JP2584213B2 - フラジエリンをコ−ドするｄｎａおよび該ｄｎａを有するベクタ− - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はフラジェリンをコードする遺伝子、およびフ
ラジェリンをコードする遺伝子またはその一部を有する
排出ベクターに関する。

従来の技術 近年の遺伝子工学の発展により、目的のペプチドをコ
ードする遺伝子をベクターに組込み、大腸菌などの細菌
に導入して該ペプチドを大量に得ることは容易な技術と
なりつつある。しかし一般に発現したペプチドは細胞内
に蓄積されるため、生成された蛋白質が細胞の成育増殖
を阻害したり、過剰に生成されると負のフィードバック
によって生産性が抑制されることがある。また、目的の
蛋白質を採集するためには、まず細胞を採集破壊し、該
細胞破壊物から目的の蛋白質を精製しなければならな
い。この細胞破壊物中には多くの不純物が含まれ、その
一部は人体に有害であり、そこから純粋な目的の蛋白質
を得ることは必ずしも容易なことではない。

細胞膜を構成する蛋白質や分泌蛋白質などは、その一
端に細胞内外の膜を通過するために必要なアミノ酸配列
シグナルペプチドを持つ前駆体ポリペプチドとして合成
され、膜通過の際に膜に存在するペプチダーゼによりシ
グナルペプチド部分は切断され、本来の蛋白質分子とな
りその活性および機能を発揮する。

細胞内に蓄積された目的のペプチドを精製する困難さ
を解決し、目的の蛋白質の生産性を向上させるため、上
記の生体の分泌システムを利用して、目的のペプチドを
細胞外に分泌させようとする試みがなされてきた。例え
ば、バチルス・ズブチリスのα−アミラーゼプロモータ
ーおよびシグナル配列を有する分泌ベクターによる、大
腸菌β−ラクタマーゼの分泌（ザ・ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー（J.Biochem.）95,87−93（198
4））、同ベクターシステムによるマウスIFN−βの分泌
（ジーン（Gene）34,1−８（1985））、大腸菌のアルカ
リフォスファターゼプロモーターおよびシグナル配列を
有する分泌ベクターによるヒトIFN−αの分泌生産（ザ
・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J.Bioche
m.）97,1429−1436（1985））、などが挙げられる。

また、細胞内で合成された蛋白質が細胞外に出るメカ
ニズムとしては上記の分泌システムだけでなく排出（ex
cretion）システムが知られている。例えば、大腸菌の
鞭毛を構成するフラジェリンなどがこの排出システムに
よって菌体外に排出される。排出システムは、分泌と異
なり、合成されたペプチドはシグナルペプチドを有さ
ず、ペプチターゼによって切断されることなく、そのま
ま菌体外に排出されて機能を発揮する（ザ・ジャーナル
・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）159,1056−
1059（1984））。大腸菌のフラジェリンをコードする遺
伝子はhag遺伝子と呼ばれ、既にpBR322やλ−ファージ
にクローニングされており（日本遺伝子学会第57回大会
プログラム・予行集、p63（1985）、ザ・ジャーナル・
オブ・バクテリオロジー（J.Bactreial.）130,736−745
（1977））、そのDNA配列の一部は既に解析されている
（ザ・ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bactre
ial.）155,74−81（1983））が未だ全配列は決定されて
いない。

発明が解決しようとする問題点 従来の分泌ベクターは、その種類によって分泌される
ペプチドは制限される。すなわち、一定のプロモーター
およびシグナル配列に、いかなる目的のペプチドをコー
ドするDNAを組み込んでも分泌されるというものではな
く、分泌されうるペプチドは一定のものであり、分泌ベ
クターに組み込んでも分泌されないペプチドは数多い。

大腸菌のフラジェリンをコードするhag遺伝子はクロ
ーニングされ、その構造の一部は明らかに成っているも
のの、その全構造は未だ不明である。またフラジェリン
の排出機構が目的の蛋白質の菌体外生産に利用可能であ
ることは全く示唆されておらず、hag遺伝子を有する排
出ベクターも全く構築されていなかった。hag遺伝子の
全DNA配列が解明されれば、そのような排出ベクターの
構築もより容易になると考えられる。

また、分泌ベクターによって目的の蛋白質が培地中に
分泌されても、培地からの精製はなお容易ではないが、
フラジェリンとの雑種蛋白質として排出し鞭毛を形成さ
せて不溶性にすれば、培地からの採集はより簡単なもの
となる。

問題点を解決するための手段 本発明者等は、目的のペプチドを菌体外に産生させる
システムに関してフラジェリンの排出機構に着目し、フ
ラジェリンをコードするhag遺伝子の全塩基配列を決定
し、ベクターに組み込み、該hag遺伝子を切断または一
部を欠損させ、その間にリンカーDNAを挿入した。該リ
ンカーに外来の蛋白質をコードするDNAを挿入したとこ
ろ、該蛋白質がフラジェリンとの雑種蛋白質として菌体
外に排出されることを見出した。排出された雑種蛋白質
は一定の条件下では鞭毛を形成し、採集がより容易にな
る。また分泌システムによっては菌体外に産生できなか
った外来のペプチドを排出できる可能性を有する。

従って、本発明は具体的には、大腸菌のフラジェリン
を実質的にコードしているDNA配列であって、第１図に
示される塩基配列の583位〜1143位が欠損しており、そ
の欠損部分に所望の配列が挿入されていることある、以
下に記載のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列に置
換、欠損、付加を含むアミノ酸配列変異体であってその
アミノ酸配列と同等の機能を有するアミノ酸配列変異
体、をコードするDNA配列；そのDNA配列を有するベクタ
ー；およびそのベクターを利用する目的ペプチドの生産
方法に関する： ［式中、−Ｘ−は、単結合、１つまたはそれ以上のリン
カーに相当する部分、またはリンカー内に挿入された目
的のペプチドのアミノ酸配列である］。

フラジェリンをコードするDNAは、大腸菌、枯草菌、
ネズミチフス菌、プロテウス属の細菌など鞭毛を有する
全ての細菌から調製し得る。例えば大腸菌のフラジェリ
ンをコードするhag遺伝子は近藤等の方法（ザ・ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bactreial.）130,73
6−745（1977））によって得られるが、既にpBR322やλ
−ファージにクローニングされたhag遺伝子を用いても
よい。

以下hag遺伝子を例に挙げて本発明を説明するが、本
発明においてはフラジェリンをコードするDNAであれば
よく、hag遺伝子に限定されるものではない。

hag遺伝子を有するファージやプラスミドは、hag遺伝
子が欠損し鞭毛を形成できない菌株に導入し、その遊走
性によってスクリーニングする。hag遺伝子欠損株は近
藤等の方法（ジェネティックス（Genetics）84,403〜42
1（1976））によって調製できるし、該方法によって得
られたW3623Hfla−am76株を用いてもよい。また、hag遺
伝子内に異種DNAを挿入した場合には、大腸菌Ｋ−12 C6
00r^-m^-hag::Tn10株または染色体のhag遺伝子内にカナマ
イシン耐性遺伝子が挿入されて鞭毛を形成できない大腸
菌Ｋ−12 JA11（微工研菌寄第8853号）を使用し得る。
本発明の実施例に於てはＫ−12C600r^-m^-hag::Tn10株を
用いたが、本発明を追試する際には微工研に寄託されて
いるＫ−12 JA11株を用いるのが便利である。以下の参
考例に示すように本発明のベクターはＫ−12 JA11株に
於ても不都合無く使用し得る。

完全なhag遺伝子が導入された株は遊走性を示すよう
になるので、遊走性を示した菌株から再びhag遺伝子を
有するDNAを調製する。即ち、該菌株を大量に培養し、
通常の遠心操作、除蛋白、エタノール沈澱などによっ
て、完全なhag遺伝子を有するDNAを精製する。

得られたDNAからhag遺伝子を有するDNA断片を適当な
制限酵素で切断し、適当なベクターに挿入する。用いら
れる制限酵素はhag遺伝子を運搬するDNA配列によって異
なるが、hag遺伝子を切断せず、不要なDNA部分をできる
だけ切断するものが好ましい。適当なベクターとして
は、pNO1523、pSC101、pRK353、pRK646、pRK248、pDF4
1、ColE1、pVH51、pAC105、RSF2124、pCR1、pMB9、pBR3
13、pBR322、pBR324、pBR325、pBR327、pBR328、pKY228
9、pKY2700、pKN80、pKC7、pKB111、pKB158、pKH47、pH
SV−106、pKK233−３、pMK2004、pACYC1、pACYC184、pU
C8、pUC9、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pAT153、pUR2
22、pBT1−１、pJDB207、Homer111、pHSV−106、ptac1
2、ptrpL1、pSV−neo、cloDF13、R6K、Ｆ、RI、R6、Ent
p307、pC194、pE194,pSA0501、pUB110、pT127などのプ
ラスミドベクターおよびM13、λgt.λｃ、λgt.λＢ、
λWESλＣ、λWES.λＢ、λZJvir.λＢ′、λALO.λ
Ｂ、λWES.T_s622などのファージベクターおよびこれら
から構築されるベクターが挙げられるが、これらに限定
されるものではなく、hag遺伝子を運搬し、宿主に導入
できるベクターであれば良い。また、得られたhag遺伝
子を運搬するベクターはhag遺伝子を損なうことなくミ
ニ化してもよいし、hag遺伝子部分を他の適当なベクタ
ーに移し替えてもよい。

得られた上記ベクターを常法に従って精製しhag遺伝
子の全塩基配列を決定した。塩基配列の決定は従来のマ
キサム・ギルバート法やジデオキシヌクレオチド鎖終止
法に従えばよい。hag遺伝子の全塩基配列は第１図に示
すとおりである。塩基配列から推定されるアミノ酸配列
を第１図中塩基配列の下に示す。

ただし、本発明は第１図の塩基配列に限定されるもの
ではなく、第１図に示されるアミノ酸配列または同等の
排出作用を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列も
本発明の範囲内である。

大腸菌のフラジェリン蛋白質のＮおよびＣ末端のアミ
ノ酸配列を分析したところ、Ｎ末端はAla−Gln−であり
Ｃ末端はGlyであり、塩基配列から推定されるアミノ酸
配列と一致する。またアミノ酸組成比の実験値も塩基配
列から推定される理論値と良く一致した。

排出ベクターとしての取扱をより容易にするために、
得られたベクターのhag遺伝子内に適当なリンカーを単
数または複数個挿入する。該リンカーは適当な制限酵素
切断点を与えフラジェリンの分泌機能を損なわないもの
であればよく、好ましくは該ベクター内に少数の制限酵
素切断点を、更に好ましくは唯一の制限酵素切断点を与
えるものがよい。例えば、hag遺伝子をpBR322に組み込
んでいる場合には、Hind III、Avr II、Bcl I、BstE I
I、Bal II、Hpa I、Kpn I、Sac I、Sac II、Sma I、Sst
I、Sst II、Xba I、Xho I、Xma Iなどの切断点を有す
るリンカーを挿入すればよい。このようなリンカーの挿
入によって外来遺伝子を容易に挿入できるようになる。

hag遺伝子は、フラジェリン蛋白質の排出に不要な部
分を欠損させて、その一部を排出ベクターに利用する事
ができる。hag遺伝子が発現するフラジェリンは中央部
が欠損しても排出されることが判明した。即ち、中央部
分が欠損したhag遺伝子を有するベクターを、上記のよ
うな鞭毛を形成しない菌株に導入すれば、その菌株は鞭
毛を形成し、遊走する。また、中央部の欠損部位にリン
カーを挿入し、該リンカー内に異種DNAを挿入しても鞭
毛を形成させることができ、異種タンパク質を菌体外へ
排出させることができる。

hag遺伝子中央部は、フラジェリンの抗原性を示すペ
プチド部分をコードしているので、該中央部の欠損は鞭
毛の抗原性が変化することにより確認できる。本発明に
於ては、hag遺伝子を有するベクターをランダムに切断
し、該切断点よりDNAを消化した後、リンカーを加え結
合し再び環化し大腸菌に導入して、抗鞭毛抗体を含む培
地上で遊走できる、即ち鞭毛抗原性が変化した大腸菌が
有するベクターを得た。該ベクターは、hag遺伝子中央
部が欠損しリンカーが挿入されており、かつ大腸菌に鞭
毛形成能を与える。この工程のDNAの切断および消化は
ランダムであり、同様の性質を有するが異なる数種のベ
クターを得る事ができた。同工程を追試すれば、切断点
および該切断点から消化される塩基数が異なる、即ちha
g遺伝子中の欠損部が異なる様々なベクターが得られる
ことは当業者には容易に類推できる。従って、本発明は
実施例に記載された数種のベクターに限定されるもので
はなく、上記の工程によって得られるベクターはもちろ
んのこと、上記の性質を有するベクターは全て本発明に
含まれる。本発明によれば、第９図に示されるhag遺伝
子塩基配列の583位〜1143位（561塩基対）を欠損させ、
18merのリンカーを挿入したベクターでさえもなお、上
記の性質を有した。

また、鞭毛形成を必要とせず、雑種タンパク質の菌体
外への排出のみを要するのであれば、更に該ベクターの
hag遺伝子内の欠損部位を拡大することが可能である。

本発明のベクターに更にpHD1変異（実施例参照）を加
えれば大腸菌の鞭毛数が増加し有効である。

なお、本明細書中で用いられる略号の意味は以下の通
りである。

DNA:デオキシリボ核酸 cDNA:相補的DNA ccDNA:閉環状DNA RNA:リボ核酸 mRNA:メッセンジャーRNA A:アデニン T:チミン G:グアニン C:シトシン ATP:アデノシン三リン酸 TTP:チミジン三リン酸 GTP:グアノシン三リン酸 CTP:シチジン三リン酸 dATP:デオキシアデノシン三リン酸 dTTP:デオキシチミジン三リン酸 dGTP:デオキシグアノシン三リン酸 dCTP:デオキシシチジン三リン酸 ddATP:ジデオキシアデノシン三リン酸 ddTTP:ジデオキシチミジン三リン酸 ddGTP:ジデオキシグアノシン三リン酸 ddCTP:ジデオキシシチジン三リン酸 DTT:ジチオスレイトール AlaまたはA:アラニン ArgまたはR:アルギニン AsnまたはN:アスパラギン AspまたはD:アスパラギン酸 CysまたはC:システイン GlnまたはQ:グルタミン GluまたはE:グルタミン酸 GlyまたはG:グリシン HisまたはH:ヒスチジン IleまたはI:イソロイシン LeuまたはL:ロイシン LysまたはK:リジン MetまたはM:メチオニン PheまたはF:フェニルアラニン ProまたはP:プロリン SerまたはS:セリン ThrまたはT:スレオニン TrpまたはW:トリプトファン TyrまたはY:チロシン ValまたはV:バリン 実施例 hag遺伝子のpBR322への再クローニング （Ａ） hag遺伝子の形質導入ラムダフアージλpfla−H
2DNAの調製 （ａ）λpfla−H2フアージの同定 hag遺伝子が変異し鞭毛を形成しない大腸菌K12株のW3
623Hfla−am76株（微工研菌寄第8619号（FERM Ｐ−861
9）、寄託日1986年１月25日、ジエネテイツクス（Genet
ics）84,403−421（1976））をラムダフアージ用トリプ
トン培地（バクトトリプトン（デイフコ（DIFCO）社
製）１％、塩化ナトリウム0.25％、チアミン塩酸塩0.00
05％から成る、pH7.0（殺菌前））で一夜37℃で振盪培
養する。この培養液0.1mlに、大腸菌K12株のKH552株のh
ag遺伝子を含む遺伝子を運搬するλpfla−H2フアージ
（ジヤーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacterio
l.）130,736−745（1977））数100個を含むと思われる
0.1mlの上記トリプトン培地を加え、寒天を0.6％含む47
℃の上記トリプトン培地を3.0ml加え、寒天1.2％を含む
上記トリプトン平板培地に重層する。一夜37℃で培養す
ると数100個のプラークが形成された。

各プラークを滅菌したツマヨウジで突き、遊走検定用
培地（寒天0.3％を含む上記培地）に突き刺し、37℃で
７〜８時間培養する。hag遺伝子を完全に形質導入でき
るフアージの感染している株は直径３〜4cmの遊走域を
持つコロニーを形成する。このコロニーを生ずるプラー
クを形成している培地をひつくり返しフタにクロロホル
ムを数滴滴下し37℃で10分間放置して殺菌した。

（ｂ）λpfla−H2フアージの培養 該λpfla−H2フアージを滅菌したツマヨウジで0.1ml
の前記トリプトン培地に懸濁する。この懸濁液に、前記
トリプトン培地に終夜培養した大腸菌K12株のC600株0.1
mlを加え、46℃の0.6％寒天を含む前記トリプトン培地3
mlを加え、1.2％の寒天を含む前記トリプトン培地に重
層する。37℃で５〜６時間培養し、C600株がλpfla−H2
フアージによつてほとんど溶菌された直後に5mlの前記
トリプトン培地を加え、更に20〜30分培養する。数滴の
クロロホルムを加えた後、重層した0.6％軟寒天をくだ
き、後に加えた5mlの培地と共に遠心チユーブに移し、3
000回転で10分間遠心し上清を得る。上清にクロロホル
ム数滴を加え37℃で５分間培養し殺菌し、λpfla−H2フ
アージの種フアージ液を得る。前記トリプトン培地で種
フアージ液を10⁶〜10⁷倍希釈し、その0.05mlを、前記ト
リプトン培地で終夜培養したC600株0.1mlと混合し、46
℃の0.6％寒天を含む前記トリプトン培地3mlを加え、1.
2％寒天を含む前記トリプトン培地に重層する。１夜37
℃で培養し出現したプラーク数から1ml当りのフアージ
数を決定する。２×10⁷フアージを含む前記種フアージ
液の希釈液0.1mlと、マルトース0.2％を含む前記トリプ
トン培地で終夜培養したC600株培養液0.1mlを混ぜ、37
℃で10分間放置する。これに46℃の0.6％寒天を含む前
記トリプトン培地3mlを加え、1.2％の寒天を含む前記ト
リプトン培地に重層する。こうして重層した平板を50枚
作成した。37℃で５〜６時間培養し、C600株がλpfla−
H2フアージによつてほとんど溶菌された直後に5mlの前
記トリプトン培地を加え、更に20〜30分培養する。数滴
のクロロホルムを加えた後、重層した0.6％軟寒天をく
だき、後に加えた5mlの培地と共に遠心チユーブに移
し、3000回転で10分間遠心し上清を採集しフアージ培養
液約350mlを得た。

（ｃ）λpfla−H2フアージの精製 上記フアージ培養液を超遠心（25000ppm、４℃、90分
間ベツクマンL8−55超遠心機、＃30ローター）し、上清
を捨て、沈澱に少量のTM緩衝液（10mMトリス塩酸（pH8.
0）、10mM硫酸マグネシウム）を加える。この懸濁液1.3
ml当り塩化セシウムを４℃で飽和させたTM緩衝液1.7ml
を加え、超遠心（23000rpm、15℃、40時間、ベツクマン
L8−55超遠心機、SW41ローター）した。遠心チユーブの
ほぼ中央に集まつたフアージは肉眼で見える帯状となつ
たので、遠心チユーブの外から注射器で帯状の部分を抜
き（約1ml）、TE緩衝液（10mMトリス塩酸（pH8.0）、1m
Mエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（Na₂−EDTA）に対
して４℃で１夜透析した。

（ｄ）λpfla−H2DNAの調製 上記λpfla−H2フアージ懸濁液１容量に対し0.1容量
の10培SSC緩衝液（1.5M塩化ナトリウム、0.15Mクエン酸
ナトリウム）、0.02容量の0.5Mエチレンヂアミン四酢酸
ナトリウム（Na₂−EDTA）、0.01容量の20％ドデシル硫
酸ナトリウム（SDS）を加え10分間37℃に保温する。TE
緩衝液を飽和させたフエノールを等量加え、１分間に60
回転する回転式抽出機で30分間DNAのフエノール抽出を
行なう。その後遠心管に内容物を移し高速冷却遠心機で
遠心（8000rpm、20℃）し、上清を透析チユーブに移しT
E緩衝液に対して１夜透析する。透析内液をSW41ポリマ
ー遠心管（ベツクマン社）に移し、0.1容量の3M酢酸ナ
トリウムを加え、更に２容量の冷エチルアルコールを加
え−20℃で１夜放置する。ベツクマン社製L8−55超遠心
機により３万回転60分４℃で遠心し沈澱を集める。沈澱
はTE緩衝液400μｌに溶かし260nmの吸光度でDNAの定量
を行ない、約300μｇの精製λpfla−H2DNAを得た。

（Ｂ）λpfla−H2DNA上のhag遺伝子の位置の推定 （ａ）λpfla−H2DNAのEcoR I消化 λpfla−H2DNAをEcoR Iで消化する。50mMトリス塩酸
（pH7.5）、7mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウ
ム、7mM2−メルカプトエタノール、0.01％ウシ血清アル
ブミン、λpfla−H2DNA500ngを含む反応液20μｌを37℃
に予熱し、EcoR I（宝酒造）５単位/1μｌを加え30分間
37℃で反応させる。酵素反応停止液（50％グリセロー
ル、１％SDS、0.02％ブロムフエノールブルーの混液）
２μｌを添加し反応を停めた後、その反応液５μｌを電
気泳動用0.8％アガローススラブゲルにチヤージする。
水平式アガロースミニゲル電気泳動装置（マリソル株式
会社製）を使用し、トリス塩酸（pH8.1）40mM、酢酸ナ
トリウム5mM、Na₂−EDTA1mMを含む電気泳動緩衝液を用
いて、80Vの定電圧で30〜60分間泳動する。電気泳動
後、ゲルを0.5μg/mlの臭化エチジウムを含む上記緩衝
液に約10分浸漬し、紫外線ランプ（280nμ）を照射しDN
Aバンドを検出する。その結果λpfla−H2DNAはEcoR Iに
よつて21.3、17.0、5.82、3.54キロベース（Kb）の断片
に切断されることが判明した。同様にバクテリオフアー
ジλC₁857S7のDNA（宝酒造）をEcoR I消化すると、21.
3、5.82、3.54kbの断片は検出されるが、17.0kb断片は
検出されなかつた。よつて、hag遺伝子を含む大腸菌DNA
断片は17.0kb断片に含まれると推測された。

（ｂ）λpfla−H2DNAのSal Iによる消化 λpfla−H2DNA500ngを10mMトリス塩酸（pH7.5）、7mM
塩化マグネシウム、175mM塩化ナトリウム、0.2mMEDTA、
7mM2−メルカプトエタノール、0.01％ウシ血清アブルミ
ンから成る混液に加え、前項と同様にSal Iで消化し、
アガロースゲル電気泳動を行なつた。λpfla−H2DNAはS
al Iによつて32.7kbと15.3kbの断片に消化された。15.3
kb断片はλC1857δ7DNAのSal Iによる消化によつても生
じるため、hag遺伝子を含むDNA断片は32.7kbの断片に存
在すると推測された。

λplfa−H2における、前項−Ｂ−ａにおけるEcoR I
ならびに本項のSal Iによる消化結果とhag遺伝子を含む
大腸菌染色体由来のDNA断片の推定位置を第２図に示
す。

（Ｃ）ベクターpBR322へのクローニング λpfla−H2DNA2.5μｇを−Ｂ−ａと同様な方法で、
100μｌの反応混合液中でEcoR Iで消化する。続いて70
℃で５分間加熱し反応を停め、3M酢酸ナトリウム10μ
ｌ、冷エタノール220μｌを加え、−20℃で一夜放置す
る。遠心（ベツクマン社マイクロフユージ、10分間）後
上清を捨て沈殿を70μｌのTE緩衝液に溶解する。

得られたλpfla−H2DNAのEcoR I消化物に、−Ｂ−
ｂと同様に反応混合液とSal Iを加え（全量100μｌ）消
化する。反応終了後上記同様にエタノール沈殿を行ない
50μｌのTE緩衝液に溶解する。

他方、pBR322ccDNA（宝酒造）２μｇを含む、−Ｂ
−ａと同様に調製した反応液144μｌにEcoR I24単位/4
μｌ、Hind III16単位/2μｌを加え、37℃で30分間反応
させる。70℃で５分間加熱し反応を止め、エタノール沈
殿後、沈澱物を100μｌのTE緩衝液に溶解する。次いで
同様にSal Iで消化してエタノール沈殿後、沈殿物を40
μｌのTE緩衝液に溶解する。

2.5μｇのEcoR IとSal Iで消化したλpfla−H2DNAと2
50μｇのEcoR I、Sal IとHind IIIで消化したpBR322を
含むT4DNAリガーゼ反応液（66mMトリス塩酸（pH7.6）、
6.6mM塩化マグネシウム、10mMDTT、1mMATP）98μｌにT₄
DNAリガーゼ（宝酒造、Lot301）0.2単位/2μｌを加え、
22〜23℃で６時間反応させ、エタノール沈殿を行ない、
沈殿物を20μｌのTE緩衝液に溶解する。

コンピテントにしたW3623Hfla−am76株210μｌに、上
記DNA250ng/20μｌを混合し感染させる。バクトトリプ
トン１％（デイフコ社）、イーストエキストラクト0.
5、塩化ナトリウム0.5％を含むLB培地（pH7.0〜7.2）で
37℃１時間振盪培養を行なつた後、その0.1mlをアンピ
シリン0.005％と寒天1.5％を含むLB平板培地に均一に塗
沫する。37℃で一夜培養後、生育したアンピシリン耐性
株をアンピシリン0.005％を含む遊走検定用培地に接種
する。180コロニーの遊走性を検定したところ４コロニ
ーが遊走域を形成した。この４コロニーの１つをアンピ
シリン50μg/mlを含むLB寒天培地で２回純化しW3623Hfl
a−am76（pBR322/hag9）株を確立した。なお、W3623Hfl
a−am76（pBR322/hag9）は1986年１月25日より微生物工
業技術研究所に微工研菌寄第8620号（FERMP−8620）と
して寄託されている。

（Ｄ）組換えプラスミドpBR322/hag9の構造の検討 （ａ）pBR322/hag9 cc−DNAの精製 W3623Hfla−am76（pBR322/hag9）株をアンピシリン50
μg/mlを含むLB培地5mlに接種して37℃で一晩振盪培養
を行なう。この終夜培養液を、１のアンピシリン50μ
g/mlを含むLB培地に植え、一晩37℃で振盪培養を行な
い、遠心（5000rpm、４℃、10分）で集菌する。

溶液Ｉ（50mMグルコース、25mMトリス塩酸（pH8.
0）、10mM EDTA）を20ml加え懸濁後卵白リゾチーム（シ
グマ社製）を100mg粉末で加え溶解する。室温で10分間
放置し、時々よく混合する。40mlの溶液II（0.2N水酸化
ナトリウム、１％ドデシル硫酸ナトリウム）をゆつくり
加え混合後、氷中に10分間置く。続いて30mlの氷冷した
5M酢酸カリウム（pH4.8）を加え、氷中に10分間置く。
遠心（10000rpm、30分、４℃）してその上清を100ml容
メスシリンダーに回収して容量を測定した後、遠心チユ
ーブに移し0.6容量のイソプロパノールを加え混合後、
室温で15分間放置する。遠心（10000rpm、30分、15℃）
し上清を捨て、沈殿に70％エタノール140mlを加え遠心
（10000rpm、30分、４℃）後上清を捨てる。沈殿物を真
空デシケーター中でほぼ乾かしTE緩衝液にとかす。50ml
容メスシリンダーに移し30mlに容量をととのえ10％のラ
ウリルザルコシン酸ナトリウムを0.3ml加え、10mg/mlの
臭化エチジウム2mlを加え、33.915gの塩化セシウムを加
え溶解する。超遠心（36000rpm、15℃、40時間、ベツク
マン社L8−55超遠心機、VTi50ローター）後、紫外線ラ
ンプ下螢光バンドを確認し、２本のバンドのうち下方の
バンドを遠心管側面より注射器で抜く。次いで注射器の
内容物を超遠心（36000rpm、15℃、20時間、ベツクマン
L8−55超遠心機、VTi65ローター）する。前回同様紫外
線ランプ下で螢光を発する下方のバンドを注射器で抜
き、試験管に移す。塩化セシウムで飽和させたイソプロ
パノールで臭化エチジウムを抽出し（３回繰り返す）、
水層をTE緩衝液に対して一晩透析する。

透析後の試料をベツクマン社SW50.1ローター用チユー
ブに移し0.1容量の3M酢酸ソーダ、２容量のエタノール
を加え、混合後−20℃に一晩置く（エタノール沈殿）。

超遠心（30000rpm、４℃、30分間、ベツクマンL8−55
超遠心機、SW50.1ローター）し、上清を捨て真空デシケ
ーター中で軽く乾かし、TE緩衝液0.6mlを加え４℃で一
晩置く。RNase（シグマ社、96℃で10分間加熱する前処
理をしておく）を最終濃度10μg/mlになるように加え室
温で１時間置く。

次いでSW50.1ローター用チユーブに1M塩化ナトリウム
−TE緩衝液を4ml入れ、上記の試料を重層し、SW50.1ロ
ーターで40000rpm、６時間超遠心し、上清を捨て沈殿物
を0.2mlTE緩衝液に溶かす。その一部を希釈し、260mμ
の吸光度を測定しDNA濃度を算出する。

（ｂ）pBR322/hag9 cc−DNAのEcoR IならびにSal Iでの
消化 pBR322/hag9 cc−DNAを−Ｂ−ａ、−Ｂ−ｂと同
様にしてEcoR I、Sal I消化を行なう。消化物をアガロ
ースゲル電気泳動で分析し、cc−DNAが線状DNAに変化す
る事を認め、EcoR IならびにSal Iの切断個所はそれぞ
れ１ケ所であると判定した。次いでpBR322/hag9DNAを、
EcoR I消化後70℃で反応を停止させ、続いてSal Iで消
化した後、70℃で反応を停止させる。アガロースゲル電
気泳動法で消化物を検討したところ、約7.5kb、約3.7kb
の断片を認めた（DNAのサイズマーカーにはλCI857S7DN
AのHind III消化物を用いた）。前者はλpfla−H2DNAよ
り由来し、後者はpBR322より由来しているものである
（第３図）。

（ｃ）pBR322/hag9 cc−DNAの制限酵素BamH Iによる消
化 10mMトリス塩酸（pH8.0）、7mM塩化マグネシウム、10
0mM塩化ナトリウム、2mM2−メルカプトエタノール、0.0
1％ウシ血清アルブミン、pBR322/hag9 cc−DNA1μｇを
含む反応液10μｌに制限酵素BamH I10単位／μｌを加
え、−Ｂ−ａのEcoR I消化と同様に反応を行ない消化
物をアガロースゲル電気泳動法で検討した。DNAのサイ
ズマーカーにはλC1857S7DNAのHind III消化物を用い
た。これによりpBR322/hag9 cc−DNAは約5.7、3.5、1.8
5Kbの大きさのDNA断片に切断された。

次にEcoR Iによつて完全分解されたpBR322/hag9DNAに
対してBamH Iの不完全分解、ならびにSal Iによつて完
全分解されたpBR322/hag9DNAに対してBamH Iの不完全分
解を行ない、pBR322/hag9 cc−DNA上でのBamH I切断部
の位置を決める。まずpBR322/hag9 cc−DNA1μｇを−
Ｂ−ａならびに−Ｂ−ｂと同様にしてEcoR I、ならび
にSal Iによる消化を別々の試験管で行なう。37℃で１
時間反応を進め70℃で５分間過熱して反応を停止する。

次いでBamH I 1単位／μｌを各試験管にくわえ、２
分、５分後に５μｌずつ抜き去り反応停止液（50％グリ
セロール、１％SDS0.02％ブロムフエノールブルー）を
加える。反応液残り11μｌには９分後に更にBamH Iを１
単位／μ１加え10分後、20分後にそれぞれ５μｌずつ抜
き去り反応停止液0.5μｌを加える。それぞれの試料を
0.8％アガロースゲル電気泳動法で解析し生じているDNA
断片の大きさを決定する。DNAのサイズマーカーにはλC
1857S7DNAのHind III消化物を用いた。まずEcoR Iの完
全消化とBamH I消化20分後の試料ではＡ（5.4kb）、Ｂ
（3.9kb）、Ｃ（1.95kb）、Ｄ（0.73kb）の断片を生
じ、EcoR Iの完全消化とBamH I消化２分（乃至５分）の
試料では断片の小さい順にＤ、Ｃ、Ｂ、Ｂ＋Ｄ、Ａ、Ｂ
＋Ｃ、Ｂ＋Ｃ＋Ｄ、Ａ＋Ｃ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋
Ｄの大きさに相当する断片のバンドを確認した。一方Sa
l Iの完全消化とBamH I消化20分後の試料ではａ（4.7k
b）、ｂ（3.8kb）、ｃ（1.95kb）、ｄ（1.26kb）の断片
を生じ、Sallの完全消化とBamH I消化２分（乃至５分）
の試料では、断片の小さい順にｄ、ｃ、ｃ＋ｄ、ｂ、
ａ、ｂ＋ｃ、ｂ＋ｃ＋ｄ、ａ＋ｂ、ａ＋ｂ＋ｃ、ａ＋ｂ
＋ｃ＋ｄの大きさに相当する断片のバンドを確認した。
第４図にpBR322/hag9DNA上のBamH I切断点の位置を示
す。

（Ｅ）組換えプラスミドpBR322/hag93の作成 まず10μg/30μlTE緩衝液のpBR322/hag9 cc−DNAを、
10mMトリス塩酸（pH8.0）、7mM塩化マグネシウム、100m
M塩化ナトリウム、2mM2−メルカプトエタノール、0.01
％ウシ血清アルブミンを含む反応液56μｌにBamH I40単
位/4μｌを加え、37℃で２時間反応させる。60μｌのフ
エノール・クロロホルム（1:1）混液を加え、混合した
後、マイクロフユージで遠心し上清を採取する。この上
清に再度60μｌのフエノール・クロロホルム混液を加え
マイクロフユージで遠心後の上清にクロロホルム60μｌ
を加えよく混合する。マイクロフユージで遠心し上清を
採取する。再度この上清にクロロホルムを加えマイクロ
フユージで遠心後上清を採取する。この上清に3M酢酸ソ
ーダを1/10量加えエタノールを２倍量加え−20℃で一晩
置く。マイクロフユージで遠心し、得た沈殿を11μｌの
TE緩衝液に溶解する。

DNA連結反応は上記の11μｌの試料溶液に４μｌの33m
M塩化マグネシウムを含む250mMトリス塩酸（pH7.6）、
２μｌの100mM ATP、２μｌの100mM DTTを加え、T4 DNA
リガーゼ１単位／μｌ（宝酒造:Code No.2010B,Lot No.
301）を加え、13〜15℃で６時間反応を進行せしめる。

上記の反応物10μｌをW3623Hfla−am76株に形質転換
し、アンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地上に生じた
コロニー200個をアンピシリン50μg/mlを含む遊走検定
用培地に植え、14株の遊走できる株を見出した。14株の
もつプラスミドDNAのBamH Iによる消化をいわゆるラピ
ツドプラスミドDNA解析法^＊１で行ない、その中から第
４図中におけるpBR322/hag9のＢ断片を欠損したプラス
ミドを見出しpBR322/hag9と名付けた（第５図）。

＊１ ラピツドプラスミドDNA解析法 コロニーを5mlのアンピシリン50μg/mlを含むLB培地
に植菌し37℃で一晩培養する。エツペンドルフチユーブ
に1.5ml採取しマイクロフユージで１分間遠心後上清を
できるだけ除き沈殿を100μｌの溶液Ｉ（50mMグルコー
ス、10mM EDTA−2Na、25mMトリス塩酸（pH8.0）、4mg/m
l卵白リゾチーム（シグマ社製）より成る）に懸濁す
る。周囲の温度に５分間置いた後、200μｌの溶液II
（0.2N水酸化ナトリウム、１％SDSより成る）を少しづ
つ加え混合し、氷中（０℃）に５分間おく。次に150μ
ｌの氷冷した3M酢酸カリウム（氷酢酸でpH4.8に合わせ
たもの）を加えよく混ぜる。０℃で５分間置いた後、４
℃でマイクロフユージで遠心し、上清を新しいエツペン
ドルフチユーブに移す。等量のフエノール、クロロホル
ム（1:1）混液を加え、混合後、マイクロフユージで２
分間遠心し上清を新しいエツペンドルフチユーブへ移
す。２容量のエタノールを加え混合後、２分間周囲の温
度におく。マイクロフユージで５分間遠心し上清を捨て
チユーブの内壁に残る溶液をできるだけ紙でぬぐいと
る。次に1mlの70％エタノールを加えよく混合後、５分
間マイクロフユージで遠心する。上清を完全に除き、真
空デシケーター内で乾かしRNase（シグマ社、95℃10分
間加熱）を20μg/ml含む50μlTE緩衝液にとかす。10μ
ｌを新しいチユーブにとり1.2μｌのBamH Iの10倍反応
ミツクス（100mMトリス塩酸（pH8.0）、70mM塩化マグネ
シウム1000mM塩化ナトリウム、20mM2−メルカプトエタ
ノール、0.1％ウシ血清アルブミン）を加え、１単位のB
amH Iを加えて37℃で１時間反応を進める。反応後試料
を0.8をアガロースゲル電気泳動法で解析した。

（Ｆ）pBR322/hag93DNAの構造の検討 （ａ）pBR322/hag93DNAの精製 W3623Hfla−am76（pBR322/hag93）株から実施例−
Ｄ−ａと同様にしてpBR322/hag93 cc−DNAを精製した。

（ｂ）pBR322/hag93 cc−DNAの制限酵素Hinc IIによる
消化 10mMトリス塩酸（pH8.0）、7mM塩化マグネシウム、60
mM塩化ナトリウム、7mM2−メルカプトエタノール、pBR3
22/hag93 cc−DNA1μｇを含む反応液50μｌに３単位/0.
5μｌのHinc IIを加え、37℃で30分反応させる。実施例
−Ｂ−ａと同様にして、アガロースゲル電気泳動法に
よりHinc IIによつて切断された断片の大きさを測定し
た。断片は3.4、1.85、1.68、0.53、0.41kbの５種類生
じた。これによりpBR322/hag93 cc−DNA上の５ケ所のHi
nc IIによる切断点は第６図に示す位置に推定された。

（ｃ）1.68kb Hinc II断片のpUC9ベクタープラスミドへ
のサブクローニング hag遺伝子はHinc II切断点（５）とHinc II切断点
（４）の間の1.68kb断片（実施例−Ｆ−ｂ）にコード
されていると推定された。この1.68kb断片をpUC9ベクタ
ープラスミドのHinc II断片点にサブクローンした。

実施例−Ｂ−ａと同様にしてpBR322/hag93cc−DNA1
0μｇ、EcoR I18単位を含む反応液30.5μｌ中でpBR322/
hag93 cc−DNAのEcoR I消化を行なう。37℃で1.5時間反
応後、反応後29.5μｌに1Mトリス−塩酸（pH8.0）５μ
ｌ、水63μｌを加え、大腸菌アルカリ性フオスフアター
ゼ（BAP、宝酒造、Lot1112）を0.236単位/2μｌ加え65
℃で30分反応を進める。等容量のフエノール、クロロホ
ルム（1:1混液）で２回抽出し、更に等容量のクロロホ
ルムで２回抽出し、エタノール沈殿を行なう。沈殿物を
20μlTE緩衝液にとかす。この20μｌ（10μgDNA）の試
料にHinc II20単位/4μｌを加え、反応液全量を40μｌ
として実施例−Ｆ−ｂと同様に37℃で２時間反応を進
行させ、65℃で10分加熱して反応を停止させエタノール
沈殿を行ない、沈殿を20μｌのTE緩衝液にとかす。

一方、−Ｂ−ａと同様にpUC9ベクタープラスミド
（フアルマシア社製）５μｇを、Hinc II15単位を含む
反応液30μｌ中で消化する。37℃で1.5時間反応を進行
させ、60℃で10分間加熱する事によつて反応を停止させ
る。エタノール沈殿を行ない、沈殿物を６μｌのTE緩衝
液にとかす。

上記のEcoR I、BAP、Hinc II消化を行なつたpBR322/h
ag93 5μg/5μｌとHinc II消化したpUC9ベクタープラス
ミド５μg/6μｌ、T4DNAリガーゼ0.1単位/1μｌを含む
反応混合液中で−Ｃと同様にしてDNAの連結反応を行
ない、W3623fla−am76株に形質転換する。アンピシリン
50μg/mlを含むLB培地上に出現したコロニーをアンピシ
リン50μg/mlを含む遊走検定用培地へ接種する事によつ
て1112株の形質転換体の中から12株の遊走可能なコロニ
ーを検出した。この２株をラピツドプラスミドDNA解析
法で解析し、Hinc II消化により1.68kb断片を生じ、Bam
H I消化で0.44、4.0kbの２断片を生ずる組換えプラスミ
ドの１つをpUC9/hag6と名付けた（第７図）。

pBR322/hag93組換えプラスミドは、実施例−Ｆ−ｂ
に示すように1.68kbのHinc II断片を持ち、この断片をp
UC9ベクタープラスミドのlacプロモーターの転写方向に
沿つて正の向き（1.68kb断片でHinc II切断（５）→Bam
H I^＊＊の方向）に挿入してやるとW3623Hfla−am76株に
遊走できる性質を与える事がわかつた。即ちこの1.68kb
の断片上にはHinc II断片点（５）よりBamH I^＊＊の向
きに流れるhag遺伝子の構造遺伝子の部分が完全に含ま
れている事がわかつた。

（ｄ）pUC9/hag6組換えプラスミドのHind III−BamH I
断片のpUC8ベクタープラスミドへのサブクローニング W3623Hfla−am76（pUC9/hag6）株を、実施例−Ｄ−
ａと同様にしてpUC9/hag6 cc−DNAを精製した。

EcoR I36単位/6μｌ、Hind III36単位/3μｌ、Pvu II
30単位/6μｌ、pUC9/hag6 cc−DNA15μg/5.1μｌを含む
反応液160μｌ中で実施例−Ｂ−ａと同様にして、pUC
9/hag6 cc−DNAのEcoR I、Hind III、Pvu IIのトリプル
消化を37℃で２時間行なつた。一方EcoR I18単位/3μ
ｌ、Hind III18単位/1.5μｌ、pUC8（フアルマシア社
製）５μg/20μｌを含む反応液60μｌ中で、実施例−
Ｂ−ａと同様にしてpUC8のEcoR I、Hind IIIのダブル消
化を37℃で２時間行なつた。

両反応とも、反応後フエノール・クロロホルム（1:1
混液）で２回抽出、更にクロロホルムで２回抽出し、エ
タノール沈殿を行なつた。沈殿物をpUC9/hag6の反応で
は30μlTE緩衝液に、PUC8の方では10μｌのTE緩衝液に
溶かした。次に消化したpUC9/hag6DNA4μg/8μｌ、消化
したpUC8 2μg/4μｌ、T4DNAリガーゼ１単位/1μｌを含
む反応液21μｌ中で実施例−Ｃと同様にしてDNA連結
反応を行なう。反応終了後、W3623Hfla−am76株に形質
転換し、アンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地に出現
したコロニーを用いて、ラピツドプラスミドDNA解析法
でpUC8（2.7kb）＋1.68kb＝4.4kbの組換えプラスミドcc
−DNAを持つか検討し、4.4kbのcc−DNAを持つコロニー4
0株を選択した。この株をアンピシリン50μl/mlを含む
遊走検定用培地上で遊走性を示すか検討した。結果は40
株全てのコロニーが遊走性を示さなかつた。この事はpU
C8でlacプロモーターの下流にlacプロモーターの流れに
反対向きに1.68kb断片が挿入されても、hag遺伝子の発
現は認められない事がわかる。

1.68kb断片はhag遺伝子の構造遺伝子部分は持つが
（実施例−Ｆ−ｃ）、自前のプロモーター領域は既に
欠損している事を示している。

前記40株の中から１株を選び、その保有する組換えプ
ラスミドをpUC8/hag6と命名し、cc−DNAを実施例−Ｄ
−ａと同様にして精製した。

hag遺伝子の塩基配列の決定 （Ａ）hag遺伝子の塩基配列の決定 実施例−Ｆ−ｃ、−Ｆ−ｄによる1.68kbpのHinc
II断片にhag遺伝子の構造遺伝子部分はコードされてい
る事が明らかになつたので、この断片の全領域の塩基配
列を決定した。

1.68kb断片のDNA塩基配列決定には通常のM13フアージ
ベクターを用いたジデオキシヌクレオチド鎖終止法を用
いた。pBR322/hag93、pUC9/hag6、pUC8/hag6のcc−DNA
をHap II、Hinc II、Taq I、Sau3A、BamH I、Pst Iの制
限酵素（すべて宝酒造社製）で生ずる特定の断片を（第
８図矢印の断片）をM13mp8、mp9、mp18ベクター（フア
ルマシア社製）にクローン化した。

pUC8/hag6、pUC9/hag6DNA上の1.68kbp断片の直接のDN
A配列決定には0.1M水酸化ナトリウムと0.1mM EDTA−2Na
を含む溶液で、前記DNAを変性し、１本鎖DNAに分離した
後、ジデオキシヌクレオチド鎖終止法によるDNA配列決
定に供試した。

DNA配列決定のスケジユールは第８図に示す。図は
５′→３′の方向に書かれてある。

第９図にDNAシーケンシングの結果得られたhag遺伝子
の全一次構造を示す。hag遺伝子の開始コドンATGの下流
60塩基までのDNAシーケンスは既知のDNAシーケンス（ジ
ヤーナル オブ バクテリオロジー（J.Bacteriol.）15
5,78（1983））と一致した。

（Ｂ）フラジエリン蛋白のアミノ末端アミノ酸とカルボ
キシ末端アミノ酸の決定 （ａ）フラジエリン蛋白の精製 大腸菌Ｋ−12W3110株をLB寒天培地で純化し、37℃で
一晩培養しコロニーを形成させる。適当なコロニーを遊
走検定用培地に突刺して培養し、37℃、４〜５時間で形
成した遊走ゾーンのできるだけ外側に生育している菌を
100mlのLB培地に植菌し、37℃で一晩培養した。翌日、
栄研角１号プレート（80×225mm）に作つておいたLB寒
天培地に、前記の終夜培養液３〜4ml/1枚を広げ、37℃
で終夜培養を行なつた。翌日、培養表面に少量のＰ緩衝
液（0.15M塩化ナトリウム、10mMリン酸二水素カリウム
−リン酸水素ナトリウム、pH6.8）を加え、コンラージ
棒（ニツスイ株式会社製）でかき集めてＰ緩衝液に懸濁
した。

90枚のプレートから約250mlの懸濁液が得られた。１
の三角フラスコ（栓付き）に移し激しく600回振盪
後、遠心（8000rpm、15分、４℃）し、上清をグラスウ
ールをしいたロートで濾過し、続いて遠心（25000rpm、
１時間、４℃ベツクマン超遠心機、ローター＃30）し、
沈殿を約20mlのＰ緩衝液に懸濁した。遠心（8000rpm、1
5分、４℃）を行ない、上清（鞭毛画分）を回収し、65
℃で５分加熱後、遠心（25000rpm、90分、４℃ベツクマ
ン超遠心機ローター＃30）し上清（14.5ml）を回収し粗
製フラジエリン分画とした。

次に0.05M塩化ナトリウムを含む10mMリン酸二水素カ
リウム−リン酸水素ナトリウム溶液（pH6.8）で３倍に
希釈してDEAE−セルロース（DE52:ホワツトマン社）カ
ラムに付す。上記の希釈溶液98mlで洗い、0.05Mを含む1
0mMリン酸二水素カリウム−リン酸水素ナトリウム溶液
（pH6.8）と0.7Mを含む10mMリン酸二水素カリウム−リ
ン酸水素ナトリウム溶液（pH6.8）の等量の濃度勾配で
溶出する。フラジエリンは塩化ナトリウム濃度0.3Mで溶
出した（18.8ml）。標準蛋白としてウシ血清アルブミン
を用いプロテインアツセイキツト（バイオラツド（Bio
−Rad）社製）で蛋白質を定量し、26.17mg/18.8mlの精
製フラジエリンを得た。

（ｂ）アミノ末端アミノ酸、カルボキシ末端アミノ酸、
全アミノ酸含量の決定 分析に先立ち、実施例−Ｂ−ａで得られた精製フラ
ジエリンを6.5mg/mlまで遠心濃縮、透析し各分析法の出
発試料を作製した。

アミノ末端アミノ酸の決定は通常のエドマン分解で行
ない、Ｎ末端配列はAla（１位）−Gln（２位）と決定さ
れ、第９図のDNA配列から推定できるAla（１位）−Gln
（２位）のアミノ酸と一致する。

カルボキシ末端アミノ酸の決定は通常のカルボキシペ
プチダーゼＰを用いた方法で分析し、Glyと決定され、
第９図から推定できるGly（497位）と一致する。

全アミノ酸含量の分析は、まず0.1％アンモニア水に
6.5mg/mlの精製フラジエリンを溶解した。この10μｌ
に、50μｌの0.2％インドールエチルアミンを含む4Mメ
タンスルホン酸を加え、110℃で24時間加水分解し、そ
の後47μｌの4N水酸化ナトリウム及び403μｌの0.2Nク
エン酸ナトリウムを加え試料とした。上記、いずれの分
析でも日立アミノ酸分析計モデル835型を用いて分析し
た。全アミノ酸含量と、DNA配列から推定できるアミノ
酸含量を比較して表１に示す。

Ｈ抗原性が変化した変異hag遺伝子の試験管内作成 （Ａ）pBR322/hag93 cc−DNAのデオキシリボヌクレアー
ゼＩ（DNase I）による消化 TE緩衝液中のpBR322/hag93 cc−DNA（1.35mg、1ml）
をエタノール沈澱し、50mMトリス塩酸（pH7.3）に溶か
す。このDNA125μｇ、DNase I（宝酒造）6ng、1mM塩化
マンガンを含む50mMトリス塩酸（pH7.3）より成る反応
液340μｌを37℃で10分間反応させ、ただちにフエノー
ル・クロロホルム（1:1混液）を等量加え反応を停止さ
せ、実施例−Ｅと同様にしてフエノール、クロロホル
ム抽出を行なつた。エタノール沈澱後、直ちにTE緩衝液
200μｌに溶解する。

次にアガロースゲル電気泳動で分離し、線状単量体の
位置にくる螢光バンドからDNAを抽出した（線状単量体
のサイズマーカーとして、EcoR Iで切断したpBR322/hag
93DNAを用いた）。抽出液をエタノール沈澱し、約２μ
ｇの線状pBR322/hag93DNAを得た。

（Ｂ）エキソヌクレアーゼBal31による消化 実施例−ＡのDNAを、14μｌの水にとかし、２μｌ
ずつ７本の反応チユーブに分注する。次いで２μｌのBa
l31反応液（24mM塩化カルシウム、24mM塩化マグネシウ
ム、200mM塩化ナトリウム、40mMトリス塩酸（pH8.0）、
2mM EDTA−2Naより成る。）を加え30℃で３分加温す
る。

Bal31酵素液（宝酒造）を、12mM塩化カルシウム、12m
M塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウム、20mMトリス
塩酸（pH8.0）、1mM EDTA−2Na、0.1％ウシ血清アルブ
ミンより成る希釈液で6.02単位/ml、3.01単位/ml、1.51
単位/ml、0.76単位/ml、0.38単位/ml、0.19単位/ml、0.
10単位/mlの７段階に希釈する。各濃度のBal31を４μｌ
加え、30℃で10分間反応を進行させる200mMエチレング
リコールビス（β−アミノエチルエーテル）−N,N,N′,
N′−四酢酸（EGTA）１μｌを加え氷冷する。７本の反
応チユーブの内容を全て集めて実施例−Ｅと同様にし
てフエノール、クロロホルム抽出を行ない、エタノール
沈澱を行なう。

（Ｃ）大腸菌DNAポリメラーゼＩのラージフラグメント
（クレノ−フラグメント）による修復と合成Hind IIIリ
ンカー存在下での連結反応 実施例−ＢのDNAを３μｌのTE緩衝液に溶解する。
このDNA3μｌ（約２μｇ）を、10倍ニツクトランスレー
シヨンバツフアー（0.5Mトリス塩酸（pH7.2）、0.1M硫
酸マグネシウム、1mMジチオスレイトール、500μg/ml牛
血清アルブミンより成る。）１μｌ、４μl dNTP′Ｓ
（宝酒造、dATP,dTTP,dGTP,dCTP各1mMより成る）、１μ
ｌクレノ−フラグメント（宝酒造）３単位/1μｌ、水１
μｌ中で30℃30分間反応させる。

続いて上記反応液10μｌ、５倍ライゲーシヨンバツフ
アー（0.25Mトリス塩酸（pH7.4）、0.05M塩化マグネシ
ウム、5mMスペルミジン、0.5mg/ml牛血清アルブミン）
４μｌ、Hind IIIリンカー（５′−CAAGCTTG、宝酒造）
１μg/1μｌ、100mMジチオスレイトール２μｌ、10mM A
TP2μｌ、T4DNAリガーゼ２単位/2μｌを16℃で16時間反
応させる。

（Ｄ）形質転換とＨ−抗原性が変化した菌株の選択 実施例−Ｃの反応物を、大腸菌K12株のC600r^-m^-ha
g::Tn10に形質転換する。C600r^-m^-hag::Tn10株はC600株
（thr−1,leu−6,thi−1,supE44,lacY1,tonA21,λ⁻）
のｒ−（リストリクシヨン・マイナス）m^-（モデイフイ
ケーシヨン・マイナス）株であり、hag遺伝子にTn10が
挿入され失活した株である。アンピシリン50μg/mlを含
むLB寒天上に約8600ケの形失転換コロニーを得た。この
うち約5000コロニーから、１万倍に希釈した抗鞭毛ポリ
マー抗体を含む遊走検定用培地上で37℃５〜６時間培養
して、抗体を含まない遊走検定用培地上と同程度の遊橋
を示す株を12株（Ａ群）分離した。更に37℃20時間の培
養で抗体存在下にもかかわらず明らかに遊走性を示した
菌株を４株（Ｂ群）分離した。

抗鞭毛ポリマー抗体は実施例−Ｂ−ａの精製フラジ
エリン蛋白13.9mg/10mlに硫酸アンモニウムを60％（w/
v）になるように加え、４℃で一晩放置し、遠心（15000
g、15分）の沈殿をＰ緩衝液に懸濁し（1.3ml）、同緩衝
液に対して透析をくり返したものを抗原として用いた。
アジュバンドにはDIFCO社のインコンプリートを用い
た。ウサギ（ニュージーランド ホワイト雌）に初回は
3mg/羽を両後肢指掌部並びに大腿部に皮下注射し９日
目、14日目に同様の注射を行ない、21日目に頚動脈より
全採血した。採血後通常の方法で粗血清画分を得た。

（Ｅ）Ｈ抗原性が変化した菌株の持つhag遺伝子の解析 （ａ）ラピッドプラスミッドDNA解析 実施例−Ｄで採取されたＡ並びにＢ群について、保
有するプラスミッドが制限酵素Hind IIIで切断されるか
ラピッドプラスミッドDNA解析法で検討した。

Ａ群からは４株、Ｂ群からは１株の保有するプラスミ
ドがHind IIIで切断された。これらのプラスミドはもと
もとpBR322/hag93プラスミド由来であり、Hind III切断
点は持っていない事から、この切断部位は実施例−Ｃ
で用いた合成Hind IIIリンカーのプラスミドへの挿入に
より生じた事になる。

（ｂ）Hind III切断点のプラスミドDNA上での位置づけ 実施例−Ｅ−ａのＡ群４株の中から３株を選び、そ
の保有するプラスミドをpFD1,pFD2,pFD3と名付けた。Ｂ
群の１株についてはpHD−１と名付けた。この４種のプ
ラスミドHind III切断点の位置づけをラピツドプラスミ
ドDNA解析法により行なつた。

pFD1,pFD2,pFD3を持つ菌株からラピツドプラスミドDN
A解析法で調製した試料をEcoR I並びにHind IIIの二重
消化を行ない、アガロースゲル電気泳動法で消化物のサ
イズを検討した。

どの試料からも約5.3kbpと約2.3kbpの断片が認められ
た。従つてHind III切断点はEcoR I切断点（実施例−
Ｆ−ｂ）から約2.3kbp離れた距離に位置する。一方、pB
R322/hag93DNAのBamH I消化では約5.8kbpと約1.9kbpの
断片を生ずる事がわかつているが（−Ｃ）、BamH I消
化後、続いてHind IIIで消化すると、約1.9kbpの断片の
方が二断片にわかれた。この事からいずれの試料のHind
III切断点もEcoR I切断点から時計回りで約2.3kbpの距
離に存在し、BamH I切断時の約1.9kbp断片内に位置する
事がわかつた。EcoR I切断点より時計回りに最初のBamH
I切断点までの距離は約0.7kbp（−Ｃ）、更に時計回
りをしてHinc II切断点（−Ｆ−ｂ）までは約0.7kbp
^＊１である。都合EcoR I切断点から1.4kbpを時計回りす
るとhag遺伝子のコードされているDNA領域にあたる。Ec
oR I切断点から時計回りで約2.3kbpの距離に存在するHi
nd III切断点はhag遺伝子がコードされているDNA領域内
に存在する事になる（第10図）。

＊１ 実施例−Ｆ−ｂ、図６においてHinc II（１）
〜Hinc II（５）間の距離は1.85kbpであり、又EcoR I〜
BamH I^＊の距離は約0.73kbpである。一方Hinc II（１）
〜EcoR Iの距離は約0.45kbpである（J.G.Sutcliffe,197
9,Cold Spring Harbor Lab.Symposia 43,p.83）。従つ
てBamH I^＊〜Hinc II（５）間の距離は約0.7kbpとな
る。

上記と同様にしてpHD−１プラスミド上のHind III切
断点の位置づけを行なつた。EcoR I並びにHind IIIの二
重消化では約6.4kbpと約1.4kbpの断片に分かれた。従つ
てHind III切断点はEcoR I切断点より約1.4kbpの距離に
存在する。一方、BamH IとHind IIIの二重消化では約5.
8kbp、1.2kbp、0.7kbpの断片が得られた。この事からpH
D−１プラスミドにおけるHind III切断点はEcoR I切断
点より時計回りで1.4kbpの距離、上記の第10図でHinc I
I（５）切断点近辺に位置する事がわかつた。これはhag
遺伝子の開始コドンATGの近辺にあたる。

（Ｃ）pFD1、pFD2、pFD3プラスミドDNAにおけるDNA欠損
部位の解析 pFD1、pFD2、pFD3プラスミドの試験管内作成過程で、
DNase1による切断点をBal31ヌクレアーゼで少し消化し
た（実施例−Ｂ）。この消化によるDNA欠損は、合成H
ind III DNAリンカーの挿入部位に起っている筈であ
る。この挿入部位はプラスミド上のEcoR I切断点より時
計廻りで約2.3Kbpの距離に存在し、この位置はHinc II
（５）−Ndel^＊１断片内に存在する。

＊１ 制限酵素Nde1は５′CA′TATGを切断し、この塩基
の並びは第９図中953位のヌクレオチド位置に存在す
る。EcoR I切断点より約2.4kbp、Hinc II（５）切断点
より約1kbpの下流に存在する。

上記の４種のプラスミドDNAを含むラピツドプラスミ
ドDNA解析用の試料をHinc IIならびにNdelで二重消化
し、生じた断片をアガロースゲル電気泳動法で検討し
た。

第９図からhag遺伝子を含むHinc II断片は約1.7kbpの
大きさでありNdel切断で約1.0kbpと0.7kbpの断片に分か
れる事がわかる。実験ではこの断片はpBR322/hag93 DNA
の消化物では約1020bp、pFD1 DNAからは930bp、pFD2 DN
Aからは990bp、pFD3 DNAからは990bpと測定された。従
つてHind IIIを含むHinc II（５）−Ndel DNA断片はpFD
1 DNAでは約90bp、pFD2、pFD3 DNAでは約30bp、pBR322/
hag93上の断片に比較して、短縮している事が示され
た。

（ｄ）pFD1,pFD2,pFD3プラスミドでのHind III切断点近
辺のDNAシーケンシング pFD1、pFD2、pFD3のプラスミドを、宿主C600r^-m^-ha
g::Tn10株を用い、実施例−Ｄ−ａと同様にしてccDNA
を精製した。この精製したプラスミドDNAを用いたHind
III切断点付近（第11図）のDNAシーケンシングには、通
常のM13ファージベクターを用いるジデオキシヌクレオ
チド鎖終止法を用いた。M13ファージベクターにはM13mp
18（ファルマシア社）を用い、Hind III、BamH Iの二重
消化を行ない、フェノール、クロロホルム抽出後エタノ
ール沈殿をしてTE緩衝液に溶かしておく。プラスミドDN
Aも同様にしてTE緩衝液に溶かしておく。この消化したD
NAをT4DNAリガーゼで連結しJM105株（ファルマシア社）
に感染させプラークを作らせる。常法に従い第11図のＡ
またはＢ断片を持つM13mp18DNAを調製した。上記の様に
M13mp18ベクター上にクローン化した後１本鎖DNAを調製
し、ジデオキシヌクレオチド鎖終止法でDNAシーケンシ
ングを行なった。

pFD1の運搬するhag遺伝子は第９図中の754位〜854位
の塩基配列が欠損し、５′CAAGCTTG（合成Hind IIIリン
カー）が挿入されており、その結果、アミノ酸配列NDGT
VTMATGATANATUTDANTTKATTITSGGTPの34アミノ酸残基が欠
損しQACの３アミノ酸が挿入されていた。pFD2の運搬す
るhag遺伝子は第９図中の719位〜765位の塩基配列が欠
損し、５′CAAGCTTG（合成Hind IIIリンカー）が挿入さ
れており、その結果、アミノ酸配列DNDGKYYAVTVANDGTの
16アミノ酸残基が欠損しASLの３アミノ酸が挿入されて
いた。pFD3の運搬するhag遺伝子は第９図中の778位〜83
6位の塩基配列が欠損し、５′CAAGCTTG（合成Hind III
リンカー）が挿入されており、その結果、アミノ酸配列
TGATANATVTDANTTKATTIの20アミノ酸残基が欠損しQACの
３アミノ酸が挿入されていた。

（ｅ）pHD1プラスミド上のHind III切断点近辺のDNAシ
ーケンシング C600r^-m^-hag::Tn10（pHD1）株より実施例−Ｄ−ａ
と同様にしてccDNAを精製した。精製プラスミドDNAのHi
nd III切断点近辺（第12図）のDNAシーケンシングは、
−Ｅ−ｄで述べたM13ファージベクターを用いるジデ
オキシヌクレオチド鎖終止法と同様に、第12図のＡまた
はＢ断片を持つM13mp18の１本鎖DNAを調製して行なっ
た。その結果、pHD1の運搬するhag遺伝子は第９図中の
−28位〜−21位の５′AACGACTTの８塩基が欠損し、５′
CAAGCTTG（合成Hind IIIリンカー）の８塩基が挿入され
ていた。この変異をpHD1変異と名付けた。pHD1変異はDN
Aシーケンシングの結果hag遺伝子の蛋白コーディング領
域内に起こった変異ではないことが明らかになった。従
ってpHD1変異が起こっても、hag遺伝子の作るフラジェ
リンは野生型のものと同じであり、宿主のＨ抗原性も変
化しない。

pHD1プラスミドを持つ宿主株C600r^-m^-hag::Tn10の
鞭毛の本数 pHD1プラスミドを持つC600r^-m^-hag::Tn10株とpBR322/
hag93プラスミドを持つC600r^-m^-hag::Tn10株の30℃で１
晩静置培養した菌体の鞭毛を染色し、光学顕微鏡下で各
鞭毛本数を持つ菌体の出現数を数えた（表２）。

pHD1プラスミドを持つC600r^-m^-hag::Tn10株では菌体
の持つ鞭毛の本数が増加している。両菌株を−Ａ−ａ
と同様にして遊走検定用培地上で遊走能を比較すると、
37℃で５時間培養後の遊走ゾーン直径の平均は、pBR322
/hag93を持つ場合16mm、pHD1を持つ場合36mmと、pHD1を
持つ株のほうがよく遊走する。pBR322のような多コピー
プラスミド上のpHD1変異を持つhag遺伝子は、野生型のh
ag遺伝子がpBR322に運搬されているよりも宿主大腸菌を
多鞭毛にすることがわかった。

pFD202プラスミドの作成 （Ａ）pFD2 DNAのヌクレアーゼBal31による消化 C600r^-m^-hag::Tn10（pFD2）株より実施例−Ｄ−ａ
と同様にしてccDNAを精製した。pFD2 ccDNA20μg/6.2μ
ｌ、10培Pvu II緩衝液（100mMトリス塩酸（pH7.5）、70
mM塩化マグネシウム、600mM塩化ナトリウム、70mM2−メ
ルカプトエタノール）10μｌ、水73.8μｌを混合したも
のに、制限酵素Hind III120単位/10μｌを加え、37℃で
１時間反応させる。実施例−Ｅと同様にフェノール・
クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行ない、0.05％牛
血清アルブミン溶液20μｌに溶かす。上記DNA溶液４μ
ｌに２培Bal31緩衝液（実施例−Ｂ）４μｌを加え30
℃で３分間インキュベートする。ヌクレアーゼBal31（4
900単位/ml）をBal31緩衝液を用いて520倍に希釈したも
のを８μｌ加え、10分間周囲の温度で反応させた後、20
0mMEGTA（実施例−Ｂ）を２μｌ加えて氷冷する。フ
ェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿後、TE緩
衝液10μｌに溶かす。

（Ｂ）クレノ−フラグメントによる修復と合成DNAリン
カー（Hind III−Sma I−Bal II）存在下の連結反応 実施例−Ａの試料DNA（約４μl/10μlTE緩衝液）５
μｌに10倍濃度のニックトランスレーションバッファー
１μｌ、dNTP′s4μｌ（実施例−Ｃ）、クレノ−フラ
グメント３単位/1μｌを加え周囲の温度で30分反応させ
る。次いで、上記反応液に５倍濃度のライゲーションバ
ッファー（実施例−Ｃ）、合成DNAリンカー（Hind II
I−Sma I−Bal II、５′AAGCTTCCCGGGAGATCT3′と３′T
TCGAAGGGCCCTCTAGA5′の２本の18merポリヌクレオチ
ド：フォスフォトリエステルを用いる固相合成法で化学
合成）0.5μg/1μｌ、10mMATP2μｌ、100mMDTT2μｌ、
水２μｌを混合し、T4DNAリガーゼ２単位/2μｌを加
え、14℃で18時間反応させた。

（Ｃ）形質転換体の選択 実施例−Ｂの反応物を大腸菌Ｋ−12株のC600r^-m^-ha
g::Tn10に形質転換した。アンピシリン50μg/mlを含むL
B寒天上に約1200個の形質転換コロニーを得た。この形
質転換コロニーをアンピシリン50μg/mlを含む遊走検定
用培地に突き刺し、37℃で５〜６時間培養したところ、
約50％が遊走性を示した。このうち90株について、保有
するプラスミドがSma Iで切断されるかラピッドプラス
ミドDNA解析法で調べた。その結果、２株の保有するプ
ラスミドがSma Iで切断された。そのうち、１株の持つ
プラスミドをpFD202と命名した。pFD202はHind III、bg
l IIで切断されることがラピッドプラスミドDNA解析で
確認された。

（Ｄ）pFD202プラスミドの合成DNAリンカー挿入部位近
辺のDNAシーケンシング pFD202は実施例−Ａの様に、pFD2のHind III切断点
からヌクレアーゼBal31によって少し消化したものであ
る。従って、合成DNAリンカー挿入部位はpFD2のHind II
I切断点近辺ということになり、この部分はプラスミド
をHinc II、Pst Iで二重消化した際に生じる約900bpの
断片の中に含まれる。

（ａ）pFD202DNAのHinc II−Pst Iによる二重消化 C600r^-m^-hag::Tn10（pFD202）株より、実施例−Ｄ
−ａと同様にしてccDNAを精製した。pFD202ccDNA23μg/
10μｌ、10倍濃度のPvu II緩衝液10μｌ、70mM2−メル
カプトエタノール10μｌ、５μｌの0.2％牛血清アルブ
ミン、Hinc II60単位/10μｌ、Pst I96単位/6μｌを加
えて全量を100μｌにして37℃で80分間反応させる。反
応終了後、10μｌの５倍濃度のサンプルバッファー（シ
ョ糖25％、酢酸ナトリウム5mM、ドデシル硫酸ナトリウ
ム0.1％、ブロムフェノールブルー0.05％）を加え、全
量を0.8％のアガロースゲルで100V4分間の電気泳動を行
ない、0.5μg/mlの臭化エチジウムで染色を行なった
後、約900bpのバンドを含むゲルを切り出す。マックス
・イールドを用いて10V10分間２回の電気的溶出を行な
い、エタノール沈殿後200μｌのTE緩衝液に溶かした。

（ｂ）M13mp8DNAのHinc II−Pst Iの二重消化 M13mp8RFDNA3μg/30μｌ、10倍濃度のPvu II緩衝液10
μｌ、70mM2−メルカプトエタノール５μｌ、水40μｌ
を含む反応液にHinc II18単位/3μｌ、Pst I32単位/2μ
ｌを加え、37℃で１時間反応後、フェノールクロロホル
ム抽出、エタノール沈殿を行ない、21μｌのTE緩衝液に
溶かす。

（ｃ）Hinc II−Pst I断片のM13mp8ベクターへのクロー
ニングとDNAシーケンシング 実施例−Ｄ−ａのHinc II−Pst I断片を含むTE緩衝
液10μｌ、実施例−Ｄ−ｂの試料３μｌ（約430ngDN
A）、５倍濃度のライゲーションバッファー４μｌ、100
mMDTT2μｌ、10mMATP2μｌを含む反応液21μｌに、T4DN
Aリガーゼ１単位/1μｌを含む反応液を14℃で18時間反
応させ、全量をJM109株（宝酒造）へ形質転換した。

M13mp8ベクターへクローン化した後、１本鎖DNAを調
製し、ジデオキシヌクレオチド鎖終止法でDNAシーケン
シングを行なった。その結果、pFD202プラスミドが運搬
するhag遺伝子は野生型のhag遺伝子に較べ78塩基対（第
９図中711位〜788位）が欠損し、18塩基対が挿入されて
おり、天然の26アミノ酸が欠損し、６個の人工アミノ酸
配列が挿入されていることがわかった。

pFD301、pFD303、pFD306、pFD307プラスミドの作成 （Ａ）pFD3 DNAのヌクレアーゼBal31による消化 C600r^-m^-hag::Tn10（pFD3）株より実施例−Ｄ−ａ
と同様にしてccDNAを精製した。pFD3ccDNA50μg/12μ
ｌ、10倍Pvu II緩衝液25μｌ、水188μｌを混合したも
のに、制限酵素Hind III300単位/25μｌを加え、37℃１
時間反応させる。反応後、実施例−Ｅと同様にして、
フェノール・クロロホルム抽出、次いでエタノール沈殿
を行ない、水25μｌに溶かした。この反応液５μｌ（約
２μgDNA/μ１）に12.5μｌの0.2％ウシ血清アルブミン
溶液と水32.5μｌを加え、最終DNA濃度約200ng/μｌの
0.05％ウシ血清アルブミン溶液とした。この溶液20μｌ
に2Bal31緩衝液20μｌを加え、30℃で30分間インキュベ
ートする。ヌクレアーゼBal31（1700単位/ml）をBal31
希釈液を用いて1140倍に希釈したものを40μｌ加え、20
分間周囲の温度で反応させた後、反応液20μｌに100mME
GTA5μｌを加え氷冷する。フェノール・クロロホルム抽
出、エタノール沈殿後10μｌの水に溶かした。

（Ｂ）クレノ−フラグメントによる修復と合成DNAリン
カー（Hind III−Sma I−Bgl II）存在下の連結反応 実施例−Ａの試料DNA（約１μg/10μｌ）に10倍濃
度のニックトランスレーションバッファー1.5μｌ、dNT
P′s2μｌ、クレノ−フラグメント３単位/1μｌを加
え、周囲の温度で30分間反応させる。続いて上記反応液
に合成DNAリンカー（Hind III−Sma I−Bgl II）3.7μg
/5μｌ、100mMDTT7μｌ、10mMATP3μｌ、500mMトリス塩
酸（pH7.3）１μｌ、水1.5μｌを混合し、T4DNAリガー
ゼ２単位/2μｌを加え15℃で18時間反応させた。

（Ｃ）形質転換体の選択 実施例−Ｂの反応物をTE緩衝液に対し約４時間透析
後、大腸菌K12株のC600r^-m^-hag::Tn10株に形質転換し
た。アンピシリン50μg/mlを含むLB寒天上に形質転換株
約560コロニーを得た。このコロニーをアンピシリン50
μg/mlを含む遊走検定用培地に突き刺し、わずかな遊走
性を示す株も遊走するものとみなしてピックアップし23
株を得た。この23株について保有するプラスミドが制限
酵素Sma Iで切断されるか検討し４株を得た。この４株
が保有するプラスミドをpFD301、pFD303、pFD306、pFD3
07と命名した。この４種はHind III、Bgl IIでも切断さ
れることがラピッドプラスミドDNA解析で確認された。

（Ｄ）pFD301、pFD303、pFD306、pFD307プラスミドの合
成DNAリンカー挿入部位近辺のDNAシーケンシング pFD301、pFD303、pFD306、pFD307は実施例−Ａと同
様にしてpFD3のHind III切断点からヌクレアーゼBal31
によって消化を進めたものであるから、pFD301、pFD30
3、pFD306、pFD307の合成DNAリンカー挿入部位はpFD3の
Hind III切断点近辺にある。従って、合成DNAリンカー
挿入部位のDNAシーケンシングにはHind III−Hinc IIの
２断片Ａ′、Ｂ′（第13図）をHind III切断点からシー
ケンシングすればよい。

（ａ）pFD301、pFD303、pFD306、pFD307 ccDNAのHinc I
I、Hind IIIの二重消化 pFD301、pFD303、pFD306、pFD307を有するC600r^-m^-ha
g::Tn10株より、実施例−Ｄ−ａと同様にしてccDNAを
精製した。pFD301のccDNA5μｇ、10倍Pvu II緩衝液５μ
ｌ、70mM2−メルカプトエタノール５μｌ、Hinc II30単
位/5μｌ、Hind III50単位/5μｌに水を加え全量を50μ
ｌにした反応液を37℃で１時間インキュベートし、反応
終了後フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿
後、水10μｌに溶かした。pFD303、pFD306、pFD307につ
いても同様の処理を行なった。

（ｂ）M13mp18RFDNAのHinc II、Hind IIIの二重消化 M13mp18 RFDNA2.5μg/5μｌ、10倍Pvu II緩衝液５μ
ｌ、70mM2−メルカプトエタノール５μｌ、水25μｌを
含む反応液にHinc II30単位/5μｌ、Hind III50単位/5
μｌを加え、37℃で１時間反応後、フェノール・クロロ
ホルム抽出、エタノール沈殿を行ない、水10μｌに溶か
した。

（ｃ）Hinc II−Hind III断片のM13mp18ベクターへのク
ローニングとDNAシーケンシング 実施例−Ｄ−ａのHinc II−Hind III断片1.5μg/3
μｌ、実施例−Ｄ−ｂの試料0.5μg/2μｌ、５倍濃度
のライゲーションバッファー４μｌ、100mMDTT2μｌ、1
0mMATP2μｌ、水５μｌを含む反応液にT4DNAリガーゼ２
単位/2μｌを加え、反応液を15℃で18時間インキュベー
トし、全量をJM109株（宝酒造）にトランスフェクショ
ンした。10個のプラークを採取し、常法に従い１本鎖DN
Aを調製した。２本鎖DNAをHinc II、Hind IIIで二重消
化した反応物を、pFD3ccDNAのHinc II、Hind III二重消
化物をDNA断片の大きさのコントロールとして、1.6％の
アガロースゲル電気泳動法で検討したところ、pFD3ccDN
A由来のＡ、Ｂ両断片（第13図）は何れも消失してお
り、かわりにＡ、Ｂ両断片より小さい２種の断片Ａ′、
Ｂ′が認められた。両断片をクローン化している１本鎖
DNA試料各１個をジデオキシヌクレオチド鎖終止法でDNA
シーケンシングを行なった。その結果、pFD301プラスミ
ドが運搬するhag遺伝子は野生型のhag遺伝子に較べ、56
1個の塩基対（583位〜1143位）が欠損し18個の塩基対が
挿入された結果、天然の187個のアミノ酸が欠損し６個
の人工アミノ酸配列が挿入されていることがわかった
（第14図Ａ）。pFD303、pFD306、pFD307の運搬するhag
遺伝子のシーケンスを第14図Ｂ、Ｃ、Ｄに示す。

pFD311、pFD313、pFD315プラスミドの作成 ヌクレアーゼBal31の反応時間を５分間とする以外
は、実施例−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄと同様にプ
ラスミドを作成し、pFD311、pFD313、pFD315を得た。各
プラスミドのDNAシーケンスを第15図Ａ、Ｂ、Ｃに示
す。

pFD1ベクタープラスミドを用いたポリペプチドHBsA
g−Ｉをキメラ化したフラジェリンの排出 （Ａ）cc−pFD1の制限酵素Hind IIIによる切断とクレノ
−フラグメントによる修復 20μｇのcc−pFD1 DNAを含む10mMトリス塩酸（pH7.
5）、7mM塩化マグネシウム、60mM塩化ナトリウムを含む
反応液に制限酵素Hind IIIを100単位加え、37℃で30分
間反応させる。フェノール・クロロホルム抽出、エタノ
ール沈殿後20μｌのTE緩衝液に溶かしておく。

上記のDNA20μg/20μlTE緩衝液に10倍ニックトランス
レーションバツファー２μｌ、2NTP（各XTPは1mM）２μ
ｌ、クレノ−フラグメント３単位/1μｌを加え、室温で
30分間反応させる。500mMEDTAを１μｌ加えフェーノル
・クロロホルム抽出後、エタノール沈殿し、20μｌのTE
緩衝液に溶かした。

（Ｂ）合成ポリヌクレオチドのアニーリング 化学合成ポリヌクレオチドRTH−1603（５′ACAAAACCT
ACGGATGGAAATGG3′）約20μg/100μｌ水とRTH−1604
（５′CCATTTCCATCCGTAGGTTTTGT3′）約20μg/100μｌ
水に10倍濃度のTE緩衝液20μｌを加え、60℃で30分間保
温した後、６時間かけて徐々に28.5℃まで下げてアニー
リングを行なった。

（Ｃ）pFD1ベクターへの化学合成DNAの連結 実施例−Ａの試料DNA1μg/1μｌ、実施例−Ｂの
合成DNA180pmol/13μｌ、５倍ライゲーシヨンバツフア
ー４μｌ、T4DNAリガーゼ5.6単位/2μｌを加え、16℃で
16時間反応させた後、TE緩衝液に対して２時間透析す
る。

（Ｄ）形質転換した菌株の選択 実施例−Ｃの試料DNAをC600r^-m^-hag::Tn10株へ形質
転換した。50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地上に、
１μｇのpFD1 DNAあたり3.8×10⁴個のアンピシリン抵抗
性コロニーが出現した。そのうち90個のコロニーの遊走
性を調べ、82株が遊走性を示した。そのうち62株につい
てラピッドDNA解析を行ない、保有するプラスミドが制
限酵素Hind IIIで切断されなくなっている菌株＃11、＃
12、＃14、＃16、＃17の計５株を選び出した。この５株
の持つプラスミドをそれぞれpFD1/HBsAg−Ｉ＃11、＃1
2、＃14、＃16、＃17と命名した。

（Ｅ）pFD1/HBsAg−Ｉプラスミドに挿入された化学合成
DNA部分のシーケンシング pFD1/HBsAg−Ｉプラスミドの化学合成DNA断片が挿入
された部分は、制限酵素Hinc IIとPst Iで切断されて生
じる断片のうち、分子サイズにして大きい方から３番目
の断片に含まれる。

（ａ）pFD1/HBsAg−ＩプラスミドのHinc II、Pst Iによ
る二重消化 実施例−Ｄの＃11、＃12、＃14、＃16、＃17の５株
をアンピシリン50μg/mlを含むLB培地10ml中で１日培養
し、各株のラピッドDNA解析用の試料を作る。その試料
を150μｌのTE緩衝液に溶かす。

上記の試料に、10培Pvu II緩衝液22μｌ、70mM2−メ
ルカプトエタノール22μｌ、0.2％ウシ血清アルブミン1
1μｌ、Hinc II80単位/10μｌ、Pst I96単位/12μｌを
加え、37℃で１時間反応を進める。

遠心エバポレーター（佐久間製作所）で100μｌまで
濃縮し、10μｌのサンプルバツファーを加え、0.8％の
アガロースゲル電気泳動を行なう。分子サイズにして大
きい方から３番目の螢光バンドを切り取り、電気溶出を
行ない、エタノール沈殿後、15μｌのTE緩衝液に溶か
す。

（ｂ）M13mp18 FR DNAのHinc II、Pst Iによる二重消化 M13mp8 RF DNAのかわりにM13mp18 RF DNA2μg/4μ
ｌ、また水66μｌを加えること以外は実施例−Ｄ−ｂ
と同様にしてHinc II、Pst Iによる二重消化を行なっ
た。

（ｃ）Hinc II−Pst I断片のM13mp18ベクターへのクロ
ーニングとDNAシーケンシング 実施例−Ｅ−ａの＃11、＃12、＃14、＃16、＃17株
のDNA試料４μｌのそれぞれに、実施例−Ｅ−ｂのDNA
試料４μｌ（400ng）を加え、５倍ライゲーションバッ
ファー４μｌ、100mMDTT2μｌ、10mMATP2μｌ、水１μ
ｌ、T4DNAリガーゼ１単位/1μｌを加えて、16℃で16時
間反応させ、全量をJM109株へトランスフェクションし
た。

M13mp18ベクターへクローン化した後、１本鎖DNAを調
製し、ジデオキシヌクレオチド鎖終止法でDNAシーケン
シングを行なった。その結果、各株プラスミドにおける
化学合成DNA部分の構造が以下の通り決定した。

pFD1ベクタープラスミドを用いたポリペプチドHBsA
g−IIをキメラ化したフラジェリンの排出 （Ａ）cc−pFD1の制限酵素Hind IIIによる切断とクレノ
−フラグメントによる修復 実施例−Ａと同様にして、cc−pFD1を制限酵素Hind
IIIで切断し、クレノ−フラグメントによって修復し
た。

（Ｂ）合成ポリヌクレオチドのアニーリング 化学合成ポリヌクレオチドとしてRSM−2103（５′ACA
AACCTTCGGATGGAAATGG3′）、RSM−2104（５′CCATTTCCA
TCCGAAGGTTTTGT3′）を用いて、実施例−Ｂと同様に
アニーリングを行なった。

（Ｃ）pFD1ベクターへの化学合成DNAの連結 実施例−Ｃと同様にして、pFD1ベクターへ化学合成
DNAを連結した。

（Ｄ）形質転換した菌株の選択 実施例−Ｃの試料DNAを、C600r^-m^-hag::Tn10株へ形
質転換した。50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地上
に、１μｇのpFD1 DNAあたり２×10⁴個のアンピシリン
抵抗性コロニーが出現した。そのうち68個のコロニーの
遊走性を調べ、43株が遊走性を示した。そのうち16株に
ついて、実施例−Ｄと同様に、その菌株が持つプラス
ミドのラピッドプラスミド解析を行ない、＃１、＃２、
＃３、＃６、＃８、＃13、＃16の７株が持つプラスミド
がHind IIIで切断されなくなっていた。この菌株の持つ
プラスミドをそれぞれpFD1/HBsAg−II＃１、＃２、＃
３、＃６、＃８、＃13、＃16と命名した。

（Ｅ）pFD1/HBsAg−IIプラスミドに挿入された化学合成
DNA部分のシーケンシング DNAシーケンシングは、pFD1/HBsAg−II＃１、pFD1/HB
sAg−II＃13のプラスミドについて、実施例−Ｅと同
様にして行なった。両プラスミドにおける化学合成DNA
部分の構造を以下に示す。

pHD1変異による鞭毛数の増加 （Ａ）dam^-菌からのpFD1、pFD1/HBsAg−Ｉ、pFD1/HBsAg
−IIプラスミドcc−DNAの調製 C600r^-m^-hag::Tn10株でpFD1、pHD1、pFD1/HBsAg−Ｉ
＃11、pFD1/HBsAg−II＃１をそれぞれ持つ菌株のラピッ
ドDNA解析用の試料DNAを調製する。各DNA試料を用い
て、GM33dam^-株を形質転換し、GM33dam^-（pFD1）、GM33
dam^-（pHD1）、GM33dam^-（pFD1/HBsAg−Ｉ＃11）、GM33
dam^-（pFD1/HBsAg−II＃１）株を確立する。各株から実
施例−Ｄ−ａと同様にして、ccDNAを精製した。

（Ｂ）pHD1プラスミドからのEcoR I−Bcl1（約1.4kbp）
DNA断片の調製 実施例−Ａのcc−pHD1 DNA29.7μg/25μｌに10倍Bc
l1緩衝液（500mMトリス塩酸（pH8.0）、100mM塩化マグ
ネシウム、500mM塩化ナトリウム）20μｌ、70mM2−メル
カプトエタノール20μｌ、0.2％ウシ血清アルブミン10
μｌ、EcoR I75単位/10μｌ、水105μｌを加え、37℃で
１時間反応を進めた後、Bcl1 50単位/5μｌを加え、50
℃で１時間反応させる。反応後の189μｌと20μｌのサ
ンプルバッファーを混合し、0.8％のアガロースゲル電
気泳動を行なう。1.4Kbpに相当する螢光バンドを切り取
り、実施例−Ｅ−ａと同様にして電気溶出を行ない、
30μｌのTE緩衝液に溶かす。

（Ｃ）pFD1、pFD1/HBsAg−Ｉ＃11、pFD1/HBsAg−II＃１
のEcoR I消化、アルカリフオスフアターゼ（BAP）処
理、Bcl1による部分消化 実施例−Ａのcc−pFD1 DNA、cc−pFD1/HBsAg−Ｉ＃
11DNAあるいはcc−pFD1/HBsAg−II＃1DNA40μg/40μｌ
に、10倍EcoR I緩衝液（1Mトリス塩酸（pH7.5）、70mM
塩化マグネシウム、500mM塩化ナトリウム）16μｌ、70m
M2−メルカプトエタノール16μｌ、0.2％ウシ血清アル
ブミン８μｌ、EcoR I60単位/8μｌを加え、37℃で30分
間反応を進め、水を加えて160μｌとし、更に37℃で１
時間反応させる。次いで、各試料に1Mトリス塩酸（pH8.
0）６μｌ、BAP1.2単位/10μｌ、水25μｌを加え、65℃
で30分間反応させる。

フェノール・クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を
行ない、100μｌのTE緩衝液に溶かす。次いで、上記の
各試料８μgDNA/20μｌに10倍Bcl1緩衝液８μｌ、0.2％
ウシ血清アルブミン４μｌ、水44μｌ、Bcl12単位/4μ
ｌを加え、50℃で40分間反応を進め、フェノール・クロ
ロホルム抽出、エタノール沈殿後、40μｌのTE緩衝液に
溶かす。

（Ｄ）連結反応 実施例−Ｂの試料DNA約90ng/30μｌ、実施例−Ｃ
の試料DNA800ng/4μｌ、10倍ライゲーションバッファー
３μｌ、100mMDTT3μｌ、10mMATP3μｌ、水12μｌにT4D
NAリガーゼ２単位/2μｌを加え、16℃で16時間反応させ
る。

（Ｅ）形質転換 実施例−Ｄの試料DNAをTE緩衝液に対し３時間透析
後、C600r^-m^-hag::Tn10の形質転換に用いた。50μg/ml
のアンピシリンを含むLB培地に、操作後のpFD1 DNA1μ
ｇ当り2.6×10⁵個、pFD1/HBsAg−Ｉ＃11 DNA1μｇ当り
3.75×10⁵個、pFD1/HBsAg−II＃1 DNA1μｇ当り2.4×10
⁵個のコロニーを得た。

（Ｆ）形質転換コロニーの遊走性ならびにそれら菌株の
有するプラスミド上のHind III切断点の有無 実施例−Ｅの形質転換株について、遊走性の有無を
検討した。操作したpFD1の形質転換によって得られた45
株のうち、11株が遊走性を示した。pFD1/HBsAg−Ｉ＃1
1、pFD1/HBsAg−II＃１からは、それぞれ45株のうち12
株が遊走性を有した。これら、11株、12株、12株のラピ
ッドDNA解析用のDNA試料を作成した。ラピッドDNA解析
用の試料DNA7μｌ、10倍EcoR I緩衝液１μｌ、70mM2−
メルカプトエタノール１μｌ、0.2％ウシ血清アルブミ
ン0.5μｌ、EcoR I4単位/0.5μｌ、Hind III5単位/0.5
μｌで37℃、30分間反応させた。0.8％アガロースゲル
電気泳動で生じるDNA断片を検討した。pFD1より得られ
た11株から、1.4Kbpと0.7kbpを含む３個の断片を生じる
プラスミドを見つけ、pHFD1と命名し、このプラスミド
を持つ菌株を純化してC600r^-m^-hag::Tn10（pHFD1）とし
て確立した。pFD1/HBsAg−Ｉ＃11より得られた12株から
1.4Kbpを含む２個の断片を生じるプラスミドを見つけpH
FD1/HBsAg−Ｉ＃11と命名し、このプラスミドを持つ菌
株を純化してC600r^-m^-hag::Tn10（pHFD1/HBsAg−Ｉ＃1
1）として確立した。同様に、操作したpFD1/HBsAg−II
＃１より得られた12株から1.4Kbpを含む２個の断片を生
じるプラスミドを見つけ、pHFD1/HBsAg−II＃１と命名
し、このプラスミドを持つ菌株を純化してC600r^-m^-ha
g::Tn10（pHFD1/HBsAg−II＃１）として確立した。

（Ｇ）pHD1変異を持つhag遺伝子を有するプラスミドに
依存する遊走性 C600r^-m^-（pBR322）、C600r^-m^-hag::Tn10（pFD3）、C
600r^-m^-hag::Tn10（pHFD1）、C600r^-m^-hag::Tn10（pHFD
1/HBsAg−Ｉ＃11）、C600r^-m^-hag::Tn10（pHFD1/HBsAg
−II＃１）の５株について遊走性を検討した。５株を50
μg/mlのアンピシリンを含むLB培地に純化し、37℃で１
晩培養し、生じたコロニーを50μg/mlのアンピシリンを
含む遊走検定培地（１％バクトトリプトン、0.25％塩化
ナトリウム、チアミン５μg/ml、0.3％寒天、pH7.0）に
接種する。37℃と30℃で培養し、６時間後の遊走ゾーン
の直径を検討した（表３）。

pHFD1、pHFD1/HBsAg−Ｉ＃11、pHFD1/HBsAg−II＃１
を持つC600r^-m^-hag::Tn10株の遊走能はpHD3を持つ同株
より常によく遊走し、野生株C600r^-m^-（pBR322）に近
い。

pFD1、pFD303、pFD306、pFD307、pFD311、pFD315ベ
クタープラスミドを用いたポリペプチドHBsAg−IIIをキ
メラ化したフラジェリンの排出 （Ａ）cc−pFD1、cc−pFD303、cc−pFD306、cc−pFD30
7、cc−pFD311、cc−pFD315の制限酵素Hind IIIによる
切断とクレノ−フラグメントによる修復 cc−pFD1、cc−pFD303、cc−pFD306、cc−pFD307、cc
−pFD311、cc−pFD315それぞれを実施例−Ａと同様に
して制限酵素Hind IIIにより切断し、クレノ−フラグメ
ントで修復した。

（Ｂ）合成ポリヌクレオチドの組立て 化学合成ポリヌクレオチドHBsAgA−１^＊１、HBsAgA−
２^＊２、HBsAgA−３^＊３、HBsAgA−４^＊４、HBsAgA−５
^＊５をZEON GENET A−II（ゼオン社）を用いて、固相フ
ォスフォロアミダイト法で合成した。

＊１ ５′TTGACACGTATCCTCACAATACCGCAGTC3′ ＊２ ５′ACTAGACTCGTGGGG3′ ＊３ ５′GAGGATACGTGTCAA3′ ＊４ ５′CTAGTGACTGCGGTATTGT3′ ＊５ ５′CCCCACGAGT3′ HBsAgA−２（500pM/12.2μｌ）、HBsAgA−３（500pM/
12.2μｌ）、HBsAgA−４（500pM/15.4μｌ）を３本のエ
ッペンドルフ1.5ml容チューブにとり、それぞれに水19.
8μｌ、19.8μｌ、16.6μｌを加える。続いて、10倍キ
ナーゼ緩衝液Ｉ（0.5Mトリス塩酸（pH7.6）、0.1M塩化
マグネシウム、50mMジチオスレイトール、1mMスペルミ
ジン、1mMEDTA）10μｌ、γ−³²PATP（5000Ci/mM:10μC
/μｌ、アマルシャム）１μｌ、10μMATP5μｌ、T4ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）２μｌを加え37℃で30
分間加温する。更に、1mMATPを2.5μｌ、T4ポリヌクレ
オチドキナーゼ５単位/2μｌ加え、37℃で１時間反応さ
せ、90℃で５分間加熱後氷中で急冷する。

上記の反応物HBsAgA−２、HBsAgA−３、HBsAgA−４全
量とHBsAgA−１（500pM/23.5μｌ）、HBsAgA−５（500p
M/8.1μｌ）を混合し、透析膜（スペクトラ・ポア／分
子量カットオフ1000、スペクトラムメディカルインダス
トリ社）に入れ、水中で４℃で１晩透析する。エッペン
ドルフ1.5mlチューブに移し、遠心エバポレーターで濃
縮する。15μｌのトリス塩酸（pH7.6）、10mM塩化マグ
ネシウムに溶かし、60℃で30分間加温し、６時間かけて
室温までゆっくり戻す。５倍ライゲーションバツファー
16μｌ、200mMDTT4μｌ、10mMATP、T4DNAリガーゼ22.4
単位/8μｌ、水37μｌを加え、15℃で16時間反応を進め
る。15％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、オート
ラジオグラフィーでバンドを検出し、44bpの位置のバン
ドを切り出し、エッペンドルフ1.5ml容チューブに入れ
ガラス棒で粉砕し、水を1ml加え、４℃で16時間抽出す
る。遠心後、上清（約700μｌ）を遠心エバポレーター
で濃縮する。約200μｌまで濃縮したところで再び遠心
し、ゲルの残渣を除く。

（Ｃ）pFD1、pFD303、pFD306、pFD307、pFD311、pFD315
への化学合成DNAの連結 実施例−Ａの試料DNA500ng/1μｌ、実施例−Ｂの
合成DNA250pM/100μｌ、５倍ライゲーションバツファー
４μｌ、200mMDTT2μｌ、10mMATP2μｌ、T4DNAリガーゼ
２μｌ、水４μｌを加え、15℃で16時間反応を進める。
TE緩衝液に対して透析後、全量を形質転換に用いた。

（Ｄ）形質転換した菌株の選択と遊走性の有無 実施例−Ｃの試料DNAを用いてC600r^-m^-hag::Tn10株
へ形質転換した。50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地
上に、５×10⁴コロニー/1μgpFD1DNA、２×10⁵コロニー
/1μgpFD303DNA、1.8×10⁵コロニー/1μgpFD306DNA、2.
3×10⁴コロニー/1μgpFD307DNA、1.3×10⁵コロニー/1μ
gpFD311DNA、８×10⁴コロニー/1μgpFD315DNAが出現し
た。

各グループより100個のコロニーの遊走性を遊走検定
用培地上で検討し、遊走したコロニーを６株づつアンピ
シリン50μg/mlを含むLB培地で１晩培養し、菌株の持つ
プラスミド上のHind III切断点の有無を検討した。ベク
ター側のHind III制限点はHind IIIで切断後、クレノ−
フラグメントで修復されているため、合成DNA HBsAg−I
IIが順向きに挿入され、合成DNAの５′端からＴが供給
された場合、Hind III制限点は復活する。一方挿入され
ていなかったり逆向きに挿入されているとHind III制限
点は存在しない。従ってHind IIIとSst II（Sst II制限
点は挿入点の下流に比較的近い距離に存在する）で切断
した場合、小断片が生じれば合成DNAは順向きに挿入さ
れており、小断片が生じなければ合成DNAは挿入されて
いないか、逆向きに挿入されている。以上によって、順
向きに挿入された合成DNAの有無を推定できるので各株
の持つプラスミドのラピッドDNA解析試料を調製し、Hin
d III、Sst IIの二重消化を行なった。DNA試料８μｌ、
10倍Sst II緩衝液（500mMトリス塩酸（pH8.0）、100mM
塩化マグネシウム、500mM塩化ナトリウム）２μｌ、70m
M2−メルカプトエタノール２μｌ、Hind III10単位/1μ
ｌ、Sst II7単位/1μｌ、水６μｌで二重消化を行な
い、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（150V、95
分）後、臭化エチジウムで染色して小断片にあたる螢光
バンドの有無を検討した。その結果、各グループから２
株づつ合成DNAが順向きに挿入されかつ遊走性がある菌
株を確立できた。これらの菌株はプラスミド上に挿入さ
れた化学合成DNA部分（HBsAg−III）がコードするペプ
チドLeu−Thr−Arg−Ile−Leu−Thr−Ile−Pro−Gln−S
er−Leu−Asp−Ser−Trp−Glyをキメラ化したフラジェ
リンを鞭毛として排出している。

pFD1、pFD303、pFD306、pFD307、pFD311、pFD315ベ
クタープラスミドを用いたポリペプチドHBsAg−IVをキ
メラ化したフラジェリンの排出 （Ａ）cc−pFD1、cc−pFD303、cc−pFD306、cc−pFD30
7、cc−pFD311、cc−pFD315の制限酵素Hind IIIによる
切断とクレノ−フラグメントによる修復 実施例−Ａと同様にして、cc−pFD1、cc−pFD303、
cc−pFD306、cc−pFD307、cc−pFD311、cc−pFD315を制
限酵素Hind IIIで切断し、クレノ−フラグメントによつ
て修復した。

（Ｂ）合成ポリヌクレオチドの組立て 化学合成ポリヌクレオチドHBsAgB−１^＊１、HBsAgB−
２^＊２、HBsAgB−３^＊３、HBsAgB−４^＊４、HBsAgB−５
^＊５、HBsAgB−６^＊６を実施例−Ｂと同様にして合成
する。

＊１ ５′TTGGTTCTTCTGGATTAT3′ ＊２ ５′CAGAAGAACCAA3′ ＊３ ５′CAAGGTATGTTGCCCGT3′ ＊４ ５′AACATACCTTGATAATC3′ ＊５ ５′TTGTCCTCTAGG3′ ＊６ ５′CCTAGAGGACAAACGGGC3′ HBsAgB−２、HBsAgB−５をそれぞれ500pM/9.7μｌ、H
BsAgB−３、HBsAgB−４をそれぞれ500pM/13.8μｌづ
つ、４本のエッペンドルフ1.5ml容チューブにとり、そ
れぞれに水を22.3μｌ、22.3μｌ、18.2μｌ、18.2μｌ
づつ加える。実施例−Ｂと同様にして、合成ポリヌク
レオチドの５′端をリン酸化する。上記の反応物全量と
HBsAgB−１、HBsAgB−６各14.6μｌを混合し、実施例
−Ｂと同様にして連結する。次いで、連結反応後の試料
をポリアクリルアミド電気泳動で分離し、200μｌの試
料DNAを得る。

（Ｃ）pFD1、pFD303、pFD306、pFD307、pFD311、pFD315
への化学合成DNAの連結 実施例−Ｃと同様にして、ベクター分子へHBsAg−I
V DNAを連結し、反応物全量を形質転換に用いる。

（Ｄ）形質転換した菌株の選択と遊走性の有無 実施例−Ｃの試料DNAを用いて、C600r^-m^-hag::Tn10
株へ形質転換した。50μg/mlのアンピシリンを含むLB培
地上には、4.4×10⁴コロニー/1μg pFD1 DNA、2.9×10⁴
コロニー/1μg pHD303 DNA、3.8×10⁴コロニー/1μg pF
D306 DNA、3.2×10⁴コロニー/1μg pFD307 DNA、1.4×1
0⁵コロニー/1μg pFD311 DNA、5.8×10⁴コロニー/1μg
pFD315 DNAが出現した。実施例−Ｂと同様にして、各
グループより遊走する菌株６株を選び、その菌株につい
て化学合成DNA HBsAg−IVが順向きに挿入されているプ
ラスミドを持つ菌株を各グループより２株確立した。こ
れら菌株はプラスミド上に挿入された化学合成DNA部分
（HBsAg−IV）がコードするペプチドLeu−Val−Leu−Le
u−Asp−Tyr−Gln−Gly−Met−Leu−Pro−Val−Cys−Pr
o−Leu−Glyをキメラ化したフラジェリンを鞭毛として
排出している。

参考例 プラスミドpBR322/hag93 cc−DNAによる大腸菌
JA11株の形質転換 大腸菌JA11株（微工研菌寄第8853号）をハナハンらの
方法（D.Hanahan、ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー（J.Mol.Biol.），166、557−580（198
3））により培養してコンピテント化する。ハナハンら
の方法（上記）により作成した−70℃で凍結したJA11株
のコンピテントセル210μｌを溶かし、０℃氷中でTE緩
衝液20μｌに溶かしたプラスミドpBR322/hag93のcc−DN
A200ngを加える。30分間０℃氷中に置き、42℃で100秒
加熱後、SOC培養液0.8mlを加え、37℃で１時間振盪培養
する。培養後、菌液を10⁴希釈し、その0.1mlをアンピシ
リン50μg/mlを含むLB寒天培地上に拡げる。１晩37℃で
培養後、52個のコロニーが出現した。この結果はJA11株
がpBR322/hag93のcc−DNA 1μｇ当り2.6×10⁷コロニー
の効率で形質転換されたことがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は大腸菌のフラジェリンをコードするhag遺伝子
の塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を示
す。第２図はλpfla−H2のEcoR IならびにSal Iによる
消化結果を示し、斜線部はhag遺伝子を含む大腸菌染色
体由来のDNA断片の推定位置を示す。第３図はpBR322/ha
g9のEcoR IならびにSal Iによる消化結果を示す。第４
図はpBR322/hag9のBamH I切断点を示す。第５図はpBR32
2/hag9のＢ断片を欠損したプラスミドpBR322/hag93を示
す。第６図はpBR322/hag93上の５ケ所のHinc IIによる
切断点を示す。第７図はpUC9/hag6を示す。第８図はhag
遺伝子の塩基配列決定のスケジユールを示す。第９図は
DNAシーケンシングの結果得られたhag遺伝子の全一次構
造を示す。第10図はpFD1,pFD2,pFD3の簡単な制限酵素マ
ツプを示す。第11図はpFD1、pFD2、pFD3のHind III切断
点付近のDNAシーケンシングスケジュールを示す。第12
図はpHD1のHind III切断点付近のDNAシーケンシングス
ケジュールを示す。第13図はpFD3とpFD301を示す。第14
図はpFD301,pFD303,pFD306およびpFD307が運搬するhag
遺伝子のシーケンスを示す。第15図はpFD311、pFD313お
よびpFD315が運搬するhag遺伝子のシーケンスを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 新 優 神戸市北区広陵町３―110 (56)参考文献 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏ ｌ．155，Ｎｏ．１，Ｐ．74−81（1983)

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】大腸菌のフラジェリンを実質的にコードし
   ているDNA配列であって、第１図に示される塩基配列の5
   83位〜1143位が欠損しており、その欠損部分に所望の配
   列が挿入されていることある、以下に記載のアミノ酸配
   列、またはそのアミノ酸配列に１個または数個のアミノ
   酸の置換、欠損、付加を含むアミノ酸配列変異体であっ
   てそのアミノ酸配列と同等の機能を有するアミノ酸配列
   変異体、をコードするDNA配列： ［式中、−Ｘ−は、単結合、１つまたはそれ以上のリン
   カーに相当する部分、またはリンカー内に挿入された目
   的のペプチドのアミノ酸配列である］。
2. 【請求項２】−Ｘ−が１つまたはそれ以上のリンカーに
   相当する部分である特許請求の範囲第１項に記載のDNA
   配列。
3. 【請求項３】フラジェリンが大腸菌由来である特許請求
   の範囲第１項に記載のDNA配列。
4. 【請求項４】該大腸菌が大腸菌Ｋ−12株である特許請求
   の範囲第１項に記載のDNA配列。
5. 【請求項５】該大腸菌Ｋ−12株がHK552株である特許請
   求の範囲第４項に記載のDNA配列。
6. 【請求項６】大腸菌のフラジェリンを実質的にコードし
   ているDNA配列であって、第１図に示される塩基配列の5
   83位〜1143位が欠損しており、その欠損部分に所望の配
   列が挿入されていることある、以下に記載のアミノ酸配
   列、またはそのアミノ酸配列に１個または数個のアミノ
   酸の置換、欠損、付加を含むアミノ酸配列変異体であっ
   てそのアミノ酸配列と同等の機能を有するアミノ酸配列
   変異体、をコードするDNA配列、を有するベクター： ［式中、−Ｘ−は、単結合、１つまたはそれ以上のリン
   カーに相当する部分、またはリンカー内に挿入された目
   的のペプチドのアミノ酸配列である］。
7. 【請求項７】−Ｘ−が１つまたはそれ以上のリンカーに
   相当する部分である特許請求の範囲第６項に記載のベク
   ター。
8. 【請求項８】フラジェリンが大腸菌由来である特許請求
   の範囲第６項に記載のベクター。
9. 【請求項９】該大腸菌が大腸菌Ｋ−12株である特許請求
   の範囲第６項に記載のベクター。
10. 【請求項１０】該大腸菌Ｋ−12株がHK552株である特許
    請求の範囲第９項に記載のベクター。