JP2588059B2 - 電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの製造方法 - Google Patents
電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、生化学、医学の分野において、生体由来
物質、例えば、蛋白質、核酸等の分離分析に用いられる
電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの製造方法に関す
る。
物質、例えば、蛋白質、核酸等の分離分析に用いられる
電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの製造方法に関す
る。
従来、電気泳動用の支持体として紙、アガロース、澱
粉等が用いられていたが、それらは分離能が悪く、バン
ドも不鮮明であった。
粉等が用いられていたが、それらは分離能が悪く、バン
ドも不鮮明であった。
近年、ポリアクリルアミドを支持体とするゲル電気泳
動法が確立され、高い精度の分子ふるい効果により高分
解能が期待できるようになった。
動法が確立され、高い精度の分子ふるい効果により高分
解能が期待できるようになった。
中でも泳動用ゲルとして、緩衝液を内包したポリアク
リルアミド架橋物を用いる方法は、アクリルアミド濃度
と架橋剤の組成により、ゲルのポアサイズを任意に調節
できることから現在のゲル電気泳動法における主流とな
っており、分離しようとする蛋白質、核酸等の分子量に
よりアクリルアミド濃度を換えたゲルを作り分析に用い
ている。即ち、一般に、比較的低分子量の蛋白質、核酸
の分離には高濃度のポリアクリルアミドゲルが高分子量
の蛋白質、核酸の分離には低濃度のポリアクリルアミド
ゲルが用いられている。
リルアミド架橋物を用いる方法は、アクリルアミド濃度
と架橋剤の組成により、ゲルのポアサイズを任意に調節
できることから現在のゲル電気泳動法における主流とな
っており、分離しようとする蛋白質、核酸等の分子量に
よりアクリルアミド濃度を換えたゲルを作り分析に用い
ている。即ち、一般に、比較的低分子量の蛋白質、核酸
の分離には高濃度のポリアクリルアミドゲルが高分子量
の蛋白質、核酸の分離には低濃度のポリアクリルアミド
ゲルが用いられている。
これらの技術に関して、例えば、特開昭63−502456号
公報、特開昭62−91850号公報、特開平２−22555号公報
等がある。
公報、特開昭62−91850号公報、特開平２−22555号公報
等がある。
即ち、特開昭63−502456号公報には、電気泳動分離法
に対する緩衝溶液の供給方法が開示されている。該電気
泳動分離法に対する緩衝溶液の供給方法は、通常は液状
で使用される電極液をゲル状とし、分離用ゲルとの接触
を容易にしたものであり、ゲル板の形態の支持マトリッ
クスで行われる水平電気泳動分離法に緩衝剤溶液を供給
するものであり、２種の電極緩衝剤をそれぞれ１つのゲ
ル片に混入し、これらゲル片をゲル片間のマトリックス
が使用可能な分離領域を提供するように支持マトリック
スと接触させておくものである。また、ゲル片がアガロ
ース若しくはポリアクリルアミドよりなるものである。
更に、各ゲル片における電極緩衝剤の含有量が80〜99重
量％の範囲内であるものである。
に対する緩衝溶液の供給方法が開示されている。該電気
泳動分離法に対する緩衝溶液の供給方法は、通常は液状
で使用される電極液をゲル状とし、分離用ゲルとの接触
を容易にしたものであり、ゲル板の形態の支持マトリッ
クスで行われる水平電気泳動分離法に緩衝剤溶液を供給
するものであり、２種の電極緩衝剤をそれぞれ１つのゲ
ル片に混入し、これらゲル片をゲル片間のマトリックス
が使用可能な分離領域を提供するように支持マトリック
スと接触させておくものである。また、ゲル片がアガロ
ース若しくはポリアクリルアミドよりなるものである。
更に、各ゲル片における電極緩衝剤の含有量が80〜99重
量％の範囲内であるものである。
また、特開昭62−91850号公報には、ポリアクリルア
ミド系水性ゲル電気泳動用媒体の製造方法が開示されて
いる。該電気泳動用媒体の製造方法は、アクリルアミド
系単量体、架橋剤、水及び重合開始手段の存在下に架橋
重合させるに当たり、該重合開始手段が過酸化物、光増
感剤、及び励起光の組み合わせからなり還元剤を含まな
い方法である。
ミド系水性ゲル電気泳動用媒体の製造方法が開示されて
いる。該電気泳動用媒体の製造方法は、アクリルアミド
系単量体、架橋剤、水及び重合開始手段の存在下に架橋
重合させるに当たり、該重合開始手段が過酸化物、光増
感剤、及び励起光の組み合わせからなり還元剤を含まな
い方法である。
また、特開平２−22555号公報には、電気泳動ゲル媒
体用キットが開示されている。該電気泳動ゲル媒体用キ
ットは、ポリアクリルアミド型ポリマーゲル媒体を便利
に安全に形成するためのキットである。
体用キットが開示されている。該電気泳動ゲル媒体用キ
ットは、ポリアクリルアミド型ポリマーゲル媒体を便利
に安全に形成するためのキットである。
また、広範囲の分子量分布を有する蛋白質や核酸を分
離するため、泳動方向に対してアクリルアミド濃度を連
続的に変化させたグラジエントゲルに関する技術とし
て、例えば、特開昭61−28512号公報、特開昭63−21065
4号公報、特開平１−263548号公報などがある。
離するため、泳動方向に対してアクリルアミド濃度を連
続的に変化させたグラジエントゲルに関する技術とし
て、例えば、特開昭61−28512号公報、特開昭63−21065
4号公報、特開平１−263548号公報などがある。
即ち、特開昭61−28512号公報には、電気泳動ゲル物
質の製法が開示されている。該電気泳動ゲル物質の製法
は、重合を水溶性の有機光反応開始剤を使用する均一系
光重合、或いは光重合水溶液中に有機反応開始剤を懸濁
又は分散させた不均一系光重合により開始して、連続的
な孔勾配を有するグラジエントゲルの製法である。
質の製法が開示されている。該電気泳動ゲル物質の製法
は、重合を水溶性の有機光反応開始剤を使用する均一系
光重合、或いは光重合水溶液中に有機反応開始剤を懸濁
又は分散させた不均一系光重合により開始して、連続的
な孔勾配を有するグラジエントゲルの製法である。
特開昭63−210654号公報、及び特開平１−263548号公
報には、電気泳動用媒体について開示されている。即
ち、これら公報には、低分子量部分から高分子量部分ま
でほぼ同等な良好な高分離性能を持つ、改良されたポリ
アクリルアミド系水性ゲル濃度グラジエントゲルを有す
るゲル媒体が記載されている。
報には、電気泳動用媒体について開示されている。即
ち、これら公報には、低分子量部分から高分子量部分ま
でほぼ同等な良好な高分離性能を持つ、改良されたポリ
アクリルアミド系水性ゲル濃度グラジエントゲルを有す
るゲル媒体が記載されている。
また、アクリルアミド濃度を段階的に変化させた電気
泳動用ゲルを製造する技術として、特開平１−302153号
公報がある。即ち、アクリルアミド濃度の異なる複数の
モノマー水溶液を段階的に逐次重層し、次いで、これを
重合して得られる電気泳動用ゲルの製造方法が記載され
ている。
泳動用ゲルを製造する技術として、特開平１−302153号
公報がある。即ち、アクリルアミド濃度の異なる複数の
モノマー水溶液を段階的に逐次重層し、次いで、これを
重合して得られる電気泳動用ゲルの製造方法が記載され
ている。
前記の公知技術において、ゲルを構成するアクリルア
イド濃度の実用的な範囲は、４〜20重量％であり、４重
量％以下の低濃度ではゲル強度が小さく、20重量％以上
の高濃度では容器面との間に剥離を生じ易い。
イド濃度の実用的な範囲は、４〜20重量％であり、４重
量％以下の低濃度ではゲル強度が小さく、20重量％以上
の高濃度では容器面との間に剥離を生じ易い。
また、蛋白質をドデシル硫酸ナトリウム（以下、SDS
と略す。）で処理し、蛋白質分子の電荷を均等にしてゲ
ル電気泳動を行えば、分子量差のみによって分離が行わ
れ、特に、ゲル緩衝液として、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン（以下、トリスと略す。）の塩酸によ
る部分中和物を使用し、泳動用電極液として、トリス・
グリシン塩を使用する方法は、レムリー〔U.K.Laemmli,
Nature Vol.227、680（1970）〕の処方として蛋白質の
分析に賞用されている。このレムリーの処方におけるゲ
ル緩衝液では、pHが8.8となるように、トリスの約10〜2
0モル％を塩酸により部分中和している。
と略す。）で処理し、蛋白質分子の電荷を均等にしてゲ
ル電気泳動を行えば、分子量差のみによって分離が行わ
れ、特に、ゲル緩衝液として、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン（以下、トリスと略す。）の塩酸によ
る部分中和物を使用し、泳動用電極液として、トリス・
グリシン塩を使用する方法は、レムリー〔U.K.Laemmli,
Nature Vol.227、680（1970）〕の処方として蛋白質の
分析に賞用されている。このレムリーの処方におけるゲ
ル緩衝液では、pHが8.8となるように、トリスの約10〜2
0モル％を塩酸により部分中和している。
前述したようにレムリーの処方においては、ポリアク
リルアミドゲルの内包する緩衝液のpHは8.8であり、ア
ミド基は経時的に加水分解反応を受ける。加水分解反応
は、冷蔵庫保管のごとき低温条件下でも進行し、ポリア
クリルアミドゲルは部分的にアニオン基を有することに
なる。この結果、蛋白質の泳動距離が短くなると共に、
分離像は不鮮明となる。加水分解を防止するためにトリ
スの中和率を高め、ゲル緩衝液のpHを中性付近、あるい
はそれ以下にすると、蛋白質の分子量差による分離性能
が悪化し実用に堪えないものとなる。
リルアミドゲルの内包する緩衝液のpHは8.8であり、ア
ミド基は経時的に加水分解反応を受ける。加水分解反応
は、冷蔵庫保管のごとき低温条件下でも進行し、ポリア
クリルアミドゲルは部分的にアニオン基を有することに
なる。この結果、蛋白質の泳動距離が短くなると共に、
分離像は不鮮明となる。加水分解を防止するためにトリ
スの中和率を高め、ゲル緩衝液のpHを中性付近、あるい
はそれ以下にすると、蛋白質の分子量差による分離性能
が悪化し実用に堪えないものとなる。
前述したように実用的なゲル作成範囲であるアクリル
アミド濃度４〜20％のポリアクリルアミドゲルは測定対
象である蛋白質の分子量範囲も限定され、レムリーの緩
衝液を用いた場合、アクリルアミド濃度４％のゲルで分
子量50万、アクリルアミド濃度20％のゲルで分子量２万
の蛋白質分子を分離するのが限界であり、測定可能な分
子量範囲を更に広範囲に拡大することが求められてい
る。
アミド濃度４〜20％のポリアクリルアミドゲルは測定対
象である蛋白質の分子量範囲も限定され、レムリーの緩
衝液を用いた場合、アクリルアミド濃度４％のゲルで分
子量50万、アクリルアミド濃度20％のゲルで分子量２万
の蛋白質分子を分離するのが限界であり、測定可能な分
子量範囲を更に広範囲に拡大することが求められてい
る。
この発明の目的は、上記の課題を解決するものであ
り、長期保存安定性に優れ、且つ測定可能な分子量範囲
を著しく拡大した分離用ゲルであるところの電気泳動用
ポリアクリルアミドゲルの製造方法を提供することであ
る。
り、長期保存安定性に優れ、且つ測定可能な分子量範囲
を著しく拡大した分離用ゲルであるところの電気泳動用
ポリアクリルアミドゲルの製造方法を提供することであ
る。
この発明は、上記の目的を達成するため、次のように
構成されている。即ち、この発明は、泳動用電極液の組
成がトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン及び両性
電解質を含有する水溶液である電気泳動法に用いる分離
用のポリアクリルアミドゲルを製造するに当たり、ゲル
緩衝液の組成がトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、pKa値が７〜11の範囲にある両性電解質及び酸を含
有する水溶液であり、トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタンと酸の含有量比が1:0.6〜１グラム当量部であ
ることを並びに酸と両性電解質の含有量比が1:0.5〜４
グラム当量部であることを特徴とする電気泳動用ポリア
クリルアミドゲルの製造方法に関する。
構成されている。即ち、この発明は、泳動用電極液の組
成がトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン及び両性
電解質を含有する水溶液である電気泳動法に用いる分離
用のポリアクリルアミドゲルを製造するに当たり、ゲル
緩衝液の組成がトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、pKa値が７〜11の範囲にある両性電解質及び酸を含
有する水溶液であり、トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタンと酸の含有量比が1:0.6〜１グラム当量部であ
ることを並びに酸と両性電解質の含有量比が1:0.5〜４
グラム当量部であることを特徴とする電気泳動用ポリア
クリルアミドゲルの製造方法に関する。
また、この電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの製造
方法において、ゲル緩衝液のpHが4.0〜7.5である。
方法において、ゲル緩衝液のpHが4.0〜7.5である。
また、この電気泳動用ポリアクリルアミドゲルは、そ
の使用時において、泳動用電極液中にSDSを含有するも
のである。
の使用時において、泳動用電極液中にSDSを含有するも
のである。
この発明による電気泳動用ポリアクリルアミドゲル
は、アクリルアミドを、架橋剤、水、ゲル緩衝液、重合
開始手段の存在下に重合させて電気泳動用ポリアクリル
アミドゲルを製造するに当たり、該ゲル緩衝液の組成が
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、pKa値が７
〜11の範囲にある両性電解質及び酸を含有する水溶液で
あり、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと酸の
含有量比が1:0.6〜１グラム当量部であること並びに酸
と両性電解質の含有量比が1:0.5〜４グラム当量部であ
ることを特徴としている。
は、アクリルアミドを、架橋剤、水、ゲル緩衝液、重合
開始手段の存在下に重合させて電気泳動用ポリアクリル
アミドゲルを製造するに当たり、該ゲル緩衝液の組成が
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、pKa値が７
〜11の範囲にある両性電解質及び酸を含有する水溶液で
あり、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと酸の
含有量比が1:0.6〜１グラム当量部であること並びに酸
と両性電解質の含有量比が1:0.5〜４グラム当量部であ
ることを特徴としている。
この電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの製造方法に
おいて、ゲル緩衝液を構成する酸は、少量の添加でゲル
緩衝液のpHをアミド基の加水分解が起こらない範囲にま
で低下させるので、解離定数の大きいことが望まれ、pK
a値が５以下であることが望ましい。特に、好ましい酸
は塩酸、１価の水溶性有機酸である。
おいて、ゲル緩衝液を構成する酸は、少量の添加でゲル
緩衝液のpHをアミド基の加水分解が起こらない範囲にま
で低下させるので、解離定数の大きいことが望まれ、pK
a値が５以下であることが望ましい。特に、好ましい酸
は塩酸、１価の水溶性有機酸である。
また、この発明に用いる両性電解質は、分子内にアニ
オン性基とカチオン性基を同数有するものであり、pKa
値よりやや低いpHでは全てのアニオン性基と全てのカチ
オン性基が解離して電気的に中性となり、pKa値より高
いpHではアニオン性基のみが解離しカチオン性基の解離
が抑制されるため、負に帯電する。
オン性基とカチオン性基を同数有するものであり、pKa
値よりやや低いpHでは全てのアニオン性基と全てのカチ
オン性基が解離して電気的に中性となり、pKa値より高
いpHではアニオン性基のみが解離しカチオン性基の解離
が抑制されるため、負に帯電する。
このため、上記両性電解質は、実質的に一価の弱酸と
しての挙動を示すものであり、上記含有量に表示するグ
ラム当量部は、一価の弱酸として計算する。pKa値は通
常20℃において測定され、pKa値が11以上の両性電解質
は電位勾配の低下に寄与せず、７以下の場合はリーディ
ングイオン（ゲル緩衝液中に存在するpKa値が５以下の
酸根）とともに流出してしまう。
しての挙動を示すものであり、上記含有量に表示するグ
ラム当量部は、一価の弱酸として計算する。pKa値は通
常20℃において測定され、pKa値が11以上の両性電解質
は電位勾配の低下に寄与せず、７以下の場合はリーディ
ングイオン（ゲル緩衝液中に存在するpKa値が５以下の
酸根）とともに流出してしまう。
この発明に用いられる両性電解質として、グリシン、
セリン、アスパラギン、β−アラニン、Ｎ−トリス（ヒ
ドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルフォ
ン酸（以下、TAPSと略す。）、Ｎ−トリス（ヒドロキシ
メチル）メチルグリシン（以下、トリシンと略す。）、
Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエ
タンスルフォン酸（以下、TESと略す）等がある。
セリン、アスパラギン、β−アラニン、Ｎ−トリス（ヒ
ドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルフォ
ン酸（以下、TAPSと略す。）、Ｎ−トリス（ヒドロキシ
メチル）メチルグリシン（以下、トリシンと略す。）、
Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエ
タンスルフォン酸（以下、TESと略す）等がある。
ゲル緩衝液を構成する両性電解質のpKa値は、陰極側
の泳動用電極液を構成する両性電解質のpKa値より高く
てはならない。電位勾配の低下に寄与する両性電解質
は、泳動用電極液からゲル中に移動してくる両性電解質
（トレイリングイオン）と同一又は低いpKa値を持つ必
要がある。ゲル緩衝液を構成する両性電解質は、目的に
応じて１種又は２種以上を使用することができる。複数
種の両性電解質を併用した場合は、pKa値の低いものか
ら順に逐次陽極側へ移動し、ゲル内の電位勾配の変化は
緩やかなものとなり、アクリルアミド濃度を変化させた
場合と同様に測定対象の分子量範囲を拡大することがで
きる。
の泳動用電極液を構成する両性電解質のpKa値より高く
てはならない。電位勾配の低下に寄与する両性電解質
は、泳動用電極液からゲル中に移動してくる両性電解質
（トレイリングイオン）と同一又は低いpKa値を持つ必
要がある。ゲル緩衝液を構成する両性電解質は、目的に
応じて１種又は２種以上を使用することができる。複数
種の両性電解質を併用した場合は、pKa値の低いものか
ら順に逐次陽極側へ移動し、ゲル内の電位勾配の変化は
緩やかなものとなり、アクリルアミド濃度を変化させた
場合と同様に測定対象の分子量範囲を拡大することがで
きる。
この電気泳動用ポリアクリルアミドゲルは、ゲル緩衝
液のpH調整と両性電解質の添加以外は、従来公知の常法
に従って製造することができる。例えば、架橋を目的と
した水溶性ジビニル化合物としては、N,N−メチレンビ
スアクリルアミド（以下、BISと略す）が最も多用され
ているが、その他、N,N−ジアリル酒石酸アミド等の一
般的なジビニル化合物も使用することができる。
液のpH調整と両性電解質の添加以外は、従来公知の常法
に従って製造することができる。例えば、架橋を目的と
した水溶性ジビニル化合物としては、N,N−メチレンビ
スアクリルアミド（以下、BISと略す）が最も多用され
ているが、その他、N,N−ジアリル酒石酸アミド等の一
般的なジビニル化合物も使用することができる。
モノマー水溶液には、ゲルに弾力性を持たせ、脆弱さ
を改善するため、アガロース、ポリアクリルアミド、ポ
リビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチ
レンオキサイド、ポリメチルビニルエーテル等の水溶性
ポリマーを含有させることもできる。他のモノマーを共
重合することもできる。
を改善するため、アガロース、ポリアクリルアミド、ポ
リビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチ
レンオキサイド、ポリメチルビニルエーテル等の水溶性
ポリマーを含有させることもできる。他のモノマーを共
重合することもできる。
モノマーの重合は、重合開始剤や紫外線照射により発
生するラジカルによって行われる。重合開始剤として
は、過硫酸アンモニウム（以下、APSと略す）等の過酸
化物とN,N,N′,N′−テトラメチルエチレンジアミン
（以下、TEMEDと略す）等の還元剤を併用するレドック
ス型の重合開始剤が賞用されるが、これらに特に限定さ
れるものではない。上記過酸化物及び還元剤は、全モノ
マーに対し、0.05〜５％（W/V）が使用される。また、
重合温度は開始剤が機能する温度であれば特に限定され
ないが、通常15〜50℃の範囲が好ましい。
生するラジカルによって行われる。重合開始剤として
は、過硫酸アンモニウム（以下、APSと略す）等の過酸
化物とN,N,N′,N′−テトラメチルエチレンジアミン
（以下、TEMEDと略す）等の還元剤を併用するレドック
ス型の重合開始剤が賞用されるが、これらに特に限定さ
れるものではない。上記過酸化物及び還元剤は、全モノ
マーに対し、0.05〜５％（W/V）が使用される。また、
重合温度は開始剤が機能する温度であれば特に限定され
ないが、通常15〜50℃の範囲が好ましい。
この発明による電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの
製造方法は、上記のように構成されており、次のように
作用する。
製造方法は、上記のように構成されており、次のように
作用する。
通電によりアニオンは陽極側へと移動する。即ち、陰
極側電極液中のアニオンは、ゲル中へ移動し、ゲル中の
アニオンは陽極側電極液中へ移動する。
極側電極液中のアニオンは、ゲル中へ移動し、ゲル中の
アニオンは陽極側電極液中へ移動する。
前述のレムリーの処方のように、ゲル緩衝液として強
酸塩水溶液を用い、電極液として弱酸塩水溶液を用いる
電気泳動法の場合、ゲル中の強酸根は陽極側へ移動し、
陰極側電極液中の弱酸根はゲル中へ移動する。ゲル緩衝
液と電極液に共通のカチオンとして、トリスのような弱
塩基を用いた場合は、弱酸塩の一部が電荷を失いイオン
量が減少することにより、ゲル中の電気抵抗（即ち、電
位勾配）が上昇し分離対象である蛋白質分子等の泳動速
度が高まる。
酸塩水溶液を用い、電極液として弱酸塩水溶液を用いる
電気泳動法の場合、ゲル中の強酸根は陽極側へ移動し、
陰極側電極液中の弱酸根はゲル中へ移動する。ゲル緩衝
液と電極液に共通のカチオンとして、トリスのような弱
塩基を用いた場合は、弱酸塩の一部が電荷を失いイオン
量が減少することにより、ゲル中の電気抵抗（即ち、電
位勾配）が上昇し分離対象である蛋白質分子等の泳動速
度が高まる。
そして、泳動ゲル中のトリス強酸塩部分とトリス弱酸
塩部分は明瞭に区分され、境界付近での電位勾配の変化
は強酸によりトリスの中和率が高まるほど大きくなる。
このため、高中和率の場合は境界付近に分離対象が収斂
し易くなり、特に、低分子量分画部の分離特性が悪くな
る。これを防止するためには、ゲル中における弱酸塩部
分の電気抵抗値を適度に低下させる必要がある。
塩部分は明瞭に区分され、境界付近での電位勾配の変化
は強酸によりトリスの中和率が高まるほど大きくなる。
このため、高中和率の場合は境界付近に分離対象が収斂
し易くなり、特に、低分子量分画部の分離特性が悪くな
る。これを防止するためには、ゲル中における弱酸塩部
分の電気抵抗値を適度に低下させる必要がある。
この発明のごとく予めゲル緩衝液中に弱酸を添加して
おくことにより、弱酸塩部分のイオン量が増加し電気抵
抗値は低下する。電気抵抗値は弱酸のpKa値と濃度によ
り任意に変えることができる。しかも、強酸根の存在下
ではpHが低いために弱酸は電気的に中性であり、電気抵
抗値を下げることは無い。
おくことにより、弱酸塩部分のイオン量が増加し電気抵
抗値は低下する。電気抵抗値は弱酸のpKa値と濃度によ
り任意に変えることができる。しかも、強酸根の存在下
ではpHが低いために弱酸は電気的に中性であり、電気抵
抗値を下げることは無い。
しかしながら、これら電気抵抗値を調節する目的に適
した弱酸のpKa値は、７〜11であり、通常のアニオン性
基の解離定数とはかけ離れた値である。
した弱酸のpKa値は、７〜11であり、通常のアニオン性
基の解離定数とはかけ離れた値である。
このため、この発明においては、カチオン性基とアニ
オン性基を同数有する両性電解質を擬似弱酸として用
い、カチオン性基のpKa値を上記範囲とすることによ
り、アルカリ側ではカチオン性基の解離が抑制され、ア
ニオンとしての挙動を示し、酸性側においては同数のア
ニオン性基とカチオン性基が解離するため、電気的に中
性であり、電気伝導に寄与しない。
オン性基を同数有する両性電解質を擬似弱酸として用
い、カチオン性基のpKa値を上記範囲とすることによ
り、アルカリ側ではカチオン性基の解離が抑制され、ア
ニオンとしての挙動を示し、酸性側においては同数のア
ニオン性基とカチオン性基が解離するため、電気的に中
性であり、電気伝導に寄与しない。
このように適当なpKa値を有する両性電解質を予めゲ
ル緩衝液中に適量共存させることにより、泳動中のゲル
内の電位勾配の分布を調節することができる。そして、
分子量が異なる種々の試料に対応して広範囲にわたり、
高分解能の泳動像を得ることが可能になる。
ル緩衝液中に適量共存させることにより、泳動中のゲル
内の電位勾配の分布を調節することができる。そして、
分子量が異なる種々の試料に対応して広範囲にわたり、
高分解能の泳動像を得ることが可能になる。
また、この発明のように、ゲル緩衝液中に両性電解質
を共存させると泳動終了後の酸性染料による蛋白質の染
色を助ける効果が認められる。これは、染色時の酢酸酸
性下において両性電解質はオニオン性基の解離が抑制さ
れ、カチオンとして作用し、蛋白質分子と結合したアニ
オン物質の妨害作用を除去するものと推測される。
を共存させると泳動終了後の酸性染料による蛋白質の染
色を助ける効果が認められる。これは、染色時の酢酸酸
性下において両性電解質はオニオン性基の解離が抑制さ
れ、カチオンとして作用し、蛋白質分子と結合したアニ
オン物質の妨害作用を除去するものと推測される。
以下、この発明による電気泳動用ポリアクリルアミド
ゲルの製造方法の実施例について説明するが、この発明
は、この出願の特許請求の範囲に記載された事項によっ
て構成される技術的思想の範囲内を超えない限り、以下
に説明する実施例に制約されるものでないことは勿論で
ある。
ゲルの製造方法の実施例について説明するが、この発明
は、この出願の特許請求の範囲に記載された事項によっ
て構成される技術的思想の範囲内を超えない限り、以下
に説明する実施例に制約されるものでないことは勿論で
ある。
実施例−１ 横幅12cm、縦10cmの長方形のガラス板と上部に凹状の
切り込みの入った同寸法のガラス板の間に、厚さ1mmの
スペーサを挟んでガラスプレートを組み立てる。アクリ
ルアミド濃度12.5％（％Ｔ）、BIS濃度2.6％（％Ｃ）、
並びに表−１に記載する濃度の緩衝液組成から成るモノ
マー溶液に対し、APS400ppm及びTEMED400ppmを添加混合
後、プレート内に注入し、常法で重合させ、電気泳動用
ポリアクリルアミドゲルを得た。
切り込みの入った同寸法のガラス板の間に、厚さ1mmの
スペーサを挟んでガラスプレートを組み立てる。アクリ
ルアミド濃度12.5％（％Ｔ）、BIS濃度2.6％（％Ｃ）、
並びに表−１に記載する濃度の緩衝液組成から成るモノ
マー溶液に対し、APS400ppm及びTEMED400ppmを添加混合
後、プレート内に注入し、常法で重合させ、電気泳動用
ポリアクリルアミドゲルを得た。
該ポリアクリルアミドゲルを用いて分子量既知の市販
マーカー蛋白質を電気泳動し、移動距離を測定した。
マーカー蛋白質を電気泳動し、移動距離を測定した。
マーカー蛋白質は、βメルカプトエタノール、SDSを
用いて処理し、７％グリセリン及び0.05％ブロムフェノ
ールブルー（以下、BPBと略す）を加えて試験に供し
た。
用いて処理し、７％グリセリン及び0.05％ブロムフェノ
ールブルー（以下、BPBと略す）を加えて試験に供し
た。
泳動用電極液の組成は、トリス濃度0.025mol/、グ
リシン濃度0.192mol/、SDS0.1重量％のレムリー処方
である。
リシン濃度0.192mol/、SDS0.1重量％のレムリー処方
である。
電気泳動は、20mA定電流で行い、BPBの泳動末端が下
から5mmの所で通電を中止した。
から5mmの所で通電を中止した。
染色は、0.25％クマシーブリリアントブルー（以下、
CBBと略す）−G250、10％酢酸、30％メタノール溶液中
で２時間行なった。また、脱色は、７％酢酸、３％メタ
ノール溶液で適宜新しい溶液に替えながら一昼夜行っ
た。
CBBと略す）−G250、10％酢酸、30％メタノール溶液中
で２時間行なった。また、脱色は、７％酢酸、３％メタ
ノール溶液で適宜新しい溶液に替えながら一昼夜行っ
た。
BPB泳動距離に対する各蛋白の泳動距離の比を移動度
として、表−２及び表−３に記載する。
として、表−２及び表−３に記載する。
表−２は製造直後の移動度であり、また、表−３は５
℃で120日間保存後の移動度である。
℃で120日間保存後の移動度である。
上記の表−１における試料−１及び試料−２の単位
は、mol/で表されており、ここでグリシンの酸（塩素
イオン）に対する比（グラム当量比）は、次のとおりで
ある。0.080:0.19≒1:2.4 実施例−２ 実施例−１と同様のガラスプレートを用い、表−４に
記載する濃度の緩衝液組成から成るモノマー組成でポリ
アクリルアミドゲルを製造し、実施例−１と同一の条件
で製造直後に電気泳動を行った結果を表−５に示す。た
だし、BIS濃度は全て5.0％（％Ｃ）である。
は、mol/で表されており、ここでグリシンの酸（塩素
イオン）に対する比（グラム当量比）は、次のとおりで
ある。0.080:0.19≒1:2.4 実施例−２ 実施例−１と同様のガラスプレートを用い、表−４に
記載する濃度の緩衝液組成から成るモノマー組成でポリ
アクリルアミドゲルを製造し、実施例−１と同一の条件
で製造直後に電気泳動を行った結果を表−５に示す。た
だし、BIS濃度は全て5.0％（％Ｃ）である。
実施例−３ 実施例−１と同様のガラスプレートを用い、表−６に
記載する濃度の緩衝液組成から成るモノマー組成でポリ
アクリルアミドゲルを製造し、低分子量の試料の分離を
試みた。ただし、BIS濃度は全て5.0％（％Ｃ）である。
記載する濃度の緩衝液組成から成るモノマー組成でポリ
アクリルアミドゲルを製造し、低分子量の試料の分離を
試みた。ただし、BIS濃度は全て5.0％（％Ｃ）である。
分子量マーカーとしては、ファルマシア社製のポリペ
プチドを用いた。SDS及びβメルカプトエタノールを、
それぞれ2.5％、５％溶解した50mMトリスー塩酸緩衝液
（pH6.8）にマーカーを溶解し、0.01％のCBBを加えて、
室温で一晩放置した後、試験に供した。
プチドを用いた。SDS及びβメルカプトエタノールを、
それぞれ2.5％、５％溶解した50mMトリスー塩酸緩衝液
（pH6.8）にマーカーを溶解し、0.01％のCBBを加えて、
室温で一晩放置した後、試験に供した。
泳動用電極液の組成はトリス濃度0.025mol/、SDS0.
1重量％で、これに加える両性電解質を表−６の泳動用
電極液の項に示す。
1重量％で、これに加える両性電解質を表−６の泳動用
電極液の項に示す。
電気泳動は、20mA定電流で行い、CBBの泳動末端が下
から10mmの所で通電を中止した。
から10mmの所で通電を中止した。
電気泳動後、ゲルを50％メタノール、10％酢酸溶液で
45分固定する。染色は、0.025％CBB−G250、10％酢酸溶
液中で２時間行い、脱色は10％酢酸溶液で適宜新しい溶
液に替えながら一晩行った。
45分固定する。染色は、0.025％CBB−G250、10％酢酸溶
液中で２時間行い、脱色は10％酢酸溶液で適宜新しい溶
液に替えながら一晩行った。
CBB泳動距離に対する各蛋白質の泳動距離の比を移動
度として表−７に記載する。
度として表−７に記載する。
〔発明の効果〕 この発明による電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの
製造方法は、上記のように構成されており、次のような
効果を有する。
製造方法は、上記のように構成されており、次のような
効果を有する。
実施例−１で示したように、ゲル緩衝液の酸によるト
リスの中和率が低いレムリーの標準処方は高pHのため
に、長期保存により移動度が低下し分離能が悪くなる。
一方、ゲル緩衝液の中和率を上げてpHを中性付近、或い
はそれ以下にした場合は、長期保存による変質は無い
が、レムリーの標準処方に比較して移動度が大幅に増大
する。
リスの中和率が低いレムリーの標準処方は高pHのため
に、長期保存により移動度が低下し分離能が悪くなる。
一方、ゲル緩衝液の中和率を上げてpHを中性付近、或い
はそれ以下にした場合は、長期保存による変質は無い
が、レムリーの標準処方に比較して移動度が大幅に増大
する。
これに対し、この発明による電気泳動用ポリアクリル
アミドゲルの製造方法のように、ゲル緩衝液に両性電解
質を共存させた場合は、中和率を上げて変質を防止して
も、レムリー標準処方に準じた泳動像が得られる。実施
例１の試料−１と試料−２の比較から明らかなように、
泳動用電極液中にSDSが存在すれば、ゲル緩衝液中の有
無は泳動に影響を与えない。
アミドゲルの製造方法のように、ゲル緩衝液に両性電解
質を共存させた場合は、中和率を上げて変質を防止して
も、レムリー標準処方に準じた泳動像が得られる。実施
例１の試料−１と試料−２の比較から明らかなように、
泳動用電極液中にSDSが存在すれば、ゲル緩衝液中の有
無は泳動に影響を与えない。
また、実施例−２の試料−４は、アクリルアミド濃度
10％の均一ゲルであるにもかかわらず、pKa値の異なる
複数の両性電解質を適宜ゲル中に共存させることによ
り、広範囲の分子量分布を持つ試料に対し良好な分離性
能を示し、グラジエントゲルと類似の泳動像が得られ
る。
10％の均一ゲルであるにもかかわらず、pKa値の異なる
複数の両性電解質を適宜ゲル中に共存させることによ
り、広範囲の分子量分布を持つ試料に対し良好な分離性
能を示し、グラジエントゲルと類似の泳動像が得られ
る。
更に、実施例−３に示すように、従来困難であった２
万以下の低分子量のポリペプチドもこの発明による電気
泳動ゲルの場合は容易に分離することが可能である。更
に、両性電解質の存在により泳動終了後の蛋白質の染色
が助長される。
万以下の低分子量のポリペプチドもこの発明による電気
泳動ゲルの場合は容易に分離することが可能である。更
に、両性電解質の存在により泳動終了後の蛋白質の染色
が助長される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 飯塚 高史 東京都文京区本郷７丁目２番３号 アト ー株式会社内
Claims (5)
- 【請求項１】泳動用電極液の組成がトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン及び両性電解質を含有する水溶液
である電気泳動法に用いる分離用のポリアクリルアミド
ゲルを製造するに当たり、ゲル緩衝液の組成がトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン、pKa値が７〜11の
範囲にある両性電解質及び酸を含有する水溶液であり、
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと酸の含有量
比が1:0.6〜１グラム当量部であること並びに酸と両性
電解質の含有量比が1:0.5〜４グラム当量部であること
を特徴とする電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの製造
方法。 - 【請求項２】酸のpKa値が５以下であることを特徴とす
る請求項１に記載の電気泳動用ポリアクリルアミドゲル
の製造方法。 - 【請求項３】ゲル緩衝液のpHが4.0〜7.5の範囲にあるこ
とを特徴とする請求項１に記載の電気泳動用ポリアクリ
ルアミドゲルの製造方法。 - 【請求項４】泳動用電極液中にドデシル硫酸塩が存在す
ることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動用ポリア
クリルアミドゲルの製造方法。 - 【請求項５】アクリルアミドを、架橋剤、水、ゲル緩衝
液、重合開始手段の存在下に重合させて電気泳動用ポリ
アクリルアミドゲルを製造するに当たり、該ゲル緩衝液
の組成がトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、pK
a値が７〜11の範囲にある両性電解質及び酸を含有する
水溶液であり、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ンと酸の含有量が1:0.6〜１グラム当量部であること並
びに酸と両性電解質の含有量が1:0.5〜４グラム当量部
であることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動用ポ
リアクリルアミドゲルの製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31140690A JP2588059B2 (ja) | 1990-11-19 | 1990-11-19 | 電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの製造方法 |
| EP19920303513 EP0566784B1 (en) | 1990-11-19 | 1992-04-21 | Polyacrylamide gel for electrophoresis |
| TW81103549A TW221817B (ja) | 1990-11-19 | 1992-05-07 | |
| US08/235,934 US5464516A (en) | 1990-11-19 | 1994-05-02 | Process for producing an electrophoresis separation layer |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31140690A JP2588059B2 (ja) | 1990-11-19 | 1990-11-19 | 電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの製造方法 |
| US08/235,934 US5464516A (en) | 1990-11-19 | 1994-05-02 | Process for producing an electrophoresis separation layer |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04184163A JPH04184163A (ja) | 1992-07-01 |
| JP2588059B2 true JP2588059B2 (ja) | 1997-03-05 |
Family
ID=26566714
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31140690A Expired - Lifetime JP2588059B2 (ja) | 1990-11-19 | 1990-11-19 | 電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの製造方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5464516A (ja) |
| EP (1) | EP0566784B1 (ja) |
| JP (1) | JP2588059B2 (ja) |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5464516A (en) | 1995-11-07 |
| EP0566784B1 (en) | 1998-09-30 |
| JPH04184163A (ja) | 1992-07-01 |
| EP0566784A1 (en) | 1993-10-27 |
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