JP2560334B2 - 新規な耐熱性中性プロテア−ゼおよびその製法 - Google Patents
新規な耐熱性中性プロテア−ゼおよびその製法Info
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- JP2560334B2 JP2560334B2 JP62193409A JP19340987A JP2560334B2 JP 2560334 B2 JP2560334 B2 JP 2560334B2 JP 62193409 A JP62193409 A JP 62193409A JP 19340987 A JP19340987 A JP 19340987A JP 2560334 B2 JP2560334 B2 JP 2560334B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は新規な耐熱性中性プロテアーゼおよびその製
法に関するものである。さらに詳しくは、本発明はバチ
ルス属に属する微生物が生産する耐熱性に優れた新規な
耐熱性中性プロテアーゼおよびその製法に関するもので
ある。
法に関するものである。さらに詳しくは、本発明はバチ
ルス属に属する微生物が生産する耐熱性に優れた新規な
耐熱性中性プロテアーゼおよびその製法に関するもので
ある。
（従来の技術） 従来、耐熱性中性プロテアーゼ及びその製法としては
醗酵工学会誌第40巻第346頁（1962）、ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（Journal of Bacterilogy）第15
4巻第381頁（1983）及び特開昭58−16229号公報等が報
告されている。
醗酵工学会誌第40巻第346頁（1962）、ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（Journal of Bacterilogy）第15
4巻第381頁（1983）及び特開昭58−16229号公報等が報
告されている。
（発明が解決しようとする問題点） しかしながら醗酵工学会誌第40巻第346頁（1962）で
はプロテアーゼの耐熱性が十分に用途を満足するもので
はなく、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journa
l of Bacterilogy）第154巻第831頁（1983）及び特開昭
58−16229号公報においてはプロテアーゼの生産性が十
分でないことから工業的に使用し得る耐熱性中性プロテ
アーゼを効果的に製造するには必ずしも有利な方法とは
なっていない。
はプロテアーゼの耐熱性が十分に用途を満足するもので
はなく、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journa
l of Bacterilogy）第154巻第831頁（1983）及び特開昭
58−16229号公報においてはプロテアーゼの生産性が十
分でないことから工業的に使用し得る耐熱性中性プロテ
アーゼを効果的に製造するには必ずしも有利な方法とは
なっていない。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らは上記問題点を解決するため鋭意研究を重
ねた結果、大阪府堺市の土壌より採取した微生物から、
従来の耐熱性中性プロテアーゼよりも熱安定性に優れた
耐熱性中性プロテアーゼを生産する菌株を見出し、本発
明に到達した。すなわち本発明は下記理化学的性質
（１）〜（６）を有し、かつ80℃において60分間加温処
理しても70％以上の中性プロテアーゼ活性を有する新規
な耐熱性中性プロテアーゼである。
ねた結果、大阪府堺市の土壌より採取した微生物から、
従来の耐熱性中性プロテアーゼよりも熱安定性に優れた
耐熱性中性プロテアーゼを生産する菌株を見出し、本発
明に到達した。すなわち本発明は下記理化学的性質
（１）〜（６）を有し、かつ80℃において60分間加温処
理しても70％以上の中性プロテアーゼ活性を有する新規
な耐熱性中性プロテアーゼである。
（１） 作用：カゼインを加水分解し、ペプチドまたは
アミノ酸を生成する。
アミノ酸を生成する。
（２） 基質特異性：カゼインまたはカルボベンゾキシ
・グリシル・ロイシンに作用する。
・グリシル・ロイシンに作用する。
（３） 至適pHおよび安定pH:pH7〜８付近pH6〜９では4
0℃、20時間放置しても安定である。
0℃、20時間放置しても安定である。
（４） 至適作用温度:80℃付近 （５） 阻害剤の影響:EDTAによって失活する。PMFSに
よって阻害されない。
よって阻害されない。
（６） 分子量：約35,000（SDS−PAGEによる） また本発明は上記理化学的性質（１）〜（６）を有
し、かつ80℃において60分間加温処理しても70％以上の
中性プロテアーゼ活性を有する新規な耐熱性中性プロテ
アーゼを生産するバチルス属菌株を栄養培地にて培養
し、培養物中に新規な耐熱性中性プロテアーゼを蓄積せ
しめ、該培養物から新規な耐熱性中性プロテアーゼを採
取することを特徴とする新規な耐熱性中性プロテアーゼ
の製造方法である。
し、かつ80℃において60分間加温処理しても70％以上の
中性プロテアーゼ活性を有する新規な耐熱性中性プロテ
アーゼを生産するバチルス属菌株を栄養培地にて培養
し、培養物中に新規な耐熱性中性プロテアーゼを蓄積せ
しめ、該培養物から新規な耐熱性中性プロテアーゼを採
取することを特徴とする新規な耐熱性中性プロテアーゼ
の製造方法である。
本発明の新規な耐熱性中性プロテアーゼを生産する菌
株、TELNE株の菌学的性質を以下に示す。
株、TELNE株の菌学的性質を以下に示す。
（ａ）形態 大きさ:0.3〜0.6×3.0〜6.0μｍ 胞 子:0.5〜1.0×1.0〜2.0μｍ 運動性：＋ グラム染色：グラム陽性 （ｂ）生理学的性質 硝酸の還元性：陰性 インドールの生成：陰性 硫化水素の生成：陰性 デンプンの加水分解：陽性 カゼインの加水分解：陽性 クエン酸の利用：陰性 カタラーゼ：陽性 オキシダーゼ：陽性 生育温度:38℃〜67℃ 生育pH:pH5.7〜7.8 以上の菌学的性質からバージェーズ・マニュアル・オ
ブ・デターミネイブ・バクテリオロジー第８版（1974）
により検索すると、TELNE株はバチルス属に属するとみ
なされ、さらにバチルス・ステアロサーモフィラスとよ
く一致する。従って本菌株をバチルス・ステアロサーモ
フィラス（Bacillus stearothermophilus）TELNEと命名
した。本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微生
物受託番号、微工研菌寄第9439号（FERM P−9439）とし
て寄託されている。
ブ・デターミネイブ・バクテリオロジー第８版（1974）
により検索すると、TELNE株はバチルス属に属するとみ
なされ、さらにバチルス・ステアロサーモフィラスとよ
く一致する。従って本菌株をバチルス・ステアロサーモ
フィラス（Bacillus stearothermophilus）TELNEと命名
した。本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微生
物受託番号、微工研菌寄第9439号（FERM P−9439）とし
て寄託されている。
本発明に使用する微生物としてはバチルス・ステアロ
サーモフィラスTELNEが一例として挙げられるがこの菌
だけに限らずバチルス属に属し、新規な耐熱性中性プロ
テアーゼを生産する天然から採取される菌は全て本発明
において使用することができる。
サーモフィラスTELNEが一例として挙げられるがこの菌
だけに限らずバチルス属に属し、新規な耐熱性中性プロ
テアーゼを生産する天然から採取される菌は全て本発明
において使用することができる。
本発明方法では、まずバチルス属に属する新規な耐熱
性中性プロテアーゼ生産菌を、酵素を生産する通常の方
法で培養する。使用する培地組成としては、菌株が資化
しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を
適量含有するものであれば、合成培地、天然培地いずれ
も使用できる。例えば炭素源としてはグルコース、ラク
トース、デンプンなどが使用される。窒素源としてはポ
リペプトン、NH4Cl、カゼイン、大豆粕などが使用され
る。
性中性プロテアーゼ生産菌を、酵素を生産する通常の方
法で培養する。使用する培地組成としては、菌株が資化
しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を
適量含有するものであれば、合成培地、天然培地いずれ
も使用できる。例えば炭素源としてはグルコース、ラク
トース、デンプンなどが使用される。窒素源としてはポ
リペプトン、NH4Cl、カゼイン、大豆粕などが使用され
る。
培養温度は38〜67℃の範囲、好ましくは50〜55℃付
近、培養pH5.7〜7.8の範囲、好ましくは6.5〜7.0に制御
するのがよい。これら以外の条件でも使用する菌株が生
育すれば実施できる。培養期間は、通常10〜30時間で生
育し、培養液中に耐熱性中性プロテアーゼが生成蓄積さ
れる。
近、培養pH5.7〜7.8の範囲、好ましくは6.5〜7.0に制御
するのがよい。これら以外の条件でも使用する菌株が生
育すれば実施できる。培養期間は、通常10〜30時間で生
育し、培養液中に耐熱性中性プロテアーゼが生成蓄積さ
れる。
培養終了後、培養液より遠心分離及び濾過などの固液
分離手段により菌体及び不溶物を除いて粗酵素液を得
る。
分離手段により菌体及び不溶物を除いて粗酵素液を得
る。
この様にして得られた粗酵素液から、例えば硫安分別
法、有機溶媒分別法、透析、等電点沈澱法及びカラムク
ロマトグラフィー等、通常の酵素精製法を単独あるいは
組合せて用いることにより精製された新規な耐熱性中性
プロテアーゼを得ることができる。
法、有機溶媒分別法、透析、等電点沈澱法及びカラムク
ロマトグラフィー等、通常の酵素精製法を単独あるいは
組合せて用いることにより精製された新規な耐熱性中性
プロテアーゼを得ることができる。
耐熱性中性プロテアーゼの活性測定法は次の通りであ
る。
る。
基質溶液：カゼイン ２％ H3BO4−Na2B4O4 10mM CaSO4 2mM PH7.2 反応停止液:20％トリクロロ酢酸溶液 上記の２％カゼイン溶液の1mlを試験管に分取し、35
℃で５分間予備加温する。酵素溶液を1ml添加し混和後1
0分間反応する。上記の20％トリクロロ酢酸溶液を2ml加
え反応を停止させた後、35℃で30分間放置後、遠心分
離、濾過等により不溶物を除去し、275nmの吸光度を記
録する。盲検は上記操作において、酵素溶液を添加する
前に20％トリクロロ酢酸溶液を添加し、その後酵素溶液
を加えたものを用いる。
℃で５分間予備加温する。酵素溶液を1ml添加し混和後1
0分間反応する。上記の20％トリクロロ酢酸溶液を2ml加
え反応を停止させた後、35℃で30分間放置後、遠心分
離、濾過等により不溶物を除去し、275nmの吸光度を記
録する。盲検は上記操作において、酵素溶液を添加する
前に20％トリクロロ酢酸溶液を添加し、その後酵素溶液
を加えたものを用いる。
本発明の耐熱性中性プロテアーゼの活性の表示は上記
条件で１分間当り１μｇのチロシンを生じる活性を１単
位とした。
条件で１分間当り１μｇのチロシンを生じる活性を１単
位とした。
次に本発明で得られる耐熱性中性プロテアーゼの理化
学的性質を示す。
学的性質を示す。
（１） 作用：本酵素はカゼイン等の蛋白質を加水分解
し、ペプチドまたはアミノ酸を生成する。
し、ペプチドまたはアミノ酸を生成する。
（２） 基質特異性：カゼイン等の天然蛋白質及びカル
ボベンゾキシ・グリシル・ロイシンの様な合成ペプチド
にも作用する。
ボベンゾキシ・グリシル・ロイシンの様な合成ペプチド
にも作用する。
（３） 至適pH及びpH安定性：至適pHはpH7〜８付近に
有り、pH安定性はpH6〜９、40℃、20時間放置しても安
定である。
有り、pH安定性はpH6〜９、40℃、20時間放置しても安
定である。
（４） 至適作用温度：本酵素の至適作用温度は、80℃
付近である。
付近である。
（５） 阻害剤の影響：本酵素はEDTAによって失活す
る。又、PMSF（フェニルメタン・スルフォニル・フルオ
ライド）によって阻害を受けない。
る。又、PMSF（フェニルメタン・スルフォニル・フルオ
ライド）によって阻害を受けない。
（６） 分子量：本酵素の分子量は約35,000、（SDS−P
AGEによる） 本発明の新規な耐熱性中性プロテアーゼは80℃におい
て、60分間加温処理しても70％以上の中性プロテアーゼ
活性を有する。従来のバチルス・サーモプロテオリティ
テカス由来の耐熱性中性プロテアーゼ（サーモライシ
ン）に比較して耐熱性に優れる。
AGEによる） 本発明の新規な耐熱性中性プロテアーゼは80℃におい
て、60分間加温処理しても70％以上の中性プロテアーゼ
活性を有する。従来のバチルス・サーモプロテオリティ
テカス由来の耐熱性中性プロテアーゼ（サーモライシ
ン）に比較して耐熱性に優れる。
（実施例） 以下本発明を実施例により説明する。
実施例１ 以下の組成の培地を調整した。
ラクトース ４ ％ MgSO4.7H2O 0.002 ％ カゼイン 1.25 ％ FeSO4.7H2O 0.005 ％ 酵母抽出物 0.25 ％ MnCl2.4H2O 0.0002％ ポリペプトン 0.2 ％ Na2MoO4.2H2O 0.0001％ CaCl2.2H2O 0.03 ％ pH7.50 ZnSO4.7H2O 0.001％ 上記培地100mlを500ml容坂口フラスコに移し、121
℃、15分間オートクレーブにより滅菌を行った。放冷
後、種母としてバチルス・ステアロサーモフィラス（Ba
cillus stearothermophilus）TELNE（FERM P−9439）を
同培地に１白金耳接種し、55℃で12時間振とう培養し、
種培養液とした。
℃、15分間オートクレーブにより滅菌を行った。放冷
後、種母としてバチルス・ステアロサーモフィラス（Ba
cillus stearothermophilus）TELNE（FERM P−9439）を
同培地に１白金耳接種し、55℃で12時間振とう培養し、
種培養液とした。
次に同培地６を10容ジャーファーメンターに移
し、121℃で15分間オートクレーブ滅菌を行ない、放冷
後、種培養液120mlを移し、撹拌数450rpm、通気量２
／分、55℃で12時間培養した。培養時の中性プロテアー
ゼ活性は2260U/mlであった。
し、121℃で15分間オートクレーブ滅菌を行ない、放冷
後、種培養液120mlを移し、撹拌数450rpm、通気量２
／分、55℃で12時間培養した。培養時の中性プロテアー
ゼ活性は2260U/mlであった。
培養液６から遠心分離機にて菌体を取り除き粗酵素
液を得た。次いでここに得られた粗酵素液を硫安で塩析
し、10〜50％飽和画分を凍結乾燥し、約2.7gの粗粉末を
得た。ここに得られた粗粉末1mgあたりのプロテアーゼ
活性は、5000単位であった。
液を得た。次いでここに得られた粗酵素液を硫安で塩析
し、10〜50％飽和画分を凍結乾燥し、約2.7gの粗粉末を
得た。ここに得られた粗粉末1mgあたりのプロテアーゼ
活性は、5000単位であった。
比較例１ 現在市販されている、バチルス・サーモプロテオリィ
ティカス由来の耐熱性中性プロテアーゼ（サーモライシ
ン）と実施例１で得られた酵素を熱安定性、至適温度、
至適pH及び、pH安定性について比較した。その結果を第
１〜４図に示す。
ティカス由来の耐熱性中性プロテアーゼ（サーモライシ
ン）と実施例１で得られた酵素を熱安定性、至適温度、
至適pH及び、pH安定性について比較した。その結果を第
１〜４図に示す。
図中、バチルス、ステアロサーモフィラスTELNEの酵
素は、○−○、△−△、□−□で示した。サーモライシ
ンは、●−●、▲−▲、■−■で示した。
素は、○−○、△−△、□−□で示した。サーモライシ
ンは、●−●、▲−▲、■−■で示した。
（発明の効果） 本発明では、従来の耐熱性中性プロテアーゼに、比較
して熱安定性に優れた、より実用的な耐熱性中性プロテ
アーゼが得られる。
して熱安定性に優れた、より実用的な耐熱性中性プロテ
アーゼが得られる。
第１図は本発明および比較例の耐熱性中性プロテアーゼ
の熱安定性を示す。 第２図は本発明および比較例の耐熱性中性プロテアーゼ
の至適温度を示す。 第３図は本発明および比較例の耐熱性中性プロテアーゼ
のpH安定性を示す。 第４図は本発明および比較例の耐熱性中性プロテアーゼ
の至適pHを示す。
の熱安定性を示す。 第２図は本発明および比較例の耐熱性中性プロテアーゼ
の至適温度を示す。 第３図は本発明および比較例の耐熱性中性プロテアーゼ
のpH安定性を示す。 第４図は本発明および比較例の耐熱性中性プロテアーゼ
の至適pHを示す。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−192388（ＪＰ，Ａ) 米国特許3796635（ＵＳ，Ａ) Ｊ，Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｉｏｌ．, 57（２）（1984），Ｐ．263−272
Claims (2)
- 【請求項１】下記理化学的性質（１）〜（６）を有し、
かつ80℃において60分間加温処理しても70％以上の中性
プロテアーゼ活性を有する新規な耐熱性中性プロテアー
ゼ。 （１） 作用：カゼインを加水分解し、ペプチドまたは
アミノ酸を生成する。 （２） 基質特異性：カゼインまたはカルボベンゾキシ
・グリシル・ロイシンに作用する。 （３） 至適pHおよび安定pH:pH7〜８付近pH6〜９では4
0℃、20時間放置しても安定である。 （４） 至適作用温度:80℃付近 （５） 阻害剤の影響:EDTAによって失活する。PMFSに
よって阻害されない。 （６） 分子量：約35,000（SDS−PAGEによる） - 【請求項２】下記理化学的性質（１）〜（６）を有し、
かつ80℃において60分間加温処理しても70％以上の中性
プロテアーゼ活性を有する新規な耐熱性中性プロテアー
ゼを生産するバチルス属菌株を栄養培地にて培養し、培
養物中に新規な耐熱性中性プロテアーゼを蓄積せしめ、
該培養物から新規な耐熱性中性プロテアーゼを採取する
ことを特徴とする新規な耐熱性中性プロテアーゼの製造
方法。 （１） 作用：カゼインを加水分解し、ペプチドまたは
アミノ酸を生成する。 （２） 基質特異性：カゼインまたはカルボベンゾキシ
・グリシル・ロイシンに作用する。 （３） 至適pHおよび安定pH:pH7〜８付近pH6〜９では4
0℃、20時間放置しても安定である。 （４） 至適作用温度:80℃付近 （５） 阻害剤の影響:EDTAによって失活する。PMFSに
よって阻害されない。 （６） 分子量：約35,000（SDS−PAGEによる）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62193409A JP2560334B2 (ja) | 1987-07-31 | 1987-07-31 | 新規な耐熱性中性プロテア−ゼおよびその製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62193409A JP2560334B2 (ja) | 1987-07-31 | 1987-07-31 | 新規な耐熱性中性プロテア−ゼおよびその製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6437290A JPS6437290A (en) | 1989-02-07 |
| JP2560334B2 true JP2560334B2 (ja) | 1996-12-04 |
Family
ID=16307479
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62193409A Expired - Lifetime JP2560334B2 (ja) | 1987-07-31 | 1987-07-31 | 新規な耐熱性中性プロテア−ゼおよびその製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2560334B2 (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3796635A (en) | 1972-12-26 | 1974-03-12 | Monsanto Co | Process for the preparation of heat resistant neutral protease enzyme |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2590462B2 (ja) * | 1986-09-30 | 1997-03-12 | 東ソー株式会社 | 耐熱性プロテア−ゼの製造法 |
-
1987
- 1987-07-31 JP JP62193409A patent/JP2560334B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3796635A (en) | 1972-12-26 | 1974-03-12 | Monsanto Co | Process for the preparation of heat resistant neutral protease enzyme |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ，Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｉｏｌ．，５７（２）（１９８４），Ｐ．２６３−２７２ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6437290A (en) | 1989-02-07 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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| EXPY | Cancellation because of completion of term |