ
ＲＵ１１１．７によりＰＥＧに接合したｒＩＬ−１アル
ファの調製 組み換えＩＬ−１アルファをアルファ−［２−（イソシ
アナト）エチル］−ＳＲＵ１１１．７を実施例４に記載
するようにペギル化した。６０分の反応混合物からの、
２６および３８ｋＤの見掛けの分子量をもつ２つの主要
な分子量のペギル化種がＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定さ
れた。これらの２つのペギル化タンパク質は合計のタン
パク質の、それぞれ、４６および４８％を構成した。実
施例４に記載するように、ペギル化ｒＩＬ−１アルファ
を反応混合物から精製し、そして特性決定した。
【０１９６】プールした精製分画の生物学的活性を実施
例７に記載するようにＤ１０細胞の増殖アッセイにおい
て評価し、そして結果を表ＸＩＸに要約する。表の中に
混合物として記載した試料は、１より多いタンパク質種
を含有し、それ以上精製しなかった。２６ｋＤのペギル
化タンパク質はＩＬ−１と本質的に区別することができ
ない比活性を有した。
【０１９７】
【表２５】表ＸＩＸ：実施例２３に記載する試薬を使用してＰＥＧに接合したｒＩＬ−１ア ルファの生物学的活性 ｒＩＬ−１アルファタンパク質の 見掛けの分子量（ｋＤ） 比活性（単位／ｍｇ） １７ １.１×１０8 ２６ １.７×１０8 ２６，３８（混合物） ２.０×１０8 ＞３８（混合物） ６.０×１０6 実施例２８ アルファ−［［（２−ピリジニルオキシ）チオカルボニ
ル］−オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタン
ジイル）ＳＲＵ２２５の調製 ３０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中の１ｇ（０．１ミリモル）のＭ
ＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）分子量１
０，０００の溶液から、１０ｍｌの溶媒を蒸留した。生
ずる溶液を冷却し、そして６９．７ｍｇ（０．３ミリモ
ル）のジ−２−ピリジルチオノカーボネートおよび２ｍ
ｇのＤＭＡＰを添加した。次いでこの混合物をアルゴン
雰囲気下に１８時間撹拌した。溶媒を真空下に除去し、
そして残留物を最小量のＣＨ2Ｃｌ2の中に再溶解した。
次いでエーテルを添加し、そして生ずる沈澱を濾過し、
そしてエーテルで洗浄した。次いで生成物を５ｍｌの加
温グリム中に溶解し、そして生ずる溶液を一夜放置し
た。次いで生ずる沈澱を濾過し、そして２×５ｍｌのグ
リムおよび５ｍｌのジエチルエーテルで洗浄した。次い
で生成物を真空炉内でＮ2の遅い流れ下に乾燥すると、
０．９ｇのアルファ−［［（２−ピリジニルオキシ）チ
オカルボニル］−オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，
２−エタンジイル）ＳＲＵ２２５が得られた。
【０１９８】分析：Ｃ9Ｈ11ＮＯ3Ｓ（ＣＨ3ＣＨ2Ｏ）
225.3についての計算値：Ｃ，５４.４６；Ｈ，９.０
４。
【０１９９】実測値：Ｃ，５４.６７；Ｈ，９.３０。
【０２００】実施例２９ 試薬アルファ−［（２−ピリジニルオキシ）チオカルボ
ニル］−オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタ
ンジイル）ＳＲＵ２２５によりＰＥＧに接合したＩＬ−
１ｒａの調製 アルファ−［（２−ピリジニルオキシ）チオカルボニ
ル］−オメガ−メトキシポリ（オキシ−１，２−エタン
ジイル）ＳＲＵ２２５（実施例２８に記載するように調
製した）を、１．０ｍｌの緩衝液（０．１モルのホウ酸
ナトリウム、ｐＨ９．０）中の２．０ｍｇのＩＬ−１ｒ
ａに、２モルの試薬／１モルのＩＬ−１ｒａのモル比で
添加した。この溶液をよく混合し、そしてペギル化反応
を室温において６０分間進行させた。次いでＰＥＧ変性
したＩＬ−１ｒａを実施例６に記載する手順に従い精製
した。
【０２０１】主要なペギル化生成物は３３ｋＤの見掛け
の分子量を有し、そして６０分の反応混合物からの合計
のタンパク質のほぼ１７％を構成した。反応混合物から
精製したＩＬ−１ｒａタンパク質のＩＬ−１の結合を阻
害する能力を実施例６に記載するように決定し、そして
表ＸＸに要約する。３３ｋＤのタンパク質の結合能力は
ＩＬ−１ｒａの３〜４倍以内であった。
【０２０２】
【表２６】表ＸＸ：実施例２８に記載する試薬でペギル化したＩＬ−１ｒａタンパク質によ る［125Ｉ］ＩＬ−１の結合の阻害 ＩＬ−１ｒａタンパク質の 見掛けの分子量（ｋＤ） ＩＣ50（ng／ml) １９ （未変性） １.４ ３３ ５.０実施例３０ カーボノチオン酸ｏ，ｏ−ジ−（６−メチル−２−ピリ
ジニル）エステル ２５０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中の１０ｇ（０．０９モル）の
６−メチル−２−ヒドロキシピリジンの溶液に、１２．
７ｍｌのトリエチルアミンを添加した。この溶液を０℃
に冷却し、そしてアルゴン雰囲気下にＣＣＬ4（８５
％）中のチオホスゲンの４．１ｍｌ（０．０４６モル）
の溶液を滴々添加した。次いでこの混合物を室温におい
て５時間撹拌し、濾過し、そしてＣＨ2Ｃｌ2溶液を１０
０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3溶液で２回洗浄した。有機層
を乾燥し、そして溶媒を減圧下に除去した。ヘキサン
（１００ｍｌ）を残留物に添加し、そして生ずる混合物
を一夜消化した。生ずる沈澱を濾過し、ヘキサンで洗浄
し、そして真空炉内でＮ2の遅い流れ下に乾燥すると、
５．７ｇのカーボノチオン酸ｏ，ｏ−ジ−（６−メチル
−２−ピリジニル）エステルが得られた、融点１５５−
１５６℃。
【０２０３】分析：Ｃ13Ｈ12Ｎ2Ｏ2Ｓについての計算
値：Ｃ，５９.９８；Ｈ，４.６５；Ｎ，１０.７６；
Ｓ，１２.３２。
【０２０４】実測値：Ｃ，５９.６５；Ｈ，４.５９；
Ｎ，１０.７５；Ｓ，１２.０６。
【０２０５】実施例３１ アルファ−メチル−オメガ−［２−［［（６−メチル−
２−ピリジニルオキシ）チオカルボニル］アミノ］エト
キシ］ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ２
２５ １５ｍｌの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中に溶解した１ｇのアルファ
−メチル−オメガ−（２−アミノエチル）ポリ（オキシ
−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ２２５（実施例１ｃに
おけるように調製した）および５２．７ｍｇのカーボノ
チオン酸ｏ，ｏ−ジ−（６−メチル−２−ピリジニル）
エステル（実施例３０）の溶液を室温において一夜撹拌
した。溶媒を減圧下に除去し、そして残留物をジエチル
エーテルで粉砕した。沈澱を濾過し、そしてエーテルで
洗浄した。次いで生成物を５ｍｌの加温グリム中に溶解
し、そして０．７５ミクロンのミリポア（Ｍｉｌｌｉｐ
ｏｒｅ）フィルターを通して濾過した。次いでこの溶液
を室温において４８時間放置し、そして生ずる沈澱を濾
過した。次いで生成物を真空炉内でＮ2の雰囲気下に１
８時間乾燥すると、０．９ｇのアルファ−メチル−オメ
ガ−［２−［［（６−メチル−２−ピリジニルオキシ）
チオカルボニル］アミノ］エトキシ］ポリ（オキシ−
１，２−エタンジイル）ＳＲＵ２２５が得られた。
【０２０６】分析：Ｃ10Ｈ14Ｎ2Ｏ2Ｓ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）
225についての計算値：Ｃ，５４.５０；Ｈ，９.０９；
Ｎ，０.２７；Ｓ，０.３２。
【０２０７】実測値：Ｃ，５４.３８；Ｈ，９.２０；
Ｎ，０.２１；Ｓ，０.３７。
【０２０８】実施例３２ アルファ−メチル−オメガ−［２−［［（６−メチル−
２−ピリジニルオキシ）チオカルボニル］アミノ］エト
キシ］ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ２
２５によりＰＥＧに接合したｒＩＬ−１ｒａの調製 実施例３１に前述したように調製した試薬を、１．０ｍ
ｌの０．１モルのホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．０中の
５．０ｍｇの精製したｒＩＬ−１アルファに２．０モル
の試薬／１モルのｒＩＬ−１ｒａのモル比で添加した。
この溶液をよく混合し、そして反応混合物を室温におい
て６０分間進行させた。
【０２０９】ｒＩＬ−１ｒａを実施例６に記載する手順
を使用して評価した。表ＸＸＩは反応混合物からの主要
な分子量の種の変性の百分率を示す。
【０２１０】
【表２７】表ＸＸＩ．実施例３１に記載する試薬を使用するｒＩＬ−１ｒａの変性 ｒＩＬ−１ｒａタンパク質の 反応からの合計の 見掛けの分子量（ｋＤ） タンパク質の％ １９（未変性） ３０.０ ３５ ６５.０ ４８ ５.０ 反応混合物からのｒＩＬ−１ｒａ生成物を実施例６に記
載する方法を使用して精製した。
【０２１１】反応混合物から精製した分画を、実施例６
に前述したｒＩＬ−１ラジオレセプタ競争結合アッセイ
においてアッセイした。これらの結果が示すように、３
５ｋＤのタンパク質はＩＬ−１の結合の阻害について未
変性ＩＬ−１ｒａより６倍活性が低いが、４８ｋＤのタ
ンパク質は２０倍活性が低い。
【０２１２】
【表２８】表ＸＸＩＩ：実施例３１に記載する試薬で接合したＩＬ−１ｒａによる［125Ｉ ］ＩＬ−１の結合の阻害 ＩＬ−１ｒａタンパク質の 見掛けの分子量（ｋＤ） ＩＣ50（ng／ml) １９（未変性） １.５ ３５ ９.０ ４８ ３０.０実施例３３ アルファ−［２−［［（２−ピリジニルオキシ）カルボ
ニル］アミノ］エチル］−オメガ−［２−［［（２−ピ
リジニルオキシ）カルボニル］アミノ］−エトキシポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル） Ａ．アルファ−（２−クロロエチル）−オメガ−（２−
クロロエトキシ）−ポリ（オキシ−１，２−エタンジイ
ル）ＳＲＵ１８０の調製 ７５０ｍｌのトルエン中の８０ｇのＭＰＥＧ（メトキシ
ポリエチレングリコール分子量８０００）のスラリーか
ら、２００ｍｌの溶媒を蒸留した。この還流する溶液
に、１．７ｍｌの乾燥ピリジンおよび４．７ｍｌの塩化
チオニルを滴々添加した。１２時間還流した後、反応を
一夜撹拌した。次いで塩化メチレン（５０ｍｌ）を添加
し、そして生ずる溶液を６０ｇの塩基性アルミナ（Ｗｏ
ｌｅｍ Ｓｕｐｅｒ １）を通して濾過した。次いでカ
ラムを５００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2で溶離し、有機層を一緒
にし、そして溶媒を減圧下に除去した。次いで残留物を
３００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中に溶解し、そしてエーテルを
ゆっくり添加し、その間溶媒を水蒸気浴上で除去した。
この手順を曇った懸濁液が発生するまで続けた。次いで
生ずる混合物を室温において数時間撹拌し、そして７３
ｇのアルファ−（２−クロロエチル）−オメガ−（２−
クロロエトキシ）−ポリ（オキシ−１，２−エタンジイ
ル）ＳＲＵ１８０が得られた。
【０２１３】分析：Ｃ2Ｈ4Ｃｌ2（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）180に
ついての計算値：Ｃ，５４.１６；Ｈ，９.０９；Ｃｌ，
０.８８。
【０２１４】 実測値：Ｃ，５３.４０；Ｈ，８.８１；Ｃｌ，０.９
３。
【０２１５】Ｂ．アルファ−（２−アジドエチル）−オ
メガ−（２−アジドエトキシ）−ポリ（オキシ−１，２
−エタンジイル）ＳＲＵ１８０の調製 ７２ｇのアルファ−（２−クロロエチル）−オメガ−
（２−クロロエトキシ）ポリ（オキシ−１，２−エタン
ジイル）ＳＲＵ１８０、２５ｇのアジ化ナトリウムおよ
び７００ｍｌの乾燥ＤＭＦの混合物を撹拌し、そして１
２５℃に１２時間加熱した。次いで溶媒を高真空下に除
去し、そして残留物を１リットルのＣＨ2Ｃｌ2中に溶解
し、そしてセライト（Ｃｅｌｉｔｅ）を通して濾過し
た。次いでＣＨ2Ｃｌ2を水蒸気浴上で除去し、その間ジ
エチルエーテルを添加して沈澱を形成させた。この混合
物を一夜撹拌し、次いで濾過した。次いで沈澱を最小量
のグリム中に５０℃において溶解し、ゆっくり冷却し、
そして濾過した。次いで生成物を真空炉内でＮ2の流れ
下に乾燥すると、６９ｇのアルファ−（２−アジドエチ
ル）−オメガ−（２−アジドエトキシ）−ポリ（オキシ
−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ１８０が得られた。
【０２１６】分析：Ｃ2Ｈ4Ｎ6（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）180につ
いての計算値：Ｃ，５４.０７；Ｈ，９.０８；Ｎ，１.
０４４。
【０２１７】 実測値：Ｃ，５３.７６；Ｈ，９.２８；Ｎ，０.９６。
【０２１８】Ｃ．アルファ−（２−アミノエチル）−オ
メガ−（２−アミノエトキシ）ポリ（オキシ−１，２−
エタンジイル）ＳＲＵ１８０の調製 ２００ｍｌの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中に溶解した６９ｇのアル
ファ−（２−アジドエチル）−オメガ−（２−アジドエ
トキシ）ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）および
６．７ｇの（２５．６ミリモル）のトリフェニルホスフ
ィンの溶液を、アルゴン雰囲気下に一夜撹拌した。水
（２ｍｌ）を添加し、そしてこの混合物をさらに１２時
間撹拌した。塩化メチレンの大部分を真空下に除去し、
そして４００ｍｌのジエチルエーテルを添加した。沈澱
を濾過し、エーテルで洗浄し、そして３００ｍｌの加温
（５０℃）グリム中に溶解した。この溶液を室温におい
て一夜放置し、そして生ずる沈澱を濾過し、２×１００
ｍｌのグリム、２×１００ｍｌのジエチルエーテルで洗
浄し、そして真空炉内でＮ2の流れ下に乾燥すると、６
６ｇのアルファ−（２−アミノエチル）−オメガ−（２
−アミノエトキシ）ポリ（オキシ−１，２−エタンジイ
ル）ＳＲＵ１８０が得られた。
【０２１９】分析：Ｃ2Ｈ8Ｎ2（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）180につ
いての計算値：Ｃ，５４.４２；Ｈ，９.１８；Ｎ，０.
３５。
【０２２０】 実測値：Ｃ，５３.８５；Ｈ，９.２０；Ｎ，０.４３。
【０２２１】Ｄ．アルファ−［２−［［（２−ピリジニ
ルオキシ）カルボニル］アミノ］エチル］−オメガ−
［２−［［（２−ピリジニルオキシ）カルボニル］アミ
ノ］−エトキシ］ポリ（オキシ−１，２−エタンジイ
ル）ＳＲＵ１８０ ４０ｍｌの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中に溶解した１ｇのアルファ
−（２−アミノエチル）−オメガ−（２−アミノエトキ
シ）ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ１８
０の溶液から、１５ｍｌの溶媒を除去した。この溶液を
０℃に冷却し、そして８５ｍｇ（６．３９ミリモル）の
ジ−２−ピリジルカーボネートを添加した。次いでこの
混合物を０℃において４時間撹拌し、そして溶媒を真空
下に除去した。残留物をジエチルエーテルで粉砕し、そ
して生成物をｆｌい、そしてエーテル（２×７５ｍｌ）
で洗浄した。生成物を真空下に乾燥し、そして８ｍｌの
乾燥グリム（５０℃）中に溶解した。次いでこの溶液を
冷却し、そして室温において１２時間放置した。沈澱し
た存在を濾過し、２×５ｍｌのグリムで洗浄し、そして
真空炉内でＮ2の流れ下に乾燥すると、１ｇのアルファ
−［２−［［（２−ピリジニルオキシ）カルボニル］ア
ミノ］エチル］−オメガ−［２−［［（２−ピリジニル
オキシ）カルボニル］アミノ］ポリ（オキシ−１，２−
エタンジイル）ＳＲＵ１８０が得られた。
【０２２２】分析：Ｃ14Ｈ14Ｎ4Ｏ4（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）
180についての計算値：Ｃ，５４.５７；Ｈ，８.９９；
Ｎ，０.６８。
【０２２３】 実測値：Ｃ，５４.３２；Ｈ，８.７９；Ｎ，０.７７。
【０２２４】実施例３４ アルファ−［２−［［（２−ピリジニルオキシ）カルボ
ニル］アミノ］エチル］−オメガ−［２−［［（２−ピ
リジニルオキシ）カルボニル］アミノ］−エトキシ］ポ
リ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ４５２ Ａ．アルファ−（２−クロロエチル）−オメガ−（２−
クロロエトキシ）−ポリ（オキシ−１，２−エタンジイ
ル）ＳＲＵ４５２の調製 実施例３３Ａに記載する手順により、ポリエチレングリ
コール分子量２０，０００をアルファ−（２−クロロエ
チル）−オメガ−（２−クロロエトキシ）−ポリ（オキ
シ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ４５２に転化した。
【０２２５】分析：Ｃ2Ｈ4Ｃｌ2（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）452に
ついての計算値：Ｃ，５４.３８；Ｈ，９.１３；Ｃｌ，
０.３５。
【０２２６】 実測値：Ｃ，５４.３６；Ｈ，９.２３；Ｃｌ，０.４
０。
【０２２７】Ｂ．アルファ−（２−アジドエチル）−オ
メガ−（２−アジドエトキシ）−ポリ（オキシ−１，２
−エタンジイル）ＳＲＵ４５２の調製 実施例３３Ｂに記載する手順により、アルファ−（２−
クロロエチル）−オメガ−（２−クロロエトキシ）−ポ
リ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ４５２をア
ルファ−（２−アジドエチル）−オメガ−（２−アジド
エトキシ）−ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）Ｓ
ＲＵ４５２に転化した。
【０２２８】分析：Ｃ2Ｈ4Ｎ6（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）452につ
いての計算値：Ｃ，５４.３５；Ｈ，９.１２；Ｎ，０.
４２。
【０２２９】 実測値：Ｃ，５４.３８；Ｈ，９.３０；Ｎ，０.４７。
【０２３０】Ｃ．アルファ−（２−アミノエチル）−オ
メガ−（２−アミノエトキシ）−ポリ（オキシ−１，２
−エタンジイル）ＳＲＵ４５２の調製 実施例３３Ｃに記載する手順により、アルファ−（２−
アジドエチル）−オメガ−（２−アジドエトキシ）−ポ
リ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ４５２をア
ルファ−（２−アミノエチル）−オメガ−（２−アミノ
エトキシ）−ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）Ｓ
ＲＵ４５２に転化した。
【０２３１】分析：Ｃ2Ｈ8Ｎ2（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）452につ
いての計算値：Ｃ，５４.４９；Ｈ，９.１７；Ｎ，０.
１４。
【０２３２】 実測値：Ｃ，５４.４４；Ｈ，９.１９；Ｎ，０.１５。
【０２３３】Ｄ．アルファ−［２−［［（２−ピリジニ
ルオキシ）カルボニル］アミノ］エチル］−オメガ−
［２−［［（２−ピリジニルオキシ）カルボニル］アミ
ノ］エトキシ］ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）
ＳＲＵ４５２ 実施例３３Ｄにに記載する手順により、アルファ−（２
−アミノエチル）−オメガ−（２−アミノエトキシ）ポ
リ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ４５２をア
ルファ−［２−［［（２−ピリジニルオキシ）カルボニ
ル］アミノ］エチル］−オメガ−［２−［［（２−ピリ
ジニルオキシ）カルボニル］アミノ］エトキシ］ポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ４５２に転化
した。
【０２３４】分析：Ｃ14Ｈ14Ｎ4Ｏ4（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）
452についての計算値：Ｃ，５４.５６；Ｈ，９.０８；
Ｎ，０.２８。
【０２３５】 実測値：Ｃ，５４.３３；Ｈ，９.１３；Ｎ，０.３３。
【０２３６】実施例３５ アルファ−［２−［［（２−ピリジニルオキシ）カルボ
ニル］アミノ］エチル］−オメガ−［２−［［（２−ピ
リジニルオキシ）カルボニル］アミノ］エトキシ］ポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ４５２により
ＰＥＧに接合したｒＩＬ−１ｒａの調製 実施例３４に前述したように調製した試薬を、１．０ｍ
ｌの０．１モルのホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．０、の中
の５．０ｍｇの精製したＩＬ−１ｒａに、１．０モルの
試薬／４．０モルのｒＩＬ−１ｒａのモル比で添加し
た。この溶液を室温において６０分間よく撹拌した。
【０２３７】ｒＩＬ−１ｒａ生成物を実施例６に前述し
た方法により評価した。表ＸＸＩＩＩは、反応混合物か
らの主要な分子量の種の百分率を示す。
【０２３８】
【表２９】表ＸＸＩＩＩ．実施例３３に記載する試薬を使用するｒＩＬ−１ｒａの変性 ｒＩＬ−１ｒａタンパク質の 反応からの合計の 見掛けの分子量（ｋＤ） タンパク質の％ １９（未変性） ５０.０ ５５ ３５.０ ７５ １５.０実施例３６ ビス−（３−メチル−２−ピリジル）カーボネート ２０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中に溶解した４．６ｇ（４２ミリ
モル）の３−メチル−２−ヒドロキシピリジンおよび６
ｍｌのトリエチルアミンの溶液を、０℃において、トル
エン中の５０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2および１１ｍｌのホスゲ
ンの溶液（１．９３モル）に添加した。この混合物を０
℃において２時間撹拌し、次いで室温において２時間撹
拌した。次いで反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液
で、次いで飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、次いで硫
酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下に除去し、そし
て残留物を酢酸エチル／ヘキサンから結晶化すると、３
ｇのビス−（３−メチル−２−ピリジル）カーボネート
が得られた、融点１１０−１１２℃。
【０２３９】分析：Ｃ13Ｈ12Ｎ2Ｏ3についての計算値：
Ｃ，６３.９３；Ｈ，４.９５；Ｎ，１１.４７。
【０２４０】 実測値：Ｃ，６３.７８；Ｈ，４.８６；Ｎ，１１.２
３。
【０２４１】実施例３７ アルファ−メチル−オメガ−［２−［［（３−メチル−
２−ピリジニルオキシ）カルボニル］アミノ］エトキ
シ］ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ２２
５ ２５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中に溶解したアルファ−メチル−
オメガ−（２−アミノエチル）ポリ（オキシ−１，２−
エタンジイル）ＳＲＵ２２５の溶液から、１０ｍｌの溶
媒を蒸留した。次いでこの溶液に、４９．２ｍｇ（０．
２ミリモル）のビス−（３−メチル−２−ピリジル）カ
ーボネートを添加し、そして生ずる混合物をアルゴン雰
囲気下に一夜撹拌した。次いで溶媒を減圧下に除去し、
そして８０ｍｌのジエチルエーテルを残留物に添加し
た。固体を濾過し、エーテルで洗浄し、次いで１０ｍｌ
のＣＨ2Ｃｌ2中に溶解した。次いでエーテルをゆっくり
添加し、その間溶液が濁るようになるまで溶媒を沸騰除
去した。次いでこの混合物を室温において１８時間撹拌
し、そして生ずる沈澱を濾過した。次いで固体を８ｍｌ
の加温グリム中に溶解し、そして室温においてさらに１
８時間放置した。次いで生成物を濾過し、そして真空炉
内で窒素雰囲気下に乾燥すると、０．６ｇのアルファ−
メチル−オメガ−［２−［［（３−メチル−２−ピリジ
ニルオキシ）カルボニル］アミノ］エトキシ］ポリ（オ
キシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ２２５が得られ
た。
【０２４２】分析：Ｃ10Ｈ14Ｎ2Ｏ3（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）
225についての計算値：Ｃ，５４.５９；Ｈ，９.０９；
Ｎ，０.２８。
【０２４３】 実測値：Ｃ，５５.６４；Ｈ，９.１４；Ｎ，０.２２。
【０２４４】実施例３８ 試薬アルファ−メチル−オメガ−［２−［［（３−メチ
ル−２−ピリジニルオキシ）カルボニル］アミノ］エト
キシ］ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）ＳＲＵ２
２５によりＰＥＧに接合したｒＩＬ−１ｒａの調製 実施例３７に前述したように調製した試薬を、１．０ｍ
ｌの０．１モルのホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．０、の中
の５．０ｍｇの精製したＩＬ−１ｒａに、２．０モルの
試薬／１モルのｒＩＬ−１ｒａのモル比で添加した。こ
の溶液を室温において６０分間よく撹拌した。
【０２４５】ｒＩＬ−１ｒａ生成物を実施例６に前述し
た方法により評価した。表ＸＸＩＶは、反応混合物から
の主要な分子量の種の百分率を示す。
【０２４６】
【表３０】表ＸＸＩＶ．実施例３３に記載する試薬を使用するｒＩＬ−１ｒａの変性 ｒＩＬ−１ｒａタンパク質の 反応からの合計の 見掛けの分子量（ｋＤ） タンパク質の％ １９（未変性） ４５.０ ３５ ４３.０ ４５ １２.０ 反応混合物からのｒＩＬ−１ｒａ生成物を実施例６に記
載するように精製した。反応混合物から精製した分画
を、実施例６に前述したｒＩＬ−１ラジオレセプタ競争
結合アッセイにおいてアッセイした。結果を表ＸＸＶに
示す。３５ｋＤのタンパク質はＩＬ−１の結合の阻害に
ついて未変性ＩＬ−１ｒａより４倍活性が低い。４５ｋ
Ｄのタンパク質は３０倍活性が低い。
【０２４７】
【表３１】表ＸＸＶ：実施例３５に記載する試薬で接合したＩＬ−１ｒａによる［125Ｉ］ ＩＬ−１の結合の阻害 ＩＬ−１ｒａタンパク質の 見掛けの分子量（ｋＤ） ＩＣ50（ng／ml) １９（未変性） １.０ ３５ ４.０ ４５ ３０.０
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/21 ＡＥＤ Ａ６１Ｋ 37/66 ＡＥＤ (72)発明者 パトリシア・キリアン アメリカ合衆国ニユージヤージイ州 07043アツパーモントクレア・ウオツチ ヤングアベニユー10 (72)発明者 ペリー・ローゼン アメリカ合衆国ニユージヤージイ州 07006ノースコールドウエル・サンセツ トドライブ26 (56)参考文献 特開 平１−71490（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−503759（ＪＰ，Ａ) 国際公開90／7938（ＷＯ，Ａ１) 国際公開91／7190（ＷＯ，Ａ１) 国際公開91／8229（ＷＯ，Ａ１) Ｉｎｔ．Ａｒｃｈｓ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｏｎ．66（４）Ｐ. 439−446（1981)

Claims (27)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式 【化１】 式中、Ｒ1は低級アルキルであり、Ｒ2は−Ｏ−または−
    ＮＨ−であり、Ｒ3は＝Ｎ−Ｒ4、＝Ｓまたは＝Ｏであ
    り、Ｒ4は低級アルキルまたはシクロアルキルであり、
    タンパク質はインターフェロン−アルファ、インターロ
    イキン−１ｒａ、インターロイキン−１またはインター
    ロイキン−２であり、ｍは １〜５の範囲内の数であり、
    そしてｎは１〜１０００である、 で示されるタンパク質の生理学的に活性な接合体。
  2. 【請求項２】 ｍおよびｎが、接合体を形成するポリエ
    チレングリコールの分子量が３００〜３０,０００ダル
    トンとなるように選択される請求項１記載のタンパク質
    接合体。
  3. 【請求項３】 ｍが１または２である請求項１または２
    記載のタンパク質接合体。
  4. 【請求項４】 式 【化２】 式中、Ｒ１、Ｒ４、ｍ、ｎおよびタンパク質は請求項１
    記載の通りである、で示される請求項１〜３のいずれか
    に記載のタンパク質接合体。
  5. 【請求項５】 式 【化３】 式中、Ｒ1 、ｍ、ｎおよびタンパク質は請求項１記載の
    通りである、 で示される請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質
    接合体。
  6. 【請求項６】 式 【化４】 式中、Ｒ1 、ｍ、ｎおよびタンパク質は請求項１記載の
    通りである、 で示される請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質
    接合体。
  7. 【請求項７】 式 【化５】 式中、Ｒ1 、ｍ、ｎおよびタンパク質は請求項１記載の
    通りである、 で示される請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質
    接合体。
  8. 【請求項８】 Ｒ１がＣＨ３である請求項１〜７のいず
    れかに記載のタンパク質接合体。
  9. 【請求項９】 タンパク質がインターロイキン−１であ
    る請求項１〜８のいずれかに記載のタンパク質接合体。
  10. 【請求項１０】 タンパク質がインターロイキン−１ｒ
    ａである請求項１〜８のいずれかに記載のタンパク質接
    合体。
  11. 【請求項１１】 タンパク質がインターフェロン−アル
    ファである請求項１〜８のいずれかに記載のタンパク質
    接合体。
  12. 【請求項１２】 タンパク質がインターロイキン−２で
    ある請求項１〜８のいずれかに記載のタンパク質接合
    体。
  13. 【請求項１３】 式 【化７】 式中、ｎは約１１２である、で示される 請求項１記載のタンパク質接合体。
  14. 【請求項１４】 インターフェロン−アルファがインタ
    ーフェロン−アルファＡである請求項１１記載のタンパ
    ク質接合体。
  15. 【請求項１５】 式 【化６】 であり、 Ｒ1は低級アルキルであり、Ｒ4は低級アルキルまたはシ
    クロアルキルであり、 Ｒ5は低級アルキルまたはＨであり、そしてｎは１〜１
    ０００の整数である、 で示される化合物。
  16. 【請求項１６】 Ｒ４がシクロアルキルである請求項１
    ５記載の化合物。
  17. 【請求項１７】 Ｒ５がＨである請求項１５記載の化合
    物。
  18. 【請求項１８】 Ｒ５がＣ３である請求項１５記載の化
    合物。
  19. 【請求項１９】 Ｒ１がＣＨ３である請求項１５〜１８
    のいずれかに記載の化合物。
  20. 【請求項２０】 式 【化１０】 式中、Ｒ１はＣＨ３であり、そしてｎは１１２である、
    で示される化合物。
  21. 【請求項２１】 病気の処置または予防において治療学
    的に活性な化合物として使用するための請求項１〜１４
    のいずれかに記載のタンパク質接合体。
  22. 【請求項２２】 請求項１５記載の化合物をタンパク質
    の遊離アミノ基またはその塩と反応させ、そしてタンパ
    ク質接合体を反応混合物から単離することを特徴とす
    る、請求項１〜１４のいずれかに記載のタンパク質接合
    体の製造方法。
  23. 【請求項２３】 請求項１〜１４のいずれかに記載のタ
    ンパク質接合体および治療学的に不活性な担体からなる
    製剤学的組成物。
  24. 【請求項２４】 請求項１〜１４のいずれかに記載のタ
    ンパク質接合体および治療学的に不活性な担体からな
    る、免疫変調障害（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ
    ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、例えば、新形成の（ｎｅｏｐ
    ｌａｓｔｉｃ）病気または感染性疾患の処置または予防
    のための製剤学的組成物。
  25. 【請求項２５】 請求項１〜１４のいずれかに記載のタ
    ンパク質接合体を使用する人間以外の動物の病気の処置
    または予防方法。
  26. 【請求項２６】 請求項１〜１４のいずれかに記載のタ
    ンパク質接合体を使用する病気の処置または予防におい
    て使用するための薬物の調製方法。
  27. 【請求項２７】 請求項２２の方法に従い製造された、
    請求項１〜１４のいずれかに記載のタンパク質接合体。
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