JP2609559B2 - 組織系細胞の培養に用いる基質 - Google Patents
組織系細胞の培養に用いる基質Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生体の組織系細胞を体外において培養しよ
うとする際に用いる培養基質に関するものであり、細胞
が外部環境を認識し接着、増殖するという細胞の機能を
生かした新規培養基質に関するものである。
うとする際に用いる培養基質に関するものであり、細胞
が外部環境を認識し接着、増殖するという細胞の機能を
生かした新規培養基質に関するものである。
組織系細胞とは、例えば、肝細胞、腎細胞、筋肉細
胞、皮膚細胞、血管内皮細胞など生体の組織を構成する
細胞をいう。これに対して、血液細胞とは、浮遊状態で
血管、リンハ管内を移行する好中球、単球等をいう。組
織系細胞は、血液系細胞とは異なり一定の部位に定在
し、分化、増殖を行い機能を表す。体外で培養を行う場
合も同様であり、血液系細胞は、培養液（以下培地とい
う）中で浮遊したまま増殖するが、組織系細胞は、接着
する基質がなくては増殖してこない。
胞、皮膚細胞、血管内皮細胞など生体の組織を構成する
細胞をいう。これに対して、血液細胞とは、浮遊状態で
血管、リンハ管内を移行する好中球、単球等をいう。組
織系細胞は、血液系細胞とは異なり一定の部位に定在
し、分化、増殖を行い機能を表す。体外で培養を行う場
合も同様であり、血液系細胞は、培養液（以下培地とい
う）中で浮遊したまま増殖するが、組織系細胞は、接着
する基質がなくては増殖してこない。
培養時に用いる基質としては、通常、ガラス、表面処
理したプラスチック等をそのまままたはコラーゲン、ポ
リリジン、フィブロネクチン等をコートして使われてい
る。これらの基質では、その表面上に均一に細胞が接着
し、増殖してくる。
理したプラスチック等をそのまままたはコラーゲン、ポ
リリジン、フィブロネクチン等をコートして使われてい
る。これらの基質では、その表面上に均一に細胞が接着
し、増殖してくる。
生体内において、細胞群は、特定の配列構造をとって
おり、一定にただ広がっているわけではない。それぞれ
の組織特有の構造体となっている。この構造は、各細胞
のまたは細胞群の機能と密接に結びついている。これま
で用いられてきた培養基質は、基質上に均等に細胞接着
が起こり、生体内で細胞のおかれている状態とは異なる
ものである。細胞を生体外にとり出して培養し、生体内
の場合と同様の働きを表わさせるためには、より生体内
に近い環境を与え一定の形態なり構造体にして培養する
ことが必要である。
おり、一定にただ広がっているわけではない。それぞれ
の組織特有の構造体となっている。この構造は、各細胞
のまたは細胞群の機能と密接に結びついている。これま
で用いられてきた培養基質は、基質上に均等に細胞接着
が起こり、生体内で細胞のおかれている状態とは異なる
ものである。細胞を生体外にとり出して培養し、生体内
の場合と同様の働きを表わさせるためには、より生体内
に近い環境を与え一定の形態なり構造体にして培養する
ことが必要である。
この方法として種々の方法が考えられるが、単なる均
一な表面の培養基質ではなく、細胞の接着特異性の異な
った領域を細胞レベルで形成することにより一定の形態
を示させ得ることが可能と考えられた。また、細胞を培
養する場合の基質は、非毒性であることが必須である。
例えば、培養に用いる培地を調整する際に使う水もイオ
ン交換、逆浸透、マイクロフィルトレーションなどの方
法で不純物を極力除いた純度の高いものが必要である。
つまり、培養基質の場合も同様の考慮が必要である。有
害成分等の溶出はいうまでもなく、細胞毒性のある表面
構造も避けなければならない。
一な表面の培養基質ではなく、細胞の接着特異性の異な
った領域を細胞レベルで形成することにより一定の形態
を示させ得ることが可能と考えられた。また、細胞を培
養する場合の基質は、非毒性であることが必須である。
例えば、培養に用いる培地を調整する際に使う水もイオ
ン交換、逆浸透、マイクロフィルトレーションなどの方
法で不純物を極力除いた純度の高いものが必要である。
つまり、培養基質の場合も同様の考慮が必要である。有
害成分等の溶出はいうまでもなく、細胞毒性のある表面
構造も避けなければならない。
そこで、本発明者は、細胞毒性の非常に少ない天然物
の多糖類を用いることを検討したところ高い有用性を示
すことが判明した。また、前記の細胞特異性の違った領
域の形成にはフオトリソグラフィーの手法を応用するこ
とが可能であるとの知見をした。
の多糖類を用いることを検討したところ高い有用性を示
すことが判明した。また、前記の細胞特異性の違った領
域の形成にはフオトリソグラフィーの手法を応用するこ
とが可能であるとの知見をした。
本発明の組織系細胞の培養に使用する培養基質は、こ
れらの方法をさらに詳細に検討した上、完成に至ったも
のである。
れらの方法をさらに詳細に検討した上、完成に至ったも
のである。
即ち、本発明は、組織系細胞を、従来の単一平面上の
培養に比してより生体内に近い培養を行うことができる
と共に、細胞毒性の非常に少ない新規培養基質を提供す
ることを目的とするものである。
培養に比してより生体内に近い培養を行うことができる
と共に、細胞毒性の非常に少ない新規培養基質を提供す
ることを目的とするものである。
このような目的を達成するための本発明の構成は、以
下の（１）〜（４）の技術的な手段から成るものであ
る。
下の（１）〜（４）の技術的な手段から成るものであ
る。
（１）プラスチック基質に、フオトレジストのパターン
を形成し、アンモニアプラズマ処理を行った後、水溶性
縮合剤とカルボキシル基を含む多糖の混液を反応させ、
最後にフオトレジストを除去することにより製造される
ことを特徴とする組織系細胞の培養基質。
を形成し、アンモニアプラズマ処理を行った後、水溶性
縮合剤とカルボキシル基を含む多糖の混液を反応させ、
最後にフオトレジストを除去することにより製造される
ことを特徴とする組織系細胞の培養基質。
（２）プラスチック基質が、ポリスルホン、ポリエーテ
ルスルホン、ポリメチルペンテンまたはポリエステルで
あることを特徴とする前記（１）項記載の組織系細胞の
培養基質。
ルスルホン、ポリメチルペンテンまたはポリエステルで
あることを特徴とする前記（１）項記載の組織系細胞の
培養基質。
（３）水溶性縮合剤が、１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩またはＮ−シ
クロヘキシル−Ｎ′−（２−モルホリノエチル）カルボ
ジイミド−パラ−トルエンスルホン酸塩であることを特
徴とする前記（１）項記載の組織系細胞の培養基質。
ルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩またはＮ−シ
クロヘキシル−Ｎ′−（２−モルホリノエチル）カルボ
ジイミド−パラ−トルエンスルホン酸塩であることを特
徴とする前記（１）項記載の組織系細胞の培養基質。
（４）カルボキシル基を有する多糖が、ヘパリン、コン
ドロイチン硫酸、コンドロイチン、ヒアルロン酸、アル
ギン酸、カルボキシルメチルキチンであることを特徴と
する前記（１）項記載の組織系細胞の培養基質。
ドロイチン硫酸、コンドロイチン、ヒアルロン酸、アル
ギン酸、カルボキシルメチルキチンであることを特徴と
する前記（１）項記載の組織系細胞の培養基質。
本発明において、使用されるプラスチック基質は、フ
オトレジストをコートしてパターン形成することができ
る材質であればいずれのばのを用いてもよいが、フオト
レジスト液に含まれる溶剤に対する耐溶剤性、レジスト
を乾燥する際に必要とされる熱に対する耐熱性等が必要
である。また、細胞を培養した状態で顕微鏡観察するこ
とができるという観点から透明性の高いものが好まし
い。このようなことから、ポリエーテルスルホン、ポリ
スルホン、ポリメチルペンテン、ポリエステル等が好ま
しい。形状は、フオトレジストをコートする点、細胞を
培養する点から、シート状態、フイルム状態が好まし
い。厚さは、特に限定されるものではないが、取扱い易
さから50〜1000μｍ程度が好適である。
オトレジストをコートしてパターン形成することができ
る材質であればいずれのばのを用いてもよいが、フオト
レジスト液に含まれる溶剤に対する耐溶剤性、レジスト
を乾燥する際に必要とされる熱に対する耐熱性等が必要
である。また、細胞を培養した状態で顕微鏡観察するこ
とができるという観点から透明性の高いものが好まし
い。このようなことから、ポリエーテルスルホン、ポリ
スルホン、ポリメチルペンテン、ポリエステル等が好ま
しい。形状は、フオトレジストをコートする点、細胞を
培養する点から、シート状態、フイルム状態が好まし
い。厚さは、特に限定されるものではないが、取扱い易
さから50〜1000μｍ程度が好適である。
フオトレジストは、半導体素子作製用に使われている
高解像度のものがすべて使用できるが、ポジ型フオトレ
ジストであるノボラック−ジアゾキノン型が使い易く、
かつ各社から多数の品種が上市されている点で好適であ
るが、プラスチック基質の耐溶剤性を考慮してより適切
なものを使用すればよい。
高解像度のものがすべて使用できるが、ポジ型フオトレ
ジストであるノボラック−ジアゾキノン型が使い易く、
かつ各社から多数の品種が上市されている点で好適であ
るが、プラスチック基質の耐溶剤性を考慮してより適切
なものを使用すればよい。
パターンの形状、幅、長さは、特に限定されるもので
はないが、組織系細胞の細胞間相互作用による機能発現
を考慮に入れるならば、単一細胞程度の大きさでは不適
当である。数十〜数百μｍが適当である。
はないが、組織系細胞の細胞間相互作用による機能発現
を考慮に入れるならば、単一細胞程度の大きさでは不適
当である。数十〜数百μｍが適当である。
フオトレジストは、スピンナー法によりコートして、
市販の露光装置を用いて所定のパターンを形成する。非
パターン部を除去ベーキングを行って、フオトレジスト
のパターンを形成する。各条件はレジスト種により異な
るため、それぞれの至適条件で行う。フオトレジストの
パターンを形成したプラスチック基質にアンモニアの低
温プラズマ処理を行いプラスチック基質表面にアミノ基
を導入する。プラズマ処理の条件は、0.01Torr程度に減
圧したチェンバー内にアンモニアガスを導入し、0.05〜
0.5Torrの圧力にして、５〜100Wの電力となるように電
圧を印加し、0.1〜５分処理する。13.56MHzの高周波を
用いることが望ましい。なお、プラズマ処理装置の種
類、電極間距離、チェンバーの大きさ等により特性が異
なるため適切な条件を選んで行えばよい。
市販の露光装置を用いて所定のパターンを形成する。非
パターン部を除去ベーキングを行って、フオトレジスト
のパターンを形成する。各条件はレジスト種により異な
るため、それぞれの至適条件で行う。フオトレジストの
パターンを形成したプラスチック基質にアンモニアの低
温プラズマ処理を行いプラスチック基質表面にアミノ基
を導入する。プラズマ処理の条件は、0.01Torr程度に減
圧したチェンバー内にアンモニアガスを導入し、0.05〜
0.5Torrの圧力にして、５〜100Wの電力となるように電
圧を印加し、0.1〜５分処理する。13.56MHzの高周波を
用いることが望ましい。なお、プラズマ処理装置の種
類、電極間距離、チェンバーの大きさ等により特性が異
なるため適切な条件を選んで行えばよい。
次に、この処理基質を水溶性縮合剤とカルボキシル基
を含む多糖の混液と反応させる。水溶性縮合剤は0.5〜1
0％、カルボキシル基を含む多糖は0.1〜５％が好適であ
る。４℃〜室温の温度で、10〜20時間反応させる。水溶
性縮合剤としては、１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、またはＮ−シク
ロヘキシル−Ｎ′−（２−モルホリノエチル）カルボジ
イミド−パラ−トルエンスルホン酸塩が好適である。カ
ルボキシル基を含む多糖は、天然物、合成物等種々のも
のが知られている。細胞に有害な作用を与えないものが
良いのは当然であるが、不純物を多く含むものや作用が
不明確なものは不適当である。
を含む多糖の混液と反応させる。水溶性縮合剤は0.5〜1
0％、カルボキシル基を含む多糖は0.1〜５％が好適であ
る。４℃〜室温の温度で、10〜20時間反応させる。水溶
性縮合剤としては、１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、またはＮ−シク
ロヘキシル−Ｎ′−（２−モルホリノエチル）カルボジ
イミド−パラ−トルエンスルホン酸塩が好適である。カ
ルボキシル基を含む多糖は、天然物、合成物等種々のも
のが知られている。細胞に有害な作用を与えないものが
良いのは当然であるが、不純物を多く含むものや作用が
不明確なものは不適当である。
また、細胞に対する特異的な接着、非接着の作用を持
たないものも不適である。なぜならば、細胞に対して特
異性の違った領域を作り出すことができないからであ
る。以上の点からカルボキシル基を含む多糖として、ヘ
パリン、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、ヒアル
ロン酸、アルギン酸、カルボキシルメチルキチンが好適
である。反応が終了したら、最後にフオトレジストの除
去を行うために、エタノールまたはメタノール中に上記
基質を浸漬し、超音波洗浄を行う。１〜５回洗浄した
後、純水でリンスする。このようにして調製した基質は
４℃のリン酸塩緩衝液中で安定に保存することができ
る。
たないものも不適である。なぜならば、細胞に対して特
異性の違った領域を作り出すことができないからであ
る。以上の点からカルボキシル基を含む多糖として、ヘ
パリン、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、ヒアル
ロン酸、アルギン酸、カルボキシルメチルキチンが好適
である。反応が終了したら、最後にフオトレジストの除
去を行うために、エタノールまたはメタノール中に上記
基質を浸漬し、超音波洗浄を行う。１〜５回洗浄した
後、純水でリンスする。このようにして調製した基質は
４℃のリン酸塩緩衝液中で安定に保存することができ
る。
実施例１ プラスチック基質として、100μｍ厚さの10cm×10cm
のフイルムを用いた。材質は、ポリエーテルスルホン、
ポリスルホン（いずれも住友ベークライト社製）の２種
を用いた。
のフイルムを用いた。材質は、ポリエーテルスルホン、
ポリスルホン（いずれも住友ベークライト社製）の２種
を用いた。
このプラスチック基質に、ポジ型フオトレジストOFPR
−5000（東京応化工業社製）をスピンナー法により膜厚
1.5μｍにコートした。露光装置NSR−1505G3A（ニコン
社製）を用いて、直径50μｍの円形、パターンをフオト
マスクで露光し形成した。露光時間は、150ms、現像液N
WD−Ｖ（東京応化工業社製）で現像後洗浄、80℃で20分
間乾燥した。この基質をプラズマ装置（サムコ社製PD−
10S）を用いてアンモニアプラズマ処理した。0.01Torr
に減圧後、アンモニアスズを導入し、0.2Torrで50W、２
分処理した。
−5000（東京応化工業社製）をスピンナー法により膜厚
1.5μｍにコートした。露光装置NSR−1505G3A（ニコン
社製）を用いて、直径50μｍの円形、パターンをフオト
マスクで露光し形成した。露光時間は、150ms、現像液N
WD−Ｖ（東京応化工業社製）で現像後洗浄、80℃で20分
間乾燥した。この基質をプラズマ装置（サムコ社製PD−
10S）を用いてアンモニアプラズマ処理した。0.01Torr
に減圧後、アンモニアスズを導入し、0.2Torrで50W、２
分処理した。
次に、この基質を、１−エチル−３−〔３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩10％水溶液とヘ
パリン、ヒアルロン酸、カルボキシメチルチキンの20％
水溶液を、それぞれ混和した水溶液と反応させた。４℃
で18時間反応後、純水で洗浄、そして、エタノール中に
浸漬し、超音波洗浄を１回/2分で、２回行った。純水で
洗浄後に、リン酸塩緩衝液中に保存した。
アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩10％水溶液とヘ
パリン、ヒアルロン酸、カルボキシメチルチキンの20％
水溶液を、それぞれ混和した水溶液と反応させた。４℃
で18時間反応後、純水で洗浄、そして、エタノール中に
浸漬し、超音波洗浄を１回/2分で、２回行った。純水で
洗浄後に、リン酸塩緩衝液中に保存した。
1cm角に上記フイルムを切ったサンプル片を12ウエル
プレートに入れて組織系細胞の培養を行った。細胞は肝
臓の細胞株であるH4TG（ラット由来）を用い、５×105
個/mlの細胞濃度の液を1ml/ウエル加え１週間培養し
た。培地は中性に調製したDMEM（日水製薬社製）にグル
タミン（日水製薬社製）を0.3g/、牛胎児血清10％、
馬血清10％となるように加えたものを使用した。培養２
日目には、いずれの条件で調製した基質でも、形成した
パターンと同じ培養形態をとっていることが観察され
た。さらに７日目には、立体的な細胞集塊が二次元のパ
ターンで形成されていることがみとめられ、生体内に近
い培養環境となっていることが認められた。
プレートに入れて組織系細胞の培養を行った。細胞は肝
臓の細胞株であるH4TG（ラット由来）を用い、５×105
個/mlの細胞濃度の液を1ml/ウエル加え１週間培養し
た。培地は中性に調製したDMEM（日水製薬社製）にグル
タミン（日水製薬社製）を0.3g/、牛胎児血清10％、
馬血清10％となるように加えたものを使用した。培養２
日目には、いずれの条件で調製した基質でも、形成した
パターンと同じ培養形態をとっていることが観察され
た。さらに７日目には、立体的な細胞集塊が二次元のパ
ターンで形成されていることがみとめられ、生体内に近
い培養環境となっていることが認められた。
実施例２ プラスチック基質にコロナ放電処理したポリメチルペ
ンテン（三井石油化学社製）、ポリエステル（東レ社
製）を用い、水溶性縮合剤は、Ｎ−シクロヘキシル−
Ｎ′−（２−モルホリエテルカルボジイミド−パラ−ト
ルエンスルホン酸塩を、カルボキシル基を含む多糖は、
コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、アルギン酸（各
シグマ社製）を用いて同様の基質を調整した。牛大動脈
より採取した血管内皮細胞（継代３代）を、DMEM/F12培
地（シグマ製）に10％となるよう牛胎児血清を添加した
培地で実施例１と同様に培養したところいずれの基質も
多糖により形成された形態どおりに細胞が培養されてい
ることが認められた。
ンテン（三井石油化学社製）、ポリエステル（東レ社
製）を用い、水溶性縮合剤は、Ｎ−シクロヘキシル−
Ｎ′−（２−モルホリエテルカルボジイミド−パラ−ト
ルエンスルホン酸塩を、カルボキシル基を含む多糖は、
コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、アルギン酸（各
シグマ社製）を用いて同様の基質を調整した。牛大動脈
より採取した血管内皮細胞（継代３代）を、DMEM/F12培
地（シグマ製）に10％となるよう牛胎児血清を添加した
培地で実施例１と同様に培養したところいずれの基質も
多糖により形成された形態どおりに細胞が培養されてい
ることが認められた。
本発明の基質を用いて組織系細胞の培養を行うと、そ
の細胞の培養形態が明瞭に制御される。
の細胞の培養形態が明瞭に制御される。
従来の単一平面上の培養に比してより生体内に近い培
養を行うことができ、細胞の機能研究、あるいは分化の
誘導、形態形成等に非常に有用なものであり、産業上の
利用性も大きなものがある。
養を行うことができ、細胞の機能研究、あるいは分化の
誘導、形態形成等に非常に有用なものであり、産業上の
利用性も大きなものがある。
Claims (4)
- 【請求項１】プラスチック基質に、フオトレジストのパ
ターンを形成し、アンモニアプラズマ処理を行った後、
水溶性縮合剤とカルボキシル基を含む多糖の混液を反応
させ、最後にフオトレジストを除去することにより製造
されることを特徴とする組織系細胞の培養基質。 - 【請求項２】プラスチック基質が、ポリスルホン、ポリ
エーテルスルホン、ポリメチルペンテンまたはポリエス
テルであることを特徴とする請求項第１項記載の組織系
細胞の培養基質。 - 【請求項３】水溶性縮合剤が、１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩または
Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ′−（２−モルホリノエチル）
カルボジイミド−パラ−トルエンスルホン酸塩であるこ
とを特徴とする請求項第１項記載の組織系細胞の培養基
質。 - 【請求項４】カルボキシル基を有する多糖が、ヘパリ
ン、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、ヒアルロン
酸、アルギン酸、カルボキシルメチルキチンであること
を特徴とする請求項第１項記載の組織系細胞の培養基
質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2242449A JP2609559B2 (ja) | 1990-09-14 | 1990-09-14 | 組織系細胞の培養に用いる基質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2242449A JP2609559B2 (ja) | 1990-09-14 | 1990-09-14 | 組織系細胞の培養に用いる基質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04126074A JPH04126074A (ja) | 1992-04-27 |
| JP2609559B2 true JP2609559B2 (ja) | 1997-05-14 |
Family
ID=17089264
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2242449A Expired - Fee Related JP2609559B2 (ja) | 1990-09-14 | 1990-09-14 | 組織系細胞の培養に用いる基質 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2609559B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL182804B1 (pl) * | 1995-02-07 | 2002-03-29 | Fidia Advanced Biopolymers | Sposób powlekania powierzchni przedmiotu kwasem hialuronowym lub pochodną kwasu hialuronowego i sposób powlekania powierzchni przedmiotu polimerem półsyntetycznym |
| CA2466578A1 (en) * | 2001-11-15 | 2003-05-30 | Becton, Dickinson And Company | Methods and devices for the integrated discovery of cell culture environments |
| US20040062882A1 (en) * | 2002-09-30 | 2004-04-01 | Andrea Liebmann-Vinson | Cell adhesion resisting surfaces |
| JP4589012B2 (ja) * | 2004-02-19 | 2010-12-01 | 大日本印刷株式会社 | 細胞培養用パターニング基板 |
| US7919305B2 (en) | 2004-02-19 | 2011-04-05 | Dai Nippon Printing Co., Ltd. | Method for manufacturing cell culture substrate |
| JP4456393B2 (ja) | 2004-03-26 | 2010-04-28 | 大日本印刷株式会社 | 細胞培養基板の製造方法および細胞培養基板製造装置 |
| JP4585790B2 (ja) * | 2004-03-27 | 2010-11-24 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 細胞培養足場および細胞培養方法 |
| US9249386B2 (en) | 2005-06-06 | 2016-02-02 | Dai Nippon Printing Co., Ltd. | Substrate for cell transfer |
-
1990
- 1990-09-14 JP JP2242449A patent/JP2609559B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04126074A (ja) | 1992-04-27 |
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