JP2021183956A - ゲル用組成物、ゲル、プレキャストゲル。 - Google Patents

Abstract

【課題】高分子量の物質に対しても高い分離能を示し、かつ、保存安定性や機械的強度、取扱性に優れる電気泳動ゲルを与えることのできる、ポリアクリルアミドを主体とするＰＡＧＥ用ゲルの提供。【解決手段】（メタ）アクリルアミド系モノマーと特定の架橋剤を含むゲル用組成物と、これから得られるゲル、このゲルからなるプレキャストゲル。【選択図】図４

Description

本発明は、（メタ）アクリルアミド系モノマーと特定の架橋剤を含むゲル用組成物、上記組成物から得られるゲル、上記ゲルからなるプレキャストゲルに関する。

ポリアクリルアミド電気泳動法（ＰＡＧＥ）は、酵素や蛋白質などの生体由来物質やこれらを人為的に合成した物質について、分子量や等電点の測定や同定、精製を行う際に多用される分析・実験手法である（非特許文献１）。ＰＡＧＥは、ゲル内部を荷電サンプル物質が移動する速度がサンプル物質の分子量や等電点に依存するという現象を用いており、サンプル物質は架橋ポリアクリルアミド分子鎖相互の網目構造内の間隙（いわゆるポア）を通過することによってゲル内を移動する。サンプル物質の移動速度は、分子量が同一ならば、ゲルの緩衝性、すなわちゲルに含まれる電解質や緩衝剤によって変動し、ＳＤＳが付加されたサンプル物質のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、分子量によって変動する。また、ＰＡＧＥが普及するにしたがって、ＰＡＧＥの分解能や効率化、作業性向上が求められるようになっている。そこで、有利なＰＡＧＥのための材料や装置が提案されてきた（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４）。

その一方で、ＰＡＧＥ自体の問題点も指摘されている。ポリアクリルアミドゲルは、特に大きな分子量、例えば分子量が１００ｋＤａ以上の物質に対する分離能は低い。これは、ゲル内に存在する、架橋ポリアクリルアミド分子鎖相互の間隙の三次元的な大きさ（架橋ポリアクリルアミド分子鎖でできた網目の大きさ。いわゆるポアサイズ）が比較的小型であることに起因すると考えられる。アクリルアミドの濃度を低くしてポアサイズの拡大を試みても、高分子量のサンプル物質に対するポリアクリルアミドゲルの分離能はそれほど変化しない（非特許文献２）。主に核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の分離に用いられているアガロースゲルの場合には、ポアサイズが大きすぎて高分子量の蛋白質の分離には適さない。アクリルアミドの架橋度を上げてポアサイズを小さくすると、ゲルの透明性と形状安定性、保水性が損なわれ、電気泳動ゲルとして機能しなくなる（非特許文献３）。

これまでに、ポリアクリルアミド自体の立体的構造を改変する様々な試みがなされている。これらの中で、ポリアクリルアミドゲルの架橋剤として最も多用されているＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）に替えて他の架橋剤でポリアクリルアミドを架橋した例としては、２−アクリルエチルメタクリルアミドを用いる例（特許文献５）、２−アクリルエチルメタクリルアミドなどの非対称型のアクリルアミド誘導体を用いる例（特許文献６）、ペンタメチレンビスアクリルアミドを用いる例（特許文献７）などが知られている。しかしながら、高分子量の物質に対しても高い分離能を示し、かつ、保存安定性や機械的強度、取扱性に優れる電気泳動ゲルを与えることのできる、ポリアクリルアミドを主体とするゲル材料は、未だ得られていない。

「ポリアクリルアミドゲル電気泳動法」恩田真紀，蛋白質科学会アーカイブ，１，ｅ０１１（２００８） "Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ" Ａ．Ｃｈｒａｍｂａｃｈ ａｎｄ Ｄ．Ｒｏｄｂａｒｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．１７２， ４４０−４５１ （１９７１）， "Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｈｉｇｈｌｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｇｅｌ" Ｗｉｌｌｉａｍ Ｐ． Ｃａｍｂｅｌｌ ｅｔ．ａｌ．， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２９， ３１−３６（１９８３）

国際公開第２０１６／００２２８２号公報 特開２００１−１５９６２１号公報 国際公開第２０１５／０９３３０１号公報 特表２０１０−５０２９６２号公報 国際公開第２０１７／０６５０９６号公報 ＵＳ ６，１９７，９０６ Ｂ１ 特開２０１４−９２４５０号公報

本発明者は、これまでに見出されていない、より機能性に優れるＰＡＧＥを可能とするゲル材料を求めた。すなわち、本発明者は、高分子量の物質に対しても高い分離能を示し、かつ、保存安定性や機械的強度、取扱性に優れる電気泳動ゲルを与えることのできる、ポリアクリルアミドを主体とするゲル材料の設計を試みた。

その結果、（メタ）アクリルアミド系モノマーを特定の架橋剤の存在下で重合して得られる架橋ポリ（メタ）アクリルアミドを含むゲルが、高分子量化合物に対する分離能、機械的強度、取扱性のいずれもが優れるＰＡＧＥ用ゲルとして有効であることを見出した。すなわち本発明は以下のものである。

（発明１）置換基を有するか又は有さない（メタ）アクリルアミドから選ばれる少なくとも１種以上の（メタ）アクリルアミド系モノマーと、以下の式（１）で表される分子量が１８２以上１５００以下の架橋剤を含む、ゲル用組成物。

（Ｂは炭素数が１以上４以下の直鎖または分岐アルキレン基を表す。Ｒ１及びＲ２は水素原子（Ｈ）またはメチル基（ＣＨ_３）を表す。ｌ，ｍ，ｎはそれぞれ１，２，３から選ばれ、ｌ，ｍ，ｎは互いに異なっていてもよく、ｌ，ｍ，ｎのうちの２つが同一でもよく、ｌ，ｍ，ｎの全てが同一でもよく、１≦ｌ＋ｍ＋ｎである。ｐ，ｑ，ｒは０≦ｐ，０≦ｑ，０≦ｒ，０≦ｐ＋ｑ＋ｒである。）
（発明２）上記架橋剤が以下の化合物ＣＬ−１及び／又はＣＬ−２から選ばれる少なくとも１以上である、発明１のゲル用組成物。

（発明３）置換基を有するか又は有さない（メタ）アクリルアミドから選ばれる少なくとも１種以上の（メタ）アクリルアミド系モノマーに由来する繰り返し単位と、以下の式（１）で表される分子量が１８２以上１５００以下の架橋剤に由来する単位とを有する、架橋（メタ）アクリルアミドを含む、ゲル。

（Ｂは炭素数が１以上４以下の直鎖または分岐アルキレン基を表す。Ｒ１及びＲ２は水素原子（Ｈ）またはメチル基（ＣＨ_３）を表す。ｌ，ｍ，ｎはそれぞれ１，２，３から選ばれ、ｌ，ｍ，ｎは互いに異なっていてもよく、ｌ，ｍ，ｎのうちの２つが同一でもよく、ｌ，ｍ，ｎの全てが同一でもよく、１≦ｌ＋ｍ＋ｎである。ｐ，ｑ，ｒは０≦ｐ，０≦ｑ，０≦ｒ，０≦ｐ＋ｑ＋ｒである。）
（発明４）上記架橋剤が以下の化合物ＣＬ−１及び／又はＣＬ−２から選ばれる少なくとも１以上である、発明３のゲル。

（発明５）置換基を有するか又は有さない（メタ）アクリルアミドから選ばれる少なくとも１種以上の（メタ）アクリルアミド系モノマーに由来する繰り返し単位と、以下の式（１）で表される分子量が１８２以上１５００以下の架橋剤に由来する単位とを有する、架橋（メタ）アクリルアミドを含む、ゲル からなるプレキャストゲル。

（Ｂは炭素数が１以上４以下の直鎖または分岐アルキレン基を表す。Ｒ１及びＲ２は水素原子（Ｈ）またはメチル基（ＣＨ_３）を表す。ｌ，ｍ，ｎはそれぞれ１，２，３から選ばれ、ｌ，ｍ，ｎは互いに異なっていてもよく、ｌ，ｍ，ｎのうちの２つが同一でもよく、ｌ，ｍ，ｎの全てが同一でもよく、１≦ｌ＋ｍ＋ｎである。ｐ，ｑ，ｒは０≦ｐ，０≦ｑ，０≦ｒ，０≦ｐ＋ｑ＋ｒである。）
（発明６）上記架橋剤が以下の化合物ＣＬ−１及び／又はＣＬ−２から選ばれる少なくとも１以上である、請求項５に記載のプレキャストゲル。

本発明のゲル用組成物を用いて製造された架橋（メタ）アクリルアミドを含む電気泳動ゲルは、高分子量化合物に対する分離能、機械的強度、取扱性のいずれもが優れる。

実施例５、実施例６、比較例３で製造したゲルを用いたＰＡＧＥのＲｆ値を示すグラフ。 実施例５、実施例６、比較例３で製造したゲルを用いたＰＡＧＥの泳動パターンとその解析結果。 実施例１５、比較例１２のゲルを用いたＰＡＧＥの泳動パターン。図３（ａ）は実施例１５のゲルを示す。図３（ｂ）は比較例１２のゲルを示す。 実施例１５、比較例１２のゲルを用いたＰＡＧＥのＲｆ値を示すグラフ。 実施例１６、比較例１３のゲルを用いた二次元ＰＡＧＥの泳動パターン。図５（ａ）は実施例１６のゲルを示す。図５（ｂ）は比較例１３のゲルを示す。代表的なスポットを点線で囲んでいる。

［ゲル用組成物］ 本発明のゲル用組成物は、（メタ）アクリルアミド系モノマーと、特定の架橋剤を含む。

［（メタ）アクリルアミド系モノマー］ 本発明において「（メタ）アクリルアミド」はメタアクリルアミド（メタクリルアミド）とアクリルアミドとの両方を意味する。上記（メタ）アクリルアミド系モノマーは、置換基を有する（メタ）アクリルアミドと置換基を有さない（メタ）アクリルアミドの両方を意味する。このような（メタ）アクリルアミド系モノマーとしては、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ′−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ′−ジエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）（メタ）アクリルアミド、ジアセトン（メタ）アクリルアミド、Ｎ′−アクリロイルアミノプロパノール等を使用することができる。本発明で用いる（メタ）アクリルアミド系モノマーは、上記（メタ）アクリルアミド類から選ばれる１種以上を用いることができる。上記（メタ）アクリルアミド系モノマーとして好ましい化合物はアクリルアミドである。本発明では、好ましくは、アクリルアミドを主成分とする（メタ）アクリルアミド系モノマーを用いる。この場合、上記（メタ）アクリルアミド系モノマーを、その総量に対して７０重量％以上、好ましくは８０重量％以上、さらに好ましくは９０重量％以上のアクリルアミドと、残余の割合のアクリルアミド以外の（メタ）アクリルアミド類で構成する。本発明では、さらに好ましくは、アクリルアミドからなる（メタ）アクリルアミド系モノマーを使用する。

［架橋剤］ 上記架橋剤は、以下の式（１）で表され、１８２以上１５００以下、好ましくは２００以上１０００以下、さらに好ましくは２００以上７００以下の分子量を有する。

式（１），（２）における基：Ｂ，Ｒ１，Ｒ２と数：ｌ，ｍ，ｎ，ｐ，ｑ，ｒは以下のように定義される。Ｂは炭素数が１以上４以下の直鎖または分岐アルキレン基を表す。Ｒ１及びＲ２は水素原子（Ｈ）またはメチル基（ＣＨ_３）を表す。ｌ，ｍ，ｎはそれぞれ１，２，３から選ばれ、ｌ，ｍ，ｎは互いに異なっていてもよく、ｌ，ｍ，ｎのうちの２つが同一でもよく、ｌ，ｍ，ｎの全てが同一でもよく、１≦ｌ＋ｍ＋ｎである。ｐ，ｑ，ｒは０≦ｐ，０≦ｑ，０≦ｒ，０≦ｐ＋ｑ＋ｒである。好ましいｐ，ｑ，ｒは０≦ｐ，０≦ｑ，０≦ｒであって、さらに１≦ｐ＋ｑ＋ｒである。
上記基Ａは、好ましくは以下の式（３−１），（３−２），（３ー３）で表される。

式（３−１），（３−２），（３−３）中の基Ｂの定義は上述の通りである。式（３−１），（３−２），（３−３）で、繰り返し数ｓは、０≦ｓであり、式（３−１），（３−２），（３−３）で表される基Ａを有する上記架橋剤の分子量が１８２以上１５００以下、好ましくは２００以上１０００以下、さらに好ましくは２００以上７００以下の分子量を有するような値であれば、制限されない。本発明で用いる架橋剤として、以下の化合物：ＣＬ−１、ＣＬ−２が最も好ましい。

本発明では、上記架橋剤の２種以上を併用することができる。本発明のゲル組成物には、上記架橋剤に加えて例えばＢＩＳのような公知の架橋剤を追加することもできる。また、本発明のゲル用組成物の性能を損なわない限り、ゲルに通常用いられる添加剤を制限なく配合することができる。例えば、ゲルの強度や弾力性を調節するために、アガロースなどの増粘多糖類、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリメチルビニルエーテルなどの水溶性ポリマーを添加することができる。

本発明のゲル用組成物において、上記（メタ）アクリルアミド系モノマーと上記架橋剤との合計に対する上記架橋剤の割合は、通常１重量％以上３０重量％以下、好ましくは２重量％以上２５重量％以下、さらに好ましくは３重量％以上２０重量％以下とする。

本発明のゲル用組成物は、ゲル作製を容易にするために、高濃度の水溶液の形態をとることができる。このような水溶液状のゲル用組成物は一般に「ストック溶液」と呼ばれる。本発明のゲル用組成物をストック溶液として製造する場合には、（メタ）アクリルアミド系モノマーと上記架橋剤とを、これらの合計量がストック溶液の全量に対して、通常は１０重量％以上６０重量％以下、好ましくは１０重量％以上５０重量％以下、さらに好ましくは１０重量％以上４０重量％以下となるように、水に溶解する。この場合、本発明のゲル用組成物の一形態である上記ストック溶液は、ゲル製造直前に希釈される。ゲル製造直前の本発明のゲル組成物における（メタ）アクリルアミド系モノマーと上記架橋剤との合計量は、通常は１重量％以上４０重量％以下、好ましくは２重量％以上３０重量％以下、さらに好ましくは４重量％以上２５重量％以下の範囲にある。

本発明のゲル用組成物には、ゲル製造時に重合開始試薬を配合する。上記重合開始試薬としては、一般に重合開始剤，重合促進剤，触媒，ラジカル安定化剤などと呼ばれるゲル製造用試薬を制限なく使用することができる。典型的には、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）とＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）からなる重合開始剤が用いられる。リボフラビンなどの光重合開始剤を用いることもできる。上記重合開始試薬の濃度は常法に従う。

さらに本発明のゲル用組成物には、ゲルの使用形態に応じて公知の添加剤、例えば、中性緩衝剤などを配合することができる。

［架橋（メタ）アクリルアミドを含むゲル］本発明のゲルは、上記（メタ）アクリルアミド系モノマーを上記架橋剤と上記重合開始剤の存在下に水中で重合させて得られたものである。上記ゲルは、上記（メタ）アクリルアミド系モノマーに由来する繰り返し単位と、上記架橋剤に由来する単位とを有する、架橋（メタ）アクリルアミドを含み、上記架橋（メタ）アクリルアミドの分子鎖がマトリックスの水中に適度な間隙（ポア）を形成するように三次元の網のように分散している。

上記式（１），（２），（３−１），（３−２），（３−３）、化合物 （ＣＬ−１），（ＣＬ−２）が示すように、本発明で用いる架橋剤は末端基の構造が同一であって対称性が高く、親水性の鎖状構造：Ａを有する。このような構造によって、本発明のゲルでは（メタ）アクリルアミド分子鎖に架橋点が均一に生じ、上記架橋剤に由来する分子鎖が凝集することなく分布すると考えられる。すなわち、本発明のゲルでは、架橋（メタ）アクリルアミド分子鎖でできた目（ポアサイズ）の大きな網がゲル内に均一に分散していると考えられる。本発明のゲルのポアサイズは従来のアクリルアミドゲルに比べて大きくかつ均一で、高分子量物質に対する優れた分離能を発揮する。ゲルを構成する上記架橋（メタ）アクリルアミドの全体構造を一般式や標準化された指標で定義することは困難であるが、本発明のゲルは、これを構成する架橋（メタ）アクリルアミドの全体構造の点で、従来のゲルとは異なるものである。

本発明のゲルは、特に高分子量の物質を対象としたＰＡＧＥに有効である。本発明のゲルは、公知の電気泳動（ＰＡＧＥ）に用いる装置に制限なく使用することができる。

本発明のゲルとともに電気泳動槽に注入される緩衝液、ｐＨ調整剤、比重調整剤、界面活性剤は制限されない。これらは泳動させる物質や、泳動方法に応じて適宜選択される。例えば、ＤＮＡや蛋白質の混合物からなるサンプルから特定分子量画分を分離する場合には、アミン化合物や双性イオン化合物の組み合わせを含む緩衝液が使用される。この場合には界面活性剤やキレート化合物を添加してもよい。例えば、トリス−ほう酸−ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＢＥ）、トリス−リン酸−ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＰＥ）などのＰＡＧＥ用緩衝液を使用することができる。

［プレキャストゲル］ 本発明のゲルは、各種電気泳動装置に応じて予め成形されたプレキャストゲルとして使用することができる。本発明のプレキャストゲルの濃度や形状は、分離対象や分析目的、電気泳動装置の種類に応じて、様々に調整することができる。本発明のプレキャストゲルを量産タイプとすれば、各種電気泳動装置を用いた分離・分析精度の均一化、再現性の向上、作業コストの低減が期待できる。

［材料・装置］ 以下の材料と装置、条件を用いた。＊は比較用の材料である。

（ゲル作成用材料）
・アクリルアミド
・架橋剤：ＣＬ−１（分子量３２８）（表１に示す化合物）
・架橋剤：ＣＬ−２（分子量２８２）（表１に示す化合物）
・架橋剤＊：ＢＩＳ（Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド，分子量１５４）（表１に示す化合物）
・中性ゲル緩衝液：アトー社製ＥｚＧｅｌＡｃｅ，ＷＳＥ−７３１０
・重合開始剤：０．０５％ＡＰＳ及び０．０５％ＴＥＭＥＤ
（電気泳動用薬剤、装置）
・ゲル作成用泳動プレートの厚み：１ｍｍ
・泳動用緩衝液：２５ｍＭトリス−１９２ｍＭグリシン−０．１％ＳＤＳ
・泳動装置：アトー社製 ラピダス・ミニスラブ電気泳動槽 ＡＥ−６５３０
・電気泳動用電源：アトー社製 ＰｏｗｅｒＳｔａｔｉｏｎ ＧｈｉｂｌｉＩ ＷＳＥ−３１００
・泳動条件：３００Ｖ定電圧、通電時間３５分
（分子量マーカー）
・アトー社製 ＥｚＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ ＷＳＥ−７０２０
・アトー社製 ＥｚＳｔａｎｄａｒｄ ＡＥ−１４４０
・Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 社製 ＨｉＭａｒｋ^ＴＭ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ ＬＣ５６８８
・アトー社製 ＥｚＡｐｐｌｙ ＡＥ−１４３０ により調製したニワトリ筋抽出液
・ＨｅＬａ細胞抽出液
（染色剤）
・アトー社製 ＥｚＳｔａｉｎ ＡＱｕａ ＡＥ−１３４０
（ＤＮＡ泳動用）
・アトー社製ＤＮＡラダーマーカー ＥｚＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ ＷＳＥ−７０３０
・ＤＮＡ断片Φ１７４／ＨｉｎｃＩＩ
・ＤＮＡ断片λ／ＨｉｎｄＩＩＩ
・泳動用緩衝液：２５ｍＭトリス−１４４ｍＭグリシンバッファー
・泳動条件：２０ｍＡ定電流
・アトー社製 蛍光試薬ＥｚＦｌｕｏｒｏＳｔａｉｎ ＤＮＡ ＷＳＥ−７１３０
（等電点・二次元目泳動用）
・ＨｅＬａ細胞抽出液
・泳動装置：アトー社製 等電点電気泳動装置 ＤｉｓｃＲｕｎ Ａｃｅ ＷＳＥ−１５１０
・アトー社製 ５〜２０％濃度勾配ゲル Ｅ−Ｄ５２０Ｌ
（染色剤）
・アトー社製 ＥｚＳｔａｉｎ ＡＱｕａ ＡＥ−１３４０
（泳動ゲル撮影装置）
・アトー社製 撮影装置ＬｕｍｉｎｏＧｒａｐｈＩＩＩ ＷＳＥ−６３００

［相対移動度Ｒｆ（％）］ 電気泳動後のゲルのスキャナー画像をアトー社製ＣＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ で解析した。相対移動度Ｒｆ（％）を以下の式で求めた。
Ｒｆ（％）＝（ゲル上端から各バンドまでの距離）÷（ゲル上端から泳動先端までの距離）×１００
［ゲル用組成物（ストック溶液）の製造］ 上記材料を表２に示すように配合し、ストック溶液としてゲル用組成物（ストック溶液）を製造した。表２に示す、本発明のゲル用組成物（ストック溶液）（実施例１〜４）と比較用のゲル用組成物（ストック溶液）（比較例１，２）が得られた。表２で、「濃度Ｔｓ」は、ストック溶液全量に対するモノマーと架橋剤との合計量の割合を示す。表２で、「濃度Ｃ」は、モノマーと架橋剤との合計量に対する架橋剤の割合を示す。表２で、「Ｍ／ＣＬ（モル比）」はストック溶液に含まれるモノマーと架橋剤の量比（モノマーのモル数÷架橋剤のモル数）を表す。

［ゲル用組成物（重合直前）の製造］ 表２に示すストック溶液Ｓ１，Ｓ３，Ｓ１＊に、上述の中性ゲル緩衝液、重合開始剤を添加して重合直前のゲル用組成物を作製した。表３に示す重合直前のゲル用組成物（実施例５，実施例６，比較例３）が得られた。表３において、「濃度Ｔｍｃ」は、重合直前のゲル用組成物に含まれるモノマーと架橋剤との合計量の割合を示す。表３において、「濃度Ｃ」はモノマーと架橋剤との合計量に対する架橋剤の割合を示し、ストック溶液の濃度Ｃが維持されている。

［ゲルの製造］ 得られた重合直前のゲル用組成物のモノマーを架橋剤の存在下に重合（ゲル化）した。表３に示す、本発明のゲル（実施例５、実施例６）と比較用のゲル（比較例３）が得られた。表３において、「濃度Ｔｐ」は、得られたゲルに含まれる架橋ポリアクリルアミドの割合を示し、上記濃度Ｔｍｃが維持されている。表３において、「濃度ｃ」はモノマーと架橋剤との合計量に対する架橋剤の割合を示し、ストック溶液の濃度Ｃが維持されている。

［電気泳動］ 得られたゲル、上記装置、材料、条件を用いて、上記分子量マーカーを電気泳動した。マーカーの分子量に対する相対移動度（Ｒｆ）を表３に示す。表３の濃度Ｔｐはゲル全量に対するモノマーと架橋剤との合計量の割合を示す。表３の濃度Ｃはモノマーと架橋剤との合計量に対する架橋剤の割合であり、ストック溶液（表１）に記載した濃度Ｃに等しい。ストック溶液に含まれるモノマーと架橋剤のモル比はゲル組成物でも維持される（モノマー：架橋剤（モル）＝８１：１）。図１に、実施例５、実施例６、比較例３のＲｆ値をグラフで示した。

［分離能］ 表３と図１に示されるように、分子量１００ｋＤａ以上の泳動物質に対するＲｆ値は、実施例５、実施例６の値の方が比較例３の値よりも大きい。特に実施例５では分子量１４０ｋＤａ以上の泳動物質に対する分離能が高いことが理解できる。

同じゲルのニワトリ筋抽出液サンプルレーンの泳動パターンを画像解析ソフトで解析した。図２に、２４５ｋＤａ付近（ミオシンバンド）のプロファイルを示す。図２（ａ）は解析に使用したレーンの泳動パターンであり、レーン１＊は比較例３、レーン２は実施例５、レーン３は実施例６のゲルを示す。図２（ｂ）に示されるように、実施例５（架橋剤ＣＬ−１を使用）と実施例６（架橋剤ＣＬ−２を使用）のいずれもが、比較例３（架橋剤ＢＩＳを使用）よりもピーク幅が狭くシャープである。すなわち、実施例５と実施例６では泳動バンドがより明瞭である。このことから、本発明のゲルを用いたＰＡＧＥでは高分子量サンプルを精密に分離できることが分かる。

［引張強度（Ｍ／ＣＬ：８１，Ｔｐ：６％）の測定］ 実施例５、実施例６、比較例３のゲルから縦４０ｍｍ×横３０ｍｍの試験片を切り出し、引張強度を測定した。ＴＡインスツルメンツ社製動的粘弾性試験機ＲＳＡ−Ｇ２を用いた。試験は移動速度：１ｍｍ／分で行った。３サンプルの測定値の平均値を求めた。表３に、得られた引張破壊応力（ｋＰａ）と引張破壊歪み（％）を表３に示す。表３に示すように、比較例のゲルは実施例に比べて引張強度が劣る。

さらに、実施例５、実施例６、比較例３のゲルの硬度を測定した。アスカー社製ゴム硬度計を使用した。表３にそれぞれのゲルの最大針押圧力（ｍＮ）を示す。表３に示すように、比較例のゲルは実施例のゲルに比べて硬い。

これらの結果から、架橋剤としてＣＬ−１あるいはＣＬ−２を用いた架橋ポリアクリルアミドを含む本発明のゲルは、従来の架橋剤としてＢＩＳを用いた架橋ポリアクリルアミドを含むゲルよりも、引張力に対して強靭で高弾性であることが分かる。このような本発明のゲルは、保存、輸送、使用の際の破損のリスクが低く、品質安定性と取扱性に優れると言える。ゆえに本発明のゲルは、電気泳動用プレキャストゲルとして適している。

［引張強度（Ｍ／ＣＬ：８１，Ｔｐ：５％〜１０％）の測定］ 実施例５、実施例６、比較例３のゲル作製方法に従い、架橋剤濃度（Ｍ／ＣＬ）を８１に維持して架橋ポリアクリルアミド濃度（Ｔｐ）が異なるゲルを作製した。得られたゲルについて、上記方法に従い引張破壊応力と引張破壊歪みを測定した。結果を表４と表５に示す。表４の実施例８（Ｔｐ：６％）は、表３に示す実施例５と同じものである。表５の比較例５（Ｔｐ：６％）は、表３に示す比較例３と同じものである。表４，表５に示されるように、ゲルに含まれる架橋ポリアクリルアミドの濃度（Ｔｐ）の高低に関わらず、実施例７〜１０のゲルは比較例４〜７のゲルに比べて引張強度が優れる。

［引張強度（Ｍ／ＣＬ：６３，Ｔｐ：５％〜１０％）］ 表２に示すストック溶液Ｓ２，Ｓ４，Ｓ２＊を用いて、上述のゲルと同様の方法で、架橋剤濃度（Ｍ／ＣＬ）を６３に変更して架橋ポリアクリルアミド濃度（Ｔｐ）が異なるゲルを作製した。得られたゲルについて、上記方法に従い引張破壊応力と引張破壊歪みを測定した。結果を表６と表７に示す。表６，表７に示されるように、架橋剤濃度（Ｍ／ＣＬ）が６３の場合でも、ゲルに含まれる架橋ポリアクリルアミドの濃度（Ｔｐ）の高低に関わらず、実施例１１〜１４のゲルは比較例８〜１１に比べて引張強度が優れる。このような結果からも、本発明のゲルがプレキャストゲルとして有効であると言える。

［ゲルの機械的強度］ このように、架橋剤としてＣＬ−１あるいはＣＬ−２を用いた架橋ポリアクリルアミドを含む本発明のゲルは、従来の架橋剤としてＢＩＳを用いた架橋ポリアクリルアミドを含むゲルよりも、強靭で高弾性であることが分かる。このような本発明のゲルは、使用中の破損のリスクが低く、取扱性に優れると言える。この結果も、本発明のゲルがプレキャストゲルとして有効であることを示している。

［保存安定性（４℃）］ 実施例５と比較例３で作製したゲルを４℃で長期保存した場合の引張破壊応力（ｋＰａ）と引張破壊歪み（％）を表８に示す。表８に示すように、４℃で１８０日間保存した状態でも本発明のゲルは比較例のゲルに比べて優れた引張強度を示す。この結果も、本発明のゲルがプレキャストゲルとして有効であることを示している。

［保存安定性（３７℃）］ 実施例５と比較例３で作製したゲルを３７℃に加温した状態で保存した場合の引張破壊応力（ｋＰａ）と引張破壊歪み（％）を表９に示す。表９に示すように、３７℃に加温した状態で１４日保存した時点で、実施例５で製造したゲルの引張強度は維持されているか、あるいは、むしろ向上している。これに対して、比較例３で製造したゲルの引張強度は低下傾向にある。この結果も、本発明のゲルがプレキャストゲルとして有効であることを示している。

［保存安定性の評価］ ３７℃で１日保存したゲルが受ける熱履歴は、４℃で約１ヶ月保存した場合に相当すると言われている。すると、本発明のゲルは４℃程度の低温下であれば、１年以上の間、機械的強度を損なうことなく保存することができると言える。このような本発明のゲルは、プレキャストゲルとして、使用前に長期保存することができる。

［ＤＮＡ分離能］ ストック溶液Ｓ１、Ｓ１＊を用いて、上述の手順に従い、濃度Ｔｐが７．５％、Ｍ／ＣＬ（モル比）が８１のゲル（実施例１５，比較例１２）を作製した。得られたゲルと、上記ＤＮＡ泳動用材料、装置を用いてＰＡＧＥを行なった。図３に、泳動後のゲルを示す。図３（ａ）は実施例１５のゲルを示す。図３（ｂ）は比較例１２のゲルを示す。図４に、泳動後のゲルから算出したＲｆを示す。図３、図４から、塩基対数（ｂｐ）が５００前後のＤＮＡマーカーのＲｆは実施例１５の方が大きいことがわかる。このことから本発明のゲルはＤＮＡのＰＡＧＥにも有効であり、かつ、より大型のＤＮＡ断片に対する分離能に優れると言える。

［二次元電気泳動］ ストック溶液Ｓ２、Ｓ２＊を用いて、濃度Ｔｐが４％、Ｍ／ＣＬ（モル比）が６３のゲル（実施例１６，比較例１３）を製造した。得られたゲルと上記等電点泳動用材料、装置を用いて、常法に従いＯ’Ｆａｒｒｅｌｌの二次元電気泳動を行った。図５に結果を示す。図５（ａ）は実施例１６、図５（ｂ）は比較例１３の結果を示す。矢印は泳動方向を表す。図５から、実施例１６のゲルでは高分子領域に対応するより多くのスポットが出現していることが分かる。また実施例１６のゲルのスポットはより集束した形状を示している。このことから、本発明のゲルは二次元電気泳動の分離精度をさらに向上すると期待される。

本発明のゲル用組成物を用いて製造したゲルはＰＡＧＥに有用であり、鮮明な泳動パターンを示す。本発明のゲル用組成物を用いて製造したゲルは、特に高分子量のたんぱく質やＤＮＡなどの分離能に優れる。さらに、本発明のゲル用組成物を用いて製造したゲルは、濃度に関わらず強靭で弾力性に優れ、作業時の破損が起こりにくい。しかも、本発明のゲル用組成物を用いて製造したゲルは長期保存安定性にも優れる。したがって、本発明のゲルはプレキャストゲルとして有用である。本発明のゲル用組成物を用いて製造したゲルは、従来のＰＡＧＥ用架橋ポリアクリルアミドゲルに比べて格段に性能が向上している。本発明のゲル用組成物、ゲル、プレキャストゲルを使用することによって、ＰＡＧＥの利用範囲の拡大、ＰＡＧＥを用いた分析精度の向上、ＰＡＧＥの作業性向上、ＰＡＧＥの作業効率化とコスト低減が可能となる。

１ 比較例３のレーン
２ 実施例５のレーン
３ 実施例６のレーン
４ 実施例１６のスポットの例
５ 比較例１３のスポットの例

Claims (6)

1. 置換基を有するか又は有さない（メタ）アクリルアミドから選ばれる少なくとも１種以上の（メタ）アクリルアミド系モノマーと、以下の式（１）で表される分子量が１８２以上１５００以下の架橋剤を含む、ゲル用組成物。
   

   

   （Ｂは炭素数が１以上４以下の直鎖または分岐アルキレン基を表す。Ｒ１及びＲ２は水素原子（Ｈ）またはメチル基（ＣＨ_３）を表す。ｌ，ｍ，ｎはそれぞれ１，２，３から選ばれ、ｌ，ｍ，ｎは互いに異なっていてもよく、ｌ，ｍ，ｎのうちの２つが同一でもよく、ｌ，ｍ，ｎの全てが同一でもよく、１≦ｌ＋ｍ＋ｎである。ｐ，ｑ，ｒは０≦ｐ，０≦ｑ，０≦ｒ，０≦ｐ＋ｑ＋ｒである。）
2. 上記架橋剤が以下の化合物ＣＬ−１及び／又はＣＬ−２から選ばれる少なくとも１以上である、請求項１に記載のゲル用組成物。
   

   
3. 置換基を有するか又は有さない（メタ）アクリルアミドから選ばれる少なくとも１種以上の（メタ）アクリルアミド系モノマーに由来する繰り返し単位と、以下の式（１）で表される分子量が１８２以上１５００以下の架橋剤に由来する単位とを有する、架橋（メタ）アクリルアミドを含む、ゲル。
   

   

   （Ｂは炭素数が１以上４以下の直鎖または分岐アルキレン基を表す。Ｒ１及びＲ２は水素原子（Ｈ）またはメチル基（ＣＨ_３）を表す。ｌ，ｍ，ｎはそれぞれ１，２，３から選ばれ、ｌ，ｍ，ｎは互いに異なっていてもよく、ｌ，ｍ，ｎのうちの２つが同一でもよく、ｌ，ｍ，ｎの全てが同一でもよく、１≦ｌ＋ｍ＋ｎである。ｐ，ｑ，ｒは０≦ｐ，０≦ｑ，０≦ｒ，０≦ｐ＋ｑ＋ｒである。）
4. 上記架橋剤が以下の化合物ＣＬ−１及び／又はＣＬ−２から選ばれる少なくとも１以上である、請求項３に記載のゲル。
   

   

   
   
5. 置換基を有するか又は有さない（メタ）アクリルアミドから選ばれる少なくとも１種以上の（メタ）アクリルアミド系モノマーに由来する繰り返し単位と、以下の式（１）で表される分子量が１８２以上１５００以下の架橋剤に由来する単位とを有する、架橋（メタ）アクリルアミドを含む、ゲル
   からなるプレキャストゲル。
   

   

   （Ｂは炭素数が１以上４以下の直鎖または分岐アルキレン基を表す。Ｒ１及びＲ２は水素原子（Ｈ）またはメチル基（ＣＨ_３）を表す。ｌ，ｍ，ｎはそれぞれ１，２，３から選ばれ、ｌ，ｍ，ｎは互いに異なっていてもよく、ｌ，ｍ，ｎのうちの２つが同一でもよく、ｌ，ｍ，ｎの全てが同一でもよく、１≦ｌ＋ｍ＋ｎである。ｐ，ｑ，ｒは０≦ｐ，０≦ｑ，０≦ｒ，０≦ｐ＋ｑ＋ｒである。）
6. 上記架橋剤が以下の化合物ＣＬ−１及び／又はＣＬ−２から選ばれる少なくとも１以上である、請求項５に記載のプレキャストゲル。
   

   

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